Способ лечения нерубцовой алопеции

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу лечения нерубцовой алопеции. Способ лечения нерубцовой алопеции включает введение в мезодермальный слой кожи в зоне облысения клеточного материала, полученного путем выдергивания волос из волосистой части головы взрослого донора, помещения в раствор Хенкса с антибиотиком и антимикотиком, отбирают волосы в стадии анагена и отсекают от них волосяные фолликулы, промывают раствором Хенкса с антибиотиком и антимикотиком и переносят в раствор коллагеназы, инкубируют и переносят во флаконы с коллагеновым покрытием, содержащие DMEM:F12 и фетальную телячью сыворотку в растворе гентамицина, стрептомицина и глутамина, через 21 день клеточный материал диссоциируют, переносят в суспензию с использованием раствора трипсина с версеном, клеточный материал промывают физиологическим раствором путем центрифугирования, переносят в стерильной среде в вакуумную пробирку, вводят в мезотермальный слой кожи при определенном угле наклона иглы. Вышеописанный способ - эффективный пролонгированный регенеративный способ лечения нерубцовой алопеции. 3 ил.

 

Изобретение относится к эстетической медицине и может быть использовано для лечения алопеций.

Известен способ лечения нарушения роста волос [RU 2381786, С2, А61К 8/37, 20.02.2010], включающий введение пациенту алкилового эфира никотиновой кислоты с алкильной группой с прямой цепью или разветвленной цепью, содержащей от приблизительно 6 до приблизительно 22 СН₂ групп в количестве, достаточном для снижения или для прекращения выпадения волос у указанного субъекта.

Недостатком способа является относительно низкая эффективность лечения.

Известен также способ [RU 2295304, С2, А61В 17/00, 20.03.2007], основанный на том, что в затылочной области головы пациента вырезают кожную полоску с волосяными фолликулами, ушивают донорскую рану, из кожной полоски формируют фолликулярные объединения-графты, для пересадки заготовленных графтов в затылочной области головы и на макушке формируют микроотверстия, направления каналов которых соответствуют направлению роста волос, причем для формирования отверстий разрезы производят параллельно донорской ране.

Недостатком этого способа также является относительно низкая эффективность лечения.

Кроме того, известен способ [RU 2550428, C1, А61В 17/00, 10.05.2015], включающий забор фрагмента кожного имплантата из волосистой области, наложение на образовавшийся дефект косметического шва, деление вырезанного фрагмента на фолликулярные графты, образование микронадрезов на реципиентной области и пересадку в них фолликулярных графтов, при этом перед забором фрагмента кожного имплантата с помощью компьютерной программы TrichoSciencePro v 1.1 рассчитывают площадь реципиентной области, проводят фототрихограмму, оценивая жизнеспособность волосяных фолликулов, на основании полученных данных определяют требуемое количество волосяных фолликулов, затем на реципиентную область наносят «шаблон», после чего на 30% реципиентной области формируют микронадрезы диаметром 1,0 мм для пересадки 2-х и 3-х жизнеспособных фолликулярных графтов и одиночных волосяных фолликулов, которые вводят с помощью одноразовых игл диаметром 0,8-1,0 мм.

Недостатком этого технического решения является относительно низкая эффективность, обусловленная малой приживаемостью волос.

Еще одним аналогом предложенного является способ [IBRAHIM ZA et al. Stem cell therapy as a novel therapeutic intervention for resistant cases of alopecia areata and androgenetic alopecia. J. Dermatolog Treat. 2016, Aug., 24:1-30; ZHAO J. et al. Treatment of alopecia by transplantation of hair follicle steam cells and dermal papilla cells encapsulated in algenate gels. Med. Hypotheses. 2008; 70(5): 1014-6], включающий использование мезенхимальных стволовых клеток, в том числе из волосяных фолликулов кожи, в т.ч. для интрадермального введения.

Недостатком указанных выше технических решений является относительно узкий арсенал способов лечения нерубцовой алопеции, что не всегда обеспечивает выбор эффективного способа.

Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ лечения нерубцовой алопеции [RU 2631642, C1, А61М 5/00, А61K 35/28, А61Р 17/14, 25.09.2017], включающий введение в мезодермальный слой кожи мезенхимальных стволовых клеток, которые выделяют из биоптата кожи с волосистой части головы взрослого донора, при этом, дополнительно выделяют мезенхимальные стволовые клетки из плаценты, после чего указанные клетки смешивают в соотношении от 3:1 до 1:3, доводят объем смеси до 2-4 мл и вводят ее в мезодермальный слой кожи человека в зоне облысения на глубину 2-3 мм через каждые 2-3 мм при объеме каждой инъекции, равном 0,02 мл.

Недостатком наиболее близкого технического решения является относительно низкая эффективность лечения.

Задачей предложенного способа является расширение арсенала способов лечения нерубцовой алопеции и повышение эффективности лечения.

Требуемый технический результат заключается в повышении эффективности лечения нерубцовой алопеции и расширение арсенала технических средств лечения алопеции.

Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, в способе лечения нерубцовой алопеции, включающий введение в мезодермальный слой кожи в зоне облысения клеточного материала на глубину 2-3 мм, согласно изобретению, предварительно выдергивают волосы из волосистой части головы взрослого донора и помещают их в раствор Хенкса с антибиотиком и антимикотиком, отбирают волосы, находящиеся в стадии анагена и отсекают от них волосяные фолликулы, которые промывают раствором Хенкса с добавлением антибиотика и антимикотика и переносят в 0,1% раствор коллагеназы 1-го типа, где их и инкубируют в течением 1-2 ч при 37°С и переносят в культуральные флаконы с коллагеновым покрытием с DMEM:F12, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки в растворе гентамицин/стрептомицин/глутамина с равным их соотношением, а через 21 день клеточный материал диссоциируют из сфероидов, образованных в культуральных флаконах, и переносят в суспензию с использованием 0,25%-ного раствора трипсина с версеном (1:1), после чего клеточный материал промывают физиологически раствором путем двухкратного центрифугирования в по 5 минут при 300g с последующим переносом в стерильной среде в вакуумную пробирку с объемом 2-4 мл и содержанием при температуре +2 - +8°С для последующего введения через иглу в мезодермальный слой кожи в виде папул с размером от 2 до 4 мм при угле наклона иглы в 45°.

На графических материалах представлены:

на фиг. 1 - чашка Петри с волосами донора в растворе Хенкса с добавлением антибиотика и антимикотика;

на фиг. 2 - волосяной фолликул в стадии анагена;

на фиг. 3 - пример формирования сфероидов из клеток ростовых зон волосяного фолликула, где А - клетками дермальной папиллы, В - клетками зоны bulge.

Предложенный способ лечения нерубцовой алопеции реализуется следующим образом.

Материально-техническое обеспечение.

1. Помещение для использования под лабораторию, отвечающее лицензионным требованиям.

2. Оборудование: центрифуга, СО₂-инкубатор, ламинарный шкаф, инвертированный микроскоп, автоматическая пипетка, микропипетка, замораживатель, сосуд Дьюара, низкотемпературный холодильник, бытовой холодильник, камера Горяева, водяная баня, термос.

3. Реактивы: антибиотики, антимикотики, питательная среда ДМЕМ/Р12, фетальная телячья сыворотка, Версен, 0,25%-ный раствор трипсина, ДМСО, раствор Хенкса, физиологический раствор, коллагеназа 1-го типа, трипановый синий.

4. Расходные материалы: одноразовая культуральная пластиковая посуда (флаконы, пробирки, серологические пипетки, чашки Петри, наконечники для микропипеток, криопробирки); покровные стекла, набор медицинских инструментов (пинцет, хирургические ножницы, глазные ножницы, скальпель, шпатель, карцанг), вакутейнеры.

Получение аутологичных клеток из волосяных фолликулов кожи головы человека.

Получение образцов волос.

А. Волосы выдергиваются с разных областей волосистой части головы взрослого донора при помощи пинцета и помещаются в раствор Хенкса с антибиотиком и антимикотиком (см. фиг. 1), где представлена чашка Петри с волосами пациента в растворе Хенкса.

Б. При помощи микроскопа отбираются волосы, находящиеся в стадии анагена, у которых затем отсекаются волосяные фолликулы (см. фиг. 2).

Выделение аутологичных клеток из волосяных фолликулов кожи человека и их культивирование.

A. Все манипуляции по выделению и культивированию аутологичных клеток из волосяных фолликулов головы человека проводятся стерильно в условиях специально оборудованного культурального бокса.

Б. Отсеченные волосяные фолликулы промываются раствором Хенкса (ПанЭко, РФ) с добавлением антибиотика/антимикотика («Gibco», США).

B. Промытые луковицы переносятся в 0,1% раствор коллагеназы 1-го типа и инкубируются 1-2 ч при 37°С.

Г. После этого волосяные фолликулы переносятся в культуральные флаконы с коллагеновым покрытием с DMEM:F12, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и р-р гентамицин/стрептомицин/глутамина (все - Gibco, США).

Д. Через две недели происходит образование сфероидов из клеток на поверхности волосяных фолликулов, в зоне дермальной папуллы и зоны bulge, (см. фиг.3), где иллюстрируется формирование сфероидов из клеток ростовых зон волосяного фолликула: А - клетками дермальной папиллы, В -клетками зоны bulge.

Е. Спустя 21 день, когда происходит остановка роста сфероидов, клетки диссоциируют из сфероидов, и переводят в суспензию с использованием раствора 0,25%-го трипсина с версеном (1:1).

Приготовление клеточного материала для транспортировки и медицинского применения.

A. Полученная суспензия переносится в изопропиленовую пробирку объемом 50 мл, после чего осуществляется подсчет количества в ней клеток при помощи камеры Горяева.

Б. Далее суспензия промывается физиологическим раствором. Для этого клетки осаждаются центрифугированием (5 мин 300g), а осадок ресуспендируется в физиологическом растворе. Манипуляция повторяется дважды.

B. Полученный в п.Б осадок клеток, ресуспендируется в стерильной среде транспортировки, состоящей из физиологического раствора и разрешенного к применению лекарственного средства, обеспечивающего лучшую выживаемость клеток и улучшение лечебных характеристик технологии.

Г. Процент жизнеспособных клеток в препарате определяется с помощью окраски трипановым синим и подсчетом в камере Горяева. Для медицинского применения необходим уровень не ниже 80% жизнеспособных клеток в суспезии.

Д. Полученная в п.В суспензия (далее клеточный материал) переносится стерильно в вакуумную пробирку для забора крови (вакутейнер, Gibco, США).

Е. Смесь доводится до объема 2-4 мл. Объем зависит от площади очага облысения.

Транспортировка и временное хранение клеточного материала.

A. Вакутейнер с готовым клеточным материалом помещается в термос со льдом и транспортируется к месту назначения.

Б. Транспортировка и хранение клеточного материала осуществляется стерильно при температурном режиме +2 - +8°С.

B. Срок годности клеточного материала для медицинского применения не более 6 ч.

Введение клеточного материала.

Клеточный материал вводится в мезодермальный слой кожи в зоне облысения, как обычный мезотерапевтический коктейль. При введении используется папульная техника, при этом формируются папулы различного диаметра, что позволяет клеточному материалу действовать постепенно, поступая малыми порциями из депо, максимально пролонгируя свой регенеративный эффект .Рассасывание папул при процедуре происходит от нескольких часов до нескольких дней. Размер папул может колебаться от 2 до 4 мм, глубина введения клеточного материала 2-3 мм, угол наклона иглы составляет 45 градусов.

Обзор результатов лечения нерубцовой алопеции предложенным способом.

При данном способе лечения аутологичные клетки волосяного фолликула выделяются, культивируются и далее при минимальном масштабировании и без пассирования вводятся в очаг облысения пациента. Особенно важным является то, что клетки выращиваются в сфероидах. Многочисленные научные исследования продемонстрировали, что двухмерное культивирование в значительной мере снижает активность выделенных клеток волосяного фолликула, а также приводит к потере их регенеративных свойств, что ухудшает их терапевтические свойства. Этого не происходит при трехмерном культивировании в сфероидах, так как это естественная ориентация клеток, наиболее близко воспроизводящая их модель деления и существования in vivo. Клетки в условиях культуры, когда на них не оказывается воздействие организма в целом, значительно омолаживаются, становятся ювенильными. Возвращаясь в кожу, они не только сами оказывают омолаживающее воздействие, но и способны запустить обратные процессы у стареющих или поврежденных клеток кожи. Полученные и размноженные in vitro клетки дермальной папилы и зоны bulge встраиваются в поврежденные участки волосяного фолликула и способны собирать их de novo. Нерубцовая алопеция - самый распространенный вид облысения на сегодняшний день, который не всегда хорошо поддается лечению обычными методами трихологии, но при этом доставляет пациенту массу неудобств и проблем эстетического характера. Клеточная мезотерапия данного заболевания показала очень хороший результат и сегодня является альтернативой медикаментозному лечению нерубцовой алопеции.

Суть самого способа подразумевает доставку клеточного материала непосредственно в мезодерму, что позволяет введенным аутологичным клеткам запустить регенеративные процессы в проблемной зоне. Результаты фототрихограммы пациентов, применивших данный способ лечения, показывают переход веллусных волос в терминальные, утолщение волос в зоне проведенной процедуры и остановка их потери, а также появление новых волос в зоне облысения.

Способ лечения нерубцовой алопеции, включающий введение в мезодермальный слой кожи в зоне облысения клеточного материала на глубину 2-3 мм, отличающийся тем, что клеточный материал получают путем выдергивания волос из волосистой части головы взрослого донора и их помещения в раствор Хенкса с антибиотиком и антимикотиком, после чего отбирают волосы, находящиеся в стадии анагена, и отсекают от них волосяные фолликулы, которые промывают раствором Хенкса с добавлением антибиотика и антимикотика и переносят в 0,1% раствор коллагеназы 1-го типа, где их и инкубируют в течение 1-2 ч при 37°С и переносят в культуральные флаконы с коллагеновым покрытием, содержащие DMEM:F12 и 10% фетальной телячьей сыворотки в растворе гентамицина, стрептомицина и глутамина с равным их соотношением, а через 21 день клеточный материал диссоциируют из сфероидов, образованных в культуральных флаконах, и переносят в суспензию с использованием 0,25%-ного раствора трипсина с версеном 1:1, после чего клеточный материал промывают физиологическим раствором путем двухкратного центрифугирования по 5 мин при 300g с последующим переносом в стерильной среде в вакуумную пробирку с объемом 2-4 мл и содержанием при температуре +2 - +8°С для последующего введения через иглу в мезодермальный слой кожи в виде папул с размером от 2 до 4 мм при угле наклона иглы в 45°.