Способ отбора противовоспалительных средств с использованием рассчитанных энергий взаимодействия с ферментами циклооксигеназ 1 и 2

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для отбора противовоспалительных средств, что позволяет осуществлять поиск биологически активных веществ с противовоспалительным действием в рядах производных антраниловой кислоты: N-замещенные антраниловые кислоты (1 ряд); гидразиды и амиды N-ацилантраниловых кислот (2 ряд); ариламиды N-ацил-М-алкенилантраниловых кислот (3 ряд). При этом рассчитывают энергии взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2: энергия связывания Be (Ве_ЦОГ1 и Ве_ЦОГ2) и межмолекулярная энергия Ime (Ime_ЦОГ1 и Ime_ЦОГ2), затем с помощью двух- и четырехпараметровых уравнений прогнозируют противовоспалительное действие (ПВД_рассч) и отбирают соединения, у которых теоретически рассчитанное ПВД превышает 30%, выбранные соединения синтезируют и подтверждают расчетные данные экспериментально на лабораторных животных (ПВД_эксп). Изобретение обеспечивает экспериментальные скрининговые исследования на животных не на всем объеме синтезированных веществ, а только тех, торможение отека которых превосходит 30%. 7 табл.

 

Изобретение относится к биологии и медицине и касается способа поиска новых противовоспалительных средств.

Известен способ отбора противовоспалительных средств из химических соединений, содержащих общий фармакофорный фрагмент: карбонил - фенильный радикал - вторичная или третичная аминогруппа, в котором все вещества разделены на четыре ряда: NH-замещенные антраниловые кислоты, ариламиды и гидразиды NH-алкенилантраниловых кислот, ариламиды N-ацетил-N-алкенилантраниловых кислот и аллиламиды NH-ацилантраниловых кислот [1]. Данный способ взят за прототип. Этот способ позволяет количественно определить уровень противовоспалительной активности на модели «каррагенинового отека» лапы крыс с помощью уравнений многопараметровой регрессии (четырех- и пятипараметровых).

Патентуемый способ заключается в прогнозе количественной оценки уровня экспериментального противовоспалительного действия ПВД (ПВД_эксп.) с помощью многопараметровых (двух- и четырехпараметровых) уравнений зависимости ПВД_эксп. от рассчитанных скоринговых функций - энергий взаимодействия с ферментами циклооксигеназ (ЦОГ) 1 и 2. Для достижения результата необходимо выполнить следующие действия:

I. Разбить 64 соединения из ряда производных антраниловой кислоты на гомологические ряды.

II. Для данных соединений экспериментально определить ПВД (ПВД_эксп.) на модели «каррагенинового отека» на крысах.

III. Рассчитать энергии взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2 для каждого соединения.

IV. Составить уравнения регрессии, по которым определить теоретически рассчитанную величину противовоспалительного действия (ПВД_рассч.).

V. Используя полученные уравнения регрессии (табл. 7), по структурной формуле выбрать соединения, торможение отека которых превышает 30%.

VI. Оценить качество прогноза ПВД_рассч. с ПВД_эксп..

Предлагаемая в способе последовательность действий над структурными формулами химических соединений, лабораторными животными и расчетными уравнениями позволяет получить технический результат - способ количественной прогнозной оценки уровня ПВД, который заключается в уменьшении затрат на синтез и сокращении числа химических соединений для испытания на биологическую активность.

Патентуемый способ предусматривает изучение связи данных ПВД_эксп. с рассчитанными параметрами: энергия связывания Be (Ве_ЦОГ1 и Ве_ЦОГ2) и межмолекулярная энергия Ime (Ime_ЦОГ1 и Ime_ЦОГ2) по ферментам ЦОГ 1 и 2. Расчет параметров проводили методом молекулярной стыковки (докинга) с помощью программы AutoDock 4, которая использует в качестве мишеней кристаллографические копии ферментов, полученные рентгеноструктурным анализом и представленные в виде pdb-файлов, взятых из базы данных Brookhaven Protein Data Bank: ЦОГ 1 (PDB ID code: 3N8X [2]) и ЦОГ 2: (PDB ID code: 1PXX [3]).

Все исследуемые 64 соединения обладают различным уровнем противовоспалительного действия экспериментального (ПВД_эксп.) (среди которых встречаются и запатентованные), разделены на три ряда:

1) N-замещенные антраниловые кислоты (табл. 1 и 2);

2) гидразиды и амиды N-ацилантраниловых кислот (табл. 3 и 4);

3) ариламиды N-ацил-N-алкенилантраниловых кислот (табл. 5 и 6).

Исследование противовоспалительного действия ПВД_эксп. выполнено на беспородных белых крысах массой 180-220 г на модели «каррагенинового отека» лапы. Исследуемые соединения в дозе 50 мг/кг вводили внутрибрюшинно в виде взвеси в 2% крахмальной слизи за 1 ч до введения каррагенина. Величину воспалительной реакции оценивали онкометрически по изменению объема воспаленной конечности через 4 ч после введения 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина [4].

Проведен расчет энергий взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2 (Ве_ЦОГ1, Ве_ЦОГ2, Ime_ЦОГ1 и Ime_ЦОГ2) для каждого соединения.

На основе полученных данных составляют уравнения многопараметровой регрессии для соединений по каждому ряду и выбирают наиболее значимое уравнение (табл. 7).

N-Замещенные антраниловые кислоты

В таблице 1 для 22 соединений из ряда N-замещенных антраниловых кислот приведены ПВД_эксп. и рассчитанные энергии взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2.

Х=Н, Y=Н, R=СН₂СН=СН₂, R₁=Н (1); Х=Н, Y=Н, R=Н, R₁=COCONHCH₂CH=CH₂ (2); Х=Н, Y=Н, R=Н, R₁=СО (2-Фурил) (3); Х=Н, Y=Н, R=Н, R₁=СОС₆Н₄(2-ОСН₃) (4); Х=Н, Y=Н, R=Н, R₁=СОСН₂С₆Н₅ (5); Х=Br, Y=Н, R=Н, R₁=CO-Ad (6); Х=Br, Y=Br, R=Н, R₁=CO-Ad (7); X=H, Y=H, R=H, R₁=COCH₃ (8); X=H, Y=H, R=CH₂CH=CClCH₃, R₁=СОСН₃ (9); X=H, Y=H, R=CH₂CH=CClCH₃, R₁=CO (2-Фурил) (10); X=H, Y=H, R=CH₂CH=CClCH₃, R₁=COC₆H₅ (11); X=H, Y=H, R=CH₂C₆H₅, R₁=H (12); X=Br, Y=H, R=H, R₁=COC₆H₅ (13); X=Br, Y=H, R=H, R₁=CO C₆H₄ (3-NO₂) (14); X=Br, Y=H, R=H, R₁=COCH₂C₆H₅ (15); X=Br, Y=H, R=H, R₁=CO (2-Фурил) (16); X=I, Y=H, R=H, R₁=COCH=CHCOOH (17); X=I, Y=H, R=H, R₁=CO(n-C₃H₆Cl) (18); X=I, Y=H, R=H, R₁=COC₆H₄(4-Cl) (19); X=I, Y=H, R=H, R₁=COC₆H₄(4-CH₃) (20); X=I, Y=H, R=H, R₁=COCH(C₆H₅)₂ (21); X=I, Y=H, R=H, R₁=СО(2-Фурил) (22).

Затем методом пошагового включения параметров с использованием программы Statistica 6, было составлено двухпараметровое уравнение 1 (табл. 7). Установлено, что уравнение зависимости экспериментально определенного ПВД от таких параметров как энергия связывания по ферменту ЦОГ 1 (Ве_ЦОГ1)» и межмолекулярная энергия по ЦОГ 2 (Ime_ЦОГ2), имеет наибольшие значения коэффициента корреляции (R), критерия Фишера (F) и критерия оценки методом перекрестного контроля исключением по одному (Q²_LOO), и минимальное значение среднеквадратичной ошибки (S):

ПВД_рассч = -1,315+6,661 × Ве_ЦОГ1 - 9,129 × Ime_ЦОГ2

Уравнение 1 апробировано для теоретического расчета ПВД на 5 примерах соединений 23-27 из ряда N-замещенных антраниловых кислот (табл. 2).

Х=Н, Y=Н, R=Н, R₁=СО С₆Н₄ (4-NO₂) (23); Х=Н, Y=Н, R=СН₂СН=CClCH₃, R₁=СОСН₂С₆Н₅ (24); Х=Н, Y=Н, R=СН₂СН=CClCH₃, R₁=COC₆H₄(4-NO₂) (25); Х=Br, Y=Н, R=Н, R₁=СО С₆Н₄ (4-Br) (26); Х=I, Y=Н, R=Н, R₁=СОС₆Н₅ (27).

Вначале были проведены расчеты энергий взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2: Ве_ЦОГ1 и Ime_ЦОГ2, и на их основе было рассчитано ПВД_рассч., а затем результаты расчетов были подтверждены экспериментально на лабораторных животных и определена ПВД_эксп..

Расчет прогнозируемого ПВД (ПВД_рассч.) для 5 соединений показал, что целесообразно провести синтез 3 соединений: 24, 25 и 27, интервал ПВД_рассч. которых будет лежать от 32,99% до 35,37%. При исследовании на лабораторных животных определено ПВД_эксп., которое составляет 46,85%, 41,90% и 37,35%, соответственно.

Для оценки качества прогноза ПВД (ПВД_рассч.) составлено линейное уравнение взаимосвязи с экспериментальными значениями ПВД (ПВД_эксп.):

ПВДр_ассч. = 0,28 × ПВД_эксп. + 22,49; R_прогн. = 0,948.

Линейная зависимость уравнения с коэффициентом корреляции (R_прогн. = 0,948), показывает очень высокую степень связи ПВД_рассч. с ПВД_эксп..

Таким образом, уравнение 1 можно использовать для прогнозирования ПВД в ряду N-замещенных антраниловых кислот.

Гидразиды и амиды N-ацилантраниловых кислот

В таблице 3 для 24 соединений из ряда гидразидов и амидов N-ацилантраниловых кислот приведены ПВД_эксп. и рассчитанные энергии взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2.

Х=Н, Y=H, R₁-СООС₂Н₅, R₂=NHNHCOCOOC₂H₅ (1); Х=Н, Y=H, R₁=CONHCH₂CH=CH₂, R₂=NHNH₂ (2); X=H, Y=H, R₁=CONHCH₂CH=CH₂, R₂=NHCH₂CH=CH₂ (3); X=H, Y=H, R₁=COOH, R₂=NHCH₂CH=CH₂ (4); X=H, Y=H, R₁=CONHCH₂CH=CH₂, R₂ = NH(CH₂)₂N(C₂H₅)₂ (5); X=H, Y=H, R₁=COOC₂H₅, R₂=NHCH₂CH=CH₂ (6); X=H, Y=H, R₁=CONHCH₂CH=CH₂, R₂=NHCH₂C(CH₃)₃ (7); X=Br, Y=Br, R₁=CH₃, R₂=NHNH₂ (8); X=Br, Y=Br, R₁=CH₃, R₂=NHCH₃ (9); X=Br, Y=Br, R₁=CH₃, R₂=NHCH₂CH₂OH (10); X=Br, Y=Br, R₁=CH₃, R₂=NH(CH₂)₂CH(CH₃)₂ (11); X=Br, Y=Br, R₁=CH₃, R₂=NHCH₂C₆H₅ (12); X=H, Y=H, R₁=Ad, R₂=NHCH₂CH=CH₂ (13); X=Br, Y=H, R₁=CH₂CH₂COOH, R₂=NH₂ (14); X=Br, Y=H, R₁=CH=CHCOOH, R₂=NH₂ (15); X=Br, Y=H, R₁=C₂H₄Cl, R₂=NH₂ (16); X=Br, Y=H, R₁=C(CH₃)=CH₂, R₂=NH₂ (17); X=Br, Y=H, R₁=CH₂Cl, R₂=NHC₆H₅ (18); X=Br, Y=H, R₁=CH₃, R₂=NH₂ (19); X=Br, Y=H, R₁=CH₂Cl, R₂=NH₂ (20); X=Br, Y=H, R₁=CH₂CH₂CH₂Cl, R₂=NH₂ (21); X=Br, Y=H, R₁=CH₂Cl, R₂=NHCH₂CH=CH₂ (22); X=Br, Y=H, R₁=CH₂CH₂Cl, R₂=NHCH₂CH=CH₂ (23); X=I, Y=H, R₁=CH₂C₆H₅, R₂=NHCH₂C₆H₅ (24).

Затем методом пошагового включения параметров с использованием программы Statistica 6, было составлено двухпараметровое уравнение 2 (табл. 7). Установлено, что уравнение зависимости экспериментально определенного ПВД от таких параметров как энергия связывания по ферментам ЦОГ 1 и 2: Ве_ЦОГ1 и Ве_ЦОГ2, имеет наибольшие значения коэффициента корреляции (R), критерия Фишера (F) и критерия оценки методом перекрестного контроля исключением по одному (Q²_LOO), и минимальное значение среднеквадратичной ошибки (S):

ПВД_рассч. = -60,487-5,642 × Ве_ЦОГ1 - 10,263 × Ве_ЦОГ2

Уравнение 2 апробировано для теоретического расчета ПВД на 7 примерах соединений 25-31 из ряда гидразидов и амидов N-ацилантраниловых кислот (табл. 4).

Х=Н, Y=H, R₁=СООС₂Н₅, R₂=NHC₆H₁₁ (циклогексил) (25); X=H, Y=H, R₁=CONHCH₂CH=CH₂, R₂=NH(CH₂)₂CH(CH₃)₂ (26); X=Br, Y=Br, R₁=CH₃, R₂=NHCH₂CH=CH₂ (27); X=Br, Y=H, R₁=CH₂C₆H₅, R₂=NHC₆H₅ (28); X=H, Y=H, R₁=CH₂Cl, R₂=NHCH₂CH=CH₂ (29); X=H, Y=H, R₁=CONHCH₂CH=CH₂, R₂=NHCH₂CH₂OH (30); X=H, Y=H, R₁=CONHCH₂CH=CH₂, R₂=NHCH₂C₆H₅ (31).

Вначале были проведены расчеты энергий взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2: Ве_ЦОГ1 и Ве_ЦОГ2, и на их основе было рассчитано ПВД_рассч., а затем результаты расчетов были подтверждены экспериментально на лабораторных животных и определена ПВД_эксп..

Расчет прогнозируемого ПВД (ПВД_рассч.) для 7 соединений, показал, что экспериментально синтезировать целесообразно 6 соединений 25-30, интервал ПВД_рассч. которых будет лежать от 35% до 64,20%. При исследовании на лабораторных животных определено ПВД_эксп., которое для соединений 25-30 составляет 32,4%, 35,60%, 33,10%, 44,45%, 39,85% и 39%, соответственно.

Для оценки качества прогноза ПВД (ПВД_рассч.) составлено линейное уравнение взаимосвязи с экспериментальными значениями ПВД (ПВД_эксп.):

ПВД_рассч. = 1,011 × ПВД_эксп. + 8,788; R_прогн. = 0,796.

Линейная зависимость уравнения с коэффициентом корреляции (R_прогн. = 0,796), показывает высокую степень связи ПВД_рассч. с ПВД_эксп..

Таким образом, уравнение 2 можно использовать для прогнозирования ПВД ряду гидразидов и амидов N-ацилантраниловых кислот.

Ариламиды N-ацил-N-алкенилантраниловых кислот

В таблице 5 для 18 соединений из ряда ариламидов N-ацил-N-алкенилантраниловых кислот приведены ПВД_эксп. и рассчитанные энергии взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2.

R₁=C₆H₄(4-Br), R₂=Ad, R₃=CH₂CH=CH₂ (1); R₁=C₆H₄(4-Br), R₂=Ad, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (2); R₁=C₆H₄(4-Cl), R₂=CH₃, R₃=CH₂CH=CH₂ (3); R₁=C₆H₄(4-Br), R₂=CH₃, R₃=CH₂CH=CH₂ (4); R₁=C₆H₄(4-Br), R₂=2-фурил, R₃=CH₂CH=CH₂ (5); R₁=C₅H₃(4-Br) 2-N, R₂=CH₃, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (6); R₁=C₆H₄(2-CH₃), R₂=CH₃, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (7); R₁=C₆H₄(4-CH₃), R₂=CH₃, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (8); R₁=C₆H₄(4-OCH₃), R₂=CH₃, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (9); R₁=C₆H₅, R₂=CH₂Cl, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (10); R₁=C₆H₅, R₂=C₂H₅, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (11); R₁=C₆H₄(3-CH₃), R₂=C₆H₅, R₃=CH₂CH=CH₂ (12); R₁=C₆H₅, R₂=2-фурил, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (13); R₁=C₆H₄(3-СН₃), R₂=H, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (14); R₁=C₆H₄(4-CH₃), R₂=H, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (15); R₁=C₆H₄(4-Br), R₂=H, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (16); R₁=C₆H₄(4-Cl), R₂=H, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (17); R₁=C₆H₄(4-OCH₃), R₂=H, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (18).

Затем методом пошагового включения параметров с использованием программы Statistica 6, было составлено четырехпараметровое уравнение 3 (табл. 7). Установлено, что уравнение зависимости экспериментально определенного ПВД по ферментам ЦОГ 1 и 2 от таких параметров как энергия связывания (Ве_ЦОГ1 и Ве_ЦОГ2) и межмолекулярная энергия (Ime_ЦОГ1 и Ime_ЦОГ2), имеет наибольшие значения коэффициента корреляции (R), критерия Фишера (F) и критерия оценки методом перекрестного контроля исключением по одному (Q²_LOO), и минимальное значение среднеквадратичной ошибки (S):

ПВДр_ассч. = -65,639 - 0,067 × Ве_ЦОГ1 - 0,071 × Ime_ЦОГ1 - 1,752 × Ве_ЦОГ2 - 10,111 × Ime_ЦОГ2

Уравнение 3 апробировано для теоретического расчета ПВД на 6 примерах, соединениях 19-24 из ряда ариламидов N-ацил-N-алкенилантраниловых кислот (табл. 6).

R₁=С₆Н₄(4-Br), R₂=С₆Н₄(4-СН₃), R₃=СН₂СН=СН₂ (19); R₁=C₆H₄(4-Br), R₂=СН₃, R₃=СН₂СН=CClCH₃ (20); R₁=С₆Н₅, R₂=СН₃, R₃=CH₂CH=CClCH₃ (21); R₁=С₆Н₄(3-СН₃), R₂=СН₃, R₃=СН₂СН=CClCH₃ (22); R₁=С₆Н₄(2-СН₃), R₂=Н, R₃=СН₂СН=CClCH₃ (23); R₁=С₆Н₄(3-СН₃), R₂=CH₂Cl, R₃=СН₂СН=СН₂ (24).

Вначале были проведены расчеты энергий взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2: Ве_ЦОГ1, Ве_ЦОГ2, Ime_ЦОГ1, Ime_ЦОГ2, и на их основе было рассчитано ПВД_рассч., а затем результаты расчетов были подтверждены экспериментально на лабораторных животных и определена ПВД_эксп..

Расчет прогнозируемого ПВД (ПВД_рассч.) для 6 соединений, показал, что экспериментально синтезировать целесообразно 5 соединений 20-24, интервал ПВД_рассч. которых будет лежать от 37,10% до 52,81%. При исследовании на лабораторных животных определено ПВД_эксп., которое составляет 40,40%, 57,30%, 49,70%, 59,00% и 58,40%, соответственно.

Для оценки качества прогноза ПВД (ПВД_рассч.) составлено линейное уравнение взаимосвязи с экспериментальными значениями ПВД (ПВД_эксп.):

ПВД_рассч. = 0,518 × ПВД_эксп. + 19,844; R_прогн. = 0,865.

Линейная зависимость уравнения с коэффициентом корреляции (R_прогн. = 0,865), показывает высокую степень связи ПВД_рассч. с ПВД_эксп..

Таким образом, уравнение 3 можно использовать для прогнозирования ПВД в ряду ариламидов N-ацил-N-алкенилантраниловых кислот.

Предлагаемый способ экономически выгоден и прост, так как позволяет по структурной формуле рассчитать энергии взаимодействия по ферментам циклооксигеназ 1 и 2, и с достаточно высокой достоверностью спрогнозировать уровень ПВД (по R 0,843÷0,920, F 18,01÷29,61, S 6,97÷9,84 по уравнениям 1-3 (табл. 7) и по методу перекрестной проверки исключением по одному (Q²_LOO) 0,61÷0,74). В отличие от патента [1], где используются четырех- и пятипараметровые уравнения регрессии, выборки составлены на примерах от 8 до 9 соединений и апробированы по 1 соединению для каждого ряда, в данном способе предлагаются двухпараметровые уравнения 1 и 2 и четырехпараметровое уравнение 3, уравнения составлены на примере от 18 до 24 соединений в каждом ряду и апробированы на примере от 5 до 7 соединений. Описанный принцип отбора противовоспалительных средств можно использовать и для других рядов химических соединений.

Литература

1. Патент 2242754. Рос. Федерация. Способ отбора противовоспалительных средств / Коркодинова Л.М., Вахрин М.И., Данилов Ю.Л., Фешин В.П., Марданова Л.Г. №2003115080; заявл. 20.05.2003; опубл. 20.11.2004.

2. Sidhu R.S., Lee, J.Y., Yuan С.. Comparison of Cyclooxygenase-1 Crystal Structures: Cross-Talk between Monomers Comprising Cyclooxygenase-1 Homodimers. // Journal Biochemistry., 49: 7069-7079 (2010).

3. Rowlinson S.W., Kiefer J.R.. A Novel Mechanism of Cyclooxygenase-2 Inhibition Involving Interactions with Ser-530 and Tyr-385. // Journal Biol. Chem., 278: 45763-45769 (2003).

4. Тринус Ф.П., Клебанов Б.М., Кондратюк В.И. Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению нестероидных противовоспалительных фармакологических веществ. М., Минздрав СССР, с. 16 (1983).

Способ отбора противовоспалительных средств, отличающийся тем, что позволяет осуществлять поиск биологически активных веществ с противовоспалительным действием в рядах производных антраниловой кислоты: N-замещенные антраниловые кислоты (1 ряд); гидразиды и амиды N-ацилантраниловых кислот (2 ряд); ариламиды N-ацил-М-алкенилантраниловых кислот (3 ряд), у которых рассчитывают энергии взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2: энергия связывания Be (Ве_ЦОГ1 и Ве_ЦОГ2) и межмолекулярная энергия Ime (Ime_ЦОГ1 и Ime_ЦОГ2), затем с помощью двух- и четырехпараметровых уравнений следующих видов:

1 ряд: ПВД_рассч= -1,315 + 6,661 × Ве_ЦОГ1 - 9,129 × Ime _ЦОГ2 (R=0,843, F=23,49, S=6,97, Q²_LOO=0,61) (1);

2 ряд: ПВД_рассч= -60,487 - 5,642 × Ве_ЦОГ1 - 10,263 × Ве_ЦОГ2 (R=0,859, F=29,61, S=9,84, Q²_LOO=0,61) (2);

3 ряд: ПВД_рассч= -65,639 - 0,067 × Ве_ЦОГ1 - 0,071 × Ime_ЦОГ1 - 1,752 × Ве_ЦОГ2 - 10,111 × Ime_ЦОГ2 (R=0,920, F=18,01, S=8,14, Q²_LOO=0,74) (3);

прогнозируют противовоспалительное действие (ПВД_рассч) и отбирают соединения, у которых теоретически рассчитанное ПВД превышает 30%, выбранные соединения синтезируют и подтверждают расчетные данные экспериментально на лабораторных животных (ПВД_эксп).