Способ оценки генетической полноценности сперматозоидов

Авторы патента:

Трофимов Владимир Александрович (RU)

G01N33/52 - использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги

G01N2800/367 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2679312:

Общество с ограниченной ответственностью "Генетико-селекционный исследовательский центр "Генология-МГУ" (RU)

Изобретение относится к области ветеринарии и животноводства и может быть использовано при искусственном осеменении для выявления генетически неполноценных сперматозоидов, их выбраковки и недопустимости использования для искусственного осеменения. Изобретение представляет собой способ оценки генетической полноценности сперматозоидов, включающий использование пробы эякулята in vitro в среде для разбавления, отличающийся тем, что в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в концентрации 0,5-1,0 ммоль с последующей инкубацией при 37°С в течение 5-10 мин и регистрацией интенсивности флуоресценции с максимумом 495 нм, при интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми, генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считают генетически неполноценными. Изобретение позволяет повысить эффективность оценки генетической полноценности сперматозоидов для определения целесообразности дальнейшего их использования при искусственном осеменении.

Оценку качества спермы проводят по органолептическим признакам, концентрации, подвижности и переживаемости сперматозоидов, наличию морфологических отклонений, осмотической резистентности, устойчивости (толерантности) к холодовому и другим видам стресса, содержанию высокоэнергетических молекул, активности дегидрогеназ и гидролаз (гиалуронидазы, акрозина и другие), суммарной антиокислительной активности, фрагментации (целостности) окрашенного хроматина/ДНК сперматозоидов путем измерения размера гало, метилированию ДНК и др. [1-5].

Основная задача в оценке физиологического статуса клеток, связанного с характеристикой жизнеспособности и функциональной активности, заключается в выборе интегрального показателя, характеризующего состояние метаболизма, антиоксидантной, репарационной и других функциональных систем клетки. Для сперматозоидов с различным уровнем функциональной активности таким интегральным показателем может выступать способность связываться с гиалуроновой кислотой. Известно, что с гиалуроновой кислотой связываются лишь зрелые, функционально активные сперматозоиды, имеющие специфические рецепторы к ее остаткам [6].

Гиалуроновая кислота - природное соединение, которое получают из соединительной ткани животных или с помощью специальных бактерий и используют в свободном или связанном виде. Известна флуоресцентная форма гиалуроновой кислоты, представляющая собой гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином (Hyaluronate fluorescein, Sigma):

Для гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, характерно возбуждение Е_х при длине волны 470 нм и эмиссии E_m при 494-518 нм. Гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином, вследствие высокой аффинности рецепторов гиалуроновой кислоты в метастазирущих клетках используется для связывания и выявления клеток злокачественной мезотелиомы у человека. Показано, что рецепторы гиалуроновой кислоты экспрессируются только на клетках злокачественной мезотелиомы, но не на нормальных мезотелиальных клетках [7].

Гиалуроновая кислота с флуоресцентной меткой обладает слабой и быстро гаснущей флуоресценцией. При воздействии гиалуронидазы, расщепляющей гиалуроновую кислоту и в результате этого снижающей миграцию энергии между молекулами флуоресцеина, флуоресценция пробы, содержащей клетки и гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, возрастает [8].

Таким образом, применение гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, с целью связывания с наружной поверхностью мембраны сперматозоида, содержащей экспонированные рецепторы к гиалуроновой кислоте, является обоснованным и может выступать в качестве эффективного приема для оценки генетической полноценности и функциональной зрелости сперматозоидов на молекулярном уровне как способа молекулярной и клеточной диагностики.

Известен способ оценки генетической полноценности сперматозоидов, в котором применен комплексный подход для оценки генетической полноценности сперматозоидов, основанный на определении риска окислительных модификаций ДНК, образовании сшивок, фрагментация хроматина, обусловленных высоким уровнем свободнорадикальных процессов, включая перекисное окисление липидов и образование активных форм кислорода, запуск процессов апоптоза в сперматозоидах [9].

Однако молекулярно-генетические исследования, несмотря на максимальную точность результатов, требуют применения сложной и дорогостоящей аппаратуры и не могут быть воспроизведены в зоотехнических и ветеринарных лабораториях.

Технический результат заключается в повышении эффективности оценки генетической полноценности сперматозоидов для определения целесообразности дальнейшего их использования при искусственном осеменении.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе оценки генетической полноценности сперматозоидов, в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в концентрации 0,5-1,0 ммоль с последующей инкубацией при 37°С в течение 5-10 мин и регистрацией интенсивности флуоресценции с максимумом при 495 нм, при интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми и генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считаются генетически неполноценными

Способ осуществляется следующим образом. Полученный препарат спермы разбавляют в среде для разбавления с рН 6,8-7,2, которая может быть либо лактозо-желточно-глицериновой, либо глюкозо-хелатоцитратной, либо другой, рекомендованной производителями до концентрации 1-5 млн. клеток в 1 мл. Полученный препарат спетматозоидов делят на две равные части. Одну пробу оставляют в нативном состоянии (контроль), а ко второйдобавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в конечной концентрации 0,5-1,0 ммоль. Пробы инкубируют при 37°С в течение 5-10 мин и регистрируют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения с максимумом при 470 нм и эмиссии E_m при 495 нм. При интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми и генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считают генетически неполноценными. При интенсивности флуоресценции пробы в пределах 36-49 а.u. сперматозоиды также пригодны для искусственного осеменения, как и сперматозоиды первой группы, однако при этом возрастает риск наличия у них структурно-функциональных нарушений. Оценку генетической полноценности сперматозоидов проводят при температуре 37°С, выявляя в сперматозоидах полученных образцов с помощью комплекса методик структурные изменения ядра и хроматина, модификации ДНК. При анализе генетической полноценности сперматозоидов используются методики морфологической оценки структурного состояния ядра и хроматина с помощью флуоресцентного ядерного красителя Hoechst 33258 и пропидиума иодида, определяется фрагментация ДНК методом Гало и с помощью флуоресцентного красителя акридинового оранжевого, анализируется интенсивность перекисного окисления липидов с помощью ТБК-теста [10-12].

Генетически полноценные сперматозоиды не имеют патологических аномалий и дефектов, характеризуются отсутствием или слабой степенью агглютинации, слабой склонностью к апоптозу (не более 10-15%), отсутствием разрывов в ДНК, ярким и выраженным свечением Гало, низким уровнем содержания ТБК-реактивных продуктов (0,24±0,05 мкМоль/л). Генетически неполноценные сперматозоиды могут иметь патологические аномалии и дефекты, склонны к индуцированному или спонтанному апоптозу, имеют высокую частоту встречаемости одноцепочечных разрывов в ДНК и менее яркое и выраженное свечение Гало, а также высокий уровень ТБК-реактивных продуктов, чем генетически полноценные сперматозоиды.

При выявлении высокой интенсивности флуоресценции до 50-60 а.u. сперматозоиды оценивают как генетически полноценные, характеризующиеся высоким уровнем жизнеспособности клеток с низким апоптотическим индексом, рассчитываемым как соотношение числа клеток в состоянии апоптоза к 100 клеткам в % (ниже 80%), отсутствием одноцепочечных разрывов хроматина, с низким содержанием ТБК-реактивных продуктов (0,24±0,05 мкМоль/л), отсутствием внеклеточной ДНК и обладающие максимальным оплодотворяющим потенциалом. В случае если интенсивность флуоресценции пробы будет иметь величину ниже 30-35 а.u., это характеризует сперматозоиды как функционально малоактивные, имеющие высокий уровень запущенности программы апоптоза, фрагментированности ДНК, модификации белков, липидов и ДНК продуктами свободнорадикального окисления, включая перекисное окисление липидов, что свидетельствует о наличии генетических дефектов и неполноценности сперматозоидов. При интенсивности флуоресценции пробы в пределах 36-49 а.u. сперматозоиды также пригодны для искусственного осеменения, как и сперматозоиды первой группы, однако при этом возрастает риск наличия у них структурно-функциональных нарушений.

По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет повысить эффективность оценки генетической полноценности сперматозоидов для определения целесообразности дальнейшего их использования при искусственном осеменении.

Источники информации:

1. ABS Global, Inc. Руководство по искусственному осеменению. Пятое издание, 2002.

2. Руководство ВОЗ для лабораторного исследования и обработки человеческой спермы, 2010.

3. Muriel L., Rivero M.T., Goyanes V., et al. // The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation // J. Androl., 2003; 24: 59-66.

4. WO 2009059327, G01N 33/48, 30 December, 2009.

5. RU 2278382, МПК G01N 33/487, опубл. 20.06.2006.

6. Husar G., Ozensi C.C., Cayli S. et al. Hyaluronic acid binding by human sperm indicates cellular maturity, viability, and unreacted acrosomal status. Fertil Steril 2003; 79 Suppl 3: 1616-24.

7. Asplund Т., Heldin P. Hyaluronan receptors are expressed on human malignant mesothelioma cells but not on normal mesothelial cells. Cancer Res. 1994 Aug 15; 54(16): 4516-23.

8. Fudala R., Mummert M.E., Gryczynski Z., Rich R., Borejdo J., Gryczynski I. Lifetime-based sensing of the hyaluronidase using fluorescein labeled hyaluronic acid. J. Photochem Photobiol B. 2012. Jan 5; 106:69-73.

9. RU 2568845, МПК G01N 33/48, опубл. 20.11.2015.

10. Mikhailenko V.M., Philchenkov A.A. Analysis of 1H NMR-detectable mobile lipid domains for assessment of apoptosis induced by inhibitors of DNA synthesis and replication // Cell Biology International, 2005, 29, 33-39.

11. Fernandez J.L. The Sperm Chromatin Dispersion Test: A Simple Method for the Determination of Sperm DNA Fragmentation // Journal of Andrology. Volume 24, Issue 1, January-February, 2003, pages 59-66.

12. Janero D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury // Free Radical Biology and Medicine. Volume 9, Issue 6, 1990, Pages 515-540.

Способ оценки генетической полноценности сперматозоидов, включающий использование пробы эякулята in vitro в среде для разбавления, отличающийся тем, что в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в концентрации 0,5-1,0 ммоль с последующей инкубацией при 37°С в течение 5-10 мин и регистрацией интенсивности флуоресценции с максимумом 495 нм, при интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми, генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считают генетически неполноценными.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу детекции последовательности нуклеотидов при проведении полимеразной цепной реакции. Раскрыт способ детекции специфических нуклеотидных последовательностей с помощью ПЦР в реальном времени, включающий приготовление реакционной смеси, при этом прямой праймер имеет в своем составе с 3' конца участок, комплементарный детектируемой нуклеотидной последовательности, следующий за ним участок, имеющий идентичную флуоресцентному зонду последовательность, участок в области 5' конца, представляющий собой две комплементарные друг другу последовательности, разделенные некомплементарным участком и гибридизующиеся во время реакции, за счет чего ампликон, полученный с помощью обратного праймера с матрицы, содержащей в своем составе прямой праймер, получает участок для отжига флуоресцентного зонда, а также две комплементарные друг другу последовательности уже на 3' конце, одна из которых после гибридизации выступает в роли праймера и запускает амплификацию с гидролизом зонда, достраивая последовательность на ампликоне с образованием на его 3' конце участка для отжига обратного праймера, что позволяет уже этому праймеру в последующих циклах запускать амплификацию с гидролизом отжигающихся на ампликоне флуоресцентных зондов, что сопровождается нарастанием флуоресценции, путем оценки которой выполняется детекция наличия специфических нуклеотидных последовательностей.

Способ количественного анализа клеточной составляющей скаффолда // 2675376

Изобретение относится к медицине, биотехнологии, регенеративной медицине, в частности к способам количественной оценки клеток в составе клеточно-инженерной конструкции (скаффолда).

Способ флуоресцентной идентификации амилоида // 2673815

Изобретение относится к медицине, а именно к области диагностики амилоидозов при помощи окрашивания гистологических образцов, и может быть использовано в патологической анатомии, цитологии, клинической лабораторной диагностике и биологии.

Способ отбора пациентов в группу риска по развитию фолликулярной ангины // 2672862

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и оториноларингологии, и может быть использовано для отбора пациентов в группу риска по развитию фолликулярной ангины, ассоциированной с недифтерийными коринебактериями.

Способ экспресс-оценки витального красителя для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза // 2669945

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмохирургии, и может быть использовано для экспресс-оценки витального красителя для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза.

Реагент для обнаружения катионов металлов на основе изохинолина и способ его получения // 2668134

Группа изобретений относится к области органической и аналитической химии, а именно к реагенту для обнаружения катионов Zn2+, представляющему собой 2-(1-(пиридин-2-ил)4-фенил-изохинолин-3-ил)-25,26,27,28-тетраметоксикаликс[4]арен, а также к способу его получения, включающему проведение реакции аза-Дильса-Альдера при температуре 105-110°С в атмосфере инертного газа 2-(6-фенил-3-(2-пиридин-2-ил)-1,2,4-триазин-5-ил)-25,26,27,28-тетраметоксикаликс[4]арена с 1,2-дегидробензолом, который генерируется in situ путем взаимодействия антраниловой кислоты с изоамилнитритом: .Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности обнаружения и/или супрамолекулярной экстракции катионов Zn2+, а также расширение арсенала способов получения реагентов для обнаружения и/или супрамолекулярной экстракции катионов Zn2+.

Реагент для обнаружения катионов металлов на основе 2,2’-бипиридина и способ его получения // 2668133

Группа изобретений относится к области органической и аналитической химии, а именно к реагенту для обнаружения катионов Zn2+ и Сd2+ в виде 2-(5-фенил-2,2'-бипиридин-6-ил)-25,26,27,28-тетраметоксикаликс[4]арена, а также к способу его получения, включающему проведение реакции аза-Дильса-Альдера между 2-(6-фенил-3-(2-пиридил)-1,2,4-триазин-5-ил)-25,26,27,28-тетраметоксикаликс[4]ареном и 2,5-норборнадиеном при температуре 130-150°C и в атмосфере инертного газа: .Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности обнаружения и/или супрамолекулярной экстракции катионов Zn2+ и Сd2+, а также расширение арсенала способов получения реагентов для обнаружения и/или супрамолекулярной экстракции катионов Zn2+ и Сd2+.

Способ получения и аттестации стандартного образца антигена вируса клещевого энцефалита // 2667957

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, а именно способу получения и аттестации стандартного образца гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита.

Способ получения и аттестации стандартного образца антигена вируса клещевого энцефалита // 2667957

Способ оценки агрегационной способности эритроцитов // 2667009

Изобретение относится к медицине и касается способа оценки агрегационной способности эритроцитов. Способ включает выделение эритроцитов из крови и регистрацию их агрегационной способности, где в качестве индуктора агрегации используют трихлорид железа, при этом эритроциты помещают в кювету агрегометра, добавляют трихлорид железа в финальной концентрации 200-400 мкМ и регистрируют степень агрегации фотометрическим методом.

Устройство для отбора пленок нефти и нефтепродуктов с поверхности воды // 2679232

Изобретение относится к области аналитических исследований пленок из нефти и нефтепродуктов, в частности к методам отбора проб для последующих анализов и контроля поверхностной концентрации.

Картридж и устройство для подготовки биологического образца // 2679226

Изобретение относится к картриджу для обработки биологического образца. Картридж содержит корпус с реакционной камерой, системой подачи текучей среды и системой отвода текучей среды.

Способ прогнозирования типа раннего ремоделирования левого желудочка у пациентов с острым инфарктом миокарда // 2679126

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, и предназначено для прогнозирования типа раннего ремоделирования левого желудочка (РЛЖ) у больных острым инфарктом миокарда.

Способ и устройство для концентрирования взвешенных компонентов в пробах воды // 2678653

Изобретение предназначено для использования при гидробиологических и гидрохимических исследованиях. Устройство для концентрирования взвешенных компонентов в пробах воды содержит устройство фильтрации, выполненное в виде цилиндра с открытым дном, в верхней части которого расположена трубка для удаления отфильтрованной жидкости, а на расстоянии от верхней стенки расположен фильтр.

Способ дифференциальной диагностики типов воспаления дыхательных путей у больных бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких // 2678577

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ дифференциальной диагностики типов воспаления дыхательных путей у больных бронхиальной астмой (БА) и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), отличающийся тем, что осуществляют комплексную математическую оценку показателей по формуле: у=0,0206×x1-0,0583×x2+0,0205×x3-0,0011×x4+0,582, где у - тип воспаления дыхательных путей; x1 - содержание эозинофилов в индуцированной мокроте, %; x2 - количество нейтрофилов в крови, 109/л; x3 - количество эозинофильного катионного протеина в крови, нг/мл; x4 - количество нейтрофильной эластазы в крови, нг/мл; при значении у=0-0,4 диагностируют нейтрофильный тип воспаления дыхательных путей у больных БА и ХОБЛ, а при значении у=0,6 и выше диагностируют эозинофильный тип воспаления дыхательных путей у больных БА и ХОБЛ.

Обнаружение антигена-мишени, фенотипический скрининг и его применение для идентификации специфичных эпитопов-мишеней клеток-мишеней // 2678421

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам для идентификации связывающих полипептидов (например, антител или их антигенсвязывающих фрагментов), которые специфически связываются с антигеном клеточной поверхности, что может быть использовано в медицине.

Композиция и способ для детектирования злокачественного неопластического заболевания // 2678135

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к композиции для специфического связывания гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19, что может быть использовано в медицине.

Способ подтверждения аутентичности вареных колбасных изделий // 2678090

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для контроля аутентичности и качества вареных колбасных изделий. Для этого проводят двумерный электрофорез в полиакриламидном геле исследуемого изделия и эталонного образца с последующим сравнением маркерных белков в полученных электрофореграммах, которые идентифицируют масс-спектрометрически после извлечения из полиакриламидного геля.

Способ оценки эффективности стандартной терапии у больных нумулярной микробной экземой // 2677881

Изобретение относится к области медицины, а именно дерматологии и клинической лабораторной диагностике. Изобретение представляет собой способ оценки эффективности проводимой стандартной терапии у больных нумулярной микробной экземой, включающий определение в крови иммунологических показателей, отличающийся тем, что исследование проводят на 10-й день терапии, в качестве иммунологических показателей в капиллярной крови из очага воспаления определяют фагоцитарное число и окислительно-восстановительную активность нейтрофилов в тесте спонтанного восстановления нитросинего тетразолия и при их значениях соответственно 5,0 и 5,0% и ниже эффективность лечения оценивают как низкую, а при 6,0 и 6,0% и выше - как высокую.

Имитатор сигналов свободной прецессии ядерного магнитного резонанса и спинового эхо протонов масла с различной массовой долей олеиновой кислоты в семенах подсолнечника // 2677644

Изобретение относится к области измерительной техники, а именно к средствам градуировки импульсных ЯМР-спектрометров, и может быть использовано для определения содержания олеиновой кислоты в масле семян подсолнечника.

Способ прогнозирования риска развития гипертонической болезни на основании молекулярно-генетических данных // 2679401

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития гипертонической болезни. У индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, выделяют ДНК из периферической венозной крови и проводят анализ полиморфизмов генов цитокинов rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFА. Высокий риск развития гипертонической болезни прогнозируют при выявлении сочетания генотипа СС rs1800469 TGFβ-1 с генотипом ТТ rs833061 VEGFА. Изобретение обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития гипертонической болезни на основе данных о сочетаниях генетических вариантов локусов rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFА. 3 ил., 3 пр.