Способ получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает получение гемосорбента путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-0,9% мас. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7,0-10,0% мас. акриламида и 0,5-1,1% мас. N,N'-метиленбисакриламида в присутствии 0,01-0,08% мас. модифицирующей добавки - гирудина, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты с получением гидрогеля. Полученный гидрогель измельчают и промывают его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений. Изобретение позволяет повысить тромборезистентность гемосорбента. 1 табл., 10 пр.

 

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ. Гемосорбент используют для удаления протеолитических ферментов из водных растворов, включая кровь, с целью детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, включая сепсис, гнойный перитонит, панкреатит, бронхиальную астму и т.п.

Известен способ получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0.1-0.9% мас. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7.0-12.0% мас. акриламида и 0.5-1.1% мас. N,N'-метиленбисакриламида, с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений [Авторское свидетельство СССР №1137388 A, G01N 33/50, Бюл. №4, 1985]. Емкость гемосорбента составляет 0.8-1.0 мг фермента на 1 мг связанного с полимером овомукоида.

Используемый овомукоид является ингибитором протеолитических ферментов и относится к классу гликопротеинов. Он имеет молекулярную массу 31000 и содержит 12.5% глюкозамина и 7.8% других сахаров. Его выделяют из белка утиных яиц по методике [Шульгин М.Н., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В., Свойства утиного овомукоида, очищенного методом аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе, Биохимия, 1981. Т. 46. №3. С. 473-480]. Одна молекула овомукоида способна одновременно связать одну молекулу химотрипсина и две молекулы трипсина.

Этот гемосорбент под названием «Овосорб» находит практическое применение для удаления протеолитических ферментов из крови, с целью детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, включая общий гнойный перитонит, острый деструктивный панкреатит, обширные гнойно-некротические процессы мягких тканей, ожоговая болезнь, синдром сдавливания, синдром отторжения после трансплантации органов и тканей, лучевая болезнь, острая печеночная недостаточность, острая и хроническая почечная недостаточность, бронхиальная астма и т.д. Овомукоид эффективно связывает трипсин, химотрипсин, катепсин, панкреатическую и нейтрофильную эластазы, а также бактериальные протеиназы, не изменяя концентрации предшественников и ингибиторов этих ферментов. Клинические данные свидетельствуют о высокой эффективности антипротеиназного биоспецифического гемосорбента «Овосорб» в коррекции нарушений белкового метаболизма и связанных с ними системных нарушений. Селективно удаляя из гемоциркуляции активные формы протеиназ, «Овосорб» в отличии от угольных гемосорбентов не обладает свойством неспецифической сорбции ингибиторов протеиназ и других индивидуальных белков плазмы. Одновременно уменьшается выраженность функциональных нарушений основных органов и систем жизнеобеспечения, происходит нормализация метаболических процессов поддержания гомеостаза в целом.

Недостатком известного способа является невысокая тромборезистентность гемосорбента. Время свертывания крови при контакте с гемосорбентом составляет 5-7 минут.В связи с этим, для предотвращения свертывания крови в процессе проведения операции гемосорбции пациентам вводят антикоагулянт крови - гепарин, в количестве порядка 1.0 мг на 1 кг массы с последующей его нейтрализацией.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является способ получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре водного раствора, содержащего 7.0-10.0% масс. акриламида, 0.1-0.9% масс. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 0.5-1.0% масс. N,N'-метиленбисакриламида и 0.01-0.08% масс. модифицирующей добавки с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений [Патент Российской Федерации №2484475. G01N 33/53. Бюл. №16. 2013].

В качестве модифицирующей добавки используют меркаптоуксусную кислоту, которая при полимеризации встраивается в полимерные цепи, обеспечивая повышение емкости гемосорбента до 1.75 мг фермента на 1 мг связанного с полимером овомукоида.

Недостатком известного способа является невысокая тромборезистентность гемосорбента. Время свертывания крови при контакте с гемосорбентом составляет 5-7 минут.

Задачей изобретения является повышение тромборезистентности гемосорбента.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является повышение тромборезистентности гемосорбента.

Технический результат достигается тем, что в способе получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-0,9% мас. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7,0-10,0% мас. акриламида и 0,5-1,1% мас. N,N'-метиленбисакриламида в присутствии 0.01-0.08% масс. модифицирующей добавки, с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений, в качестве модифицирующей добавки используют гирудин, ацилированный хлорангидридом акриловой кислоты.

Гирудин - полипептид, выделяемый из слюнных желез медицинских пиявок или получаемый рекомбинантным способом, состоит из 65 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 12000. Основная биологическая функция гирудина заключается в предотвращение свертывания крови за счет нейтрализации свертывающей активности тромбина при образовании комплекса тромбин-гирудин [Markwardt F. Hirudin as an inhibitor of thrombin. // Methods in Enzymol. 1970. V. 19. P. 924-932]. Гирудин является антикоагулянтом прямого действия. В отличие от известного антикоагулянта крови - гепарина, он не вступает в реакцию с другими факторами системы свертывания крови и оказывает свое ингибирующее действие на тромбин без участия каких-либо находящихся в крови компонентов. В связи с этим, в последние годы этот препарат получил широкое распространение при лечении заболеваний или состояний, при которых гепаринотерапия оказывается недостаточно эффективной, например в остром периоде инфаркта миокарда, при нестабильной стенокардии и т.д.

Ацилирование гирудина проводят путем растворения 0.1 г гирудина в 50 мл бикарбонатного буфера при рН 8,0 и добавлением к раствору 0,1 мл хлорангидрида акриловой кислоты при перемешивании (4°С, 30 минут). Ацилированный гирудин выделяют путем лиофильного высушивания.

Ацилирование овомукоида проводят аналогичным способом.

Пример 1. В 89 мл дистиллированной воды при комнатной температуре и перемешивании растворяют 0.1 г овомукоида, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 8.0 г акриламида, 1.0 г N,N'-метиленбисакриламида и 0.01 г гирудина, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты. После полного растворения всех веществ в раствор добавляют катализатор: 0,08 г персульфата аммония и 0,08 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина. Раствор вакуумируют при 10-12 мм рт.ст. и выдерживают при комнатной температуре (18-21°С) в течение 5 часов. Полученный гель извлекают из сосуда, измельчают продавливанием через сито с диаметром пор 1 мм и промывают бикарбонатным буфером с рН=8,0 до полного удаления непрореагировавших веществ. Полноту удаления контролируют спектрофотометрически.

Количество иммобилизованного в гемосорбенте овомукоида определяют по разнице между исходной концентрацией овомукоида и его концентрацией в промывных водах.

Для изучения емкости гемосорбента его помещают в колонку объемом 25 мл и через колонку пропускают водный раствор с рН 7,4 или плазму крови человека, содержащие 2,0 мг трипсина и 1,1 мг α-химотрипсина в 3.0 мл, до полного насыщения сорбента. Количество сорбированных ферментов определяют путем смывания их с колонки водным раствором с рН 1,5.

Для определения времени свертывания крови в стеклянной пробирке 2.0 г гемосорбента инкубируют с 5.0 мл крови и определяют время образования сгустка крови.

Состав исходного раствора и свойства сорбента приведены в таблице.

Примеры 2-7. Процесс проводят по примеру 1, используя различные количества исходных соединений.

Состав исходных растворов и свойства сорбентов приведены в таблице.

Примеры 8-10 (контрольные). Процесс проводят по способу-прототипу без добавления гирудина, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты.

*- сорбция из водного раствора, рН=7,4

** - сорбция из плазмы крови человека

Из таблицы видно, что использование гирудина, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, который в процессе полимеризации встраивается в полимерные цепи гемосорбента, приводит к существенному повышению тромборезистентности гемосорбента. Время образования тромбинового сгустка при контакте гемосорбента с кровью увеличивается по сравнению с гемосорбентом, полученным по способу-прототипу, с 5-7 до 24-25 минут при сохранении эффективности связывания протеиназ иммобилизованным овомукоидом порядка 1.6-2.1 мг протеиназы на 1 мг овомукоида.

Предельные значения ацилированного гирудина в исходной смеси определяются тем, что при его концентрации ниже 0,01% мас. время свертывания крови увеличивается незначительно, а при повышении концентрации выше 0.08% время свертывания крови не изменяется.

Таким образом, предложенный способ позволяет получать биоспецифический гемосорбент, обладающий повышенной тромборезистентностью по сравнению с гемосорбентом, полученным по способу-прототипу.

Способ получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-0,9% мас. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7,0-10,0% мас. акриламида и 0,5-1,1% мас. N,N'-метиленбисакриламида в присутствии 0,01-0,08% мас. модифицирующей добавки, с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений, отличающийся тем, что в качестве модифицирующей добавки используют гирудин, ацилированный хлорангидридом акриловой кислоты.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу получения средства на основе фицина, обладающего ранозаживляющим и регенерирующим действием, согласно которому осуществляют иммобилизацию фицина в буферном растворе на матрицу ионообменных волокон ВИОН КН-1 в соотношении 20 мл буферного раствора фицина в концентрации 1 мг/мл на 1 г волокон, при этом в качестве буферного раствора используют 0.05 М трис-HCl буфер с рН 7,0; далее проводят инкубирование в течение 24 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; а затем промывают образовавшийся осадок 0.05 М трис-HCl буфером с рН 7,0 до отсутствия в промывных водах фицина.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения гетерогенного препарата на основе бромелайна, обладающего ранозаживляющими свойствами, включающий иммобилизацию ферментного препарата в буферном растворе, инкубирование и промывку, отличающийся тем, что иммобилизацию бромелайна проводят на матрицу ионообменных волокон ВИОН КН-1 или ВИОН АН-1 в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 2 мг/мл на 1 г волокон; в качестве буферного раствора для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0.05 М глициновый буфер с pH 9.0-10,5 или 0.05 М боратный буфер с pH 8.0 без добавления KCl, а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0.2 М ацетатный буфер с pH 5.0; инкубация проводится в течение 24 часов при комнатной температуре; образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
Изобретение относится к получению топлив из возобновляемого сырья. Способ получения биодизельного топлива заключается в том, что масло смешивают с низшим спиртом с получением смеси, затем проводят процесс переэтерификации с использованием воды и каталитически активной мембраны, состоящей из диффузионного слоя, выполненного на базе полимера, проницаемого по отношению к низшим спиртам и глицерину, соединительного слоя, выполненного из пористого полимера, и каталитически активного слоя, образованного липолитическим микроорганизмом, при этом пористый полимер выбран из тканых или нетканых материалов из волокон полиэтилена, полипропилена, политетрафторэтилена, полиамида, при этом указанную смесь приводят в контакт с каталитически активным слоем мембраны, а воду - с диффузионным слоем мембраны, после чего продукт контактирования указанной смеси с каталитически активным слоем подвергают упариванию для удаления непрореагировавшего спирта с получением целевого биодизельного топлива, а продукт контактирования воды с диффузионным слоем разделяют на воду и глицерин.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении гетерогенных биокатализаторов для процессов биокаталитической трансформации органических соединений.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен иммобилизованный биокатализатор для получения фумаровой кислоты.

Изобретение относится к синтетическому носителю для иммобилизации микроорганизмов. Описана композиция для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта для иммобилизации микроорганизмов, состоящая из поливинилового спирта и катализатора сшивки церий-аммоний нитрата, отличающаяся тем, что исходные компоненты взяты в мольном соотношении ПВС:(NH4)2Се(NO3)6 (160-110):(1-1,3).

Группа изобретений относится к медицине, а именно к терапевтическому лечению подагры и предупреждению сопутствующих побочных реакций и осложнений у пациентов. Способ предупреждения и прогноз риска инфузионных реакций при внутривенном введении ПЭГилированной уриказы пациентам с подагрой заключается в определении содержания мочевой кислоты в сыворотке крови пациента с последующим указанием на прекращение терапии на уровне примерно 4 мг/дл.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo.

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ.

Изобретение относится к способам получения полиакриламидного гидрогеля, который может быть использован в области сельского хозяйства, в медицине, косметологии, для очистки нефтяных трубопроводов и для создания предметов гигиены.

Настоящее изобретение относится к присадочной композиции для контроля и ингибирования полимеризации винилароматических мономеров. Описана улучшенная присадочная композиция на аминной основе для контроля и ингибирования полимеризации винилароматических мономеров, включая стирол, содержащая: (A) один или более хинонметид или его производные (QM), (B) одно или более фенольное соединение, и вышеупомянутая композиция отличается тем, что она дополнительно содержит: (C) по меньшей мере один амин, включая алифатический третичный амин, содержащий группу -ОН в алкильной цепи; причем хинонметид или его производные (QM) включает бензилхинонметид, предпочтительно 4-бензилиден-2,6-ди-трет-бутилциклогекса-2,5-диенон; причем фенольное соединение содержит 2,6-ди-трет-бутилфенол (2,6-DTBP), бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ) или их смесь и причем алифатический третичный амин включает триизопропаноламин или трис(2-гидроксипропил)амин (TIPA), N,N,N',N'-тетракис(2-гидроксиэтил)этилендиамин (THEED), N,N,N',N'-тетракис(2-гидроксипропил)этилендиамин (Quadrol®) или их смесь.

Изобретение относится к установке предварительного образования катализатора олигомеризации этилена. Описана установка предварительного образования катализатора олигомеризации этилена, содержащая:первую емкость с первым впускным отверстием для газа, содержащую раствор сокатализатора и модификатора; вторую емкость с вторым впускным отверстием для газа, содержащую соединение хрома и лиганд; смеситель, соединенный трубопроводами с первой и второй емкостями, причем каждый трубопровод имеет клапан-регулятор расхода, который независимо представляет собой тепловой массовый расходомер или расходомер Кориолиса; причем смеситель соединен посредством трубопровода, имеющего клапан-регулятор расхода, с реактором олигомеризации; причем каждое впускное отверстие для газа соединено с первой емкостью и со второй емкостью, и причем первая емкость, вторая емкость, смеситель и клапаны-регуляторы расхода, по меньшей мере частично находятся в корпусе с регулируемой температурой; причем клапаны-регуляторы расхода независимо представляют собой тепловой массовый расходомер или расходомер Кориолиса.

Предложены способ отверждения полимерной композиции клеев с применением микроволн и способ прикрепления термопластичного материала. Полимерная композиция клея, отверждаемая с применением микроволн, содержит ионную жидкость [A]+a[B]a-, при этом [A]+ представляет собой катион, а [B]a- представляет собой анион, и a представляет собой целое число.

Изобретение относится к области химии полимеров, а именно к получению макропористых полимерных материалов, которые могут быть использованы при устранении разливов нефтепродуктов с водной поверхности.

Способ управления суспензионной полимеризацией для получения полиэтилена. Полиэтилен получают в каскаде реакторов полимеризации реакцией катализатора Циглера, этилена и либо водорода, либо, в качестве сомономера(ов), одного или нескольких С3-С10 альфа-олефинов, или водорода и одного или нескольких С3-С10 альфа-олефинов при температуре 60-95°С и при давлении 0,15-3 МПа.

Изобретение относится к химической промышленности, в частности к автоматическим системам регулирования, и может быть использовано для поддержания температуры реакционной массы химических реакторов–полимеризаторов.

Изобретение относится к способу получения полиэтилена низкой плотности. Способ полимеризации или сополимеризации этиленненасыщенных мономеров проводят при давлении 110-500 МПа и температуре 100-350°С в производственной линии.
Изобретение относится к составу полимера этилена и его использованию для производства изделий, например кабельной оболочки и пластиковых деталей автомобилей. Состав полимера этилена содержит: А) 25-75 мас.% полимера этилена, выбранного из гомополимеров (А1) этилена, сополимеров этилена (А2) с содержанием не более 10 мас.% одного или нескольких олефиновых сомономеров и смесей указанных гомополимеров и сополимеров, и B)25-75 мас.% сополимера этилена и пропилена, содержащего от 45 до 70 мас.% этилена.

Настоящее изобретение касается применения гелеобразной полимерной композиции в композициях для машинного мытья посуды. Предложено применение гелеобразной полимерной композиции, получаемой способом, при котором: a) предоставляют мономерную композицию, которая состоит из акриловой кислоты или акриловой кислоты и по меньшей мере одной другой α,β-этиленненасыщенной кислоты, выбранной из карбоновых кислот, сульфоновых кислот, фосфоновых кислот и их смесей, причем мономерная композиция свободна от мономеров со сшивающим действием, которые содержат две или больше двух способных к полимеризации α,β-этиленненасыщенных двойных связей на каждую молекулу; b) предоставленную на стадии а) мономерную композицию подвергают радикальной полимеризации в присутствии по меньшей мере одного простого полиэфирного компонента, который выбран из простых полиэфироспиртов со среднечисленной молекулярной массой по крайней мере 200 г/моль и их простых моно- и диалкиловых эфиров с 1-6 атомами углерода в алкиле, поверхностно-активных веществ, содержащих простые полиэфирные группы, и их смесей, причем радикальную полимеризацию на стадии b) дополнительно осуществляют в присутствии растворителя, который выбран из воды, алкановых спиртов с 1-6 атомами углерода, отличающихся от простого полиэфирного компонента полиолов, их простых моно- и диалкиловых эфиров и их смесей, в композициях для машинного мытья посуды.
Настоящее изобретение относится к области получения твердых синтетических гранулированных неорганических адсорбентов. Способ включает в приготовление гетерогенной композиции на основе водного раствора кристаллогидрата метасиликата натрия и твердого хлорида цезия.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает получение гемосорбента путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-0,9 мас. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7,0-10,0 мас. акриламида и 0,5-1,1 мас. N,N-метиленбисакриламида в присутствии 0,01-0,08 мас. модифицирующей добавки - гирудина, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты с получением гидрогеля. Полученный гидрогель измельчают и промывают его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений. Изобретение позволяет повысить тромборезистентность гемосорбента. 1 табл., 10 пр.

Наверх