Триспецифические антитела против il-17a, il-17f и другой провоспалительной молекулы

Изобретение относится к вариантам триспецифичной связывающей молекулы, содержащей вариабельный домен VHH, специфично связывающий человеческие IL-17A и IL-17F, и домен, содержащий вариабельные домены тяжелой и легкой цепи и специфично связывающий человеческий TNF-альфа (ФНО-альфа). Также предложены: нуклеиновая кислота, кодирующая упомянутую молекулу, экспрессионный вектор, клетка-хозяин и способ получения триспецифичной молекулы по изобретению. Кроме того, представлена фармацевтическая композиция и способы лечения заболеваний, опосредованных человеческими IL-17A, IL-17F или TNF-альфа, таких как ревматоидный артрит, псориаз или псориатический артрит. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в профилактике и лечении различных аутоиммунных и воспалительных нарушений. 10 н. и 17 з.п. ф-лы, 29 ил., 11 табл., 30 пр.

 

Предпосылки создания изобретения

[0001] Иммунная система выполняет функции защиты организма от бактериальных или вирусных инфекций, а также раковых поражений. Иммунный ответ включает в себя воспаление, т.е. системное накопление иммунных клеток или их накопление в определенной части организма. Клетки иммунной системы включают несколько типов миелоидных и лимфоидных клеток, таких как моноциты, макрофаги, дендритные клетки, эозинофилы, Т-клетки, В-клетки и нейтрофилы. В ответ на инфекцию или чужеродное вещество иммунные клетки вырабатывают сигнальные белки, известные как цитокины, которые, в свою очередь, регулируют пролиферацию, развитие, дифференцировку и/или миграцию клеток иммунной системы. В некоторых случаях, иммунный ответ может привести к патологическим процессам, таким как аутоиммунные заболевания (см., например, Abbas et al. (ред.) (2000) Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pa.; Oppenheim and Feldmann (ред.) (2001) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, Calif.; von Andrian and Mackay, New Engl J Med 343:1020-1034 (2000); Davidson and Diamond, New Engl J Med 345:340-350 (2001)).

[0002] CD4+ Т-клетки играют центральную роль в иммунных реакциях, помогая другим клеткам адаптивной или врожденной иммунной системы. В ранних исследования выявлено два класса CD4+ Т-клеток (Th1 и Th2). Недавно была идентифицирована новая субпопуляция CD4+ Т-клеток: ТМ7-клетки. ТМ7-клетки возникли как ветвь адаптивной иммунной системы, специализирующаяся на усилении защиты хозяина от внеклеточных бактерий и некоторых грибов и бактерий, против которых Th1- и Th2-клетки не обеспечивают защиту.

[0003] Th17-клетки были идентифицированы в контексте открытия нового семейства цитокинов, семейства IL-17, которое в настоящее время включает шесть членов (IL-17A-F). IL-17 (ранее именуемый CTLA-8), экспрессируется главным образом ТМ7-клетками и был обозначен как IL-17A в качестве исходной молекулы в цитокиновом семействе IL-17. Последовательности членов семейства IL-17 не гомологичны другим известными в настоящее время белкам млекопитающих; таким образом, семейство IL-17 представляет собой отдельное семейство цитокинов. Структурные признаки членов семейства IL-17, определнные на основе кристалической структуры IL-17F, сходны со многими цитокинами; каждый из членов семейства, скорее всего, продуцируется как гомодимер, хотя структурные анализы дают основания предполагать, что могут также присутствовать и гетеродимеры. Совсем недавно было обнаружено, что гетеродимеры IL-17A и IL-17F, состоящие из активированных Т-клеток CD4+, передают сигнал через комплекс IL-17R/IL-17RC (Wright JF и др., J Immunol 181:2799-2805 (2001)).

[0004] Ген, кодирующий человеческий IL-17F, расположен рядом с геном, кодирующим человеческий IL-17A (Hymowitz et al., Embo J 20 (19):5332-41 (2001)). IL-17A и IL-17F идентичны на 44% по аминокислотной последовательности, в то время как другие члены семейства IL-17 обладают более низкой идентичностью последовательности (15-27%). Это позволяет предположить, что IL-17A и IL-17F образуют особую подгруппу семейства IL-17 (Starnes et al., J Immunol 167 (8):4137-40 (2001); Aggarwal and Gurney, J. Leukoc Biol 71 (1):1-8 (2002)). Обнаружено, что биологические эффекты IL-17F подобны биологическим эффектам IL-17A, например, способность стимулировать выработку IL-6, IL-8 и G-CSF в самых разнообразных клетках. Подобно IL-17A, IL-17F способен стимулировать выработку хрящевого матрикса и подавлять синтез новой хрящевой ткани (см. US 2002/0177188). Таким образом, подобно IL-17A, IL-17F может вносить вклад в развитие патологии воспалительных заболеваний. В последнее время, авторы отмечали, что как IL-17A, так и IL-17F вырабатываются Т-клетками под воздействием интерлейкина 23 (IL-23) (Aggarwal et al., J Biol Chem 278 (3):1910-4 (2003)). Наблюдение, что IL-17A и IL-17F имеют аналогичную хромосомную локализацию и значительное сходство последовательностей, а также тот факт, что IL-17A и IL-17F индуцируются в одних и тех же популяциях клеток в ответ на специфические стимулы, привели к идентификации нового человеческого цитокина, который содержит ковалентный гетеродимер IL-17A и IL-17F.

[0005] Кроме того, IL-17A усиливает действие фактора некроза опухолей альфа (ФНО-альфа) и интерлейкина-1 бета (IL-1β) для достижения значимого провоспалительного эффекта. Для лечения различных воспалительных, иммунных и пролиферативных заболеваний, включая ревматоидный артрит (РА), остеоартроз, остеопороз при ревматоидном артрите, воспалительный фиброз (например, склеродермию, легочный фиброз и цирроз), гингивит, пародонтоз или заболевания пародонта, воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и воспалительные заболевания кишечника), астму (в том числе аллергическую астму), аллергии, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), рассеянный склероз, псориаз, рак и другое, было предложено уменьшить активность IL-17A с антителами или антигенсвязывающими фрагментами антител, которые являются антагонистами этих молекул (см., например, US 2003/0166862, WO 2005/108616, WO 2005/051422 и WO 2006/013107).

[0006] Антагонисты ФНО-альфа, как известно, применяются для лечения артрита, уменьшая воспаление и подавляя развитие хряща и разрушение костей (van den Berg, Arthritis Res 3:18-26 (2001)). Однако, у значительного процента пациентов отмечен неадекватный ответ на препараты, содержащие антагонисты ФНО-альфа. Доклинические исследования показали, что ФНО-альфа и IL-17A проявляют одинаковые свойства в патофизиологии артрита. В то время как по отдельности ФНО-альфа и IL-17A оказывают незначительное влияние на экспрессию воспалительных генов, их сочетание приводит к сильному синергическому ответу. Взаимодействие ФНО-альфа и IL-17A повышает экспрессию цитокинов (LeGrand et al., Arthritis Rheum 44:2078-2083 (2001)) и провоспалительных хемокинов (Chabaud et al., J. Immunol 167:6015-6020 (2001)), а также подавляет разрастание хряща и разрушение костной ткани (Van Bczooijen et al., Ann Rheum Pis 61:870-876 (2002)).

[0007] В настоящее время существует целый ряд биспецифичных антител к IL-17A и других провоспалительных молекул, например, DVD (Abbott) и COVA322 (Covagen-Janssen).

[0008] В международной патентной публикации № WO 2015/014979 описаны четырехвалентные биспецифичные антитела к IL-17A и ФНО-альфа, которые содержат два места связывания IL-17A и два места связывания ФНО-альфа. Эти антитела продемонстрировали синергическое действие в подавлении воспаления и разрушения ткани при ревматоидном артрите.

[0009] В международной патентной заявке WO 2014/137961 описаны биспецифичные антитела к IL-17A и ФНО-альфа, которые содержат два полипептида. Эти биспецифичные антитела являются термически и химически стабильными, обладают низкой способностью к агрегации и могут одновременно связываться с IL-17A и ФНО-альфа.

[0010] В патенте США №8,496,936 описаны триспецифичные антитела к IL-17A, IL-17F и IL-23р19, которые в ходе клеточных анализов и на животных моделях in vivo показывают различную активность против различных лигандов, но не демонстрировали какие-либо физико-химических характеристик, необходимых для создания потенциальной стабильной лекарственной формы.

[0011] Сохраняет свою актуальность производство антител, которые могут эффективно нейтрализовать IL-17A, IL-17F, а также активность ФНО-альфа в контексте воспалительных реакций и аутоиммунных заболеваний, особенно антител, сохраняющих стабильность в лекарственной форме.

Краткое описание изобретения

[0012] Настоящее изобретение относится к триспецифичным связывающим молекулам, направленным против IL-17A, IL-17F и провоспалительных молекул, таких как ФНО-альфа. Такие антитела могут быть использованы для лечения аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, псориаз и псориатический артрит. По сравнению с существующими в настоящее время способами лечения таких заболеваний, включая лечение антителами, предполагается, что триспецифичные связывающие молекулы по настоящему изобретению могут обеспечить наилучший клинический ответ, применяемые как отдельно, так и в сочетании с другой противовоспалительной и/или иммуносупрессивной терапией.

[0013] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к триспецифичной связывающей молекуле, содержащей первый связывающий домен, который связывается с человеческим IL-17A и человеческим IL-17-F, и второй связывающий домен, который связывается с человеческой провоспалительной молекулой. В некоторых вариантах осуществления изобретения провоспалительной молекулой человека является человеческий ФНО-альфа. В отдельном варианте осуществления изобретения связывающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть.

[0014] В некоторых вариантах осуществления изобретения первый связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый связывающий домен содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-3. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый связывающий домен конкурирует за связывание или связывается с тем же эпитопом, что и связывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность первого связывающего домена идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В отдельном варианте осуществления изобретения первый связывающий домен состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

[0015] В некоторых вариантах осуществления изобретения первый связывающий домен является гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления первый связывающий домен является гуманизированным VHH.

[0016] В некоторых вариантах осуществления второй связывающий домен конкурирует за связывание или связывается с тем же эпитопом, что и связывающий домен, содержащий:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10-12, и легкую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13-15;

вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; или

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

В некоторых вариантах осуществления изобретения второй связывающий домен содержит тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй связывающий домен содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10-12, и легкую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13-15. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй связывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи, последовательность которого идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, вариабельный домен, идентичный по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, или оба домена. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй связывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или оба домена. В отдельном варианте осуществления изобретения второй связывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.

[0017] В некоторых вариантах осуществления изобретения второй связывающий домен представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, одноцепочное антитело, Fv, Fab, F (ab')₂, Fd, одноцепочную Fv молекулу (ScFv), диатело или однодоменное антитело (dAb). В некоторых вариантах осуществления изобретения второй связывающий домен является гуманизированным Fab.

[0018] В некоторых вариантах осуществления изобретения второй связывающий домен содержит тяжелую цепь, последовательность которой меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, легкую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, или обе цепи. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй связывающий домен содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или обе цепи. В отдельном варианте осуществления изобретения второй связывающий домен содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

[0019] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к триспецифичной связывающей молекуле, содержащей любой из описанных в настоящем документе первых связывающих доменов в комбинации с любым из вторых связывающих доменов, описанных в настоящем документе.

[0020] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к триспецифичной связывающей молекуле, содержащей первый связывающий домен, который связывается с человеческим IL-17A и человеческим IL-17F, и второй связывающий домен, который связывается с человеческим ФНО-альфа, при этом указанный первый связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и указанный второй связывающий домен содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

[0021] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к триспецифичной связывающей молекуле, содержащей первый связывающий домен, который связывается с человеческим IL-17A и человеческим IL-17F, и второй связывающий домен, который связывается с человеческим ФНО-альфа, при этом указанный первый связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и указанный второй связывающий домен содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

[0022] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к триспецифичной связывающей молекуле, которая связывается с человеческим IL-17A, человеческим IL-17F и человеческим ФНО-альфа, при этом указанная связывающая молекула содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5 и 7.

[0023] В некоторых вариантах осуществления изобретения первый связывающий домен и второй связывающий домен соединены пептидным линкером из более чем пяти аминокислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения, аминокислотные остатки пептидного линкера выбраны из G, A, S, Р, Е, Т, D и К. В отдельном варианте осуществления изобретения пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. Первый связывающий домен может быть прикреплен к N-концу или С-концу как тяжелой, так и легкой цепи второго связывающего домена с помощью пептидного линкера.

[0024] В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающая молекула представляет собой антитело изотипа IgG или его антигенсвязывающей части. Антитело может относиться, например, к подтипу изотипа IgG1.

[0025] В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающая молекула содержит F_C-фрагмент по меньшей мере с одной мутацией, которая снижает антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) по сравнению с той же связывающей молекулой без мутации.

[0026] В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающая молекула имеет по меньшей мере одно из следующих свойств:

K_D для IL-17A, составляющая 10-11 М или ниже;

K_D для IL-17F, составляющая 10^-7 М или ниже;

K_D для ФНО-альфа, составляющая 10-11 М или ниже;

подавляет активность IL-17A и/или IL-17A /ФНО-альфа по меньшей мере на 50% (например, 60%, 70%, 80% или 90%) при концентрациях IL-6 ниже 200 нг/мл в анализе на клетках линии НТ1080;

подавляет IL-17А-зависимое высвобождение IL-6 клетками линии НТ080;

подавляет продукцию IL-6 в клетках линии НТ1080;

подавляет ФНО-альфа-зависимую цитотоксичность по меньшей мере на 50% (например, 60%, 70%, 80% или 90%) при концентрациях ниже 100 нг/мл в клетках линии WEHI-13VAR;

не связывается с ФНО-альфа кролика, мыши или морской свинки;

одновременно связывается с IL-17А и ФНО-альфа;

связывается с IL-17A и ФНО-альфа яванского макака;

остается стабильной по меньшей мере в течение трех, четырех, пяти, шести или семи дней инкубации (например, после семи дней инкубации) при температуре 37°С в сыворотке крови человека;

имеет период полувыведения более 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 дней in vivo (например, 12 дней);

оказывает противовоспалительный эффект в модели артрита in vivo; а также

подавляет активность IL-17 и ФНО-альфа in vivo.

[0027] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей любую из триспецифичных связывающих молекул, описанных в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

[0028] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую первый связывающий домен любой из триспецифичных связывающих молекул, описанных в настоящем документе.

[0029] Настоящее изобретение также относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует тяжелую цепь, легкую цепь или обе цепи, второго связывающего домена любой из триспецифичных связывающих молекул, описанных в настоящем документе.

[0030] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей:

нуклеотидную последовательность, которая кодирует первый связывающий домен любой из триспецифичных связывающих молекул, описанных в настоящем документе;

нуклеотидную последовательность, которая кодирует тяжелую цепь второго связывающего домена любой из триспецифичных связывающих молекул, описанных в настоящем документе;

нуклеотидную последовательность, которая кодирует первый связывающий домен любой из триспецифичных связывающих молекул, описанных в настоящем документе; или

любое сочетание указанных выше последовательностей.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую первый связывающий домен, и нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь второго связывающего домена, любой из триспецифичных связывающих молекул, описанных в настоящем документе, в некоторых случаях дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую пептидный линкер. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты может содержать, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 4, и нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 6, которая в некоторых случаях далее содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую пептидный линкер. В одном варианте осуществления изобретения аминокислотной последовательностью пептидного линкера является SEQ ID NO: 16. В одном варианте осуществления изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательность SEQ ID NO: 7.

[0031] В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-15.

[0032] Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему любую из выделенных молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше, при этом указанный вектор далее содержит последовательности, контролирующие экспрессию.

[0033] Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей:

нуклеотидную последовательность, которая кодирует первый связывающий домен любой из триспецифичных связывающих молекул, описанных в настоящем документе;

нуклеотидная последовательность, которая кодирует тяжелую цепь второго связывающего домена любой из триспецифичных связывающих молекул, описанных в настоящем документе;

нуклеотидную последовательность, которая кодирует первый связывающий домен любой из триспецифичной связывающих молекул, описанных в настоящем документе;

В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 5, и нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 7.

[0034] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения любой из триспецифичных связывающих молекул, описанных в настоящем документе, включающему получение клетки-хозяина, как описано выше, культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии связывающей молекулы, и выделение полученной связывающей молекулы.

[0035] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, нуждающегося в таком лечении, содержащему введение пациенту любой из триспецифичных связывающих молекул или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения у пациента имеется заболевание, опосредованное IL-17A, IL-17F или ФНО-альфа. В отдельном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения пациента с ревматоидным артритом, псориазом или псориатическим артритом, содержащему введение пациенту любой из триспецифичных связывающих молекул или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ далее содержит введение противовоспалительного или иммуносупрессивного агента. В любом из указанных выше способов лечения, пациент может быть человеком.

Краткое описание чертежей

[0036] На фиг. 1 показана схема производства триспецифичных анти-IL-17А/анти-IL-17F /анти-ФНО-альфа-антител.

[0037] На фиг. 2 показана последовательность белка IL-17A-His6-FLAG.

[0038] На фиг. 3 представлен гель, показывающий очищенный белок IL-17A-His6-FLAG.

[0039] На фиг. 4 представлен гель, показывающий очищенные контрольные анти-IL-17А антитела.

[0040] На фиг. 5 представлен график, показывающий титр античеловеческих антител к IL-17A, полученных путем иммунизации ламы [Lama glama].

[0041] На фиг. 6 представлена карта, показывающая плазмиду РН5 для фагового дисплея антител Fab-фрагментов.

[0042] На фиг. 7 представлена карта, показывающая плазмиду pLL-Fab для секреторной экспрессии антител Fab-фрагментов в E.coli.

[0043] На фиг. 8 представлен график, показывающий связывание поликлонального фага со специфическими и неспецифическими антигенами после отбора фрагментов анти-IL17-А из иммунной фаговой библиотеки.

[0044] На фиг. 9 показана последовательность аминокислот с высоким сродством VHH-домена (VHH17; SEQ ID NO: 4) и VHH-домена его родительского антитела (VHH; SEQ ID NO: 17), специфичного для человеческого IL-17A и IL-17F. Аминокислоты, замещенные в процессе гуманизации, выделены жирным шрифтом. CDR-участки [участки, определяющие комплементарность], выделены серым цветом. На фиг. 9 также показаны аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей (SEQ ID NO: 18 и 9, соответственно) античеловеческого антитела к ФНО-альфа (RU 2303604).

[0045] На фиг. 10 показана таблица мутаций в CDR-участках анти-ФНО-альфа вариантов антител, используемых в составе анти-IL-17А /анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа триспецифичных антител (сверху вниз, SEQ ID NO: 19-32).

[0046] На фиг. 11 показаны результаты переходного процесса развития различных триспецифичных вариантов антител анти-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа.

[0047] На фиг. 12 показан сравнительный анализ анти-ФНО-альфа активности различных вариантов триспецифичных анти-IL-17F/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа антител в анализе цитотоксического ФНО-альфа-зависимого действия с использованием клеток линии WEHI-13VAR. Варианты с максимальной подавляющей активностью выделены серым цветом.

[0048] На фиг. 13 показан график анти-ФНО-альфа активности различных вариантов триспецифичных анти-IL-17А/анти-ILF/анти-ФНО-альфа антител (Mab12, Mab31 и Mab32), постренный по результатм анализа цитотоксичного ФНО-альфа-зависимого действия с использованием клеток линии WEHI-13VAR.

[0049] На фиг. 14 показан график анти-ФНО-альфа активности в отношении анти-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа триспецифичных антител BCD-121 и двух коммерчески доступных моноспецифических анти-ФНО-альфа антител адалимумаба и инфликсимаба, построенный по результатам анализа цитотоксического ФНО-альфа-зависимого действия с использованием клеток линии WEHI-13VAR.

[0050] На фиг. 15 представлен график, показывающий способность BCD-121 блокировать функцию IL-17А-зависимую продукцию IL-6 в кетках линии НТ1080 по сравнению с положительным контролем (моноспецифичным анти-IL-17А антителом BCD-085) и отрицательным контролем (анти-ФНО-альфа антителом адалимумабом).

[0051] На фиг. 16 представлен график, показывающий способность BCD-121 блокировать функцию IL-17А-зависимую продукцию IL-6 в клетках линии НТ1080 по сравнению с положительным контролем (моноспецифичным анти-IL-17А антителом BCD-085) и отрицательным контролем (анти-ФНО-альфа антителом адалимумабом).

[0052] На фиг. 17 представлен график, показывающий антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), индуцированную антителом BCD-121, по сравнению с тремя коммерческими доступными моноспецифическими анти-ФНО-альфа антителами (адалимумаб, инфликсимаб и симзия), построенный на основе клеточной культуры Jurkat-tm TNFα cl.8.

[0053] На фиг. 18 представлен график, показывающий комплемент-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (CDC), индуцированную антителом BCD-121, по сравнению с тремя коммерческими доступными моноспецифическими анти-ФНО-альфа антителами (адалимумаб, инфликсимаб и симзия), постренный на основе клеточной культуры Jurkat-tm TNFα cl.8.

[0054] На фиг. 19 представлена сенсограмма анализа «сэндвич»-методом одновременного связывания BCD-121, как с IL-17A, так и с человеческим ФНО-альфа, выполненного на приборе Octet RED96.

[0055] На фиг. 20 представлен график, построенный по результатам ИФА для антитела BCD-121, связывающегося с различными лигандами семейства человеческого IL-17.

[0056] На фиг. 21 представлен график, построенный по результатам ИФА для антитела BCD-121, связывающегося с различными ортологическими белками ФНО-альфа.

[0057] На фиг. 22 представлен график, показывающий термостабильность агрегации белка BCD-121, построенный по результатам, полученным с использованием динамического рассеяния света (ДРС). На графике показана зависимость среднего размера частиц (Z-среднее) от температуры для четырех буферов.

[0058] На фиг. 23 представлен график, показывающий термостабильность BCD-121 в течение длительного воздействия, построенный по результатам, полученным с методом теплового стресса при 50°С в четырех различных буферных растворах.

[0059] На фиг. 24 показан анализ чистоты BCD-121, полученный из культуральной среды производителя стабильной клеточной линии в соответствии с оптимизированной схемой очистки. Панель А: восстанавливающие условия (+ β-МЕ). Панель В: невосстанавливающие условия (- β-МЕ). Дорожки 2 и 3: наносили 10 и 40 мкг, соответственно.

[0060] На фиг. 25 представлен график, демонстрирующий стабильность BCD-121 в очищенной сыворотке крови человека, построенный по результатам ИФА.

[0061] На фиг. 26 представлен график, показывающий фармакодинамические свойства BCD-121 на модели коллаген-индуцированного артрита (CIA) у яванского макака М. fascicularis.

[0062] На фиг. 27 представлен график, построенный по результатам ИФА, показывающий фармакокинетический профиль BCD-121 у обезьян после однократного подкожного введения в дозе 10, 50 или 100 мг/кг.

[0063] На фиг. 28 представлен график, показывающий, что BCD-121 может дважды блокировать способность IL-17A и ФНО-альфа индуцировать продукцию IL-6 в клетках линии НТ1080. BCD-121 более надежно блокирует выработку IL-6, чем моноспецифичные анти-ФНО AM, анти-ФНО Fab-ПЭГ или анти-IL17 Ab (моноклональное антитело против IL-17), при ИК50, составляющей 20 нг/мл.

[0064] На фиг. 29 представлен график, показывающий результаты агрегационного анализа при интенсивном встряхивании (20 при 500 об/мин), выполненного с помощью системы Zetasizer nano ZSP. Данные показывают, что BCD-121 представляет собой хорошо растворимую триспецифичную молекулу, которая может быть использована в высококонцентрированный лекарственных формах для подкожных инъекций (выше 100 мг/мл).

Подробное описание изобретения

Определения и общие методы

[0065] Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области. Примерные способы и материалы описаны ниже, хотя на практике или при тестировании настоящего изобретения могут также использоваться способы и материалы подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе. Все публикации и другие ссылочные материалы, упомянутые в настоящем документе, включены в во всей их полноте путем отсылки. В случае противоречий настоящее описание, включая определения, будет превалировать. Хотя в настоящем документе цитируется ряд документов, такое цитирование не является признанием того, что любой из этих документов образует часть общеизвестных знаний в данной области.

[0066] Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы клеточной и тканевой культуры, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.

[0067] В этом описании и вариантах осуществления изобретения слова «иметь» и «содержать» или их вариации, такие как «имеет», «имеющий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.

Определения, связанные с антителом

[0068] Если не указано иное, при использовании в данном описании «IL-17A», «IL-17F» и «ФНО-альфа» относятся к человеческому IL-17A, IL-17F и ФНО-альфа, соответственно.

[0069] Интерлейкин-17 («IL-17») представляет собой гликозилированный гомодимерный белок с молекулярной массой 20-30 кДа. Человеческий ген IL-17A кодирует белок из 155 аминокислот, который имеет сигнальную последовательность из 19 аминокислот и 136 аминокислот зрелого сегмента. Человеческий ген IL-17F кодирует белок из 163 аминокислот, который имеет сигнальную последовательность из 30 аминокислот и 133 аминокислот зрелого сегмента. Последовательность человеческого полипептида IL-17A доступна в базе данных UniProt под номером доступа Q16552. Последовательность человеческого полипептида IL-17F доступна в базе данных UniProt под номером доступа Q96PD4.

[0070] Термин «фактор некроза опухоли альфа» или «ФНО-альфа» при использовании в настоящем документе относится к молекуле человеческого ФНО-альфа, имеющей последовательность полипептида, описанную у Pennica et al., Nature 312:721 (1984) or in Aggarwal et al., J ВС 260:2345 (1985).

[0071] Термины «иммунный ответ», «аутоиммунная реакция» и «аутоиммунное воспаление» относятся, например, к действию лимфоцитов, антиген-представляющих клеток, фагоцитирующих клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, вырабатываемых указанными клетками или клетками печени (включая антитела, цитокины и комплемент, образующиеся в результате селективного повреждения, разрушения или элиминации из человеческого организма инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случаях аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей).

[0072] Термин «связывающая молекула» включает в себя антитела и иммуноглобулины. Термин «антитело» (Ab) или «иммуноглобулин» (Ig) при использоваии в настоящем документе относится к тетрамеру, содержащему две тяжелые (Н) цепи (около 50-70 кДа) и две легкие (L) цепи (около 25 кДа), связанных друг с другом дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (СН). Каждая легкая цепь состоит из вариабельного домена легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Домены VH и VL могут быть далее подразделены на гипервариабельные участки, именуемые «участками, определяющими комплементарность» (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, именуемые «каркасными областями» (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR-участков (H-CDR в данном документе обозначает CDR из тяжелой цепи и L-CDR в данном документе обозначает CDR из легкой цепи) и четырех каркасных областей FRs, отходящие от амино-конца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Приписывание аминокислот к каждому региону может осуществляется в соответствии с определениями IMGT^® (Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003); или определениями Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991)); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); или Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

[0073] В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или иммуноглобулин, как описано в настоящем документе, может содержать в дополнение к тяжелой и легкой цепям домен VHH, или «нанотело.» Эти единичные домены являются антигенсвязывающими частями антител тяжелой цепи (hcAb), которые лишены легких цепей и обычно встречаются у видов семейства верблюдовых, таких как лама и альпака.

[0074] Термин «антигенсвязывающая часть» антитела (или просто «часть антитела»)при использовании в настоящем документе относится к одной или более частям или фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, человеческого IL-17A, человеческого IL-17F, ФНО-альфа или их частям). Было показано, что некоторые фрагменты полноразмерного антитела могут выполнять функцию антигенсвязывающего антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином «антигенсвязывающая часть», включают (i) а Fab-фрагмент: моновалентный фрагмент, состоящий из V_L, V_H, C_L и C_H1 доменов; (ii) F (ab')₂-фрагмент: двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из V_H и C_H1 доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из V_L и V_H доменов одного плеча антитела, (v) фрагмент однодоменного антитела (dAb), который состоит из V_Hдомена; и (vi) выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR), способный специфически связываться с антигеном. Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, V_L и V_H, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных способов синтетическим линкером, который позволяет им иметь вид одной цепи белка, в которой V_L и V_H области спариваются, образуя одновалентные молекулы (известные как одноцепочечные Fv (scFv)). Также в рамках данного изобретения представлены антигенсвязывающие молекулы, содержащие V_H и/или V_L. В случае V_H, молекула может также содержать одну или более из СН1, шарнирной, СН2 или СН3 области. Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином «антигенсвязывающая часть» антитела. Также охватываются и другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой двухвалентные, биспецифичные антитела, в которых V_H и V_L домены экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким для спаривания двух доменов одной и той же цепи, тем самым заставляя домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антигенсвязывающих участка.

[0075] Участки антител, такие как Fab- и F (ab')₂-фрагменты, могут быть получены из целых антител с использованием традиционных методов, таких как папаиновый или пепсиновый гидролиз целых антител. Более того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, например, как описано в настоящем документе.

[0076] Термин «рекомбинантное антитело» означает антитело, которое экспрессируется из клетки или клеточной линии, содержащей нуклеотидную последовательность(нуклеотидные последовательности), которая кодирует антитела, при этом указанная нуклеотидная последовательность (нуклеотидные последовательности) не ассоциирована с клеткой в природе.

[0077] Термин «вариантное» антитело, используемый в данном документе, относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности его «родительского» антитела путем добавления, удаления и/или замены одного или более аминокислотных остатков относительно последовательности родительского антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариантное антитело содержит по меньшей мере одно или более (например, от одного до двенадцати, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять, десять, одиннадцать или двенадцать; и в некоторых вариантах осуществления изобретения от одного до примерно десяти) добавлений, делеций и/или замен аминокислот относительно родительского антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретение добавления, делеций и/или замены осуществляются на CDR-участках вариантного антитела. Идентичность или гомология по отношению к последовательности вариантного антитела определяется в настоящем документе как процент аминокислотных остатков в последовательности вариантного антитела, которые идентичны остаткам родительского антитела, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Вариантное антитело сохраняет способность связываться с тем же антигеном, и предпочтительно эпитопом, с которым связывается родительское антитело, и в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно свойство или биологическая активность превосходит аналогичные свойства родительского антитела. Например, вариантное антитело может иметь, например, более выраженную аффинность связывания, более длительный период полувыведения, более низкое значение ИК50 или повышенную способность подавлять биологическую активность антигена по сравнению с родительским антителом. Особый интерес в настоящем документе представляет вариантное антитело, показывающее биологическую активность, превышающую по меньшей мере в 2 раза (предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз, 10 раз или 20 раз) биологическую активность родительского антитела.

[0078] Термин «химерное антитело» относится в широком смысле к антителу, которое содержит одну или более областей из одного антитела, и одну или более областей из одного или нескольких других антител, как правило, антитело, частично человеческого происхождения и частично нечеловеческого происхождения, то есть полученное частично из не относящегося к человеку животного, например, мыши, крысы или другого грызуна или верблюдовых, таких как лама или альпака. Химерные антитела являются предпочтительными по сравнению с нечеловеческими антителами для того, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антител у человека, например, ответа, направленного против мышиных тел у человека в случае мышиного антитела. Примером типичного химерного антитела является то, в котором последовательности вариабельного участка являются мышиными, в то время как последовательности константного участка являются человеческими. В случае химерного антитела нечеловеческие части могут быть подвергнуты дальнейшему изменению с целью гуманизации антитела.

[0079] Термин «гуманизация» относится к факту, что когда антитело имеет полностью или частично нечеловеческое происхождение, например, антитело мыши или ламы, полученное при иммунизации мышей или лам, соответственно, с представляющим интерес антигеном, или является химерным антителом на основе такого антитела мыши или ламы, можно заменить некоторые аминокислоты, в частности, в каркасных областях и константных доменах тяжелой и легкой цепей, с тем чтобы избежать или свести к минимуму иммунный ответ у человека. Специфичность взаимодействия антитела с антигеном-мишенью присуща главным образом аминокислотным остаткам, расположенных в шести CDR-участках тяжелой и легкой цепи. Поэтому аминокислотные последовательности внутри CDR-участков, являются гораздо более вариабельными между отдельными антителами, по сравнению с последовательностями вне CDR-участков. Поскольку последовательности CDR-участков отвечают за большинство антитело-антиген взаимодействий, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфического природного антитела, или в более общем плане какого-либо специфического антитела с данной аминокислотной последовательностью, например, путем конструирования экспрессионных векторов, которые экспрессируют последовательности CDR-участков из специфического антитела в каркасные последовательности другого антитела. В результате, можно «гуманизировать» нечеловеческое антитело и в значительной степени сохранить специфичность связывания и аффинность исходного антитела. Несмотря на то, что невозможно точно предсказать иммуногенность и тем самым иммунный ответ, направленный против антитела у человека, на конкретное антитело, нечеловеческие антитела, как правило, более иммуногенны, чем человеческие антитела. Химерные антитела, у которых инородные (например, грызуна или верблюда) константные участки были заменены последовательностями человеческого происхождения, показали в целом более низкую иммуногенность, чем антитела полностью инородного происхождения, и существует тенденция использовать в терапевтических антителах гуманизированные или полностью человеческие антитела. Химерные антитела или другие антитела нечеловеческого происхождения, таким образом, могут быть гуманизированы, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антитела, у человека.

[0080] Для химерных антител, гуманизация обычно включает в себя модификацию каркасных участков последовательностей вариабельного участка. Аминокислотные остатки, которые являются частью участков, определяющих комплементарность (CDR-участков), чаще всего не будут изменяться в связи с гуманизацией, хотя в некоторых случаях это может быть желательным, чтобы изменить отдельные аминокислотные остатки CDR-участка, например, чтобы удалить участок гликозилирования, участок дезамидирования, участок изомеризации аспартата или нежелательный остаток цистеина или метионина. N-связанное гликозилирование происходит путем присоединения олигосахаридной цепи к остатку аспарагина в трипептидной последовательности Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме Pro. Удаление участка N-гликозилирования может быть достигнуто путем мутирования Asn или Ser/Thr остатка другим остатком, предпочтительно путем консервативной замены. Дезамидирование остатков аспарагина и глутамина может происходить в зависимости от таких факторов, как рН и обнажение поверхности. Остатки аспарагина особенно восприимчивы к дезамидированию, прежде всего, если они присутствуют в последовательности Asn-Gly, и в меньшей степени в других дипептидных последовательностях, таких как Asn-Ala. При наличии такого дезамидированного участка, в частности, Asn-Gly в последовательности CDR-участка, может быть предпочтительным удалить этот участок, как правило, путем консервативной замены для удаления одного из вовлеченных остатков.

[0081] В данной области техники известны многочисленные способы гуманизации последовательности антитела; см., например, обзор Almagro & Fransson, Front Biosci. 13:1619-1633 (2008). Одним из наиболее часто используемых методов является трансплантация CDR-участков, например, когда химерные антитела мышиного происхождения задействуют идентификацию человеческих зародышевых генных эквивалентов к мышиным генам вариабельного участка и трансплантацию последовательностей мышиных CDR-участков в этот каркас. Трансплантация CDR-участка может быть основана на определениях CDR-участков по Kabat, хотя в более поздней публикации (Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 64:210-225 (2007)) предполагается, что определение no IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) может улучшить результат гуманизации (см Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)). В некоторых случаях, трансплантация CDR-участка может уменьшить специфичность и аффинность связывания, и, следовательно, биологическую активность, в CDR-трансплантированном нечеловеческом антителе, по сравнению с родительским антителом, из которого получены CDR-участки. Обратные мутации (иногда именуемые «ремонт каркасного участка»), могут применяться в выбранных положениях CDR-трансплантированного антитела, как правило, в каркасных участках, для того, чтобы восстановить специфичность и аффинность связывания родительского антитела. Определение позиций для возможных обратных мутаций может быть выполнено с использованием информации, имеющейся в литературе и в базах данных антител. Аминокислотные остатки, которые являются кандидатами для обратных мутаций, как правило, расположены на поверхности молекулы антитела, в то время как остатки, которые углублены или имеют низкую степень обнажения поверхности обычно не будут подвержены изменениям. Метод гуманизации, альтернативный трансплантации CDR-участка и обратной мутации, представляет собой изменение поверхности, при котором неэкспонированные на поверхности остатки нечеловеческого происхождения, сохраняются, в то время как экспонированные на поверхности остатки изменяются в человеческие остатки.

[0082] В некоторых случаях может также быть предпочтительным изменение одного или более остатков аминокислот CDR-участков с целью повышения аффинности связывания с целевым эпитопом. Это известно как «созревание аффиности» и в некоторых случаях может выполняться в связи с гуманизацией, например, в ситуациях, когда гуманизация антитела приводит к снижению специфичности или аффинности связывания, и не представляется возможным в достаточной степени улучшить специфичность или аффинность связывания с помощью только обратных мутаций. Различные методы созревания аффинности известны в данной области техники, например, способ in vitro сканирующего насыщающего мутагенеза, описанный Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), и способ пошагового in vitro созревания аффинности, предложенный Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037-6042(1998).

[0083] Термин «выделенный белок», «выделенный полипептид» или «выделенное антитело» относится к белку, полипептиду или антителу, которые в силу своего происхождения или источника получения, (1) не ассоциированы с ассоциированными в природе компонентами, сопутствующими им в нативном состоянии, (2) свободны от других белков того же вида, (3) экспрессированы клеткой другого вида или (4) не встречаются в природе. Таким образом, полипептид, который химически синтезирован или синтезирован в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он происходит в природных условиях, будет «выделенным» из своих ассоциированных в природе компонентов. Белок может быть также по существу освобожден от ассоциированных в природе компонентов посредством выделения с использованием способов очистки белков, хорошо известных в данной области.

[0084] Используемый в данном документе термин «зародышевый» относится к нуклеотидным и аминокислотным последовательностям генов антител и генных сегментов, как они передаются от родителей к потомству через зародышевые клетки. Последовательности зародышевой линии отличаются от нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела в зрелых В-клетках, которые были изменены в результате событий рекомбинации и сверхмутации во время созревания В-клеток. Антитело, которое «использует» конкретную последовательность зародышевой линии, имеет нуклеотидную и аминокислотную последовательности, которые согласовываются с той нуклеотидной последовательностью или аминокислотной последовательностью зародышевой линии, которой более полно соответствуют, чем с любой другой нуклеотидной или аминокислотной последовательностей зародышевой линии.

[0085] Термин «аффинность» относится к измерению притяжения между антигеном и связывающей молекулой, например, антителом. Внутренняя способность к притяжению связывающей молекулы по отношению к антигену, как правило, выражается как константа равновесия аффинности связывания (K_D) конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Считается, что связывающая молекула специфически связываться с антигеном, когда K_D составляет ≤ 1 мМ, предпочтительно ≤ 100 нМ. AK_D константа связывания аффинности может быть измерена, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore™) или биослойной интерферометрии, например, с использованием системы ProteOn™ XPR36 SPR от Bio-Rad или системы Octet™.

[0086] Термин «k_off» относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Константу скорости диссоциации k_off +можно измерить посредством биослойной интерферометрии, например, с помощью системы Octet™.

[0087] Термин «эпитоп» при использовании в данном документе относится к части (детерминанте) антигена, который специфически связывается со связывающей молекулой (например, и антитело или родственная молекула, такие как биспецифичная связывающая молекула). Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или углеводы, или боковые цепи Сахаров, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов. Эпитоп может быть «линейным» или «конформационным.» В линейном эпитопе, все точки взаимодействия между белком (например, антиген) и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) происходит линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе, точки взаимодействия происходят через аминокислотные остатки на белке, отделенные друг от друга в первичной аминокислотной последовательности. Когда желаемый эпитоп антигена определен, можно генерировать антитела к этому эпитопу с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Кроме того, генерация и характеристика антител или других связывающих молекул могут пролить свет на информацию о желательных эпитопах. Основываясь на этой информации, можно затем конкурентно скринировать связывающие молекулы для связывания с теми же или аналогичными эпитопами, например, путем проведения исследований конкуренции, чтобы найти связывающие молекулы, которые конкурируют за связывание с антигеном.

[0088] Можно определить, связывается ли антитело или другая связывающая молекула с тем же эпитопом или перекрестно конкурирует за связывание с IL-17A, IL-17F или ФНО-альфа с триспецифичной связывающей молекулой по данному изобретению, используя хорошо известные в данной области техники методы. В одном варианте осуществления изобретения возможно связывание триспецифичной связывающей молекуле, предложенной в данном изобретении, с IL-17A, IL-17F или ФНО-альфа в условиях насящения с последующим измерением способности испытуемого антитела связываться с указанным антигеном-мишенью. Если испытуемое антитело способно связываться с антигеном-мишенью в одно время с референсной триспецифичной связывающей молекулой, то испытуемое антитело связывается с эпитопом, отличным от эпитопа референсной триспецифичной связывающей молекулы. Тем не менее, если испытуемое антитело не способно связываться с антигеном-мишенью одновременно, то испытуемое антитело связывается с тем же эпитопом, перекрывающимся эпитопом или эпитопом, который находится в непосредственной близости от эпитопа, связанного с триспецифичной связывающей молекулой. Этот эксперимент может быть выполнен с использованием ИФА, РИА, анализа межмолекулярных взаимодействий на BIACORE™, биослойной интерферометрии или проточной цитометрии. Для того, чтобы проверить, кросс-конкурирует ли триспецифичная связывающая молекула по данному изобретению с другой связывающей молекулой, можно использовать описанный выше способ конкурентного анализа в двух направлениях, то есть определить, блокирует ли известная связывающая молекула испытуемую связывающую молекулу, и наоборот. Такие эксперименты по перекрестной конкуренции могут быть выполнены, например, с помощью прибора IBIS МХ96 SPR или системы Octet™.

[0089] В одном варианте осуществления изобретения связывающая молекула, предложенная в данном изобретении, представляет собой моноклональное антитело. Используемое в данном документе сокращение «mAb» относится к моноклональному антителу, то есть антителу, которые синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток. Клональная популяция может быть клональной популяцией иммортализованных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммортализованные клетки в клональной популяции являются гибридными клетками, гибридомами, которые обычно получают путем слияния отдельных В-лимфоцитов от иммунизированных животных с отдельными клетками лимфоцитарной опухоли. Гибридомы представляют собой тип сконструированных клеток и не встречаются в природе.

[0090] Класс (изотип) и подкласс антител может быть определен любым способом, известным в данной области техники. В целом, класс и подкласс антитела может быть определен с помощью антител, специфичных к конкретному классу и подклассу антител. Такие антитела коммерчески доступны. Класс и подкласс может быть определен с помощью ИФА, вестерн-блот анализа, а также другими методами. В другом варианте класс и подкласс может быть определен посредством секвенирования всех или части константных доменов тяжелой и/или легкой цепей антител, сравнения их аминокислотных последовательностей с известными аминокислотными последовательностями различных классов и подклассов иммуноглобулинов и определения класса и подкласса антител.

[0091] Термин «провоспалительные молекулы» включает, помимо прочего, лимфокины, монокины, традиционные полипептидные гормоны, гормоны роста, такие как человеческий гормон роста, N-метионильный человеческий гормон роста и бычий гормон рост, паратиреоидный гормон, тироксин, инсулин, проинсулин, релаксин, прорелаксин, гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреотропный гормон (ТТГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ), печеночный фактор роста, фактор роста фибробластов, пролактин, плацентарный лактоген, фактор и фактор некроза опухоли, мюллеровое подавляющее вещество, гонадотропин-ассоциированный мышиный пептид, ингибин, активин, фактор роста эндотелия сосудов, интегрин, тромбопоэтин (ТПО), фактор роста нервов и фактор роста тромбоцитов, трансформирующие факторы роста (TGF), инсулиноподобный факторы роста I и II, эритропоэтин (ЕРО), остеоиндуктивные факторы, интерфероны, колониестимулирующие факторы (CSF), такие как CSF макрофагов (M-CSF), CSF, гранулоцитарно-макрофагального (GM-CSF) и КСФ гранулоцитов (G-CSF), интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL15, IL-12, IL-17A, IL-22 и ИЛ-23, фактор некроза опухолей, и другие полипептидные факторы, индуцирующий фактор ингибирования лейкоза (LIF) и комплект лиганда (KL). Используемый в данном описании термин «провоспалительные молекулы» включает белки, выделенные из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активных эквивалентов указанных белков.

Триспецифичные анти-ФНОα/анти-IL-17А/анти-IL-17F связывающие молекулы

[0092] Настоящее изобретение относится к триспецифичной связывающей молекуле, направленной против IL-17A, IL-17F и провоспалительной молекулы, которая не является IL-17A или IL-17F, такой как ФНО-альфа. В отдельном варианте осуществления изобретения триспецифичные связывающие молекулы являются триспецифичными антителами или их антигенсвязывающими частями. Связывающие молекулы содержат домены, которые связываются с IL-17A, IL-17F и провоспалительной молекулой (например, ФНО-альфа). В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающие молекулы содержат первый связывающий домен, который связывается с IL-17A и IL-17F, и второй связывающий домен, который связывается с ФНО-альфа. В некоторых вариантах осуществления связывающие домены для IL-17A и IL-17F могут быть отдельными доменами.

[0093] В одном варианте осуществления изобретения триспецифичная анти-ФНО-альфа/анти-IL-17А/анти-IL-17F связывающая молекула, предложенная в данном изобретении, конкурирует за связывание с человеческим IL-17A и/или IL-17F или связывается с тем же эпитопом(-ами) указанного антигена(-ов), таким как содержащие VHH:

SEQ ID NO: 1-3; или

SEQ ID NO: 4.

[0094] В одном варианте осуществления изобретения триспецифичная анти-ФНО-альфа/анти-IL-17А/анти-IL-17F связывающая молекула, предложенная в данном изобретении, конкурирует за связывание с человеческим ФНО-альфа или связывается с тем же эпитопом(-ами) указанного антигена(-ов) антитела, содержащего:

SEQ ID NO: 10-15;

SEQ ID NO: 8 и 9; или

SEQ ID NO: 5 и 6.

[0095] В одном варианте осуществления изобретения триспецифичная анти-ФНО-альфа/анти-IL-17А/анти-IL-17F связывающая молекула изобретения конкурирует за связывание с человеческим IL-17A и/или IL-17F с или связывается с тем же эпитопом(-ами) указанного антигена(-ов), таким как содержащие VHH:

SEQ ID NO: 1-3; или

SEQ ID NO: 4;

и конкурирует за связывание с человеческим ФНО-альфа или связывается с тем же эпитопом(-ами) указанного антигена(-ов), таким как содержащие антитело:

SEQ ID NO: 10-15;

SEQ ID NO: 8 и 9; или

SEQ ID NO: 5 и 6.

[0096] В одном варианте осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула содержит анти-IL-17А/анти-IL-17F VHH домен. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-IL-17А/анти-IL-17F VHH домен является гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-IL-17A/анти-IL-17F VHH домен включает аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи (H-CDR1) с номером SEQ ID NO: 1, аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи (H-CDR2) с номером SEQ ID NO: 2, аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи (H-CDR3) с номером SEQ ID NO: 3 или любую из их комбинаций. В одном из вариантов осуществления изобретения домен VHH содержит аминокислотные последовательности H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 с номерами SEQ ID NO: 1-3. В некоторых вариантах осуществления изобретения VHH домен по меньшей мере на 60% идентичен последовательности SEQ ID NO: 4, например, по меньшей мере на 60%, 70% или 80% идентичен последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения VHH домен по меньшей мере на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO: 4, например, по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения VHH домен содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

[0097] В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула содержит анти-человеческое антитело к ФНО-альфа или его антигенсвязывающую часть. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-человеческое антитело ФНО-альфа представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающую часть (например, гуманизированный Fab-фрагмент).

[0098] В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь античеловеческого антитела к ФНО-альфа содержит аминокислотную последовательность H-CDR1 с номером SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность H-CDR2 с номером SEQ ID NO: 11, аминокислотную последовательность H-CDR3 с номером SEQ ID NO: 12, или любую их комбинацию. В одном варианте осуществления изобретения тяжелая цепь анти-человеческого антитела к ФНО-альфа содержит аминокислотные последовательности H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 с номерами SEQ ID NO: 10-12. В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь античеловеческого антитела к ФНО-альфа имеет вариабельный домен тяжелой цепи (VH), который по меньшей мере на 60% идентичен последовательности SEQ ID NO: 8, например, по меньшей мере на 60%, 70% или 80% идентичен последовательности SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь анти-человеческого антитела к ФНО-альфа имеет вариабельный домен тяжелой цепи (VH), который по меньшей мере на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO: 8, например, по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности SEQ ID NO: 8. В отдельном варианте осуществления изобретения VH домен содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8. VH может быть присоединен к константному домену тяжелой цепи (СН) молекулы изотипа IgG, IgM, IgE, IgA или IgD. В определенных вариантах осуществления изобретения СН относится к изотипу IgG, например, подтипу изотипа IgG1, IgG2a или b, IgG3 или IgG4. В отдельном варианте осуществления изобретения СН относится к подтипу изотипа IgG1.

[0099] В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь анти-человеческого антитела к ФНО-альфа (НС) по меньшей мере на 60% идентична последовательности SEQ ID NO: 5, например, не менее, чем на 60%, 70% или 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь анти-человеческого антитела к ФНО-альфа (НС) по меньшей мере на 90% идентична последовательности на SEQ ID NO: 5, например, по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 5. В отдельном варианте осуществления изобретения НС содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.

[0100] В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь анти-человеческого антитела к ФНО-альфа содержит аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи (L-CDR1) с номером SEQ ID NO: 13, аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи (L-CDR2) с номером SEQ ID NO: 14, аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи (L-CDR3) с номером SEQ ID NO: 15, или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь анти-человеческого антитела к ФНО-альфа содержит аминокислотные последовательности L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3 с номерами SEQ ID NO: 13-15. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь анти-человеческого антитела к ФНО-альфа содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), который по меньшей мере на 60% идентичен последовательности SEQ ID NO: 9, например, по меньшей мере на 60%, 70% или 80% идентичен последовательности SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь анти-человеческого антитела к ФНО-альфа содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), который по меньшей мере на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO: 9, например, по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности SEQ ID NO: 9. В отдельном варианте осуществления изобретения VL-домен содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.

[0101] В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь анти-человеческого антитела к ФНО-альфа (LC) по меньшей мере на 60% идентична последовательности SEQ ID NO: 6, например, по меньшей мере на 60%, 70% или 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь анти-человеческого антитела к ФНО-альфа (LC) по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 6, например, по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 6. В отдельном варианте осуществления изобретения VL-домен содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

[0102] В некоторых вариантах осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула, предложенная в данном изобретении, содержит анти-IL-17А/анти-IL-17F-связывающий домен (например, VHH домен) соединяющийся непосредственно или через линкер к тяжелой или легкой цепи анти-ФНО-альфа связывающего домена (например, антитело или его антигенсвязывающая часть). В одном варианте осуществления изобретения связывающая молекула содержит анти-IL-17A/анти-IL-17F VHH домен соединяющийся через линкер к легкой цепи анти-ФНО-альфа антителу с образованием слитой молекулы. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер по меньшей мере на 60% идентичен последовательности SEQ ID NO: 16, например, по меньшей мере на 60%, 70% или 80% идентичен последовательности SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер по меньшей мере на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO: 16, например, по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности SEQ ID NO: 16. В определенном варианте осуществления изобретения линкер содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления изобретения слитая молекула по меньшей мере на 60% идентична последовательности SEQ ID NO: 7, например, по меньшей мере на 60%, 70% или 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления изобретения слитая молекула по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 7, например, по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 7. В отдельном варианте осуществления изобретения слитая молекула содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.

[0103] В некоторых вариантах осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула содержит анти-ФНО-альфа-связывающий домен, содержащий любую из описанных выше тяжелых цепей и любую из описанных выше легких цепей, или их антигенсвязывающие части. В некоторых вариантах осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула далее содержит любой из описанных выше анти-IL-17А/анти-IL-17F-связывающих доменов. В отдельном варианте осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула содержит любую одну из описанных выше слитых молекул в сочетании с любым из описанных выше анти-ФНО-альфа-связывающим доменом тяжелых цепей.

[0104] Класс триспецифичной связывающей молекулы полученной способами, описанными в данном документе, может заменяться другим классом или подклассом. В одном из аспектов данного изобретения, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую VL или VH, выделяют с использованием способов, хорошо известных в данной области, так что она не включает последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих CL или СН. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие VL или VH, функционально соединили с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей CL или СН, соответственно, из другого класса молекулы иммуноглобулина. Это может быть достигнуто с использованием вектора или молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит CL или СН цепь, как описано выше. Например, связывающая молекула, которая изначально была IgM, может заменяться на класс IgG. Кроме того, замена класса может использоваться для конвертирования одного подкласса IgG в другой, например, из IgG1 в IgG2. Примерный способ получения связывающей молекулы, предложенной в данном изобретении, с желаемым изотипом, содержит этапы выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь связывающей молекулы и молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь связывающей молекулы, получение вариабельного домена тяжелой цепи, лигирование вариабельного домена тяжелой цепи с константным доменом тяжелой цепи желаемого изотипа, выделение легкой цепи и лигированной тяжелой цепи в клетке, а также получение связывающей молекулы с желаемым изотипом.

[0105] Триспецифичная связывающая молекула по данному изобретению может представлять собой молекулу IgG, IgM, IgE, IgA или IgD, но, как правило, относится к изотипу IgG, например, IgG1, IgG2a, или b, IgG3 или IgG4 подкласса IgG. В одном варианте осуществления изобретения связывающая молекула представляет собой антитело IgG1 подкласса IgG.

[0106] В одном варианте осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула содержит Fc-участок по меньшей мере с одной мутацией. Известен ряд различных Fc мутаций, когда эти мутации обеспечивают изменение эффекторной функции. Например, во многих случаях будет желательно уменьшение или устранение эффекторной функции, например, когда взаимодействие лиганда и рецептора является нежелательным или в случае конъюгатов антитела с лекарственным препаратом. Аминокислотные позиции Fc-участка, которые могут выгодно мутировать с целью снижения эффекторной функции, включают одну или более позиций 228, 233, 234 и 235, где позиции аминокислот пронумерованы в соответствии со схемой нумерации Kabat. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающая молекула содержит Fc-участок по меньшей мере с одной мутацией, которая сокращает ADCC и/или CDC по сравнению с той же связывающей молекулой без мутации.

[0107] В определенных вариантах осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула по данному изобретению может быть частью более крупной иммуноадгезивной молекулы, образованной ковалентной или нековалентной ассоциацией антитела или части антитела с одним или более другими белками или пептидами. Примерами таких иммуноадгезивных молекул являются использование области ядра стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)) и использование остатка цистеина, маркер-пептида и С-концевой полигистидиновой метки для получения бивалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)). Другие примеры включают примеры, где один или более CDR-участков из антитела включены в молекулу ковалентно или нековалентно, чтобы получить иммуноадгезин, который специфично связывается с представляющим интерес антигеном. В таких вариантах осуществления изобретения CDR-участки могут быть включены как часть более крупной полипептидной цепи, могут ковалентно соединяться с другой полипептидной цепью или могут включаться нековалентно.

[0108] В другом варианте осуществления изобретения может быть получено слитое антитело или иммуноадгезин, который содержит всю или часть триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению, соединенную с другим полипептидом. В некоторых вариантах осуществления изобретения только вариабельные домены триспецифичной связывающей молекулы соединяются с полипептидом. В некоторых вариантах осуществления изобретения VH домен триспецифичной связывающей молекулы соединен с первым полипептидом, тогда как VL домен триспецифичной связывающей молекулы соединен со вторым полипептидом, который асссоциируется с первым полипептидом таким образом, что VH и VL домены могут взаимодействовать друг с другом с образованием антигенсвязывающего участка. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения VH домен отделен от VL домена линкером таким образом, что домены VH и VL могут взаимодействовать друг с другом (например, одноцепочечные антитела). Антитело VH-линкер-VL затем соединяется с представляющим интерес полипептидом. Кроме того, могут создаваться слитые антитела, в которых два (или более) одноцепочечных антитела соединены друг с другом. Это используется, если необходимо создать двухвалентное или поливалентное антитело на одной полипептидной цепи, или при создании мульти-специфичных антител.

[0109] Для создания одноцепочечного антитела (scFv) VH- и VL-кодирующие фрагменты ДНК функционально соединяются с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4 - Ser)3, так что последовательности VH и VL могут быть экспрессированы в виде непрерывного одноцепочечного белка с VL и VH доменами, соединенными гибким линкером. См., например, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); and McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Одноцепочечное антитело может быть одновалентным, если используется только один VH и VL домен; двухвалентным, если используются два VH и VL домена; или поливалентным, если используются более чем два VH и VL домена.

[0110] В других вариантах осуществления изобретения другие модифицированные антитела могут быть получены с использованием триспецифичной связывающей молекулы, кодирующей молекулы нуклеиновых кислот. Например, «каппа тела» (III etal., Protein Eng. 10:949-57 (1997)), «минитела» (Martin etal., EMBO J. 13:5303-9(1994)), «диатела» (Holliger etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)), или «Janusins» [биспецифичные одноцепочечные молекулы] (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) и Traunecker etal., Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992)), могут быть получены с использованием стандартных молекулярно-биологических методов, придерживаясь принципов данного описания.

[0111] Триспецифичную связывающую молекулу изобретения можно дериватизировать или соединить с другой молекулой (например, другим пептидом или белком). В целом, связывающие молекулы (например, антитела или антигенсвязывающие их части) дериватизируют таким образом, что дериватизация и мечение не оказывают неблагоприятного влияния на связывание с IL-17A, IL-17F и/или ФНО-альфа. Таким образом, связывающие молекулы по данному изобретению могут включать как интактные, так и модифицированные формы триспецифичных связывающих молекул, описанных в настоящем документе. Например, связывающая молекула по данному изобретению может быть функционально соединена (путем химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одним или более молекулярными образованиями, такими как другое антитело, детектирующий агент, фармацевтический агент и/или белок или пептид, который может опосредовать ассоциацию связывающей молекулы с другой молекулой (такой как область ядра стрептавидина или полигистидиновая метка).

[0112] Один тип дериватизированной связывающей молекулы получают путем сшивания двух или более антител (одного и того же типа или различных типов, например, для создания биспецифичных антител). Подходящие сшивающие агенты включают те, которые являются гетеробифункциональными, имеющими две различные реактивные группы, разделенные подходящим спейсером (например, сложный эфир m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида) или гомобифункциональными (например, дисукцинимидил суберат). Такие линкеры имеются в наличии у Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

[0113] Триспецифичная связывающая молекула по данному изобретению также может быть дериватизированна с химической группой, такой как полиэтиленгликоль (PEG), метильной или этильной группой, или углеводной группой. Эти группы могут использоваться для улучшения биологических характеристик связывающей молекулы, например, увеличение периода полувыведения в сыворотке крови.

[0114] Триспецифичная связывающая молекула изобретения также может быть меченой. Используемый в настоящем описании термины «метка» или «меченый» относится к встраиванию другой молекулы в связывающую молекулу. В одном варианте осуществления изобретения метка представляет собой детектируемый маркер, например, включение радиоактивной аминокислотной метки или присоединение к полипептиду биотиниловых фрагментов, которые могут быть обнаружены с помощью меченного авидина (например, стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которые могут быть детектируемы оптическими или колориметрическими способами). В другом варианте осуществления изобретения метка или маркер может быть терапевтической, например, конъюгат с лекарственным препаратом или токсин. Различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов хорошо известны в данной области техники и могут быть использованы. Примеры меток для полипептидов включают, помимо прочего, следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3Н, 14С, 15N, 35S, 90Y, 99Тс, 111In, 125I, 131I), флуоресцентные метки (например, ФИТЦ, родамин, лантаноидов люминофоры), ферментные метки (например, пероксидазу хрена, β-галактозидазы, люциферазы, щелочной фосфатазы), хемилюминесцентные маркеры, биотиниловые группы, предварительно определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, пары последовательностей лейциновой молнии, сайты связывания для вторичных антител, связывающих доменов металлов, эпитопные метки), магнитные агенты, такие как хелаты гадолиния, токсины, такие как коклюшный токсин, таксол, цитохалазин, грамицидин D, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидрокси антрацин дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаина, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. В некоторых вариантах осуществления изобретения метки прикреплены плечами спейсера различной длины для снижения потенциального стерического затруднения.

[0115] В определенных вариантах осуществления изобретения триспецифичные связывающие молекулы по данному изобретению, могут присутствовать в нейтральной форме (в том числе и цвиттер-ионных формах) или в форме как положительно, так и отрицательно заряженных частиц. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут образовывать комплекс с противоионом с образованием фармацевтически приемлемой соли.

[0116] Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к комплексу, содержащему одну или более триспецифичных связывающих молекул и один или более противоионов, полученных из фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований.

[0117] Фармацевтически приемлемые неорганические основания включают ионы металлов, включая, помимо прочего, подходящие соли щелочных металлов, соли щелочноземельных металлов и другие физиологические ионы приемлемых металлов. Соли, полученные из неорганических оснований, включают соли алюминия, аммония, кальция, кобальта, никеля, молибдена, ванадия марганца, хрома, селена, олова, меди, трехвалентного железа, лития, магния, марганцевые или марганцовистые соли, соли калия, рубидия, натрия и цинка, например, с их обычными валентностями.

[0118] Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли триспецифичных связывающих молекул по настоящему изобретения могут быть получены из следующих кислот, включая, помимо прочего, муравьиную, уксусную, ацетамидобензойную, адипиновую, аскорбиновую, борную, пропионовую, бензойную, камфорную, угольную, цикламовую, дегидрохолевую, малоновую, эдетовую (этилендиаминтетрауксусную), этилсерную, фендизойную (fendizoic), метафосфорную, янтарную, гликолевую, глюконовую, молочную, яблочную, винную, дубильную, лимонную, азотную, глюкуроновую, малеиновую, фолевую, фумаровую, пировиноградную, аспарагиновую, глутаминовую, соляную, бромистоводородную, иодистоводородную, лизин, изолимонную, трифторуксусную, памовую, антраниловую, метансульфоновую (mesylic), оротовую, щавелевую, щавелевоуксусную, олеиновую, стеариновую, салициловую, аминосалициловую, силикат, пара-гидроксибензойную, никотиновую, фенилуксусную, миндальную, эмбоновую, сульфоновую, метансульфоновую, фосфорную, фосфоновую, этансульфоновую, этандисульфоновую, аммоний, бензолсульфоновую, пантотеновую, нафталинсульфоновую, толуолсульфоновую, 2-гидроксиэтансульфоновую, сульфаниловую, серную, азотную, азотистую, монометиловый сложный эфир серной кислоты, циклогексиламиносульфоновую, β-гидроксимасляную, глицин, глицилглицин, какодиловую, диаминокапроновую, камфорсульфоновую, тиоциановую, оксоглутаровую, пиридоксаль-5-фосфат, хлорфеноксиуксусную, ундекановую, N-ацетил-L-аспарагиновую, галактаровую и галактуроновую кислоты.

[0119] Фармацевтически приемлемые органические основания включают триметиламин, диэтиламин, N,N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, дибензиламин, диэтаноламин, этилендиамин, меглумин (N-метилглукамин), прокаин, циклические амины, четвертичные аммониевые катионы, аргинин, бетаин, кофеин, клемизол, 2-этиламиноэтанол, 2-диэтиламиноэтанол, 2-диметиламиноэтанол, этандиамин, бутиламин, этаноламин, этилендиамин, N-этилморфолин, N-этилпиперидин, этилглукамин, глюкамин, глюкозамин, гистидин, гидрабамин, имидазол, изопропиламин, метилглюкамин, морфолин, пиперазин, пиридин, пиридоксин, неодим, пиперидин, полиаминовые смолы, прокаин, пурины, теобромин, триэтиламин, трипропиламин, триэтаноламин, трометамин, метиламин, таурин, холат, 6-амино-2-метил-2-гептанол, 2-амино- 2-метил-1,3-пропандиол, 2-амино-2-метил-1-пропанол, алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенил-замещенные алкановые кислоты, гидроксильные алкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты, стронций, трицин, гидразин, phenylcyclohexylamine, 2- (N-морфолино) этансульфоновой кислоты, бис (2-гидроксиэтил) амино-трис (гидроксиметил) метана, N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновая кислота, 1,4-piperazinediethanesulfonic кислота, 3-морфолино-2-hydroxypropanesulfonic кислоты, 1,3-бис [трис (гидроксиметил) метиламино] пропан, 4-morpholinepropanesulfonic кислота, 4-(2-гидроксиэтил) пиперазин-1-этансульфоновой кислоты, 4-(2-гидроксиэтил) пиперазин-1-этансульфоновую кислотыу 2-[(2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметил)этил)амино]этансульфоновую кислоту, N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтанансульфоную кислоту, 4-(N-морфолино)бутансульфоновую кислоту, 3-(N,N-бис[2-гидроксиэтил]амино)-2-гидроксипропансульфоновую кислоту, 2-гидрокси-3-[трис(гидроксиметил)метиламино]-1-пропансульфоновую кислоту, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-(2-гидроксипропансульфоновую кислоту), пиперазин-1,4-бис(2-гидроксипропансульфоновую кислоту)дигидрат, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинпропансульфоную кислоту, N,N-бис(2-гидроксиэтил)гилицин, N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(4-бутансульфоновую кислоту), N-[трис(гидроксиметил)метил]-3-аминопропансульфоновую кислоты, N-трис(гидроксиметил)метил-4-аминобутансульфоновую кислоту, N-(1,1-диметил-2-гидроксиэтил)-3-амино-2-гидроксипропансульфоновую кислоту, 2-(циклогексиламино)этансульфоновую кислоту, 3-(циклогексиламино)-2-гидрокси-1-пропансулльфоновую кислоту, 3-(циклогексиламино)-1-пропансульфоновую кислоту, N-(2-ацетоамидо)иминодиуксусную кислоту, 4-(циклогексиламино)-1-бутансульфоновую кислоту, N-[трис(гидроксиметил)метил]глицин, 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол и трометамол.

[0120] В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифичные молекулы антитела по настоящему изобретению содержат анти-ФНО-альфа антитело, содержащее две тяжелые цепи и две легкие цепи или его антигенсвязывающую часть, а также анти-IL-17А/анти-IL-17F VHH соединяющиеся (напрямую или через линкер) с антителом. Анти-IL-17А/анти-IL-17F VHH может быть соединен своим N-концом или С-концом к N-концу или С-концу тяжелой или легкой цепи анти-ФНО-альфа антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-IL-17А/анти-IL-17F VHH соединен с N-концом легкой цепи анти-ФНО-альфа антитела. Любое такое слияние, описанное в настоящем документе, может быть получено в соответствии со способами, известными в данной области техники. См., например, Ahmad et al., Clinical and Developmental Immunology 2012, Article ID 980250 (2012). В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-ФНО-альфа антитело присоединяется к анти-IL-17А/анти-IL-17F VHH с помощью линкера, более предпочтительно с помощью пептидного линкера, и наиболее предпочтительно с помощью пептидного линкера, который лишен сайта протеолитического расщепления. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки из пептидного линкера выбраны из G, A, S, Р, Е, Т, D и К. В некоторых вариантах осуществления изобретения пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

Молекулы нуклеиновых кислот и векторы

[0121] Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, и последовательностям, кодирующим триспецифичные связывающие молекулы по данному изобретению, описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения различные молекулы нуклеиновых кислот кодируют первый домен и второй домен аминокислотной последовательности триспецифичной связывающей молекулы. Там, где первый домен и/или второй домен содержит тяжелую цепь и легкую цепь, в некоторых вариантах осуществления изобретения различные нуклеиновые кислоты кодируют тяжелую цепь и аминокислотные последовательности легкой цепи. В других вариантах осуществления изобретения та же молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательность тяжелой цепи и аминокислот легкой цепи. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты может кодировать любую комбинацию из аминокислотных последовательностей (например, последовательности тяжелой и легкой цепи) первого и второго домена. В конкретной варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты может кодировать аминокислотную последовательность первого связывающего домена и аминокислотную последовательность легкой цепи второго связывающего домена, необязательно включающей любую последовательность соединяющего их пептидного линкера.

[0122] Ссылка на нуклеотидную последовательность, охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью. Термин «полинуклеотид», упоминаемое в данном документе, означает полимерную форму нуклеотидов, по меньшей мере 10 оснований в длину, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Термин включает в себя одно- и двухцепочечные формы.

[0123] Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичны одной или нескольким из вышеупомянутых нуклеотидных последовательностей или нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16. В определенных вариантах осуществления нуклеотидные последовательности по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4-9. Термин «процент идентичности последовательности» в контексте последовательностей нуклеиновых кислот, относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Сравнение идентичности последовательности может проходить на участке длиной по меньшей мере около девяти нуклеотидов, обычно по меньшей мере около 18 нуклеотидов, чаще по меньшей мере около 24 нуклеотида, типично по меньшей мере около 28 нуклеотидов, более типично по меньшей мере около 32 нуклеотидов, и предпочтительно по меньшей мере около 36, 48 или более нуклеотидов. Существует целый ряд различных алгоритмов, известных в данной области, которые могут быть использованы для измерения идентичности нуклеотидной последовательности. Например, полинуклеотидные последовательности можно сравнить с использованием FASTA, Gap или BESTFIT, которые являются программами в Wisconsin Package версии 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Мэдисон, штат Висконсин. FASTA, которая включает, например, программы FASTA2 и FASTA3, обеспечивает выравнивание и процентную идентичность последовательности в областях наилучшего покрытия между запрашиваемой и искомой последовательностями (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998); включены в настоящий документ путем отсылки). Если не указано иное, используются параметры по умолчанию для конкретной программы или алгоритма. Например, процент идентичности последовательности между последовательностями нуклеиновых кислот может быть определен с использованием FASTA с параметрами по умолчанию (размер слова 6 и фактора NOPAM для балльной матрицы) или с использованием Gap с параметрами по умолчанию, как это предусмотрено в GCG версии 6.1, включенных в настоящий документ путем осылки.

[0124] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-16. Молекула нуклеиновой кислоты может также содержать любую комбинацию указанных нуклеотидных последовательностей. В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 4. В другом варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 4 и 6. В другом варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 4, 6 и 16. В другом варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 5.

[0125] В любом из указанных выше вариантах осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот могут быть выделенными.

[0126] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, подходящему для экспрессии любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе. Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих). В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы»).

[0127] Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из аминокислотных последовательностей триспецифичных связывающих молекул или их частей (например, последовательностей тяжелой и/или легкой цепи первого и/или второго связывающих доменов) как описано в настоящем документе. Настоящее изобретение далее относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител и их зонды.

[0128] Молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может быть выделена из любого источника, который продуцирует триспецифичную связывающую молекулу или ее часть. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты данному изобретению может быть синтезирована, а не выделена.

[0129] В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую VH домен из первого или второго домена триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению, соединенного в рамках считывания с нуклеотидной последовательности, кодирующей константный домен тяжелой цепи из любого источника. Аналогичным образом, молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую VL домен из первой или второй области триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению, объединеной в рамках считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен легкой цепи из любого источника.

[0130] В еще одном аспекте настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельный домен тяжелой (VH) и/или легкой (VL) цепей первого или второго связывающего домена, могут «преобразовываться» по всей длине генов антитела. В одном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие домены VH или VL преобразуются в гены антитела по всей длине путем вставки в экспрессионный вектор, уже кодирующей константные домены тяжелой цепи (СН) или легкой цепи (CL), соответственно, так что VH сегмент функционально соединен с СН сегментом(-ами) в векторе и/или VL сегмент оперативно соединен с CL сегментом в векторе. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие VH и/или VL домены преобразуются в гены по всей длине антитела путем соединения, например, лигирования, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VH и/или VL домены, к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей СН и/или CL домены с использованием стандартных молекулярно-биологических методов. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие по всей длине тяжелую и/или легкую цепи, могут затем экспрессироваться из клетки, в которую они были введены.

[0131] Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для экспрессии большого количества рекомбинантных триспецифичных связывающих молекул. Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для получения человеческих антител, гуманизированных антител, химерных антител, биспецифических антител, одноцепочечных антител, иммуноадгезинов, диател, мутировавших антител и производных антител, как описано в настоящем документе.

[0132] В другом варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению используется в качестве зонда или праймера ПЦР для определенной аминокислотной последовательности. Например, нуклеиновая кислота может быть использована в качестве зонда в способах диагностики или в качестве праймера ПЦР для амплификации участков ДНК, которые могут использоваться, например, для выделения дополнительных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих участки (например, вариабельные домены) триспецифичной связывающей молекулы. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот являются олигонуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления изобретения олигонуклеотиды - из высоковариабельных доменов триспецифичной связывающей молекулы. В некоторых вариантах осуществления изобретения олигонуклеотиды кодируют все или часть одного или нескольких CDR-участков триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению, как описано в данном документе.

[0133] В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот и векторы могут быть использованы для изготовления мутировавших триспецифичных связывающих молекул. Антитела могут мутировать в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей первого и/или второго связывающего домена, например, для изменения связывающей способности триспецифичной связывающей молекулы. Например, мутация может произойти в одном или нескольких CDR-участках, чтобы увеличить или уменьшить KD триспецифичной связывающей молекулы, чтобы увеличить или уменьшить k_off или изменить специфичность связывания антитела в отношении L-17A, IL-17F и/или ФНО-альфа. В другом варианте осуществления изобретения одной или более мутациям подвергнут аминокислотный остаток, который, как известно, изменен по сравнению с зародышевой линией в антителе, соответствующем первому или второму связывающему домену триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению. Эти мутации могут быть сделаны в CDR-участке или каркасном участке вариабельного домена, или в константном домене. В предпочтительном варианте осуществления изобретения мутации произведены в вариабельном домене. В другой варианте осуществления изобретения одной или нескольким мутациям подвергнут аминокислотный остаток, который, как известно, изменен по сравнению с зародышевой линией в CDR-участке или каркасном участке вариабельного домена триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению.

[0134] В другой варианте осуществления изобретения каркасный участок(-и) мутирует таким образом, что полученный каркасный участок(-и) имеет аминокислотную последовательность соответствующего гена зародышевой линии. Мутации могут осуществляться в каркасном участке или константном домене, чтобы увеличить период полувыведения триспецифичной связывающей молекулы. См., например, WO 00/09560. Мутация в каркасном участке или константном домене также может быть произведена для изменения иммуногенности триспецифичной связывающей молекулы и/или обеспечить участок для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой. В соответствии с изобретением триспецифичная связывающая молекула может иметь мутации в любом одном или нескольких из CDR-участков или каркасных участков вариабельного домена или в константном домене.

[0135] В некоторых вариантах осуществления изобретения триспецифичные связывающие молекулы по данному изобретению экспрессируются путем вставки ДНК, кодирующей частично или полностью последовательность первого и второго связывающего домена (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательности тяжелой и легкой цепи), полученный, как описано выше, в экспрессионных векторах таким образом, что гены функционально соединены с необходимыми последовательностями, контролирующими экспрессию, такими как транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности. Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы (AAV), вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV полученные эписомы и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть лигированы в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК, кодирующие частично или по всей длине последовательности первого и второго связывающих доменов (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательность тяжелой и легкой цепи) могут быть введены в отдельные векторы. В одном варианте осуществления изобретения любая комбинация указанных выше молекул ДНК вводится в тот же экспрессионный вектор. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют).

[0136] Подходящим вектором является тот, который кодирует функционально законченные последовательности СН или CL человеческого иммуноглобулина с конструированием соответствующего места рестрикции так, что любая последовательность VH или VL может быть легко включена и экспрессирована, как описано выше. НС - и LC-кодирование генов в таких векторах может содержать интронные последовательности, что приводит к общему увеличению белковых продуктов антитела путем стабилизации соответствующей мРНК. Интронные последовательности находится в окружении сплайс-донора и сплайс-акцептора сайтов, которые определяют, где будет происходить сплайсинг РНК. Расположение интронных последовательностей может быть либо в вариабельных или константных участках цепей антитела, или как в вариабельных, так и константных участках, когда используются несколько интронов. Прекращение полиаденилирования и транскрипции может произойти вниз по ходу сайта нативной хромосомы кодируемых участков. Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный пептид, который облегчает выработку цепочки антитела клеткой-хозяином. Ген цепочки антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид соединен с рамкой считывания аминоконца цепи иммуноглобулина. Сигнальным пептидом может быть сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (то есть, сигнальный пептид белка не иммуноглобулиновой природы).

[0137] Помимо цепочки генов антител, рекомбинантная экспрессия векторов по данному изобретению может нести регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антител в клетке-хозяине. Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как селекция клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Предпочтительные регулирующие последовательности для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промотеры и/или энхансеры полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотера/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотера/энхансера), аденовируса, (например, аденовирус большого позднего промотора (AdMLP)), вирус полиомы, а также сильных промотеров млекопитающих, таких как нативный иммуноглобулин и актин промотеров. Для дальнейшего описания вирусных регулирующих элементов и их последовательностей см., например, патенты США 5,168,062, 4,510,245 and 4,968,615. Способы экспрессии связывающих молекул, таких как антитела растений, в том числе описание промотеров и векторов, а также трансформация растений, известны в данной области техники. См., например, патент США 6,517,529. Методы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной области техники.

[0138] В дополнение к генам цепи антитела и регулирующим последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017). Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую вектор введен. Например, гены селектируемого маркера включают ген дигидрофолат редуктазы (DHFR) (для использования в dhfr-клетках-хозяевах при селекции/амплификации метотрексата), ген нео (для селекции G418) и ген синтетазы глутамата.

[0139] Термин «последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотер рибосомального сайта связывания, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промотеры и последовательности терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток.

Клетки-хозяева и способы получения триспецифичной связывающей молекулы

[0140] Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способам получения триспецифичных связывающих молекул по данному изобретению. Один вариант осуществления изобретения относится к способу получения триспецифичных связывающих молекул, как определено в настоящем документе, содержащему введение рекомбинантной клетки-хозяина, способной экспрессировать триспецифичную связывающую молекулу, культивацию указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии триспецифичной связывающей молекулы, и выделение полученной триспецифичной связывающей молекулы. Триспецифичные связывающие молекулы, полученные такой экспрессией в таких рекомбинантных клетках-хозяевах упоминаются в данном документе как «рекомбинантные триспецифичные связывающие молекулы.» Там, где триспецифичные связывающие молекулы являются антителами, они называются «рекомбинантными антителами». Изобретение также относится к потомству клеток таких клеток-хозяев и триспецифичных связывающих молекул получаемых аналогично.

[0141] Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые могут включать, например, вектор в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше. Настоящее изобретение относится также к клеткам-хозяевам, которые включают, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающие части, нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь или ее антигенсвязывающие части, или обе из них, первого связывающего домена и/или второго связывающего домена триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению. Следует понимать, что «рекомбинантная клетка-хозяин» и «клетка-хозяин» означают не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может, на самом деле, быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по-прежнему включены в объем термина «клетка-хозяин» при использовании в настоящем документе.

[0142] Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие триспецифичные связывающие молекулы по изобретению и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы для трансфекции подходящего млекопитающего, растения, бактериальной или дрожжевой клетки-хозяина. Преобразование может происходить любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают декстран-опосредованную трансфекцию, осаждение фосфата кальция, полибрен-опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, инкапсуляцию полинукпеотида(-ов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В дополнение, молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными векторами. Способы трансформации клеток хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США, 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 и 4,959,455. Способы трансформации клеток растений хорошо известны в данной области, включая, например, Agrobacterium-опосредованную трансформацию, биолистическую трансформацию, прямую инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Методы трансформации клеток бактерий и дрожжей также хорошо известны в данной области.

[0143] Клеточные линии млекопитающих используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных клеточных линий доступных в Американской коллекции типовых культур (АТСС). К ним относятся, в частности, клетки яичников китайского хомячка (СНО), NS0 клетки, клетки SP2, НЕК-293Т клетки, 293 Фристайл клетки (Invitrogen), NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (ВНК), клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), А549 клетки и ряд других клеточных линий. Клеточные линии особого предпочтения выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующих триспецифичные связывающие молекулы, вводятся в клетки-хозяева млекопитающих, связывающие молекулы продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии связывающей молекулы в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, выделения связывающей молекулы в питательной среде, в которой выращиваются клетки-хозяева. Триспецифичные связывающие молекулы могут быть восстановлены из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды Е. coli и Streptomyces. Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.

[0144] Кроме того, экспрессию триспецифичных связывающих молекул по данному изобретению из продуцирующей клеточной линии можно усилить с помощью ряда известных методов. Например, система экспрессии гена глутамин синтетазы (система GS) является достаточно распространенной для усиления экспрессии при определенных условиях. Система GS обсуждается в целом или частично в связи с патентами ЕР 0216846, 0256055, 0323997 и 0338841.

[0145] Вполне вероятно, что триспецифичные связывающие молекулы различных клеточных линий или трансгенные животные будут отличаться друг от друга профилем гликозилирования. Однако все триспецифичные связывающие молекулы, кодируемыми молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в данном документе, или содержащими аминокислотные последовательности, приведенные в настоящем документе, являются частью данного изобретения, независимо от состояния гликозилирования связывающих молекул и в целом, независимо от наличия или отсутствия пост-трансляционных модификаций.

[0146] Триспецифичные связывающие молекулы могут изготавливаться с использованием различных способов. Например, домены, связывающиеся с IL-17а, IL-17F, ФНО-альфа и/или любым их сочетанием, могут быть приготовлены отдельно (например, с помощью, химического белкового синтеза, способами рекомбинантной экспрессии, гибридомной технологии, и т.д.) и затем химически прикреплены друг к другу, непосредственно или с помощью линкера. Средства химической конъюгации молекул (например, антител или их антигенсвязывающих частей) хорошо известны в этой области. Полипептиды, как правило, содержат целый ряд функциональных групп; например, карбоновая кислота (СООН) или безаминные (-NH2) группы, способные реагировать с подходящими функциональными группами соответствующего полипептида или линкера. Антитела могут также быть дериватизированы для взаимодействия или присоединения дополнительных функциональных групп и могут включать прикрепление одной или нескольких молекул линкера, таких как те, что предлагаются Pierce Chemical Company, Rockford 111. Линкеры, используемые в триспецефичных связывающих молекулах по данному изобретению, могут быть любыми из различных подходящих линкеров, известных в этой области.

[0147] В некоторых вариантах осуществления изобретения связывание доменов с IL-17a, IL-17F, ФНО-альфа и/или любым их сочетанием производится путем экспрессии рекомбинантных антител или их антигенсвязывающих частей в клетках-хозяевах. Последовательности, кодирующие любую комбинацию связывающих доменов, могут быть соединены (напрямую или через линкер). Полученные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие домены, связывающиеся с IL-17а, IL-17F, ФНО-альфа, вставляют в экспрессионные векторы и вводят в клетки-хозяев. Полученные триспецифичные связывающие молекулы затем экспрессируются, изолируются и очищаются от системы экспрессии.

[0148] В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающие домены триспецифичной связывающей молекулы могут быть спарены вместе посредством инновационной молекулой линкера, предназначенной для защиты от протеолитической деградации связывающей молекулы. Такой линкер обычно лишен сайта протеолитического расщепления.

Фармацевтические композиции

[0149] Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента (или в качестве единственного активного ингредиента) триспецифичную связывающую молекулу по данному изобретению. Фармацевтическая композиция может включать любую из триспецифичных связывающих молекул, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции предназначены для улучшения, профилактики или лечения нарушений, которые могут быть связаны с активностью IL-17A, IL-17F, ФНО-альфа и/или аутоиммунных или воспалительных заболеваний.

[0150] Как правило, триспецифичные связывающие молекулы по данному изобретению пригодны для применения в виде лекарственных форм в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемыми инертными наполнителями, например, как описано далее.

[0151] Фармацевтические композиции по данному изобретению могут содержать по меньшей мере одну триспецифичную связывающую молекулу и одну или более дополнительных связывающих молекул (например, антител), которые нацелены на один или более соответствующих поверхностных рецепторов, например, поверхностный рецептор клеток, участвующих в аутоиммунных или воспалительных реакциях.

[0152] Термин «наполнитель» используется в данном документе для описания любого ингредиента, отличающегося от соединения(-ий) по данному изобретению. Выбор инертного наполнителя будет в значительной степени зависеть от таких факторов, как конкретный способ введения, действие наполнителя на растворимость и стабильность и характер лекарственной формы. При использовании в данном документе «фармацевтически приемлемый наполнитель» включает все без исключения растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и подобные физиологически совместимые вещества. Некоторыми примерами фармацевтически приемлемых наполнителей являются вода, физиологический раствор, фосфатный буфер, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительным включить в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннитол, сорбит, или хлорид натрия. Дополнительными примерами фармацевтически приемлемых веществ являются увлажняющие агенты или небольшое количество вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие вещества, консерванты или буферы, которые увеличивают продолжительность хранения или эффективность антитела.

[0153] Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Такие композиции и способы их изготовления можно найти, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995). Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики).

[0154] Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться, в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащего заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки.

[0155] Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению.

[0156] Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, как правило, пригодны для парентерального введения. Используемый в данном документе термин «парентеральное введение» фармацевтической композиции включает любой способ введения, для которого характерно физическое нарушение целостности ткани субъекта и введение фармацевтической композиции через нарушение в ткани, что обычно приводит к прямому попаданию в кровоток, в мышцу или во внутренний орган. Таким образом, парентеральное введение включает, помимо прочего, введение фармацевтической композиции путем инъекции композиции посредством введения композиции через хирургический разрез, путем нанесения композиции с помощью проникающей в ткани нехирургической раны и т.п. В частности предполагается, что парентеральное введение включает, помимо прочего, подкожную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутривенную, внутриартериальную, интратекальную, внутрижелудочковую, интрауретральную, внутричерепную, внутрисуставнную инъекцию или инфузии; и почечные диализные инфузионные методики. Внутриопухолевая доставка, например, внутриопухолевая инъекция, также может оказаться полезной. Также предусмотрена региональная перфузия. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают внутривенный и подкожный пути.

[0157] Лекарственные формы фармацевтических композиций, подходящие для парентерального введения, обычно содержат активный ингредиент в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, например, стерильной водой или стерильным изотоническим раствором. Такие лекарственные формы могут быть изготовлены, упакованы или проданы в форме, подходящей для болюсного введения или для непрерывного введения. Инъекционные лекарственные формы могут быть изготовлены, упакованы или проданы в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах, или в многодозовых контейнерах, содержащих консервант. Лекарственные формы для парентерального введения включают, помимо прочего, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных основах, пасты и тому подобное. Такие лекарственные формы могут также содержать один или более дополнительных ингредиентов, включая, помимо прочего, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие агенты. В одном варианте осуществления изобретения композиции для парентерального введения активный ингредиент предоставляется в сухой форме (то есть, порошок или гранулы) для растворения с подходящей основой (например, стерильная апирогенная вода) до парентерального введения восстановленного состава. Парентеральные лекарственные формы и также включают водные растворы, которые могут содержать наполнители, такие как соли, углеводы и буферные агенты (предпочтительно до рН от 3 до 9), но для некоторых видов применения более подходящей лекарственной формой может являться стерильный неводный раствор или сухая форма для использования в сочетании с подходящей основой, такой как стерильная апирогенная вода. Примером формы для парентерального введения являются растворы или взвеси в стерильных водных растворах, например, водные растворы пропиленгликоля или декстрозы. Такие лекарственные формы при необходимости могут быть буферными. Другие подходящие лекарственные формы для парентерального введения могут включать те, которые содержат активный ингредиент в микрокристаллической форме или в липосомальном препарате. Лекарственные формы для парентерального введения могут быть выполнены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Лекарственные формы с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.

[0158] Например, в одном из аспектов стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения триспецифичной связывающей молекулы в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей фильтрационной стерилизацией. Обычно дисперсии получают введением активного соединения в стерильный растворитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов, способы получения представляют собой сушку вымораживанием (лиофилизацию), которая дает порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желательный ингредиент из его предварительно стерилизованного фильтрацией раствора. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, применением материалов покрытия, таких как лецитин, поддержанием необходимого размера частиц в случае дисперсий и применением поверхностно-активных веществ. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может быть осуществлено путем включения в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например, моностеараты и желатин, и/или путем покрытий с модифицированным высвобождением (например, покрытий с медленным высвобождением).

[0159] Триспецифичные связывающие молекулы по данному изобретению могут также вводиться интраназально или ингаляционно, обычно в форме сухого порошка (самостоятельно, в виде смеси или в виде частиц со смешанными компонентами, например, смешанными с подходящим фармацевтически приемлемым наполнителем) из ингалятора с сухим порошком, такого как аэрозольный контейнер под давлением, помпа, спрей, распылитель (предпочтительно распылитель, в котором использован принцип электрогидродинамики для получения мелкодисперсного тумана) или небулайзер, в котором используется или не используется подходящий пропеллент, или в виде назальных капель.

[0160] Контейнер под давлением, помпа, спрей, распылитель или небулайзер обычно содержит раствор или суспензию связывающей молекулы по данному изобретению, включая, например, подходящее вещество для диспергирования, растворения или продления высвобождения активного вещества, пропеллент в качестве растворителя.

[0161] До использования в виде сухого порошка или суспензии, лекарственный препарат обычно микронизируют до размера подходящего для доставки путем ингаляции (обычно менее 5 микрон). Этого можно достичь любым подходящим способом измельчения, таким как размол на спиральной струйной мельнице, размол на струйной мельнице с кипящим слоем, сверхкритическая очистка жидкости для формирования наночастиц, гомогенизация высоким давлением или распылительная сушка.

[0162] Капсулы, блистеры и картриджи для использования в ингаляторе или инсуфляторе могут выполнены так, чтобы содержать порошковую смесь соединения по данному изобретению, подходящей порошковой основы и модификатор активности.

[0163] Подходящая формула раствора для использования в распылителе, в котором использован принцип электрогидродинамики для получения мелкодисперсного тумана, может содержать подходящую дозу триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению на одно нажатие, и объем на нажатие может варьироваться, например, от 1 мкл до 100 мкл.

[0164] В лекарственные формы по данному изобретения, предназначенные для ингаляции/интраназального введения, могут быть добавлены подходящие ароматизаторы, такие как ментол и левоментол, или подсластители, такие как сахарин или натрия сахарин.

[0165] Лекарственные формы для парентерального введения могут быть выполнены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Лекарственные формы с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.

[0166] В случае порошковых ингаляторов и аэрозолей, единица дозирования устанавливается посредством клапана, который доставляет отмеренное количество. Единицы в соответствии с данным изобретением обычно устанавливают для введения отмеренной дозы или «впрыска» связывающей молекулы по данному изобретению. Общая суточная доза будет обычно вводиться в виде однократной дозы или еще чаще - в виде разделенных доз в течение суток.

[0167] Триспецифичные молекулы по данному изобретению также могут быть выполнены в лекарственной форме для перорального введения. Пероральное введение может включать глотание, так что соединение поступает в желудочно-кишечный тракт и/или буккально, лингвально или сублингвально поступает в кровоток непосредственно из полости рта.

[0168] Лекарственные формы, пригодные для перорального введения, включают твердые, полутвердые и жидкие системы, такие как таблетки; мягкие или твердые капсулы, содержащие мульти- или наночастицы, жидкости или порошки; пастилки (включая заполненные жидкостью); жевательные формы; гели; быстро растворимые лекарственные формы; пленки; суппозитории; спреи; и щечные/мукоадгезивные пластыри.

[0169] Жидкие лекарственные формы включают суспензии, растворы, сиропы и эликсиры. Такие лекарственные формы могут быть использованы как наполнители в мягких или жестких капсулах (например, из желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы) и обычно содержат носитель, например, воду, этанол, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, метилцеллюлозу или подходящее масло и один или более эмульгаторов и/или суспендирующих агентов. Жидкие лекарственные формы могут быть также изготовлены путем восстановления твердого вещества, например, из саше.

[0170] В одном варианте осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула по данному изобретению является частью композиции, содержащей гистидин и ацетат в концентрации от 1 до 100 мМ в буфере с рН от 5,0 до 6,5.

Терапевтическое применение триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению

[0171] В одном аспекте триспецифичная связывающая молекула по данному изобретению применяется в лечении нарушений, которые связаны с активностью IL-17A, IL-17F или ФНО-альфа. Например, врач может лечить аутоиммунные или воспалительные заболевания, назначая триспецифичную связывающую молекулу по настоящему изобретению отдельно или в сочетании с другими терапевтическими агентами (последовательно один за другим или одновременно). Триспецифичная связывающая молекула модулирует активность IL-17A, IL-17F или ФНО-альфа, что приводит к снижению аутоиммунного или воспалительного ответа. Расстройства, которые можно лечить с помощью триспецифичной связывающей молекулы и способы по настоящему изобретению могут включать любое из следующего: ревматоидный артрит, артроз, ювенильный хронический артрит, септический артрит, артроз Лайма, псориатический артрит, реактивный артрит, спондилоартропатия, системная красная волчанка, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника, сахарный диабет, тиреоидит, астма, аллергические заболевания, псориаз, атопический дерматит, склеродермия, реакция «трансплантат против хозяина», отторжение трансплантата, острые или хронические иммунные заболевания, связанные с трансплантацией, саркоидоз, болезнь Кавасаки, болезнь Грейвса, нефротический синдром, синдром хронической усталости, гранулематоз Вегенера, пурпура Геноха-Шенлейна, микроскопический почечный васкулит, хронический активный гепатит, uvenita, септический шок, синдром токсического шока, септический синдром, кахексия, синдром приобретенного иммунодефицита, острый поперечный миелит, хорея Гентингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, инсульт, первичный билиарный цирроз, гемолитическая анемия, взрослых (острый) респираторный дистресс-синдром, алопеция, очаговая алопеция, серонегативная артропатия, артропатии, болезнь Рейтера, псориатическая артропатия, связанная с язвенным колитом артропатия, атопические аллергии, аутоиммунные Буллезные заболевания, пузырчатка vulgaris, листовидная пузырчатка, болезнь пемфигоида, линейные IgA, аутоиммунная гемолитическая анемия, Кумбс позитивныя гемолитическая анемия, злокачественная анемия, ювенильная злокачественная анемия, артрит, первичный склерозирующий геппатит А, криптогенный аутоиммунный геппатит, фиброзирующие заболевания легких, криптогенный фиброзный альвеолит, поствоспалительные интерстициальные заболевания легких, интерстициальный пневмонит, хроническая эозинофильная пневмония chronic, постинфекционные интерстициальные заболевания легких, подагрический артрит, аутоиммунный геппатит, аутоиммунный геппатит I типа (классический аутоиммунный геппатит или липоид), аутоиммунный геппатит II типа, остеоартрит, первичный склерозирующий холангит, псориаз I типа, псориаз II типа, идеопатическая лейкопения, аутоиммунная нейтропения, ренальные NOS заболевания [renal NOS-disease], гломерулонефрит, микроскопический ренальный васкулит, дискоидный волчаночный эритематоз, идеопатическая или мужская NOS фертильность, [autoimmunity to sperm], все подтипы множественного склероза, симпатическая офтальмия, вторичная легочная гипертензия при заболеваниях соединительной ткани, синдром Гудпасчура, легочная манифистация узлового полиартрита, острая ревматическая лихорадка, ревматоидный спондилит, анкилозирующий спондилит, болезнь Стилла, системный склероз, синдром Шенгрена, синдром Такаясу, аутоиммунная тромбоцитопения, идиопатическая тромбоцитопения, аутоимунный тиреоидит, гипертироидизм, болезнь Хошимото, аутоиммунный атрофический гипотироидизм, первичная мексидема, факогенный увеит, первичный васкулит, витилиго, острые заболевания печени, хронические заболевания печени, аллергии, астма, психические заболевания (включая депрессию и шизофрению), заболевания опосредованные Th2 типом и Th1 типом, коньюктивиты, аллергические контактные дерматиты, аллергические риниты, деффицит альфа-1-антитрипсина, амиотрофический латеральный склероз, анемия, цистический фиброз, заболевания ассоциированные с цитокиновой терапией, демиелизирующие заболевания, дерматиты, иридоциклит/увеит/оптический неврит, повреждение ишемической реперфузии, ишемический инсульт, ювенильный ревматоидный артрит, аутоиммунная энтеропатия, аутоимунная потеря слуха, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунный миокардит, аутоиммунная преждевременная недостаточность яичника и блефарит.Триспецифичная связывающая молекула может также лечить любую комбинацию из перечисленных выше расстройств.

[0172] В определенных вариантах осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула изобретения может использоваться для лечения следующих заболеваний (помимо прочего): ревматоидный артрит (РА), остеоартрит, остеопороз ревматоидного артрита, воспалительный фиброз (например, склеродермия, легочный фиброз и цирроз), гингивит, периодонтоз или заболевания периодонта, воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона, язвенный колит и воспалительные заболевания кишечника), астма (включая аллергическую астму), аллергии, хронические обструктивные заболевания легких (ХОБЛ), множественный склероз, псориаз и рак.

[0173] В конкретном варианте осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула по данному изобретению используется для лечения ревматоидного артрита, псориаза или псориатического артрита.

[0174] «Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемый в данном документе, чтобы «облегчить» болезнь, заболевание или состояние, означает уменьшение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки в на «лечение» включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию.

[0175] В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.

[0176] «Терапевтически эффективным количеством» считается количество вводимого в процессе лечения терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.

[0177] Триспецифичные связывающие молекулы по данному изобретению могут назначаться отдельно или в сочетании с одним или более другими препаратами или антителами(или в любой их комбинации). Таким образом, фармацевтические композиции, способы и использование изобретения также охватывает варианты осуществления комбинаций (совместное назначение) с другими активными агентами, как описано далее.

[0178] Используемые в данном документе термины «совместное назначение», «совместно назначенный» и «в сочетании с» относящиеся к триспецифичным связывающим молекулам с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагается, означают, сслылаются или включают:

одновременное введение такой комбинации триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,

одновременное введение такой комбинации триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,

последовательное введение такой комбинации триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются в последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также

последовательное введение такой комбинации триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями.

[0179] Триспецифичные связывающие молекулы по данному изобретению могут назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии. Кроме того, лечение триспецифичными связывающими молекулами по данному изобретению может включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированная терапия). В некоторых вариантах осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула может вводиться совместно или быть сформулирована с другим медикаментом/препаратом для лечения аутоиммуного или воспалительного заболевания.

[0180] В некоторых вариантах осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула по данному изобретению вводится в сочетании с противовоспалительным агентом. Противовоспалительные агенты, которые могут вводиться с триспецифичной связывающей молекулой по данному изобретению включают, помимо прочего, кортикостероиды (например бетаметазон, будесонид, кортизон, дексаметазон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизолон и триамцинолона), нестероидные противовоспалительные препараты (например, балсалазид, целекоксиб, диклофенак, дифлунисал, этодолак, фенопрофен, флоктафенин, флурбипрофен, ибупрофен, индометацин, кетопрофен, меклофенамат, мефенамовая кислота, мелоксикам, набуметон, напроксен, олсалазин, оксапрозин, фенилбутазон, пироксикам, салсалат, сулиндак, теноксикам, тапрофеновая кислота и толметин), а также ацетаминофен, антигистаминные препараты, производные аминоарилкарбоксиловой кислоты, производные арилацетатной кислоты, производные арилбутировой кислоты, арилкарбоксиловой кислоты, производные арилпропионовой кислоты, пиразолы, пиразолоны, производные салициловой кислоты (например, сульфсалазин и месалазин), тиазинкарбоксамидды, е-ацетамидокапроевая кислота, S-аденозилметионин, 3-амино-4-оксимасляная кислота, амиксетрин, бендазак, бензидамин, буколом, дифенпирамид, дитазол, эморфозон, гуаиазулен, набуметон, нимесулид, орготеин, оксацепрол, парнилин, перизоксал, пифоксим, проказон, проксазол и тенидап.

[0181] В некоторых вариантах осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула по данному изобретению вводится в сочетании с иммуносупрессивным агентом, таким как, помимо прочего, стероиды, циклоспорин, аналоги циклоспорина, циклофосфамид, метилпреднизон, преднизолон, азатиоприн, FK-506, 15-деоксиспергуалин, натализумаб и другие иммуносупрессивные агенты, которые действуют путем подавления функции отвечающих Т-клеток.

[0182] В некоторых вариантах осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула изобретения вводится в сочетании с иммунодепрессантами такими как, помимо прочего, ORTHOCLONE™ (ОКТ3), SANDIMMUNE™/NEORAL™/SANGDYA™ (циклоспорин), PROGRAF™ (такролимус), CELLCEPT™ (микофенолат), азатиоприн, глюкокорткостероиды, AVONEX™ (интерферон-бета 1А) и RAPAMUNE™ (сиролимус). В одном варианте осуществления изобретения иммунодепрессанты могут использоваться для предотвращения отторжения трансплантированных органов или костного мозга.

[0183] В некоторых вариантах осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула изобретения назначается в сочетании с антагонистами ФНО. Антагонисты ФНО, которые могут вводиться со связывающими молекулами по данному изобретению включают, помимо прочего, инфликсимаб (REMICADE™), адалимумаб (HUMIRA™), цертолизумаб пегол (CIMZIA™), голимумаб (SIMPONI™), этанерцепт (ENBREL™), производные ксантина (например pentoxifyline) и бупропион (WELLBURTIN™, ZYBAN™). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист ФНО представляет собой антагонист ФНО-альфа.

[0184] В некоторых вариантах осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула по данному изобретению вводится в комбинации с антагонистом из перечня, включающем, помимо прочего, антагонисты IL-6R (например, тоцилизумаб и серулумаб), антагонисты IL-6, IL-1а или IL-1b, IL-23, IL-22 и GM-CSF антагонисты.

[0185] В некоторых вариантах осуществления изобретения триспецифичная связывающая молекула по данному изобретению вводится в сочетании с антагонистами IL-17A и/или IL-17F. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанным антагонистом является анти-IL-17А и/или анти-IL-17F антитела или их антигенсвязывающая часть.

[0186] Фармацевтические препараты, содержащие триспецифичную связывающую молекулу по данному изобретению и по меньшей мере один другой агент (например, иммуносупрессивный или противовоспалительный агент), могут применяться в качестве комбинированной терапии для одновременного, раздельного или последовательного введения в лечении воспалительных и аутоиммунных расстройств.

[0187] Подразумевается, что триспецифичные связывающие молекулы по данному изобретению могут использоваться в способах лечения, как описано выше, могут использоваться в лечении, как описано выше, и/или могут использоваться в производстве медикаментов для лечения, как описано выше.

Дозы и пути введения

[0188] Триспецифичные связывающие молекулы по данному изобретению будут вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение триспецифичных связывающих молекул самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных анти-аутоиммунных или противовоспалительных методов лечения.

[0189] Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени, или доза могут быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты, и (b) ограничений, присущих в технике компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.

[0190] Таким образом, квалифицированным специалистам понятно, исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, так же как и требования к времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения.

[0191] Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться, в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента, конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение композиций, и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования с композициями по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояния здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретную используемую триспецифичную связывающую молекулу. Таким образом режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе.

[0192] Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.

[0193] Предполагается, что подходящая доза триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению будет в диапазоне от 0,1-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например, около 1-20 мг/кг. Триспецифичная связывающая молекула может быть введена, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например, по меньшей мере 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например, по меньшей мере 1,5 мг/кг, например, также как не менее 2 мг/кг, например, по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например, по меньшей мере 5 мг/кг; и например вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например, вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например, раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости.

[0194] Эффективное количество для терапии аутоиммунных или воспалительных расстройств может измеряться его способностью стабилизировать прогрессирование заболевания и/или улучшить симптомы у пациента и предпочтительно вызвать обратное развитие проявлений заболевания. Способность триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению подавлять аутоиммунные или воспалительные нарушения может оцениваться в in vitro анализах, например, как описано в приведенных примерах, а также в подходящих животных моделях, которые прогнозируют эффективность при таких нарушениях. Подходящая схема дозирования будет выбрана для того, чтобы обеспечить оптимальный терапевтический ответ в каждой конкретной ситуации, например, введение в виде одного болюса или в виде непрерывной инфузии с возможной корректировкой дозы в зависимости от остроты каждого случая.

Диагностическое использование и композиции

[0195] Триспецифичные связывающие молекулы по настоящему изобретению также используются в диагностических процессах (например, in vitro, ex vivo). Например триспецифичные связывающие молекулы могут использоваться для обнаружения или измерения уровня IL-17A, IL-17F и/или ФНО-альфа в образцах, полученных от пациента (например, образец ткани или образец жидкости тела, такой как воспалительный экссудат, кровь, сыворотка крови, жидкость кишечника, слюна или моча). Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистология. Изобретение далее включает наборы (например, диагностические наборы), содержащие триспецифичные связывающие молекулы, описанные в данном документе.

[0196] Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.

[0197] Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.

Примеры

Пример 1: Создание и оптимизация три специфичных анти-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа антител

[0198] Триспецифичные анти-IL-17А/анти-IL17F/анти-ФНО-альфа антитела были созданы и оптимизированы как показано на фиг. 1.

Пример 2: Продукция рекомбинатных антигенов и антител в суспензионной культуре клеток млекопитающих

[0199] Антитела и антигены были произведены в клетках линии СНО-К1, конститутивно экспрессирующих EBNA 1 (вирус Эпштейна - Барра ядерного антигена 1), по данным опубликованных протоколов (Longo et al., Methods Enzymol 529:227-240 (2013)). Клетки выращивали в суспензии на орбитальных шейкерах с использованием свободного от сыворотки средства, производимого Life Technologies Corporation, согласно инструкциям производителя. Для переходной экспрессии клетки были трансфицированы в концентрации 2×10Е6 / мл с линейным полиэтиленимином (PEI MAX, Polysciences). ДНК/PEI соотношение составило 1:3. Через 5-7 дней после трансфекции питательную среду центрифугировали при 2000 g в течение 20 минут и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Белки-мишени извлекали из культуральной жидкости с помощью аффинитивной хроматографии.

[0200] Рекомбинантный белок IL-17A, содержащий шесть аминокислот в С-конце белка и FLAG-пептид (фиг. 2), извлекали и очищали от культуральной жидкости с помощью Profinity IMAC Ni-заряженных смол (Компания Bio-Rad). До очистки к культуральной жидкости добавляли NiCI2 до достижения концентрации 1 мМ. Затем к культуральной жидкости добавляли 5 мл Profinity IMAC Ni-заряженной смолы и перемешивали на шейкере в течение 1 ч при комнатной температуре. Сорбент (5 мл) переносили в полипропиленовую колонку Thermo Scientific и промывали с объемом 5 колонок ФСБ для удаления примесей неспецифических компонентов. Связанный антиген извлекали из сорбента с помощью имидазола 0,3 М, рН 8, 150 мм NaCl. Белок затем переносили в ФСБ (рН 7,4) методом диализа с использованием технологии SnakeSkin Dialysis Tubing, фильтровали (0,22 мкм), переносили в пробирки и хранили при температуре -70°С. Чистоту полученного белкового раствора оценивали с помощью SDS-гель-электрофореза (фиг. 3).

[0201] Испытуемые и контрольные IgG1- антитела очищали на HiTrap Protein FF 1 мл (GE Healthcare) согласно процедуре, описанной выше для IL-17A-Fc антигена. Чистоту полученного белкового раствора оценивали с помощью SDS-гель-электрофореза (фиг. 4).

[0202] Согласно данным очистки электрофорезом в условиях денатурирации рекомбинантные антигенные продукты и IL-17A-H6F и IL-17A-FC подходят для иммунизации и дальнейшего исследования. Кроме того, контрольный препарат AIN457 (Novartis; воспроизведенный (US 7807155 В2)) удовлетворительной чистоты может использоваться в исследованиях.

Пример 3: Иммунизация ламы человеческим II-17а и создание фаговой библиотеки Fab-фрагментов антител ламы

[0203] Животное лама (Lama Glama) последовательно иммунизировали 5 раз путем подкожного введения антигенного материала, смешанного с равным объемом полного (во время первой инъекции) или неполного (для остальных инъекции) адъюванта Фройнда. В качестве антигена использовали смесь рекомбинантных белков (по 0,2 мг каждого из белков на 1 инъекцию), один из которых был человеческим IL-17A-H6F (пример 2). Вторую инъекцию (этап иммунизации) проводили через 3 недели после первой, затем с интервалом в две недели проводили еще три иммунизации. Через 5 дней после каждой инъекции, начиная с третьего раза были взяты пробы крови (50 мл).

[0204] Отобранную кровь лам после иммунизации разбавляли 2 раза раствором ФСБ, содержащего 1 мМ ЭДТА. 35 мл разбавленной крови наслаивали на среду Histopaque®-1077 (Sigma) с плотностью 1,077 г/мл, объем 15 мл, и затем центрифугировали 20 мин при 800 д. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/среда Histopaque и затем промывали раствором ФСБ, содержащим 1 мМ ЭДТА.

[0205] Полученная сыворотка титра иммуноглобулина против IL-17A, сертифицированная в соответствии со стандартным протоколом, была не менее 1/10000, что является удовлетворительным для построения библиотек антител (5).

[0206] Суммарную РНК мононуклеарных клеток ламы выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit согласно предлагаемому протоколу (QIAGEN). Концентрацию РНК определяли с помощью Nanovue (GE Healthcare) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.

[0207] Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора MMLV RT (Evrogen) в соответствии с рпекомендованным протоколом с использованием обратной транскриптазы и случайных-MMuLV гексамерных олигонуклеотидов в качестве праймеров.

[0208] Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой ПЦР для получения генов вариабельных доменов, фланкированных сайтами рестрикции, с использованием набора олигонуклеотидов и опубликованных протоколов (de Haard et al., J Biol Chem 274(26): 18218-30 (1999 год); De Genst et al., Dev Comp Immunol 30(1-2): 187-98 (2006)). Затем смесь генов вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи одного фрагмента реализовывали с путем последовательной рестрикции, лигирования и амплификации. Гены тяжелых цепей соединяли с генами каппа и отдельно с генами лямбда легких цепей. Таким образом, рассчитанное количество молекул матрицы во всех реакциях составляло не менее 10¹¹. Полученный ДНК препарат VL-CK-VH обрабатывали рестриктазами NheI/Есо91I и лигировали в оригинальный фагемид рН5. На фиг. 6 показана полученная структура плазмид. Продукты лигирования трансформировали в электрокомпетентные клетки штамма SS320, полученные согласно протоколам (Bond et al., J Mol Biol 332(3):643-55 (2003)). Репертуар производных каппа библиотеки Fab-фрагментов составил 5,1*10Е8 и производных лямбда библиотеки Fab-фрагментов составил - 3,7*10Е8, соответственно.

Пример 4: Селекция фаговых библиотек Fab-фрагментов антител

[0209] Специфичные к анти-IL-17А фаговые Fab-фрагменты выделяли из фаговой дисплейной библиотеки Fab-фрагментов на рекомбинантном человеческом IL-17A (R&DSystems), выполняя серии циклов селекции, как описано ранее (Marks et al., J Mol Biol 222(3):581-597 (1991); de Haard et al., J Biol Chem 274(26): 18218-30 (1999)). Для осуществления селекции методом пэннинга, человеческий IL-17A в 50 мМ карбонатном буфере (рН 9,5) адсорбировали в течение ночи при температуре 4°С на поверхности сорбирующих пробирок HighSorb (Nunc). Пробирки промывали ФСБ (рН 7,4), затем блокировали раствором ФСБ (рН 7,4) - обезжиренное молоко (0,5% мас./об.) в течение 1 ч. Далее, 2,4 мл раствора фаговых частиц в ФСБ (рН 7,4) - обезжиренное молоко (0,5% мас./об.) в концентрации 1012 фаговых частиц на 1 мл добавляли в пробирку с антигеном и инкубировали в течение 1 ч при перемешивании. Несвязавшиеся фаговые частицы удаляли в ходе серий циклов промывки с использованием раствора ФСБ (рН 7,4) - Твин 20 (0,1% об./об.). Количество отмывок увеличивали от первого раунда к третьему раунду до 20-30-40 раз, соответственно. Оставшиеся связанными фаговые частицы элюировали 100 мМ раствором Gly-HCl (рН 2.5) в течении 15 мин при перемешивании, затем нейтрализовали 1 М Трис-HCl (рН 7,6). Бактерии штамма Е. coli TG1 инфицировали полученными фаговыми частицами, затем фаговые частицы выделяли и использовали в следующем цикле селекции.

[0210] После второго и третьего раунда селекции на IL-17A, проведенный ИФА анализ препарата поликлональной фаговой частицы показал значимое обогащение (фиг. 8). Полученный пул клонов, обогащенных Fab-фрагментами человека, специфичными против IL-17A, был реклонирован в экспрессионную плазмиду pLL. (фиг. 7), содержащую myctag и His6 tag на С- конце гена СН1 тяжелой цепи.

Пример 5: Анализ специфического связывания Fab-фрагмента с человеческим IL-17

[0211] ИФА (ТИФА) использовали для измерения связывания исследуемых Fab-фрагментов с человеческим IL-17А. В качестве положительного контроля использовали Fab-фрагмент антитела AIN457 с опубликованной последовательностью (Novartis). Для анализа специфического связывания лунки планшетов ИФА (Nunc ImmunoMaxisorp) покрывали 50 мкл (0,5 мкг/мл в 1Х покрывающем карбонатном буфере) IL-17А, затем герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. Все последующие этапы выполняли по стандартному ИФА протоколу с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем GenetixQ-pix2xt (Molecular Device) и Тесап Freedom EVO 200 (Тесап). Чтобы заблокировать неспецифическое связывание, добавляли блокирующий буфер (ВВ) (200 мкл 0,5% обезжиренного молока в ФСБ). Планшеты инкубировали в шейкере в течение одного часа при комнатной температуре. После отмывок ФСБ-Твином добавляли по 50 мкл на лунку супернатанта испытуемой клеточной культуры, содержащего анализируемый Fab-фрагмент, смешанного с равным объемом блокирующего буфера. Планшеты снова инкубировали с встряхиванием в течение одного часа при комнатной температуре, затем каждую лунку планшета промывали пять раз буфером ФСБ-Твин. После промывания добавляли 50 мкл/лунку человеческого анти-Fab HRP-конъюгированного вторичного антитела (Pierce-Thermo Scientific) в соотношении 1: 5000 в ФСБ-Твин. Планшеты встряхивали на роторном шейкере (50 мин, при комнатной температуре) и пять раз промывали буфером ФСБ-Твин, как описано выше. Развитие колориметрического сигнала получали путем добавления ТМВ (100 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 3-5 мин), затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (100 мкл/лунку, 10% серная кислота). Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет-ридер (Tecan-Sunrise; Тесап). Степень связывания антител была пропорциональна продуцированию цветового сигнала. Клоны, у которых цветовой сигнал превышал фоновый более чем в 5 раз, были проверены в конкурентном ИФА анализе для выявления антагонистических Fab-фрагментов, блокирующих взаимодействие IL- 17А лиганда и рецептора.

Пример 6: Конкурентный анализ ИФА блокирования взаимодействия IL17A лиганда и IL17R рецептора

[0212] Конкурентный ИФА использовали для анализа антагонистической способности ранее отобранных Fab-фрагментов античелоческого IL-17A. В качестве положительного контроля использовали Fab-фрагменты антитела AIN457 (Novartis). Иммобилизовывали 50 мкл рецептора L-17RA-Fc (R&D Systems) в лунки планшетов ИФА (Nunc ImmunoMaxisorp) при концентрации 1 мкг/мл в 1Х покрывающем карбонатном буфере, затем инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. Все последующие этапы выполняли по стандартному ИФА протоколу с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем GenetixQ-pix2xt (Molecular Device) и Тесап Freedom EVO 200 (Тесап). Чтобы заблокировать неспецифическое связывание, добавляли блокирующий буфер (ВВ) (200 мкл 0,5% обезжиренного молока в ФСБ). Планшеты инкубировали в шейкере в течение одного часа при комнатной температуре.

[0213] Параллельно 50 мкл супернатанта испытуемой клеточной культуры, содержащего анализируемый Fab-фрагмент, смешивали в 96-луночном планшете с 50 мкл IL-17A-His6-Flag при концентрации 0,4 мкг/мл в 1% молоке на ФСБ-Твин. Затем проводили инкубацию в течение 1 часа при температуре 37°С с перемешиванием на шейкере при 500 об/мин.

[0214] После отмывки блокирующего буфера из планшетов, содержащих IL-17ARA-Fc-рецептор, реакционную смесь, описанную выше, переносили из расчета 90 мкл на лунку. Планшеты снова инкубировали с встряхиванием в течение 45 минут при комнатной температуре, затем каждую лунку планшета промывали пять раз буфером ФСБ-Твин. Добавляли 50 мкл/лунку анти-FLAG мышиного М2 антитела (Sigma) при концентрации 1 мкг/мл. Планшеты снова инкубировали с встряхиванием в течение 45 минут при комнатной температуре, затем каждую лунку планшета промывали пять раз буфером ФСБ-Твин. Добавляли 50 мкл/лунку антимышиного-lgG HRP-конъюгированного вторичного антитела (Pierce-ThermoScientific) в разведении 1:5000 в ФСБ- Твин. Планшеты встряхивали на роторном шейкере в течение 45 минут при комнатной температуре и пять раз промывали буфером ФСБ-Твин, как описано выше. Развитие колориметрического сигнала получали путем добавления ТМВ (100 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 3-5 мин), затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (100 мкл/лунку). Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет-ридер (Tecan-Sunrise; Тесап). Степень связывания антител была пропорциональна продуцированию цветового сигнала.

[0215] Клоны, показавшие блокирование на уровне контрольного Fab-фрагмента антитела AIN457, были отмечены как положительные и использовались в дальнейших анализах. Гены вариабельных доменов положительных клонов были секвенированы, согласно стандартным протоколам на аппарате Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) и проанализированы.. Клоны, содержащие вариабельные домены VHH были отобраны для дальнейших исследований. Также обнаружили, что клон 3VHHFab повлялся в комбинации с двадцатью тремя различными по последовательности доменами легких цепей, что может указывать на его относительную структурную толерантность и позволяет предположить, что именно VHH домен, а не легкая цепь, вносит вклад во взаимодействие с IL-17A.

Пример 7: Сравнительный скрининг VHHFab анти IL-17а кандидатов по кинетической константе диссоциации k_off (k_dis)

[0216] Сравнительный скрининг k_off для анти IL-17a Fab кандидатов проводили с помощью прибора Octet Red 96 (Pall-ForteBio). Анти FABCH1 биосенсоры в течение 30 минут регидратировали в рабочем буфере, содержащем 10 мМ ФСБ, рН 7,2-7,4, 0.1% Твин-20, 0,1% БСА. В испытуемые образцы прибавляли Е. coli 10х-рабочий буфер до достижения конечной концентрации 1х. Затем анти FABCH1 биосенсоры погружали в образцы кандидатов Fab-фрагментов и Е. coli на 4 часа при температуре 12°С. Сенсоры с иммобилизованными на поверхности Fab-фрагментами переносили в лунки с подвижным буфером, где определялась базовая линия (60 сек.). Затем сенсоры переносили в лунки с раствором аналита (IL-17A, 30 мкг/мл) для ассоциации комплекса антиген-антитело (300 сек). Далее сенсоры возвращали в лунки, содержащие подвижный буфер, для последующей стадии диссоциации (300 сек.). После каждого эксперимента использованные сенсоры регенерировали путем трехкратного помещения их в буфер для регенерации (Gly-HCl, рН 1,7) после чего они могли быть использованы в следующем эксперименте. Анализ полученных кривых проводили с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis (версия 7.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1:1.

[0217] Результаты k_off-скрининга анти-IL-17а Fab кандидатов представлены в таблице 1. Продемонстрировано специфическое высокоаффиное связывание всех уникальных VHHFab с человечеким IL-17A, при этом 3VHHFab продемонстрировали очень быструю k_on и очень медленную k_dis (1/сек), выходящую за пределы чувствительности прибора.

Таким образом, основываясь на данных анализа, монодомен VHH 3VHHVK4B11 показал максимальное аффинность связывания по сравнению с другими двумя кандидатами.

Пример 8: Специфическое связывание VHHFab с человеческим IL-17F

[0218] Анализы ИФА проводились на трех вышеупомянутых VHHFab-фрагментах согласно стандартным протоколам ИФА, описанным в примере 5, но для человеческого IL-17F (R&D Systems). Fab-фрагмент антитела AIN457 (опубликованная последовательность; Novartis) использовали в качестве положительного контроля. В таблице 1 представлены результаты качественного анализа взаимодействия трех VHHFab кандидатов. VHH монодомен, далее именуемый VHH17 (SEQ ID NO: 1, фиг. 9) с мутациями, описанными ниже, был выбран для дальнейшей работы на основе испытаний аффинности и перекрестной реактивностью для 3VHHVK4B11 Fab-фрагмента.

Пример 9: Сканирующий мутагенез CDR-участков анти-IL-17а VHH17 домена

[0219] Мутации для отдельных позиций CDR-участков VHH17 домена были вставлены с помощью метода рандомизации NNK, с использованием набора Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB) в соответствии с протоколом производителя. Плазмиду pET22b-VHH17 использовали в качестве матрицы. Продукты PCR фракционировали на легкоплавких гелях агарозы и очищали на соответствующих колонках. После лигирования ДНК перемещали в экспрессирующий штамм Е.coli BL21(DE3). Индивидуальные клоны получали путем экспрессии в 96-луночных планшетах, как описано выше. Супернатанты, содержащие мутант VHH17, анализировали методом ИФА в условиях, описанных выше, и с использованием высокопроизводительных систем Genetix Q-pix2xt и Tecan Freedom EVO200. Концентрация иммобилизованных IL-17A составляла 0,2 мкг/мл. Окрашивание связанных VHH17 монодоменов проводили с разведенным 1:5000 конъюгатом мышиного anti-myc-tag 9Е10 и антимышинного IgG (HRP) (Pierce) и красителем ТМВ+H₂O₂/H₂SO₄; поглощение измеряли при длине волны 450 нм.

[0220] Результаты, полученные путем сканирующего мутагенеза, представлены в таблице 2. В таблице показаны замены CDR-участков, которые соответствуют ≤30% редукции сигнала связывания мутанта VHH17/человеческий IL-17A по сравнению с последовательностью дикого типа. В одном аспекте изобретение относится к триспецифичным связывающим молекулам, включающим эти мутации и любые их комбинации.

[0221] В ходе этого скрининга идентифицированы позиции аминокислот в CDR-участках VHH17, толерантные к аминокислотным заменам. Было продемонстрировано, что настоящая панель аминокислотных замен значимо не изменяет аффинность связывания VHH17 к человеческому IL-17A. Таким образом, эта панель замен может использоваться для улучшения различных свойств кандидата.

Пример 10: Проектирование и создание анти-IL-17а/анти-IL-17F и анти-ФНО-альфа триспецифичного антитела: VHH-IqG1 (LALA)

[0222] Гены для вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела к человеческому ФНО-альфа (RU 2303604) были синтезированы в оригинальной кодоновой композиции и клонированы в рЕЕ-Нс (IgG1) и pEE-Lc плазмидах для тяжелой и легкой цепи, соответственно. Это позволяет продуцировать моноклональные антитела изотипа IgG1 путем совместной транзиторной экспрессии в клетках линий CHO-EBNA. Эти конструкции были валидизированы путем секвенирования и получили названия ЕЕ-aTNF-IgG1Hc для тяжелой цепи и pEE-aTNFLc для легкой цепи (на фиг. 9 показаны аминокислотные последовательностей вариабельных доменов).

[0223] Для получения «no effect» LALA вариант анти-ФНО-альфа IgG1 (Woodle et al., Transplantation 68(5):608-16 (1999)) с вариабельными доменами, показанного на фиг. 9, аминокислотные замены L234A/L235A (номенклатура Kabat) были введены с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза в pEE-aTNF-IgG1Hc конструкт через PfuUltraHS полимеразу (Stratagene) по данным опубликованного протокола (Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB)). Продукты PCR фракционировали на легкоплавких гелях агарозы и очищали на колонках. После реакции лигирования ДНК перемещали в Е. coli. Целевая последовательность была валидизирована путем секвенирования и в дальнейшем получила название pEE-aTNF-IgG1HcLALA.

[0224] В дополнение, основываясь на высокой степени аффинности последовательностей VHH к IL-17A и IL-17F, обнаруженое в примере 8, был синтезирован ген VHH17 (SEQ ID NO: 4; фиг. 9). Представлен оригинальная совокупность мутаций, специфичных к зародышевой линии человеческого VH (Q5V, S11L, D61A, Y77N, R93V) а также комбинацию мутаций E44G/R45T на сайте межсубъединичного контакта тяжелой и легкой цепи вариабельных доменов (VH и VL). Как показано ранее (RU 2014138740), это обеспечивает стабильность производного VHH в сочетании с легкой цепью антитела.

[0225] Далее, в соответствии со стандартными генно-инженерными процедурами, ген VHH17 (SEQ ID NO: 1) клонирован на N-конце конструкта pEE-aTNFL c легкой цепи, отделенный от легкой цепи специфическим 13-аминокислотным гибким линкером, необходимым для коррекции независимой укладки обоих полипептидов внутри слитой молекулы и независимого связывания с разными антигенами. Полученный конструкт получил название pEE-VHH17-77N-aTNFLc.

[0226] Различные аминокислотные замены были введены через олигонуклеотид-направленный мутагенез в расчетные позиции CDR-участки тяжелой цепи pEE-aTNF-IgG1HcLALA и легкой цепи pEE-VHH17-77N-aTNFLc (см. таблицу на фиг. 10) (номенклатура Kabat) с помощью PfuUltraHS полимеразы (Stratagene) по данным опубликованного протокола (Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB)) следуя процедуре, описанной выше. Мутации в клонах, выбранные для дальнейшей работы указаны на фиг. 10.

[0227] Конструкты, содержащие мутации тяжелой и легкой цепей, были объединены попарно для получения различных парных сочетаний и транзиторного накопления, как описано в примере 2. Это привело к генерации 1 варианта (MabC) без мутации в CDR-участках домена анти-ФНО-альфа, и 32 вариантам триспецифичных антител (Mab1-32; фиг. 11). Продуктивность всех вариантов приближается к или превышает 100 мг/л, которая является удовлетворительной для дальнейшего изучения их свойств.

Пример 11: Сравнительный анализ нейтрализации фактора некроза опухоли с помощью триспецифичных анти-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа связывающих молекул

[0228] Испытуемые растворы антител титровали в 96-луночных планшетах при концентрации 500 нг/мл с шагом 2, 100 мкл раствора на лунку. Раствор рекомбинантного человеческого ФНО-альфа готовили в концентрации 500 пг/мл и затем прибавляли по 50 мкл в каждую лунку с испытуемыми образцами. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С в CO₂-инкубаторе.

[0229] Клетки линии WEHI-13VAR суспендировали в концентрации 1×10⁶ клеток/мл и вводили в каждую лунку с 50 мкл испытуемого раствора. Планшеты инкубировали при температуре 37°С в CO₂-инкубаторе в течение 20-24 часов. Количество живых клеток измеряли с помощью витального красителя Alamar Blue. После завершения инкубации прибавляли 20 мкл реагента Alamar Blue в каждую лунку аналитического планшета, затем планшеты встряхивали в течение 5 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Планшеты инкубировали при температуре 37°С в течение 16-20 часов. Показатели флуоресценции оценивали в относительных единицах флуоресценции при длине волн возбуждения/эмиссии 544/590 нм с использованием прибора Fluoroskan Ascent FL. При анализе данных использовали Microsoft Excel для построения диаграмм зависимости для флуоресцентного сигнала и концентрации испытуемых и стандартных образцов.

[0230] В таблице на фиг. 12 показаны результаты сравнительного анализа антагонистической активности 32 мутантов триспецифичных антител по сравнению с немутировавшим вариантом MabC и моноспецифическим анти-ФНО-альфа антителом адалимумабом. На основе этого анализа были отобраны и протестированы шесть лучших вариантов для выявления наилучших трех: Mab12 (ЭД50 = 4 нг/мл), МАБ 31 (ЭД50 = 20 нг/мл) и Mab32 (ЭД50 = 4 нг/мл). На фигуре 13 показана диаграмма сравнительного анализа этих вариантов относительно контроля. На основе этого анализа Mab12 вариант был выбран для последующего наблюдения и получил название BCD-121.

[0231] Далее, с помощью того же способа сравнивали триспецифичный кандидат BCD-121 с двумя моноспецифичными анти-ФНО-альфа антителами инфликсимабом и адалимумабом. Результаты подтвердили, что BCD-121 демонстрирует более выраженную антагонистическую активность, чем адалимумаб (превышение в 5 раз) и инфликсимаб (десятикратное превышение) при ЭК50, составляющей 6 нг/мл (фиг. 14).

Пример 12: Сравнительный анализ ингибирования IL-17А-зависимой продукции IL-6 триспецифичными анти-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа связывающими молекулами

[0232] Нейтрализация активности триспецифичного кандидата BCD-121 (см. пример 10) была проанализирована с помощью способности IL-17A индуцировать продукцию человеческого IL-6 клеточных линий НТ1080 (АТСС: CCL-121) в присутствии человеческого рекомбинантного IL-17A и ФНО-альфа. Клетки выращивали в среде DMEM, обогащенной 10% инактивированной эмбриональной сывороткой, глутамином и гентамицином. Клетки прибавляли в 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты в количестве 5×10⁴ на лунку и оставляли на 5 часов для прикрепления. Смесь рекомбинантного IL-17A с концентрацией 40 нг/мл инкубировали с разведениями антител в течение одного часа при температуре 37°С. Затем в клетки прибавляли смесь цитокина и антитела и оставляли на ночь. Продукция IL-6 в клеточной культуре линии НТ1080 была пропорциональна прибавленному количеству IL-17A. Количество высвобожденного IL-6 в клетках супернатанта измеряли методом ИФА с использованием «DuoSet ELISA Development System Human IL6» (R&D System, кат. № DY206). Результаты показаны на фиг. 15. В качестве отрицательного контроля использовали воспроизведенное анти-ФНО-альфа моноспецифичное антитело адалимумаб, и в качестве положительного контроля использовали моноспецифичное анти-IL-17а антитело BCD-085 (BIOCAD). Как видно из графика, в то время как адалимумаб не подавляет продукцию IL-6, и BCD-085 подавляет продукцию IL-6 с ИК₅₀, составляющей около 9,2 нг/мл, антитело BCD-121 обеспечивает преимущество, состоящее в подавлении продукции IL-6 с ИК₅₀, составляющим 3,5 нг/мл. Таким образом, антитело-кандидат BCD-121 является наиболее мощным антагонистом продукции IL-6 в этом анализе.

Пример 13: Сравнительный анализ подавления двойной IL-17A/ /ФНО-альфа-зависимой продукции IL-6 триспецифичной анти-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа связывающей молекулой BCD-121

[0233] Способность IL-17а или пары IL-17А/ФНО-альфа индуцировать продукцию IL-6 клеточный линиями НТ1080 человека (АТСС: CCL-121) использовали для анализа нейтрализующей активности триспецифичной связывающей молекулы- кандидата BCD-121 (см. пример 10) в присутствии человеческого рекомбинантного IL-17A и ФНО-альфа. Клетки выращивали в среде DMEM, обогащенной 10% инактивированной эмбриональной сывороткой, глутамином и гентамицином. Клетки прибавляли в 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты в количестве 5×10⁴ на лунку. Клетки оставляли на 5 часов для прикрепления. Смесь рекомбинантного IL-17A с концентрацией 40 нг/мл и ФНО-альфа с концентрацией 20 нг/мл инкубировали с разведениями антител в течение одного часа при температуре 37°С. Затем в клетки прибавляли смеси цитокинов и антител и оставляли на ночь. Продукция IL-6 в клеточной культуре линии НТ1080 была пропорциональна прибавленному количеству IL-17A. Количество высвобожденного IL-6 в клетках супернатанта измеряли методом ИФА с использованием «DuoSet ELISA Development System Human IL6» (R&D System, кат. № DY206). Результаты показаны на фиг. 16. В качестве контроля использовали воспроизведенное анти-ФНО-альфа моноспецифичное антитело адалимумаб и моноспецифичное анти-IL-17А антитело BCD-085 (BIOCAD). Как видно из графика, триспецифичное антитело BCD-121 продемонстрировало более выраженный эффект по сравнению с моноспецифичными антителами, показывая значения ИК50 около 25 рМ и почти необнаруживаемое количество IL-6 в нижней части плато. В противоположность этому контрольное антитело адалимумаб имеет значения ИК50 около 100 рМ. BCD-085 показало аналогичные значения ИК50 около 25 рМ, но нижний порог плато в 20 раз превышал показатели BCD-121. Таким образом, BCD-121 является наиболее мощным антагонистом продукции IL-6 в этом анализе.

Пример 14: Анализ антитело-зависимой цитотоксичности (ADCC) триспецифичной анти-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа связывающей молекулы BCD-121 в клетках линии Jurkat-tmTNFα

[0234] Для использования в количественном анализе, приведенном ниже, клеточную культуру линии Jurkat-tmTNFα cl.8 забирали из колб и центрифугировали в течение 5 минут при 200 д. Супернатант переливали и еще раз промывали в среде для количественного определения.

[0235] Дебрис суспендировали в 5 мл среды для количественного определения. Определяли жизнеспособность и количество клеток. Готовили клеточную суспензию для посева в белый 96-луночную культуральные планшеты в концентрации 3×10⁵ клеток/мл.

[0236] Испытуемый образец разводили в лунках 96-луночного планшета. В лунки с испытуемыми образцами прибавляли суспензию клеток линии Jurkat-tmTNFα cl.8, и планшет инкубировали в CO₂-инкубаторе в течение 15-30 минут.

[0237] Готовили суспензию РВМС клеток с концентрацией 7,5×10⁶ клеток/мл и прибавляли в лунки с испытуемыми образцами. Планшеты инкубировали в течение четырех часов при температуре 37°С в CO₂-инкубаторе.

[0238] Аналитический буфер смешивали с AAF-Glo™Substrate из набора «CytoTox-Glotm Cytotoxicity Assay,» затем добавляли в лунки с испытуемыми образцами. Планшеты инкубировали в течении 15 минут при комнатной температуре. Люминесценцию измеряли на приборе Fluoroskan Ascent FL. Этим способом определяли активность внутриклеточных протеаз; люминесцентный сигнал пропорционален количеству лизированных клеток.

[0239] Как показано на фиг. 17, BCD-121 продемонстрировал примерно 100-кратное уменьшение ADCC активности по сравнению с производными IgG1-антител адалимумабом и инфликсимабом, и сопоставимый уровень этой активности для симзии (Fab-PEG).

Пример 15: Анализ комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) триспецифичной анти-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа связывающей молекулы BCD-121 в клетках линии Jurkat-tmTNFα

[0240] Испытуемые растворы антител титровали в 96-луночных планшетах от концентрации 15 нг/мл с шагом 2, 50 мкл на лунку. Человеческий комплемент растворяли в соотношении 1:3 в охлажденной среде для анализа (RPMI с 1% БСА) и прибавляли 50 мкл в лунки с испытуемыми образцами. По 50 мкл суспензии клеток линии Jurkat-tmTNFα прибавляли в каждую лунку с образцами в концентрации 1×10⁶ клеток/мл (5×10⁴ клеток на лунку). Планшеты встряхивали в течение 3 минут при комнатной температуре на и помещали на 2-3 часа в CO₂-инкубатор при температуре 37°С. Количество живых клеток измеряли с помощью витального красителя Alamar Blue. После завершения инкубации прибавляли 15 мкл реагента Alamar Blue в каждую лунку аналитического планшета, затем планшеты встряхивали в течение 5 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Планшеты инкубировали при температуре 37°С в течение 18-24 часов. Показатели флуоресценции оценивали в относительных единицах флуоресценции при длине волн возбуждения/эмиссии 544/590 нм с использованием прибора Fluoroskan Ascent FL.

[0241] Как показано на фиг. 18, у BCD-121 отсутствует активность CDC в клетках линии Jurkat ТМ TNFα cl.8 по сравнению с IgG1-производными антител, адалимумабом и инфликсимабом, и он сопоставим по уровню такой активности с симзией (Fab-PEG).

Пример 16: Анализ одновременного взаимодействия BCD-121 с человеческим IL-17A и человеческим ФНО-альфа с помощью прибора OctetRED96

[0242] Анализ одновременного связывания BCD-121 с человеческим IL-17A и человеческим ФНО-альфа был проведен классический анализ анализа «сэндвич»-методомс использованием прибора Octet Red96 (Pall-ForteBio) (фиг. 19). Анализ проводили при температуре 30°С с использованием ФСБ, содержащего 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве подвижного буфера. В ходе эксперимента первый антиген (IL-17а биртин) был иммобилизован на покрытых стрептавидином сенсорах в концентрации 20 мкг/мл и объемом 200 мкл/лунка. Затем сенсоры погружали в раствор антител 200 мкл/лунка с концентрацией антител 20 мкг/мл. Сенсоры последовательно погружали в раствор ФНО-альфа 200 мкл/лунка в концентрации 1 мг/мл и в солевой раствор, не содержащий белка.

[0243] Кривые связывания минус базовый сигнал анализировали с помощью Octet Data Analysis (версия 7.0) в соответствии со стандартной процедурой.

[0244] Сенсограмма, представленная на фиг. 19, показывает, что триспецифичные связывающие молекулы BCD-121 могут одновременно связывать IL-17A и ФНО-альфа.

Пример 17: Анализ связывания BCD-121 с ортологическими IL-17a и ФНО-альфа лигандами с помощью прибора Biacore Т200

[0245] Анализ проводили с использованием принципов сэндвич-анализа, используя препараты IL-17A и ФНО-альфа, произведенные Sino Biologies. После активации чипов, индивидуальный лиганд был неспецифично (группами NH2) иммобилизован на поверхности биосенсора в концентрации 20 мкг/мл. Затем проводили загрузку антитела в концентрации от 1 до 25 мкг/мл. После этого сенсоры погружали в подвижный буфер для этапа комплексной диссоциации. Скорость потока составляла 10 мкл/мин.

[0246] Анализ полученных данных выполняли с помощью программного обеспечения BIA Evolution 3.1 и модели гетерогенного лиганда.

[0247] В таблице 3 показаны данные взаимодействия BCD-121 с ортологическими IL-17а и ФНО-альфа лигандами человека и приматов. BCD-121 демонстрирует очень высокую аффинность для всех лигандов (ниже рМ).

Пример 18: Иммуноферментный анализ взаимодействия между BCD-121 и различными антигенами семейства IL-17 (А, В, С, D, Е, F и А / F

[0248] Для измерения сравнительного связывания BCD-121 с антигенами семейства IL17 человека использовали ИФА. Для анализа связывания лунки планшетов для ИФА (среднее связывание от Greiner bio one) индивидуально покрывали 50 мкл человеческого IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F или IL-17A/F (R&D Systems) в концентрации 1 мкг/мл (в 1 × покрывающем карбонатном буфере), герметично закупоривали и инкубированы в течение ночи при температуре 4С. Все последующие шаги выполняли по стандартному протоколу ИФА. Чтобы заблокировать неспецифическое связывание, добавляли блокирующий буфер (ВВ) (200 мкл 0,5% обезжиренного молока в ФСБ). Планшеты инкубировали в шейкере в течение одного часа при комнатной температуре. После отмывки с ФСБ-Твин прибавляли по 50 мкл испытуемых антител в каждую лунку в концентрации 5 мкг/мл в ФСБ-Твин. Планшеты снова инкубировали с встряхиванием в течение одного часа при комнатной температуре, затем каждую лунку планшета промывали три раза буфером ФСБ-Твин. После промывания прибавляли человеческое анти-Fab HRP-конъюгированное вторичное антитело (50 мкл/лунка) (Pierce-ThermoScientific) в соотношении 1: 5000 в ФСБ-Твин. Планшеты встряхивали на роторном шейкере (50 мин, при комнатной температуре) и три раза промывали буфером ФСБ-Твин, как описано выше. Развитие колориметрического сигнала получали путем добавления ТМВ (50 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 3-5 мин), затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (30 мкл/лунку, 10% серная кислота). Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет-ридер (Tecan-Sunrise; Тесаn). Степень связывания антител была пропорциональна продуцированию цветового сигнала.

[0249] Результат взаимодействия BCD-121 с членами семейства человеческого IL-17 представлен на фиг. 20. Как можно увидеть из кривой оптической абсорбции концентрации для BCD-121, триспецифичная связывающая молекула специфично взаимодействует с IL-17A и IL-17F с высокой аффинностью, и с их естественным гетеродимером IL-17A/F с низкой аффинностью. BCD-121 не проявляет перекрестной реактивности с другими членами семейства.

Пример 19: Иммуноферментный анализ взаимодействия BCD-121 с ФНО-альфа морской свинки, кролика и мыши

[0250] Анализ ИФА выполняли с использованием аналогичного протокола, описанного в примере 16. Антигены ФНО-альфа человека, морской свинки, кролика и мыши получены из R&D Systems.

[0251] Результат взаимодействия BCD-121 с ФНО-альфа человека, морской свинки, кролика и мыши показан на фиг. 21. Как можно увидеть из кривой для оптического поглощения в зависимости от концентрации BCD-121, триспецифичная связывающая молекула реагирует специфично и с высокой аффиностью только с ФНО-альфа человека. BCD-121 не проявляет перекрестного взаимодействия с ортологическими ФНО-альфа (за исключением ФНО-альфа приматов, как показано в примере 17).

Пример 20: Определение термической стабильности путем оценки точки агрегации белков методом динамического рассеяния света (ДРС).

[0252] Определение точки агрегации образцов (1 мг/мл) был выполнено на приборе Zetasizer Nano ЗСО. 0,5 мл раствора помещали в освобожденную от пыли кварцевую кювету, которую постепенно нагревали в приборе от 50 до 85°С с шагом в 1,5°С. Каждая температура поддерживалась в течение 30 секунд с постоянным измерением интенсивности рассеянного света. Интенсивность рассеянного света была обнаружена при угле θ=173°.

[0253] Данные, полученные с помощью метода динамического рассеяния света, показаны на фиг. 22 и таблице 4 для точек агрегации белков в четырех разных буферах.

Пример 21: Определение термической стабильности во время длительного воздействия методом теплового стресса при 50°С.

[0254] Образцы протеина в концентрации ~ 5 мг/мл были разделены на 3 порции по 200 мкл каждая и помещены в отдельные пробирки: 1 пробирку для каждой композиции хранили в холодильнике при +4°С, и две других поместили в нагреватель и инкубировали при температуре 50°С в течение 6 и 24 часов, соответственно. После нагревания пробирки доставали из нагревателя, оставляли при комнатной температуре на 15 мин, центрифугировали при 8000 об/мин в течение 5 минут и переносили супернатанты для гелевой фильтрации с УФ детектором.

[0255] Использовали стандарт исследования для гель-фильтрационная хроматографии (Bio-rad; кат. номер 151-1901). Данные стабильности BCD-121 в различных буферах при длительном нагревании при 50°С показаны в таблице на фиг. 23.

[0256] Результаты показывают, что все буферы, испытанные методом теплового стресса, обеспечивают удовлетворительную стабильность BCD-121.

Пример 22: Создание стабильных клеточных линий для продукции BCD-121

[0257] Стабильную клеточную линию для продукции BCD-121 получали путем трансфекции с электропорацией суспензии родительской клеточной линии векторных конструкций CHO-S, содержащих легкие и тяжелые цепи в оптимальном соотношении, с помощью Neon Transfection System (Life Technologies). Клоновые линии с высокой продуктивностью (до 1000 мг/Л) получали с использованием роботизированной платформы ClonePix (Molecular Devices), и предварительные этапы отбора минипула выполняли с использованием антибиотиков в форматах различных культур. Анализ продуктивности проводили с использованием аналитической системы Octet RED96 (Pall Life Sciences). DOE для выбора основных сред и схем культивирования реализовывали с использованием автоматизированной системы Biomek FX robotics (Beckman Coulter). Для культивирования клеток-продуцентов использовали бессывороточную среду и принадлежности, не содержащие белков животного происхождения. Накопление BCD-121 для доклинических исследований проводили в одноразовом биореакторе HyClone (Thermo Fisher Scientific) с рабочим объемом 50 л.

Пример 23: Выделение BCD-121 из продуктивной из среды стабильной клеточной линии

[0258] Осветление культуральной жидкости, содержащей BCD-121 выполняли с использованием глубинного фильтра Millistak С0НС (Мерк-Millipore). Очистка первичного антитела проводили на смоле для аффинной хроматографии с белком А, с помощью специфичного белка-мишени, антитело было элюировано с помощью глицинового буфера при рН 3,3-3,8. Элюат инкубировали при кислой рН в течение 30-60 минут для вирусной инактивации и затем нейтрализовывали раствором 1 М Трис-ОН. Окончательную хроматографическую очистку выполняли на сорбенте СНТ™ керамический гидроксиапатит (Bio-Rad) для удаления остаточной ДНК, продуцирующих белок клеток, агрегаты аффинных соребнтов, содержащих расщепленные лиганды, и фрагменты антител. Для этого способа раствор белка наносили на сорбент, приготовленный при рН 7,5, с последующим элюированием в градиенте концентраций хлорида натрия. Очищенный белок фильтровали на вирусы с помощью набора фильтров Viresolve PRO (Merck Millipore). Белок был сконцентрирован в тангенциальном потоке на лентах с пределом отсечения 50 кДа с последующей диафильтрацией с финальным буфером, содержащим ацетатный буфер (рН 5,0), сорбитол и полисорбат-80. Концентрация белка в окончательном растворе составляла по меньшей мере 70 мг/мл.

[0259] Результаты очистки представлены на фигуре 24. Вертикальный электрофорез с использованием полиакриламидного геля с SDS в условиях редукции и в условиях отсутствия редукции показал чистоту продукта, которая является достаточной для использования в фармацевтической композиции.

Пример 24: Иммуноферментный анализ показал стабильность BCD-121 в чистой сыворотке человеческой крови

[0260] Для оценки стабильности BCD-121 в чистой сыворотке человеческой крови триспецифичные антитела прибавляли в концентрациях, 2, 10 и 50 мкг/мл смеси чистой сыворотки человеческой крови, полученой от семи здоровых доноров, консервированной с 0,01% тимеросала и хранившейся в течение 7 дней при температуре 37°С. После 7 дней, измеряли концентрацию BCD-121 методом ИФА в двух форматах анализа: детектирование иммобилизованного ФНОα и биотинилированного IL17 со стрептавидином, конъюгированным со пероксидазой хрена (HRP) и детектирование иммобилизованного ФНОα с козьим античеловеческим IgG Fc, конъюгированным с HRP. В качестве контроля использовали образцы сыворотки, в которые прибавляли BCD-121 в концентрации 2, 10 и 50 мкг/мл непосредственно перед измерением методом ИФА. Измерение выполняли следующим образом: контрольные и сохраненные образцы сыворотки с 2, 10 или 50 мкг/мл BCD-121 разбавляли до 100 нг/мл (20, 100 и 500-кратно, соответственно), измеряли фактическую концентрацию против стандартной калибровочной кривой (от 6,25 до 200 нг/мл) расстворенной в ФСБ-Твин. Все этапы ИФА были выполнены по стандартному протоколу ИФА. 100 мкл разбавленных образцов или калибровочных стандартов добавляли в микролунки, предварительно покрытые ФНОα. Концентрация покрытого ФНОα составляла 2 мкг/мл в 20 мМ карбонатном буфере при рН 9,5. Блокирующий буфер (ВВ: 200 мкл 0,5% обезжиренного молока в ФСБ) затем прибавляли в планшеты. Планшеты инкубировали в шейкере в течение одного часа при комнатной температуре. После отмывки с ФСБ-Твин 100 мкл биотинилированного IL17 (3 мкг/мл) или козьего античеловеческого IgG Fc, конъюгированного с HRP (от Sigma, в соотношении 1:20000) прибавляли в лунку с концентрацией ФСБ-Твин. Планшеты снова инкубировали с встряхиванием в течение одного часа при комнатной температуре, затем каждую лунку планшета промывали три раза буфером ФСБ-Твин. В лунки, в которые ранее был прибавлен биотинилированный IL17, далее прибавляли 100 мкл стрептавидина, конъюгированного с HRP в соотношении 1:20000 (Sigma). После последовательных инкубации в течение одного часа и отмывки, получали развитие колориметрического сигнала путем добавления ТМВ (100 мкл/лунка) до насыщения (в среднем 10-15 мин), затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (50 мкл/лунка, 10% серная кислота). Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет-ридер (Tecan-Sunrise; Tecan). Степень связывания BCD-121 была пропорциональна продуцированию цветового сигнала. Концентрацию по калибровочной кривой умножали на коэффициент разбавления и выражали как % теоретически добавленной к сыворотке концентрации BCD-121.

Пример 25: Оценка эффективности антик-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа связывающей молекулы BCD-121 in vivo

[0261] Исследование ниже проводили на самцах яванского макака (Масаса fascicularis) с использованием модели коллагена индуцированного артрита. Общее количество животных в эксперименте составило 20 особей, пять групп по четыре обезьяны в каждой. В эксперименте применяли четыре дозы продукта: 0.2 мг/кг; 1,0 мг/кг; 5,0 мг/кг; и 10,0 мг/кг. Животные контрольной группы получали плацебо. Введение продукта и плацебо начали после предварительной сенсибилизации коллагеном. В ходе этого исследования провели измерения у животных всех групп для вычисления суставной поверхности APW. В конце исследования была оценена выраженность деструктивных изменений в пястно-фаланговых и плюснефаланговых суставах. Схема для экспериментальных групп показана в таблице 5 ниже.

[0262] Для индукции артрита животным три раза вводили эмульсию бычьего коллагена типа II (Sigma).

Первое введение коллагена:

[0263] Общее количество введенного коллагена составило 2 мг на экспериментальное животное. Для этой цели 2 мг коллагена растворяли в 0,7 мл 0,1 М уксусной кислоты. В раствор прибавляли 0,7 мл полного адъюванта Фройнда.

[0264] Животных держали в течение 28 дней после первого введения коллагена.

Второе введение коллагена:

[0265] Общее количество введенного коллагена составило 3 мг на экспериментальное животное. Для этой цели 3 мг коллагена растворяли в 1 мл 0,1 М уксусной кислоты. В раствор прибавляли 1 мл полного адъюванта Фройнда.

[0266] Животных держали в течение 21 дня после второго введения коллагена. Третье введение коллагена

[0267] Общее количество введенного коллагена составило 3 мг на экспериментальное животное. Для этой цели 3 мг коллагена растворяли в 1 мл 0,1 М уксусной кислоты. В раствор прибавляли 1 мл полного адъюванта Фройнда.

[0268] Измерение размера суставов осуществляли разделителем в следующие временные точки:

Перед первым введением коллагена;

Во время второго введения коллагена; и

Еженедельно после второго введения непосредственно перед введением коллагена в течение 7 недель.

[0269] Во время процесса измерения оценивали продольную и поперечную оси сустава. Эту процедуру проводили для всех пястно-фаланговых и плюснефаланговых суставов, за исключением большого пальца. Расчет площади проводили по формуле:

JA = значение для продольной оси × значение для поперечной оси × 3,14 × 0,25.

[0270] Данные для 16 суставов каждого животного использовали для вычисления процента площади воспаления (PIA). Расчет проводили по формуле:

Значение JA в день эксперимента × 100 среднее значение JA перед индукцией артрита

[0271] Результаты, показанные на фиг. 26, продемонстрируют дозозависимый противовоспалительный эффект BCD-121 в модели обезьян CIA.

Пример 26: Оценка токе и ко кинетики {ut1 }анти-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа связывающей молекулы BCD-121

[0272] Анализ токсикокинетики проводили на яванских макаках (cynomolgus). В исследовании применяли три уровня доз продукта BCD-121. Схема для экспериментальных групп показана в таблице 6 ниже.

[0273] В ходе исследования, оценивали следующие параметры:

- Результаты клинического обследование;

- Масса животного (до введения и в день 7, 14, 21, 28, 35 и 42 эксперимента);

- Температура тела (до введения и через 1, 2, 4, 6 и 24 часа после введения в день 7, 14, 21, 28, 35 и 42 эксперимента);

- Анализ мочи (до введения и в день 7, 14, 21, 28, 35 и 42 эксперимента);

- Клинический анализ крови по показателям: количество эритроцитов, количество лейкоцитов, концентрация гемоглобина (до введения и в день 7, 14, 21, 28, 35 и 42 эксперимента);

- Биохимический анализ соотношения в сыворотке крови: ЛДГ, общий билирубин, общий белок, глюкоза, аспартатаминотрансфераза и аланинаминотрансфераза (до введения и в день 7, 14, 21, 28, 35 и 42 эксперимента); и

- Концентрация препарата в сыворотке крови приматов (через 0,5, 1, 3, 6, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 264, 336, 408, 504, 624, 720, 816, 912 и 1008 часов после введения).

[0274] Уровень препарата в сыворотке крови оценивали, используя метод ИФА и хрен пероксидазы в качестве индикаторного фермента.

[0275] Лунки 96-луночных микротитровальных планшетов («Costar», Cat. №3590) сенсибилизировали рекомбинантным человеческим ФНО-альфа ((R&D Systems, кат. №210-TA/CF) на основе 250 нг/100 мкл 20 мМ Трис HCl буферного раствора, рН 9,0, на лунку и инкубировали в течение 16-18 часов при температуре 4°С. Несвязавшиеся антигены удаляли из лунок. Чтобы заблокировать неспецифично связывающиеся сайты, 200 мкл 20 мМ Трис HCl буферного раствора, рН 7,2-7,4 (ТВ), содержащий 1,0% БСА, 0,14 М NaCl и 0,05% Твин-20 (блокирующий буфер-ВВ) вводили в каждую лунку, затем лунки инкубировали в течение 30 минут при при температуре 37°С. Буфер ВВ раствор удаляли и в каждую лунку вводили по 100 мкл испытуемой сыворотки, 1000-10000-кратно разведенной буфером ВВ. Одновременно в каждую лунку вводили по 100 мкл ВВ, содержащего различные концентрации BCD-121 в диапазоне от 3,9-250 нг/мл. Планшеты инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°С. Из лунок удаляли все содержимое, лунки промывали по 3 раза каждую 200 мкл ТВ, содержащего 0,05 Твин-20, в каждую лунку вводили по 100 мкл ВВ, содержащего антитела против Fc-фрагмента человеческого IgG, меченого пероксидазой хрена («Sigma», USA, кат. № А0170 на рабочие разведения), и лунки инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°С. Из лунок удаляли все содержимое, лунки промывали 4 раза каждую 200 мкл ТВ, содержащего 0,05 Твин-20 и в каждую лунку вводили по 100 мкл 0,1 М буферного раствора натрия ацетата, рН 5.0, содержащего 0,1 мг/мл тетраметилбензидина и 0,003% H₂O₂. Чтобы остановить реакцию, в каждую лунку прибавляли 50 мкл 2М H₂SO₄, затем измеряли поглощение в лунках с помощью планшетного спектрофотометра при длине волны 450 нм.

[0276] Для определения концентрации BCD-121 в испытуемых образцах, строили калибровочную кривую зависимости поглощения от концентрации BCD-121 в стандартных образцах, и определяли концентрацию BCD-121 с помощью значения поглощения, полученного для испытуемого образца.

[0277] Нижний предел надежного обнаружения BCD-121 составил 2 нг/мл. Концентрацию BCD-121 в тесте sera (X), мкг/мл, рассчитывали по следующей формуле:

X = AxF

где, А - концентрация таблицы BCD-121 в испытуемом образце определенная с использованием калибровочных кривых, нг/мл; F - разведение первоначальной сыворотки;

[0278] Результаты фармакокинетического профиля профиля продемонстрировали ожидаемые уровни BCD-121 (фиг. 27). Период полувыведения в конечной фазе распределения рассчитывали в течение более 12 дней. Полученный фармакокинетический профиль BCD-121 у обезьян был аналогичен нативному человеческому IgG-антителу и обладал типичным дозозависимым характером.

Пример 27: Оценка токсичности многократных подкожных введений яванским макакам в течение одного месяца с последующим периодом без введений в течение одного месяца

[0279] Анализ токсичности многократного подкожного введения BCD-121 в течение одного месяца с последующим периодом восстановления в течение одного месяца проводили на яванских макаках. В эксперименте использовали три уровня доз. Схема для экспериментальных групп показана в таблице 7 ниже.

[0280] В ходе исследования, оценивали следующие параметры:

- Результаты клинического обследование;

- Масса животного (до введения и затем еженедельно);

- Температура тела (до введения и затем еженедельно до окончания эксперимента);

- Влияние на сердечно-сосудистую систему, для чего оценивали биоэлектрическую активность сердца с помощью Poly-Spectrum системы; оценку проводили до введения и затем на 3, 5 и 7 неделе эксперимента;

- Анализ мочи (до введения и на 3, 5 и 7 неделе эксперимента);

- Клинический анализ крови на показатели: количество эритроцитов, концентрация гемоглобина, лейкоцитов, лимфоцитов, количество моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов и базофилов и тромбоцитов (до введения, а затем один раз в неделю, начиная с первой недели эксперимента);

- Оценка влияния на систему свертывания крови по показателям: активированное частичное тромбопластиновое время, концентрации фибриногена и протромбиновое время (до введения, затем на 3, 5 и 7 неделе эксперимента);

- Биохимический анализ соотношений в сыворотке крови: натрий, калий, креатинин, мочевина, щелочная фосфатаза, ЛДГ, общий билирубин, общий белок, глюкоза, триглицериды, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, общий холестерин (до введения и на 3, 5 и 7 неделе эксперимента);

- По окончанию периода введения животных из сопутствующей группы 3 * умерщвляли и затем проводили исследование патологических изменений; по окончанию исследования то же самое применяли и к животным группы 3 и контрольной группы;

- Как часть исследования токсичности, также оценивали местное раздражающее действие препаратов, для чего выбирали область мягких тканей в месте инъекции и выполняли гистологическое обследование.

Пример 28: Оценка иммунотоксичности анти-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа связывающей молекулы BCD-121

[0281] Анализ иммунотоксичности многократного подкожного введения BCD-121 в течение одного месяца с последующим периодом восстановления в течение одного месяца проводили на яванских макаках. В эксперименте использовали три уровня доз. Схема для экспериментальных групп показана в таблице 8 ниже.

[0282] В ходе исследования оценивали следующие параметры:

- Состав субпопуляции лимфоцитов, который оценивался до введения и затем на 2, 4 и 6 неделе эксперимента;

- Соотношение классов иммуноглобулинов, которое оценивалось перед введением и 2, 4 и 6 неделе эксперимента;

- Влияние на фагоцитоз оценивали до введения и затем на 2, 4 и 6 неделе эксперимента.

Пример 29: Оценка иммуногенности при многократных подкожных введениях связывающей молекулы анти-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альфа BCD-121

[0283] Анализ иммунотоксичности многократного подкожного введения BCD-121 в течение одного месяца с последующим периодом восстановления в течение одного месяца проводили на яванских макаках. В эксперименте использовали три уровня доз. Схема для экспериментальных групп показана в таблице 9 ниже.

[0284] Анализ иммуногенности выполняли на одном уровне связывания антитела, для которого сыворотку крови забирали и выделяли перед введением и затем на 3, 5, и 7 неделе эксперимента.

Пример 30: Фармакокинетический анализ в течение многократных подкожных введений анти-IL-17А/анти-IL-17F/анти-ФНО-альФа связывающей молекулы BCD-121

[0285] Фармакокинетический анализ многократного подкожного введения в течение одного месяца с последующим периодом восстановления в течение одного месяца проводили на яванских макаках. Использовали три уровня доз. Схема для экспериментальных групп показана в таблице 10 ниже.

[0286] Для оценки уровня продукта на 0, 1, 2, 8, 9, 15, 16, 22, 23, 29, 36 и 43 день эксперимента выполняли забор крови.

Последовательности

1. Триспецифичная связывающая молекула, которая специфично связывается с человеческим IL-17A, человеческим IL-17F и человеческим TNFα (ФНО-альфа), содержащая:

a) первый связывающий домен, который специфично связывается с человеческим IL-17A и человеческим IL-17F и представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи VHH, который содержит:

(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью GTFATSPMG (SEQ ID NO: 1);

(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью AISPSGGDRIYADSVKG (SEQ ID NO: 2);

(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью VRRRFDGTSYYTGDYDS (SEQ ID NO: 3);

b) второй связывающий домен, который специфично связывается с человеческим TNFα (ФНО-альфа) и включает:

(i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий:

CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы: DYGMS, DYAMS, DYSMS, DYGMN, DYGMA, DYGMH;

CDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы: WINTYIGEPIYADSVKG, WITTYIGEPIYADSVKG, WIQTYIGEPIYADSVKG;

CDR3 с аминокислотной последовательностью GYRSYAMDY;

(ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий:

CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы: KASQNVGTNVA, KASQNVGTDVA, KASQNVGTAVA;

CDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы: SASFLYS, AASFLYS, DASFLYS, GASFLYS;

CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы: QQYNIFPLT, QQFNIFPLT, QQYNIYPLT;

при этом если CDR2 вариабельного домена тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательностью WITTYIGEPIYADSVKG, то CDR2 вариабельного домена легкой цепи не является DASFLYS или GASFLYS.

2. Триспецифичная связывающая молекула по п. 1, где первый связывающий домен, который специфично связывается с человеческим IL-17A и человеческим IL-17F, представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи VHH с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 4.

3. Триспецифичная связывающая молекула по п. 1, где второй связывающий домен, который специфично связывается с человеческим TNFα (ФНО-альфа), включает:

(a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-3 с аминокислотными последовательностями, представленными SEQ ID NO: 10-12;

(b) вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-3 с аминокислотными последовательностями, представленными SEQ ID NO: 13-15.

4. Триспецифичная связывающая молекула по п. 1, где второй связывающий домен представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, одноцепочечное антитело, Fv, Fab, F(ab')2, одноцепочечную Fv молекулу (ScFv) или диатело.

5. Триспецифичная связывающая молекула по п. 1, где второй связывающий домен, который специфично связывается с человеческим TNFα (ФНО-альфа), включает:

(i) вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 8;

(ii) вариабельный домен легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 9.

6. Триспецифичная связывающая молекула по п. 5, где второй связывающий домен, который специфично связывается с человеческим TNFα (ФНО-альфа), включает:

(i) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 5;

(ii) легкую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 6.

7. Триспецифичная связывающая молекула по п. 1, где

a) первый связывающий домен, который специфично связывается с человеческим IL-17A и человеческим IL-17F, представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи VHH с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 4, и

b) второй связывающий домен, который специфично связывается с человеческим TNFα (ФНО-альфа), включает:

(i) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 5;

(ii) легкую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 6.

8. Триспецифичная связывающая молекула, которая специфично связывается с человеческим IL-17A, человеческим IL-17F и человеческим TNFα (ФНО-альфа), содержащая:

a) первый связывающий домен, который специфично связывается с человеческим IL-17A и человеческим IL-17F и представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи VHH с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 4, и

b) второй связывающий домен, который специфично связывается с человеческим TNFα (ФНО-альфа), включает:

(i) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 5;

(ii) легкую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 6.

9. Триспецифичная связывающая молекула, которая специфично связывается с человеческим IL-17A, человеческим IL-17F и человеческим TNFα (ФНО-альфа), содержащая аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5 и 7.

10. Триспецифичная связывающая молекула по любому из пп. 1-9, где указанный первый связывающий домен и указанный второй связывающий домен соединены пептидным линкером из более чем пяти аминокислот.

11. Триспецифичная связывающая молекула по п. 10, где аминокислотные остатки пептидного линкера выбраны из G, A, S, Р, Е, Т, D и К.

12. Триспецифичная связывающая молекула по п. 11, где указанный пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

13. Триспецифичная связывающая молекула по пп. 1-9, где указанная триспецифичная связывающая молекула представляет собой антитело изотипа IgG.

14. Триспецифичная связывающая молекула по п. 13, где указанное антитело изотипа IgG относится к подтипу изотипа IgG1.

15. Триспецифичная связывающая молекула по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что связывающая молекула содержит Fc-фрагмент по меньшей мере с одной мутацией, которая снижает антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплементзависимую цитотоксичность (CDC) по сравнению с той же связывающей молекулой без мутации.

16. Триспецифичная связывающая молекула по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что указанная связывающая молекула имеет по меньшей мере одно из следующих свойств:

a) KD для IL-17A, составляющая 10-11 М или менее;

b) KD для IL-17F, составляющая 10-7 М или ниже;

c) KD для ФНО-альфа, составляющая 10-11 М или менее;

d) подавляет активность IL-17A и/или IL-17A/ФНО-альфа по меньшей мере на 50% при концентрациях IL-6 ниже 200 нг/мл в анализе на клетках линии НТ1080;

e) подавляет IL-17А-зависимое высвобождение IL-6 клетками линии НТ080;

f) подавляет продукцию IL-6 в клетках линии НТ1080;

g) подавляет ФНО-альфа-зависимую цитотоксичность по меньшей мере на 50% при концентрациях ниже 100 нг/мл в клетках линии WEHI-13VAR;

h) не связывается с ФНО-альфа кролика, мыши или морской свинки;

i) одновременно связывается с IL-17A и ФНО-альфа;

j) связывается с IL-17A и ФНО-альфа яванского макака;

k) остается стабильной после семи дней инкубации при температуре 37°C в сыворотке крови человека;

l) имеет период полувыведения более 12 дней in vivo;

m) оказывает противовоспалительный эффект в модели артрита in vivo; а также

n) подавляет активность IL-17 и ФНО-альфа in vivo.

17. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого человеческим IL-17A, человеческим IL-17F или человеческим TNFα (ФНО-альфа), содержащая триспецифичную связывающую молекулу по любому из пп. 1-15 в терапевтически эффективном количестве в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями.

18. Фармацевтическая композиция по п. 17, предназначенная для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого человеческим IL-17A, человеческим IL-17F или человеческим TNFα (ФНО-альфа), выбранного из группы: ревматоидный артрит, псориаз или псориатический артрит.

19. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует триспецифичную связывающую молекулу по любому из пп. 1-15.

20. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 19, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

21. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 19, 20.

22. Клетка-хозяин для получения триспецифичной связывающей молекулы по любому из пп. 1-15, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 19, 20.

23. Способ получения триспецифичной связывающей молекулы по любому из пп. 1-15, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п. 22 в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии указанной триспецифичной связывающей молекулы, при необходимости с последующим выделением и очисткой полученной триспецифичной связывающей молекулы.

24. Способ лечения заболевания у пациента, опосредованного человеческим IL-17А, человеческим IL-17F или человеческим TNFα (ФНО-альфа), включающий введение триспецифичной связывающей молекулы по любому из пп. 1-15 или фармацевтической композиции по п. 17 пациенту, нуждающемуся в таком лечении, в терапевтически эффективном количестве.

25. Способ лечения ревматоидного артрита, псориаза или псориатического артрита лечения у пациента, включающий введение триспецифичной связывающей молекулы по любому из пп. 1-15 или фармацевтической композиции по п. 17 пациенту, нуждающемуся в таком лечении, в терапевтически эффективном количестве.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанный способ далее включает введение противовоспалительного или иммунодепрессивного агента.

27. Способ по любому из пп. 24-26, отличающийся тем, что пациент является человеком.