Средство, обладающее антипролиферативными и антиметастатическими свойствами, для лечения онкологических заболеваний
Владельцы патента RU 2678769:
Общество с ограниченной ответственностью "Тиацен" (RU)
Изобретение относится к медицине. Описано средство, представляющее собой комплексы 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена с β-циклодекстринами. Указанная композиция может найти применение в медицине и фармакологии для лечения опухолевых заболеваний различной локализации. Средство стабильно при хранении. 19 табл., 1 пр.
Изобретение относится к новому средству, представляющему собой комплексы 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена с β-циклодекстринами. Указанная композиция может найти применение в медицине и фармакологии для лечения опухолевых заболеваний различной локализации.
В настоящее время химиотерапия онкологических заболеваний является одним из основных методов их лечения. Применяемые для лечения онкологических заболеваний современные лекарственные средства недостаточно эффективны и обладают рядом серьезных нежелательных явлений, обусловленных повреждающим действием на здоровые органы и ткани. В связи с этим актуальной остаётся проблема поиска малотоксичных лекарственных средств и их комбинации с высокой терапевтической активностью. При этом успехи в разработке новых противоопухолевых лекарственных средств связаны не только с синтезом новых химических соединений, но и в значительной степени, с созданием их комбинации и улучшением свойств.
Известно, что у вещества 3-(2-фенилэтил)-2-тиоксо-4-тиазолидинон проявляется антипролиферативное действие на культуре клеток нейробластомы N2A /US 2003/0195238, C07D207/44, опубл. 16.10.2003/.
Известно также, что 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-он обладает антипролиферативным и антиметастатическим действием в отношении опухолевых клеток эпидермоидной карциномой Lewis, имплантированных мышам /Патент на изобретение РФ2522449, C07D277/36 , опубл. 10.07.2014г./.
Известно, что соединение 9-фенил-симм-октагидроселено-ксантен обладает широким спектром фармакологического действия /Патент на изобретение РФ 2281007, A23L1/30, опубл. 10.08.2006/. Соединение 9-фенил-симм-октагидроселено-ксантен стимулирует иммунную систему и обладает адаптогенными свойствами, что повышает его ценность при лечении онкологических заболеваний. Будучи антиоксидантом, соединение 9-фенил-симм-октагидроселено-ксантен потенциально способно защищать здоровые органы и ткани при радио- и химиотерапии онкологических заболеваний. Протекторное действие 9-фенил-симм-октагидроселено-ксантена может быть обусловлено не только его антиоксидантными свойствами, но и опосредованным вследствие способности молекулы препарата ингибировать дифференцировку низкодифференцированных клеток подобных стволовым [Патент на изобретение РФ 2317074, A61K31/095, опубл. 20.02.2008г.]. Последний эффект наблюдается при предварительном введении препарата за 7 суток до действия радиации.
Имеющиеся данные по 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-ону, 9-фенил-симм-октагидроселено-ксантену и β-циклодекстрину в качестве носителя позволяют создать эффективную и безопасную фармацевтическую композицию и расширить арсенал средств для лечения онкологических заболеваний. Один из компонентов фармацевтической композиции 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-он, являясь мультикиназным ингибитором [Ana Martinez SAR and 3D-QSAR Studies on Thiadiazolidinone Derivatives: Exploration of Structural Requirements for Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors / Ana Martinez et al. // J. Med. Chem. 2005, 48, 7103-7112], нацелен как на подавление пролиферации опухолевых клеток и их метастазирования, так и на ингибирование роста сосудов опухоли. Пролиферация опухолевых клеток и васкуляризация (рост сосудов) опухоли – два важных процесса, которые обеспечивают рост злокачественной опухоли. Другой компонент фармацевтической композиции 9-фенил-симм-октагидроселено-ксантен, обладая цитостатическим и защитным действием, возможно, обеспечит ее адъювантные свойства. При этом изыскание новых комплексов активных компонентов композиции с β-циклодекстрином позволить увеличить растворимость в воде, улучшить биодоступность и, следовательно, снизить их дозы. Разработка низкодозных высокоэффективных лекарственных препаратов является актуальной задачей современной медицинской химии. Одним из перспективных в разработке подобных лекарственных форм направлением является механохимия. Создание новых фармацевтических композиций методом механохимической активации базируется на создании комплексов путем соединения носителей β-циклодекстрина с фармацевтически активными субстанциями 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-оном и 9-фенил-симм-октагидроселено-ксантеном.
Задачей изобретения является повышение эффективности, снижение применяемых доз.
Поставленная задача достигается использованием фармацевтической композиции, состоящей из комплексов 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена с β-циклодекстринами, при следующем содержании компонентов:
активные субстанции (3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена) 8-10 масс. % , β-циклодекстрин остальное, при соотношении 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена от 1:1 до 4:1 в качестве комбинированного средства, обладающего антипролиферативными и антиметастатическими свойствами.
В литературе отсутствует информация по применению фармацевтической композиции, состоящей из комплексов 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена с β-циклодекстринами в соотношении от 1:1 до 4:1, с суммарным содержанием активных субстанций от 8 до 10 мас.% и β-циклодекстрина остальное масс.%, как антипролиферативного и антиметастатического средства для лечения онкологических заболеваний.
Новым в предлагаемом изобретении является то, в качестве комбинированного средства подавляющего пролиферацию и метастазирование различных опухолевых клеток может применяться фармацевтическая композиция, состоящая из комплексов 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена с β-циклодекстринами в соотношении от 1:1 до 4:1, с суммарным содержанием активных субстанций от 8 до 10 масс.% (3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-он от 4,5 до 7,2 масс. %, 9-фенил-сим-октагидроселеноксантен от 4,5 до 1,8 масс. %) и β-циклодекстрина - остальное. Для специалиста эти свойства явным образом не вытекают из уровня техники.
Полученная фармацевтическая композиция стабильна при хранении и была проверена на антипролиферативную и антиметастатическую эффективность.
Статистическую обработку проводили с применением следующих подходов и критериев: однофакторного дисперсионного анализа, критерия Стьюдента (в том числе для выборок с различной вариацией). Все расчеты проводили с помощь статистического пакета R (версия 2.15.0) в соответствии с современными руководствами по биологической статистике.
Комплекс 1 - 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-он в комплексе с β-циклодекстрином.
Комплекс 2 - 9-фенил-сим-октагидроселеноксантен в комплексе с β-циклодекстрином.
Сущность изобретения поясняется примерами конкретного выполнения.
Пример. Проведена оценка сочетанного антипролиферативного и антиметастатического действия 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена (активные субстанции 9 масс.%, β-циклодекстрин 91 масс.%) в модельных экспериментах на мышах с имплантированными опухолями эпидермоидной карциномой Lewis.
Материалы и методы
Исследование сочетанных антипролиферативных и антиметастатических свойств 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена было проведено в эксперименте на мышах с имплантированными опухолевыми клетками эпидермоидной карциномой Lewis.
Тест-система
Эксперименты были проведены на 125 мышах-самцах гибридах первого поколения CBA×C57Bl/6: на каждую группу приходилось по 25 животных. В заднюю лапку мышей имплантировали эпидермоидную карциному Lewis, в количестве ~106 клеток (~ 0,2 см3).
Дозы и схемы введения 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена
Исследуемое соединение 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-он в комплексе с β-циклодекстрином в соотношении 1:10 вводили ежедневно в течение 3-х недель после имплантации опухоли. Изучаемое соединение 9-фенил-сим-октагидроселеноксантен в комплексе с β-циклодекстрином в соотношении 1:10 вводили три раза: на 7, 11 и 15 сутки после имплантации. Экспериментальные группы, дозы и количество животных указаны в таблице 1. Оба комплекса вводились внутрижелудочно (в/ж) в количестве 0,2 мл на животное в виде суспензии. Мышам контрольной группы с имплантированной опухолью внутрижелудочно вводилась водная суспензия β-циклодекстрина в количестве 0,2 мл на животное.
Таблица 1. Экспериментальные группы
| # | Группы | Количество животных |
|
| 1 | Контроль | - | 25 |
| 2 | Комплекс 1 | 25 мг/кг | 25 |
| 3 | Комплекс 2 | 100 мг/кг | 25 |
| 4 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 50 мг/кг |
25 |
| 5 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 100 мг/кг |
25 |
Критерии оценки эффективности исследуемых комплексов
Антипролиферативная эффективность оценивалось по изменению объема новообразования, который определяется по формуле. Объем новообразования оценивали по следующей формуле (1):
V = a×b×c (1)
| где: | a, b и с | – длина, ширина и высота опухолевого узла. |
Сроки измерения: 11, 16 и 21 сутки после имплантации. В качестве дополнительных критериев использовали изменение массы тела животных и выживаемость в группах на поздних сроках.
Антиметастатическая эффективность оценивалась по количеству метастазов в легких, которое определяли через 3 недели после начала введения комплексов. Для этого у декапитированных под наркозом животных извлекали легкие и переносили в жидкость Буэна. Подсчет метастазов проводили визуально.
Результаты
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что введение мышам с имплантированной опухолевыми клетками эпидермоидной карциномой Lewis изучаемых комплексов значительно снижает у них объем опухоли по сравнению с контрольной группой (таблица 2) уже через 11 сутки после имплантации опухоли.
Таблица 2. Изменение объема опухоли (мм3) у животных в зависимости от дозы введения изучаемых комплексов
| Дозы введения | Сутки после имплантации опухоли | ||||
| 11 | 16 | 21 | |||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 2897±226 | 5098±407 | 8860±665 | |
| 2 | Комплекс 1 | 25 мг/кг | 2648± 292 | 3885±417 | 5524±565* |
| 3 | Комплекс 2 | 100 мг/кг | 2789±287 | 4890±398 | 8621±577 |
| 4 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 50 мг/кг |
2182±267 | 3213±309* | 5097±646* |
| 5 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 100 мг/кг |
1762±447* | 2668±541* | 3551±404*× |
*Здесь и далее достоверное (P<0,00001-0,05) отличие от контроля по критерию Стьюдента
Таблица 3. Количество метастазов в легких в зависимости от дозы введения изучаемых комплексов
| Дозы введения | Количество метастазов, шт. | |||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 52,1 ± 8,3 | ||
| 2 | Комплекс 1 | 25 мг/кг | 30,2 ± 6,1* | |
| 3 | Комплекс 2 | 100 мг/кг | 47,3 ± 3,6 | |
| 4 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 50 мг/кг |
28,7 ± 6,4* | у двух мышей в легких отсутствуют метастазы |
| 5 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 100 мг/кг |
17,2 ± 3,27* | у двух мышей в легких отсутствуют метастазы |
Достоверные отличия от контроля были получены при введении комплекса 1 в дозе 25 мг/кг, и комплекса 2 - 50-100 мг/кг. При этом наилучшие результаты были достигнуты по снижению объема опухоли при сочетанном введении комплекса 1 и комплекса 2, соответственно в дозах 25 и 100 мг/кг.
При анализе количества метастазов в легких было установлено достоверное их снижение по сравнению с контролем только для мышей-опухоленосителей тех групп, которым вводили как отдельно комплекс 1, так и при сочетанном его введении с комплексом 2, соответственно, в дозах 25 мг/кг и 50 – 100 мг/кг массы тела животных (таблица 4). Также следует отметить, что наилучшие результаты были достигнуты как и в случае со снижением объема опухоли при сочетанном введении комплекса 1 и комплекса 2, соответственно в дозах 25 и 100 мг/кг. При сочетанном введении комплекса 1 и комплекса 2 соответственно, в дозах 25 мг/кг и 50 – 100 мг/кг массы тела животных у двух мышей из групп в легких отсутствовали метастазы.
На протяжении всего эксперимента измерение массы тела подопытных мышей-опухоленосителей не показало существенного ее изменения при внутрижелудочном введении изучаемых комплексов (таблица 4).
Таблица 4. Изменение массы тела (г) животных в зависимости от дозы введения изучаемых комплексов
| Дозы введения | Сутки после имплантации опухоли | |||||
| 7 | 11 | 16 | 21 | |||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 23,5±0,6 | 24,3± 0,6 | 24,1±0,6 | 24,9±0,7 | |
| 2 | Комплекс 1 | 25 мг/кг | 22,8±0,5 | 23,5±0,6 | 24,5±0,6 | 24,1±0,7 |
| 3 | Комплекс 2 | 100 мг/кг | 24,0±0,7 | 24,5±0,7 | 24,2±0,7 | 24,1±0,9 |
| 4 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 50 мг/кг |
22,7±0,5 | 23,1±0,5 | 23,9±0,6 | 23,7±0,7 |
| 5 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 100 мг/кг |
24,5±0,4 | 24,8±0,4 | 25,7±0,5 | 25,5±0,6 |
Результаты анализа выживаемости на поздних сроках показали, что как отдельное введение комплекса 1, так и сочетанное с комплексом 2, соответственно, в дозах 25 мг/кг и 50 – 100 мг/кг массы тела животных способствует увеличению продолжительности жизни мышей с имплантированной опухолью (таблица 5). При этом наилучшие результаты по выживаемости мышей-опухоленосителей обеспечило сочетанное введение комплекса 1 и комплекса 2, соответственно в дозах 25 мг/кг и 100 мг/кг массы тела животных.
Таблица 5. Количество выживших и погибших животных (шт.) в зависимости от дозы введения изучаемых комплексов
| Дозы введения | Погибшие | Выжившие | Соотношение выживших к погибшим | ||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 8 | 6 | 0,75 | |
| 2 | Комплекс 1 | 25 мг/кг | 4 | 10 | 2,50 |
| 3 | Комплекс 2 | 100 мг/кг | 7 | 7 | 1,0 |
| 4 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 50 мг/кг |
3 | 11 | 3,67 |
| 5 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 100 мг/кг |
2 | 12 | 6,0 |
В модельных экспериментах на мышах с имплантированной опухолью эпидермоидной карциномой Lewis была проведена оценка сочетанного антипролиферативного и антиметастатического действия комплекса 1 и комплекса 2. Проведенные исследования показали, что сочетанное введение комплекса 1 и комплекса 2 мышам-опухоленосителям способствует ингибированию роста опухоли, увеличению продолжительности их жизни, снижению количества метастазов в легких и при этом не влияет на массу тела животных. При этом наилучшие результаты были достигнуты при сочетанном введении комплекса 1 и комплекса 2, соответственно в дозах 25 и 100 мг/кг.
Таким образом, в результате проведенных исследований было продемонстрировано более выраженное противоопухолевое действие сочетанного применения комплекса 1 и комплекса 2 мышам-опухоленосителям и целесообразности их включения в фармацевтическую композицию.
Пример. Исследованы адъювантные свойства 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена в комплексе с β-циклодекстрином при его совместном применении с 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-оном в комплексе с β-циклодекстрином по противоопухолевой и антиметастатической активности в модельных экспериментах на мышах с имплантированными опухолями меланомой В16 (активные субстанции 9 масс.%, β-циклодекстрин 91масс. %).
Материалы и методы. Оценка адъювантных свойств комплекса 2 при его совместном применении с комплексом 2 по антипролиферативной и антиметастатической активности было проведено в эксперименте на мышах с имплантированными опухолевыми клетками меланомой В16.
Тест-система
Эксперименты были проведены на 120 мышах-самцах гибридах первого поколения CBA×C57Bl/6: на каждую группу приходилось по 20 животных. В заднюю лапку животных была имплантирована меланома B-16, в количестве ~106 клеток (~0,2 см3). Клетки мышиной меланомы B-16, приспособленная к выращиванию в монослое (банк клеток ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина) культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением антибиотиков (пенициллин-стрептомицин по 100 ЕД/мл), 10% эмбриональной телячьей (10% по объему) сыворотки при температуре +37º C в атмосфере, содержащей 5% СО2. В качестве культуральной посуды использовали стерильные матрацы площадью 75 см3 (Corning, Nunc). Пересев культуры проводился 3 раза в неделю.
Дозы и схемы введения 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена
Исследуемое соединение 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-он в комплексе с β-циклодекстрином в соотношении 1:10 вводили ежедневно в течение 3-х недель после имплантации опухоли. Изучаемое соединение 9-фенил-сим-октагидроселеноксантен в комплексе с β-циклодекстрином в соотношении 1:10 вводили три раза: на 7, 11 и 15 сутки после имплантации. Экспериментальные группы, дозы и количество животных указаны в таблице 6. Оба комплекса вводились внутрижелудочно (в/ж) в количестве 0,2 мл на животное в виде суспензии. Мышам контрольной группы с имплантированной опухолью внутрижелудочно вводилась водная суспензия β-циклодекстрина в количестве 0,2 мл на животное.
Таблица 6. Экспериментальные группы
| # | Группы | Количество животных |
|
| 1 | Контроль | - | 20 |
| 2 | Комплекс 1 | 25 мг/кг | 20 |
| 3 | Комплекс 1 | 50 мг/кг | 20 |
| 4 | Комплекс 1 | 75 мг/кг | 20 |
| 5 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 100 мг/кг |
20 |
| 6 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
50 мг/кг 100 мг/кг |
20 |
Критерии оценки эффективности исследуемых комплексов
Антипролиферативная эффективность оценивалось по изменению объема новообразования, который определяется по формуле. Объем новообразования оценивали по следующей формуле (1):
V = a×b×c (1)
| где: | a, b и с | – длина, ширина и высота опухолевого узла. |
Сроки измерения: 10, 15 и 20 сутки после имплантации. В качестве дополнительных критериев использовали изменение массы тела животных и выживаемость в группах на поздних сроках.
Антиметастатическая эффективность оценивалась по количеству метастазов в легких, которое определяли через 3 недели после начала введения комплексов. Для этого у декапитированных под наркозом животных извлекали легкие и переносили в жидкость Буэна. Подсчет метастазов проводили визуально.
Результаты
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что введение мышам с имплантированной опухолевыми клетками меланомой В16 изучаемых комплексов значительно снижает у них объем опухоли по сравнению с контрольной группой (таблица 7) уже через 10 сутки после имплантации опухоли.
Достоверные отличия от контроля были получены при введении комплекса 1 в дозе 25, 50 и 75 мг/кг, и комплекса 2 - 100 мг/кг. При этом наилучшие результаты были достигнуты по снижению объема опухоли при сочетанном введении комплекса 1 и комплекса 2, соответственно в дозах 25 и 100 мг/кг.
При анализе количества метастазов в легких было установлено достоверное их снижение по сравнению с контролем только для мышей-опухоленосителей тех групп, которым вводили как отдельно комплекс 1, так и при сочетанном его введении с комплексом 2, соответственно, в дозах 25, 50 и 75 мг/кг и 100 мг/кг массы тела животных (таблица 8). Также следует отметить, что наилучшие результаты были достигнуты как и в случае со снижением объема опухоли при сочетанном введении комплекса 1 и комплекса 2, соответственно в дозах 25 и 100 мг/кг.
Таблица 7. Изменение объема опухоли (мм3) у животных в зависимости от дозы введения изучаемых комплексов
| Дозы введения | Сутки после имплантации опухоли | ||||
| 10 | 15 | 20 | |||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 2215±289 | 3901±546 | 7537±911 | |
| 2 | Комплекс 1 | 25 мг/кг | 1326 ± 224* p<0,02 |
3242±513 | 5375±843 |
| 3 | Комплекс 1 | 50 мг/кг | 1168 ± 175* p<0,004 | 3095±424 | 5041±718* p<0,05 |
| 4 | Комплекс 1 | 75 мг/кг | 1249±227* p<0,01 | 2920±370* p<0,01 | 4906±559* p<0,05 |
| 5 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 100 мг/кг |
816±149* p<0,00001 | 1856±323* p<0,006 | 3216±546* p<0,001 |
| 6 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
50 мг/кг 100 мг/кг |
695±70* p<0,0001 | 1563±175* p<0,0001 | 3924±487* p<0,002 |
*Здесь и далее достоверное (P<0,00001-0,05) отличие от контроля по критерию Стьюдента
Таблица 8. Количество метастазов в легких в зависимости от дозы введения изучаемых комплексов
| Дозы введения | Количество метастазов, шт. | ||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 34,3 ± 2,8 | |
| 2 | Комплекс 1 | 25 мг/кг | 22,2 ± 3,1* (p<0,05) |
| 3 | Комплекс 1 | 50 мг/кг | 21,0 ± 2,3* (p<0,01) |
| 4 | Комплекс 1 | 75 мг/кг | 18,2 ± 3,6* (p<0,003) |
| 5 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 100 мг/кг |
11,3 ± 2,3* (p<0,00001) |
| 6 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
50 мг/кг 100 мг/кг |
14,9 ± 3,4* (p<0,001) |
Измерение массы тела подопытных мышей-опухоленосителей в ходе проведения эксперимента не продемонстрировало значительного ее изменения при внутрижелудочном введении изучаемых комплексов (таблица 9).
Таблица 9. Изменение массы тела (г) животных в зависимости от дозы введения изучаемых комплексов
| Дозы введения | Сутки после имплантации опухоли | |||||
| 6 | 10 | 15 | 20 | |||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 21,2±0,4 | 22,0± 0,5 | 23,5±0,5 | 23,0±0,6 | |
| 2 | Комплекс 1 | 25 мг/кг | 20,9±0,3 | 21,4±0,4 | 22,3±0,4 | 22,0±0,5 |
| 3 | Комплекс 1 | 50 мг/кг | 21,8±0,4 | 22,2±0,5 | 23,4±0,5 | 23,7±0,6 |
| 4 | Комплекс 1 | 75 мг/кг | 22,1±0,6 | 23,1±0,6 | 24,3±0,5 | 23,8±0,5 |
| 5 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
25 мг/кг 50 мг/кг |
21,6±0,5 | 22,0±0,4 | 23,7±0,4 | 24,0±0,6 |
| 6 | Комплекс 1 Комплекс 2 |
50 мг/кг 100 мг/кг |
22,0±0,5 | 23,4±0,5 | 24,6±0,7 | 24,1±0,7 |
В модельных экспериментах на мышах с имплантированной опухолью меланомой В16 изучены адъювантные свойства комплекса 2 при его совместном применении с комплексом 1 по противоопухолевой активности. В результате проведенных исследований установлено, что комплекс 2 усиливает противоопухолевое действие комплекса 1. Сочетанное введение комплекса 1 и комплекса 2 мышам способствует ингибированию роста опухоли, снижению количества метастазов в легких и при этом не влияет на массу тела животных. При этом наилучшие результаты были достигнуты при сочетанном введении комплекса 1 и комплекса 2, соответственно в дозах 25 и 100 мг/кг.
Пример. Проведена оценка противоопухолевой и антиметастатической активности фармацевтической композиции in vivo и ее терапевтических доз в модельных экспериментах на мышах с имплантированными опухолями меланомой В16 и эпидермоидной карциномой Lewis (активные субстанции 9 масс.%, β-циклодекстрин 91 масс.%).
Материалы и методы. Исследованы антипролиферативные и антиметастатические свойства фармацевтической композиции было проведено в двух сериях экспериментов на мышах с имплантированными опухолевыми клетками эпидермоидной карциномой Lewis и меланомой В16.
Первая серия эксперимента
Тест-система
Первая серия эксперимента была проведена на 100 мышах-самцах гибридах первого поколения CBA×C57Bl/6: на каждую группу приходилось по 25 животных. В заднюю лапку мышей имплантировали эпидермоидную карциному Lewis, в количестве ~106 клеток (~ 0,2 см3).
Дозы и схемы введения фармацевтической композиции
Исследуемую фармацевтическую композицию вводили ежедневно в течение 3-х недель после имплантации опухоли. Экспериментальные группы, дозы и количество животных указаны в таблице 10. Фармацевтическая композиция вводилась внутрижелудочно (в/ж) в количестве 0,2 мл на животное в виде суспензии. Мышам контрольной группы с имплантированной опухолью внутрижелудочно вводилась водная суспензия β-циклодекстрина в количестве 0,2 мл на животное.
Таблица 10. Экспериментальные группы
| # | Группы | Количество животных |
|
| 1 | Контроль | - | 25 |
| 2 | Фармацевтическая композиция | 17,5 мг/кг | 25 |
| 3 | Фармацевтическая композиция | 35 мг/кг | 25 |
| 4 | Фармацевтическая композиция | 70 мг/кг | 25 |
Критерии оценки эффективности фармацевтической композиции
Антипролиферативная эффективность оценивалось по изменению объема новообразования, который определяется по формуле. Объем новообразования оценивали по следующей формуле (1):
V = a×b×c (1)
| где: | a, b и с | – длина, ширина и высота опухолевого узла. |
Сроки измерения: 11, 16 и 21 сутки после имплантации. В качестве дополнительных критериев использовали изменение массы тела животных и выживаемость в группах на поздних сроках.
Антиметастатическая эффективность оценивалась по количеству метастазов в легких, которое определяли через 3 недели после начала введения комплексов. Для этого у декапитированных под наркозом животных извлекали легкие и переносили в жидкость Буэна. Подсчет метастазов проводили визуально.
Вторая серия эксперимента
Тест-система
Вторая серия эксперимента была проведена на 100 мышах-самцах гибридах первого поколения CBA×C57Bl/6: на каждую группу приходилось по 25 животных. В заднюю лапку животных была имплантирована меланома B-16, в количестве ~106 клеток (~0,2 см3). Клетки мышиной меланомы B-16, приспособленная к выращиванию в монослое (банк клеток ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина) культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением антибиотиков (пенициллин-стрептомицин по 100 ЕД/мл), 10% эмбриональной телячьей (10% по объему) сыворотки при температуре +37º C в атмосфере, содержащей 5% СО2. В качестве культуральной посуды использовали стерильные матрацы площадью 75 см3 (Corning, Nunc). Пересев культуры проводился 3 раза в неделю.
Дозы и схемы введения фармацевтической композиции
Исследуемую фармацевтическую композицию вводили ежедневно в течение 3-х недель после имплантации опухоли. Экспериментальные группы, дозы и количество животных указаны в таблице 11. Фармацевтическая композиция вводилась внутрижелудочно (в/ж) в количестве 0,2 мл на животное в виде суспензии. Мышам контрольной группы с имплантированной опухолью внутрижелудочно вводилась водная суспензия β-циклодекстрина в количестве 0,2 мл на животное.
Таблица 11. Экспериментальные группы
| # | Группы | Количество животных |
|
| 1 | Контроль | - | 25 |
| 2 | Фармацевтическая композиция | 17,5 мг/кг | 25 |
| 3 | Фармацевтическая композиция | 35 мг/кг | 25 |
| 4 | Фармацевтическая композиция | 70 мг/кг | 25 |
Критерии оценки эффективности фармацевтической композиции
Антипролиферативная эффективность оценивалось по изменению объема новообразования, который определяется по формуле. Объем новообразования оценивали по следующей формуле (1):
V = a×b×c (1)
| где: | a, b и с | – длина, ширина и высота опухолевого узла. |
Сроки измерения: 10, 15 и 20 сутки после имплантации. В качестве дополнительных критериев использовали изменение массы тела животных и выживаемость в группах на поздних сроках.
Антиметастатическая эффективность оценивалась по количеству метастазов в легких, которое определяли через 3 недели после начала введения комплексов. Для этого у декапитированных под наркозом животных извлекали легкие и переносили в жидкость Буэна. Подсчет метастазов проводили визуально.
Результаты
Первая серия эксперимента
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что введение мышам с имплантированной опухолевыми клетками эпидермоидной карциномой Lewis фармацевтической композиции значительно снижает у них объем опухоли по сравнению с контрольной группой (таблица 12) уже через 11 сутки после имплантации опухоли.
Таблица 12. Изменение объема опухоли (мм3) у животных в зависимости от дозы введения фармацевтической композиции
| Дозы введения | Сутки после имплантации опухоли | ||||
| 11 | 16 | 21 | |||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 2266±202 | 4967±306 | 8157±555 | |
| 2 | Фармацевтическая композиция | 17,5мг/кг | 1620± 233 | 3766±365 | 6233±466 |
| 3 | Фармацевтическая композиция | 35 мг/кг | 901±178* | 2189±399* | 3245±456* |
| 4 | Фармацевтическая композиция | 70 мг/кг | 1232±244* | 2834±324* | 4321±512* |
*Здесь и далее достоверное (P<0,00001-0,05) отличие от контроля по критерию Стьюдента
Достоверные отличия от контроля были получены при введении мышам-опухоленосителям фармацевтической композиции в дозе 35 мг/кг и 70 мг/кг массы тела животных. При этом наилучшие результаты были достигнуты по снижению объема опухоли при введении фармацевтической композиции в дозе 35 мг/кг.
При анализе количества метастазов в легких было установлено достоверное их снижение по сравнению с контролем только для мышей-опухоленосителей тех групп, которым вводили фармацевтическую композицию в дозах 35 мг/кг и 70 мг/кг массы тела животных (таблица 13). Также следует отметить, что наилучшие результаты были достигнуты как и в случае со снижением объема опухоли при введении фармацевтической композиции в дозе 35 мг/кг. При введении фармацевтической композиции дозах 35 мг/кг и 70 мг/кг, соответственно у 4 и 2 мышей из групп в легких отсутствовали метастазы.
На протяжении всего эксперимента измерение массы тела подопытных мышей-опухоленосителей не показало существенного ее изменения при внутрижелудочном введении фармацевтической композиции (таблица 14).
Таблица 13. Количество метастазов в легких в зависимости от дозы введения фармацевтической композиции
| Дозы введения | Количество метастазов, шт. | |||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 48,4 ± 8,0 | ||
| 2 | Фармацевтическая композиция | 17,5 мг/кг | 35,0 ± 5,9 | |
| 3 | Фармацевтическая композиция | 35 мг/кг | 21,1 ± 4,2* | у 4 мышей в легких отсутствуют метастазы |
| 4 | Фармацевтическая композиция | 70 мг/кг | 28,8 ± 7,3* | у 2 мышей в легких отсутствуют метастазы |
Таблица 14. Изменение массы тела животных в зависимости от дозы введения фармацевтической композиции
| Дозы введения | Сутки после имплантации опухоли | |||||
| 7 | 11 | 16 | 21 | |||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 20,2±0,5 | 21,4± 0,4 | 22,4±0,5 | 22,0±0,6 | |
| 2 | Фармацевтическая композиция | 17,5 мг/кг | 21,1±0,6 | 22,5±0,5 | 23,2±0,5 | 23,0±0,6 |
| 3 | Фармацевтическая композиция | 35 мг/кг | 21,5±0,6 | 22,6±0,5 | 23,0±0,8 | 22,5±0,7 |
| 4 | Фармацевтическая композиция | 70 мг/кг | 20,8±0,4 | 21,4±0,6 | 22,7±0,7 | 23,3±0,8 |
Результаты анализа выживаемости на поздних сроках показали, что введение фармацевтической композиции в дозах 35 мг/кг и 70 мг/кг массы тела животных способствует увеличению продолжительности жизни мышей с имплантированной опухолью (таблица 15). При этом наилучшие результаты по выживаемости мышей-опухоленосителей обеспечило введение фармацевтической композиции в дозе 35 мг/кг массы тела животных.
Таблица 15. Количество выживших и погибших животных в зависимости от дозы введения фармацевтической композиции
| Дозы введения | Погибшие | Выжившие | Соотношение выживших к погибшим | ||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 9 | 5 | 0,56 | |
| 2 | Фармацевтическая композиция | 17,5 мг/кг | 5 | 9 | 1,8 |
| 3 | Фармацевтическая композиция | 35 мг/кг | 2 | 12 | 6,0 |
| 4 | Фармацевтическая композиция | 70 мг/кг | 3 | 11 | 3,67 |
Вторая серия эксперимента
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что введение фармацевтической композиции мышам с имплантированной опухолевыми клетками меланомой В16 значительно снижает у них объем опухоли по сравнению с контрольной группой (таблица 16) уже через 10 сутки после имплантации опухоли.
Таблица 16. Изменение объема опухоли (мм3) у животных в зависимости от дозы введения фармацевтической композиции
| Дозы введения | Сутки после имплантации опухоли | ||||
| 10 | 15 | 20 | |||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 2031±294 | 5012±299 | 7976±452 | |
| 2 | Фармацевтическая композиция | 17,5мг/кг | 1556± 310 | 3897±378 | 5986±502 |
| 3 | Фармацевтическая композиция | 35 мг/кг | 1010±182* | 2089±354* | 3623±400* |
| 4 | Фармацевтическая композиция | 70 мг/кг | 1312±198* | 2999±298* | 4440±498* |
*Здесь и далее достоверное (P<0,00001-0,05) отличие от контроля по критерию Стьюдента
Достоверные отличия от контроля были получены при введении фармацевтической композиции в дозах 35 мг/кг и 70 мг/кг. При этом наилучшие результаты были достигнуты по снижению объема опухоли при введении фармацевтической композиции в дозе 35 мг/кг.
При анализе количества метастазов в легких было установлено достоверное их снижение по сравнению с контролем только для мышей-опухоленосителей тех групп, которым вводили фармацевтическую композицию, в дозах 35 мг/кг и 70 мг/кг массы тела животных (таблица 17). Также следует отметить, что наилучшие результаты были достигнуты как и в случае со снижением объема опухоли при введении фармацевтической композиции в дозе 35 мг/кг. При введении фармацевтической композиции дозах 35 мг/кг и 70 мг/кг, соответственно у 3 и 2 мышей из групп в легких отсутствовали метастазы.
На протяжении всего эксперимента измерение массы тела подопытных мышей-опухоленосителей не показало существенного ее изменения при внутрижелудочном введении изучаемых комплексов (таблица 18).
Таблица 17. Количество метастазов в легких в зависимости от дозы введения фармацевтической композиции
| Дозы введения | Количество метастазов, шт. | |||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 37,9 ± 7,2 | ||
| 2 | Фармацевтическая композиция | 17,5 мг/кг | 25,3 ± 4,8 | |
| 3 | Фармацевтическая композиция | 35 мг/кг | 12,5 ± 5,0* | у 3 мышей в легких отсутствуют метастазы |
| 4 | Фармацевтическая композиция | 70 мг/кг | 19,2 ± 6,1* | у 2 мышей в легких отсутствуют метастазы |
Таблица 18. Изменение массы тела животных в зависимости от дозы введения фармацевтической композиции
| Дозы введения | Сутки после имплантации опухоли | |||||
| 7 | 11 | 16 | 21 | |||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 21,5±0,4 | 22,1± 0,5 | 24,0±0,7 | 23,2±0,7 | |
| 2 | Фармацевтическая композиция | 17,5 мг/кг | 22,3±0,7 | 23,4±0,6 | 23,9±0,4 | 22,8±0,7 |
| 3 | Фармацевтическая композиция | 35 мг/кг | 22,8±0,6 | 24,0±0,6 | 24,5±0,7 | 25,1±0,8 |
| 4 | Фармацевтическая композиция | 70 мг/кг | 21,9±0,5 | 22,8±0,5 | 23,9±0,5 | 24,2±0,9 |
Результаты анализа выживаемости на поздних сроках показали, что введение фармацевтической композиции в дозах 35 мг/кг и 70 мг/кг массы тела животных способствует увеличению продолжительности жизни мышей с имплантированной опухолью (таблица 19). При этом наилучшие результаты по выживаемости мышей-опухоленосителей обеспечило введение фармацевтической композиции в дозе 35 мг/кг массы тела животных.
Таблица 19. Количество выживших и погибших животных в зависимости от дозы введения фармацевтической композиции
| Дозы введения | Погибшие | Выжившие | Соотношение выживших к погибшим | ||
| 1 | Контроль (β-циклодекстрин) | 8 | 5 | 0,63 | |
| 2 | Фармацевтическая композиция | 17,5 мг/кг | 5 | 8 | 1,6 |
| 3 | Фармацевтическая композиция | 35 мг/кг | 2 | 11 | 5,5 |
| 4 | Фармацевтическая композиция | 70 мг/кг | 4 | 9 | 2,3 |
В результате проведенных исследований по противоопухолевому действию фармацевтической композиции установлено, что изучаемая комбинация обладает способностью ингибировать рост опухоли эпидермоидной карциномы Lewis и меланомы В16 у мышей. Ингибирование носит дозозависимый характер. При введении фармацевтической композиции в дозе 35 мг/кг массы тела животного ингибирование роста опухоли носит более выраженный характер, чем применение в дозах 17,5 мг/кг и 70 мг/кг. Но при введении мышам фармацевтической композиции в дозах 35 мг/кг и 70 мг/кг размеры опухолей статистически значимо отличаются от размеров контрольной группы, которым препарат не вводили. Изучение действия фармацевтической композиции на метастазирование при имплантации опухолевых клеток эпидермоидной карциномы Lewis и меланомы В16 мышам позволило установить, что предлагаемая комбинация в дозах 35 мг/кг и 70 мг/кг массы тела животных достоверно снижал количество метастазов в легких. Введение фармацевтической композиции в дозах 35 мг/кг и 70 мг/кг мышам-опухоленосителям способствует увеличению продолжительности жизни животных.
Таким образом, разработанная фармацевтическая композиция обладает выраженным антипролиферативным и антиместатическим действием в отношении опухолей эпидермоидной карциномы Lewis и меланомы В16.
Предлагаемое изобретение обеспечивает повышение эффективности, снижение применяемых доз и расширение арсенала средств для лечения различных видов опухолевых заболеваний.
Средство, обладающее антипролиферативными и антиметастатическими свойствами, состоящее из комплексов 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена с β-циклодекстринами,
при следующем содержании компонентов:
активные субстанции (3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена) 8-10 масс.%
β-циклодекстрин остальное,
при соотношении 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и 9-фенил-сим-октагидроселеноксантена от 1:1 до 4:1.
