Штамм бактерии komagataeibacter hansenii - продуцент бактериальной целлюлозы

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм Komagataeibacter hansenii ВКПМ В-12950 – продуцент бактериальной целлюлозы. Изобретение обеспечивает получение бактериальной целлюлозы в количестве 2,8 – 3,5 г/л со степенью кристалличности 62,45 – 72,5% при динамическом культивировании в течение 3 суток на средах с отходами биотехнологических производств. 6 ил., 6 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине как биоматериал для тканевой инженерии, создания раневых покрытий и трансдермальных терапевтических систем, в пищевой промышленности, в технике, для получения нанокристаллической целлюлозы и биокомпозиционных материалов для аэрокосмической и авиационной промышленности.

Бактериальная целлюлоза обладает уникальными свойствами: высокой механической прочностью, сорбционной способностью, биологической совместимостью и т.д. В отличие от растительной целлюлозы она представляет собой химически чистый внеклеточный продукт. Молекулы бактериальной целлюлозы образуют микрофибриллы в 100 раз тоньше микрофибрилл растительной целлюлозы, то есть это структурные элементы наноуровневого размера. За счет правильного расположения волокон степень кристалличности бактериальной целлюлозы достигает 70 – 89 %. Благодаря своим уникальным свойствам бактериальная целлюлоза является перспективным материалом для промышленности и техники, открывая новые горизонты для нанотехнологии. Она имеет большой потенциал использования в медицине как биоматериал для тканевой инженерии, создания раневых покрытий и трансдермальных терапевтических систем, в пищевой, фармацевтической промышленности, в технике, в промышленной электронике для получения оптически прозрачных соединений с ультранизким коэффициентом теплового расширения, для изготовления акустических диафрагм, способна служить заменой растительной целлюлозы в производстве бумаги, для получения нанокристаллической целлюлозы и биокомпозиционных материалов (Lee K.Y. More than meets the eye in bacterial cellulose: biosynthesis, bioprocessing, and applications in advanced fiber composites / K.Y. Lee, G. Buldum, A. Mantalaris, A. Bismarck // Macromolecular bioscience. – 2014. – № 14. – P. 10-32).

Несмотря на указанные преимущества, производство бактериальной целлюлозы является довольно дорогостоящим процессом. Это связано, прежде всего, с невысокой продуктивностью известных штаммов и использованием дорогих питательных сред (Ревин В.В. Получение бактериальной целлюлозы и нанокомпозиционных материалов : монография / В.В. Ревин, Е.В. Лияськина, Н.А. Пестов. – Саранск : Издательство Мордов. ун-та, 2014. – 128 с.).

В качестве продуцента бактериальной целлюлозы известен штамм бактерии Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008, полученный путем многоступенчатого скрининга из культуры «чайного кваса». Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-10547. При культивировании в статических условиях в течение 7 сут на среде Hestrin-Schramm (HS) выход бактериальной целлюлозы составляет 2,17 г/л, на селективных средах – 4,73-6,67 г/л (RU 2464307, МПК C12N 1/20, С12Р 19/04, С12R 1/01, опубл. 20.10.2012).

Недостатком известного решения является длительное время культивирования (7 сут) и использование в качестве питательных сред для получения бактериальной целлюлозы сахаросодержащих сред сложного состава.

Известен штамм бактерии Komagataeibacter xylinus В-12068 – продуцент бактериальной целлюлозы, который был выделен из природной ассоциации Medusomyces gisevii J. Lindau (чайный гриб) селекционным путем на стандартной среде HS. Штамм бактерии Komagataeibacter xylinus позволяет получать бактериальную целлюлозу с высокими выходами до 200-350 г/л (во влажном состоянии), при поверхностном и глубинном культивировании на жидкой питательной среде HS с глюкозой со степенью кристалличности 60-67 и 30 %, соответственно (RU 2568605, МПК C12N 1/20, С12Р 19/04, С12R 1/00, опубл. 20.11.2015).

Недостатком известного решения является использование дорогих питательных сред, длительное время культивирования (7 сут) и низкая степень кристалличности полимера, полученного в динамических условиях (30 %).

Технический результат заключается в создании нового штамма бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950, используемого для получения бактериальной целлюлозы.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать штамм бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950 – продуцент бактериальной целлюлозы.

Штамм бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950 депонирован во ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ В-12950.

На фиг. 1 представлены клетки бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950; на фиг. 2 изображено филогенетическое дерево Komagataeibacter hansenii B-12950 с гомологичными штаммами бактерии; на фиг. 3 – результаты проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК; на фиг. 4 показана гель-пленка бактериальной целлюлозы, образованная в статических условиях; на фиг. 5 показаны хлопьевидные структуры, образованные в динамических условия; на фиг. 6 представлен график получения бактериальной целлюлозы в статических и динамических условиях.

Заявляемый штамм выделен из природной ассоциации индийского риса с последующей селекцией на основе естественного отбора. Индийский рис наряду с чайным и молочным грибом принадлежит к группе зооглей. Индийский рис (индийский морской рис, тиби) представляет собой ассоциацию микроорганизмов, включающую молочнокислые бактерии родов Lactobacillus, Leuconostoc, уксуснокислые бактерии, дрожжи родов Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces и д.р. (Fiorda F.A. Microbiological, biochemical, and functional aspects of sugary kefir fermentation - A review /F.A .Fiorda, G.V. de Melo Pereira, V. Thomaz-Soccol  [et al.] // Food Microbiol. – 2017. – Vol. 66. – P.86-95).

Штамм бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950 идентифицирован по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам и генетическим характеристикам и имеет следующие признаки.

Штамм бактерии – облигатный аэроб, клетки цилиндрические с закругленными концами размерами 0,6-1,2×1-3 мкм, некоторые слегка изогнуты, расположены одиночно, попарно и в коротких цепочках; спор не образуют; грамотрицательные, подвижные (фиг. 1).

Штамм бактерии идентифицирован до вида с помощью анализа 16S РНК.

При секвенировании вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, получена собранная нуклеотидная последовательность для штамма бактерии. Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank. По данным анализа генов, кодирующих 16S рРНК, построено филогенетическое дерево Komagataeibacter hansenii B-12950 с гомологичными штаммами бактерии, представленное на фиг. 2. По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, штамм бактерии наиболее близок к виду Komagataeibacter hansenii (фиг. 3).

Штамм бактерии хорошо растет на агаризованных средах. На агаризованной среде с глюкозой (состав (г/л): глюкоза – 10,0; дрожжевой экстракт – 10,0; пептон – 7,0; лимонная кислота – 0,2; уксусная кислота – 1,5 мл; агар – 15,0; мел – 0,5; этанол – 10,0 мл. pH среды 5,0-6,0) и среде YE (состав (г/л): дрожжевой экстракт – 30,0; этанол – 20,0, агар – 20,0. pH среды 5,0-6,0) на третьи сутки роста колонии мелкие круглые диаметром 1 мм светло-бежевого цвета. На пятые сутки культивирования диаметр колоний увеличивается до 2-4 мм. На агаризованной среде с мелом колонии круглые, диаметром 1 мм, белого цвета, окруженные прозрачным ореолом. На жидких питательных средах с сахарозой и глюкозой в статических условиях образуется гель-пленка бактериальной целлюлозы (фиг. 4), в динамических условиях – хлопьевидные структуры (фиг. 5).

Штамм бактерии культивируют в статических и динамических условиях на качалке при 250 об/мин и температуре 30 °C в среде HS (Hestrin, Schramm, 1954) следующего состава, г/л: D-глюкоза – 20,0; дрожжевой экстракт – 5,0; пептон – 5,0; Na2PHO4 – 2,7; лимонная кислота – 1,15. pH среды – 6,0. Режим стерилизации 121 °C в течение 20 мин. Количество бактериальной целлюлозы, образующееся на среде HS в статических условиях, составляет 1,02 г/л на пятые сутки культивирования, в динамических условиях – 1,5 г/л на третьи сутки культивирования со степенью кристалличности 57,9 % (фиг. 6). На среде с мелассой в статических условиях образуется 2,8 г/л бактериальной целлюлозы на пятые сутки культивирования, в динамических условиях 3,5 г/л бактериальной целлюлозы на третьи сутки культивирования со степенью кристалличности 72,4 % (фиг. 5). На фильтрате нативной барды в статических условиях образуется 2,1 г/л бактериальной целлюлозы на пятые сутки культивирования, в динамических условиях 2,8 г/л бактериальной целлюлозы на третьи сутки культивирования со степенью кристалличности 62,45 % (фиг. 6).

Штамм бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950 может расти без добавления уксусной кислоты. Штамм бактерии растет при pH от 2,5 до 6,5, оптимальным pH является интервал от 4,0 до 6,0.

Пример 1. Культуру штамма бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950 выращивают в течение 3-5 сут в статических условиях в открытых емкостях на среде HS (Hestrin, Schramm, 1954) следующего состава, г/л: D-глюкоза – 20,0; дрожжевой экстракт – 5,0; пептон – 5,0; Na2PHO4 – 2,7; лимонная кислота – 1,15. pH среды – 6,0. Режим стерилизации 121 °C в течение 20 мин. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании бактерий, обрабатывают 0,1 Н раствором NaOH при 80 °C в течение 30 мин для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывали дистиллированной водой, 0,5 %-ным водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяют 3 раза. Далее целлюлозу высушивают при 80 °C до постоянной массы. Количество бактериальной целлюлозы определяют весовым методом. Масса сухой бактериальной целлюлозы составляет 1,02 г/л.

Пример 2. Культуру штамма бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950 выращивают в течение 3-5 сут в статических условиях на среде с мелассой в концентрации 55 г/л. pH среды – 4,5. Режим стерилизации 121 °C в течение 20 мин. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании бактерий, обрабатывают 0,1 Н раствором NaOH при 80 °C в течение 30 минут для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывают дистиллированной водой, 0,5 %-ным водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяют 3 раза. Далее целлюлозу высушивают при 80 °C до постоянной массы. Количество бактериальной целлюлозы определяют весовым методом. После удаления клеток и компонентов среды масса сухой бактериальной целлюлозы составляет 2,8 г/л.

Пример 3. Культуру штамма бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950 выращивают в течение 3-5 сут в статических условиях открытых емкостях на фильтрате послеспиртовой барды. pH среды – 4,4. Режим стерилизации 121 °C в течение 20 мин. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании бактерий, обрабатывают 0,1 Н раствором NaOH при 80 °C в течение 30 мин для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывают дистиллированной водой, 0,5 %-ным водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяют 3 раза. Далее целлюлозу высушивали при 80 °C до постоянной массы. Количество бактериальной целлюлозы определяют весовым методом. После удаления клеток и компонентов среды масса сухой бактериальной целлюлозы составляет 2,1 г/л.

Пример 4. Культуру штамма бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950 выращивают в течение 3 сут в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 250 об/мин и температуре 30 °C в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды HS следующего состава, г/л: D-глюкоза – 20,0; дрожжевой экстракт – 5,0; пептон – 5,0; Na2PHO4 – 2,7; лимонная кислота – 1,15. pH среды – 6,0. Режим стерилизации 121 °C в течение 20 мин. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании бактерий, обрабатывают 0,1 Н раствором NaOH при 80 °C в течение 30 мин для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывают дистиллированной водой, 0,5 %-ным водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяют 3 раза. Далее целлюлозу высушивают при 80 °С до постоянной массы. Количество бактериальной целлюлозы определяют весовым методом. После удаления клеток и компонентов среды масса сухой бактериальной целлюлозы составляет 1,5 г/л.

Пример 5. Культуру штамма бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950 выращивают в течение 3 сут в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 250 об/мин и температуре 30 °С в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды с мелассой в концентрации 55 г/л. pH среды – 4,5. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании бактерий, обрабатывают 0,1 Н раствором NaOH при 80 °C в течение 30 мин для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывали дистиллированной водой, 0,5 % водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяют 3 раза. Далее целлюлозу высушивают при 80 °C до постоянной массы. Количество бактериальной целлюлозы определяют весовым методом. После удаления клеток и культуральной среды масса сухой бактериальной целлюлозы составляет 3,5 г/л.

Пример 6. Культуру штамма бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950 выращивают в течение 3 сут в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 250 об/мин и температуре 30 °C в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл фильтрата послеспиртовой барды. pH среды – 4,4. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании бактерий, обрабатывают 0,1 Н раствором NaOH при 80 °C в течение 30 мин для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывают дистиллированной водой, 0,5 %-ным водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяют 3 раза. Далее целлюлозу высушивают при 80 °C до постоянной массы. Количество бактериальной целлюлозы определяют весовым методом. После удаления клеток и культуральной среды масса сухой бактериальной целлюлозы составляет 2,8 г/л.

По сравнению с известным решением предлагаемое обеспечивает образование бактериальной целлюлозы в количестве 2,8 – 3,5 г/л со степенью кристалличности 62,45 – 72,5 % при динамическом культивировании в течение 3 сут на средах с отходами биотехнологических производств за счет использования штамма бактерии Komagataeibacter hansenii B-12950.

Штамм бактерии Komagataeibacter hansenii ВКПМ В-12950 – продуцент бактериальной целлюлозы.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к микробиологии, в частности к питательным средам для микроорганизмов. Питательная среда плотная для хранения микроба чумы содержит ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический и питьевую воду при заданном содержании компонентов.

Изобретение относится к биотехнологии. Термофильный планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella sorokiniana FAT обладает тонкой оболочкой и способен интенсивно наращивать биомассу в синхронном режиме культивирования, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Аl-26.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Питательная среда для культивирования бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 содержит пептон ферментативный, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, сульфат аммония и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения наночастиц золота или серебра, включающий получение бесклеточного фильтрата культуральной жидкости при культивировании Lentinus edodes.

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для производства макролидного антибиотика рапамицина - лекарственного средства, широко используемого в трансплантологии и терапии опухолевых процессов.
Изобретение относится к микробиологии и касается питательной среды для дифференциации сибиреязвенного микроба. Питательная среда для дифференциации B.

Изобретение относится к генной инженерии и биотехнологии, в частности к генотерапевтическому ДНК-вектору VTvaf17 размером 3165 п.н. и способу его получения.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии. Применение штамма бактерии Azospirillum zeae OPN-14, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-12542, в качестве биологического агента с рост-стимулирующей активностью по отношению к растениям.

Группа изобретений относится к биотехнологии и экологии и включает препарат для биодеградации метанола и способ его получения. Изобретения могут быть использованы для биодеградации загрязнений окружающей среды (почвы, грунтов, морских, пресных и минерализованных вод), а также технологических конструкций метанолом и сопутствующими нефтепродуктами.

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для культивирования Pseudomonas fluorescens АР-33 содержит мелассу, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный, сульфат магния семиводный, горох шлифованный, предварительно обработанный автоклавированием, янтарную кислоту, лапрол для жидкой среды и дистиллированную воду при заданных соотношениях компонентов.
Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения экзополисахарида (ЭПС) бактерий Xanthobacter xylophilus Z-0055.
Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения экзополисахарида (ЭПС) бактерий Ancylobacter abiegnus.

Изобретение относится к области медицины и химико-фармацевтической промышленности, а именно к композиции биосовместимого материала, включающей 46-50 мас.% иммобилизированной гиалуроновой кислоты в 1%-ном растворе NaOH, в качестве биополимера – гель-пленку бактериальной целлюлозы в количестве 36-40 мас.% и в качестве сшивающего агента – 20%-ный 1,4-бутандиол-диглицидиловый эфир в 1%-ном растворе NaOH (остальное).

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ выделения водного раствора глюканов из содержащего глюканы и биомассу водного ферментационного бульона на фильтрационной установке.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Штамм Gluconacetobacter intermedius, продуцирующий бактериальную целлюлозу, депонирован в Национальном Институте передовой промышленной науки и технологии (Япония) под регистрационным номером SIID 9587.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ гидролиза лигноцеллюлозной биомассы и гидролизат биомассы, полученный вышеуказанным способом (варианты).

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к переработке биомассы. Предложен способ получения фермента.

Изобретение относится к способу получения фибриллированного целлюлозного материала и к фибриллированной целлюлозе. Способ получения фибриллированного целлюлозного материала включает фибриллирование исходного материала на основе целлюлозы с помощью фермента(ов) и усиление фибриллирования путем механического перемешивания, перед фибриллированием исходный материал на основе целлюлозы добавляют в суспензию, содержащую, таким образом, после добавления исходный материал на основе целлюлозы с консистенцией от 10% до 60%, после чего фибриллирование выполняют с применением ферментативной смеси, проявляющей главным образом целлобиогидролазную активность и низкую эндоглюканазную активность, при этом эндоглюканазная активность является достаточной для создания новых концевых групп цепи, в сочетании с механическим перемешиванием без измельчающего действия, и при этом фибриллирование осуществляют в две стадии путем селективного регулирования температуры реакции, при этом на первой стадии выбирают такую температуру реакции, которая позволяет быть активной как целлобиогидролазе, так и эндоглюканазе, и на второй стадии инактивируют эндоглюканазную активность путем повышения температуры реакции.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ получения капсулярного полисахарида Haemophilus influenzae типа b, применение вышеуказанного капсулярного полисахарида для получения вакцинной композиции и способ получения вакцинной композиции.

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии, фармакологии и медицине. Предложено применение физиологического липополисахарида, продуцируемого штаммом фототрофной бактерии Rhodobacter capsulatus ВКМ ИБФМ РАН B-2381Д, в качестве нетоксичного фактора, усиливающего дифференцирующую активность 1α,25-дигидроксивитамина D3 при дифференцировке моноцитоподобных клеток в моноциты.
Изобретение относится к микробиологии, в частности к питательным средам для микроорганизмов. Питательная среда плотная для хранения микроба чумы содержит ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический и питьевую воду при заданном содержании компонентов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм Komagataeibacter hansenii ВКПМ В-12950 – продуцент бактериальной целлюлозы. Изобретение обеспечивает получение бактериальной целлюлозы в количестве 2,8 – 3,5 гл со степенью кристалличности 62,45 – 72,5 при динамическом культивировании в течение 3 суток на средах с отходами биотехнологических производств. 6 ил., 6 пр.

Наверх