Штамм streptomyces hygroscopicus bkm ac-2737d - продуцент антибиотика рапамицина и способ увеличения его продуктивности

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для производства макролидного антибиотика рапамицина - лекарственного средства, широко используемого в трансплантологии и терапии опухолевых процессов. Предложен штамм Streptomyces hygroscopicus ВКМ Ac-2737D и способ получения антибиотика рапамицина, предусматривающий внесение штамма Streptomyces hygroscopicus ВКМ Ac-2737D в питательную среду, содержащую соевую муку, лизин, дрожжевой экстракт, соевый пептон, глюкозу, хлорид натрия, сульфат магния, сульфат аммония, 30% кислорода и дистиллированную воду при заданных соотношениях компонентов и его культивирование при температуре 29±1°С и рН среды 6,8-7,0 в течение 216±24 ч. При этом глюкозу вносят в питательную среду начиная с 72-го часа биосинтеза. Группа изобретений позволяет повысить выход рапамицина. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтической промышленности и касается способа получения биологически активного соединения - рапамицина для использования в качестве иммуносупрессора.

Рапамицин, также известный как Сиролимус, является продуктом метаболизма актиномицета Streptomyces hygroscopicus и представляет собой азотсодержащий макролид с эмпирической формулой C₅₁H₇₉NO₁₃, имеющий в своем составе 31-членное лактонное кольцо (рис. 1).

Рапамицин был впервые выделен в 1972 году и показана его антифунгицидная активность в отношении патогенных дрожжей Candida albicans и некоторых дерматофитов {Microsporum gypseum и Trichophyton granulosum) (Vezina G., Kudelski A., Sehgal S.N., 1975. Rapamycin (AY-22, 989), Journal of Antibiotics 10(XXVIII), 721-726), US 3929992 (Surendra Sehgal 1975). Дальнейшее изучение препарата позволило установить, что он является мощным иммуносупрессором и с 2001 года его стали применять в трансплантологии для предотвращения отторжения трансплантатов. Рапамицин успешно применяют в ангиопластике в качестве лекарственного покрытия стентов для предотвращения рестеноза коронарных артерий. (Marks S.O. and Marks A.R., 2001, 104: 852-855). Также он используется для лечения системной красной волчанки, аутоиммунных кишечных [US 5286731] и кожных заболеваний, таких как псориаз [US 5286730].

Помимо вышеописанных способов применения, рапамицин используют в качестве антипролиферанивного агента, а также в биологических исследованиях в качестве агента для химически индуцированной димеризации.

Производится рапамицин фирмами Pfizer (Пфайзер) США и ее филиалами, а также индийской фирмой Biocon Ltd. В России рапамицин не производится.

Несмотря на широкий спектр возможностей применения рапамицина в медицине, его использование в значительной мере ограничивается тем, что существующие природные штаммы-продуценты не отличаются высокой продуктивностью, что увеличивает себестоимость субстанции и снижает возможные объемы ее промышленного производства.

В первых работах по биосинтезу рапамицина с использованием актиномицета S. hygroscopicus, продуктивность штаммов не превышала 110-130 мг/л (Lee M.S., Kojima I., Demain A.L. Microbiology and Biotechnology. 1995. V. 43, P. 1096-1098).

Продуктивность существующих в настоящее время промышленных штаммов остается в основном в пределах 700-900 мг/л [Zhu et al. (2010), Zou and Li (2013)]. Таким образом, проблема разработки высокопродуктивных штаммов и технологий биосинтеза рапамицина остается актуальной.

В существующих публикациях, касающихся способов получения высокопродуктивных штаммов, описаны различные методы, такие как слияние протопластов близкородственных штаммов, классический мутагенез с последующей селекцией, селекция с использованием антибиотиков в качестве селективного агента, оптимизация питательных сред и их совместные комбинации.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения рапамицина описанный в патенте US 2015/0079642 А1. Штамм - МТСС 5681, продуцент рапамицина, получен в результате совместного применения физического (УФ-облучение) и химического (NTG) мутагенов. Продуцирующая способность данного штамма при глубинном культивировании составляет 900 мг/л рапамицина.

Однако, для обеспечения достаточного объема производства рапамицина этой продуктивности недостаточно. Необходимы не только эффективные технологии его промышленного производства, выделения и очистки, но и высокопродуктивные штаммы-продуценты.

Задачей данного изобретения было получение нового высокопродуктивного штамма продуцента рапамицина, способного обеспечить необходимые объемы его промышленного производства, а также дальнейшее повышение его продуктивности за счет оптимизации состава питательной среды и условий культивирования.

Задача была решена в три этапа:

1. Применением метода ненаправленного индуцированного многоступенчатого УФ-мутагенеза и последующей селекции исходного штамма S. hygroscopicus АТСС 29253 с продуктивностью (43±5) мг/л был получен штамм S. hygroscopicus (R 33-41) с продуктивностью (655±5) мг/л рапамицина, что более чем в 15 раз превышает продуцирующую способность исходного штамма S. hygroscopicus АТСС 29253. Штамм S.hygroscopicus (R 33-41) депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина 30.05.2016 с регистрационным номером ВКМ Ac-2737D.

2. Оптимизацией состава питательной среды, в том числе подбором альтернативных источников углерода, органического и минерального азота, а также макроэлементов и их соотношений, максимально стимулирующих биосинтез рапамицина обеспечено дополнительное значительное (в 1.89 раза) повышение продуктивности штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D при глубинном культивировании в колбах до (1215±5) мг/л рапамицина.

3. Усовершенствованием условий культивирования штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D с применением оптимизированной ферментационной среды в опытно-промышленных условиях удалось повысить продуктивность штамма с (1215±5) мг/л до 1275±10 мг/л рапамицина.

На первом этапе был получен новый штамм - продуцент рапамицина S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D.

Штамм получен путем ненаправленного индуцированного многоступенчатого УФ-мутагенеза и последующей селекции с применением мутагенных факторов, и направленных методов отбора изолятов исходного штамма S. hygroscopicus АТСС 29253. В качестве мутагенного фактора были использованы УФ - лучи с длиной волны 250-280 нм (лампа Mineralight, мощность 12,5 Вт). Облучение проводили в водной суспензии спор на расстояние 40 см от лампы, при этом интенсивность излучения лампы составляла 0,25 мВт/см².

Далее суспензию переносили на поверхность агаризованной среды и равномерно распределяли по поверхности. Культивирование на твердой агаризованной среде проводили в течение 12-14 суток при температуре 29°С. По окончанию культивирования из выросших на агаризованной среде колоний отбирали от 20 до 50 морфологически измененных колоний и повторно пересевали на агаризованную среду, а затем культивировали в колбах с использованием ферментационной среды и определяли их продуктивность хроматографическим методом (ВЭЖХ). Изоляты, обладающие максимальной продуктивностью, использовали в следующем цикле УФ-мутагенеза и отбора.

Продуктивность полученного таким образом нового штамма S. hygroscopicus (R 33-41) определялась методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Полученный новый штамм S. hygroscopicus (33-41) депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ Ac-2737D.

Штамм S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D обладает повышенной продуктивностью рапамицина в колбах (655±5) мг/л.

Культурально-морфологические признаки штамма ВКМ Ac-2737D.

Морфологические признаки. Размер 3-4 мм; форма округлая со светлым валиком по краю; воздушный мицелий белого цвета; споры светло-серые; профиль колонии выпуклый, вросший в агар; структура однородная.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С, оптимум роста 29°С и в диапазоне значений рН (5,0-10,0) с оптимумом роста при рН 6,8. Глюкозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет.

Использование источников углерода. В отличие от исходного штамма, хорошо утилизирует в высоких концентрациях такие источники углерода как, глюкозу и глицерин.

Антагонистические свойства Штамм S. hygroscopicus (R 33-41) ВКМ Ас-2737D при росте на агаровых средах умеренно угнетает рост патогенных дрожжей Candida albicans и некоторых дерматофитов (Microsporum gypseum и Trichophyton granulosum).

Отношение к антибиотикам В отличие от исходного штамма S. hygroscopicus АТСС 29253, штамм ВКМ Ac-2737D устойчив к повышенным концентрациям собственного антибиотика (МИК>1000 мкг/мл), к циклогексимиду (МИК>200 мг/мл) и амфотерицину (МИК 1.0 мкг/мл). По отношению к другим видам антибиотиков чувствительность штаммов оказалась одинаковой.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Агаризованная питательная среда

Для поддержания, хранения и приготовления посевного материала культуры используется агаризованная среда состава (г/л): агар-агар - 20.0, соевая мука - 1.0, растворимый крахмал - 10.0, сульфат магния - 1.0, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0.5, дистиллированная вода - до 1 л. рН - 6.8±0.1.

Вегетативная питательная среда

Приготовление посевного материала осуществляется на вегетативной среде следующего состава: соевая мука (г/л): соевая мука -21.0, L-лизин-6.0, дрожжевой экстракт - 6.0, глюкоза - 20.0, дистиллированная вода - до 1 л. рН 6.6±0.1.

Ферментационная питательная среда

В качестве исходной ферментационной среды использовали питательную среду следующего состава (г/л): хлопковая мука - 21.0, L-лизин - 15.0, NaCl - 5.0, глицерин - 10.0, глюкоза - 80.0, вода дистиллированная до 1 л. рН 6.8±0.1.

Хранение культуры

Штамм S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D хранят на агаризованной среде состава (г/л): агар-агар - 20.0, соевая мука - 1.0, растворимый крахмал - 10.0, сульфат магния - 1.0, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0.5, дистиллированная вода - до 1, рН - 6.8±0.1 не более трех месяцев при температуре около 5°С в холодильной камере. Для длительного хранения культуру лиофилизируют или хранят в жидком глицерине при -70°С.

Поддержание культуры

Культуру продуцента рапамицина поддерживают на агаризованной среде состава (г/л): агар-агар - 20.0, соевая мука - 1.0, растворимый крахмал - 10.0, сульфат магния - 1.0, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0.5, дистиллированная вода - до 1. рН- -6.8±0.1. Для поддержания уровня продуктивности культуры, перед каждым пересевом ее на свежие питательные среды, проводят моноспоровый рассев на чашки Петри.

Выращивание культуры продуцента в чашках Петри проводят в течение 10-12 суток при температуре 29°С.

Таким образом, создан новый штамм S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D, отличающийся от известного по характеру роста на диагностических агаровых средах, по степени усвоения источников углерода (глюкоза, глицерин), по отношению к антибиотикам и по продуктивности, которая во много раз превосходит продуктивность исходного штамма S. hygroscopicus АТСС 29253. Продуктивность нового штамма S. hygroscopicus ВКМ Ас-2737D, определенная методом ВЭЖХ составляет (655±5) мг/мл, что значительно превосходит продуктивность известных штаммов продуцентов рапамицина.

2. Следующим этапом работы было дальнейшее повышение продуктивности штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D. путем оптимизации состава питательной среды.

Получение штаммов с высоким уровнем биосинтеза антибиотических веществ зачастую сопровождается изменением требований не только к условиям культивирования, но и к составу питательных веществ и соотношению концентраций тех или иных компонентов индивидуально для каждого штамма.

Для того чтобы выяснить какие компоненты питательной среды и в каком количестве способствуют повышению продуктивности, был проведен ряд экспериментов по подбору оптимального состава жидкой питательной среды. Результаты оценивали по изменению продуцирующей способности штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D. Исследуемые компоненты добавляли в среду перед стерилизацией.

Так было проверено:

1. Влияние различных источников углерода на рост культуры S. hygroscopicus и уровень биосинтеза рапамицина

Установлено, что положительное влияние на биосинтез рапамицина оказывают глюкоза и глицерин. Было оценено влияние различных концентраций, дополнительно добавляемых в среду глюкозы или глицерина на биосинтез целевого соединения штаммом S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D. Максимальная продуктивность штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D была достигнута при дополнительном внесении глюкозы в количестве 20 г/л (общее содержание глюкозы в питательной среде составило 100 г/л) и составила 741±4 мг/л. Дальнейшее увеличение концентрации глюкозы в питательной среде ингибировало биосинтез целевого вещества. Дополнительное внесение в среду глицерина не привело к существенному повышению продуктивности штамма.

2. Влияние альтернативного источника органического азота

Хлопковая мука, входящая в состав исходной питательной среды, отличается высоким содержанием белка (45-50%), однако относится к дорогостоящим компонентам, в связи с чем, ее использование в процессе биосинтеза рапамицина экономически нецелесообразно.

Влияние источников органического азота на продуктивность штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D. оценивали относительно исходного компонента (хлопковой муки). Исследуемый диапазон концентраций составлял 20-40 г/л для различных видов муки и 1-15 г/л для пептонов и экстрактов. (Табл. 1)

Максимально положительный эффект на биосинтез рапамицина был выявлен в случае совместного использования соевой муки (30 г/л), соевого пептона (5 г/л) и дрожжевого экстракта (5 г/л). Максимальная концентрация рапамицина в культуральной жидкости на данном этапе оптимизации составила (792±5) мг/л.

* концентрация компонента, оказывающая максимально положительный эффект на биосинтез целевого вещества.

3. Влияние источников неорганического азота

Было изучено влияние неорганических источников азота на продуцирующую способность штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D. В качестве контрольной питательной среды использовали среду следующего состава (г/л): соевая мука (полножировая) - 30, соевый пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, L-лизин - 15, NaCl - 5, глицерин - 20, глюкоза - 100, дистиллированная вода - до 1 л. Для получения сред №1-15 к контрольной среде добавляли неорганические источники азота в концентрациях, указанных в Табл. 2.

Штамм S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D оказался не способен утилизировать мочевину (CH₄N₂O) и нитраты (KNO₃), но хорошо усваивал азот в виде солей аммония ((NH₄)₂SO₄, NH4Cl, C₆H₈O₇⋅2NH₃). При этом максимальное содержание рапамицина (835±6 мг/л) наблюдали при использовании сульфата аммония в концентрации 1 г/л.

4. Влияние макроэлементов

Авторы установили, что в период интенсивного роста (первые 48 ч) падение уровня рН ниже значения 5.5 негативно сказывается на накоплении биомассы и оказывает ингибирующее воздействие на биосинтез рапамицина.

В связи с этим было изучено влияние дополнительных количеств макроэлементов (фосфора, магния, калия, кальция) на поддержание рН среды и на биосинтез рапамицина в процессе культивирования. (Табл. 3)

В качестве контрольной питательной среды использовали среду следующего состава г/л: соевая мука (полножировая) - 30.0, соевый пептон -10.0, дрожжевой экстракт - 5.0, L-лизин - 15.0, NaCl - 5.0, (NH₄)₂SO₄ - 1.0, глицерин - 20.0, глюкоза - 100.0, дистиллированная вода - до 1 л.

Максимальная концентрация рапамицина в культуральной жидкости была отмечена при добавлении к исходной питательной среде Na₂HPO₄ (5 г/л) и MgSO₄ (1 г/л). При совместном внесении данных компонентов питательную среду содержание рапамицина к концу периода культивирования достигало 937±3 мг/л.

Проведенная оптимизация питательной среды для штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D позволила получить данные необходимые для разработки ферментационной среды следующего состава (г/л): соевая мука -36.2±0.2, лизин - 20.4±0.4, дрожжевой экстракт - 5.0±0.05, соевый пептон - 5.0±0.05, глюкоза - 85.2±0.2, хлорид натрия - 5.0±0.05, сульфат магния - 1.0±0.05, сульфат аммония - 1.0±0.05, натрий фосфорнокислый 2-замещенный -5.0±0.05, вода дистиллированная до 1 л (рН 6.8-6.9).

Заявляемые соотношения компонентов в этой ферментационной среде, найденные экспериментальным путем, являются оптимальными и позволяют при их использовании достичь к концу периода культивирования штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D содержания рапамицина (1215±5) мг/л.

3. Следующим этапом работы по повышению продуктивности штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D является оптимизация условий его культивирования. Основными параметрами условий культивирования штаммов являются температура процесса, рН среды, концентрация растворенного кислорода. Авторы проверили влияние данных параметров на биосинтез рапамицина с целью подбора оптимальных значений

А. Для проверки влиянии рН на биосинтез целевого продукта и определения его оптимальных значений проведен ряд ферментаций при различных рН среды. Поддержание заданных уровней рН производили в автоматическом режиме. Наилучшие показатели ферментации были достигнуты при уровне рН равном 6.8-7.0 (рис. 2, 3).

Б. Одним из важных факторов, влияющих на продуктивность биосинтеза микроорганизмами биологически активных веществ, в том числе и рапамицина, является содержание растворенного кислорода в ферментационной среде. В связи с этим были проведены эксперименты по оценке влияния различных концентраций растворенного кислорода на рост биомассы и продуктивности штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D в условиях автоматического контроля значения рН на уровне 6.8-7.0. Содержание растворенного кислорода в среде изменяли путем изменения оборотов перемешивающего устройства и изменения количества расходуемого в процессе ферментации воздуха. Наибольшая продуктивность по рапамицину и максимальный прирост биомассы были отмечены при концентрации растворенного кислорода 30% (рис. 4).

В. Изменения метаболизма мутантных штаммов, связанные с повышением их продуктивности, как правило, оказывают влияние на интенсивность потребления источников питательных веществ и возможность их усвоения. Так, высокопродуктивные штаммы обычно отличаются более интенсивным ростом, в связи, с чем нуждаются в более высокой концентрации питательных элементов (в первую очередь, углеводов) в среде.

К наиболее доступным для микроорганизмов источникам углерода в первую очередь следует отнести моно и дисахара. Авторами было показано, что оптимальным дополнительным источником углерода является глюкоза.

Непрерывную подачу 50% стерильного раствора глюкозы в ферментер осуществляли в автоматическом режиме при рН 6.8, начиная с 72 ч ферментации, в условиях поддержания рН и концентрации растворенного кислорода на ранее определенных оптимальных уровнях (6.8-7.0 и 30%, соответственно).

Добавление в ферментационную среду 50% раствора глюкозы в процессе ферментации обеспечило дополнительную стабилизацию рН среды культивирования за счет образования органических кислот в процессе метаболизма культуры и увеличило содержание сырой биомассы, тем самым позволив увеличить время активного синтеза рапамицина. Это положительно сказалось на накоплении рапамицина в культуральной жидкости, достигшем к 216 ч роста 1275±5 мг/л. Потребление глюкозы культурой в среднем, составило 10 г/л/сутки.

Таким образом, поддержание активной кислотности среды в процессе ферментации на оптимальном уровне (6.8-7.0), концентрации растворенного кислорода на уровне 30%, использование дополнительных количеств глюкозы в процессе ферментации в концентрации Юг/л в сутки позволило увеличить содержание рапамицина в культуральной жидкости с (1215±5) до (1275±5) мг/л.

Авторами проведено успешное масштабирование процесса биосинтеза и тем самым продемонстрирована возможность проведения процесса биосинтеза рапамицина с использованием штамма S. hygroscopicus ВКМ Ас-2737D в промышленном масштабе.

Технический результат предлагаемого изобретения состоит в получении высокопродуктивного штамма способного в специально разработанных для него условиях синтезировать рапамицин в промышленных масштабах с высоким выходом, составляющим 1275±5 мг/л.

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами:

Пример 1

Получение нового высокопродуктивного штамма культуры S. hygroscopicus

Мутагенез.

В качестве исходного штамма в работе использовали штамм Streptomyces hygroscopicus АТСС 29253.

В качестве мутагенного фактора были использованы УФ-лучи с длиной волны, 250-280 нм (лампа Mineralight, мощность 12.5 Вт).

Суспензию, полученную путем смыва с поверхности агаризованной среды и содержащую споры и обрывки мицелия, фильтровали через стерильный ватный фильтр или через фильтровальную воронку Шотта (размер пор 100 мкм). В полученной суспензии при помощи камеры Горяева-Тома подсчитывали концентрацию спор; при необходимости суспензию разводили до конечной концентрации (1.5-2)*10⁶ спор/мл. После подсчета и разведения суспензию подвергали облучению в открытой чашке Петри на расстоянии 40 см от лампы. Время экспозиции варьировало от 20 до 25 минут. Далее облученную суспензию в объеме 100-200 мкл переносили на твердую агаризованную среду и равномерно распределяли по ее поверхности. Культивирование проводили в течение 10-12 суток при температуре 29°С, после чего из развившихся колоний отбирали 20-50 морфологически измененных колоний.

Степень выживаемости колоний определяли по соотношению выросших колоний в необлученном контроле и после УФ-облучения. Эффективность мутагенеза определяли по количеству возникающих морфологически измененных колоний. Выросшие изолированные колонии повторно пересевали на агаризованную среду, затем культивировали в колбах с использованием питательной среды (ферментационной). Для предварительной оценки продуктивности отобранных изолятов использовали метод тонкослойной хроматографии. Изоляты, обладающие максимальной продуктивностью, пересевали и повторно подвергали УФ-облучению. Для определения содержания рапамицина в культуральной жидкости использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Продуктивность нового штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D, определенная методом ВЭЖХ составляла (655±5) мг/мл.

Пример 2

Идентификация исходного и полученного штаммов

Для генетической идентификации исходного АТСС 29253 и полученного ВКМ Ac-2737D штаммов S. hygroscopicus было проведено секвенирование штаммов и определена частичная последовательность амплификата гена (1472 bp), кодирующего 16S рРНК. Нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов для обоих образцов оказались идентичными между собой. Анализ полученной последовательности был проведен путем сравнения с аналогичными последовательностями, помещенными в базу данных GenBank (Табл. 4). Филогенетически наиболее близкими к исследованным образцам среди описанных образцов оказались штаммы S. hygroscopicus АТСС 14891 и S. sp. 219847. Уровень сходства последовательностей исследуемых образцов с указанными штаммами составил 99.3% и 98.0%, соответственно. Согласно современным стандартам, обнаруженный уровень сходства последовательностей 16S рРНК позволяет отнести изучаемый штамм к роду Streptomyces hygroscopicus.

Пример 3

Определение устойчивости к антибиотикам

Для определения чувствительности штамма ВКМ Ac-2737D к различным видам антибиотиков использовали метод серийных разведений в плотных средах. Для этого подготавливали тройные серийные разведения препаратов в различных концентрациях и по 1 мл каждого разведения вносили в пробирки, содержащие по 20 мл охлажденной до 45°С среды R₁ и тщательно перемешивали. Содержимое пробирок переносили в чашки Петри и оставляли до полного застывания, после чего засевали исследуемыми штаммами S. hygroscopicus, производя сплошной посев петлей либо внося по 100-200 мкл предварительно подготовленной суспензии, и культивировали при 29°С в течение 10-12 суток. После инкубации определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) по отсутствию роста на чашках, содержащих наименьшую концентрацию препарата. Штамм ВКМ Ac-2737D устойчив к повышенным концентрациям собственного антибиотика (МИК>1000 мкг/мл), к циклогексимиду (МИК>200 мг/мл) и амфотерицину (МИК 1.0 мкг/мл) (Табл. 5).

Пример 4

Биосинтез рапамицина в биореакторе объемом 15 литров в режиме регистрации основных технологических и биохимических параметров.

Подготовка посевного материала.

Для приготовления посевного материала в чашках Петри используют агаризованную среду состава г/л: агар-агар - 20.0, соевая мука - 1.0, растворимый крахмал - 10.0, сульфат магния - 1.0, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0.5, дистиллированная вода - до 1 л, рН - 6.8±0.1.

Проверенную агаризованную среду засевают мицелием исходной рабочей культуры, полученной моноспоровым рассевом, и выдерживают в термостате от 10 до 12 суток, при температуре 29°С.

Выращивание посевного материала 1 генерации.

Выращивание посевного материала в колбах проводят в одну стадию (маточные колбы) на вегетативной среде следующего состава, (г/л): соевая мука -21.0, L-лизин-6.0, дрожжевой экстракт - 6.0, глюкоза - 20.0, дистиллированная вода - до 1 л. рН 6.6±0.1. Культивирование осуществляют при 29°С в течение 48 часов на термостатируемой качал очной установке при 230-250 об/мин (эксцентриситет 5 см). При микроскопии наблюдается негустая базофильная сетка, протоплазма в гифах дифференцирована.

Биосинтез рапамицина.

Выросший посевной материал в объеме 1.0 л засевали в 15-л ферментационную установку. Ферментацию проводили на среде следующего состава (г/л): соевая мука - 36.2, лизин - 20.4, дрожжевой экстракт - 5.0, соевый пептон - 5.0, глюкоза - 85.2, хлорид натрия - 5.0, сульфат магния - 1.0, сульфат аммония - 1.0, натрий фосфорнокислый 2-замещенный - 5.0, вода дистиллированная до 1 л (рН 6.8-6.9).

Общий объем среды в ферментере - 10 л. Выращивание штамма-продуцента в ферментере ведут при следующих условиях: температура (29±1)°С; аэрация 5 л/мин от 0 до 48 часов роста от 48 часов роста до конца ферментации - 10 л/мин; давление от 0,05 до 0,08 Мпа; обороты перемешивающего устройства 200-500 об/мин.

Начиная с 72 часов, ведут контроль содержания рапамицина методом ВЭЖХ. В качестве стандарта используют образец антибиотика с содержанием рапамицина 96% (SIGMA). Время ферментации - (216±24) часа. Параметры культуральной жидкости на момент окончания процесса биосинтеза: - посторонняя микрофлора - отсутствует; - микроскопическая картина - ветвящиеся гифы, собранные в плотные колонии; протоплазма в гифах дифференцирована; содержание рапамицина не менее 1220 мг/мл (ВЭЖХ).

Пример 5. Продуктивность штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D на ферментационной среде с добавлением дополнительного источника углерода.

Биосинтез осуществляют аналогично примеру 4, а с 72 ч ферментации начинают непрерывную подачу 50% стерильного раствора глюкозы в биореактор в автоматическом режиме, в условиях поддержания рН и концентрации растворенного кислорода на ранее определенных оптимальных уровнях (6.8-7.0 и 30%, соответственно).

Параметры культуральной жидкости на момент окончания процесса биосинтеза: - посторонняя микрофлора - отсутствует; - микроскопическая картина - ветвящиеся короткие гифы, колонии округлой формы, протоплазма в гифах дифференцирована; - содержание рапамицина не менее 1270 мг/мл (ВЭЖХ).

1. Штамм S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D - продуцент антибиотика рапамицина.

2. Способ увеличения продуктивности штамма продуцента антибиотика рапамицина рода S. hygroscopicus путем использования для его культивирования водной питательной среды, содержащей один или более источников углерода, азота, ионов металлов в виде растворимых солей, с дополнительной подачей источника углерода в течение продуктивной стадии, отличающийся тем, что биосинтез проводят с использованием штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D в среде с pH 6.8-7.0 и температурой 29±1°C, содержащей 30% кислорода и глюкозу в качестве дополнительного источника углерода, имеющей следующий состав, г/л:

соевая мука	36,2±0.2
лизин	20.4±0,4
дрожжевой экстракт	5.0±0,05
соевый пептон	5.0±0,05
глюкоза	85.2±0,2
хлорид натрия	5.0±0,05
сульфат магния	1.0±0,05
сульфат аммония	1.0±0,05
натрий фосфорнокислый 2-замещенный	5.0±0,05
вода дистиллированная	до 1 л

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что глюкозу в качестве дополнительного источника углерода вносят, начиная с 72-го часа биосинтеза.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что количество дополнительно вносимой глюкозы составляет 10 г/л в сутки.

5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что позволяет увеличить продуктивность штамма S. hygroscopicus ВКМ Ac-2737D до 1275±5 мг/л.