Стероидное соединение для применения в лечении печеночной энцефалопатии

Группа изобретений относится к области медицины, в частности к применению соединения 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим или его фармацевтически приемлемой соли, а также к способу лечения печеночной энцефалопатии. Группа изобретений относится к применению соединения 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения печеночной энцефалопатии. Также описан способ лечения печеночной энцефалопатии, включающий введение фармацевтически эффективного количества 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, нуждающемуся в таком введении. Группа изобретений позволяет селективно ингибировать положительную модуляцию рецептора GABA_A эндогенными стероидами при введении 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима, а также 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим способен оказывать положительный эффект в отношении моторного и когнитивного нарушения при печеной энцефалопатии. 2 н. и 26 з.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл., 13 пр.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к соединению для применения в лечении печеночной энцефалопатии.

Предшествующий уровень техники

Печеночная энцефалопатия (НЕ) представляет собой серьезное нейропсихиатрическое и нейрокогнитивное осложнение при остром и хроническом заболевании печени. НЕ представляет собой важную и растущую проблему здравоохранения вследствие значительной и увеличивающейся распространенности хронического заболевания печени. НЕ характеризуется нарушениями цикла сна-бодрствования, познавательной способности, памяти, обучения, моторной координации, сознания, снижением энергичности и изменениями личности, и находится в диапазоне от минимальной НЕ (МНЕ) до клинически выраженной НЕ (ОНЕ). МНЕ проявляется когнитивным нарушением и обладает неблагоприятными эффектами в отношении связанного с состоянием здоровья качества жизни и способностью реализовывать сложные задачи, такие как вождение автотранспорта. Кроме того, ОНЕ клинически проявляется умственными и моторными расстройствами, и симптомы находятся в диапазоне от дезориентации до седативного действия и комы.

Природные стероиды подвергаются интенсивному метаболизму и, как правило, не подходят для перорального введения. Метаболиты эндогенных стероидных гормонов прегненолон, прогестерон, дезоксикортикостерон, кортизон и кортизол, известные как прегнанолоны, а также метаболиты тестостерона, андростендион и дегидроэпиандростерон, были подвергнуты различным исследованиям, по меньшей мере частично выявившим их роль в неврологической сигнальной системе у млекопитающих. Стероидные метаболиты вызывают симптомы в ЦНС (центральной нервной системе) и расстройства, и стероиды действуют в качестве положительных модуляторов в отношении комплекса рецептор гамма-аминомасляной кислоты-переносчик хлорид-ионов (GABA_A-R) и, таким образом, называются стероидами, модулирующими рецептор GABA_A (GAMS).

Было продемонстрировано, что некоторые стероиды представляют собой специфические усилители рецептора GABA_A. Примеры этих стероидов также можно обнаружить в WO 2008/063128. Некоторые из этих стероидов являются сильными и, например, показано, что они обладают способностью вызывать амнезию, седативное действие и анестезию в фармакологической дозе. В WO 99/45931 и WO 03/059357 раскрыты антагонистические действия стероидов. Wang et al. 2000 (Acta Physiol Scand 169, 333-341) и Wang et al. 2002 (J Neurosci 22(9):3366-75) раскрыли антагонистические действия 3β-ОН-5α-прегнан-20-она и других 3β-ОН-5α/β прегнановых стероидов. В WO 2006/056794 и WO 2010/144498 раскрыто применение соединений для лечения декомпенсации печени, печеночной энцефалопатии и портальной гипертензии. Существует потребность в новых и эффективных способах терапевтического лечения печеночной энцефалопатии и связанных с ней расстройств.

Описание изобретения

В настоящем изобретении предложено соединение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим

или его фармацевтически приемлемая соль для применения в лечении печеночной энцефалопатии.

3α-Этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим относится к классу соединений, известных как стероидные антагонисты, модулирующие рецептор GABA_A (GAMSA).

Авторы изобретения обнаружили, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим способен селективно ингибировать положительную модуляцию рецептора GABA_A эндогенными стероидами, такими как аллопрегнанолон и тетрагидродезоксикортикостерон (THDOC). Эти стероиды, как известно, вызывают седативное действие, когнитивное нарушение и двигательные расстройства, и их концентрация в головном мозге увеличивается у пациентов, страдающих от вызванной заболеванием печени гипераммониемии и НЕ.

Тем не менее, авторы изобретения также обнаружили, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим не оказывает антагонистического действия в отношении действия гамма-аминомасляной кислоты (GABA) на рецепторы GABA_A. Эта неожиданная избирательность благоприятна с точки зрения безопасности, поскольку ингибирование связывания GABA с рецепторами GABA_A может привести к побочным действиям, включая конвульсии.

Кроме того, 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он действует в отношении подтипов рецептора GABA_A как α1, так и α5, и, таким образом, способен оказывать положительный эффект как при моторном, так и когнитивном нарушении, и седативные эффекты, которые являются результатом сверхактивации рецепторов GABA_A. Положительный эффект 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в отношении моторного и когнитивного нарушения проиллюстрирован на двух животных моделях НЕ (гипераммониемия и анастомоз между воротной и полой веной у крыс, смотри ниже).

В отличие от существующих способов лечения НЕ, 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он не влияет на уровни аммиака in vivo. Таким образом, также существует явный потенциал к его комплементарному применению в терапии.

Соответственно, существует хорошая основа для того, чтобы предположить, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим особенно хорошо подходит для лечения НЕ и связанных расстройств.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 демонстрирует, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим не влияет на уровни аммиака в крови. Значения представляют собой среднее значение ± SEM (стандартная ошибка среднего) для 12 крыс на группу, где значения, значимо отличающиеся от контролей, обозначены звездочками; ***, р<0,001. CV = контрольные крысы, обработанные разбавителем; HAV = крысы с гипераммониемией, обработанные разбавителем; HA+GAM = крысы с гипераммониемией, обработанные 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксимом.

Фиг. 2 демонстрирует, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим восстанавливает пространственное обучение у крыс с гипераммониемией в радиальном лабиринте. На Фигуре продемонстрированы рабочие ошибки в радиальном тесте. Рабочие ошибки в блоке 1. Значения представляют собой среднее значение ± SEM для 8 крыс на группу. # р<0,05 по сравнению с HAV. CV = контрольные крысы, обработанные разбавителем; HAV = крысы с гипераммониемией, обработанные разбавителем; HA+GAM = крысы с гипераммониемией, обработанные 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксимом.

Фиг. 3 демонстрирует, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим в тесте водного лабиринта Морриса восстанавливает специальную память у крыс с гипераммониемией. На Фигуре продемонстрировано время для нахождения платформы в первом испытании на 3 сутки. Значения представляют собой среднее значение ± SEM для 8 крыс на группу. HAV по сравнению с CV р = 0,052. CV = контрольные крысы, обработанные разбавителем; HAV = крысы с гипераммониемией, обработанные разбавителем; HA+GAM = крысы с гипераммониемией, обработанные 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксимом.

Фиг. 4 демонстрирует, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим восстанавливает моторную координацию у крыс с гипераммониемией. Значения представляют собой среднее значение ± SEM для 15 крыс на группу. Значения, значимо отличающиеся от CV, обозначены *, р<0,05, значения, значимо отличающиеся от HAV, обозначены ###, р<0,001. CV = контрольные крысы, обработанные разбавителем; HAV = крысы с гипераммониемией, обработанные разбавителем; HA+GAM = крысы с гипераммониемией, обработанные 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксимом.

Фиг. 5 демонстрирует общие концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима в плазме крови. Общие концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима в плазме крови у контрольных и крыс с гипераммониемией через 4 и 23 часа после подкожной инъекции 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима на пятые сутки и в течение последней недели обработки с суточными инъекциями. НА = гипераммониемические животные.

На Фиг. 6 представлены не связанные* концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима в головном мозге контрольных и крыс с гипераммониемией через 1-2 часа после подкожной (s.c.) инъекции 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима после семи суток с суточными инъекциями 20 мг/кг.

Несвязанная концентрация в головном мозге = фракция 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима в головном мозге, которая не связана с белком-носителем или тканью головного мозга.

На Фиг. 7 представлены репрезентативные электрофизиологические измерения, демонстрирующие усиленную тетрагидродезоксикортикостероном (THDOC) активацию рецепторов α1β2γ2L GABA_A. Клетки HEK-293, экспрессирующие человеческие рецепторы α1β2γ2L GABA_A, подвергали воздействию 30 мкМ GABA или 30 мкМ GABA с 100 нМ THDOC в течение 40 мс. Для THDOC производили предварительную инкубацию в течение 20 с до применения THDOC + GABA.

На Фиг. 8 представлены репрезентативные электрофизиологические измерения, демонстрирующие антагонистическое действие 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она (GAMSA) в отношении усиленной THDOC активации рецепторов α1β2γ2L и α5β3γ2L GABA_A и отсутствие ингибирования GABA. А) антагонистическое действие 1 мкМ 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в отношении усиленной 100 нМ THDOC активации 30 мкМ GABA для рецептора α1β2γ2L GABA_A, В) 1 мкМ 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он не оказывает антагонистического действия в отношении активации 30 мкМ GABA рецептора α1β2γ2L GABA_A, С) антагонистическое действие 1 мкМ 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в отношении усиленной 200 нМ THDOC активации 0,3 мкМ GABA для рецептора α5β3γ2L GABA_A; свидетельствуя об антагонистическом действии THDOC, D) 1 мкМ 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он не оказывает антагонистического действия в отношении активации 0,3 мкМ GABA рецептора α5β3γ2L GABA_A.

Фиг. 9 иллюстрирует способность 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она восстанавливать моторную координацию у крыс с гипераммониемией и крыс PCS. Моторную координацию оценивали с использованием теста прохождения по бревну. (А) демонстрирует данные для контрольных крыс (CV) или крыс с гипераммониемией (HAV), обработанных разбавителем, и для крыс с гипераммониемией, обработанных 3 (НА3), 10 (НА10) или 20 (НА20) мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она. (В) демонстрирует данные для контрольных крыс с ложной операцией (SM) или крыс PCS, обработанных разбавителем, и для крыс PCS, обработанных 0,7 (PCS0.7) или 2,5 (PCS2.5) мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она. Значения представляют собой среднее значение ± SEM количества крыс, указанное под каждым столбцом. Значения, значимо отличающиеся от контрольных крыс или крыс с ложной операцией, обозначены звездочками. Значения, значимо отличающиеся от крыс с гипераммониемией или крыс PCS, обработанных разбавителем, обозначены "а". * р<0,05; а р<0,05; аа р<0,01; ааа р<0,001.

Фиг. 10 иллюстрирует способность 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она восстанавливать пространственную память в водном лабиринте Морриса у крыс с гипераммониемией и крыс PCS. Память пространственного обучения в водном лабиринте Морриса оценивали у контрольных (CV) крыс или крыс с гипераммониемией (HAV), обработанных разбавителем, и у крыс с гипераммониемией, обработанных 3 (НА3), 10 (НА10) или 20 (НА20) мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она (А, В) и у контрольных крыс с ложной операцией (SM) или крыс PCS, обработанных разбавителем, и у крыс PCS, обработанных 0,7 (PCS0.7) или 2,5 (PCS2.5) мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она (C, D). (А, С) Латентности спасения (в секундах) для достижения платформы во время различных раундов. (B, D) Время, проведенное (%) в правильном квадранте во время теста памяти. Значения представляют собой среднее значение ± SEM для количества крыс, указанные под каждым столбцом. Значения, значимо отличающиеся от контрольных крыс или крыс с ложной операцией, обозначены звездочками. Значения, значимо отличающиеся от крыс с гипераммониемией или крыс PCS, обработанных разбавителем, обозначены "а". * р<0,05; а р<0,05.

Фиг. 11 иллюстрирует способность 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она восстанавливать пространственное обучение в радиальном лабиринте у крыс с гипераммониемией и крыс PCS. Пространственное обучение в радиальном лабиринте оценивали у контрольных (CV) крыс или крыс с гипераммониемией (HAV), обработанных разбавителем, и у крыс с гипераммониемией, обработанных 3 (НА3), 10 (НА10) или 20 (НА20) мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она (А, В), и у контрольных крыс с ложной операцией (SM) или крыс PCS, обработанных разбавителем, и у крыс PCS, обработанных 0,7 (PCS0.7) или 2,5 (PCS2.5) мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она (C, D). (А, С) Рабочие ошибки во время различных раундов. (B, D) Рабочие ошибки в течение 1-2 суток. Значения представляют собой среднее значение ± SEM для количества крыс, указанные под каждым столбцом. Значения, значимо отличающиеся от контрольных крыс или крыс с ложной операцией, обозначены звездочками. Значения, значимо отличающиеся от крыс с гипераммониемией или крыс PCS, обработанных разбавителем, обозначены "а". * р<0,05; а р<0,05; аа р<0,01.

Фиг. 12 иллюстрирует способность 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она увеличивать спонтанную моторную активность в течение ночи и частично восстанавливать циркадный ритм у крыс PCS. Моторную активность оценивали у контрольных крыс с ложной операцией (SM) или крыс PCS, обработанных разбавителем или 0,7 (PCS0.7) или 2,5 (PCS2.5) мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она. Моторная активность в течение каждого часа представлена на А; отношение активности в течение ночи и в течение дня на В, и общая активность в течение дня или ночи на С. Свет выключали в 7:00 утра. Значения представляют собой среднее значение ± SEM для 8 крыс на группу. Значения, значимо отличающиеся от крыс SM, обозначены звездочками; * р<0,05; ** р<0,01; *** р<0,001. Значения, значимо отличающиеся от крыс PCS, обозначены а; а р<0,05.

Фиг. 13 иллюстрирует способность этинил-3β-гидроксиандростан-17-она нормализовать вертикальную активность в течение дня и частично восстанавливать циркадный ритм у крыс PCS. Эксперимент осуществляли как описано для Фиг. 12, но представлено число вертикальных отсчетов. Значения представляют собой среднее значение ± SEM для 8 крыс на группу. Значения, значимо отличающиеся от крыс SM, обозначены звездочками; * р<0,05; ** р<0,01; *** р<0,001. Значения, значимо отличающиеся от крыс PCS, обозначены а; а р<0,05; аа р<0,01.

Фиг. 14 демонстрирует концентрации этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в плазме крови и в головном мозге в момент тестирования поведения у крыс с гипераммониемией и крыс PCS. У А) крыс с гипераммониемией и В) крыс PCS общие концентрации в плазме крови этинил-3β-гидроксиандростан-17-она представлены в мкМ. У С) крыс с гипераммониемией и D) крыс PCS несвязанные концентрации в головном мозге этинил-3β-гидроксиандростан-17-она представлены в нмоль/кг. Следует отметить похожие концентрации в различных крысиных моделях с используемыми дозами у крыс с гипераммониемией 3, 10 и 20 мг/кг/сутки и у крыс PCS 0,7 и 2,5 мг/кг/сутки. Данные приведены для окончания исследования, т.е. после девяти недель ежесуточных обработок этинил-3β-гидроксиандростан-17-оном в кунжутном масле, вводимых один раз в сутки подкожно (s.c).

Перед тем, как настоящего изобретения будет подробно описано, должно быть понятно, что используемая здесь терминология применяется исключительно для задачи описания конкретных воплощений и не предполагается, что она будет ограничивать объем изобретения.

Отмечается, что используемые в данном описании и формуле изобретения формы единственного числа также включают множественные формы, если в контексте ясно не указано иное.

Термин "фармацевтическая композиция" используется в своем самом широком смысле, охватывающем все фармацевтически применимые композиции, содержащие по меньшей мере одно активное вещество и возможные носители, адъюванты, растворители, составляющие и т.п.

Термины "введение" и "способ введения", а также "путь введения" также используются в своем самом широком смысле.

Соединение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим, используемое в соответствии с изобретением, может быть введено множеством путей в зависимости в основном от того, подходит ли локальный, местный или системный способ введения в наибольшей степени для состояния печеночной энцефалопатии, которое лечат. Эти различные способы введения представляют собой, например местный (например, на кожу), локальный (включающий офтальмологическое введение и на различные слизистые оболочки, например вагинальная и ректальная доставка), пероральный, парентеральный или легочный, включающий верхние и нижние дыхательные пути. Приготовление таких композиций и составов в общем известно специалистам в области фармацевтических препаратов и составов и может применяться к составлению композиции по настоящему изобретению.

Под термином "антагонист" понимают вещество, которое мешает другому веществу, агонисту, индуцировать свое действие. В данной заявке на изобретение термины антагонист и блокатор используются взаимозаменяемо.

Под термином "печеночная энцефалопатия тип А" обычно понимают печеночную энцефалопатию, связанную с острой печеночной недостаточностью, обычно связанную с отеком головного мозга.

Под термином "печеночная энцефалопатия тип В" обычно понимают печеночную энцефалопатию (обходной анастомоз), вызванную портосистемным шунтом, не связанную с истинным заболеванием печени.

Под термином "печеночная энцефалопатия тип С" обычно понимают печеночную энцефалопатию, возникающую у пациентов с циррозом - этот тип подразделяют на эпизодическую, хроническую и минимальную энцефалопатию.

Под термином "минимальная печеночная энцефалопатия" обычно понимают печеночную энцефалопатию, которая не приводит к клинически выраженной когнитивной дисфункции, но может быть продемонстрирована при помощи нейрофизиологических исследований.

Под термином "клинически выраженная печеночная энцефалопатия" обычно понимают клинически выраженную печеночную энцефалопатию, проявляющуюся как нейропсихиатрический синдром с широким спектром умственных и моторных расстройств. Клинически выраженная печеночная энцефалопатия может возникать эпизодически в течение периода нескольких часов или суток у пациентов, ранее стабильных, или пациенты могут быть с хроническими нейропсихиатрическими аномалиями.

Под термином "гипераммониемия" как правило понимают метаболическое расстройство, характеризующееся избытком аммиака в крови.

Под термином "пересадка печени" как правило понимают хирургическую процедуру для удаления больной печени вследствие, например острой печеночной недостаточности или цирроза, и замены ее на здоровую печень донора. В большинстве операций по пересадке печени используются печени умерших доноров, но печень может также быть получена у живого донора (часть печени здорового индивида). Пациенты, например, с циррозом обычно испытывают печеночную энцефалопатию, и предоперационная печеночная энцефалопатия представляет собой важный прогностический фактор посттрансплантационных неврологических осложнений.

Под термином "обострение хронической печеночной недостаточности" как правило понимают острую декомпенсацию цирроза, по меньшей мере поражение одного органа, или он относится к подгруппе с высокой степенью смертности в течение короткого периода времени.

Под термином "компенсированный цирроз" как правило понимают цирроз печени без какого-либо клинического проявления, но он может включать бессимптомные варикозные расширения вен пищевода или желудка и ранние симптомы, такие как утомление и упадок сил, потеря аппетита и потеря массы тела, тошнота или боль в животе.

Под термином "декомпенсированный цирроз" как правило понимают запущенный цирроз печени с диапазоном клинических проявлений, таких как желтуха, асцит, отек, печеночная энцефалопатия, желудочно-кишечное кровотечение, портальная гипертензия, бактериальные инфекции или любая их комбинация.

Под термином "портальная гипертензия" как правило понимают градиент давления в печеночной вене после цирроза печени с ассоциированным трансяремным внутрипеченочным портосистемным шунтом (TIPS) или без него.

Под термином "предупреждение" в данном описании изобретения как правило понимают предупреждение возникновения заболевания или расстройства печеночной энцефалопатии.

Под термином "уменьшение интенсивности" в данном описании изобретения как правило понимают уменьшение или избавление от заболевания или расстройства печеночной энцефалопатии.

Пациенты, страдающие печеночной энцефалопатией, могут демонстрировать симптомы, включающие нарушения цикла сна-бодрствования, когнитивной функции, памяти, обучения, моторной координации, сознания, снижение энергичности и изменения личности, когнитивное нарушение, дезориентацию и кому, но не ограничивающиеся ими.

Авторы настоящего изобретения неожиданно продемонстрировали, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим может быть полезен для лечения печеночной энцефалопатии.

В первом аспекте изобретения предложено соединение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим

или его фармацевтически приемлемая соль для применения в лечении печеночной энцефалопатии.

В одном из воплощений изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию тип А.

В еще одном воплощении изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию тип В.

В еще одном воплощении изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию тип С.

В еще одном воплощении изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой минимальную печеночную энцефалопатию.

В еще одном воплощении изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой клинически выраженную печеночную энцефалопатию.

В еще одном воплощении изобретения указанное соединение предназначено для применения, когда указанную печеночную энцефалопатию лечат у пациента с острой печеночной недостаточностью.

В еще одном воплощении изобретения указанное соединение предназначено для применения, когда указанную печеночную энцефалопатию лечат у пациента с хроническим заболеванием печени с обострением хронической печеночной недостаточности или без него.

В еще одном воплощении изобретения указанное соединение для применения предназначено для предупреждения или уменьшения интенсивности печеночной энцефалопатии, такой как печеночная энцефалопатия тип А, печеночная энцефалопатия тип В, печеночная энцефалопатия тип С, минимальная печеночная энцефалопатия, клинически выраженная печеночная энцефалопатия, у пациента с острой печеночной недостаточностью, или у пациента с хроническим заболеванием печени с обострением хронической печеночной недостаточности или без него.

В еще одном воплощении изобретения указанное соединение для применения предоставляют до, во время или после пересадки печени.

В еще одном воплощении изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в лечении печеночной энцефалопатии вместе с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом и/или растворителем.

В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения печеночной энцефалопатии, включающий введение фармацевтически эффективного количества 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима

или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, нуждающемуся в таком введении.

В одном из воплощений изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию тип А.

В еще одном воплощении изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию тип В.

В еще одном воплощении изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию тип С.

В еще одном воплощении изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой минимальную печеночную энцефалопатию.

В еще одном воплощении изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой клинически выраженную печеночную энцефалопатию.

В еще одном воплощении изобретения указанный пациент страдает острой печеночной недостаточностью.

В еще одном воплощении изобретения указанный пациент страдает хроническим заболеванием печени с обострением хронической печеночной недостаточности или без него.

В еще одном воплощении изобретения указанное соединение предоставляют до, во время или после пересадки печени.

В еще одном воплощении изобретения предложен способ предупреждения или уменьшения интенсивности печеночной энцефалопатии, включающий введение фармацевтически эффективного количества 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима

или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, нуждающемуся в таком введении. Указанная печеночная энцефалопатия может представлять собой печеночную энцефалопатию тип А, печеночную энцефалопатию тип В, печеночную энцефалопатию тип С, минимальную печеночную энцефалопатию или клинически выраженную печеночную энцефалопатию. Кроме того, указанное предупреждение могут осуществлять у пациента с острой печеночной недостаточностью или у пациента с хроническим заболеванием печени с обострением хронической печеночной недостаточности или без него.

В еще одном аспекте изобретения предложено соединение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим

или его фармацевтически приемлемая соль для применения в лечении портальной гипертензии. Указанное применение может также представлять собой предупреждение или уменьшение интенсивности портальной гипертензии. Пациент с портальной гипертензией как правило страдает заболеванием печени, таким как хроническое заболевание печени, цирроз или острая печеночная недостаточность.

В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения портальной гипертензии, включающий введение фармацевтически эффективного количества 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима

или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, нуждающемуся в таком введении. Указанный способ может также представлять собой предупреждение или уменьшение интенсивности портальной гипертензии. Пациент с портальной гипертензией как правило страдает заболеванием печени, таким как хроническое заболевание печени, цирроз или острая печеночная недостаточность.

В еще одном аспекте изобретения предложено соединение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим

или его фармацевтически приемлемая соль для применения в лечении декомпенсации печени. Указанное применение может также представлять собой предупреждение или уменьшение интенсивности декомпенсации печени. Пациент с декомпенсацией печени как правило страдает заболеванием печени, таким как хроническое заболевание печени, или может иметь подозрение на наличие провоцирующего события, такого как желудочно-кишечное кровотечение, инфекция, тромбоз портальной вены или обезвоживание.

В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения декомпенсациии печени, включающий введение фармацевтически эффективного количества 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима

или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, нуждающемуся в таком введении. Указанный способ может также применяться при предупреждении или уменьшении интенсивности декомпенсации печени. Пациент с декомпенсацией печени как правило страдает заболеванием печени, таким как хроническое заболевание печени, или может иметь подозрение на наличие провоцирующего события, такого как желудочно-кишечное кровотечение, инфекция, тромбоз портальной вены или обезвоживание.

В еще одном аспекте изобретения предложено применение соединения 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима

или его фармацевтически приемлемой соли в изготовлении лекарственного средства для лечения печеночной энцефалопатии.

В одном из воплощений изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию тип А.

В еще одном воплощении изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию тип В.

В еще одном воплощении изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию тип С.

В еще одном воплощении изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой минимальную печеночную энцефалопатию.

В еще одном воплощении изобретения указанная печеночная энцефалопатия представляет собой клинически выраженную печеночную энцефалопатию.

В еще одном воплощении изобретения указанное применение осуществляют тогда, когда указанную печеночную энцефалопатию лечат у пациента с острой печеночной недостаточностью.

В еще одном воплощении изобретения указанное применение осуществляют тогда, когда указанную печеночную энцефалопатию лечат у пациента с хроническим заболеванием печени с обострением хронической печеночной недостаточности или без него.

В еще одном воплощении изобретения указанное применение осуществляют до, во время или после пересадки печени.

В еще одном воплощении изобретения указанное применение соединения 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима или его фармацевтически приемлемой соли в изготовлении лекарственного средства может предназначаться для предупреждения или уменьшения интенсивности печеночной энцефалопатии, такой как печеночная энцефалопатия тип А, печеночная энцефалопатия тип В, печеночная энцефалопатия тип С, минимальная печеночная энцефалопатия, клинически выраженная печеночная энцефалопатия, у пациента с острой печеночной недостаточностью или у пациента с хроническим заболеванием печени с обострением хронической печеночной недостаточности или без него.

В еще одном воплощении этого аспекта предложена фармацевтическая композиция, содержащая 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в лечении печеночной энцефалопатии вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами и/или растворителями. Указанное применение может также осуществляться при предупреждении или уменьшении интенсивности печеночной энцефалопатии.

Еще один аспект изобретения представляет собой соединение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим

или его фармацевтически приемлемая соль для применения в ингибировании или лечении симптомов, вызванных гипераммониемией.

Еще одно воплощение изобретения представляет собой соединение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим для применения в лечении или предупреждении печеночной энцефалопатии, такой как печеночная энцефалопатия тип А, печеночная энцефалопатия тип В, печеночная энцефалопатия тип С, минимальная печеночная энцефалопатия, клинически выраженная печеночная энцефалопатия, у пациента с острой печеночной недостаточностью или у пациента с хроническим заболеванием печени с обострением хронической печеночной недостаточности или без него; где указанное лечение или предупреждение включает совместное введение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима или его фармацевтически приемлемой соли с соединением, понижающим уровень аммиака, таким как рифаксимин, лактулоза, орнитин фенилацетат и глицерин фенилбутират, предпочтительно соединение, понижающее уровень аммиака, представляет собой рифаксимин или лактулозу, и наиболее предпочтительно соединение, понижающее уровень аммиака, представляет собой рифаксимин.

Еще одно воплощение изобретения представляет собой способ лечения или предупреждения печеночной энцефалопатии, такой как печеночная энцефалопатия тип А, печеночная энцефалопатия тип В, печеночная энцефалопатия тип С, минимальная печеночная энцефалопатия, клинически выраженная печеночная энцефалопатия, у пациента с острой печеночной недостаточностью или у пациента с хроническим заболеванием печени с обострением хронической печеночной недостаточности или без него; где указанное лечение или предупреждение включает совместное введение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима или его фармацевтически приемлемой соли с соединением, понижающим уровень аммиака, таким как рифаксимин, лактулоза, орнитин фенилацетат и глицерин фенилбутират, предпочтительно соединение, понижающее уровень аммиака, представляет собой рифаксимин или лактулозу, и наиболее предпочтительно соединение, понижающее уровень аммиака, представляет собой рифаксимин.

Еще одно воплощение изобретения представляет собой применение соединения 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения печеночной энцефалопатии, такой как печеночная энцефалопатия тип А, печеночная энцефалопатия тип В, печеночная энцефалопатия тип С, минимальная печеночная энцефалопатия, клинически выраженная печеночная энцефалопатия, у пациента с острой печеночной недостаточностью, или у пациента с хроническим заболеванием печени с обострением хронической печеночной недостаточности или без него; где указанное лечение или предупреждение включает совместное введение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима или его фармацевтически приемлемой соли с соединением, понижающим уровень аммиака, таким как рифаксимин, лактулоза, орнитин фенилацетат и глицерин фенилбутират, предпочтительно соединение, понижающее уровень аммиака, представляет собой рифаксимин или лактулозу, и наиболее предпочтительно соединение, понижающее уровень аммиака, представляет собой рифаксимин.

Еще один аспект изобретения представляет собой соединение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим, где один или более чем один атом водорода в каждом возможном положении замещения может быть замещен дейтерием или тритием, для применения в лечении печеночной энцефалопатии, такой как минимальная печеночная энцефалопатия или клинически выраженная печеночная энцефалопатия.

Еще один аспект изобретения представляет собой соединение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим, где один или более чем один атом водорода в каждом возможном положении замещения может быть замещен дейтерием или тритием, для применения в анализах, которые включают определение концентрации соединения в ткани или жидкостях.

В соответствии с настоящим изобретением 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим может быть введен посредством одного из следующих путей введения: внутривенного, назального, ректального, трансбуккального, внутривагинального, чрескожного, внутримышечного и перорального. В соответствии с одним из воплощений 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим вводят внутривенно. В соответствии с другим воплощением 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим вводят назально. Чрескожное введение с использованием 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима, приготовленного в виде крема, геля и мази или в форме адгезивных медицинских пластырей с медленным высвобождением представляет собой еще одну возможную форму введения, подобным образом подходящую для самолечения.

Фармацевтическая композиция может быть адаптирована или скорректирована в соответствии с нормальными фармакологическими процедурами, включающими эффективный фармацевтический препарат в химической форме, подходящей для выбранного пути, вместе с подходящими адъювантами, носителями, растворителями и разбавителями, обычно используемыми и хорошо известными специалисту в данной области техники. Обычно используемые для перорального введения адъюванты и разбавители представляют собой, например, наполнители или суспендирующие агенты, такие как диоксид титана, ангидрид лактозы, диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния, метилцеллюлоза, стерат магния, микрокристаллическая целлюлоза и т.п. Обычно используемые для внутривенного введения адъюванты и разбавители представляют собой, например стерильную воду для инъекций (WFI), стерильные буферы (например раствор, забуферивающий до рН 7,4) раствор альбумина, липидные растворы, циклодекстрины и т.п. Обычно используемые для трансдермального введения адъюванты и разбавители представляют собой, например вазелин, жидкий парафин, глицерин, воду, триглицеридное масло с цепочками средней длины (МСТ), кунжутное масло, растительные масла и т.п. Доза естественно варьирует в зависимости от способа введения, конкретного состояния, которое лечат, или желаемого действия, пола, возраста, массы и здоровья пациента, а также возможных других факторов, оцениваемых лечащим врачом.

Изобретение будет описано при помощи нескольких иллюстративных не ограничивающих объем изобретения примеров.

Пример 1.

Синтез 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима

Стадия 1: Синтез 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она

3,17-Андростандион (5,0 ммоль) растворяли в 50 мл безводного THF (тетрагидрофуран) при комнатной температуре (к.т.) в атмосфере азота. Этинилмагния бромид (1,1 эквив.) добавляли по каплям при к.т. при перемешивании, и раствор оставляли перемешиваться в течение ночи при к.т. в потоке азота. Раствор затем гасили насыщенным NH₄Cl_(водн.), и водную фазу экстрагировали дихлорметаном (3×30 мл). Собранные органические фазы упаривали при пониженном давлении, получающееся в результате желтое масло растворяли в дихлорметане, промывали рассолом и сушили над MgSO₄. Раствор упаривали в вакууме, и остаток очищали при помощи колоночной флэш-хроматографии на диоксиде кремния (1:4 диэтиловый эфир : дихлорметан), типичные выходы 65%. Возможные следовые количества побочных продуктов могут быть устранены путем дополнительной перекристаллизации из диэтилового эфира.

¹Н ЯМР (ядерный магнитный резонанс) (400 МГц, CDCl₃-d₆): δ 2.43 (s, 1Н); 2.42 (m, 1Н); 2.10-2.04 (m, 2Н); 1.02 (m, 1Н); 0.86 (s, 3Н); 0.83 (s, 3Н).

Стадия 2: Синтез 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима

3α-Этинил-3β-гидроксиандростан-17-он (10 ммоль) растворяли при комнатной температуре и в атмосфере воздуха в 5 мл дихлорметана и 50 мл этанола в круглодонной колбе объемом 250 мл. 4 эквив. NH₂OH хлоргидрата и 4 эквив. ацетата натрия растворяли в 5 мл H₂O и затем добавляли к стероидному раствору. Добавляли 20 мл этанола, и смесь оставляли кипятиться с обратным холодильником в течение ночи. Смесь затем охлаждали, и растворитель удаляли при пониженном давлении. Белый остаток обрабатывали 50 мл Н₂О и 50 мл дихлорметана, водную фазу экстрагировали 3×30 мл дихлорметана. Собранные органические фазы затем сушили над MgSO₄, фильтровали, и растворитель удаляли при пониженном давлении. Конечный остаток очищали при помощи колоночной флэш-хроматографии на диоксиде кремния, дихлорметан : диэтиловый эфир 4:1, типичные выходы 95-100% (количественные).

¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆): δ 2.51-2.47 (m, 2Н); 2.43 (s, 1Н); 1.00 (m, 1Н); 0.80 (m, 1Н); 0.90 (s, 3Н), 0.83 (s, 3Н).

Пример 2.

Терапевтический эффект 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима в животной модели печеночной энцефалопатии

Обработка и схема тестирования

В этом исследовании использовали животную модель хронической гипераммониемии, которая воспроизводит множество из когнитивных и моторных изменений, присутствующих при печеночной энцефалопатии. Крысам вводили аммиак вместе с их кормом, и после двух недель кормления кормом, обогащенным аммиаком, у них развивались симптомы печеночной энцефалопатии. Тест прохождения по бревну осуществляли во время 3^й и 4^й недели обработки 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксимом, тогда как тест водного лабиринта Морриса осуществляли во время 4^й -5^й недели обработки 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксимом, и тест радиального лабиринта осуществляли во время 6^й -7^й недели обработки 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксимом.

Исследование разделяли на две серии с животными (самцами крыс Wistar), где каждая из серий включала следующие группы: контроли, обработанные разбавителем (CV, n=8 на серии), контроли, обработанные 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксимом (C+GAM, n=8 на серии), крысы с гипераммониемией, обработанные разбавителем (HAV, n=8 на серии), крысы с гипераммониемией, обработанные 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксимом (HA+GAM, n=8 на серии). Однократную суточную обработку 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксимом в дозе 20 мг/кг или разбавителем осуществляли при помощи подкожных инъекций 1 мл/кг в районе 9 часов утра. Обработку начинали через одну неделю после начала кормления кормом, содержащим аммоний, и продолжали в течение всего экспериментального периода.

Тестируемое изделие 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим готовили в виде суспензии в кунжутном масле в концентрации 20 мг/кг. Пространственное обучение в радиальном лабиринте Радиальный лабиринт разработан как способ оценки пространственного обучения. Аппарат состоит из центральной зоны, которая обеспечивает доступ к восьми ответвлениям равного размера. Ответвления были длиной 70 см и шириной 10 см, и центральная зона в диаметре составляла 30 см. Лабиринт изготовлен из черного Perspex и поднимался на 80 см над полом. Каждое ответвление имело боковые стенки с высотой, большей со стороны, расположенной ближе к центральной зоне (30 см), чем с удаленной стороны (5 см). На удаленном крае каждого ответвления был установлен утопленный колпачок для размещения корма для поощрения (Hernandez-Rabaza V. et al 2010).

Для привыкания крыс к лабиринту последним давали возможность исследовать лабиринт в течение 10 минут в течение двух суток подряд в присутствии удаленных раздражителей (постеров и объектов различных размеров), которые оставались на месте во время тренировки.

Тренировка в радиальном лабиринте состояла из пяти блоков по три испытания в каждом, осуществляемых в течение десяти последовательных суток. Задание включало расположение четырех шариков, каждый из которых размещался в конце различных ответвлений в соответствии со случайной конфигурацией. Конфигурации были специфическими для каждой крысы и оставались постоянными в течение тренировки. Количество ошибок определения положения в пространстве и рабочую память рассчитывали и выражали как количество ошибок определения положения и рабочих ошибок на блок. Дополнительно, индекс обучения использовали для оценки обучения задаче и определяли как количество правильных выборов-ошибок определения положения (Hernandez-Rabaza et al. 2010).

Результаты

3α-Этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим восстанавливал пространственное обучение у крыс с гипераммониемией в радиальном лабиринте. Крысы с гипераммониемией демонстрируют сниженное пространственное обучение и совершают больше рабочих ошибок в задании радиального лабиринта. Пространственная память полностью восстанавливалась при помощи 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима (Фиг. 2).

Пример 3.

Терапевтическое действие 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима в животной модели печеночной энцефалопатии

Обработка и схема тестирования

Обработка и схема тестирования были такими, как изложено в примере 2.

Пространственная память в водном лабиринте Морриса

Лабиринт разработан как способ для оценки пространственного обучения (Morris R. 1984). Тест осуществляли с использованием черного круглого бассейна (диаметром 160 см, высотой 40 см), условно разделенного на четыре квадранта. Непрозрачности воды достигали путем добавления черного красителя. Прозрачную платформу из плексигласа диаметром 10 см погружали на 2 см под поверхность воды в центре одного квадранта во время раундов тренировки (Monfort et al., European Journal of Neuroscience, 2007, 25, 2103-211).

Тест осуществляли следующим образом; первые сутки представляли собой сутки до тренировки, крыс помещали в воду дважды на 30 с исключительно для адаптации к воде. Затем крыс тренировали запоминать фиксированное расположение невидимой платформы в течение 3 суток. Каждое тренировочное испытание включало размещение крысы в бассейне мордой к стенке в одном из трех квадрантов, не содержащих платформу. Различные исходные точки размещения произвольным образом использовали в каждом испытании. Тренировка состояла из пяти заплывов в сутки. Каждому животному давали максимум 120 с для нахождения платформы, и его оставляли на 15 с на платформе. Если крысе не удавалось обнаружить платформу в течение 120 с, тогда экспериментатор вручную направлял ее к платформе. Задача этого теста заключалась в том, чтобы крысы выучили расположение невидимой платформы и достигали ее в самое короткое возможное время. Время, скорость и путь, необходимые для нахождения спрятанной платформы, регистрировали при помощи системы записи видеоизображения, предоставленной Viewpoint Company (Viewpoint 2.5, Champagne au Mont D` Or, Франция), и использовали в качестве показателя обучения заданию. После 15 тренировочных испытаний платформы удаляли из бассейна, крысам давали возможность поплавать в течение 90 с в бассейне, и регистрировали время нахождения в квадранте, в котором располагалась платформа во время тренировки.

Результаты

3α-Этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим полностью восстанавливал пространственную память у крыс с гипераммониемией в водном лабиринте Морриса. Крысы с гипераммониемией демонстрировали уменьшенную память и требовали для нахождения платформы больше времени, чем контрольные (Фиг. 3).

Пример 4.

Терапевтическое действие 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима в животной модели печеночной энцефалопатии

Обработка и схема тестирования

Обработка и схема тестирования были такими, как изложено в примере 2.

Моторная координация в прохождении по бревну

В тесте прохождения по бревну крысы тренировались пересекать поднятое узкое бревно для достижения изолированной спасительной платформы. Бревно изготовлено из гладкого круглого дерева (20 мм в диаметре). Бревно поднято на 1 м над полом. Параметры измеряемой моторной координации: скольжения конечностей (или нарушения походки) и задержка в пересечении бревна. (Jover et al., 2006; Carter et al., 2010). Для привыкания крысы экспериментатор помещал ее в начало бревна и помогал крысе пересекать бревно трижды. После этого тест состоял из трех последовательных испытаний. Количество раз, когда левая или правая задняя лапа соскальзывала с бревна, регистрировали для каждого испытания.

Результаты

3α-Этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим полностью восстанавливал моторную дискоординацию у крыс с гипераммониемией в тесте прохождения по бревну. Крысы с гипераммониемией демонстрировали моторную дискоординацию (увеличенное количество скольжений = нарушений походки) (Фиг. 4).

Пример 5.

Концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима в плазме крови и ткани головного мозга после экзогенного введения

Получение плазмы крови

Кровь отбирали из хвоста крыс (в соответствии с примером 2) в конце второй недели обработки аммиаком и первой недели обработки 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксимом, и также из шеи во время умерщвления животного. Для получения плазмы крови в нее добавляли 7,5 нМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и центрифугировали при 1500 об./мин в течение 5 минут.

Определение аммиака

Концентрацию аммиака в образцах крови измеряли с использованием анализатора аммиака Pocket chem ВА (Woodley Equipment Company Ltd, Великобритания). Устройство обеспечивает возможность для немедленного тестирования и выдает результаты в течение 3 минут и 20 с. Оно также устраняет необходимость в предварительных обработках, таких как центрифужное разделение.

Умерщвление

Крыс умерщвляли путем декапитации. Одну половину головного мозга, содержащую мозжечок, собирали и консервировали при -80°С для определения 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима. Различные области головного мозга (мозжечок, кора головного мозга, гиппокамп и полосатое тело) иссекали и консервировали при -80°С для возможного определения GAMS.

Анализ ионцентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима

Собранные образцы головного мозга и плазмы крови анализировали в отношении концентраций 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима. Образцы плазмы крови и головного мозга оттаивали при комнатной температуре. Белок плазмы крови осаждали при помощи 3-х объемов ацетонитрила, и ткань головного мозга гомогенизировали в отношении 1:4 ткань : PBS (физиологический раствор, забуференный фосфатом) (рН 7,4) и затем экстрагировали 2 объемами метанол : ацетонитрил (1:1) в течение 20 мин во время ультразвуковой обработки. После этого образцы встряхивали и центрифугировали в течение 10 мин при 10000 × g (центрифуга Heraeus Pico 17). Супернатант затем разбавляли равным объемом PBS и анализировали. Некоторые образцы повторно анализировали в виде 10-кратных разведений из-за слишком высокой концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима. Разведения готовили 37,5% раствором ацетонитрила в буфере PBS.

Стандарты готовили путем внесения контрольной плазмы крови/гомогената головного мозга в концентрации 0,5 - 5000 нг/мл, а в остальном обрабатывали как образцы. Определение осуществляли при помощи LC-MS (жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии).

Результаты

Определение аммиака: 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим не влиял на уровни аммиака в крови. Уровни аммиака в крови увеличивались у крыс, получающих аммониевую диету (167±17 мкМ), по сравнению с контрольными крысами (47±3 мкМ). 3α-Этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим не влиял на уровни аммиака в крови контрольных крыс (55±7 мкМ) или у крыс с гипераммониемией (139±15 мкМ) (Фиг. 1). Эти результаты являются неожиданными, поскольку все более ранние исследования, показавшие действие в отношении симптомов печеночной энцефалопатии, демонстрировали уменьшенные уровни аммиака.

Определение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима после воздействия

В настоящем исследовании общую концентрацию 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима в плазме крови анализировали на пятые сутки обработки и на последней неделе обработки 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксимом через четыре часа и 23 часа после инъекции, соответственно. Концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима в плазме крови представлены на Фиг. 5, а концентрации в головном мозге на Фиг. 6. На пятые сутки обработки концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима были ниже через 23 часа после инъекции, чем через 4 часа после инъекции, тогда как на последней неделе обработки похожие концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима были обнаружены как через 4 часа, так и через 23 часа в обеих группах, соответственно. В головном мозге похожие концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима были обнаружены у контрольных крыс (91±4,1 нмоль/кг несвязанный* 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим) и у крыс НА (106±15,4 нмоль/кг несвязанный* 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим) через 1-2 ч после последней обработки (Фиг. 6). Концентрации продемонстрировали неожиданно высокие уровни и стабильные концентрации в течение 24 часов.

Несвязанная концентрация в головном мозге = фракция 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима в головном мозге, которая не связана с белком-носителем или тканью головного мозга.

Пример 6.

Способность 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима оказывать антагонистическую активность против действия THDOC, но не GABA в отношении рецептора GABA_A

Электрофизиологическая фиксация напряжения на цельных клетках с рецепторами α1β2γ2L и α5β3γ2L GABA_A

Для электрофизиологическмих измерений использовали систему Dynaflow^® с чипом Resolve (Cellectricon, Goteborg, Швеция). Клетки HEK-293 постоянно трансфицировали векторами, включающими промотор человеческого CMV (цитомегаловируса) для конститутивной экспрессии субъединиц α5, β3, и γ2L человеческого рецептора GABA_A (α5β3γ2L) или субъединиц α1, β2, и γ2L человеческого рецептора GABA_A (α1β2γ2L). Используемые клеточные линии отбирали в отношении хорошей реактивности к GABA и к THDOC. Перед измерениями клетки инкубировали в течение 15 мин при 37°С в 95% воздухе + 5% CO₂ во внеклеточном растворе (ЕС), содержащем следующие компоненты: 137 мМ NaCl, 5,0 мМ KCl, 1,0 мМ CaCl₂, 1,2 мМ MgCl₂, 10 мМ HEPES и 10 мМ глюкоза, 0,1% DMSO, рН 7,4. После этого отделенные клетки добавляли к раствору ЕС в ванночке для чипа Dynaflow.

Регистрации фиксации напряжения на цельных клетках осуществляли при комнатной температуре (21-23°С, -17 мВ для компенсации потенциала жидкостного соединения как у Haage et al., 2002; Neher, 1992). Генерировали управляющие импульсы, и данные собирали при помощи программного обеспечения PCIamp 9.0, конвертер DigiData 1322А и AxonPatch 200В (Axon Instruments, Foster City, CA). Контактные прижимные электроды (2-6 MQ) заполняли внутриклеточным раствором (IC), включающим: 140 мМ Cs-глюконат, 3,0 мМ NaCl, 1,2 мМ MgCl₂, 10 мМ HEPES, 1,0 мМ EGTA (этиленгликольтетрауксусная кислота), 2 мМ Mg-АТР, 0,1% DMSO, рН 7,2.

THDOC и 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) и затем разбавляли раствором ЕС, включающим 0,1% DMSO.

Для различных электрофизиологических измерений использовали разные протоколы. Поскольку рецепторы α1β2γ2L-GABA_A in vivo находятся в синапсе, то для состояния, напоминающего эту ситуацию, использовали краткосрочное применение (40 мс) высокой концентрации GABA (30 мкМ). Наоборот, поскольку рецепторы α5β3γ2L- GABA_A присутствуют вне синапсов, тогда используемые состояния представляли собой длительные воздействия (6 с) низких концентраций GABA (0,3 мкМ). В отношении THDOC использовали концентрацию ЕС₇₅ (т.е. 75% эффективную концентрацию), т.е. 100 нМ для исследований α1β2γ2L и 200 нМ при оценке клеток, экпрессирующих α5β3γ2L Для обоих типов клеток предварительное воздействие THDOC или THDOC с 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-оном использовали до применения GABA.

Действия стероидов в присутствии GABA нормализовали к контролям для того чтобы избежать действия межклеточной и внутриклеточной вариации измеряемых параметров, где каждую клетку использовали в качестве своего собственного контроля, и анализировали площадь под кривой (AUC).

Результаты

Действия 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в отношении рецептора GABA_A исследовали при помощи электрофизиологических измерений на рекомбинантных клетках HEK293, экспрессирующих человеческие варианты рецептора. Усиленная 100 нМ THDOC активация рецептора α1β2γ2L GABA_A в присутствии GABA представлена на Фиг. 7.

3α-Этинил-3β-гидроксиандростан-17-он (1 мкМ) частично оказывает антагонистическое действие против действия THDOC в отношении вариантов субъединицы α1β2γ2L и α5β3γ2L рецептора GABA_A (Фиг. 8А и С). В отношении рецепторов α1β2γ2L 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он ингибирует 29±4,7% опосредованного THDOC усиления GABA (Р<0,001) и в отношении рецептора α5β3γ2L ингибирование составляло 49±4,7% (Р<0,001, таблица 1).

Наоборот, 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он (1 мкМ) не оказывает антагонистического действия против GABA-активации рецептора GABA_A (Фиг. 8В и D). Отсутствует значимое действие 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в отношении рецептора α1β2γ2L GABA_A (-3,1±1,7%, NS (не значимо)) или рецептора α5β3γ2L GABA_A (-3,8±1,5%, NS), когда GABA представляет собой единственный активатор рецептора (Таблица 1).

Пример 7

Избирательность 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в отношении других мишеней и рецепторов

Связывание 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она определяли для рецепторов, ионных каналов и ферментов, включающих все основные классы рецепторов нейромедиаторов. В общей сложности тестировали 113 мишеней в двух параллелях с 10 мкМ 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она (Perkin Elmer, индивидуально адаптированный отбор). Активность связывания определяли как превышающую или равную 50% ингибированию связывания лиганда.

Результаты

В концентрации 10 мкМ 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он не демонстрировал связывающую активность в отношении любого из исследованных рецепторов нейромедиаторов, стероидных рецепторов или пептидных рецепторов.

Пример 8.

Терапевтическое действие 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она на моторную координацию у крыс с НЕ и анастомозом между воротной и полой веной

Обработка и схема тестирования

Хроническая гипераммониемия у крыс. У самцов крыс Wistar (140-160 г) вызывали гипераммониемию путем кормления их пищей, содержащей ацетат аммония (30% по массе) (Felipo et al, European Journal of Biochemistry, 1988, 176, 567-571).

Анастомоз между воротной и полой веной. Самцов крыс Wistar (220-240 г) анестезировали изофлураном, и терминолатеральный анастомоз между воротной и полой веной осуществляли, как описано Lee и Fisher (Surgery, 1961, 50, 668-672). Контрольные крысы подвергались ложной операции; у них на 10 мин пережимали воротную вену и нижнюю полую вену.

Крысы, которые подвергались процедуре анастомоза между воротной и полой веной, здесь обозначены как "крысы PCS".

Адекватные меры принимали для минимизации боли и дискомфорта у животных. Эксперименты были одобрены Comite de Experimentation у Bienestar Animal (СЕВА) в соответствии с Центром и осуществляли в соответствии с Указаниями Европейской Комиссии (Directive of the European Commission) (2010/63/EU) и испанским законодательством (R.D. 1201/2005 по уходу и обращению с экспериментальными животными).

Обработка 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-оном. 3α-Этинил-3β-гидроксиандростан-17-он в кунжутном масле вводили путем подкожных инъекций в спину крыс один раз в сутки. Две различных серии экспериментов осуществляли у крыс с гипераммониемией. В первой серии использовали четыре группы крыс: 1) контрольные крысы, которым инъецировали разбавитель; 2) крысы с гипераммониемией, которым инъецировали разбавитель; 3) контрольные крысы, которым инъецировали 20 мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она и 4) крысы с гипераммониемией, которым инъецировали 20 мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она.

Контрольных крыс, которым инъецировали 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он, не включали далее, поскольку никакого релевантного действия у этих крыс не обнаружили.

Во второй серии экспериментов использовали пять групп крыс: 1) контрольные крысы, которым инъецировали разбавитель; 2) крысы с гипераммониемией, которым инъецировали разбавитель, и 3-5) крысы с гипераммониемией, которым инъецировали 3, 10 или 20 мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она. В каждом эксперименте использовали 6-8 крыс на группу.

Для экспериментов с крысами PCS использовали следующие группы крыс: 1) крысы, подвергшиеся ложной операции, которым инъецировали разбавитель; 2) крысы PCS, которым инъецировали разбавитель; 3-4) крысы PCS, которым инъецировали 0,7 или 2,5 мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она. Количество крыс, используемых в каждом эксперименте, представлено на соответствующей Фигуре или приведено в описании соответствующей Фигуры

Статистический анализ.

Приведенные данные представляют собой среднее значение±SEM (стандартная ошибка среднего значения) количества крыс, указанное на каждой из Фиг. Статистическую значимость оценивали при помощи двустороннего ANOVA (дисперсионного анализа) и послеэкспериментального теста Бонферрони, и при помощи t-теста Стьюдента, когда сравнивают только один параметр. Анализы осуществляли с использованием программного обеспечения GraphPad PRISM для Windows (GraphPad software Inc., La Jolla, CA, USA).

Моторная координация. Тест прохождения по бревну.

Моторную координацию тестировали, как описано Gonzalez-Usano et al (ACS Chemical Neuroscience, 2014, 19, 5(2), 100-105), с использованием деревянного бревна (диаметром 20 мм). Крыс заставляли пересекать деревянное бревно длиной один метр, расположенное на высоте приблизительно один метр над полом, и количество нарушений походки (скольжений) регистрировали два исследователя. Крыс тренировали для теста путем того, что их заставляли пересекать бревно до пяти раз перед регистрацией результатов измерений. Количество нарушений походки (скольжений) представляет собой показатель моторной дискоординации.

Результаты

Продемонстрировано, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он восстанавливал моторную координацию у крыс с гипераммониемией и крыс PCS.

Крысы с гипераммониемией демонстрируют моторную дискоординацию в тесте прохождения по бревну с большим (р<0,05) количеством скольжений (1,4±0,1) чем контрольные крысы (1,0±0,1). Обработка 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-оном восстанавливает моторную координацию у крыс с гипераммониемией (Фиг. 9А). Действия были статистически значимыми для доз 3 мг/кг (0,8±0,1 скольжений, р<0,05) и 20 мг/кг (0,78±0,07 скольжений, р<0,05).

Крысы PCS также демонстрируют моторную дискоординацию в тесте прохождения по бревну с большим (р<0,01) количеством скольжений (1,2±0,1) чем контрольные крысы, перенесшие ложную операцию (0,71±0,07). Обработка 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-оном также восстанавливает моторную координацию у крыс PCS (Фиг. 9В). Количество скольжений для дозы 0,7 мг/кг составляло 0,75±0,10 (р<0,05 по сравнению с крысами PCS). В дозе 2,5 мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он также улучшал моторную координацию, возвращаясь к значениям, похожим на значения для крыс, перенесших ложную операцию (0,8±0,1 скольжений; р по сравнению с крысами PCS = 0,058) (Фиг. 9В).

Пример 9.

Терапевтический эффект 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в отношении пространственной памяти и пространственного обучения у крыс с НЕ и анастомозом между воротной и полой веной

Обработка и схема тестирования

Обработка и схема тестирования были такими, как изложено в примере 8. Пространственная память и обучение в тесте водного лабиринта Морриса

Тест осуществляли, как описано Monfort et al. (European Journal of Neuroscience, 2007, 25, 2103-2111) с использованием круглого бассейна (диаметром 160 см, высотой 40 см), условно разделенного на четыре квадранта. После предварительной тренировки крысы тренировались заучивать фиксированное расположение невидимой платформы в течение 3 суток. Тренировка включала размещение крысы в бассейне мордой к стенке в одном из трех квадрантов, не содержащих платформу. Различные исходные точки размещения произвольным образом использовали в каждом испытании. Тренировка состояла из трех заплывов в сутки. Каждому животному давали максимум 120 с для нахождения платформы, и его оставляли на 20 секунд на платформе. Если крысе не удавалось обнаружить платформу в течение 120 с, тогда экспериментатор вручную направлял ее к платформе. Время, необходимое для нахождения скрытой платформы, регистрировали вручную и использовали в качестве показателя обучения заданию.

Пространственную память оценивали через 24 часа путем извлечения платформы и измерения времени, проведенного крысой в квадранте, где была платформа.

Результаты.

Продемонстрировано, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он восстанавливает пространственную память в тесте водного лабиринта Морриса у крыс с гипераммониемией и крыс PCS.

Крысы с гипераммониемией демонстрировали ослабленную пространственную память в водном лабиринте Морриса. Все группы крыс обучались находить платформу, и задержка в ее достижении уменьшалась в течение трех суток тренировки (Фиг. 10А). Способность к обучению была несколько снижена у крыс с гипераммониемией, которым требовалось больше времени, чем контрольным крысам для достижения платформы.

Пространственная память значимо ухудшалась (р<0,05) у крыс с гипераммониемией. В тесте памяти крысы с гипераммониемией проводили меньше времени (30±2% времени) в правильном квадранте, чем контрольные крысы (39±2% времени). Обработка 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-оном восстанавливала пространственную память в водном лабиринте Морриса у крыс с гипераммониемией. Процентная доля времени, проведенного в правильном квадранте, составляла 41±4, 42±5 и 38±3, для доз 3, 10 и 20 мг/кг, соответственно (Фиг. 10В).

Крысы PCS также демонстрировали ослабленную пространственную память в водном лабиринте Морриса. Все группы крыс учились находить платформу, и задержка в ее достижении уменьшалась в течение трех суток тренировки (Фиг. 10С). Пространственная память значимо ухудшалась (р<0,05) у крыс PCS. В тесте памяти крысы PCS оставались меньше времени (31±3% времени) в правильном квадранте, чем контрольные крысы (41±2% времени). Обработка 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-оном восстанавливала пространственную память в водном лабиринте Морриса у крыс PCS. Процентная доля времени, проведенного в правильном квадранте, составляла 34±4 и 39±3 для доз 0,7 и 2,5 мг/кг, соответственно (Фиг. 10D).

Пример 10.

Терапевтический эффект 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в отношении пространственного обучения у крыс с НЕ и анастомозом между воротной и полой веной

Обработка и схема тестирования

Обработка и схема тестирования были такими, как изложено в примере 8.

Пространственное обучение в тесте радиального лабиринта.

Аппарат состоял из центральной зоны, обеспечивающей доступ к восьми ответвлениям равного размера. Ответвления имели длину 70 см и ширину 10 см, а центральная зона имела диаметр 30 см. На удаленном крае каждого ответвления имелся колпачок, содержащий корм для поощрения. Крысам давали возможность исследовать лабиринт в течение 10 минут в течение двух суток подряд в присутствии удаленных раздражителей для адаптации к лабиринту.

Тренировка в радиальном лабиринте состояла из трех испытаний в сутки в течение шести последовательных суток. Задание включало расположение четырех шариков, каждый из которых размещался в конце различных ответвлений в соответствии со случайной конфигурацией, как описано Hernandez-Rabaza et al. (Addiction Biology, 2010, 15, 413-423). Количество рабочих ошибок памяти (посещения ответвлений, уже посещенных в том же самом испытании), регистрировали и выражали как рабочие ошибки.

Результаты

Обнаружено, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он восстанавливает пространственное обучение в тесте радиального лабиринта.

Крысы с гипераммониемией демонстрируют ухудшенное пространственное обучение в радиальном лабиринте. Как представлено на Фиг. 11А, количество рабочих ошибок было выше у крыс с гипераммониемией, чем у контрольных крыс на 1-3 сутки. Все группы крыс обучались в течение суток тренировки, и различие между контрольными крысами и крысами с гипераммониемией было незначимым после 3 суток. (Фиг. 11А). Количество рабочих ошибок на 1-2 сутки было выше (р<0,05) у крыс с гипераммониемией (18±3 ошибок), чем у контрольных крыс (11±1,5 ошибок). Крысы с гипераммониемией, обработанные 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-оном, вели себя как контрольные крысы. Количество ошибок (не значимо отличающееся от контролей) составляло 6,5±2,8, 8,8±1,9 и 12±2, для доз 3, 10 и 20 мг/кг дозы, соответственно (Фиг. 11В-С).

Крысы PCS также демонстрируют ухудшенное пространственное обучение в радиальном лабиринте. Как представлено на Фиг. 11С, количество рабочих ошибок было выше у крыс PCS чем у крыс, подвергнутых ложной операции, на 1 и 2 сутки. Все группы крыс обучались в течение всех дней тренировки, и различие между крысами, подвергнутыми ложной операции, и крысами PCS не было значимым после 3 суток (Фиг. 11С). Количество рабочих ошибок на 1-2 сутки (Фиг. 11D) было выше (р<0,01) у крыс PCS (22±2 ошибок) чем у крыс, подвергнутых ложной операции (10±2 ошибок). Обработка крыс PCS 0,7 мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она не была достаточной для того, чтобы улучшить эффективность в радиальном лабиринте (23±2 ошибок). Обработка 2.5 мг/кг полностью приводила в норму эффективность у крыс PCS в радиальном лабиринте (11±1 ошибок, р<0,05 по сравнению с PCS).

Пример 11.

Терапевтический эффект 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в отношении циркадных ритмов и ночной моторной активности у крыс PCS

Обработка и схема тестирования

Обработка и схема тестирования были такими, как изложено в примере 8.

Циркадные ритмы спонтанной локомоторной активности

Моторную активность измеряли с использованием актиметра (Med Associates, S t. Albans, VT). Крыс индивидуально размещали в камере для измерения активности типа "открытое поле" (43×43×31 см), и моторную активность регистрировали непрерывно в течение 14 суток в условиях свет-темнота (L.D), 12 ч : 12 ч. Данные регистрировали с интервалами 5 минут. Моторную активность обнаруживали при помощи массива инфракрасных датчиков движения, расположенных в трех направлениях х, y и z. Один отсчет двигательной активности регистрируют при помощи аппарата, когда крыса пересекает три последовательных инфракрасных датчика в позиции х или у. Вертикальный отсчет регистрируют, когда крыса пересекает инфракрасные датчики в позиции z. Программное обеспечение дает возможность для измерения различных параметров моторной активности, таких как отсчеты хождения или вертикальные отсчеты (Ahabrach et al. Journal of Neuroscience Research, 2010, 88, 1605-14).

Результаты.

Обнаружено, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он увеличивает спонтанную моторную активность в течение ночи и частично восстанавливает циркадный ритм у крыс PCS.

Крысы PCS демонстрируют пониженную моторную активность (отсчеты хождения) в течение ночи (активная фаза крыс), демонстрирующую 1849±176 отсчетов, что является значимо (р<0,05) меньшим чем у контрольных крыс (4546±584 отсчетов). 3α-Этинил-3β-гидроксиандростан-17-он в дозе 0,7 мг/кг слегка увеличивал (р<0,05) активность у крыс PCS до 2652±275 отсчетов. 3α-Этинил-3β-гидроксиандростан-17-он в дозе 2,5 мг/кг не влиял на отсчеты хождения (2235±170 отсчетов для 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она) (Фиг. 12А и 12С).

Отношение двигательной активности в течение ночи по сравнению с активностью в течение дня уменьшалось у крыс PCS, указывая на измененный циркадный ритм (Фиг. 12В). Для контрольных крыс это отношение составляло 3,3±0,4 и уменьшалось (р<0,001) у крыс PCS до 0,8±0,16. Крысы PCS, обработанные 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-оном, демонстрировали частичное, но значимое улучшение (р<0,05) отношения активности ночь/день, достигая 1,7±0,2 и 1,6±0,3 для 0,7 и 2,5 мг/кг, соответственно (Фиг. 12В). Последнее указывает на частичное восстановление циркадного ритма активности.

Также обнаружено, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он нормализовал вертикальную активность в течение дня и частично восстанавливал циркадный ритм у крыс PCS.

Крысы PCS демонстрировали уменьшенную вертикальную активность в течение ночи (активная фаза крыс), демонстрируя 561±108 отсчетов, что было значимо (р<0,05) меньше чем у контрольных крыс (1228±138 отсчетов). 3α-Этинил-3β-гидроксиандростан-17-он в дозе 0,7 мг/кг или 2,5 мг/кг не влиял на вертикальную активность в течение ночи (664±121 и 695±185 отсчетов, соответственно) (Фиг. 12А и 12С).

Наоборот, крысы PCS демонстрировали увеличенную вертикальную активность в течение дня, демонстрируя 682±114 отсчетов, что было значимо (р<0,05) выше, чем у контрольных крыс (391±64 отсчетов). 3α-Этинил-3β-гидроксиандростан-17-он в дозе 0,7 мг/кг или 2,5 мг/кг полностью нормализовал вертикальную активность в течение дня, достигая 339±47 и 424±44 отсчетов, соответственно. (Фиг. 12А и 12С).

Отношение вертикальной активности в течение ночи к активности в течение дня также уменьшалось у крыс PCS, указывая на измененный циркадный ритм (Фиг. 12В). Для контролей это отношение составляет 3,7±0,6 и уменьшалось (р<0,001) у крыс PCS до 0,8±0,01. Крысы PCS, обработанные 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-оном, демонстрировали частичное, но значимое улучшение (р<0,01) в отношении активности ночь/день, достигая 2,1±0,4 и 1,9±0,6 для 0,7 и 2,5 мг/кг, соответственно (Фиг. 12В). Последнее указывает на частичное восстановление циркадного ритма вертикальной активности.

Пример 12.

Эффект обработки 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-оном на концентрацию аммиака в крови у крыс с гипераммониемией и крыс PCS

Обработка и схема тестирования

Обработка и схема тестирования были такими, как изложено в примере 8.

Определение аммиака

Уровень аммиака в крови измеряли с использованием набора II Ammonia Arkray test (PocketChem BA, Arkray) с использованием 20 мкл свежей крови в соответствии с указаниями производителя.

Результаты

Обнаружено, что 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-он не влиял на уровни аммиака у крыс с гипераммониемией и крыс PCS.

Уровни аммиака в крови увеличивались (р<0,001) у крыс с гипераммониемией 167±16 мкМ по сравнению с контролями (47±3 мкМ). Обработка 20 мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она не влияла на уровни аммиака у крыс с гипераммониемией (139±14 мкМ).

Аналогичные результаты были получены у крыс PCS. Уровни аммиака в крови увеличивались (р<0,001) у крыс PCS (348±27 мкМ) по сравнению с крысами, перенесшими ложную операцию (125±31 мкМ). Обработка 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-оном не влияла на уровень аммиака в крови, который оставался на уровне 302±30 и 294±37 мкМ у крыс PCS, обработанных 0,7 и 2,5 мг/кг 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она, соответственно.

Пример 13.

Концентрация 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в плазме крови и ткани головного мозга у крыс с гипераммониемией и крыс PCS после периода обработки

Обработка и схема тестирования

Обработка и схема тестирования были такими, как изложено в примере 8. Анализ концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она К концу периода обработки плазму крови собирали из хвостовой вены, и после умерщвления путем декапитации образцы головного мозга собирали и немедленно замораживали на сухом льду. Для анализа концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она ткань головного мозга гомогенизировали в отношении 1:4 ткань : PBS (рН 7.4) и затем экстрагировали 2 объемами метанол : ацетонитрил (1:1), тогда как белки плазмы крови осаждали 3 объемами ацетонитрила. Анализы осуществляли при помощи тройного квадрупольного масс-спектрометра Waters ACQUITY UPLC + Waters XEVO-TQS (Admescope Oy, Oulu, Финляндия). Для расчетов концентрации свободного 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в головном мозге не связанную фракцию (F_ub) в гомогенатах головного мозга определяли путем диализа, F_ub в НА = 0,70 и F_ub в PCS = 1,43% (Admescope Oy, Oulu, Финляндия). Результаты

У крыс с гипераммониемиейы введение один раз в сутки 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в дозе 3, 10 и 20 мг/кг приводило в результате к зависимой от дозы концентрации в плазме крови и в ткани головного мозга. В момент тестирования поведения общие концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она в плазме крови составляли 0,34±0,03, 1,08±0,11, 1,95±0,61 мкМ, соответственно, и в ткани головного мозга не связанные концентрации 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она составляли 6,1±1,4, 11,6±1,4, 23±5 нмоль/кг, соответственно (Фиг. 14А).

Также у крыс PCS концентрации зависели от дозы, и при меньших дозах, используемых у этих крыс 0,7 и 2,5 мг/кг, концентрации были весьма близки к концентрациям у крыс с гипераммониемией. Общие концентрации в плазме крови составляли 0,48±0,09, и 1,64±0,30 мкМ, при 0,7 и 2,5 мг/кг/сутки соответственно, и не связанные концентрации в головном мозге составляли 6,18±0,97 и 17±2 нмоль/кг, соответственно, в момент тестирования поведения.

1. Применение соединения 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксим

или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения печеночной энцефалопатии.

2. Применение по п. 1, где указанная печеночная энцефалопатия представляет собой минимальную печеночную энцефалопатию.

3. Применение по п. 1, где указанная печеночная энцефалопатия представляет собой клинически выраженную печеночную энцефалопатию.

4. Применение по п. 1, где указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию типа А.

5. Применение по п. 1, где указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию типа В.

6. Применение по п. 1, где указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию типа С.

7. Применение по любому из пп. 1-6, где лечение включает предупреждение печеночной энцефалопатии.

8. Применение по любому из пп. 1-6, где указанное соединение вводят пациенту с острой печеночной недостаточностью.

9. Применение по любому из пп. 1-6, где указанное соединение вводят пациенту с хроническим заболеванием печени с обострением хронической печеночной недостаточности или без него.

10. Применение по п. 1, где указанное соединение вводят до, во время или после пересадки печени.

11. Применение по п. 1, где лечение включает совместное введение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима с соединением, понижающим уровень аммиака.

12. Применение по п. 11, где соединение, понижающее уровень аммиака, выбрано из группы, состоящей из рифаксимина, лактулозы, орнитина фенилацетата и глицерина фенилбутирата.

13. Применение по п. 11 или 12, где соединение, понижающее уровень аммиака, представляет собой лактулозу.

14. Применение по п. 11, где соединение, понижающее уровень аммиака, представляет собой рифаксимин.

15. Способ лечения печеночной энцефалопатии, включающий введение фармацевтически эффективного количества 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима

или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, нуждающемуся в таком введении.

16. Способ по п. 15, где указанная печеночная энцефалопатия представляет собой минимальную печеночную энцефалопатию.

17. Способ по п. 15, где указанная печеночная энцефалопатия представляет собой клинически выраженную печеночную энцефалопатию.

18. Способ по п. 15, где указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию типа А.

19. Способ по п. 15, где указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию типа В.

20. Способ по п. 15, где указанная печеночная энцефалопатия представляет собой печеночную энцефалопатию типа С.

21. Способ по любому из пп. 15-20, где способ лечения печеночной энцефалопатии включает предупреждение печеночной энцефалопатии.

22. Способ по любому из пп. 15-20, где указанный пациент страдает острой печеночной недостаточностью.

23. Способ по любому из пп. 15-20, где указанный пациент страдает хроническим заболеванием печени с обострением хронической печеночной недостаточности или без него.

24. Способ по любому из пп. 15-20, где указанное соединение вводят до, во время или после пересадки печени.

25. Способ по п. 15, где лечение включает совместное введение 3α-этинил-3β-гидроксиандростан-17-она оксима с соединением, понижающим уровень аммиака.

26. Способ по п. 25, где соединение, понижающее уровень аммиака, выбрано из группы, состоящей из рифаксимина, лактулозы, орнитина фенилацетата и глицерина фенилбутирата.

27. Способ по п. 26, где соединение, понижающее уровень аммиака, представляет собой лактулозу.

28. Способ по п. 26, где соединение, понижающее уровень аммиака, представляет собой рифаксимин.