Клеточно-связанные продукты активации комплемента в качестве диагностических биомаркеров волчанки в доклинической стадии

Изобретение относится к биотехнологии. Заявлен способ определения вероятности того, что пациент имеет волчанку в доклинической стадии. Способ включает взятие образца крови у пациента, измерение уровней для группы клеточно-связанных продуктов активации комплемента (CB-CAP) в указанном образце крови, где указанная группа CB-CAP включает по меньшей мере восемь из следующих: E-C4d, E-C3d, R-C4d, R-C3d, T-C4d, T-C3d, B-C4d, B-C3d, М-C4d, М-C3d, G-C4d, G-C3d, P-C4d и E-CR1, сравнение уровней CB-CAP пациента с контрольными уровнями, вычисление процента CB-CAP, для которых уровни у пациента являются аномальными по сравнению с контрольными уровнями, и принятие вычисленного процента за вероятность того, что пациент имеет волчанку в доклинической стадии. Клеточно-связанные продукты активации комплемента (CB-CAP) служат в качестве диагностических биомаркеров волчанки в доклинической стадии у пациентов, которые не соответствуют по меньшей мере четырем критериям Американской коллегии ревматологов (или подобным, например SLICC) установленного диагноза волчанки. 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 1 пр.

 

Заявление об исследовании, финансируемом из федерального бюджета

[0001] Настоящее изобретение было сделано при правительственной поддержке по гранту W81XWH-09-1-0275, выданному Министерством обороны. Настоящее изобретение было сделано при правительственной поддержке по гранту R01 AI077591, выданному Национальными институтами здравоохранения США. Настоящее изобретение было сделано при правительственной поддержке по гранту R01 AR046588, выданному Национальными институтами здравоохранения США. Правительство США обладает некоторыми правами на изобретение.

Родственные заявки и испрашивание приоритета

[0002] Настоящая заявка на патент испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 61/762,620, поданной 8 февраля 2013 года, озаглавленной "Cell-Bound Complement Activation Products as Diagnostic Biomarkers for Lupus". Описание предварительной заявки полностью включено в настоящую заявку посредством отсылки.

Уровень техники

[0003] Системная красная волчанка (СКВ), сокращенно называемая волчанкой, является прототипическим аутоиммунным заболеванием, которое характеризуется иммунной дисрегуляцией (например, образованием аутоантител и иммунного комплекса, активацией комплемента, гиперреактивностью лимфоцитов и нарушением продукции цитокинов) и последующим воспалительным поражением ткани. Клинические проявления волчанки являются гетерогенными, от слабых симптомов до смертельной болезни, и могут включать буквально любую ткань и орган пациента. Хотя волчанка, прежде всего, поражает женщин репродуктивного возраста, это - болезнь любого возраста и пола. Начало волчанки может быть скрытым, с такими симптомами, как лихорадка, боль в суставах и усталость, которые обычны при других болезнях. Волчанка также характеризуется периодическим обострением (вспышками) и ремиссией болезни. Тем не менее, тяжелое поражение органов может появляться и протекать бессимптомно начиная с ранней стадии болезни.

[0004] Диагностика волчанки остается главной клинической задачей. Хотя обычно используется несколько анализов крови, которые помогают врачам установить диагноз волчанки, ни один анализ в отдельности не является достаточно чувствительным и специфичным для определения, имеется ли у пациента волчанка. Типичному больному волчанкой требуетмя четыре различных врача в течение пяти лет для установления точного диагноза.

[0005] Неспецифические симптомы и анализы крови иногда могут быть проигнорированы или переоценены, что приводит к недостаточной диагностике или гипердиагностике. Недостаточная диагностика и отсроченный диагноз, несомненно, могут привести к более осложненному течению и летальности у больных, которые фактически имеют волчанку. Напротив, гипердиагностика волчанки может привести к ненужному воздействию токсичных лекарственных средств, которые могут быть дорогостоящими и вызывать значительные побочные эффекты у больных, которые не имеют волчанки. Таким образом, своевременный и точный диагноз оказывает значительное влияние не только на физическое состояние пациентов, но также и на экономическое состояние системы здравоохранения.

[0006] В настоящем документе описаны способы и системы, которые могут помочь решить, по меньшей мере, некоторые из описанных выше проблем, и которые могут обеспечить дополнительные выгоды.

[0007] Предшествующий уровень техники включает следующее:

[0008] Патент США 8,126,654, выданный J.M. Ahearn и S.M. Manzi.

[0009] Патент США 8,080,382, выданный J.M. Ahearn и S.M. Manzi.

[0010] Патент США 7,585,640, выданный J.M. Ahearn и др.

[0011] Патент США 7,390,631, выданный J.M. Ahearn и S.M. Manzi.

[0012] Заявка на патент США 2010/0233752, за авторством J.M Ahearn, E.L. Erickson, D.M. Hawkins, S.M. Manzi и T. Mercolino.

[0013] Перечисленные выше документы из уровня техники были разработаны на основе исследований пациентов, которые демонстрировали четыре или более критериев волчанки по классификации Американской коллегии ревматологов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0014] В варианте осуществления в настоящем документе раскрыт способ идентификации доклинического состояния у пациента, которое можно считать "пре-волчанкой". Способ, который в некоторых вариантах осуществления может быть осуществлен обрабатывающим устройством или системой, обеспечивает способ, который включает получение набора данных анализа крови пациента. Набор данных анализа крови включает множество уровней клеточно-связанных продуктов активации комплемента (CB-CAP) для пациента. Способ включает доступ к контрольному набору данных, который включает контрольный уровень для каждого CB-CAP. Способ включает сравнение уровней CB-CAP пациента с контрольными уровнями для определения количества и/или уровня (величины) CB-CAP, по которым уровни пациента превышены по сравнению с контрольными уровнями. В способе используется определенное количество и/или уровень для присвоения вероятности того, что пациент должен быть классифицирован как имеющий волчанку в доклинической стадии, и выдается отчет, включающий диагноз на основе вероятности.

[0015] Таким образом, в варианте осуществления, способ определения, требуется ли классифицировать пациента как имеющего волчанку в доклинической стадии, включает: (i) получение обрабатывающим устройством набора данных анализа крови пациента, который, как было определено, соответствует меньше чем четырем критериям классификации (таким как критерии ACR или SLICC) волчанки, где набор данных анализа крови включает множество уровней клеточно-связанных продуктов активации комплемента (CB-CAP) пациента; (ii) доступ обрабатывающего устройства к набору контрольных данных, который включает контрольный уровень для каждого CB-CAP; (iii) сравнение обрабатывающим устройством уровней CB-CAP пациента с контрольными уровнями для определения ряда CB-CAP, по которым уровни пациента превышены по сравнению с контрольными уровнями; (iv) если определенное количество превышает порог, классификацию обрабатывающим устройством пациента как демонстрирующего волчанку в доклинической стадии; и (v) генерацию отчета, включающего показание, классифицирован ли пациент как демонстрирующий волчанку в доклинической стадии.

[0016] В другом варианте осуществления система для определения, можно ли классифицировать пациента как демонстрирующего волчанку в доклинической стадии, включает обрабатывающее устройство, машиночитаемый носитель и запоминающее устройство, содержащее контрольный набор данных анализа крови для контрольной выборки субъектов, где первая группа субъектов в выборке, как известно, имеет волчанку, а вторая группа субъектов в выборке, как известно, не имеет волчанки, и где данные анализа крови включают уровни клеточно-связанных продуктов активации комплемента (CB-CAP) для каждого субъекта. Машиночитаемый носитель содержит программные инструкции, которые служат для передачи команд обрабатывающему устройству, которое: (i) получает набор данных анализа крови для пациента, где набор данных анализа крови включает уровни CB-CAP для пациента, где уровни CB-CAP представлены по меньшей мере для восьми следующих CB-CAP: E-C4d, E-C3d, R-C4d, R-C3d, T-C4d, T-C3d, B-C4d, B-C3d, M-C4d, M-C3d, G-C4d, G-C3d и P-C4d; (ii) сравнивает уровни CB-CAP для пациента с контрольными уровнями для определения ряда CB-CAP, по которым уровни пациента превышены по сравнению с контрольными уровнями; (iii) определяет, демонстрирует ли пациент пониженный уровень E-CR1 по сравнению с контрольной группой; (iv) если определенное количество CB-CAP, по которым превышены уровни пациента, превышает порог, и пациент демонстрирует пониженный уровень E-CR1, классифицирует пациента как демонстрирующего волчанку в доклинической стадии; и (v) генерирует отчет, включающий показание относительно того, классифицирован ли пациент как демонстрирующий волчанку в доклинической стадии.

[0017] В другом варианте осуществления способ определения, можно ли классифицировать пациента как демонстрирующего волчанку в доклинической стадии, включает: (i) получение набора данных анализа крови для пациента, где набор данных анализа крови включает уровни CB-CAP для пациента, где уровни CB-CAP представлены для множества следующих CB-CAP: E-C4d, E-C3d, R-C4d, R-C3d, T-C4d, T-C3d, B-C4d, B-C3d, M-C4d, M-C3d, G-C4d, G-C3d и P-C4d; (ii) сравнение уровней CB-CAP пациента с контрольными уровнями для определения ряда CB-CAP, по которым уровни пациента превышены по сравнению с контрольными уровнями; и (iii) если определенное количество CB-CAP, по которым превышены уровни пациента, превышает порог, классификацию пациента как демонстрирующего волчанку в доклинической стадии.

[0018] Необязательно способы могут включать определение веса для один или более CB-CAP, по которым присутствует повышенный уровень, а также применение определенного веса для одного или более сравненных CB-CAP для определения, можно ли классифицировать пациента как демонстрирующего волчанку в доклинической стадии. Необязательно способы могут включать определение величины для одного или более CB-CAP, по которым присутствует повышенный уровень, а также применение определенной величины для одного или более CB-CAP для определения, можно ли классифицировать пациента как демонстрирующего волчанку в доклинической стадии. Необязательно способы также могут включать определение, демонстрирует ли пациент пониженный уровень E-CR1 по сравнению с контрольной группой, и только классификацию пациента как демонстрирующего волчанку в доклинической стадии, если пациент также демонстрирует пониженный уровень E-CR1.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0019] Фиг. 1 - блок-схема, описывающая способ определения, нужно ли классифицировать пациента как имеющего волчанку в доклинической стадии.

[0020] На Фиг. 2 приведено обоснование и общий подход определения профиля и оценки CB-CAP.

[0021] На Фиг. 3 показана распространенность пациентов с различными оценками CB-CAP в примерных группах пациентов.

[0022] Фиг. 4 - блок-схема, на которой показаны различные аппаратные средства, которые могут быть включены в электронное устройство, которое осуществляет различные процессы, описанные в настоящем документе.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0023] Настоящее описание не ограничивается конкретными описанными системами, устройствами и способами, поскольку они могут изменяться. Терминология, используемая в описании, служит только для описания конкретных версий или вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения объема изобретения.

[0024] При использовании в оригинальном тексте настоящего документа, формы единственного числа "a," "an" и "the" включают множественные ссылки, если из контекста прямо не следует иное. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют те же значения, под которыми они обычно понимаются средним специалистом в данной области. Ничто в настоящем описании не должно рассматриваться как допущение того, что варианты осуществления, описанные в настоящем описании, не могут быть противопоставлены такому описанию в силу приоритета. При использовании в настоящем документе, термин "включающий" означает "включающий, но не ограниченный".

[0025] При использовании в настоящем документе, "системная красна волчанка", "СКВ" или "волчанка" является прототипическим аутоиммунным заболеванием, привоящим к полиорганному поражению. Этот аутоимунный ответ характеризуется наличием аутоантител, направленных против множества ядерных и эндоплазматических клеточных компонентов. Такие аутоантитела связываются с соответствующими антигенами, образуя иммунные комплексы, которые циркулируют и, в конечном счете, накапливаются в тканях. Такое накопление иммунных комплексов и последующая активация системы комплемента вызывают хроническое воспаление и повреждение ткани. Волчанка прогрессирует в форме вспышек или периодов обострения болезни, сопровождаемых периодами ремиссии. Симптомы обострения волчанки, которые значительно отличаются среди пациентов и даже у одного и того же пациента, включают недомогание, лихорадку, боль в суставах и светочувствительность (развитие покраснений после кратковременного воздействия солнца). Другие симптомы волчанки включают алопецию, язвы слизистых оболочек, воспаление внутренней выстилки сердца и легких, которое приводит к болям в груди, а также синовит, болезненное воспаление синовиальных мембран. Эритроциты, тромбоциты и лейкоциты могут поражаться при волчанке, что приводит к анемии, кровотечению и тромбическим нарушениям. В более тяжелых случаях накопление иммунных комплексов и хроническое воспаление в клубочках могут привести к поражению почек и иногда к острой недостаточности, требующей проведение диализа или пересадку почки. Поскольку кровеносный сосуд является главной мишенью аутоиммунной реакции при волчанке, достаточно распространены ранние инсульты и болезни сердца. С течением времени, так или иначе, такие обострения могут привести к необратимому повреждению органов. Термин "волчанка" также может относиться к другим типам волчанки, таким как дискоидная красная волчанка или лекарственная волчанка.

[0026] При использовании в настоящем документе, термин "волчанка в доклинической стадии" относится к предварительному, доклиническому состоянию, которое может служить ранним индикатором того, что пациент подвергается повышенному риску развития волчанки. Пациент с диагнозом волчанки в доклинической стадии будет иметь некоторые показатели, которые соответствовали бы определенной волчанке, но при этом у него еще не развилась или не была диагностирована определенная волчанка.

[0027] Предволчаночное состояние можно было бы считать эквивалентом предракового или предзлокачественного состояния, которое является состоянием, связанным со значительно повышенным риском развития рака или злокачественной опухоли, которую нужно лечить соответствующим способом. Примеры предраковых или предзлокачественных состояний включают полипы толстой кишки, связанные с повышенным риском развития рака толстой кишки, пищевод Баррета, связанный с повышенным риском развития рака пищевода, цервикальную дисплазию, связанную с повышенным риском развития рака шейки матки, актинический кератоз, связанный с повышенным риском развития рака кожи, и предраковые поражения молочной железы, связанные с повышенным риском развития рака молочной железы. При большинстве предзлокачественных состояний лечение поражения снижает или устраняет риск развития рака. Таким образом, раннее обнаружение является необходимым. Предволчаночное состояние может рассматриваться в подобном контексте. Пациенты с доклинической волчанкой подвергаются повышенному риску развития определенной волчанки, однако это может быть и не так. Раннее обнаружение и соответствующее лечение необходимы для снижения риска прогрессии болезни.

[0028] Доклиническая волчанка отличается и должна отличаться от "вероятной" волчанки. Диагноз вероятной волчанки часто подлежит интерпретации, поскольку диагностика волчанки остается искусством. Не существует никакого анализа крови или физического проявления заболевания, которые могут абсолютно гарантировать установление точного диагноза волчанки. Поэтому "вероятная волчанка" относится к вероятности того, что пациент фактически будет иметь определенную волчанку в установленное время. Это отличается от "доклинической волчанки", которая указывает, что пациент не имеет определенной волчанки в установленное время, а скорее подвергается повышенному риску конечного развития болезни, хотя возможно, что у пациента никогда не будет волчанки.

[0029] При использовании в настоящем документе, "компонент каскада комплемента" включает белки из классического, альтернативного и лектинового каскада комплемента, например, CI, C4, C2, C3 и их фрагменты, например, C4a, C4b, C2a, C2b, C4b, C2a, C3a, C3b, C4c, C4d, iC4b, C3d, C3i, C3dg. Также включены C5, C5b, C6, C7, C8, C9, C1inh, MASP1, MASP2, MBL, MAC, CR1, DAF, MCP, C4-связывающий белок (C4BP), фактор H, фактор B, C3bB, фактор D, Bb, Ba, C3bBb, пропердин, C3bBb, CD59, C3aR, C5aR, ClqR, CR2, CR3 и CR4, а также другие компоненты каскада комплемента, рецепторы и лиганды, не перечисленные конкретно в настоящей заявке.

[0030] При использовании в настоящем описании, "продукт активации комплемента" является "компонентом каскада комплемента", как перечислено в параграфе выше, а именно, C4a, C4b, C2a, C2b, C4bC2a, C3a, C3b, C4c, C4d, iC4b, C3d, C3i, iC3b, C3c и C3dg.

[0031] "Клеточно-связанный продукт активации комплемента" или "CB-CAP" является комбинацией одного или более продуктов активации комплемента и клетки крови (такой как, без ограничения перечисленными, эритроцит, ретикулоцит, лимфоцит, B-лимфоцит, моноцит, гранулоцит или тромбоцит), с которой связан продукт активации комплемента.

[0032] При использовании в настоящем документе, "контрольный уровень" любого CB-CAP относится, в некоторых вариантах осуществления, к уровню того CB-CAP, который получен из жидкой пробы, взятой у одного или более индивидов, которые не страдают аутоиммунным, воспалительным или другим заболеванием или нарушением, которые представляют интерес в исследовании. Уровень может быть измерен на индивидуальной основе или на совокупной основе, такой как среднее. Контрольный уровень может также определяться путем анализа выборки индивидов, которые имеют болезнь или нарушение, но не находятся в острой фазе болезни или нарушения. В некоторых вариантах осуществления контрольный уровень соответствующего CB-CAP взят у того же индивида, у которого устанавливают диагноз или чье состояние отслеживают, но получен в другое время.

[0033] При использовании в настоящем документе, "отличие от контрольного уровня" относится к различию, которое является статистически значимым, как определяют с помощью любого метода статистического анализа в настоящее время или будут определять в дальнейшем специалисты в данной области техники. Отличие от контрольного уровня относится к статистически значимому различию между контрольным уровнем соответствующего CB-CAP и уровнем того же CB-CAP у человека, у которого устанавливают диагноз или получают другую информацию, то есть экспериментальный уровень. Специалистам в данной области известно, что доступно множество методов для определения, является ли различие статистически значимым, при этом конкретный используемый метод не является ограничивающим в отношении изобретения.

[0034] В рамках настоящего документа "электронное устройство" или "обрабатывающее устройство" относится к устройству, которое включает процессор и энергонезависимую машиночитаемую память. Память может явиться неотъемлемой частью устройства или она может быть удалена от устройства и доступна для устройства через одну или более коммуникационных сетей. Память может содержать программные инструкции, которые при выполнении процессором предписывают процессору выполнять одну или более операций согласно программным инструкциям. Примеры электронных устройств включают компьютерные устройства, планшеты и смартфоны.

[0035] Волчанка продолжает представлять как диагностические, так и управленческие сложности для врачей, частично из-за недостатка надежных тестов и биомаркеров. Современным стандартом для диагностики волчанки является решение ревматолога, основанное, прежде всего, на стандартной схеме классификации, разработанной Американской коллегией ревматологов (ACR). Критерии ACR представляют собой набор клинических критериев, которые может использовать медицинский работник для определения, имет ли пациент волчанку. Диагноз установленной волчанки определяют, если пациент соответствует по меньшей мере 4 из 11 критериев ACR по клиническим симптомам или лабораторным тестам. Поскольку различные проявления волчанки могут не проявляться одновременно, часто требуются годы до выявления соответствия 4 критериям и установления окончательного диагноза. Подобные критерии были приняты Международной организацией сотрудничества клиник системной красной волчанки (SLICC).

[0036] Для решения этой дилеммы, классу пациентов, которые соответствуют менее чем 4 критериям ACR или SLICC, но у которых, тем не менее, подозревают наличие волчанки, можно дать диагноз "доклинической волчанки". Впрочем, в настоящее время не существует никакого доступного теста для измерения вероятности того, что такой пациент фактически имеет волчанку в доклинической стадии, и при этом нет никакого общепринятого теста даже для установления диагноза потенциальной волчанки, кроме как с использованием критериев ACR или SLICC. Кроме того, сложно определить, каких пациентов, которые соответствовали менее чем 4 критериям, следует продолжить связывать с риском развития волчанки, вместо того, чтобы считать, что у них нет болезни. У некоторых пациентов с доклинической стадией волчанки может продолжиться развитие определенной волчанки, потенциально приводящее к повреждению органов, которое необязательно может произойти из-за упущенной возможности раннего лечения. Улучшение своевременности и точности диагноза волчанки можно было бы значительно облегчить в случае доступности биомаркеров, которые могут помочь идентифицировать пациентов, которые имеют "доклиническую волчанку" и извлекут выгоду из раннего контроля предотвратимого повреждения органов.

[0037] Многочисленные исследования указали важную роль системы комплемента в патогенезе волчанки. Поскольку белки комплемента в большом количестве присутствуют в кровотоке и могут с легкостью взаимодействовать с циркулирующими клетками, авторами изобретения была выдвинута гипотеза, что продукты активации комплемента, связанные с циркулирующими клетками, могут служить в качестве более информативных биомаркеров волчанки, нежели растворимые белки комплемента. Действительно, значительные уровни C4-производных продуктов активации комплемента, в особенности C4d, специфично присутствуют на поверхностях эритроцитов, ретикулоцитов, тромбоцитов и лимфоцитов у больных волчанкой. Такие клеточно-связанные продукты активации комплемента (CB-CAP) могут служить уникальными биомаркерами не только для диагностики, но и для контроля активности болезни у больных волчанкой.

[0038] Как описано в настоящем документе, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что продукты активации комплемента способны связываться по существу со всеми циркулирующими клетками крови и после связывания могут изменять функции этих клеток, способствуя таким образом развитию целого ряда иммунопатогенных реакций при волчанке. В этом контексте способ и система, которые позволяют определить профили CB-CAP у больных с риском развития волчанки, могут обеспечить "окно" для изучения патогенного процесса, который переходит от "доклинической волчанки" в установленную волчанку. Таким образом, определение профиля CB-CAP может позволить врачам решить, диагностировать ли пациента как демонстррующего предволчаночное состояние. Это может помочь идентифицировать пациентов, которые подвергаются повышенному риску развития волчанки, и установить подходящие профилактические и терапевтические меры в соответствии с намерением задержать или предотвратить развитие волчанки или минимизировать проявления болезни.

[0039] Обзор этого процесса описан на Фиг. 1, на которой представлен процесс, посредством которого набор исходных данных хранится в машиночитаемой памяти 101. Контрольный набор данных содержит данные анализов для группы пациентов, у которых было подтверждено отсутствие волчанки. Данные анализов включают данные анализа проб крови, взятых у каждого пациента, где данные идентифицируют уровень одного или более CB-CAP в пробе крови каждого пациента, таких как CB-CAP, перечисленные в следующем параграфе.

[0040] Контроля набор данных может включать измерения контрольных уровней для различных CB-CAP, которые могут включать продукты активации комплемента C4d или C3d, связанные с любыми из клеток следующих типов: эритроциты (с CB-CAP, представленными E-C4d, E-C3d), ретикулоциты (с CB-CAP, представленными R-C4d, R-C3d), T-лимфоциты (с CB-CAP, представленными T-C4d, T-C3d), B-лимфоциты (с CB-CAP, представленными B-C4d, B-C3d), моноциты (с CB-CAP, представленными М-C4d, М-C3d) и гранулоциты (с CB-CAP, представленными G-C4d, G-C3d). CB-CAP также могут включать C4d на тромбоцитах [P-C4d], а также рецептор комплемента 1 (CR1), экспрессируемый на эритроцитах [E-CR1]. В дополнение к этим 13 перечисленным выше CB-CAP контрольные уровни других CB-CAP, таких как, но не ограниченных CB-CAP, презентированных на базофилах, эозинофилах, циркулирующих эндотелиальных клетках, также могут храниться в наборе данных.

[0041] Данная система может помочь определить, следует ли классифицировать пациента как имеющего предволчаночное состояние и, таким образом, являющегося кандидатом на дополнительное тестирование или лечение. При заборе пробы крови у пациента, которому требуется установить диагноз, проба будет проанализирована на предмет уровней любых или всех CB-CAP, для которых уровни также доступны в наборе данных 103. Данные анализов можно ввести или передать обрабатывающему устройству, которое будет сравнивать уровни CB-CAP в пробе пациента с уровнями CB-CAP в наборе данных, чтобы определить количество и/или уровни 105 CB-CAP, по которым пациент демонстрирует повышенный уровень. Уровень CB-CAP в образце пациента может быть определен как "повышенный", если он демонстрирует отличие от (превышает) контрольного уровня того же CB-CAP в контрольном наборе. Например, если уровень CB-CAP в пробе пациента по меньшей мере на два стандартных отклонения превышает уровень того же CB-CAP в контрольном наборе, уровень можно считать повышенным. Другие методы определения статистической значимости могут использоваться для определения, повышен ли уровень.

[0042] На основе определенного количества критериев ACR (или критериев SLICC или других критериев) для классификации волчанки, которым соответствует данный пациент (меньше четырех) и на основе определенного количества повышенных CB-CAP, которые присутствуют у пациента, и/или величины уровня повышения каждого повышенного CB-CAP, система может установить уровень вероятности для пациента 107. Уровень вероятности представляет собой процент, оценку или некоторый другой показатель, который медицинский работник может использовать для определения, будет ли пациент, вероятно, иметь доклиническую волчанку. В настоящем документе уровень вероятности может относиться к величине вероятности того, что пациент имеет доклиническую волчанку. Уровень вероятности может быть определен как фактор, зависящий от количества аномальных (повышенных) CB-CAP, которые присутствуют в наборе. Уровень вероятности может быть всего лишь процентом CB-CAP, которые являются повышенным (например, 40%, если повышены два из пяти CB-CAP). Или он может быть скорректирован по любому количеству факторов. Например, отдельные CB-CAP могут быть взвешены так, чтобы некоторые CB-CAP способствовали более высокому уровню вероятности в случае их превышения, чем другие CB-CAP. Вычисление также может включать такие переменные, как степень, в которой повышен один или более CB-CAP, и/или один или более критериев классификации, таких как критерии ACR или SLICC.

[0043] При установлении уровня вероятности и определения, следует ли классифицировать пациента как демонстрирующего волчанку в доклинической стадии, система может не просто рассматривать один CB-CAP, а может требовать, чтобы комбинация нескольких CB-CAP превышала, по меньшей мере, пороговую величину, до того как система классифицирует пациента как имеющего доклиническую волчанку. Например, система может рассматривать любое количество CB-CAP и требовать, чтобы по меньшей мере восемь CB-CAP у пациента были повышены по сравнению с контролем, чтобы классифицировать пациента как имеющего доклиническую волчанку. В некоторых вариантах осуществления группа CB-CAP может включать более восьми тестов. В некоторых вариантах осуществления вероятность установления диагноза доклинической волчанки возрастает при увеличении количества аномальных результатов анализов в группе. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления система также может определить, демонстрирует ли пациент пониженный уровень E-CR1 по сравнению с уровнями E-CR1 контрольного набора, при этом она может классифицировать пациента как демонстрирующего волчанку в доклинической стадии только в случае, если пациент, также демонстрирующий пониженный уровень E-CR1 по сравнению с контрольными уровнями E-CR1 в контрольном наборе данных.

[0044] Система может затем генерировать отчет 109 с диагнозом, таким как уровень вероятности непосредственно или одна или более текстовых или графических индикаций, которые описывают причины, по которым считается, что пациент демонстрирует (или не демонстрирует) доклиническую волчанку. Отчет будет обеспечивать оценку, можно ли было бы классифицировать пациента как пациента с доклинической волчанкой. Система может быть удалена от пациента или медицинского работника, и некоторые или все элементы системы могут присутствовать во множестве систем, таких как облачная система, где контрольный набор данных удален от системы, которая выполняет обработку и анализ, но связан через одну или более коммуникационных сетей.

ПРИМЕР

[0045] Например, авторы изобретения выполнили анализы CB-CAP в пробах крови, взятых у пациентов, у которых диагноз "доклинической волчанки" был установлен специалистами в области волчанки, ревматологами с помощью специфического обследования при диагностике и обслуживании пациентов с волчанкой. Четыреста сорок семь пациентов, которые соответствовали критериям классификации ACR, переработанным в 1982 или 1997 году, для установленной волчанки (≥4 критерия), были включены в набор данных. Двадцать четыре пациента, которые демонстрировали СКВ-ассоциированные симптомы, но, тем не менее, не соответствовали критериям установленной волчанки (то есть они демонстрировали менее четырех критериев ACR), были диагностированы как имеющие "доклиническую волчанку" экспертами в области диагносики волчанки, поскольку у них проявлялись связанные с волчанкой симптомы, при этом считали, что они не имели другую болезнь, не имели недифференцированного коллагеноза и не имели наложения более чем одной болезни. Посчитали, что их болезнь была подобна волчанке, но отличалась недостаточным количеством критериев ACR, чтобы ее можно было диагностировать как установленную волчанку. Таких пациентов диагностировали как имеющих "доклиническую волчанку", предполагая присутствие волчанкоподобного процесса, который может перейти или может не перейти в установленную волчанку, при этом все равно они подвергались повышенному риску развития установленной волчанки. Такой повышенный риск основан на известной динамике, согласно которой развивается волчанка. У большинства пациентов критерии становятся положительными во время хронологического развития болезни, таким образом, большинство пациентов с волчанкой соответствуют только 1, 2 или 3 критериям до развития четвертого критерия, который позволяет установить точный диагноз. Возможность диагностировать доклиническую волчанку позволила бы проводить более раннее лечение и применять превентивные меры для снижения тяжести последствий болезни с течением времени. Двести восемьдесят шесть пациентов с неволчаночными иммунно-воспалительными заболеваниями были включены в исследование в течение того же периода времени. Среди этих пациентов присутствовал 41 пациент с синдромом Шегрене, 20 пациентов с ревматоидным артритом, 7 пациентов со склеродермией, 15 пациентов с антифосфолипидным синдромом, 11 пациентов с идиопатической воспалительной миопатией, 8 пациентов с васкулитом, 5 пациентов с воспалительно болезнью кишечника, 4 пациента с первичным феноменом Рейно, 4 пациента с дискоидной или кожной волчанкой, 3 пациента с псориазом, 3 пациента с гранулематозом Вегенера, 1 пациент с болезнью Бехчета, 1 пациент с саркоидозом, 5 пациентов с различными инфекциями и 192 пациента с недифференцированным коллагенозом или нарушениями неясной этиологии во время посещения.

[0046] Кроме того, сто девяносто шесть здоровых людей были включены в качестве нормального контроля. Для подтверждения своего здорового статуса эти участники заполняли краткую анкету относительно существующих заболеваний.

[0047] Проточный цитометрический анализ для определения профиля CB-CAP: У каждого участника забирали пробу крови 3 мл в пробирку Vacutainer, содержащую ЭДТА в качестве антивокоагулянта (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Пробы крови хранили при 4°C и анализировали в течение 24 часов после забора. Каждую пробу крови анализировали в общей сложности по тринадцати CB-CAP (C4d и C3d на 6 типах клеток: эритроциты [E-C4d, E-C3d], ретикулоциты [R-C4d, R-C3d], T-лимфоциты [T-C4d, T-C3d], B-лимфоциты [B-C4d, B-C3d], моноциты [М-C4d, М-C3d] и гранулоциты [G-C4d, G-C3d], и C4d на тромбоцитах [P-C4d]), а также рецептор комплемента 1 (CR1), экспрессируемый на эритроцитах [E-CR1]). Уровни C4d и C3d, связанных с эритроцитами, ретикулоцитам и тромбоцитами, а также уровни E-CR1 измеряли согласно методикам, описанным в последних публикациях авторов изобретения.

[0048] Уровни C4d и C3d, связанных с лейкоцитами, включая T-лимфоциты, B-лимфоциты, моноциты и гранулоциты, измеряли при использовании недавно разработанного многоцветного проточного цитометрического анализа, с некоторыми модификациями. Коротко, лейкоциты периферической крови (ЛПК) получали с помощью центрифугирования в градиенте Ficoll Plus (GE Healthcare). После удаления примеси эритроцитов путем гипотонического лизиса, ЛПК промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), ресуспендировали в PBS, содержащем 1% бычьей сыворотки и делили на аликвоты для окрашивания антителами. Лимфоциты, моноциты и гранулоциты различали по экспрессии характерных поверхностных молекул и их уникальных свойств прямого (размер)/бокового (зернистость) светорассеяния. Фикоэритрин- или фикоэритрин-Cy5-конъюгированные моноклональные мышиные антитела (mAb), реактивные в отношении линиеспецифчных поверхностных клеточных маркеров (CD3, CD4 и CD8 для T-лимфоцитов; CD19 для B-лимфоцитов; BD Biosciences, San Diego, CA), использовали в сочетании с mAb против C4d человека или C3d человека (мышиный IgG1; реактивный к C4d-содержащим или C3d-содержащим фрагментам C4 или C3; Quidel, San Diego, CA), которое было помечено Alexa Fluor 488 при использовании набора Zenon для введения меток в антитела (Invitrogen, Carlsbad, CA).

[0049] После окрашивания клетки анализировали с использованием проточного цитометра FACS Calibur™ и программы Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Чтобы гарантировать специфичность обнаружения окрашивания антителами, аликвоты лейкоцитов от каждого пациента, окрашенные IgG мыши подходящих изотипов, обычно включали во все эксперименты. Все mAb использовали в концентрации 5 μг/мл. Уровни клеточно-связанных C4d и C3d выражали в специфической срединной интенсивности флуоресценции (SMFI), которую вычисляли как C4d (или C3d) - специфическая срединная интенсивность флуоресценции минус срединная интенсивность флуоресценции изотипического контроля.

[0050] На Фиг. 2 представлено обоснование и общий подход определения профиля и оценки CB-CAP. Как показано на Фиг. 2, во время стадий патогенеза волчанки, включая предволчаночную стадию, система комплемента активируется и производит продукты активации комплемента (CAP), которые могут с легкостью связываться с клетками, циркулирующими в крови. Поверхностно-связанные CAP на клетках периферической крови пациента могут быть измерены с помощью проточно-цитометрических анализов. Профиль CB-CAP и оценка CB-CAP могут быть получены для каждого пациента. Однако, как было показано, одинаковые оценки CB-CAP могут быть получены из различных комбинаций повышенных уровней CB-CAP. Поскольку CAP могут связываться с различными типами клеток у различных пациентов, пациенты могут иметь одинаковые оценки CB-CAP, но различные профили CB-CAP. В сочетании с клинической информацией и/или критериями ACR, профили и оценки CB-CAP могут помочь врачу диагностировать у пациента волчанку в доклинической стадии.

[0051] Статистический анализ: Нормальность распределения непрерывных данных (например, возраста, продолжительности болезни и уровней CB-CAP) определяли при использовании критерия Шапиро-Уилка. В зависимости от структур распределения данных вычисляли описательную статистику, включая средние, стандартные отклонения, медианы и интерквартильный размах (IQR: от 25 до 75 процентиля). Сравнения уровней CB-CAP между больными волчанкой и здоровым контролем выполняли, используя критерий суммы рангов Уилкоксона на основе двойной выборки (Манна-Уитни). Выполняли дополнительные анализы, уделив основное внимание уровням C4d на 7 типах циркулирующих клеток (эритроциты, ретикулоциты, тромбоциты, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, гранулоциты и моноциты).

[0052] Для вычисления оценки CB-CAP, эритроцит-CR1 и каждое измерение клеточно-связанного C4d классифицировали бинарно как положительное (аномальное; оценка = 1) и отрицательное (нормальное; оценка = 0). Положительный фенотип устанавливали, если SMFI клетки конкретного типа у исследуемого пациента на 2 стандартных отклонения (SD) превышала среднюю SMFI клетки соответствующего типа в здоровой контрольной группе. Таким образом, оценки CB-CAP отдельных пациентов могут колебаться от 0 до 8. Все исследования проводили, используя STATA/SE версию 11.0 для Windows (Stata Corporation, College Station, TX).

[0053] Когорта исследования состояла из 447 пациентов с установленной волчанкой, 25 пациентов с доклинической волчанкой, 286 пациентов с другими иммунно-воспалительными заболеваниями и 196 здоровых представителей контрольной группы. Демографические особенности этих групп, участвовавших в исследовании, приведены в Таблице 1 ниже. Хотя группа пациентов с другими болезнями оказалась старше и состояла из большего количества европеоидов по сравнению с другими тремя группами пациентов, эти различия не были статистически значимыми. Сравнение клинических особенностей пациентов с установленной волчанкой или доклинической волчанкой показано в Таблице 2. Если не определено иное, показанные данные соответствовали клиническим проявлениям, определенным согласно критериям ACR, которые присутствовали в любой момент времени в течение болезни. Как было определено, пациенты с диагнозом доклинической волчанки имели меньше клинических проявлений и отклонений показателей лабораторных анализов от нормы (<4), чем пациенты с диагнозом установленной волчанки (>3) (Таблица 3).

Таблица 1 Демографические данные когорты исследования
	Возраст	Пол	Раса
	(лет; среднее +/-SD)	(% женщин)	(% белых)
Установленная волчанка (n = 447)	42,1 +/- 13,3	92,8	80,3
Доклиническая волчанка (n = 24)	42,0 +/- 12,3	91,7	75,0
Другие болезни (n = 286)	46,1 +/- 15,1	86,0	90,6
Здоровая контрольная группа (n = 196)	44,9 +/- 13,7	90,3	83,7

Таблица 2 Сравнение клинических показателей пациентов с установленной волчанкой и с доклинической волчанкой
	Установленная волчанка (%)	Доклиническая волчанка (%)
Суставы	90,2	54,2
Скуловая сыпь	44,1	8,3
Дискоидная сыпь	12,1	12,5
Светочувствительность	58,4	12,5

Язва полости рта	55,0	25
Серозит	41,8	12,5
Неврологическая	10,7	0
Почечная	33,3	12,5
ANA	97,3	87,5
Серологическая	74,3	37,5
Гематологическая	65,1	25,0
Антитела к дцДНК	55,9	25,0
Антитела к а/г Смита	15,7	16,7
Антитела к фосфолипидам	40,9	16,7

Таблица 3 Критерии ACR, которым соответствовали пациенты с доклинической волчанкой
№ пациента	Суставы	Скуло-вая сыпь	Диско-идная сыпь	Свето-чувстви-тельность	Язвы полости рта	Серозит	Невро-логи-ческие	Почеч-ные	ANA	Сероло-гические	Гематоло-гические	Всего критериев ACR
101584	1	0	0	0	0	1	0	0	1	0	0	3
101677	0	0	0	0	0	0	0	0	1	1	1	3
101924	0	0	0	0	0	0	0	0	1	1	0	2
102645	0	0	0	0	1	0	0	0	1	1	0	3
107153	0	0	0	0	0	1	0	0	1	0	1	3
110738	0	0	0	0	0	1	0	0	1	0	1	3
110840	1	0	0	0	0	0	0	0	1	1	0	3
110904	0	0	1	1	1	0	0	0	0	0	0	3
113007	0	0	0	0	0	0	0	1	1	0	0	2
125103	1	1	0	0	0	0	0	0	1	0	0	3
128289	1	0	1	1	0	0	0	0	0	0	0	3
128390	1	0	0	0	0	0	0	0	1	1	0	3
128429	1	0	0	0	0	0	0	0	1	0	0	2
128521	1	1	0	0	0	0	0	0	1	0	0	3
128627	0	0	0	0	1	0	0	0	1	1	0	3
130055	1	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	3
135610	1	0	0	0	0	0	0	0	1	1	0	3

138922	0	0	0	0	0	0	0	0	1	0	1	2
145530	1	0	0	0	0	0	0	0	1	1	0	3
148745	0	0	0	1	1	0	0	0	0	0	0	2
151528	1	0	1	0	0	0	0	0	1	0	0	3
151795	1	0	0	0	0	0	0	1	1	0	0	3
152934	1	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	3
157292	0	0	0	0	0	0	0	1	1	1	0	3

[0054] Специфичное связывание CAP с циркулирующими клетками крови пациентов с установленной волчанкой: В перекрестном исследовании использовалм проточно-цитометрические анализы для измерения и сравнения уровней CAP, связанных на поверхности циркулирующих клеток крови всех субъектов исследования. Согласно предыдущим исследованиям авторов изобретения, значительно превышенные уровни C4d и C3d были обнаружены на поверхностях эритроцитов, ретикулоцитов, тромбоцитов и лимфоцитов пациентов с установленной волчанкой (Таблицы 4 и 5). Значительно превышенные уровни C4d и C3d были также специфично обнаружены на моноцитах пациентов с установленной волчанкой (Таблицы 4 и 5). Согласно предыдущим результатам исследований авторов изобретения, эритроциты пациентов с установленной волчанкой экспрессировали значительно более низкие уровни CR1 (E-CR1), чем эритроциты пациентов с другими болезнями или здоровых пациентов в контрольной группе. Примечательно, что пациенты с доклинической волчанкой, несмотря на наличие менее чем 4 положительных критериев установленной волчанки согласно классификации ACR, также показали пониженные уровни E-CR1 и повышенные уровни CB-CAP на различных циркулирующих клетках крови, которые были статистически неотличимы от соответствующих показателей пациентов с установленной волчанкой (Таблицы 4 и 5). В совокупности, эти результаты указывают, что повышение уровней CB-CAP может предшествовать клиническим симптомам и отклонениям результатов лабораторных анализов от нормы у больных, которые могут находиться в процессе развития волчанки, несмотря на отсутствие соответствия (или отсутствие оценки на соответствие) более чем трем критериям ACR и, таким образом, пока не определены как имеющие установленную волчанку.

[0055] В общем, уровни клеточно-связанных C4d были значительно более высокими, чем уровни C3d (Таблица 4). Поэтому авторы сосредоточились на клеточно-связанном C4d в исследованиях на определение профиля и оценку CB-CAP, описанных ниже.

Таблица 4 Сравнение CB-CAP различных групп в исследовании 4A. CB-C4d
Установленная волчанка (n = 447)
SMFI	E-CR1*	E-C4d*	P-C4d	R-C4d	T-C4d	B-C4d	М-C4d	G-C4d
Среднее	8,65	12,45	2,67	5,24	15,12	53,60	11,44	3,94
Срединное	7,93	7,57	0,71	1,47	3,70	24,90	4,83	1,49
Максимум	26,41	167,77	65,23	206,80	337,01	537,23	256,99	450,93
Минимум	-0,01	-1,32	-2,98	-0,71	-1,36	1,91	-0,55	-0,67
Станд. откл.	5,04	16,24	7,40	13,72	33,26	84,24	21,00	21,82
Квартиль (25%)	4,84	4,72	0,15	0,75	1,57	10,69	3,07	0,85
Квартиль (75%)	11,46	13,94	1,77	3,73	12,71	55,09	9,87	2,98
Доклиническая волчанка (n = 24)
SMFI	E-CR1*	E-C4d*	P-C4d	R-C4d	T-C4d	B-C4d	М-C4d	G-C4d
Среднее	8,62	10,54	3,95	7,14	10,99	30,41	15,15	2,88
Срединное	8,01	10,21	1,06	2,99	4,13	26,58	6,79	1,94
Максимум	17,40	20,06	24,23	41,17	68,22	80,05	60,40	9,30
Минимум	1,94	1,46	-0,41	0,23	0,19	3,82	0,07	0,19
Станд. откл.	4,29	5,22	6,74	10,36	18,32	24,55	16,97	2,70
Квартиль (25 %)	6,28	6,32	0,31	0,94	1,73	10,07	3,76	1,02
Квартиль (75 %)	10,88	13,84	4,07	6,25	10,38	46,87	24,18	4,12

Другие болезни (n = 286)
SMFI	E-CR1*	E-C4d*	P-C4d	R-C4d	T-C4d	B-C4d	М-C4d	G-C4d
Среднее	10,93	5,99	0,55	1,93	2,73	15,59	4,31	1,84
Срединное	10,43	4,48	0,40	0,88	1,52	9,84	3,35	0,99
Максимум	32,70	43,45	4,60	34,48	54,92	200,17	33,77	110,73
Минимум	0,94	0,83	-1,61	-0,08	-0,22	0,08	-0,08	-1,19
Станд. откл.	5,22	5,49	0,84	3,76	5,64	18,82	3,82	6,76
Квартиль (25%)	7,11	3,16	0,08	0,51	0,89	6,95	2,06	0,52
Квартиль (75%)	14,02	6,50	0,76	1,65	2,38	16,30	5,04	1,61
Здоровые пациенты в контрольной группе (n = 196)
SMFI	E-CR1*	E-C4d*	P-C4d	R-C4d	T-C4d	B-C4d	М-C4d	G-C4d
Среднее	12,44	4,16	0,34	1,13	1,54	9,55	4,67	1,35
Срединное	12,52	3,70	0,27	0,80	1,24	7,99	3,86	1,10
Максимум	28,06	12,69	3,12	7,37	6,06	38,02	19,64	7,41
Минимум	3,07	1,07	-2,66	-1,37	-0,42	0,49	0,00	-1,10
Станд. откл.	5,23	2,02	0,68	1,11	1,00	6,59	3,38	1,12
Квартиль (25%)	8,53	2,63	0,00	0,36	0,81	5,31	2,57	0,74
Квартиль (75%)	15,54	5,22	0,58	1,55	2,19	10,84	6,13	1,64
Точка отсечения (HC среднее+2 SD)	10,00	8,20	1,70	3,35	3,54	22,68	11,43	3,59

4B. CB-C3d
Установленная Волчанка (n = 447)
SMFI	E-C3d*	R-C3d	T-C3d	B-C3d	М-C3d	G-C3d
Среднее	2,38	0,94	2,51	18,78	2,13	0,91
Срединное	0,89	0,26	1,32	15,24	1,82	0,78
Максимум	90,76	34,23	52,97	100,98	17,29	12,95
Минимум	-0,80	-1,54	-1,12	2,31	-7,48	-5,18
Станд. откл.	6,26	2,86	4,19	14,07	2,24	1,09
Квартиль (25%)	0,38	0,08	0,61	9,30	0,89	0,39
Квартиль (75%)	2,32	0,59	2,61	23,06	2,81	1,21
Доклиническая волчанка (n = 24)
SMFI	E-C3d*	R-C3d	T-C3d	B-C3d	М-C3d	G-C3d
Среднее	1,40	1,29	1,91	22,40	2,83	0,88
Срединное	0,94	0,29	1,62	20,12	2,42	0,80
Максимум	4,02	8,81	6,17	55,00	10,91	2,21
Минимум	-0,01	0,02	-0,46	4,50	-0,49	-0,47
Станд. откл.	1,29	2,11	1,74	15,48	2,38	0,64
Квартиль (25%)	0,46	0,11	0,74	8,18	1,40	0,47
Квартиль (75%)	2,57	1,95	2,28	33,56	3,39	1,34
Другие болезни (n = 286)

SMFI	E-C3d*	R-C3d	T-C3d	B-C3d	М-C3d	G-C3d
Среднее	0,65	0,32	1,08	15,60	1,58	0,76
Срединное	0,33	0,15	0,71	11,64	1,39	0,60
Максимум	12,01	14,16	15,30	77,12	11,50	22,65
Минимум	-1,98	-0,81	-2,04	-1,59	-1,56	-0,93
Станд. откл.	1,36	1,12	1,53	12,70	1,31	1,53
Квартиль (25%)	0,17	0,04	0,33	7,55	0,79	0,26
Квартиль (75%)	0,62	0,26	1,36	18,32	2,21	0,99
Здоровые пациенты в контрольной группе (n = 196)
SMFI	E-C3d*	R-C3d	T-C3d	B-C3d	М-C3d	G-C3d
Среднее	0,29	0,09	0,83	9,94	1,69	0,69
Срединное	0,25	0,12	0,62	8,32	1,53	0,63
Максимум	1,55	1,13	4,03	58,72	6,97	3,19
Минимум	-1,07	-1,38	-0,21	-1,05	-0,40	-1,04
Станд. откл.	0,31	0,27	0,68	6,44	1,14	0,60
Квартиль (25%)	0,14	0,00	0,34	5,99	0,96	0,36
Квартиль (75%)	0,39	0,24	1,18	11,92	2,12	0,95
Точка отсечения (HC среднее+2 SD)	0,91	0,63	2,19	22,82	3,97	1,89

* Специфическая срединная интенсивность флуоресценции была показана для всех маркеров кроме E-CR1, E-C4d и E-C3d. Для этих двух маркеров вместо этого была вычислена специфическая средняя интенсивность флуоресценции.

Таблица 5 Сравнение CB-CAP в Различных Группах по изучению 5A. CB-C4d
P-значение	E-CR1	E-C4d	P-C4d	R-C4d	T-C4d	B-C4d	М-C4d	G-C4d
Установленная волчанка и доклиническая волчанка	0,976	0,565	0,418	0,533	0,547	0,179	0,396	0,812
Установленная волчанка и другие болезни	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	0,059
Установленная волчанка и здоровые пациенты в контрольной группе	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	0,013

Доклиническая волчанка и другие болезни	0,036	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	0,459
Доклиническая волчанка и здоровые пациенты в контрольной группе	0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001

5B. CB-C3d
P-значение	E-C3d	R-C3d	T-C3d	B-C3d	М-C3d	G-C3d
Установленная волчанка и доклиническая волчанка	0,443	0,577	0,488	0,221	0,135	0,909
Установленная волчанка и доклиническая волчанка	<0,001	<0,001	<0,001	0,002	<0,001	0,148
Установленная волчанка и здоровые пациенты в контрольной группе	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	0,001	0,001
Доклиническая волчанка и другие болезни	0,010	<0,001	0,012	0,014	<0,001	0,691
Доклиническая волчанка и здоровые пациенты в контрольной группе	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	0,1408

[0056] Результаты, показанные выше, демонстрируют, что CB-CAP, в особенности C4d, производимые во время активации комплемента у больных с установленной волчанкой или доклинической волчанкой, способны связываться с целым рядом циркулирующих клеток крови. Как показано в Таблице 4, когда пациенты с установленной волчанкой или доклинической волчанкой были проанализированы как группа, все средние уровни C4d, связанного на 7 протестированных типах клеток, были значительно повышены. Однако дальнейший анализ отдельных пациентов показал, что повышенные уровни C4d не обязательно одновременно присутствовали на всех типах клеток у данного пациенте в данный момент (данные не показаны). Когда уровни C4d, связанного на различных типах клеток у отдельных пациентах, измеряли тщательно в одно и то же время исследования, было установлено, что различные уровни C4d могут быть обнаружены на некотором наборе типов клеток у одного пациента, но на другом наборе типов клеток у другого пациента (Таблица 6). Таким образом, данный тип селективного связывания C4d с различными типами клеток создает сигнатуру профиля CB-CAP, уникальную для каждого пациента. Таким образом, авторы изобретения определили, что эта информация полезна для определения того, каких пациентов следует считать демонстрирующими волчанку в доклинической стадии.

Таблица 6 Дифференциальное связывание CAP с различными типами клеток у различных пациентов с установленной волчанкой
№ пациента	E-CR1	E-C4d	P-C4d	R-C4d	T-C4d	B-C4d	М-C4d	G-C4d	CD4 T-C4d	CD8 T-C4d
111462	16,13	24,34	0,90	23,70	5,20	47,01	15,91	2,08	5,79	6,03
107468	7,40	5,36	6,00	11,21	148,85	88,53	124,93	0,00	76,21	255,26
111271	14,87	23,38	1,67	50,82	180,73	312,06	23,55	5,00	68,56	227,63
101601	9,14	8,19	0,27	7,39	184,38	355,238	10,98	2,88	99,19	250,36
102683	22,18	7,02	1,15	7,00	129,57	180,94	16,48	2,50	234,16	0,97
111521	16,80	50,83	0,36	56,30	5,84	55,86	14,49	4,21	10,62	6,25
111505	1,13	23,06	26,68	28,42	41,7	145	197,8	40,4	31,8	54,22
101658	10,49	8,33	11,42	2,46	183,62	353,52	97,17	19,43	245,61	176,94
94705	3,09	113,71	5,54	19,62	18,38	90,03	138,41	17,05	16,19	41,04
107395	4,42	44,30	69,14	40,36	404,24	174,82	778,53	343,92	376,1	411,57

[0057] Затем предприняли попытку разработать оценочную систему, в которой будут использоваться наблюдаемые пациент-специфические профили CB-CAP. Устанавливая 1 балл для аномально повышенных уровней C4d, связанного с каждым из 7 протестированных типов клеток (E-C4d, R-C4d, P-C4d, T-C4d, B-C4d, М-C4d и G-C4d), и для аномально низкого уровня CR1, экспрессируемого эритроцитами (E-CR1), для каждого пациента может быть получена оценка CB-CAP в пределах от 0 (нет аномального уровня CB-CAP и CR1) до 8 (аномальные уровни CR-1 и CB-CAP на всех 7 типах клеток). Точка отсечения для аномальных уровней CB-CAP для каждого типа клеток была определена как средний уровень CAP соответствующего типа клеток здоровой контрольной группы плюс 2 стандарных отклонения (см. Таблицу 4). Точка отсечения для аномального уровня E-CRl была эмпирически определена как SMFI<10 на основе предыдущего исследования авторов. Используя такую оценочную систему, вычислили и сравнили оценки CB-CAP для каждого пациента с установленной волчанкой, доклинической волчанкой или другими иммунно-воспалительными заболеваниями. Как показано в Таблице 7, пациенты с установленной волчанкой и доклинической волчанкой обычно получали более высокие оценки CB-CAP (со средним баллом 2,80 и 4,00, соответственно), чем пациенты с другими иммунно-воспалительными заболеваниями (средний балл 1,23).

Таблица 7 Сравнение оценок CB-CAP в 3 различных группах пациентов
	Оценка CB-CAP
	0 (n;%)	1 (n;%)	2 (n;%)	3 (n;%)	4 (n;%)	5 (n;%)	6 (n;%)	7 (n;%)	8 (n;%)	Общий балл	Средний балл
Установленная волчанка (всего n = 447)	63; 14	101; 24	50; 11	59; 13	44; 10	51; 11	27; 6	29; 6	23; 5	1250	2,80
Доклиническая волчанка (всего n = 24)	2; 8	6; 26	2; 8	1; 4	2; 8	2; 8	4; 17	3; 13	2; 8	100	4,00
Другие болезни (всего n = 286)	114; 38	104; 36	26; 9	14; 5	14; 5	15; 5	2; 1	2; 1	0; 0	352	1,23

[0058] Распространенность пациентов с различными оценками CB-CAP в каждой группы пациентов представлена на Фиг. 3. Из Фиг. 3 видно, что высокие оценки CB-CAP были более распространенными в группах пациентов с установленной волчанкой и доклинической волчанкой, чем в группе пациентов с другими иммунно-воспалительными заболеваниями. Примечательно, что распределение частоты оценок CB-CAP в группе пациентов с доклинической волчанкой существенно не отличалось от такового у пациентов с установленной волчанкой, но значительно отличалось от такового у пациентов с другими заболеваниями. Этот результат дополнительно подтверждает определение, что комплемент-опосредованный иммунопатогенный процесс может возникать внезапно и, в конечном счете, приводить к клинически очевидным симптомам у пациента. Кроме того, связывание CAP с различными популяциями клеток у различных больных волчанкой может указать уникальные патогенные механизмы у разных пациентов. В совокупности эти результаты дают основания предполагать, что связывание CAP с циркулирующими клетками может фактически являться частью иммунопатогенного процесса волчанки, который может непрерывно развиваться и усиливаться. Таким образом, авторы изобретения определили, что профили CB-CAP могут служить суррогатными маркерами волчанки в доклинической стадии.

[0059] Таким образом, в настоящем документе описаны способы и системы для определения профиля и оценки CB-CAP, служащих в качестве диагностических биомаркеров для определения того, что пациентов следует диагностировать как демонстрирующих волчанку в доклинической стадии. Это может позволить врачу установить более ранний и более точный диагноз, назначить более раннее и более точное терапевтическое воздействие и, в конечном счете, уменьшить риск активности острого заболевания и долговременного повреждения органов. Этот более ранний и более точный диагноз и воздействие могут препятствовать прогрессии у ранее невыявленных пациентов установленной волчанки или, по меньшей мере, задерживать такую прогрессию.

[0060] На Фиг. 4 показан пример внутренних аппаратных средств, которые могут использоваться, чтобы содержать или выполнять различные компьютерные процессы и системы, как обсуждается выше. Электрическая шина 600 служит в качестве главной информационной магистрали, связывающие другие показанные компоненты аппаратных средств. ЦП 605 является центральным процессором системы, выполняющим вычисления и логические операции, требуемые для выполнения программы. ЦП 605, один или в соединении с одним или более другими элементами, раскрытыми на Фиг. 4, является обрабатывающим устройством, вычислительным устройством или процессором, при этом данные термины используются в рамках настоящего описания. Постоянное запоминающее устройство (ПЗУ) 610 и оперативное запоминающее устройство (ОЗУ) 615 представляют примеры запоминающих устройств. Обрабатывающее устройство может исполнять программные инструкции, сохраненные в запоминающем устройстве, чтобы выполнять способы, раскрытые в настоящем документе. При использовании в настоящем документе термина "процессор" или "обрабатывающее устройство", предполагается, что данный термин включает одно устройство или любое количество устройств, которые вместе выполняют процесс, если конкретно не указано иное.

[0061] Контроллер 620 подсоединен с одним или более необязательными запоминающими устройствами 625, которые служат в качестве накопителей данных, к системной шине 600. Эти запоминающие устройства 625 могут включать, например, внешний DVD-привод или привод CD-ROM, жесткий диск, флеш-память, USB-накопитель или другой тип устройства, которое служит в качестве накопителя данных. Как указано ранее, эти различные приводы и контроллеры являются необязательными устройствами. Дополнительно запоминающие устройства 625 могут служить для включения отдельных файлов для хранения любых программных модулей или инструкций, вспомогательных данных, данных о событиях, общих файлов для хранения групп таблиц сопряженности признаков и/или регрессионных моделей, или одной или более баз данных для хранения информации, как обсуждается выше.

[0062] Программные инструкции, программное обеспечение или интерактивные модули для выполнения любого из функциональных шагов, связанных с процессами, как описано выше, могут быть сохранены в ПЗУ 610 и/или ОЗУ 615. Необязательно, программные инструкции могут быть сохранены на материальном машиночитаемом носителе, таком как компакт-диск, цифровой диск, флеш-память, карта памяти, USB-накопитель, накопитель на оптическом диске и/или другой носитель информации.

[0063] Интерфейс 630 дисплея может обеспечивать вывод информации с шины 600 на дисплей 635 в аудио, визуальном, графическом или буквенно-цифровом формате. Связь с внешними устройствами может осуществляться при использовании различных коммуникационных портов 640. Коммуникационный порт 640 может быть подсоединен к коммуникационной системе, такой как интернет, локальная сеть или сеть мобильной телефонной связи.

[0064] Аппаратные средства могут также включать интерфейс 645, который обеспечивает прием данных с устройств ввода, таких как клавиатура 650 или другое устройство ввода 655, такое как устройство дистанционного управления, указывающее устройство, устройство ввода видео и/или устройство ввода аудио.

[0065] Особенности и функции, описанные выше, а также альтернативы могут быть объединены во многие другие различные системы или приложения. Различные, непредвиденные на настоящий момент или непредусмотренные альтернативы, модификации, вариации или улучшения могут быть включены специалистами в данной области техники, каждый из которых, как предполагается, также должен быть охвачен раскрытыми вариантами осуществления.

1. Способ определения вероятности того, что пациент имеет волчанку в доклинической стадии, включающий:

взятие образца крови у пациента, который, как было определено, соответствует менее чем четырем критериям классификации волчанки,

измерение уровней для группы клеточно-связанных продуктов активации комплемента (CB-CAP) в указанном образце крови, где указанная группа CB-CAP включает по меньшей мере восемь из следующих: E-C4d, E-C3d, R-C4d, R-C3d, T-C4d, T-C3d, B-C4d, B-C3d, М-C4d, М-C3d, G-C4d, G-C3d, P-C4d и E-CR1;

сравнение уровней CB-CAP пациента с контрольными уровнями для определения количества CB-CAP, для которых уровни у пациента являются аномальными по сравнению с контрольными уровнями;

вычисление процента CB-CAP, для которых уровни у пациента являются аномальными по сравнению с контрольными уровнями; и

принятие вычисленного процента за вероятность того, что пациент имеет волчанку в доклинической стадии.

2. Способ по п. 1, где указанная группа CB-CAP включает E-CR1.

3. Способ по п. 1, дополнительно включающий:

определение веса одного или более CB-CAP, для которых присутствует аномальный уровень; и

использование определенного веса в вычислении вероятности того, что пациент имеет волчанку в доклинической стадии.

4. Способ по п. 1, дополнительно включающий:

определение величины одного или более CB-CAP, для которых присутствует аномальный уровень; и

использование определенной величины в вычислении вероятности того, что пациент имеет волчанку в доклинической стадии.

5. Способ по п. 1, дополнительно включающий:

определение, демонстрирует ли пациент один или более критериев классификации; и

использование критериев классификации в вычислении вероятности того, что пациент имеет волчанку в доклинической стадии.

6. Способ по любому из пп.1-5, где аномальный уровень E-CR1 является пониженным по меньшей мере на предварительно определенное пороговое значение по сравнению с контрольным уровнем E-CR1 и где аномальный уровень любого CB-CAP, отличного от E-CR1, является повышенным по меньшей мере на предварительно определенное пороговое значение по сравнению с соответствующим контрольным уровнем.

7. Способ по п.6, где указанное пороговое значение представляет собой два стандартных отклонения от соответствующего контрольного уровня.