Способ выявления и количественной оценки содержания днк u. diversum методом пцр в реальном времени в материале от взрослого крупного рогатого скота



Способ выявления и количественной оценки содержания днк u. diversum методом пцр в реальном времени в материале от взрослого крупного рогатого скота
Способ выявления и количественной оценки содержания днк u. diversum методом пцр в реальном времени в материале от взрослого крупного рогатого скота
G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2683029:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) (RU)

Изобретение относится к области ветеринарии, микробиологии и биотехнологии. Предложен способ выявления и количественной оценки содержания ДНК U. diversum в материале от взрослого крупного рогатого скота (КРС). Одновременно проводят две реакции ПЦР в реальном времени, причем одна с праймерами к фрагменту гена 16S рРНК метилтрансферазы U. diversum, а вторая к фрагменту гена GAPDH быка домашнего (Bos taurus), с последующим анализом соотношения содержания ДНК U. diversum и ДНК быка домашнего. При значениях соотношения больше нуля и меньше единицы делают вывод об активном инфекционном процессе U. diversum. При значениях больше единицы делают вывод о вялотекущей инфекции или носительстве. Изобретение обеспечивает повышение специфичности и точности диагностики уреалазмоза КРС. 1 табл.

 

Изобретение относится к области ветеринарии, микробиологии и биотехнологии может быть использовано для диагностики заболеваний человека и животных вирусной, бактериальной и др. этиологии.

Известен способ выявления и количественной оценки содержания ДНК U. diversum, заключающийся в постановке ПЦР в реальном времени с праймерами к гену 16S рРНК U. diversum с последующей оценкой содержания ДНК U. diversum в пробе. Количественная оценка в данном случае проводится путем сравнения порогового цикла детекции продуктов ПЦР с калибровочного графика. (Marques L.M., Amorim А.Т., Martins Н.В. et al. A quantitative TaqMan PCR assay for the detection of Ureaplasma diversum // Vet Microbiol. - 2013. - V. 167. N. 3-4. - P. 670-674).

Недостатками вышеизложенного способа количественной оценки содержания ДНК U. diversum являются:

- отсутствие внутреннего контроля качества препарата ДНК;

- отсутствие учета концентрации клеток крупного рогатого скота в исходном препарате, который позволяет сделать вывод о тяжести инфекции U. diversum.

Изобретение направлено на разработку способа выявления и количественной оценки содержания ДНК U. diversum методом ПЦР в реальном времени в материале, при этом обеспечено повышение точности количественной оценки содержания ДНК U. diversum в исследуемом препарате ДНК и возможность осуществления контроля качества исследуемого материала одновременно с проведением диагностического исследования.

Повышение точности обеспечено за счет учета концентрации ДНК клеток крупного рогатого скота в образце, отражающего его подлинность и качество отбора материала.

Способ предусматривает отбор клинического материала и постановку ПЦР в реальном времени с праймерами U. diversum с последующей оценкой содержания ДНК U. diversum в пробе.

В отличие от прототипа отбор клинического образца осуществляют от коровы со слизистой оболочки нижнего свода влагалища с захватом области ямки клитора и областей локализации пузырьковой сыпи при ее наличии, хранение в транспортной питательной среде, представляющей собой среду "УРЕАПЛАЗМА-СРЕДА". Одновременно проводят две реакции ПЦР в реальном времени, причем одна с праймерами к фрагменту гена 16S рРНК метилтрансферазы U. diversum, а вторая к фрагменту гена GAPDH быка домашнего (Bos taurus) с последующим анализом соотношения содержания ДНК U. diversum и ДНК быка домашнего, оцениваемым на основании соотношения пороговых циклов выявления продукта ПЦР в первой и второй реакции, при значениях соотношения больше нуля и меньше единицы делают вывод об активном инфекционном процессе U. diversum, при значениях больше единицы делают вывод о вялотекущей инфекции или носительстве.

Значения пороговых циклов определяются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Цикл, на котором наблюдается пересечение кривой флуоресценции на соответствующем с пороговой линией соответствует пороговому циклу детекции ДНК в образце.

«УРЕАПЛАЗМА-СРЕДА» выпускается ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, ее состав описан в патенте РФ 2568062.

Способ реализуется следующим образом: при постановке ПЦР в реальном времени используется смесь праймеров и зондов с флуоресцентными метками к гену 16S рРНК метилтрансферазы U. diversum и к гену GAPDH домашнего быка (Bos taurus). Реакция проводится с одновременной детекцией накопления продукта. После завершения реакции оцениваются следующие показатели: цикл ПЦР на котором происходит детектируемое накопление продукта реакции (пороговый цикл) детекции продукта реакции с праймерами и зондом к гену 16S рРНК метилтрансферазы U. diversum, пороговый цикл реакции с праймерами и зондом к гену GAPDH домашнего быка. Путем сравнения со стандартными образцами проводится оценка абсолютного содержания ДНК U. diversum и быка домашнего в исследуемом образце. Путем расчета соотношения двух этих показателей оценивается относительное содержание ДНК U. diversum в исследуемом образце, отражающее инфекционную нагрузку. На основе оценки накопления продукта реакции с праймерами и зондом к гену GAPDH домашнего быка осуществляется контроль качества исследуемого образца (препарата ДНК) и принимается решение о достоверности полученного результата. Положительным результатом считается присутствие накопления продукта ПЦР на матрице ДНК U. diversum, детектируемое до 40 цикла.

Для доказательства возможности промышленного использования изобретения были проведены исследования, описанные ниже.

У 32 коров с симптоматикой, характеризующейся наличием мелкой сыпи в области наружных половых органов без симптомов респираторных заболеваний. С целью исследования были взяты мазки с поверхности слизистых оболочек носовой полости (32 образца), преддверия влагалища (27 образцов) и влагалища (31 образец), всего 92 образца. Материал отбирался с помощью зондов. Для забора мазка из носовой полости зонд вводился на глубину 12-14 см. Забор мазка из преддверия влагалища проводился в области нижнего свода влагалища из ямки клитора.

Полученные образцы были исследованы на предмет носительства U. diversum с помощью предложенного метода. Результаты представлены в таблице №1.

При постановке ПЦР в реальном времени с праймерами к гену 16S рРНК метилтрансферазы U. diversum и к гену GAPDH быка домашнего, анализ графиков накопления продукта ПЦР для количественной оценки содержания ДНК U. diversum позволил выявить ДНК U. diversum в 18 образцах, анализ графиков накопления продукта ПЦР для количественной оценки содержания ДНК быка домашнего позволил выявить ДНК быка домашнего в 88 образцах. На основании выявления ДНК U. diversum установлено наличие патогена в 18 образцах. На основании выявления ДНК быка домашнего в дальнейший анализ было включено 88 образцов. 2 образца, не содержащих ДНК быка домашнего (2,17%) были признаны нерепрезентативными и исключены из исследования. В обоих образцах ДНК U. diversum выявлено не было, таким образом было исключено два ложноотрицательных результата. Пороговые циклы реакции представлены в табл. 1. Помимо этого была проведена реакция ПЦР с контрольными положительным и контрольным отрицательным образцами (ПКО и ВКО). В ПКО было установлено накопление продуктов ПЦР на матрице обоих мишеней, в ОКО результат реакции был отрицательным, что позволяет расценивать полученные данные как достоверные.

Анализ соотношения содержания ДНК U. diversum и быка домашнего, рассчитанный на основании значений пороговых циклов (ДНК U. diversum/быка домашнего) показал значения от 1,32 до 0,84 (табл. 1). Значения в диапазоне от 0 до 1 характерны для случаев, когда содержание уреаплазм в образце превышает содержание клеток хозяина. Более высокие значения соотношения пороговых циклов характерны для случаев, когда число уреаплазм меньше числа клеток. На основании анализа установлено, что в 9 образцах от 8 коров содержание уреаплазм выше, чем содержание клеток животного.

*"-" - образец отсутствует.

Учет содержания клеток животного (быка домашнего) образца при оценке инфекционной нагрузки U. diversum заключается в том, что в исследуемой пробе проводится количественная оценка содержания ДНК быка домашнего. Содержание ДНК быка домашнего в пробе отражает количество клеток в образце. Расчет соотношения содержания ДНК U. diversum и ДНК быка домашнего позволяет оценить инфекционную нагрузку, что может иметь значение при дифференциации носительства и инфекционного процесса.

Возможность контроля качества исследуемого препарата ДНК при идентификации носительства и тяжести инфекционного процесса достигается за счет проведения ПЦР в реальном времени для выявления ДНК быка домашнего. В биологическом, клиническом и патологическом материале от крупного рогатого скота всегда присутствует ДНК животного, от которого взят материал. Отсутствие ДНК быка домашнего в исследуемом препарате ДНК свидетельствует о нарушении процедуры взятия, обработки и хранения исследуемых образцов или их фальсификации. При отсутствии накопления продукта ПЦР в данной реакции результат исследования считается недостоверным. Это позволяет снизить частоту ложноотрицательных ответов и повысить специфичность и точность диагностической реакции при постановке клинико-эпизоотологического диагноза.

Способ выявления и количественной оценки содержания ДНК U. diversum методом ПЦР в реальном времени в материале от взрослого крупного рогатого скота, предусматривающий отбор клинического материала и постановку ПЦР в реальном времени с праймерами U. diversum с последующей оценкой содержания ДНК U. diversum в пробе, отличающийся тем, что отбор клинического образца осуществляют от коровы со слизистой оболочки нижнего свода влагалища с захватом области ямки клитора и областей локализации пузырьковой сыпи при ее наличии, хранение и транспортирование материала осуществляют в транспортной питательной среде, представляющей собой среду "УРЕАПЛАЗМА-СРЕДА", одновременно проводят две реакции ПЦР в реальном времени, причем одна с праймерами к фрагменту гена 16S рРНК метилтрансферазы U. diversum, а вторая к фрагменту гена GAPDH быка домашнего (Bos taurus), с последующим анализом соотношения содержания ДНК U. diversum и ДНК быка домашнего, оцениваемым на основании соотношения пороговых циклов выявления продукта ПЦР в первой и второй реакции, при значениях соотношения больше нуля и меньше единицы делают вывод об активном инфекционном процессе U. diversum, при значениях больше единицы делают вывод о вялотекущей инфекции или носительстве.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития ишемического инсульта. У индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, выделяют ДНК из венозной крови и проводят анализ полиморфизмов генов цитокинов rs1061624 TNFR2 и rs767455 TNFR1.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития гипертонической болезни. У индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, выделяют ДНК из периферической венозной крови и проводят анализ полиморфизмов генов цитокинов rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFА.

Изобретение относится к области медицины, молекулярной биологии и микробиологии. Предложен способ определения генетических детерминант резистентности возбудителя туберкулеза к бедаквилину и линезолиду, включающий мультиплексную амплификацию генов Rv0678, atpE, 23S рРНК, rplC, обеспечение олигонуклеотидного микрочипа для установления наличия/отсутствия точечных мутаций, инсерций, делеций в указанных генах, гибридизацию амплифицированных флуоресцентно-меченных продуктов на олигонуклеотидном микрочипе и регистрацию результатов гибридизации.

Изобретение относится к области микробиологии и предназначено для идентификации дрожжей рода Pichia. Осуществляют предварительное обогащение дрожжей, осаждение их центрифугированием, выделение ДНК с проведением ПЦР в реальном времени.

Предложенная группа изобретений относится к области молекулярной биологии и медицины. Предложены способ и набор праймеров и зондов для идентификации иммуногенных несоответствий ДНК в парах донор - реципиент.

Предложенная группа изобретений относится к области молекулярной биологии и медицины. Предложены способ и набор праймеров и зондов для идентификации иммуногенных несоответствий ДНК в парах донор - реципиент.

Изобретение относится к области генетики, молекулярной биологии и медицины. Предложен способ выявления соматических мутаций Q209P (с.

Изобретение относится к области генетики, молекулярной биологии и медицины. Предложен способ выявления соматических мутаций Q209P (с.

Изобретение относится к области генетики, молекулярной биологии и медицины. Предложен способ выявления соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT.

Изобретение относится к области генетики, молекулярной биологии и медицины. Предложен способ выявления соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству, и предназначено для прогнозирования преждевременных родов. Используя показатели концентрации общего количества внеклеточной ДНК (овДНК) и концентрации IL-8 в плазме периферической крови у беременных женщин на 22-36 неделях гестации, определяют переменную Р.
Изобретение относится к медицине, гинекологии и может быть использовано в лечении пациенток с пролапсом гениталий при недифференцированной дисплазии соединительной ткани.

Изобретение относится к способу определения свинца(II) в водных объектах окружающей среды и биологических образцах. Способ включает приготовление полимерной сенсорной пленки, которую помещают в испытуемый образец и по изменению цвета полимерной сенсорной пленки определяют наличие в нем свинца(II), количество которого определяют по калиброванной цветовой шкале, предварительно полученной из не менее 5-ти испытуемых образцов с известными концентрациями свинца.

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано для тестирования жидкой пробы. Заявлен блок носителя реагентов, представляющий собой картридж сосудов или микропланшет, имеющий множество реакционных сосудов, содержащий соединительную часть для обеспечения разъемного соединения с соединительной частью (18) пипетирующей руки средств пипетирования лабораторного робота (1) для разъемного соединения пипетирующего наконечника.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и представляет собой способ оценки эффективности нейроретинопротективного лечения первичной открытоугольной глаукомы с применением препарата Ретиналамина, включающий определение содержания нейронспецифической энолазы (neuron specific enolase или NSE) в слезной жидкости, согласно изобретению ее определяют до и после лечения и при снижении содержания NSE не менее чем на 20% от исходного показателя результат нейроретинопротекции оценивают как эффективный.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для оценки эффективности нейроретинопротекции первичной открытоугольной глаукомы.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для оценки эффективности нейроретинопротекции первичной открытоугольной глаукомы.

Изобретение относится к медицине, а именно к области диагностики онкогематологических заболеваний, и может быть использовано для дифференциальной диагностики острых лейкозов.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно способу контроля инкубации птичьего эмбриона в яйце для получения выборки яиц путем определения пола, стадии развития и/или жизнеспособности птичьего эмбриона.

Изобретение относится к области медицины, а именно педиатрии, кардиологии, и представляет собой способ диагностики поражения сердца при инфекционных заболеваниях у детей и подростков путем оценки электрокардиографических показателей, отличающийся тем, что определяют атриовентрикулярное проведение в соотношении с частотой сердечных сокращений в перцентилях и маркеры инфекционных заболеваний: при выявлении PQ>75 перцентиля для исключения скрытых нарушений АВ-проводимости проводят нагрузочные пробы или холтеровское мониторирование ЭКГ с определением PQ на различных ЧСС и при постоянной атриовентрикулярной блокаде I степени, выявленных скрытых нарушениях атриовентрикулярной проводимости и маркерах острого или перенесенного инфекционного заболевания диагностируют инфекции-ассоциированное поражение проводящей системы сердца.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования безметастатической выживаемости у больных раком молочной железы.

Изобретение относится к области ветеринарии, микробиологии и биотехнологии. Предложен способ выявления и количественной оценки содержания ДНК U. diversum в материале от взрослого крупного рогатого скота. Одновременно проводят две реакции ПЦР в реальном времени, причем одна с праймерами к фрагменту гена 16S рРНК метилтрансферазы U. diversum, а вторая к фрагменту гена GAPDH быка домашнего, с последующим анализом соотношения содержания ДНК U. diversum и ДНК быка домашнего. При значениях соотношения больше нуля и меньше единицы делают вывод об активном инфекционном процессе U. diversum. При значениях больше единицы делают вывод о вялотекущей инфекции или носительстве. Изобретение обеспечивает повышение специфичности и точности диагностики уреалазмоза КРС. 1 табл.

Наверх