Способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения стволовых клеток (СК) из зуба. Способ включает заполнение внутренней полости отделенного зуба через апикальную часть его корневого канала 0,1-0,4% раствором коллагеназы и выдерживание в диапазоне от примерно 25°С до примерно 39°С в течение 20-120 минут. Далее содержимое внутренних полостей зуба собирают, центрифугируют, после чего удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования мезенхимных СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования. Изобретение позволяет упростить получение СК из зуба. 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

 

В последнее время стволовые клетки стали широко применять в регенеративной медицине. В качестве безопасного и эффективного средства используют мезенхимные стволовые клетки (МСК), которые, с одной стороны, обладают рядом полезных свойств, а с другой стороны относительно доступны для культивирования в любой современной лаборатории. Источниками МСК традиционно являются костный мозг, жировая ткань, пуповинная кровь, пупочный канатик, реже эндометрий и периферическая кровь. Способы получения МСК из этих источников имеют существенные недостатки, такие как инвазивность, малая доступность сырья и т.п., поэтому проблема поиска источника для неинвазивного и надежного способа получения стволовых клеток по-прежнему актуальна.

В последнее время привлекательным источником стволовых клеток (СК) стала пульпа зубов. Стволовые клетки пульпы зуба (СКП) - постнатальные эктодермальные стволовые клетки, происходящие из мигрирующих клеток нервного гребня. Несмотря на эктодермальное происхождение, СКП обладают свойствами мезенхимных стволовых клеток: фибробластоподобной морфологией, характерным набором поверхностных маркеров, способностью адгезировать к пластиковой подложке. Способны они и к дифференцировке в адипогенном (жировая ткань), хондрогенном (хрящевая ткань), остеогенном (костная ткань) направлениях. СКП способны к дифференцировке в одонтобласты: небольшие клетки полярного строения, участвующие в образовании дентина, имеющие клеточное тело и очень длинный отросток, который располагается в дентинной трубочке и распространяется на всю длину дентина, немного выходя в эмаль. Способность СКП дифференцироваться в преостеоциты, одонтобласты, прехондроциты делает их пригодными для использования в регенеративной терапии не менее эффективно, чем МСК.

Заготовка СКП может производиться как из экстрагированных в стоматологической клинике постоянных и молочных зубов, так и из молочных зубов, выпавших естественным путем. В последнем случае процесс извлечения СК клеток из организма пациента очень удачно совпадает с естественными процессами взросления организма.

Существуют способы извлечения пульпы зуба, при которых коронку зуба раскалывают, пульпу отделяют механически и в дальнейшем получают из нее культуру СК. Все эти способы требуют специального дорогостоящего стоматологического оборудования, а также навыков для его использования и соответствующей квалификации сотрудников. Стандартная лаборатория для культивирования клеток не располагает ни подобным оборудованием, ни персоналом для его использования. В случае, когда источником СК являются молочные зубы, выпавшие в домашних условиях или вдали от стоматологических учреждений, такие способы извлечения пульпы зуба представляются тем более малопригодными.

Существуют способы извлечения пульпы зуба без раскалывания зубной коронки.

В статье: , Soukup Т, , , , , et al. Human dental pulp stem cells - isolation and long term cultivation. Acta Medica (Hradec Kralove) 2007; 50:195e201 описан способ извлечения пульпы зуба для получения культуры СК, при котором интактные зубы транспортировали в сбалансированном солевом растворе Хэнкса в лабораторию. В лаборатории с помощью щипцов Луера разрушали корни зуба, чтобы проникнуть в корневые каналы. Если корни были еще недостаточно развиты, и апикальное отверстие было достаточно широким, использовали острую иглу для механического извлечения зубной пульпы. Если отверстие было узким, для механического извлечения пульпы использовали экстирпационную иглу. Описанный способ требует специального оборудования и инструментов для разрушения корней зуба и механического извлечения пульпы. В обычной лаборатории для культивирования клеток нет такого оборудования, а проведение подобного вскрытия корней требует специальных навыков. В противном случае, возможна утрата биологического материала. Кроме того, описанный способ рассчитан на извлечение пульпы из зубов с широкими, открытыми зубными каналами, в частности, из 3-х моляров. Описанный способ не применим к более мелким зубам, резцам, клыкам, особенно тем, которые имеют узкие и/или извитые каналы.

В статье: , , , , , Santibanez JF, , Bugarski D. Mesenchymal Stem Cell Properties of Dental Pulp Cells from Deciduous Teeth. Arch. Biol. Sci., Belgrade, 2011; 63(4):933-942 описан способ извлечения пульпы зуба для получения культуры СК, при котором молочные зубы извлекали под местной анестезией, пульпу отделяли от зубной коронки соответствующим инструментом (черпалка, excavator). В дальнейшем извлеченную пульпу помещали в модифицированную Дюльбекко среду Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров (FBS) для транспортировки в лабораторию. Центрифугировали материал 10 мин при 1800 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, ткани пульпы выдерживали 45 минут при 37°С в 0,3% растворе коллагеназы I типа в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 20% FBS. Затем в клеточную суспензию добавляли PBS с 2% FBS, центрифугировали 10 мин при 1800 об/мин и подсчитывали количество живых клеток с помощью окрашивания трипановым синим. Клетки, полученные из одного зуба, помещали в культуральные флаконы, и инкубировали в среде, содержащей DMEM, 20% FBS, 200 мкМ 2-фосфата L-аскорбиновой кислоты, 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина при 37°С во влажной атмосфере с 5% CO₂. Описанный способ требует специальных инструментов для механического извлечения пульпы. Способ рассчитан на извлечение пульпы из зубов с широкими, открытыми зубными каналами. Он не пригоден для извлечения пульпы из зубов, которые имеют узкие и/или извитые каналы. Данный способ является наиболее близким к заявляемому изобретению и выбран в качестве прототипа.

Задачей настоящего изобретения является создание способа извлечения пульпы зуба для получения культуры СК, при котором используются инструменты, имеющиеся в стандартной лаборатории для культивирования клеток, без применения специального стоматологического оборудования для извлечения пульпы, без разрушения коронки зуба.

Поставленная задача решается тем, что в способе извлечения пульпы зуба для получения культуры СК внутренние полости отделенного зуба заполняют через апикальную часть его корневых каналов 0,1-0,4% раствором коллагеназы и выдерживают при температуре в диапазоне от примерно 25°С до примерно 39°С в течение 20-120 минут. После этого содержимое внутренних полостей зуба собирают, центрифугируют, после чего удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования. Далее СК культивируют известным способом культивирования мезенхимных СК. Здесь и далее под внутренними полостями зуба мы понимаем пульпарную камеру, корневые каналы и другие полости зуба, заполненные мягкими тканями и окруженные твердым материалом зуба. При осуществлении настоящего способа можно использовать зуб, отделенный из полости рта любым доступным способом, как в результате экстракции, так и выпавший естественным путем.

В отличие от прототипа в заявляемом способе извлечения пульпы зуба для получения культуры СК проводят извлечение пульпы из зуба не механическим, а ферментативным способом. Во время выдерживания зуба, заполненного 0,1-0,4% раствором коллагеназы, происходит ферментативное разрушение соединительной ткани, удерживающей клетки и ткани пульпы внутри пульпарной камеры и корневых каналов зуба, клетки переходят в суспензию из прикрепленного состояния. При этом не требуется разрушения коронки либо корней зуба, поскольку раствор коллагеназы подается через открытое отверстие в апикальной части корня зуба.

При последующем сборе жидкости из внутренних полостей зуба выходят практически все клетки и кусочки ткани пульпы. При осуществлении настоящего способа клетки и ткани пульпы отделяются от зубной коронки не механически, а ферментативно, и извлекаются после этого без использования специального оборудования для вскрытия и разрушения зубной коронки или для вычерпывания пульпы. Кроме того, при осуществлении этого способа возможно извлечение пульпы из зубов, которые имеют узкие или извитые каналы, для которых невозможно осуществить механическое вычерпывание пульпы без разрушения коронки зуба.

В одном из вариантов осуществления способа зуб после заполнения внутренних полостей раствором коллагеназы полностью помещают в 0,1-0,4% раствор коллагеназы. Это обеспечивает дополнительный эффект увлажнения, препятствуя высыханию наружных поверхностей зуба. В другом варианте осуществления способа зуб после заполнения пульпарной камеры и корневых каналов раствором коллагеназы выдерживают в упомянутых условиях при помешивании, независимо от того, помещен он в раствор коллагеназы или нет. Это дает дополнительный эффект перемешивания содержимого внутренних полостей и увеличивает эффективность ферментативного разрушения соединительных тканей и следовательно отделения пульпы от твердых тканей зуба.

Заполнение внутренних полостей зуба раствором коллагеназы производят любым известным способом подачи жидкости, например, при помощи шприца с иглой, вводя ее в корневой канал зуба с апикальной стороны, при этом предполагается, что канал зуба открыт в результате естественного процесса резорбции корня молочного зуба, либо в результате механического разрушения корня зуба, либо апикальное отверстие корня зуба достаточно широко для подачи жидкости.

В одном из вариантов осуществления изобретения внутренние полости зуба предварительно промывают 0,1-0,4% раствором коллагеназы через апикальную часть его корневого канала, собирают прошедший через внутренние полости зуба раствор, центрифугируют его, удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования мезенхимных СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования. Далее СК культивируют известным способом культивирования мезенхимных СК. При этом после предварительного промывания внутренних полостей зуба 0,1-0,4% раствором коллагеназы, отдельные клетки и кусочки ткани пульпы отрываются и вымываются током жидкости, обеспечивая дополнительный выход тканей пульпы. Кроме того, наиболее легко отделяемые ткани пульпы при этом не подвергаются длительному воздействию раствора коллагеназы, что дополнительно обеспечивает сохранность этих клеток. Промывание внутренних полостей зуба раствором коллагеназы производят любым известным способом подачи жидкости, например, при помощи шприца с иглой, вводя ее в корневой канал зуба с апикальной стороны, при этом предполагается, что канал зуба открыт в результате естественного процесса резорбции корня молочного зуба, либо в результате механического разрушения корня зуба, либо апикальное отверстие корня зуба достаточно широко для подачи жидкости.

Сбор содержимого внутренних полостей зуба производят любым доступным способом удаления жидкостей, например, промывая пульпарную камеру и корневые каналы зуба током жидкости, продувая камеру током газа, например, воздуха, либо центрифугируя зуб, сориентировав его в пробирке таким образом, чтобы центробежная сила была направлена от пульпарной камеры к апикальным отверстиям корней. В одном из вариантов осуществления изобретения, чтобы собрать содержимое внутренних полостей зуба, их промывают сбалансированным солевым раствором, подавая его через апикальную часть корневого канала зуба, затем собирают всю жидкость, прошедшую через внутренние полости зуба, центрифугируют ее, после чего надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования. Далее СК культивируют известным способом культивирования мезенхимных СК.

Вместо тока жидкости возможно использовать ток газа. При этом внутренние полости через апикальную часть корневых каналов зуба продувают любым доступным газом, например воздухом, собирают извлеченную из внутренних полостей жидкость, и далее центрифугируют ее, после чего надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования.

Также содержимое внутренних полостей зуба можно собирать центрифугированием - разместить зуб в пробирке для центрифугирования, сориентировав его таким образом, чтобы центробежная сила была направлена от пульпарной камеры к апикальным отверстиям корней. При этом дополнительно осаждается клеточный материал, и таким образом одновременно осуществляются этапы сбора содержимого и его центрифугирования. После такого центрифугирования зуб и надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования.

При необходимости допускается отламывание корней зуба для получения доступа к корневому каналу, в случае если апикальное отверстие корня зуба закрыто или очень мало. Упомянутое отламывание не требует специального оборудования и легко производится в условиях лаборатории для культивирования клеток при помощи любого подходящего инструмента, например, педикюрных кусачек, ножниц для стрижки когтей животных, и т.п.

Активность коллагеназы зависит от температуры реакционной смеси. Обычно диссоциацию ткани растворами ферментов проводят при 37°С, что оптимально для активности используемых протеолитических ферментов, однако эта процедура осуществима и при комнатной температуре [Wittenberg В.A., Robinson Т.F. Oxygen requirements, morphology, cell coat and membrane permeability of calcium tolerant myocytes from hearts of adult rats // Cell Tissue Res. 1981. Vol. 216. P. 231-251; Frangakis C. Bahl J. McDaniel H., Bressler R. Tolerance to physiological calcium by isolated myocytes from the adult rat heart; an improved cellular preparation // Life Sci. 1980. Vol. 27. P. 815-825]. Поэтому в заявляемом изобретении выдерживание в 0,2% растворе коллагеназы проводят при температуре не ниже 25°С. Повышение температуры оказывает влияние на скорость ферментативной реакции в результате влияния температуры на любую химическую реакцию. С повышением температуры ускоряется движение молекул, что приводит к повышению вероятности взаимодействия реагирующих веществ. Кроме того, температура может повышать энергию реагирующих молекул, что также приводит к ускорению реакции. Однако скорость химической реакции, катализируемая ферментами, имеет свой температурный оптимум, превышение которого сопровождается понижением ферментативной активности, возникающим из-за термической денатурации белковой молекулы [Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с. ISBN 5-9231-0254-4]. Для коллагеназы оптимальна температура 37-38°С. При повышении температуры скорость реакции замедляется, однако верхняя граница температуры в заявляемом изобретении определяется температурной толерантностью получаемых из пульпы зуба клеток. СК при температуре выше 39°С претерпевают изменения, связанные с тепловым шоком. Поэтому в заявляемом изобретении выдерживание в 0,1-0,4% растворе коллагеназы проводят при температуре не выше 39°С.

Описанная в заявляемом способе последовательность операций обработки зуба, выбранные режимы и вещества, используемые при этом, обеспечивают решение поставленной задачи.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

На Фиг. 1 представлен общий вид культуры стволовых клеток пульпы зуба, полученных, как описано в примере 1.

На Фиг. 2 представлен общий вид культуры стволовых клеток пульпы зуба, полученных, как описано в примере 2.

На Фиг. 3 представлен общий вид культуры стволовых клеток пульпы зуба, полученных, как описано в примере 4.

На Фиг. 4 представлена таблица сравнения иммунофенотипов СК пульпы зуба и мезенхимных стволовых клеток.

Способ осуществляли следующим образом.

Пример 1. Зуб 54 по принятой в России классификации ВОЗ с сохранной пульпой, соблюдая условия асептики, помещали в пробирку, содержащую 5 мл транспортировочной среды, состоящей из физиологического раствора с антибиотиками. Образец в среде помещали в изотермический контейнер при комнатной температуре и транспортировали в лабораторию.

Тщательно промывали зуб сбалансированным солевым раствором, например раствором PBS, для удаления крови. Помещали образец на чашку Петри диаметром 10 см. Отбирали всю лишнюю жидкость из чашки Петри. Промывали при помощи шприца с иглой внутренние полости зуба 0,2% раствором коллагеназы в PBS, вводя его в отверстие корневого канала в апикальной части корня зуба, вымывая оттуда содержимое внутренних полостей зуба. Собирали раствор после промывки, помещали в коническую центрифужную пробирку и центрифугировали, например, на центрифуге СМ-6М (Elmi, Латвия) при 1100 об/мин в течение 7 минут.

Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в 10 мл питательной среды, например, среды Advanced Stem Cell Media (HyClone, Германия) с добавлением 20% фетальной коровьей сыворотки для СК или заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells (HyClone, Германия) и 10 мкг/мл раствора пенициллина-стрептомицина (HyClone, Германия). Помещали суспензию клеток в культуральный флакон площадью 25 см². Помещали флаконы в CO₂-инкубатор, например, BBD 6220 (Thermo, Германия) при температуре 37°С, время экспозиции 3-5 суток в зависимости от состояния клеток. Далее СК культивировали известным способом культивирования мезенхимных СК.

Внутренние полости промытого образца зуба заполняли свежим 0,2% раствором коллагеназы при помощи шприца с иглой, вводя его в отверстие корневого канала в апикальной части корня зуба, помещали в центрифужную пробирку, добавляли 1 мл раствора коллагеназы. Помещали пробирку с образцом в шейкер-инкубатор, например, ES-20 (Biosan, Латвия), при температуре 37°С и помешивании со скоростью 90 об/мин, и выдерживали в течение 30 минут. Затем промывали внутренние полости зуба при помощи шприца с иглой раствором, например фосфатно-солевым раствором, вымывая оттуда содержимое внутренних полостей зуба. Собирали полученную жидкость, помещали в коническую центрифужную пробирку и центрифугировали при 1100 об/мин в течение 7 минут.

Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в 10 мл вышеупомянутой питательной среды. Помещали суспензию клеток на флакон площадью 25 см². Помещали флаконы в CO₂-инкубатор, например, BBD 6220 (Thermo, Германия) при температуре 37°С, время экспозиции 3-5 суток в зависимости от состояния клеток. Далее СК культивировали известным способом культивирования мезенхимных СК. В результате получена однородная клеточная культура, представленная фибробластоподобными адгезивными клетками, как показано на Фиг. 1а. Иммунофенотип полученных клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием цитометра, например FC500 (Beckman Coulter, США). Клетки прижизненно окрашивали антителами к поверхностным маркерам CD90, CD105, CD73, CD10, CD44, CD45, CD34, CD117, CD14. Для каждой из исследуемых популяций клеток определяли количество окрашенных клеток и среднюю интенсивность флюоресценции. Процентное соотношение клеток, несущих определенный фенотип относительно общего количества клеток, представлено на Фиг. 4 и соответствует иммунофенотипу мезенхимных СК. Таким образом, СК из пульпы зуба, извлеченной с помощью настоящего способа, имеют иммунофенотип мезенхимных СК.

Пример 2. Извлечение пульпы зуба для получения культуры СК проводили по схеме, приведенной в примере №1, отличающейся тем, что для извлечения пульпы брали зуб 12 по принятой в России классификации ВОЗ, а также выдерживание проводили в 0,4% растворе коллагеназы в течение 20 минут.

Пример 3. Извлечение пульпы зуба для получения культуры СК проводили по схеме, приведенной в примере №1, отличающейся тем, что для извлечения пульпы брали зуб 28 по принятой в России классификации ВОЗ, а также отламывали кончик корня зуба при помощи педикюрных кусачек.

Пример 4. Извлечение пульпы зуба для получения культуры СК проводили по схеме, приведенной в примере №1, отличающейся тем, что для извлечения пульпы брали зуб 75 по принятой в России классификации ВОЗ, а также выдерживание проводили в 0,1% растворе коллагеназы в течение 120 минут.

Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток» на предмет выдачи патента РФ на изобретение.

1. Способ получения стволовых клеток (СК) из зуба, при котором внутренние полости отделенного зуба заполняют через апикальную часть его корневого канала 0,1-0,4% раствором коллагеназы и выдерживают при температуре в диапазоне от примерно 25°С до примерно 39°С в течение 20-120 минут, затем содержимое внутренних полостей зуба собирают, центрифугируют, после чего удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования мезенхимных СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования.

2. Способ по п. 1, при котором заполненный раствором коллагеназы зуб помещают в 0,1-0,4% раствор коллагеназы.

3. Способ по п. 1, при котором выдерживание заполненного раствором коллагеназы зуба производят при помешивании.

4. Способ по п. 1, при котором заполнение внутренних полостей зуба раствором коллагеназы производят при помощи шприца с иглой, вводя ее в апикальную часть корневого канала зуба.

5. Способ по п. 1, при котором внутренние полости экстрагированного зуба предварительно промывают 0,1-0,4% раствором коллагеназы через апикальную часть его корневого канала, собирают прошедший через внутренние полости зуба раствор, центрифугируют его, удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования мезенхимных СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования.

6. Способ по п. 5, при котором внутренние полости зуба промывают при помощи шприца с иглой, вводя ее в апикальную часть корневого канала зуба.