Способ диагностики туберкулеза легких

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике и фтизиатрии, касается способа диагностики туберкулезной инфекции у взрослых людей. Изобретение представляет собой способ диагностики туберкулеза легких путем цитофлюориметрического исследования крови, после которого определяют количество CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺-клеток крови и при их значении, равном или большем 0,12*10⁹/литр, диагностируют туберкулез легких, а при величине меньше 0,12*10⁹/литр диагностируют отсутствие туберкулеза легких. Способ позволяет упростить диагностику туберкулеза легких, снизить трудоемкость, повысить скорость исследования. 5 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно клинической лабораторной диагностике и фтизиатрии, касается способа диагностики туберкулезной инфекции у взрослых людей.

Несмотря на совершенствование диагностических технологий, трудности верификации диагноза «туберкулез» сохраняются, в связи с тем, что не всегда удается его подтвердить морфологически или микробиологически [1]. В связи с расширением базы знаний о других заболеваниях легких, появились сложности в дифференциальной диагностике туберкулеза от воспалительных заболеваний, новообразований. Высок процент поздней диагностики туберкулеза легких в лечебных учреждениях общей лечебной сети: только у около 20% больных туберкулезом легких заболевание диагностируют в первые 2-3 недели заболевания, у остальных 80% - в сроки от 1 до 3 месяцев [2]. Расхождение диагнозов по туберкулезу у умерших в нетуберкулезных больницах достигает 80% и более. По данным ряда исследований ошибочная диагностика туберкулеза при обращении пациентов в лечебные учреждения составляет 14-25% как в сторону гипо-, так и гипердиагностики [3]. По другим данным процент ошибок составляет 34-40% [4].

В настоящее время согласно Федеральным клиническим рекомендации по диагностике и лечению туберкулеза органов дыхания [5] диагностика туберкулеза основывается на данных клинической картины заболевания, рентгенологических исследований (флюорография, рентгенография, томография), результатах специфических иммунологических (кожных) тестов (диаскинтест, проба Манту), пробирочных исследований (полимеразная цепная реакция - ПЦР, квантифероновый тест и другие), данных микробиологических анализов (микроскопия, посев на плотные/жидкие среды), результатов патоморфологических (гистологических) исследований. В случае отсутствия точного диагноза дополнительно назначаются повторные лучевые исследования (спиральная томография), микробиологические исследования, фибробронхоскопия, медианоскопия, трансторакальные и открытые виды биопсии. Недостатками вышеперечисленных методов являются:

клиническое исследование - низкая информативность, сложности в дифференциальной диагностике с другими заболеваниями;

рентгенологические исследования - высокая стоимость (томография), сложности в дифференциальной диагностике с воспалительными процессами иной этиологии (например, пневмоцистная пневмония), новообразованиями, лучевая нагрузка;

специфические иммунологические (кожные) тесты - не информативны пациентов с отягощенным аллергоанамнезом, могут иметь побочное действие в виде повышенной температуры тела, головной боли и легкого недомогания, инвазивный метод;

пробирочные методы - результат определяется высокой квалификацией выполняющего исследование специалиста, наличием специальных помещений, оборудования и материалов для проведения исследований (сложности в культивировании клеток, ограничения, обусловленные риском контаминации при ПЦР-исследовании);

микробиологические исследования (микроскопия, посев на плотные/жидкие среды) - результат зависит от качества взятия материала на исследования (часто требуется неоднократное исследование) и активности бактериовыделения (встречается туберкулез без бактериовыделения); посев - осложняется высоким риском заражения, длительностью процедуры анализа, необходимостью использования специального комплекса помещений для проведения исследования;

патоморфологические (гистологические) - определяют необходимость проведения сложного инвазивного вмешательства (бронхоскопия, игловая биопсия), высокой квалификации специалиста, длительность исследования.

фибробронхоскопия, медианоскопия - требуют высокой квалификации проводящего исследование специалиста, эмоционально неприятная процедура для пациента;

биопсии - инвазивный метод, сопряженный с болевыми ощущениями, сложности в получении материала, содержащего возбудителя (необходимо попасть в очаг инфекции), риском развития осложнений (пневмоторакс, нагноение послеоперационной раны, аритмия, ослабленная реакция возвратного нерва, кровотечение, повреждение трахеи, повреждение пищевода, воспаление средостения (медиастинит).

Существуют методы усовершенствованной люминесцентной микроскопии, иммуноферментного анализа и экспресс-диагностики туберкулеза "MycoDotT" [6]. Ограничениями их использования являются необходимость применения уникальных материалов (сверхтонкое железо, дополнительно обработанное на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-А), предварительной концентрации возбудителя туберкулеза (трудоемкость и риск заражения оператора). Кроме того, при определении антител против липоарабиноманнана (MycoDotT) и использовании иммуноферментной диагностики получены отрицательные результаты в подтвержденных случаях туберкулеза [7].

Обнаружение туберкулостеариновой кислоты (TBSA) - одного из маркеров туберкулеза, также имеет ограничения, в связи с тем, что эта кислота может выявляться и при заражении другими патогенами [8].

В последнее время получили распространение пробирочные тесты, основанные на определении уровня стимулированного гамма-интерферона (IFN-γ) - QFT-G - QuantiFERON-TB Goldtest, квантифероновый тест голд, QFT-IT - Quantiferon-in-tube, квантифероновый тест в пробирке, ELISPOT - enzyme-linked immunosorbent spot assay, тест система для иммуноферментного анализа, T-SPOT ТВ - T-cells-spot-tuberculosis, тест определения количества Т-лимфоцитов, продуцирующих интерферон-гамма при туберкулезе. Они имеют удовлетворительную чувствительность и специфичность, однако требуют хорошего оснащения лаборатории, умения культивировать клетки [9], а также имеют значительную стоимость исследования.

Известен способ диагностики туберкулеза (RU 2525428, 3.07.11.2012, оп. 20.05.2014) и его модификация (RU 2012147415, 3.07.11.2012, оп. 20.05.2014) путем проведения иммуноцитогистохимического исследования и выявления экспрессии антигена M.tuberculosis. Недостатком данного метода является трудоемкость (несколько видов окрашивания, промывание), работа с материалом, инфицированным M.tuberculosis и токсическими веществами.

Известен способ ранней диагностики туберкулеза при ВИЧ-инфекции (RU 2416801, 3.12.10.2009, оп. 20.04.2011), включающий мониторинг иммунологических маркеров, заключающийся в определении комплекса сывороточных цитокинов: фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), интерлейкина-10 (IL-10) и растворимого рецептора интерлейкина-6 (rrIL-6) и при TNF-α от 19,72 до 23,87 пг/мл, IL-10 от 15,48 до 21,86 пг/мл и rrIL-6 от 770,76 до 1800,31 пг/мл при вирусной нагрузке более 10000 коп/мл и СД4+ менее 500 диагностируют туберкулез у ВИЧ-инфицированных больных. Недостатком метода является необходимость использования разных методов определения показателей (иммуноферментного, цитофлюориметрического и ПЦР исследования). Способ предложен для диагностики туберкулеза при одновременной ВИЧ-инфекции.

Известен способ диагностики туберкулеза (RU 2005108993, 3.30.03.2005, оп. 10.09.2006), основанный на анализе слюны, консервируемой азидом натрия для проведения иммуноферментного исследования с участием микобактериального антигена. Концентрацию специфических противотуберкулезных антител определяют спектрофотометически в единицах оптической плотности. Недостатком данного метода является его вариабельность в зависимости от качества исследуемого материала (не всегда инфекционный материал может попасть в исследование), работа с материалом, инфицированным M.tuberculosis, отсутствие сертифицированных тест-систем, рекомендованных к применению в медицинских учреждений любого уровня, нестандартизированные единицы измерения.

Известен способ диагностики туберкулеза (RU 2003130802, 3.20.10.2003, оп. 27.03.2005), основанный на заражении лабораторных животных с последующим (через 30-35 дней) внутрибрюшинным введением туберкулина. Гибель животного свидетельствует о наличии туберкулеза. Недостатком способа является его длительность, необходимость содержания лабораторных животных, этические ограничения.

Существует способ определения антител к возбудителю туберкулеза (RU 2395092, з.17.09.2008, оп. 20.07.2010), основанный на проведении иммунохроматографического анализа, при котором на мембранной тест-полоске формируются комплексы, в состав которых входят молекулы антигена или антигенов Mycobacterium tuberculosis, специфичные к ним антитела, содержащиеся в тестируемой жидкой пробе, и частицы коллоидного золота, связывание которых в аналитической зоне тест-полоски регистрируется визуально или с помощью оптического детектора, отличающийся тем, что для достижения более интенсивного окрашивания аналитической зоны тест-полоски и достоверной регистрации результатов анализа молекулы антигена или антигенов Mycobacterium tuberculosis иммобилизуются как в аналитической зоне тест-полоски, так и на поверхности коллоидной частицы, вследствие чего при контакте тест-полоски с жидкой пробой и последующем движении реагентов по мембранам тест-полоски в аналитической зоне происходит формирование регистрируемых комплексов, состоящих из иммобилизованных на мембране молекул антигена или антигенов, содержащихся в пробе антител, к антигену или антигенам Mycobacterium tuberculosis и конъюгата антигена или антигенов Mycobacterium tuberculosis с частицами коллоидного золота. Недостатками данного способа являются сложности в обеспечении надежности получаемых результатов, чувствительности, экономичности теста, необходимость использования дополнительного программного обеспечения для оценки полученных результатов (http://www.km.ru/referats/39229974AAF4421EBDBC203E1FF92634).

Наиболее близким анализом, принятым за прототип, является способ диагностики туберкулезной инфекции (RU 2560679, 3.14.10.2014, оп. 20.08.2015) у пациентов с отрицательными кожными пробами на препарат Диаскинтест. Для стимуляции клеток гепаринизированной цельной крови применяют препарат Диаскинтест, использующийся для постановки кожных проб; дополнительно в гепаринизированной цельной крови определяют уровень CD4+CD27- - лимфоцитов методом лазерной проточной цитофлюориметрии и при совокупном повышении уровня стимулированного ИФН-у более 18,0 пг/мл и CD4+CD27- - лимфоцитов более 15,0% подтверждают наличие туберкулезной инфекции. Недостатками метода являются необходимость совокупного проведения иммуноферментного анализа, использования препарата Диаскинтест, использование способа только в случаях отрицательного результата кожного теста (Диаскинтест), применение метода только в детской популяции.

Задачей и техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение способа диагностики туберкулеза легких, снижение трудоемкости, повышение скорости исследования.

Для решения поставленной задачи в способе диагностики туберкулеза легких путем цитофлюориметрического исследования крови, согласно изобретению определяют количество CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺ - клеток крови и при их значении, равном или большем 0,12*10⁹/литр ,диагностируют туберкулез легких, а при величине меньше 0,12*10⁹/литр диагностируют отсутствие туберкулеза легких.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. У пациента с предполагаемым диагнозом «туберкулез» до лечения и проведения физиотерапевтических процедур производят забор венозной крови из периферической вены с соблюдением правил асептики и антисептики в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА. Объем, достаточный для исследования, составляет 0,5-1,0 мл. Определение содержания CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺ - клеток крови проводят методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител любого производителя, например Beckman Coulter (USA). Полученное значение, равное или больше 0,12*10⁹/л, свидетельствует о наличии туберкулеза легких, величина менее 0,12*10⁹/л позволяет считать, что туберкулеза нет.

В ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» Минздрава России проводилось исследование количества СВ3⁺СВ⁴⁺СБ127^-СВ25⁺ - лимфоцитов крови у 124 человек, из которых у 99 был туберкулез легких, 25 обследованных были практически здоровыми людьми. Среди больных был 31 пациент с туберулемами (средний возраст обследованных составил 32,4±1,6 года; 18 мужчин (58%) и 13 (42%) женщин; сопутствующая патология встречалась у 18 больных (58%)), 44 человека с инфильтративным туберкулезом легких (средний возраст - 35,4±4,6 года, 26 (59,1%) пациентов были мужчины, 18 (40,9%) - женщины, сопутствующая патология встречалась у 35 больных (79,5%)), 24 больных фиброзно-кавернозным туберкулезом легких (средний возраст - 33,6±2,0 года; было 17 мужчин (70,8%) и 7 (29,2%) женщин; сопутствующая патология встречалась у 13 больных (54,0%)). Контрольная группа здоровых людей имела средний возраст 36,0 лет, 60% в ней были мужчины, 40% - женщины. Было установлено, что абсолютное количество регуляторных Т-клеток (CD3⁺CD4+CD127-CD25+) было достоверно повышено в сравнении с контролем во всех трех группах больных в 1,5 раза. Таким образом, увеличение количества CD3⁺CD⁴⁺CD127^-CD25⁺ - клеток крови до величины равной и более 0,12*10⁹/л свидетельствует о туберкулезе легких, при значении меньше 0,12*10⁹/л о том, что туберкулеза нет. Для оценки возможности использования данного теста в клинической практике нами были рассчитаны стандартные статистические показатели по общепринятым формулам (http://pubhealth.spb.ru/EBM/Epid/EpidRusG04.htm). Диагностическая чувствительность теста составила 80,5%, диагностическая специфичность - 97,6%.

Дополнительно для проверки выявленной закономерности в ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» Минздрава России была набрана тестовая выборка - 36 человек. Распределение клинических вариантов течения туберкулеза и отсутствия поражения туберкулезом было сопоставимо с основными группами исследования (средний возраст - 34,3±2,8 года, 19 (52,8%) мужчин и 17 (47,2%) женщин, сопутствующая патология отмечена у 22 (61,1%)). Прогноз был подтвержден в 94,5% случаев.

В изученной литературе авторами не обнаружено сведений об известности диагностики туберкулеза легких по количеству CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺ - клеток крови. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».

Исследованиями авторов впервые было доказано, что количество CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺ - клеток крови позволяют достоверно оценить наличие туберкулеза легких. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемое изобретение позволяет упростить способ диагностики туберкулеза легких, снизить трудоемкость, повысить скорость исследования.

Использование изобретения позволяет с высокой точностью оценить поражение легочной ткани.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1.

Пациентка Б., 34 года. Социальный статус: житель города, не работает. Взята кровь на исследование 09.09.2013, установлено количество CD3⁺CD4+CD127-CD25+ - клеток 0,21*10⁹/л, что свидетельствует о наличии туберкулеза. На основании клинико-рентгенологических исследований установлен диагноз туберкулез, туберкулема, подтвержден гистологически. Заключение гистолога: небольшая активная гомогенная туберкулема с нейтрофильным краевым распадом в казеозных массах и крупный умеренный активный фиброзно-казеозный очаг в S2, эпителиоидно-клеточные гранулемы без некрозов. Лечение: операция 11.09.2013 - резекция С 1-2 справа, режим химиотерапии 2Б, установлена лекарственная устойчивость M.tuberculosis. Длительность лечения в стационаре составила 37 суток.

Пример 2.

Пациент Ж., 25 лет. Социальный статус: житель города, инвалид 2 группы, не работает, образование неполное среднее, был в местах лишения свободы, курит. Обследован 19.02.2013, количество CD3⁺CD4+CD127-CD25+ - клеток - 0,32*10⁹/л, что свидетельствует о наличии туберкулеза. На основании клинико-рентгенологических исследований установлен диагноз «фиброзно-кавернозный туберкулез легких 5 сегментов слева с двусторонним обсеменением». Диагноз подтвержден ростом культуры M.tuberculosis, установлена множественная лекарственная устойчивость к изониазиду, рифамицину, стрептомицину, этамбутолу. Сопутствующая патология: хронический правосторонний мезотимпанит. Терапия: таваник, пиразинамид, резонизат, протионамид, ПАСК, режим химиотерапии - индивидуальный; выполнен пневмоперитонеум, интенсивная пластическая деформация. M.tuberculosis обнаружены методом люминисцентной микроскопии и методом посева на плотные/жидкие среды. Длительность лечения в стационаре составила 165 суток.

Пример 3.

Пациентка Б., 24 года, Социальный статус: житель города, проживает в благоустроенной квартире, профессия - медсестра, инвалид 2 группы, не работает, замужем, есть ребенок, не курит, туберкулезный контакт не установлен. Обследована 04.04.2013, количество CD3⁺CD4+CD127-CD25+ - клеток 0,23*10⁹/л, что свидетельствовало о наличии туберкулеза. Ds: инфильтративный туберкулез легких, С 6 правого легкого, фаза рубцевания полости и уплотнения. Сопутствующая патология: бронхоэктатическая болезнь. Клинические проявления: кашель с мокротой, одышка при нагрузке M.tuberculosis - множественная лекарственная устойчивость: стрептомицин, изониазид, рифампицин, канамицин, капреомицин. Лечение: клапанная бронхоблокация нижнедолевого бронха справа, пневмоперитонеум, режим химиотерапии – индивидуальный. Терапия: пиразинамид, этамбутол, левофлоксацин, ПАСК, циклосерин. Длительность лечения в стационаре - 108 суток. Исход заболевания - улучшение.

Пример 4.

Обследованный Ш., 24 года. Социальный статус: житель города, женат, ребенок. 12.12.2013 проведено определение количества CD3⁺CD4⁺CD127^-СБ25⁺-клеток. Полученный результат 0,06*10⁹/л, свидетельствует об отсутствии туберкулеза. Клинико-рентгенологическое и многократное микробиологическое исследование подтвердили отсутствие инфицирования M.tuberculosis.

Пример 5.

Обследованная Б., 40 лет. Социальный статус: житель города, работает в медицинском учреждении, замужем, есть ребенок, не курит. Исследование крови для определения количества CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺-клеток проведено 06.11.2013. Величина CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺-клеток 0,09*10⁹/л свидетельствовала об отсутствии туберкулеза легких. Клинико-рентгенологическое, многократное микробиологическое исследование и диагностические кожные тесты подтвердили отсутствие инфицирования M.tuberculosis.

Предлагаемый способ может быть воспроизведен в условиях лечебного учреждения. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».

Заявляемый способ позволяет упростить диагностику туберкулеза легких, снизить трудоемкость, повысить скорость исследования.

Литература

1. Красноборова С.Ю. Трудности и причины ошибок в диагностике туберкулеза легких зональной (долевой) протяженности: Автореф. дис....канд. мед. наук / Урал. НИИ фтизиопульмонологии. - М., 2004. - 28 с.

2. Цветкова О.А., Абдуллаева Г.Б., Колосова К.Ю. Трудности диагностики туберкулеза легких в клинике внутренних болезней // РМЖ. - 2005. - №27. - 908. - http://www.rmj.ru/articles_4040.htm

3. Морозова Т.И. Клинико-лабораторные параллели при туберкулезе и пневмониях // III съезд научно-медицинской ассоциации фтизиатров: Сб. резюме. - Екатеринбург, 1997. - С. 52.

4. Салина Т.Ю. Иммунологические методы в диагностике и оценке течения туберкулезной инфекции: Автореф. дис.…докт. мед. наук / ГОУВПО "Московская медицинская академия". - М., 2007. - 30 с.

5. Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению туберкулеза органов дыхания. - М., Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2014. - 56 с.

6. Сравнительное изучение эффективности разных методов диагностики туберкулеза [Текст] / Т.Ю. Салина, Т.И. Морозова, Э.А. Федотов // Проблемы туберкулеза. – М., 2000. - №2. - С. 43-44.

7. Shamsuzzaman А.К., Siddique A., Akhter S., Shamsuzzaman S.M. Comparison between ELISA and ICT-MycoDot in childhood tuberculosis // Mymensingh Med J. 2005 Jul; 14 (2): 175-81. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16056206.

8. Fend R. Development of medical point-of-care applications for renal medicine and tuberculosis based on electronic nose technology. - 2004. - P. 69.

9. Fend R. Development of medical point-of-care applications for renal medicine and tuberculosis based on electronic nose technology. - 2004. - P. 70-71.

Способ диагностики туберкулеза легких путем цитофлюориметрического исследования крови, отличающийся тем, что определяют количество CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺-клеток крови и при их значении, равном или большем 0,12*10⁹/литр, диагностируют туберкулез легких, а при величине меньше 0,12*10⁹/литр диагностируют отсутствие туберкулеза легких.