Способ оценки характера аутоиммунной реакции организма человека на множественно модифицированные липопротеины низкой плотности в литическом тесте

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для оценки литической активности множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности. Способ включает приготовление преципитата из сыворотки крови человека путем инкубации супернатанта, полученного после предварительного осаждения множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП) буфером, содержащим 20% поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000), в течение 30 мин при 4°С. Затем образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов, содержащих ммЛНП (ИК-ммЛНП) осаждают центрифугированием при 4°С в течение 10 мин при 31000 g, декантируют, полученный преципитат растворяют в буфере без ПВП-35000 и пределяют содержание холестерина в иммунных комплексах. К пробам ммЛНП и ИК-ммЛНП добавляют стандартизованные эритроциты барана, инкубируют в течение 24 ч при 37°С, рассчитывают коэффициент удельной литической активности (К_УЛА) ммЛНП и ИК-ммЛНП как отношение степени лизиса к холестерину в этих комплексах, сопоставляют величину К_УЛА ммЛНП и ИК-ммЛНП у обследуемого человека. В случае снижения данного коэффициента ИК-ммЛНП по сравнению с К_УЛА ммЛНП оценивается как нейтрализация литической активности. При противоположном эффекте, при тенденции к увеличению данного коэффициента ИК-ммЛНП, оценивается как возрастание литической активности. Равные величины К_УЛА (ммЛНП) и К_УЛА (ИК-ммЛНП) свидетельствуют о том, что аутоантитела, связываясь с ммЛНП в иммунных комплексах, не влияют на литическую активность. Использование данного изобретения позволяет оценить характер аутоиммунной реакции организма на ммЛНП для раннего прогноза течения и контроля эффективности патогенетической терапии атеросклероза.1 пр., 7 табл., 1 ил.

 

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для оценки литической активности иммунных комплексов, содержащих множественно-модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛНП), для прогноза течения заболеваний, связанных с повышенным уровнем ммЛНП (атеросклероз, гестоз, сахарный диабет, и.т.д.), так и для разработки препаратов, уменьшающих патогенность ммЛНП и иммунных комплексов, содержащих ммЛНП.

Атеросклероз является сложным, периодически обостряющимся хроническим воспалительным процессом повреждения сосудов, развивающимся на фоне нарушений холестеринового обмена, который приводит к структурной модификации сосудистого эндотелия и разрастанию соединительной ткани, обуславливая формирование атеросклеротической бляшки. Атеросклероз и его осложнения - ишемическая болезнь сердца, инсульт, поражение сосудов нижних конечностей продолжают оставаться наиболее частой причиной инвалидизации и смертности населения в экономически развитых странах Европы, США и особенно России [European Guidelines on Cardiovascular Disease // Eur. Heart J. - 2003. - V. 24 №17. - P. 1601-1610; NCEP. Adult Treatment Panel III Guidelines // Circulation. - 2004. - V. 110. - P. 227-239; ВНОК Российские рекомендации. Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. М. - 2004. - 36 с.].

Заболевание начинается с накопления липопротеинов, в первую очередь, липопротеинов низкой плотности (ЛНП), во внеклеточном матриксе сосудов. Данные частицы ЛНП агрегируют и подвергаются модификации в результате окисления. Модифицированные окислением ЛНП (моЛНП) являются токсичными и повреждают сосуды, вызывая воспаление и фиброз [Steinberg D. The LDL modification hypothesis of atherogenesis: an update // J. Lipid Res. - 2009. - V. 50. - P. S376-S381]. Параллельно с окислением ЛНП обретают иммуногенные свойства и в организме синтезируются аутоантитела к моЛНП и образуются иммунные комплексы, содержащие моЛНП. Аутоантитела, образующиеся против неоэпитопов моЛНП, определяются в крови и титр этих антител коррелирует с тяжестью атеросклероза, и рассматривается в качестве маркера заболевания [Itabe Н., Mori М., Higashi Y., and Takano Т. Minimally modified LDL is an oxidized LDL enriched with oxidized phosphatidylcholines //J Biochem. - 2003. - V. 134. - P. 459-465; Tsimikas S. Oxidative biomarkers in the diagnosis and prognosis of cardiovascular disease //Am J Cardiol. - 2006. - V. 98. - P. 9Р-17Р].

В качестве прототипа использован способ определения литической активности множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП) [Патент РФ №2577719 от 20.03.2016 г. ]. Суть способа заключается в том, что предварительно из сыворотки крови человека выделяют ммЛНП путем обработки раствором 20% поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000), инкубируют, образовавшиеся агрегаты ммЛНП осаждают центрифугированием, декантируют, осадок ммЛНП растворяют в буфере без ПВП-35000, добавляют отмытые стандартизованные эритроциты барана, инкубируют в течение 48 часов при комнатной температуре, измеряют фотометрически оптическую плотность проб при длине волны 620 нм, по калибровочному графику определяют степень лизиса и при лизисе более 10% констатируют повышенную литическую активность ммЛНП.

Техническим результатом предлагаемого способа является расширение арсенала лабораторных тестов для оценки литической активности ИК-ммЛНП путем сравнения величин коэффициентов удельной литической активности ммЛНП и иммунных комплексов, содержащих ммЛНП (ИК-ммЛНП) для раннего прогноза течения и контроля эффективности патогенетической терапии атеросклероза в условиях клинико-диагностических лабораторий.

Этот результат достигается тем, что специфическую преципитацию ИК-ммЛНП, из сыворотки крови человека проводят путем инкубации супернатанта, полученного после предварительного осаждения множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП) буфером, содержащим 20% поливинилпирролидона (ПВП) с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000), в течение 30 минут при 4°С, затем образовавшиеся агрегаты (ИК-ммЛНП) осаждают центрифугированием при 4°С в течение 10 мин при 3100g, тщательно декантируют, полученный преципитат растворяют в буфере без ПВП-35000 и определяют содержание холестерина, с использованием коммерческих ферментативных наборов. К пробам ммЛНП и ИК-ммЛНП добавляют стандартизованные эритроциты барана, инкубируют в течение 24 часов при 37°С, рассчитывают коэффициент удельной литической активности (К_УЛА) ммЛНП и ИК-ммЛНП как отношение степени лизиса к холестерину в этих комплексах, сопоставляют величину К_УЛА ммЛНП и ИК-ммЛНП у обследуемого человека, в случае снижения данного коэффициента ИК-ммЛНП по сравнению с К_УЛА ммЛНП - оценивается как нейтрализация литической активности, при противоположном эффекте, при тенденции к увеличению данного коэффициента ИК-ммЛНП - оценивается как возрастание литической активности, равные величины К_УЛА (ммЛНП) и К_УЛА (ИК-ммЛНП) свидетельствуют о том, что аутоантитела, связываясь с ммЛНП в иммунных комплексах не влияют на литическую активность.

Способ осуществляют следующим образом: проводят забор крови натощак из локтевой вены человека, готовят сыворотку крови. Приготовление ммЛНП и ИК-ммЛНП, описано в работе [Патент №2632118 от 02.10.2017 г]. Кратко: к 100 мкл сыворотки крови добавляют 84 мкл буфера, содержащего 20% ПВП-35000 (конечная концентрация ПВП-35000 в пробе составляет 9,1%), тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Агрегированные ммЛНП осаждают центрифугированием, тщательно отбирают супернатант и инкубируют его в течение 30 мин при 4°С. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов, содержащих ИК-ммЛНП, осаждают центрифугированием при 4°С при 3100g в течение 10 мин, тщательно декантируют и преципитат растворяют в буфере без ПВП-35000. К 10 мкл препаратов ммЛНП и ИК-ммЛНП, приготовленных из сыворотки крови индивидуумов, добавляют 50 мкл стандартизованные эритроциты барана (1,5×10⁸ кл/мл), общий объем доводят до 100 мкл буфером VBS²⁺, инкубируют в течение 24 часов при 37°С, измеряют оптическую плотность на фотометре при длине волны 620 нм и по калибровочному графику определяют степень лизиса. Рассчитывают коэффициент удельной литической активности (К_УЛА) ммЛНП и ИК-ммЛНП как отношение степени лизиса к холестерину в этих комплексах, сопоставляют величину К_УЛА ммЛНП и ИК-ммЛНП у обследуемого человека, в случае снижения данного коэффициента ИК-ммЛНП по сравнению с К_УЛА ммЛНП - оценивается как нейтрализация литической активности, при противоположном эффекте, при тенденции к увеличению данного коэффициента ИК-ммЛНП - оценивается как возрастание литической активности, равные величины К_УЛА (ммЛНП) и К_УЛА (ИК-ммЛНП) свидетельствуют о том, что аутоантитела, связываясь с ммЛНП в иммунных комплексах не влияют на литическую активность.

Для выделения иммунных комплексов, содержащих ммЛНП используют:

- Буфер-1 для преципитации множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности, который содержит 20% ПВП-35000 в 0,01 М трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl;

- Буфер-2 для растворения преципитата иммунных комплексов, который представляет собой 0,01М Трис-HCl-буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 M NaCl.

Изобретение поясняется фигурой 1 на которой представлен калибровочный график для определения степени лизиса эритроцитов барана по оптической плотности при длине волны 620 нм.

Определение оптимальной концентрации эритроцитов барана для теста определения литической активности ИК-ммЛНП. Эритроциты барана (Е) 3 раза отмывают в вероналовом солевом буфере (VBS²⁺) центрифугированием в течение 10 мин при 2500 об/мин. Строят график зависимости оптической плотности суспензии эритроцитов (при длине волны 620 нм) от концентрации эритроцитов. Для этого 1% суспензию эритроцитов прогрессивно разводят в плоскодонной 96-ти луночной иммунологической планшете в объеме 100 мкл 0,15М NaCl. Тщательно перемешивают и измеряют на фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 620 нм. Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, наблюдается линейная зависимость оптической плотности суспензии эритроцитов от концентрации в растворе до А₆₂₀ равной 0,56 ЕД. Свыше 0,56 ЕД при А₆₂₀ данная зависимость - нелинейная. Поэтому для теста определения литической активности ИК-ммЛНП нами выбрана концентрация суспензии Е, которая в объеме 100 мкл в лунке 96-луночного планшета дает оптическую плотность, равную 0,40-0,56 ЕД (1,5×10⁸ кл/мл). Для определения степени лизиса эритроцитов нами предложен калибровочный график, в котором степень лизиса эритроцитов оценивают по снижению оптической плотности при длине волны 620 нм. За 0% лизиса принимают оптическую плотность контроля эритроцитов на спонтанный лизис (50 мкл Е + 50 мкл VBS²⁺), соответственно за 100% лизис принимают оптическую плотность контроля на полный лизис (50 мкл Е + 50 мкл H₂O). Степень лизиса эритроцитов оценивают после 24-ти часовой инкубации при 37°С по калибровочному графику, представленному на фиг. 1.

Как видно из фиг. 1, калибровочный график позволяет определять степень лизиса эритроцитов в процентах по оптической плотности пробы без стадии центрифугирования и измерения гемоглобина в супернатанте и последующего расчета степени лизиса эритроцитов, что существенно упрощает регистрацию результатов анализа литической активности ИК-ммЛНП в рутинных исследованиях.

Выделение иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеинов низкой плотности. ИК-ммЛНП выделяли, как описано в работе [Патент №2632118 от 02.10.2017 г, бюлл. №28]. На первом этапе из индивидуальных сывороток крови выделяют ммЛНП путем добавления к 100 мкл сыворотки 84 мкл буфера, содержащего 20% ПВП (конечная концентрация ПВП-35000 составляет 9,1%), и инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре. Агрегированные в этих условиях ммЛНП осаждают центрифугированием при 3100g в течение 10 мин при 23°С, тщательно отбирают супернатант, преципитат ммЛНП растворяют в 100 мкл Буфера-2. Далее супернатант, приготовленный как описано выше, инкубируют при 4°С в течение 30 минут. Агрегированные иммунные комплексы осаждают путем центрифугирования при 3100g в течение 10 мин при 4°С. реципитат ИК-ммЛНП тщательно декантируют и полученный осадок ресуспендируют в исходном объеме, в 100 мкл буфера-2. После растворения осадков в полученных фракциях ммЛНП и ИК-ммЛНП определяют содержание холестерина с использованием коммерческих ферментных наборов. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, содержание холестерина в ммЛНП в среднем составил 53,4 мг/дл (колебания от 13,5 мг/дл до 116,4 мг/дл). Содержание холестерина в ИК-ммЛНП в среднем составил 22,6 мг/дл (колебания от 1,8 мг/дл до 68,8 мг/дл). Причем в 15 пробах ИК-ммЛНП уровень холестерина был менее 10 мг/дл.

Таким образом, во всех пробах содержание холестерина в ммЛНП было повышенным, в то время как холестерин в ИК-ммЛНП в 29% тестированных проб был менее 10 мг/дл.

Пример 1. Определение литической активности ммЛНП и ИК-ммЛНП, приготовленных из сыворотки крови беременных женщин.

Литическую активность ИК-ммЛНП определяли аналогично определению литической активности ммЛНП как описано в патенте РФ №2577719 от 20.03.2016 г. Литический тест проводят в 96-луночных плоскодонных иммунологических планшетах. Вначале вносят в лунки по 10 мкл ммЛНП или ИК-ммЛНП, затем добавляют 40 мкл буфера VBS²⁺ и 50 мкл суспензии стандартизованных (1,5×10⁸ кл/мл) эритроцитов барана. Параллельно ставят контроли: на полный лизис (50 мкл суспензии эритроцитов барана +50 мкл H₂O); на спонтанный лизис (50 мкл эритроцитов барана +50 мкл буфера VBS²⁺). Планшету заклеивают пленкой и оставляют на 24 часа при 37°С. После инкубации планшету тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность проб на фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 620 нм и по калибровочному графику определяют степень лизиса. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, по литической активности исследованные пробы мм ЛНП распределяются на три группы:

1 группа с низкой литической активностью (% лизиса менее 11%), всего 5 проб;

2 группа - со средней литической активностью (% лизиса от 12% до 50%), всего 20 проб;

3 группа - с высокой литической активностью (% лизиса более 51%), всего 26 проб.

Таким же образом по величине литической активности пробы ИК-ммЛНП также распределяются на три группы:

1 группа с низкой литической активностью (менее 11%). Всего 15 проб;

2 группа - со средней литической активностью (%>лизиса от 12% до 50%). Всего 30 проб;

3 группа - с высокой литической активностью (лизис более 51%). Всего 6 проб.

Таким образом, данное условное распределение по группам было бы корректным при равном количестве холестерина в ммЛНП и ИК-ммЛНП. С другой стороны, тест определения литической активности данных физиологических макромолекулярных комплексов является функциональным и поэтому требуется стандартизация литической активности с учетом содержания холестерина в данных комплексах через расчетный коэффициент, коэфициент удельной литической активности (К_УЛА).

Расчет коэффициента удельной литической активности (К_УЛА) ммЛНП и ИК-ммЛНП, Для комплексной оценки литической активности ммЛНП и ИК-ммЛНП предложен коэффициент удельной литической активности, который представляет собой отношение степени лизиса эритроцитов к холестерину в индивидуальных пробах ммЛНП и ИК-ммЛНП, приготовленных из сыворотки крови одного и того же человека. Полученные значения К_УЛА представлены в таблице 4.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, по величине коэффициентов удельной литической активности (К_УЛА) пробы ммЛНП условно делятся на три группы:

1 группа - 24 пробы с низким К_УЛА (менее 1,0 ЕД);

2 группа - 23 пробы со средним значением К_УЛА (от 1,0 ЕД до 2,0 ЕД);

3 группа - 4 пробы с высоким К_УЛА (более 2 ЕД).

Аналогично, пробы ИК-ммЛНП по величине К_УЛА также делятся на три группы:

1 группа - 19 пробы с низким К_УЛА (менее 1 ЕД);

2 группа - 22 пробы со средним значением К_УЛА (от 1,0 ЕД до 2,0 ЕД);

3 группа - 10 проб с К_УЛА (более 2,0 ЕД).

Анализ величины коэффициентов в парах ммЛНП и ИК-ммЛНП свидетельствует о разнонаправленных сдвигах, т.е. в одних пробах наблюдается возрастание К_УЛА, в других, наоборот, снижение данного коэффициента. В третьей группе К_УЛА остается постоянным.

Таким образом, для оценки литической активности иммунных комплексов, содержащих ммЛНП, в предлагаемом тесте проводится анализ в парных пробах величины К_УЛА (ммЛНП и ИК-ммЛНП). Результаты парного анализа свидетельствуют:

1. В случае снижения величины К_УЛА ИК-ммЛНП по сравнению с К_УЛА ммЛНП в парных пробах характер аутоиммунной реакции организма на ммЛНП оценивается как протективный (благоприятный). Эффект нейтрализации литической активности при взаимодействии аутоантител с ммЛНП, возможно, связан либо с нейтрализацией липопротеин-ассоциированной фосфолипаза А2, либо нейтрализацией лизофосфатидилхолина в молекуле ммЛНП в иммунных комплексах, либо связывание аутоантител с ммЛНП вызывает конформационные изменения в молекуле липопротеина, приводя к снижению патогенности в литическом тесте (см. таблицу 5);

2. В случае возрастания величины К_УЛА в парных пробах ммЛНП и ИК-ммЛНП характер аутоиммунной реакции организма на ммЛНП оценивается как про-воспалительный (патогенный) ответ на ммЛНП. Возможно, возрастание патогенности (литической активности) ммЛНП в составе иммунных комплексов связано с конформационными изменениями в молекуле липопротеина. Данный факт является абсолютно новым эффектом для иммунных реакций, (см. таблицу 6);

3. В случае равных значений величины К_УЛА в парах ммЛНП и ИК-ммЛНП, с одной стороны, имеет значение величина данного коэффициента для оценки патогенности, с другой стороны, данный факт свидетельствует о том, что аутоантитела, связываясь с ммЛНП в иммунных комплексах не влияют на литическую активность данных комплексов. При данной ситуации патогенный эффект ммЛНП и ИК-ммЛНП зависит только от концентрации их в крови обследуемого индивидуума (таблица 7).

Таким образом, способ оценки литической активности ИК-ммЛНП в организме человека позволяет проводить диагностику течения атеросклеротического процесса, расширяет возможности для коррекции проводимой терапии под контролем коэффициента удельной литической активности ммЛНП и ИК-ммЛНП, открывает новый подход к оценке атерогенности ммЛНП и ИК-ммЛНП «от количественных» показателей к «качественным» (функциональным) показателям. То есть, при нормальном уровне ммЛНП и ИК-ммЛНП патологический процесс, обусловленный данными комплексами может протекать с разной скоростью, в зависимости от коэффициента удельной литической активности, т.е. от патогенности данных комплексов.

Предлагаемый способ прост в выполнении, не требует дорогостоящих реактивов и оборудования. Для регистрации лизиса эритроцитов не требуется стадия центрифугирования Использование простого и информативного способа оценки характера аутоиммунной реакции организма на естественный метаболит, ИК-ммЛНП, позволяет проводить скрининг и выявлять людей с острым течением патологического, в частности, атеросклеротического процесса, как на доклинических стадиях заболевания, так и при клиническом атеросклерозе.

Способ оценки литической активности множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности, включающий приготовление преципитата из сыворотки крови человека путем инкубации супернатанта, полученного после предварительного осаждения множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП) буфером, содержащим 20% поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000), в течение 30 мин при 4°С, затем образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов, содержащих ммЛНП (ИК-ммЛНП), осаждают центрифугированием при 4°С в течение 10 мин при 31000 g, декантируют, полученный преципитат растворяют в буфере без ПВП-35000, определяют содержание холестерина в иммунных комплексах, отличающийся тем, что к пробам ммЛНП и ИК-ммЛНП добавляют стандартизованные эритроциты барана, инкубируют в течение 24 ч при 37°С, рассчитывают коэффициент удельной литической активности (К_УЛА) ммЛНП и ИК-ммЛНП как отношение степени лизиса к холестерину в этих комплексах, сопоставляют величину К_УЛА ммЛНП и ИК-ммЛНП у обследуемого человека, в случае снижения данного коэффициента ИК-ммЛНП по сравнению с К_УЛА ммЛНП оценивается как нейтрализация литической активности, при противоположном эффекте, при тенденции к увеличению данного коэффициента ИК-ммЛНП, оценивается как возрастание литической активности, равные величины К_УЛА (ммЛНП) и К_УЛА (ИК-ммЛНП) свидетельствуют о том, что аутоантитела, связываясь с ммЛНП в иммунных комплексах, не влияют на литическую активность.