Способ определения солей фитиновой кислоты в семенах растений


G01N1/34 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2680833:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") (RU)

Изобретение относится к аналитической химии, предназначено для определения органического соединения фитина в семенах растений. Способ определения солей фитиновой кислоты в семенах растений включает экстракцию фитина из сырья соляной кислотой, проведение дополнительной очистки солянокислой вытяжки добавлением к ней смеси изоамилового спирта с хлороформом (1:24 об. долей) в соотношении объемов вытяжка : смесь 4:1, перемешивание, центрифугирование полученной смеси при не менее 20000g, добавление к полученной надосадочной жидкости раствора 0.03% роданида аммония NH4SCN в 6% HCl и раствора 0.86% FeCl3 и 0.2% HCl в дистилированой воде в объемном соотношении 1:1,5:1, колориметрирование при длине волны 337 нм, в качестве контроля принимается смесь растворов 0.03% роданида аммония NH4SCN в 6% HCl и раствор 0.86% FeCl3 и 0.2% HCl в дистилированой воде в тех же пропорциях, но объем надосадочной жидкости заменяется равным объемом воды, определение абсолютной массы f (мг) фитина в навеске пробы по градуировочному графику и концентрации F (%) по формуле F=100f/Mn, где Mn - масса навески пробы надосадочной жидкости (мг). 1 пр.

 

Изобретение относится к аналитической химии, предназначено для определения органического соединения фитина в семенах растений.

Фитин является основным фосфорсодержащим компонентом клеток многих растений и играет значительную роль в процессах прорастания семян, ускоренного роста и накопления биомассы. Основными проблемами при определении содержания солей фитиновой кислоты является его труднодоступность в связи с плохой растворимостью как в спирте, так и водных растворах, а также большим содержанием жиров и белков в семенах.

Известен способ выделения концентрата фитина из рисовых отрубей (JPS 6058993, МПК C07C 27/00; C07C 29/12; C07C 35/16; C07C 67/00; C07F 9/117, опубл. 1985-04-05), согласно которому рисовые отруби перемешивают с растворителем, например, н-гексаном и оставляют до образования сверху белой суспензии, содержащей фитин. Известен способ экстракции и очистки фитина из рисовых отходов с помощью обработки 1% раствором азотной кислоты, с последующим осаждением 10% известковым молоком и фильтрацией на прессе (Патент №2171808 C07F 9/117, опубл. 10.08.2001). Полученный технический фитин перекристаллизовывают 10% азотной кислотой, затем осаждают, сушат. Недостатком метода является его многостадийность, не приводящая, однако, к получению высокоочищенного от органических и неорганических примесей препарата, что затрудняет точное определение его концентрации. При этом работы по очистке фитина проводятся на холоду для предотвращения действия фермента фитазы, расщепляющей фитин на низкомолекулярные компоненты.

Известен способ количественного определения фитина с применением реактива Вэйда, включающего сульфосалициловую кислоту в присутствии соли трехвалентного хлористого железа FeCl3⋅6Н2О (Latta М., Eskin М.А simple and rapid colorimetric method for phytate determination // J. Agric. Food Chem. 1980. №28. P. 1313-1315). Недостатком метода является зависимость окраски результирующей смеси от pH среды: в зависимости от кислотности применяется измерение концентрации фитина при трех разных длинах волн. Кроме того, метод не дает точных значений, приходится делать много повторностей, что не всегда возможно, а результирующая смесь имеет нестабильную окраску (не более 1-2 минут).

Известен метод определения фитина с помощью железо-тиоцианатного комплекса (Демьянов Н.Я. Общие приемы анализа растительных веществ. М.: Государственное издательство, 1923. 252 с.), измерение проводят при длине волны 470 нм. Недостатком данного метода является крайняя нестабильность окраски (не более 1 минуты), а также значительный разброс данных, что связано с отсутствием применения оптимальной длины поглощения продукта реакции.

Известен способ количественного анализа фитина в растительных кормах, взятый за прототип, по АС 1432399 (опубл. 23.10.1988), включающий экстракцию фитина соляной кислотой, отделение экстракта от нерастворившегося осадка центрифугированием, пропускание экстракта через хроматографическую колонку с сильнокислотным катеонитом, содержащим 0,1-1 мг-экв железа в 1 г катионита, элюирование фитинового комплекса с железом из колонки 0,4-0,8 MHCl и определение фитина спектрофотометрически в УФ-спектре по светопоглощению фитинового комплекса с железом, при этом используется раствор сравнения, при экстрагировании используется 0,33-0,35 M HCl, а спектрофотомерию проводят при 240 нм. К недостаткам метода можно отнести сложность и большую затратность за счет использования оборудования ЖХ (ВЭЖХ). Кроме того метод дает избыточную точность для сравнительного анализа объектов исследования.

Заявленное изобретение решает задачу выделения из семян, очищенных от жиров и белков, соединений фитиновой кислоты (фитинатов), определения содержания фитина в семенах получением стойкой окраски при использовании железо-тиоцианатного комплекса, снижения погрешности измерения до ±10% абсолютной массы фитина в навеске, работать при комнатной температуре.

Технический результат заключается в повышении точности и упрощении измерения количественного содержания фитина за счет получения абсолютно прозрачных образцов, стабилизации окраски до 10 минут, а также в разработке способа, пригодного для определения фитина при низкой концентрации от 0,08 до 4 мг на 1 г сырья.

Технический результат достигается тем, что в способе определения солей фитиновой кислоты в семенах растений, включающем экстракцию фитина из сырья соляной кислотой, центрифугирование полученной смеси, колориметрирование при длине волны 337 нм, согласно изобретению, проводится дополнительная очистка солянокислой вытяжки добавлением к ней в соотношение объемов 4:1 смеси изоамилового спирта с хлороформом (1:24 об. долей) и перемешиванием, к полученной после центрифугирования надосадочной жидкости добавляют раствор 0.03% роданида аммония NH4SCN в 6% HCl и раствор 0.86% FeCl3 и 0.2% HCl в дистилированой воде в объемном соотношении 1:1,5:1, колориметрирование проводят, принимая в качестве контроля смесь этих же растворов в тех же пропорциях, заменяя объем надосадочной жидкости равным объемом воды, определение абсолютной массы f (мг) фитина в навеске пробы проводят по градировочному графику, а концентрацию F (%) определяют по формуле F=100f/Mn, где Mn - масса навески пробы (мг).

Авторами настоящего изобретения на Международной научной конференции по биологической химии «XII чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова» (Москва, ИБХ РАН, 18-22 сентября) был сделан доклад с примером осуществления заявляемого способа на плодах ореха (Измерение содержания фитина в плодах четырех видов ореха на основе модифицированного колориметрического метода. Ф, Р. Аль Хачами, О.А. Землянухина, В.Н. Епринцев, В.Н. Калаев, Н.Н. Черкасова, В.А. Славский

// под ред. В.Т. Иванова, А.Г. Габибова. - М.: Издательство «Перо», 2017. - с. 179).

В заявляемом изобретении использован метод очистки семян от содержания жиров и белков, применяемый обычно при выделении растительной ДНК.

Определение содержания фитина в полученной надосадочной жидкости проводят с использованием железо-тиоцианатного комплекса. На нанофотометре IMPLEN Р330 (Германия) был определен максимум поглощения тиоцианата. Он составляет 337 нм, что позволяет продлить стабильность окраски реакции до 10 мин и повысить точность измерения с использованием меньшего числа повторностей.

Метод основан на способности анионов солей фитиновой кислоты конкурировать с анионом роданида, дающим в растворе окрашенное труднорастворимое соединение с трехвалентным железом (тиоцианат). Таким образом, концентрация фитина обратно пропорциональна концентрации образованного тиоцианата железа (оптической плотности окрашенного раствора). Зная соотношение взаимодействующих компонентов реакции (4 Fe:l фитинат), можно определить концентрацию фитина по концентрации остаточного железа согласно стехиометрическому закону.

Пример осуществления способа.

Для очистки растительного материала (20-300 мг) к 2 мл гомогената, растертого для лучшего разрушения семян с битым стеклом в 0.5 М HCl (раствор №1), добавляется 0.5 мл раствора изоамилового спирта с хлороформом (1:24) (раствор №2). После чего смесь переносили в эппендорфы и энергично встряхивали в течение 1 мин, после чего центрифугировали в течение 3 мин при 20000 g на центрифуге СМ50 ELMI (Латвия). При этом получали абсолютно прозрачную, очищенную от примесей надосадочную жидкость, содержащую соли фитиновой кислоты.

Ход измерения.

К 1 мл надосадочной жидкости добавляют сначала 1.5 мл индикативного 0.03% кислого раствора роданида аммония NH4SCN в 6% HCl (раствор №3), затем прибавляли 50 мкл кислого конкурентного раствора хлорида железа(III) (раствор №4). Раствор хлорида железа готовят из соли FeCl3, высушенной в эксикаторе с концентрированной серной кислотой. Содержание раствора представляет собой 0.86% по FeCl3 в 0.2% по HCl. После добавления раствора №4 образцы колориметрируют в предварительно калиброваных кварцевых кюветах. Можно производить определение фитина в одной кювете для избегания разброса данных. В качестве контроля используют смесь растворов №3 и №4 в тех же пропорциях, что и для образцов, заменяя объем пробы равным объемом воды. Содержание фитина рассчитывают по заранее составленному градуировочному графику, используя в качестве стандарта водный раствор натриевой соли фитиновой кислоты (Sigma). По кривой зависимости величины оптической плотности при 337 нм от количества фитината натрия в образце видно, что линейная зависимость наблюдается при концентрации фитина 0.08-4 мг/г с.м. При больших концентрациях фитина необходимо производить разведение образцов, а при концентрациях меньше 0.08 мг/г с.м. результаты недостоверны. Снижение погрешности определения и сопоставимость данных нескольких определений достигается использованием свежих реактивов одной партии с чистотой не менее ЧДА.

Расчет абсолютной массы (мг) фитина в образце с учетом разбавления в ходе анализа проводили по формуле:

f=Cf*(Mn+2000)*1,275/Mn,

где f - содержание фитина в пробе (мг); Cf - измеренная концентрация фитината (мг/мл); Mn - масса навески пробы (мг).

Расчет концентрации (в % масс.) фитина в образце с учетом разбавления в ходе анализа проводят по следующей формуле:

F=100f/Mn,

где F - содержание фитина в образце (%).

Необходимым замечанием является то, что примеси двух- и трехвалентных катионов металлов могут вносить погрешность в точность определения в связи с большим их сродством к фитиновой кислоте, нежели у катиона железа(III). В связи с этим необходимо следить за чистотой используемых реактивов (ч.д.а.), посуды и воды (дистиллят или бидистиллят).

Способ определения солей фитиновой кислоты в семенах растений, включающий экстракцию фитина из сырья соляной кислотой, центрифугирование полученной смеси, колориметрирование при длине волны 337 нм, отличающийся тем, что проводится дополнительная очистка солянокислой вытяжки добавлением к ней смеси изоамилового спирта с хлороформом (1:24 об. долей) в соотношении объемов вытяжка : смесь 4:1, перемешивание перед центрифугированием, к полученной после центрифугирования при не менее 20000g надосадочной жидкости добавляют раствор 0.03% роданида аммония NH4SCN в 6% НСl и раствор 0.86% FeCl3 и 0.2% НСl в дистилированой воде в объемном соотношении 1:1,5:1, колориметрирование проводят, принимая в качестве контроля смесь этих же растворов в тех же пропорциях, заменяя объем надосадочной жидкости равным объемом воды, проводят определение абсолютной массы f (мг) фитина в навеске пробы по градуировочному графику, определяют концентрацию F (%) по формуле F=100f/Mn, где Мn - масса навески пробы надосадочной жидкости (мг).



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к способу оценки иммуногенности вакцины чумной живой с использованием антигенспецифических клеточных тестов in vitro и проточно-цитометрического анализа.

Изобретение относится к определениям и испытаниям, а именно к способу определения антиоксидантной активности пептидов животного происхождения. Способ количественного определения антиоксидантной активности пептидов животного происхождения включает спектрофотометрическое определение оптической плотности продукта реакции изучаемых пептидов с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (DPPH) в органическом растворителе, выбранном из группы, включающей метанол, этанол, изопропанол, ацетон и метилэтилкетон, определение оптической плотности продукта реакции референтного пептидного антиоксиданта природного происхождения L-глутатиона восстановленного (GSH) с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом и расчет антиоксидантной активности изучаемых пептидов как глутатионэквивалентной антиоксидантной активности GSHEAC (GSH equivalent antioxidant capacity), представляющей собой отношение концентрации L-глутатиона, при которой прореагировало 50% DPPH, к концентрации изучаемой субстанции, при которой прореагировало 50% DPPH.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полинуклеотидам, которые кодируют CDR3 в генах TCR-[альфа] и TCR-[бета] цепей CD4+ хелперных Т-клеток, которые специфичны к хелперному пептиду WT1322, и может быть использовано в медицине для индукции иммунного ответа против WT1322-экспрессирующей злокачественной опухоли.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к активации хелперных Т-клеток, которые специфичны к пептиду WT1, и может быть использовано в медицине для индукции иммунного ответа против WT1-экспрессирующей злокачественной опухоли.

Изобретение относится к фармацевтическому анализу, а именно к анализу материалов с помощью оптических средств, и может быть использовано для количественного определения производных бензимидазола (группы празолов) в субстанциях.

Изобретение относится к аналитической химии компонентов ионных форм неорганических веществ, определяемых в атмосферных осадках и поверхностных водах. Экстракционно-вольтамперометрический способ определения ионов цинка, кадмия, свинца и меди в поверхностных водах включает экстракцию ионных форм указанных металлов из фильтрата поверхностной воды с рН≤2 в органическую фазу расслаивающейся системы расплава салицилата тиопириния и воды.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для диагностики выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития ишемического инсульта. У индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, выделяют ДНК из венозной крови и проводят анализ полиморфизмов генов цитокинов rs1061624 TNFR2 и rs767455 TNFR1.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития гипертонической болезни. У индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, выделяют ДНК из периферической венозной крови и проводят анализ полиморфизмов генов цитокинов rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFА.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению конъюгатов люминесцентных наночастиц диоксида кремния с антителами, и может быть использовано в диагностике для выявления гиперэкспрессирующегося на поверхности опухолевых клеток рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2/neu).

Изобретение относится к исследованию дисперсных характеристик аэрозолей различной природы и может быть использовано в метеорологии, в нанопроизводстве, для контроля нанобезопасности на рабочих местах, для определения ингаляционной дозы при применении аэрозольных форм доставки лекарственных средств.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полинуклеотидам, которые кодируют CDR3 в генах TCR-[альфа] и TCR-[бета] цепей CD4+ хелперных Т-клеток, которые специфичны к хелперному пептиду WT1322, и может быть использовано в медицине для индукции иммунного ответа против WT1322-экспрессирующей злокачественной опухоли.

Изобретение относится к контейнеру устройства, предназначенного для формирования образцов из тампонажных растворов, применяемых при цементировании нефтяных и газовых скважин, полученных в условиях, имитирующих скважинные по температуре и давлению, для последующих прочностных испытаний образцов на изгиб и на сжатие.

Изобретение относится к быстро охлаждаемому пробоотборнику, который заполняется расплавленным металлом в направлении погружения, параллельном продольной оси. Пробоотборник для отбора проб из ванны расплавленного металла включает в себя узел пробоотборной камеры, имеющий закрывающую пластину и корпус.

Изобретение относится к биотехнологии. Заявлен способ определения вероятности того, что пациент имеет волчанку в доклинической стадии.

Изобретение относится к солям соединения формулы I с щелочными металлами, замещающими атомы водорода в обеих сульфогруппах , где R означает N-оксисукцинимидильную группу Также предложены способ получения солей и их применение.

Изобретение относится к аналитической химии компонентов ионных форм неорганических веществ, определяемых в атмосферных осадках и поверхностных водах. Экстракционно-вольтамперометрический способ определения ионов цинка, кадмия, свинца и меди в поверхностных водах включает экстракцию ионных форм указанных металлов из фильтрата поверхностной воды с рН≤2 в органическую фазу расслаивающейся системы расплава салицилата тиопириния и воды.

Изобретение относится к области гидроакустики, конкретно к векторно-скалярным приемникам, и может быть использовано в составе антенной системы, размещаемой на носителе (безэкипажный катер, необитаемые подводные аппараты различных типов, глайдеры и т.п.), при проведении гидроакустических исследований, в частности для обнаружения источников подводных шумов в морях и океанах.

Изобретение относится к системе отбора проб многофазной текучей среды, такой как продукты компонентов газоконденсатной жидкости (NGL) из трубопровода, и способу максимизации однофазного состояния жидкой пробы газоконденсатной жидкости.

Изобретение относится к способу измерения загрязняющих веществ, содержащихся в выхлопном потоке на выходе двигателя, содержащему следующие этапы, на которых располагают зонд так, чтобы отверстие отбора проб указанного зонда находилось на поверхности отбора проб, расположенной на выходе двигателя в выхлопном потоке.
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике и фтизиатрии, касается способа диагностики туберкулезной инфекции у взрослых людей. Изобретение представляет собой способ диагностики туберкулеза легких путем цитофлюориметрического исследования крови, после которого определяют количество CD3+CD4+CD127-CD25+-клеток крови и при их значении, равном или большем 0,12*109/литр, диагностируют туберкулез легких, а при величине меньше 0,12*109/литр диагностируют отсутствие туберкулеза легких. Способ позволяет упростить диагностику туберкулеза легких, снизить трудоемкость, повысить скорость исследования. 5 пр.

Изобретение относится к аналитической химии, предназначено для определения органического соединения фитина в семенах растений. Способ определения солей фитиновой кислоты в семенах растений включает экстракцию фитина из сырья соляной кислотой, проведение дополнительной очистки солянокислой вытяжки добавлением к ней смеси изоамилового спирта с хлороформом в соотношении объемов вытяжка : смесь 4:1, перемешивание, центрифугирование полученной смеси при не менее 20000g, добавление к полученной надосадочной жидкости раствора 0.03 роданида аммония NH4SCN в 6 HCl и раствора 0.86 FeCl3 и 0.2 HCl в дистилированой воде в объемном соотношении 1:1,5:1, колориметрирование при длине волны 337 нм, в качестве контроля принимается смесь растворов 0.03 роданида аммония NH4SCN в 6 HCl и раствор 0.86 FeCl3 и 0.2 HCl в дистилированой воде в тех же пропорциях, но объем надосадочной жидкости заменяется равным объемом воды, определение абсолютной массы f фитина в навеске пробы по градуировочному графику и концентрации F по формуле F100fMn, где Mn - масса навески пробы надосадочной жидкости. 1 пр.

Наверх