Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа



Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа
Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа
Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа

Владельцы патента RU 2680664:

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "КАЗАНСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. А.Н. ТУПОЛЕВА-КАИ", КНИТУ-КАИ (RU)

Данный способ относится к использованию лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при регистрации высокоскоростных флуоресцентных сигналов. В частности, в физиологических исследованиях, для регистрации интенсивности свечения кальциевых красителей в нервно-мышечном препарате при стимуляции двигательного нерва. Технический результат изобретения заключается в возможности достоверной оценки амплитудных и временных характеристик регистрируемых сигналов. Способ включает в себя получение на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе временной серии изображений и построение графика зависимости интенсивности свечения флуоресцентного красителя от времени, при этом съемка происходит в несколько этапов, на каждом из которых смещается по времени сигнал от стимулятора относительно начала процесса сканирования конфокальным микроскопом, а полученные серии изображений собираются в одну серию. 2 ил.

 

Предлагаемый способ относится к использованию лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при регистрации высокоскоростных флуоресцентных сигналов. В частности, в физиологических исследованиях, для регистрации интенсивности свечения кальциевых красителей в нервно-мышечном препарате при стимуляции двигательного нерва.

Известен способ сканирования флуоресцентных сигналов от биологических объектов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа (принцип впервые предложен М. Мински в 1957 г.), описанный в книге "Мухитова А.Р., Архиповой С.С, Никольского Е.Е., Современная световая микроскопия в биологических и медицинских исследованиях Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казанский гос. мед университет Росздрава. - М.: Наука, 2011. - 140 с. - ISBN 978-5-02-037483-6", в соответствие с которым препарат сканируют поточечно лазерным лучом и возбуждают флуоресцентный краситель, свет от которого через конфокальную диафрагму регистрируется фотоумножителем. Затем из зарегистрированных значений интенсивности света при помощи компьютера восстанавливается поточено изображение препарата. Для формирования серии изображений, циклы сканирования повторяются.

Смещения Стокса - разница длин волн максимумов спектров поглощения и испускания флуоресценции флуорохромом. Измеряется в обратных сантиметрах, реже нанометрах, в силу нелинейности зависимости энергии фотона от длинны волны. Назван в честь физика Джоджа Стокса.

Кальциевый транзиент - изменение интенсивности свечения кальциевого флуоресцентного красителя во времени в зависимости от концентрации ионов кальция в среде.

Вход кальция - вход в нервное окончание ионов кальция через кальциевые каналы, расположенные на мембране.

Кальциевый канал - семейство ионных каналов, избирательно проницаемых для ионов кальция.

Потенциал действия - волна возбуждения, перемещающаяся по мембране живой клетки в виде кратковременного изменения мембранного потенциала на небольшом участке возбудимой клетки, в результате которого наружная поверхность этого участка становится отрицательно заряженной по отношению к внутренней поверхности мембраны, в то время, как в покое она заряжена положительно. Потенциал действия является физиологической основой нервного импульса.

Конфокальная диафрагма - это диафрагма конфокального микроскопа, которая предназначена отсекать поток фонового рассеянного света. Диафрагма расположена после объективной линзы так, чтобы свет, испускаемый исследуемой точкой, проходил через нее, а свет, исходящий от других точек, задерживался диафрагмой.

Недостатком имеющегося способа является низкая скорость сканирования. Ограничение скорости сканирования связано со временем, необходимым на механическое перемещение зеркал, которые позиционируют лазерный луч. Современные конфокальные микроскопы позволяют сканировать изображение с разверткой несколько десятков мс на кадр. Этого недостаточно для регистрации быстрых процессов. Возможно высокоскоростное сканирование одной линии изображения. Но при таком режиме сканирования, можно получить информацию только от ограниченной зоны объекта исследования.

Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, является улучшение временного разрешения при сканировании быстрых флуоресцентных сигналов в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии на примере регистрации флуоресцентного кальциевого транзиента.

Технический результат предлагаемого способа регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа заключается в возможности достоверной оценки амплитудных и временных характеристик регистрируемых быстрых флуоресцентных сигналов.

Технический результат в предлагаемом способе регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа, включающий в себя получение на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе временной серии изображений и построение графика зависимости интенсивности свечения флуоресцентного красителя от времени, достигается тем, что съемка происходит в несколько этапов, на каждом из которых сигнал от препарата смещается на некую константу времени при неизменных параметрах сканирования микроскопа, а полученные в ходе эксперимента серии изображений собираются в одну серию по определенному алгоритму.

Рассмотрим осуществление предлагаемого способа регистрации быстрого кальциевого флуоресцентного сигнала при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа на примере регистрации кальциевого транзиента.

Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп - это микроскоп, получение изображения в котором осуществляется сканированием препарата, окрашенного флуоресцентным красителем, сфокусированным лазерным лучом определенной длины волны. Перемещение лазерного луча осуществляется за счет системы зеркал, которые осуществляют развертку лазерного луча при сканировании препарата. Во время сканирования препарата лазерный луч возбуждает флуоресцентный краситель, который согласно смещению Стокса испускает свет, длина волны которого выше длинны волны света от лазерного источника возбуждения. С помощью системы фильтров свет возбуждения задерживается, а свет эмиссии проходит через конфокальную диафрагму и регистрируется системой фотоумножителей. Из зарегистрированных интенсивностей свечения, соответствующих определенным точкам препарата, при помощи компьютера формируется интересующее нас видеоизображение.

В случае регистрации кальциевого транзиента одновременно со сканированием изображения осуществляется стимуляция препарата, которая вызывает изменение свечения флуоресцентного красителя. Регистрация входа кальция осуществляется при помощи флуоресцентных кальциевых красителей, которые меняют интенсивность своего свечения в зависимости от концентрации ионов кальция в среде (кальциевый транзиент). Вход ионов кальция в периферические нервные окончания является быстропротекающим биологическим процессом и для его регистрации необходимо высокоскоростное сканирование. Длительность кальциевого транзиента в зависимости от красителя и объекта исследования составляет 500-1000 мс а скорость нарастания переднего фронта кальциевого транзиента составляет около 6-12 мс. Соответственно для корректного анализа амплитуды флуоресцентного кальциевого транзиента необходимо временное разрешение системы регистрации порядка 1 миллисекунды на кадр. Существующие конфокальные сканирующие системы позволяют сканировать изображения размером 512 на 512 пикселей со скоростью 30-70 миллисекунд на кадр, что не позволяет оценивать корректно амплитудные и временные характеристики кальциевого транзиента.

Кальциевый транзиент инициируется входом кальция в нервное окончание через потенциал-чувствительные кальциевые каналы во время распространяющегося потенциала действия. Потенциал действия запускается раздражением двигательного нерва специализированным стимулятором биологических объектов. Стимулятор - это внешнее электронное устройство, которое выдает импульсы заданной амплитуды и длительности. Стимулятор синхронизируется с конфокальным сканирующим микроскопом через блок синхронизации, входящий в состав микроскопа.

Блок синхронизации осуществляет запуск стимулятора синхроимпульсом. В момент начала съемки видеоизображения блок синхронизации посылает импульсный сигнал на стимулятор, после чего стимулятор посылает импульсный сигнал на препарат. На стимуляторе можно настраивать задержку между синхроимпульсом от микроскопа и импульсом, стимулирующим препарат.

Разработанный способ позволяет зарегистрировать повторяющийся периодический флуоресцентный кальциевый сигнал с достаточным временным и пространственным разрешением посредством только программных операций, без конструктивного изменения существующей конфокальной системы. Суть метода заключается в том, что сигнал стимуляции можно смещать относительно начала процесса сканирования микроскопом. Это достигается посредством задержки этого сигнала стимулятором. Так как развертка микроскопа неизменна, то регистрировать сигнал при смещении микроскоп будет в других точках, отстоящих по времени от начала исходного сигнала на величину временной константы t. Величина t выбирается исходя из необходимого временного разрешения и зависит от временных параметров регистрируемого сигнала. Чтобы достичь необходимого результата, нужно смещать сигнал до тех пор, пока шаг времени смещения n*t не достигнет значения минимального времени между кадрами Т (n*t=Т), где n=1, 2, 3,.., N(Фигура 1). Длительность одной серии кадров k*T выбирается исходя из длительности интересующего сигнала флуоресценции и должна превышать его длительность на значение Т, где k - количество кадров одного регистрируемого сигнала. На фиг. 1 изображен сигнал без смещения и четыре смещенных сигнала. Так как микроскоп формирует кадры с периодом Т, то полученный сигнал будет далек от истинного. На изображении он представлен пятью соединенными между собой точками сигнала без смещения, попавшими в момент регистрации кадра. Таким образом, смещая сигнал по времени, можно собрать потерянные из-за низкой скорости сканирования кадры и соответственно потерянные точки сигнала. Восстановление флуоресцентного сигнала с высоким временным разрешением из зарегистрированных серий кадров осуществляется согласно следующему алгоритму (Фиг. 2): кадр из смещенной серии изображений вставляется за соответствующим кадром первой серии изображений в порядке смещения. Собранные кадры таким путем объединяются в порядке смещения в одно видеоизображение, которое будет обладать интересующей нас разверткой по времени. При этом развертка (время между кадрами) нового видеоизображения будет равна заданному шагу времени смещения сигнала t.

Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов, включающий получение временной серии изображений и построение графика зависимости интенсивности свечения флуоресцентного красителя от времени, отличающийся тем, что съемка происходит в несколько этапов, на каждом из которых смещается по времени сигнал от стимулятора относительно начала процесса сканирования конфокальным микроскопом, а полученные серии изображений собираются в одну серию.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области формирования изображения образца и может быть применено в области цифровой патологии. Способ одновременного захвата данных изображений при многочисленных глубинах образца использует устройство формирования изображений, которое содержит датчик изображения, который выполнен с возможностью отображения наклонного сечения образца для формирования отличающихся длин оптического пути от образца до датчика и получения данных изображения при многочисленных глубинах образца, и имеет первую и вторую пиксельную линии, которые имеют отличающуюся длину оптического пути до образца вдоль оптической оси устройства и отделены друг от друга просветом вдоль направления сканирования.
Регулируемый штатив для оптического прибора для наблюдения, в частности для операционного микроскопа, имеет ось (1) наклона и ось (2) поворота для прибора и фланец (4) для соединения с прибором или дополнительным элементом регулируемого штатива.

Изобретение относится к способам определения местоположения единичных молекул вещества в образце. Единичные молекулы вещества находятся во флуоресцентном состоянии, в котором их можно возбуждать светом возбуждения для испускания света флуоресценции.

Изобретение относится к области приборостроения, связанной с производством оптико-электронной аппаратуры. В осветительном блоке устройства коллимированный свет лазерного источника расщепляется в матрицу лучей с помощью дифракционного оптического элемента, матрица лучей затем отклоняется светоделительным кубиком и фокусируется в плоскость матрицы диафрагм, проходит через светоделительную пластинку и далее отклонение или сканирование матрицы лучей по двум координатам исследуемого объекта осуществляется с помощью двух плоскопараллельных пластин, установленных на ортогонально ориентированных относительно друг друга осях роторов электродвигателей или гальвано-сканеров, и формирующей оптики, затем упомянутые лучи проходят двулучепреломляющую пластинку, попадают через фокусирующую оптику на исследуемый объект, а отраженный от исследуемого объекта оптический сигнал возвращается в обратном направлении до светоделительного кубика, проходит через кубик и попадает на регистрирующую матрицу фотодетекторов через поляризационный фильтр, оборачивающий изображение по двум ортогональным осям оптический элемент, проекционный объектив, поворотное зеркало, затем проходит через плоскопараллельные пластины осветительного блока и проекционный объектив.

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике. Для исследования биологических объектов, в том числе наружных покровов тела человека, используют аппаратно-программный комплекс для цифровой биомикроскопии, включающий в себя блок обработки данных, включающий в себя компьютер с программным обеспечением, который реализует алгоритмы обработки изображений для определения цветовых характеристик и геометрических параметров изображений, анализирует стереограммы, архивирует данные, генерирует отчеты и дополнительно обеспечивает обмен данными с сервером или «облачным» ресурсом; блок фоторегистрации, включающий в себя защитный кожух, в котором смонтированы: цифровая камера; блок диффузно-рассеянного освещения, выполненный в виде разнонаправленных источников света видимого диапазона, ближнего УФ-диапазона и ближнего ИК-диапазона, имеющих матовые рассеиватели; блок бокового освещения, выполненный в виде узконаправленных источников света видимого диапазона, ближнего УФ-диапазона и ближнего ИК-диапазона, располагаемых под углом 30-45 градусов к оптической оси цифровой камеры; бесконтактный датчик определения расстояния до биообъекта; и тест-объект с допуском 0,1 мм, обеспечивающий получение стандартных калибровочных изображений с возможностью смещения тест-объекта с шагом 1 мм; и блок индикации, выполненный в виде монитора пациента, связанного с блоком обработки данных.

Микроскоп может быть использован при юстировке оптических систем, а также для контроля погрешностей центрирования линз. Микроскоп содержит два измерительных канала.

Изобретение относится к технологиям количественной фазовой микроскопии и предназначено для измерения пространственного распределения фазовой задержки, вносимой прозрачным микрообъектом, в произвольных узких спектральных интервалах.

Оптический прибор для формирования оптического изображения, предназначенного для наблюдения наблюдателем, содержит оптическую систему для формирования оптического изображения объекта, видимого наблюдателю на выходном зрачке.

Изобретение относится к области интерференционной оптики и может быть использовано для определения рельефа поверхности на основе фазового изображения, например, в интерференционных микроскопах.

Изобретение относится к устройству для размещения объектов, подлежащих медицинскому исследованию посредством продувки. Устройство содержит средство крепления контейнера, узел всасывания со средством выталкивания и всасывания воздуха, узел нагнетания воздуха для создания, средство перемещения фильтра к узлу всасывания и узлу нагнетания воздуха.

Изобретение относится к методам определения концентрации примесей. Люминесцентный способ определения концентрации центров свечения в кристаллических материалах включает возбуждение люминесцентных примесей электронным пучком, длительность которого составляет 0,1 излучательного времени жизни наиболее короткоживущего центра свечения, регистрацию люминесценции, выявление характеристических полос в спектре люминесценции, идентификацию центров свечения, измерение интенсивностей эталона и характеристических полос, определение концентрации с привлечением данных по градуировочным образцам, где внутренним эталоном чувствительности является собственное фундаментальное широкополосное свечение исследуемого материала, длительность которого меньше излучательного времени центров свечения.

Изобретение относится к области оптических измерений. Установка для калибровки/поверки средств измерений ширины лазерного пучка содержит закрепленные на едином основании источник лазерного излучения, делительную пластину, механизм изменения ширины лазерного пучка и выполненное с возможностью перемещения основное средство измерений, а также контрольное средство измерений, расположенное на линии отраженного от делительной пластины лазерного пучка.

Изобретение относится к области оптических измерений и касается дозиметра ультрафиолетового излучения. Дозиметр включает в себя последовательно расположенные по ходу распространения излучения средство оптической фильтрации, пропускающее ультрафиолетовое излучение, фотолюминесцентный преобразователь ультрафиолетового излучения в видимое и фотодетектор.

Изобретение относится к области измерительной техники и касается способа регистрации вакуумного ультрафиолета. Способ основан на регистрации вторичного излучения люминесцирующего вещества и заряженных частиц, генерируемых вакуумным ультрафиолетом.

Изобретение относится к области радиационных измерений и касается люминесцентного дозиметра ультрафиолетового излучения. Дозиметр включает в себя чувствительный элемент, передающее оптическое волокно, подвижную кассету с оптическими фильтрами и фотоприемное устройство.

Изобретение относится к радиационным измерениям, в частности к измерениям дозы ультрафиолетового (УФ) излучения, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, биотехнологии, обеззараживании объектов, материаловедении, экологии, дефектоскопии, криминалистике, искусствоведении.

Изобретение относится к устройствам для оптического спектрального определения элементного состава веществ по спектрам люминесценции и может быть использовано, в частности для определения малых концентраций актинидных элементов в объектах окружающей среды и технологических растворах, например, для определения концентрации урана в природных водах, в водах хозяйственно-бытового и технического назначения.

Изобретение относится к области приборостроения и может быть использовано при исследовании объектов окружающей среды, а также технологических растворов. .

Изобретение относится к устройствам для сканирования результатов диагностики в медицине, ветеринарии, контроле пищевых продуктов, в криминалистике. .

Изобретение относится к медицинской технике и может быть использовано для определения биологически эффективных интенсивностей и доз различных видов излучения. .

Данный способ относится к использованию лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при регистрации высокоскоростных флуоресцентных сигналов. В частности, в физиологических исследованиях, для регистрации интенсивности свечения кальциевых красителей в нервно-мышечном препарате при стимуляции двигательного нерва. Технический результат изобретения заключается в возможности достоверной оценки амплитудных и временных характеристик регистрируемых сигналов. Способ включает в себя получение на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе временной серии изображений и построение графика зависимости интенсивности свечения флуоресцентного красителя от времени, при этом съемка происходит в несколько этапов, на каждом из которых смещается по времени сигнал от стимулятора относительно начала процесса сканирования конфокальным микроскопом, а полученные серии изображений собираются в одну серию. 2 ил.

Наверх