Способ микроскопической диагностики качества спермы после седиментации эякулята

Изобретение относится к области медицины и медицинской диагностики. Раскрыт способ микроскопической диагностики качества спермы после седиментации эякулята, включающий отбор клеток из осадка эякулята (ОЭ), подготовку цитологических препаратов из отобранных клеток ОЭ с размещением на предметные стекла, высушивание и окрашивание препаратов, последующий подсчет количества, оценку различных типов клеток и сравнение с данными контрольной группы для получения заключения. При этом перед забором диагностического материала провоцируют воспалительный процесс для последующего выявления инфекционного агента; ОЭ получают путем седиментации эякулята, для этого инкубируют эякулят в течение 20-30 мин в термостате при температуре 37°С до полного разжижения, порцию переносят в градуированную центрифужную пробирку; центрифугирование осуществляют при 1000-1500 об./мин в течение 15-20 мин; пипеткой отделяют супернатант без захвата осадка со дна; препарат готовят с помощью автоматической дозирующей пипетки, которой отбирают 10 мкл подготовленного ОЭ таким образом, чтобы мазок занимал площадь 1/3-2/3 площади предметного стекла, при этом используют предметные стекла с повышенной адгезией; высушивание препарата осуществляют в термостате в течение 15-20 мин в условиях повышенной влажности и при температуре 37°С. Подсчет и оценку клеток проводят с помощью микроскопа, регулируя его оптическое увеличение. Изобретение позволяет выявить злокачественные находки, повысить диагностическую ценность биоматериала, провести комплексное микроскопическое исследование и обеспечивает повышение точности исследования. 3 з.п. ф-лы, 25 ил.

 

Изобретение относится к медицине и используется при анализе биологических материалов, в частности, и может быть использовано при диагностике нарушений сперматогенеза и бесплодия в урологии, андрологии, онкологии, ветеринарии и животноводстве. Изобретение относится к области исследования биологических материалов, а именно сперматозоидов, и может быть использовано при проведении функционального теста при оценке их оплодотворяющей способности и для выявления этиопатогенеза патозооспермии.

Для оценки сперматогенеза используется два подхода: спермиологический анализ эякулята, при котором характеризуют концентрацию, двигательную активность и морфологию сперматозоидов, наличие лейкоцитов, иных соматических клеток; округлых клеток сперматогенеза, но без их морфологической постадийной характеристики [Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. 4-е изд. Изд-во Cambridge University Press, 1999. Перевод Р.А. Нерсесяна, научный редактор русского перевода проф. Л.Ф. Курило. Москва: МедПресс, 2001, с. 18-21, с. 73-75].

Недостатком способа является отсутствие количественного анализа по стадиям развития незрелых половых клеток и сперматозоидов эякулята, т.е. невозможность получить информацию о физиологичности или нарушении прохождения половых клеток через все последовательные стадии сперматогенеза в целом.

Вторым традиционным подходом является гистологический анализ препаратов срезов биоптата яичка с определением характеристики цикла сперматогенного эпителия, по расчету индекса половых клеток относительно числа клеток Сертоли [Патент РФ №2199117].

Анализ проводят после изъятия фрагмента яичка (биопсия) и его фиксации, после обезвоживания кусочка биоптата яичка по спиртам восходящей концентрации и ксилолу, заливки в парафин, приготовления срезов и их окрашивания с последующим микроскопированием гистологических препаратов биоптата яичка.

Недостатком способа является: травма яичка при хирургическом получении биоптата, развитие аутоиммунного процесса в яичке и нарушение сперматогенеза и плодовитости; время приготовления гистопрепаратов биоптата яичка составляет 3-5 дней; результаты анализа сперматогенеза получают на локальном участке яичка (биоптате), и их нельзя экстраполировать на все яичко в целом или на оба яичка, поскольку в них часто протекают локальные процессы. Кроме того, проведение биопсии яичка допускается только для пациентов с азооспермией или олигозооспермией тяжелой степени (ВОЗ, 1982, 1999, 1). Такие пациенты составляют не более 30% от числа мужчин, обращающихся к специалистам по поводу нарушения сперматогенеза и бесплодия. Т.е. около 70% мужчин не имеют возможности получения квалифицированной информации о причинах и степени нарушения сперматогенеза до его конечного этапа - до сперматозоидов.

Известен также способ морфологической оценки клеточного состава биологического материала, например половых клеток, в котором готовят мазки и анализируют их после окрашивания [Патент РФ №2231979].

Данный способ включает взятие биоптата - 100 мг яичка, гомогенизацию ткани яичка и из капли полученной суспензии клеток делают на предметном стекле мазок, высушивают, окрашивают и с помощью микроскопа проводят дифференциальную диагностику и количественный подсчет отдельных групп клеток сперматогенеза.

Недостатком мазков клеток является нечеткость цитологической картины состояния ядер и ядерных структур изучаемых клеток, что не позволяет идентифицировать каждую стадию профазы 1 и метафазы 1 и 2 мейоза гамет, характеризующуюся четкими отличиями по состоянию различных компонентов ядра гамет: степени конденсированности хроматина, идентифицируемости хромосом, наличию или отсутствию ядрышка, его морфологии. Кроме того, получение биопсии яичка показано лишь для ограниченной группы мужчин, менее 1/3 из большого числа тех, которым в связи с бесплодием и нарушением сперматогенеза необходимо иметь информацию о причинах нарушения детородной функции яичек.

Наиболее близким аналогом является способ по патенту №2328736 «Способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза». В соответствии с известным способом пробу половых и соматических клеток для анализа берут из осадка центрифугированного эякулята, готовят цитологические препараты нативных половых клеток путем обработки их в течение 1 ч гипотоническим раствором 0,55-0,56%-го хлористого калия (KCl) при температуре 37,0-37,1°С, с последующей фиксацией в смеси метанолового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1, с добавлением 0,1-0,2 мл хлороформа. Затем полученную клеточную суспензию раскапывают на влажные охлажденные предметные стекла, высушивают сухим воздухом с последующим их окрашиванием красителем Гимза и подсчитывают количество различных типов соматических клеток и, в основном, половых клеток на следующих этапах их развития: сперматогониев, сперматоцитов 1 - первичных в профазе 1 мейоза, на стадиях прелептотенной конденсации и деконденсации хромосом, лептотены, зиготены, пахитены, диплотены, диакинеза; а также подсчитывают гаметы: число сперматоцитов 1 и 2 на стадиях метафазы 1 и 2 мейоза; сперматид и сперматозоидов; число неразошедшихся при делениях митоза и мейоза гамет, число дегенерирующих гамет. Затем сравнивают полученные числовые данные в виде индекса по каждой стадии с таковыми от контрольной группы, установленными по результатам обследования здоровых мужчин - доноров спермы, с нормальным набором хромосом - кариотипом и спермограммой; при этом контрольные индексы стадий развития половых клеток здоровых мужчин соответствуют следующим значениям: сперматогониев 0,03-0,07%, сперматоцитов первичных на стадиях: от прелептотены до зиготены включительно 0,57-0,81%; пахитены 0,35-0,45%, диплотены 1-2%, диакинеза 0,03-0,07%, сперматоцитов в метафазе 1 и 2 0,03-0,07%, сперматоцитов 2 и сперматид 91-93%, сперматоцитов 2 и сперматидов, не разошедшихся в делениях созревания и в митозе гониев, 15-31%, дегенерирующих гамет 4,9-6,9%, при этом доля незрелых половых клеток у здоровых мужчин с нормальной спермограммой не превышает 2-4%, а сперматозоидов 96-9 8% от общего числа половых клеток в эякуляте. При выявлении количества сперматогониев и сперматоцитов 1 на стадиях прелептотенной конденсации и деконденсации хромосом, а также лептотены и зиготены для каждой стадии менее 0,01%; для достоверности анализа объединяют число клеток указанных стадий в одну группу - «допахитенные стадии», контрольный индекс которых не менее 0,7%. Для исследования состояния хромосом гамет для остановки митоза сперматогониев или мейоза сперматоцитов 1 и 2 перед обработкой гипотоническим раствором хлористого калия клетки из эякулята вначале обрабатывают статмокинетическими препаратами - колхицином 0,25 мл, в концентрации 10 мгк/мл в 1 мл эякулята или колцемидом.

Недостатком известного способа является низкая диагностическая ценность биоматериала «Сперма (эякулят») и низкая информативность диагностики - возможности поиска диагностически значимых микроскопических находок - инфекционных патогенов.

Это связано с тем, что спермоплазма, является ингибитором ДНК-полимеразы в ПЦР и ингибирование может привести к получению недостоверных результатов.

Точность анализа, как известно, во многом зависит от способа подготовки и сохранности материала образца, подготовленного для электронно-микроскопического анализа.

Изобретение направлено на решение задачи повышения диагностической ценности биоматериала «сперма (эякулят»)» и, следовательно, расширения информативности исследования за счет обеспечения возможности поиска диагностически значимых микроскопических находок, инфекционных патогенов, и в результате повышения достоверности диагностики.

Технический результат, достигаемый при использовании представленного способа, состоит в повышении диагностической ценности биоматериала, позволяющего провести комплексное микроскопическое исследование и обеспечить повышение его точности.

Технический результат достигается за счет того, что в способе подготовки и исследования цитологических препаратов для оценки качества спермы, включающем отбор клеток из осадка эякулята (ОЭ), подготовку цитологических препаратов из отобранных клеток ОЭ с размещением на предметные стекла, высушивание и окрашивание препаратов, последующий подсчет количества, оценка различных типов клеток и сравнение с данными контрольной группы для получения заключения, перед забором диагностического материала провоцируют воспалительный процесс для последующего выявления инфекционного агента, ОЭ получают путем седиментации эякулята, для этого инкубируют эякулят в течение 20-30 минут в термостате при температуре 37°С до полного разжижения, порцию переносят в градуированную центрифужную пробирку, центрифугирование осуществляют при 1000-1500 об/мин в течение 15-20 минут, пипеткой отделяют супернатант без захвата осадка со дна, препарат готовят с помощью автоматической дозирующей пипетки, которой отбирают 10 мкл подготовленного ОЭ таким образом, чтобы мазок занимал площадь 1/3-2/3 площади предметного стекла, при этом используют предметные стекла с повышенной адгезией, высушивание препарата осуществляют в термостате в течение 15-20 минут в условиях повышенной влажности и при температуре 37°С, подсчет и оценку клеток проводят с помощью микроскопа, регулируя его оптическое увеличение: регистрацию клеточных элементов, таких как эпителиальные клетки, комплексы из клеток, макрофаги, гистиоциты, эритроциты осуществляют при оптическом увеличении микроскопа ×400, наличие воспалительной реакции регистрируют при наличии более 3 лейкоцитов в поле зрения микроскопа при оптическом увеличении ×1000, наличие или отсутствие микробиоты - при оптическом увеличении ×1000, наличие нетипичных клеток - при оптическом увеличении ×100 или ×200 с последующим переводом на ×1000, а при микроскопическом цитологическом анализе ОЭ дополнительно к подсчету типов клеток на этапах их развития оценивают общий фон макропрепарата, а также подсчитывают процентное содержание сперматозоидов с патологией головки, шейки, хвоста.

Окрашивание препарата производят экспресс-методом с использованием многоцветности в течение 15 сек.

Окрашивание препарата производят ручным методом по Романовскому-Гимзе с предварительной фиксацией мазков 96% этиловым спиртом в течение 5 мин; или по Папенгейму-Крюкову с фиксацией путем предварительного погружения в контейнер с фиксатором-красителем Мая-Грюнвальда на 5-10 мин и последующей докраской препаратов рабочим раствором краски Романовского-Гимзе в течение 20-25 минут, при этом время окрашивания определяют после тестирования свежеприготовленного красителя.

При окрашивании препарата используют автоматический стейнер открытого или закрытого типа.

Для минимизации потери биологического материала в процессе фиксации и окрашивания при подготовке цитологических препаратов используют предметные стекла с полилизиновым покрытием с положительно заряженной поверхностью.

При реализации способа

1. Не требуется половое воздержание, в отличие от исследования спермограммы.

2. Установлена гетерогенность исследования осадка эякулята (ОЭ). ОЭ является высококонцентрированным биоматериалом как для микроскопии, так для проведения полимеразно-цепной реакции (ПЦР).

3. ОЭ превосходит по диагностической значимости соскоб из уретрального отделяемого по выявлению вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР). ОЭ освобожден от спермоплазмы, которая, в свою очередь, является ингибитором ДНК-полимеразы в ПЦР (ингибирование может привести к получению недостоверных результатов).

4. ОЭ используется для цитологического исследования (ЦОЭ), что в свою очередь является необходим звеном в скриниговом обследовании урологических пациентов наряду с рутинной спермограммой для установления верного диагностического и лечебного менеджмента.

5. ОЭ используется для выявления инфекционных патогенов.

6. ОЭ используется для выявления злокачественных находок.

Сущность изобретения и возможность достижения технического результата будут более понятны из последующего описания со ссылками на фигуры графических материалов и фотографий.

Фиг. 1 - Препарат из осадка эякулята на обычном предметном стекле. Материал распределен не равномерно. При окрашивании был потерян материал с большей поверхности стекла, где он располагался плотно. Окрашивание по Романовскому.

Фиг. 2- Препарат из осадка эякулята на предметном стекле с повышенной адгезивной способностью. Материал распределен равномерно и при окрашивании не был потерян. Окрашивание по Романовскому.

Фиг. 3- Неравномерное, некачественное окрашивание мазка при многоразовом использовании предметного стекла (Препарат 1). Окрашивание по Романовскому. Увеличение ×100.

Фиг. 4 - Неравномерное распределение материала при многоразовом использовании предметного стекла (Препарат 2). Окрашивание по Романовскому. Увеличение ×100.

Фиг. 5 - Маркировка с использованием штрих кодирования.

Фиг. 6 - Маркировка водостойким маркером.

Фиг. 7 - Правильно приготовленный мазок осадка спермы. Макроскопическая оценка препарата. Материал ОЭ распределен по стеклу равномерно тонким слоем, при окрашивании не был потерян. Окрашивание по Романовскому

Фиг. 8 - Мазок осадка спермы. Микроскопическая оценка препарата. Сперматозоиды и T.vaginalis (стрелка) располагаются в один слой. Окрашивание по Романовскому. Увеличение ×1000

Фиг. 9 - Препарат осадка эякулята, толстый мазок. Элементы спермы в виде мультислоя - нагромождение сперматозоидов и клеток сперматогенеза, неподдающиеся просмотру и индентификации. Окрашивание по Романовскому. Увеличение ×100.

Фиг. 10 представляет устройство для приготовления мазка.

Фиг. 11 показывает процедуру приготовления мазка.

Фиг. 12 также показывает процедуру приготовления мазка.

Фиг. 13 - показывает окрашивание по Май-Грюнвальд-Гимзе (МГГ)*: быстрое окрашивание «вручную» V-Chromer® mini для 15 стекол.

Фиг. 14 - Процедура автоматического окрашивания V-Chromer.

Фиг. 15 показывает программно-аппаратные средства анализа Vision Cyto® Sperm Sediment: цифровую камеру, высококачественную оптическую систему, микроскопию окрашенного препарата, интерфейс алгоритма программного обеспечения, интеграцию с МИС (медицинская информационная система) и ЛИС (лабораторная информационная система).

Фиг. 16-19 представляют Алгоритм VisionSpermSediment (VSS).

Фиг. 20 - Осадок эякулята. Макрофаг - спермиофаг. Окрашивание по Романовскому. Увеличение ×1000.

Фиг. 21 - Осадок эякулята. Обильная микробиота - мелкие палочки в скоплениях. Окрашивание по Романовскому.

Фиг. 22 - Осадок эякулята. Entamoeba histolytica: округлой формы, мелкого размера, несколько округлых ядер разного размера. Окрашивание по Романовскому. Увеличение ×1000

Фиг. 23 - Осадок эякулята. Trichomonas vaginalis. Окрашивание по Романовскому. Увеличение ×1000.

Фиг. 24 - Осадок эякулята. Двухъядерные клетки метаплазированного уретрального эпителия с признаки папилломавирусной инфекции. Окрашивание по Романовскому. Увеличение ×1000.

Фиг. 25 - Осадок эякулята. Макрофаг - спермиофаг. Окрашивание по Романовскому. Увеличение ×1000 Клетки уретрального эпителия с признаками хламидийной инфекции - вакуолями в цитоплазме. Окрашивание по Романовскому. Увеличение ×1000.

Способ реализуется следующим образом.

Перед исследованием осадка эякулята не требуется половое воздержание, в отличие исследования спермограммы, накануне сбора эякулята с целью провокации воспалительного процесса для выявления инфекционного агента рекомендуется прием острой, соленой, пряной пищи. Сбор спермы путем мастурбации, без презерватива. Допускается сбор эякулята в специальные презервативы для сбора спермы с обязательной маркировкой на их упаковке «не токсично для сперматозоидов». Обычные презервативы не используют, т.к. содержат спермицидную смазку. Всю порцию спермы собирают в стерильный одноразовый пластиковый контейнер с завинчивающейся крышкой и маркируют. Если сперму собирают вечером, а доставку в лабораторию планируют на следующий день, контейнер с собранным биоматериалом помещают в холодильник при температуре от +2 до +8°С. В жаркое время года доставка в лабораторию осуществляют с соблюдением температурного режима холодовой цепи: холодильник от +2 до +8°С; термосумка с хладагентами и термометром от +2 до 8°С, доставить в лабораторию в течение 24 часов, не замораживать.

При соблюдении условий доставки и хранения клеточные элементы и инфекционные агенты не изменяют своей морфологической структуры

Для приготовления препаратов ОЭ используют стекла с повышенной адгезией. Используют стекла размером - 26×76×1,0 мм, т.е. стандартизованные для приготовления мазков ОЭ и последующей микроскопии. Стекла имеют гидрофильные поверхности, что обеспечивает хорошую адгезию материала и качественное окрашивание. В отличие от обычных стекол (фиг. 1) предметные стекла с адгезивным покрытием (с полилизиновым покрытием, Super Frost Plus с положительно заряженной поверхностью) обеспечивают наилучшее прикрепления клеточного материала к поверхности стекла (фиг. 2). При использовании обычных предметных стекол в процессе окрашивания препарата теряется часть биологического материала, а порой и весь ценный диагностический материал ОЭ. Использование предметных стекол с высокой адгезией сводит к минимуму потерю биоматериала и обеспечивает равномерное распределение материала при приготовлении мазка.

При многоразовом использовании предметных стекол, как это практикуется в некоторых клиническо-диагностических лабораториях (КДЛ), возможно, во-первых, механическое повреждение поверхности стекла с формированием царапин и сколов (Фиг. 3, 4). Во-вторых, на них могут быть следы плохо смытого предыдущего материала, остатки иммерсионного масла, моющего средства, которые невозможно удалить полностью даже после многоэтапной очистки высоко адгезивного стекла, и которые становятся причиной неравномерного и некачественного окрашивания препарата. Различные участки мазка могут окрашиваться в разные оттенки, что способно увеличить число артефактов и привести к недостоверной диагностике. Таким образом, для уменьшения артефактов и хорошей воспроизводимости оттенков окрашивания, предметные стекла должны использоваться однократно.

Маркировку препаратов осадка спермы производят с помощью наклейки со штрих кодом или водостойким маркером на матовом окошке стекла (Фиг. 5, 6).

Достоинством штрих-кодирования является возможность использования автоматического считывания штрих-кода и точной идентификации материала. В лабораториях без лабораторной информационной системы, сотрудник клинической диагностической лаборатории (КДЛ) наносит необходимую информацию на матовой полосе для записи предметного стекла. Если маркер или карандаш выходят на зону нанесения биоматериала, то во время работы частички графита затрудняют выполнение анализа. Распространение мелких частичек графита в иммерсионном масле загрязняет «чистые» участки препарата, увеличивая количество артефактов в целом. Решением данной проблемы является полный отказ от использования маркировки графитными карандашами. Далее получают осадок эякулята. Доставленный биоматериал проходит стадии инкубации в течение 20-30 мин в термостате (при температуре 37°С) до полного разжижения; переноса всей порции спермы в новую градуированную центрифужную пробирку объемом 10-12 мл; седиментации путем центрифугирования при 1000-1500 об./мин 15-20 минут; отделения пипеткой супернатанта без захвата осадка со дна. Оптимальный объем осадка эякулята - 10 мкл.

Правильная оценка морфологических особенностей цитологических находок в ОЭ возможна лишь на хорошо приготовленных и надлежащим образом окрашенных мазках.

Далее готовят предварительно промаркированное новое обезжиренное предметное стекло. Автоматической дозирующей пипеткой отбирают 10 мкл подготовленного осадка эякулята. Объем ОЭ 10 мкл обеспечивает формирование тонкого мазка на поверхности предметного стекла (фиг. 7). В тонком мазке возможен просмотр нетипичных для эякулята клеток с высокой точностью идентификации (фиг. 8). Как показывает практика, дозирование 10 мкл вязкой субстанции практически невозможно. В этом случае наносят на стекло то количество, которое удалось захватить наконечником дозирующего устройства, но не более 20 мкл.

Использование большого объема осадка может привести к формированию толстого слоя, распознавание клеток в котором может быть затруднено. Более того, плотный слой клеточной массы растрескивается на стекле, из-за чего существует риск отслоения его от стекла.

Приготовление мазка осуществляют двумя способами: ручным и полуавтоматическим с помощью специальных устройств-сэмплеров. Правильно приготовленный мазок ОЭ занимает 1/3-2/3 предметного стекла, отстоит от края на 5 мм, имеет тонкие участки для адекватного просмотра препарата. Длина и толщина мазка зависят от вязкости и плотности ОЭ, количества нанесенной субстанции.

Ручное приготовление заключается в осторожном распределении капли осадка спермы по стеклу с помощью одноразового пластикового лабораторного шпателя, держа под углом 45°, стараясь не повредить клеточные элементы.

Полуавтоматическое приготовление осуществляется с помощью сэмплеров: Для приготовления мазков осадка спермы желательно использовать устройства, обеспечивающие равномерное распределение клеток по поверхности предметного стекла (фиг. 10). Осторожно нажимают на рычаг (фиг. 11) и, убедившись, что он полностью опустился, отпускают его. После некоторой задержки можно увидеть распределение биоматериала на стекле и мазок готов (фиг. 12). При этом получают качественный, тонкий препарат независимо от опыта и квалификации сотрудников лаборатории. Использование прибора для приготовления мазков позволяет контролировать процесс приготовления препарата из ОЭ и получать стандартизированные мазки с достаточной для исследования «рабочей областью», что особенно важно для их дальнейшей покраски и компьютерной обработки изображения.

Мазки ОЭ хорошо высушивают. В обычных условиях для этого требуется 15-20 минут. При высокой влажности высыхание мазков замедляется. В этом случае необходимо обеспечить быстрое высыхание мазка, что может быть достигнуто в термостате при 37°С. Использование цито-центрифуги может быть целесообразным в случае азооспермии, олигозооспермии. В таких случаях концентрирование элементов спермы с помощью цито-центрифуги будет способствовать более вероятному поиску цитологических находок.

Для качественного окрашивания цитологических находок ОЭ используют три способа, которые применяют в зависимости от поточности исследований клинико-диагностической лаборатории и ее возможностей: 1) экспресс-окрашивание с использованием ручной методики окрашивания, 2) унифицированные ручные методы фиксации и окраски: по Романовскому-Гимзе, по Папенгейму-Крюкову, а также 3) аппаратный способ окраски с использованием автоматических приборов для окрашивания.

В процессе ручного окрашивания препаратов в связи с возможным несоблюдением временных интервалов протокол окраски соблюдается недостаточно строго. Как следствие, для исследования получаются некачественно окрашенные мазки, где трудно визуализировать клеточные элементы даже опытному специалисту.

Экспресс-окрашивание с использованием ручной методики представляют собой систему дифференциального окрашивания клеток, которая комбинирует многоцветность и качество классических систем (Май-Грюнвальд-Гимзе) с очень быстрым выполнением (около 15 секунд). В готовых наборах все реагенты готовы к использованию, стабильны при соблюдении условий хранения (15-20°С). Процедура: Май-Грюнвальд-Гимзе (МГГ)*: быстрое окрашивание «вручную» V-Chromer® mini для 15 стекол (фиг. 13).

Используют унифицированные ручные методы фиксации и окраски по Романовскому-Гимзе с предварительной фиксацией мазков 96% этиловым спиртом на 5 мин; по Папенгейму-Крюкову с фиксацией путем предварительного погружения в контейнер с фиксатором-красителем типа Мая-Грюнвальда на 5-10 мин и последующей докраской препаратов рабочим раствором краски Романовского-Гимзе в течение 20-25 минут. Время окрашивания определяют после тестирования свежеприготовленного красителя.

Использование автоматов для окраски значительно упрощает и улучшает рабочий процесс окрашивания. Необходимо поместить неокрашенные мазки в держатель и установить в прибор. На выходе получаются стандартно окрашенные и высушенные препараты. Дополнительным преимуществом является обеспечение минимального контакта персонала при работе с красящими веществами и вредными испарениями. Автоматическое окрашивание V-Chromer (фиг. 14).

Приготовление препаратов из ОЭ - это многоступенчатый процесс, который при соблюдении условий получения, хранения и доставки биоматериала, этапов приготовления препаратов из ОЭ и окрашивания позволяет получить качественные препараты с информативным материалом в диагностических целях.

Микроскопия препаратов ОЭ производилась с использованием фазово-контрастного светового лабораторного микроскопа с окулярами ×10 и объективами ×40 и ×100, а также с использованием программного обеспечением Vision Cyto® Sperm Sediment (VC®SS) с алгоритмом VisionSpermSediment (VSS), которые обеспечивают необходимую точность и полноту анализа.

Система Vision Cyto® Sperm Sediment включает следующие блоки: цифровую камеру, высококачественную оптическую систему, блок микроскопии окрашенного препарата, интерфейс алгоритма программного обеспечения, который гарантирует соблюдение всех этапов анализа для получения корректного результата, а также ведение единой базы данных пациента с документацией фотографий находок). Система интегрировано я с МИС (медицинская информационная система) и ЛИС (лабораторная информационная система).

Система обеспечивает выдачу презентабельных бланков результатов анализа (Фиг. 15)

Расчет Показателя риска (ПР) с помощью VSS - алгоритма повышает диагностическую ценность ЦОЭ при обнаружении Т. vaginalis у мужчин на 6,7%* (*Сапожкова Ж.Ю., Диагностическое значение различных лабораторных методов выявления трихомоноза у мужчин // Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, Москва, 2010 г. С. 55).

1. На первом этапе микроскопии оценивается фон препарата: общее увеличении микроскопа ×100 (т.е. комбинация ×10 линз объектива с ×10 линз окуляра), ×200 или ×400 общее увеличение (т.е. комбинация ×20 или ×40 объектива с ×10 окуляра) обеспечивает общую оценку препарата: определяется наличие крупных клеточных элементов (эпителиальных клеток, комплексов из клеток) с просмотром всей площади препарата. Наличие макрофагов (Фиг. 20), гистиоцитов, эритроцитов также подлежит оценке, так как эти элементы появляются при воспалительных заболеваниях урогенитального тракта.

2. На втором этапе при увеличении микроскопа ×1000 (окуляр ×10 и объектив ×100) оценивается:

- наличие воспалительной реакции: диагностический порог для оценки наличия воспаления: >3 лейкоцитов в поле зрения (при увеличении микроскопа ×1000)

- оценка сопутствующей микробиоты: полиморфные палочки (незначительное количество является вариантом нормы) (фиг. 21), смешанная, кокковая, кокко-бациллярная, нитчатые бактерии типа Лептотрикс, элементы гриба рода Кандида, диплококки, трихомонады, амебы и другие простейшие.

Оценка микроскопических находок:

Простейшие

- Единственным референтным методом для обнаружения T.vaginalis на территории России является микроскопический. Согласно положению действующего приказа МЗ СССР №1570 от 04.12.1986 г, постоянными идентификационными морфологическими признаками трихомонад в мазках являются характерное, интенсивно окрашенное, эксцентрически расположенное ядро и нежно-ячеистая цитоплазма.

Для идентификации Т. vaginalis в препарате ОЭ необходимо оценить следующие морфологические критерии (фиг. 23):

• форма (типичная грушевидная, округлая, иная)

• контур клетки (ровная, неровная, инвагинации в цитоплазме по типу макрофагального захвата),

• цвет цитоплазмы (нежно-голубой, иной)

• наличие синей линии перипласта (отсутствует, присутствует)

• жгутики (присутствуют, отсутствуют)

• форма ядра (миндалевидная, иная)

• положение ядра (эксцентричное, по центру)

• окраска ядра (розово-фиолетовое с равномерно и неравномерно прокрашенными зонами, иная).

- Обнаружение простейших с несколькими ядрами округлой формы позволяет заподозрить Enthamoeba histolytica (дизентерийная амеба) - для подтверждения необходимо провести иммунохроматографический тест на антиген к Enthamoeba histolytica (Vegal, Испания) (фиг. 22). Критерии оценки иммунохроматографического теста качественные: положительный, отрицательный, неадекватный (специфичность теста >99%, чувствительность теста >99%).

Оценка нетипичных для осадка эякулята клеток

- Клетки с признаками папилломавирусной инфекции - уплощенные, метаплазированные клетки, одно- или двухъядерные, реже многоядерные, со сглаженной или дегенеративно измененной структурой хроматина и с участками просветления в цитоплазме (фиг. 24).

- Клетки с признаками цитомегаловирусной инфекции - клетки с внутриядерными и/или цитоплазматическими включениями, хроматин конденсируется по границе ядерной оболочки.

- Признаки герпес-вирусной инфекции - многоядерные клетки с подстраивающимися ядрами со сглаженной структурой хроматина.

- Эпителий с включениями, морфологически сходными с хламидийными (фиг. 25).

- Эпителиальные клетки с дегенеративными изменениями вследствие воспаления.

- Клетки типа инородных тел (многоядерные гистиоциты).

- Клетки с признаками атипии: железистые, метаплазированные клетки с укрупненными ядрами, увеличенным ядерно-цитоплазматическим соотношением, неравномерным и грубым хроматином, расположенные разрозненно или в комплексах, железистоподобных структурах.

В результате дается комплексное заключение, используя установленные шаблоны, но с учетом персонифицированного подхода к каждому образцу ОЭ.

На первом этапе микроскопии оценивается фон препарата: общее увеличении микроскопа ×100 (т.е. комбинация ×10 линз объектива с ×10 линз окуляра), ×200 или ×400 общее увеличение (т.е. комбинация ×20 или ×40 объектива с ×10 окуляра) обеспечивает общую оценку препарата: определяется наличие крупных клеточных элементов (эпителиальных клеток, комплексов из клеток) с просмотром всей площади препарата. Наличие макрофагов (Фиг. 20), гистиоцитов, эритроцитов также подлежит оценке, так как эти элементы появляются при воспалительных заболеваниях урогенитального тракта.

На втором этапе при увеличении микроскопа ×1000 (окуляр ×10 и объектив ×100) оценивается:

- наличие воспалительной реакции: диагностический порог для оценки наличия воспаления: >3 лейкоцитов в поле зрения (при увеличении микроскопа ×1000)

- оценка сопутствующей микробиоты: полиморфные палочки (незначительное количество является вариантом нормы) (фиг. 21), смешанная, кокковая, кокко-бациллярная, нитчатые бактерии типа Лептотрикс, элементы гриба рода Кандида, диплококки, трихомонады, амебы и другие простейшие.

- Обнаружение простейших с несколькими ядрами округлой формы позволяет заподозрить Enthamoeba histolytica (дизентерийная амеба) - для подтверждения необходимо провести иммунохроматографический тест на антиген к Enthamoeba histolytica (Vegal, Испания) (фиг. 22). Критерии оценки иммунохроматографического теста качественные: положительный, отрицательный, неадекватный (специфичность теста >99%, чувствительность теста >99%).

Таким образом, применение способа подготовки и исследования цитологических препаратов позволяет исключить недостатки, присущие прототипу: низкую диагностическую ценность биоматериала «Сперма (эякулят») и низкую информативность диагностики - отсутствие возможности поиска диагностически значимых микроскопических находок - инфекционных патогенов.

Способ имеет следующие преимущества:

1. Не требуется половое воздержание, в отличие исследования спермограммы.

2. Вследствие гетерогенности осадка эякулята (ОЭ), ОЭ является высококонцентрированным биоматериалом как для микроскопии, так для проведения полимеразно-цепной реакции (ПЦР).

3. ОЭ превосходит по диагностической значимости соскоб из уретрального отделяемого по выявлению вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР). ОЭ освобожден от спермоплазмы, которая, в свою очередь, является ингибитором ДНК-полимеразы в ПЦР (ингибирование может привести к получению недостоверных результатов).

4. ОЭ используется для цитологического исследования (ЦОЭ), что, в свою очередь, является необходимым звеном в скрининговом обследовании урологических пациентов наряду с рутинной спермограммой для установления верного диагностического и лечебного менеджмента.

5. ОЭ используется для выявления инфекционных патогенов.

6. ОЭ используется для выявления злокачественных находок.

1. Способ подготовки и исследования цитологических препаратов для оценки качества спермы, включающий:

отбор клеток из осадка эякулята (ОЭ),

подготовку цитологических препаратов из отобранных клеток ОЭ с размещением на предметные стекла,

высушивание и окрашивание препаратов,

последующую оценку различных типов клеток, подсчет их количества и сравнение с данными контрольной группы для получения заключения,

при этом перед забором диагностического материала провоцируют воспалительный процесс для последующего выявления инфекционного агента,

ОЭ получают путем седиментации эякулята, для этого инкубируют эякулят в течение 20-30 мин в термостате при температуре 37°С до полного разжижения, порцию переносят в градуированную центрифужную пробирку; центрифугирование осуществляют при 1000-1500 об/мин в течение 15-20 мин; отделяют супернатант;

препарат готовят с помощью автоматической дозирующей пипетки, которой отбирают 10 мкл подготовленного ОЭ, наносят мазок таким образом, чтобы он занимал 1/3-2/3 площади предметного стекла, используют одноразовые предметные стекла с повышенной адгезией, имеющие полилизиновое покрытие, маркируют препарат с возможностью автоматического считывания штрихкода,

высушивание препарата осуществляют в термостате в течение 15-20 мин в условиях повышенной влажности и при температуре 37°С,

подсчет и оценку клеток проводят с помощью микроскопа, регулируя его оптическое увеличение:

регистрацию клеточных элементов, таких как эпителиальные клетки, комплексы из клеток, макрофагов, гистиоциты, эритроциты осуществляют при оптическом увеличении микроскопа ×400,

наличие воспалительной реакции регистрируют при наличии более трех лейкоцитов в поле зрения микроскопа при оптическом увеличении ×1000,

наличие или отсутствие микробиоты - при оптическом увеличении ×1000,

наличие нетипичных клеток - при оптическом увеличении ×100 или ×200 с последующим переводом на ×1000,

при микроскопическом цитологическом анализе ОЭ дополнительно к подсчету типов клеток на этапах их развития оценивают общий фон макропрепарата, а также подсчитывают процентное содержание сперматозоидов с патологией головки, шейки, хвоста.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что окрашивание препарата производят экспресс-методом с использованием многоцветности в течение 15 с.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что окрашивание препарата производят ручным методом по Романовскому-Гимзе с предварительной фиксацией мазков 96% этиловым спиртом в течение 5 мин; или по Папенгейму-Крюкову с фиксацией путем предварительного погружения в контейнер с фиксатором-красителем Мая-Грюнвальда на 5-10 мин и последующей докраской препаратов рабочим раствором краски Романовского-Гимзе в течение 20-25 мин, при этом время окрашивания определяют после тестирования свежеприготовленного красителя.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что окрашивание препарата проводят с помощью автоматического стейнера открытого или закрытого типа.