Деления витамина bis из культуральной жидкости

 

ГЛМ6@6

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства ¹â€”.Ч. Кл. А 61k 25i2

Заявлено ЗО.Х11.1968 (¹ 1292607 28-13) с присоединением заявки ¹â€”

Hpиоритет—

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

Оп бли ковано 15Х.1973. Бюллетень ¹ 21

УДК 663.11(Ю88.8>

Дата опубликования опиcàíèÿ 6.1Х.1973.Авторы изобретения

М. Б. Баторииа, В. Н. Букин, И. М. Зарицкий, Л. Н. Кондакова, М. Н. Нестюк, И. А. Рубцов и М. Г. Смирнова

Московский технологический институт пищевой промышленности

Заявитель

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В1

ИЗ КУЛЬТУРАЛЪНОЙ ЖИДКОСТИ

Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности.

Известны способы выделения витамина В а из культуральной жидкости, полученной в результате культивирования его продуцентов ме- 5 танового брожения путем гидролиза культуральной жидкости, адсорбции витамина из гидролизата на колонке с катионитом в Н— форме с последующей элюцией витамина с катионита водным раствором аммиака и аммиач- 1О но-боратным буфером и кристаллизацией его при помощи ацетона.

Для получения очищенного кристаллического витамина в результате удаления балластных веществ с помощью специально приготовленных форм сорбента щелочной и кислой хроматографической окиси аммония предложено элюат перед кристаллизацией обрабатывать сорбентом — щело шой окисью алюминия. Последний отделяют одним из извест- 20 ных спосооов, нап рямер дакгятацией, промыванием водой, а полученный раствор вместе с промывными водами,под1ки сляют tH оорабатывают кислой окисью алюминия с последующим подщелачиванием и фильтрацией очищенного 25 раствора от полученного осадка алюми натрия. Очистку ведут в следующих условиях: рН щелочной окиси алюминия равен 10,0, начальный рН очищаемого раствора 8,0, а конечный 10,0, рН кислой окиси алюминия равен 3,0, начальный рН очищаемого раствора

2,5 — 3,0, а конечный 4,0.

Способ заключается в следующем.

Культуральную жидкость метанового брожения подвергают гидролизу, гидролизат пропускают через колонку с катионитом в Н+-форме. С катионита витамин Вд элюируют водным раствором аммиака и аммиачно-боратным буфером. Полученные темно-окрашенные элюаты объединяют, доводят рН до 8,0 и обрабатывают щелочной окисью алюминия, имеющей рН 10,0; конечный рН очпщаемого раствора должен быть 8,0 — 9,0. При этом достигается частичная очистка. Затем декантат и промывные воды подкпсляют до рН 4,0 и обрабатывают кислой окисью алюминия, имеющей исходный рН 2,5 — 3,0. Конечный рН очпщаемого раствора равен 4,0.

Раствор декантнруют, сорбент промывают водой с рН 4,0. Полученный раствор имеет светло-розовую или желтовато-розовую окраску. Зтот раствор подвергают цпанированпю с последующей экстракционной очисткой.

Пример. 600 л культуральной жидкости с известным содержанием витам|ша В1 (по пробирочному методу с Е, coii 1!3 — 3) гидролизуют с помощью специально разработанного способа. Выход на гидролпзе 98,3о!о. Гидролизат пропускают через колонку с катиони275308

10."" = 1,71 в48

""" = 3,23 зчь

Предмет изобретения

Составитель Г. Богачева

Текред T. Курилко

Редактор В. Смирягина

Корректор Л. Царькова

Заказ 384/1!68 Изд. № 540 Тираж 467 Подписное

Ц! !ИИГ1И Комитета по делам изобретений и открытий прп Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раугвская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Г!атент» том СГ-1 в Н+-форме; после тщательного промывания колонки подкисленной водой витамин В1, элюируют с катионита водным раствором аммиака и аммиачно-боратным буфером.

Темно-коричневый щелочной элюат после доведения рН до 8,0 обрабатывают щелочной окисью алюминия в статических условиях, сорбент отделяют декантацией и промывают водой с рН 8,0. Полученный декантат и промывные воды подкисляют до рН 2,5 — 3,0 и обрабатывают кислой окисью алюминия в статических условиях, сорбент отделяют и промывают водой с рН 4,0. Очищенный желтоваторозовый раствор подщелачивают до рН 8,0, выпавший осадок алюмината натрия отфильтровывают; выход на стадии 68,5% от исходного (по пробирочному методу с Е. со11 113—

3). Прозрачный фильтрат обрабатывают цианистым калием.Цианированпый раствор экстрагируют смесью фенол-четыреххлористый углерод (1: 1,1 по объему), органическую фазу отделяют и после добавления 1,5 объема четыреххлористого углерода и 0,8 объема н-6утилового спирта витамин В» (кобаламин) извлекают водой, водный экстракт промывают эфиром. Выход на стадии 69,3% от исходного в культуральной жидкости (по фотоколориметрическому анализу).

Затем водный экстракт сгущают в вакууме до небольшого объема. Полученный водный концентрат разбавляют четырьмя объемами ацетона, выпавший осадок балластных веществ отделяют фильтрованием. Водно-ацетоновый экстракт подвергают хроматографированию на колонке, наполненной окисью алюминия, обработанной ацетоном. После адсорбции кобаламинов на верхней части слоя сорбента колонку промывают 80%-ным водным раствором ацетона. Витамин В» элюируют

50%-ным Водным раствором ацетона, при этом начальная и конечная фракции, обогащенные другими кобаламинами, собирают отдельно. Из темно-красного элюата кольца витамин В» кристаллизуют с помощью добавления большого количества ацетона. Выход сырь!х кристаллов составил 59,1% от содержания в исходной культуральной жидкости. По данным электрофореза и хроматографии, ца бумаге биологически активные формы составляют 93%, в том числе цианокобаламин 64%; спектр поглощения раствора кристаллов имеет максимум при длине волн 278, 360, 548 mp.

1. Способ выделения витамина В» из культуральной жидкости, полученной в результате культивирования его продуцентов метанового и, брожения путем гидролиза культуральной жидкости, адсорбции витамина из гидролизата на колонке с катионитом Н--форме с последующей элюцией витамина с катионита водным раствором аммиака и аммиачно-боратным буфером и кристаллизации его при помо1ци ацетона, отличающийся тем, что, с целью получения очищенного кристаллического витамина в результате удаления балластных веществ, элюат перед кристаллизацией обраба3О тывают сорбентом — щелочной окисью алюминия, последний отделяют одним из известных способов например декантацией, промыванием водой, а полученный раствор вместе с промывными водами подкисляют и обрабатывают кислой окисью алюминия с последующим подщелачиванием и фильтрацией очищенного раствора от полученного осадка алюмипата натрия.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при сильно загрязненных гидролизатах очистку производят в следующих условиях: рН щелочной окиси алюминия равен 10,0, началь1:ый рН очищаемого раствора 8,0, а конечный

10,0, рН кислой окиси алюминия равен 3,0, 45 начальный рН очи1цаемого раствора 2,5 — 3,0, а конечный 4,0.