Антитело, специфически связывающееся с erbb3, и его применение
Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с ErbB3, а также фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания, связанного с активацией или сверхэкспрессией белка ErbB3. Кроме того, рассмотрены способ профилактики или лечения заболевания, связанного с активацией или сверхэкспрессией белка ErbB3, и способ профилактики или лечения резистентности к противораковым лекарственным средствам. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии различных видов рака. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 14 ил., 6 табл., 5 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Один или более примеров вариантов осуществления относятся к антителу, специфически связывающемуся с белком ErbB3 рецепторной тирозинкиназы или антигенсвязывающему фрагменту антитела, способу их получения и их применению.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Семейство рецепторных тирозинкиназ рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR или ErbB) включает ErbB1 (также известный как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR)), ErbB2 (также известный как человеческий рецептор эпидермального фактора роста 2 (HER2)), ErbB3 (также известный как HER3) и ErbB4 (также известный как HER4). Рецепторные тирозинкиназы семейства ErbB могут образовывать гомодимер или гетеродимер посредством комбинации с лигандом и могут активировать путь передачи сигнала митоген-активируемой протеинкиназы киназы (MAP2K, MEK или MAPKK)/митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), или путь передачи сигнала фосфоинозитид-3-киназы (PI3K)/протеинкиназы B (PKB или Akt). Сообщается, что семейство белков ErbB имеет отношение к возникновению, развитию или прогнозу появления злокачественного новообразования.
[0003] Эрбитукс® (Цетуксимаб) или Тарцева® (Эрлотиниб) в качестве ингибиторов ErbB1 и Герцептин® (Трастузумаб) или Тайверб® (Лапатиниб) в качестве ингибиторов ErbB2 являются доступными для приобретения противоопухолевыми препаратами. Однако большое число пациентов являются нечувствительными к этим противоопухолевым препаратам, и действие этих противоопухолевых препаратов сопровождается развитием резистентности. Специфичное ингибирующее антитело против ErbB3 или ErbB4, доступное для приобретения, все еще не получено.
[0004] Следовательно, существует потребность в развитии новых противоопухолевых препаратов, которые могут справиться с проблемой генетического разнообразия злокачественных новообразований и решить проблему резистентности к противоопухолевым препаратам.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА
[0005] Один или несколько примеров вариантов осуществления включают антитело, специфически связывающееся с ErbB3, или его антигенсвязывающий фрагмент.
[0006] Один или несколько примеров вариантов осуществления включают фармацевтическую композицию для профилактики или лечения заболевания, относящегося к активации или сверхэкспрессии белка ErbB3.
[0007] Один или несколько примеров вариантов осуществления включают способ профилактики или лечения заболевания, относящегося к активации или сверхэкспрессии белка ErbB3 у индивидуума.
ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ
[0008] По данной заявке испрашивается приоритет в соответствии с Заявкой на патент Республики Корея № 10-2015-0173281, поданной 7 декабря 2015 г., в Ведомство по охране прав в области интеллектуальной собственности Республики Корея, раскрытие которой полностью включено в данное описание посредством ссылки.
[0009] Теперь будет сделана подробная ссылка на примеры вариантов осуществления, которые иллюстрируются на сопровождающих чертежах, где подобные номера позиций относятся к подобным элементам на протяжении всего описания. В этой связи, настоящие примеры вариантов осуществления могут иметь различные формы и не должны рассматриваться, как ограниченные описаниями, приведенными в настоящем раскрытии. Соответственно, примеры вариантов осуществления просто описаны ниже посредством ссылки на чертежи, чтобы объяснить аспекты настоящего описания. Как применяют в настоящем описании, термин "и/или" включает любые и все комбинации одного или более ассоциированных перечисленных признаков. Такие выражения, как "по меньшей мере один из", когда предшествуют перечню элементов, модифицируют полный перечень элементов и не модифицируют индивидуальные элементы перечня.
[0010] Согласно аспекту настоящего раскрытия, антитело, специфически связывающееся с ErbB3, или антигенсвязывающий фрагмент антитела включают:
[0011] вариабельную область тяжелой цепи, включающую по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:61-85 и 102;
[0012] вариабельную область легкой цепи, включающую по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:86-101 и 103; или
[0013] вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи.
[0014] Существуют пять типов тяжелых цепей, обозначаемых γ, δ, α, μ и ε. Тип тяжелой цепи определяет класс антитела. Каждая цепь из тяжелых цепей типов α и γ состоит из приблизительно 450 аминокислот, в то время как каждая цепь μ и ε состоит из приблизительно 550 аминокислот. Каждая тяжелая цепь имеет две области, т.е., вариабельную область и константную область.
[0015] Существуют два типа легких цепей, обозначаемых λ и κ. Каждая легкая цепь состоит из приблизительно 211-217 аминокислот. Каждое человеческое антитело содержит только один тип легкой цепи. Каждая легкая цепь содержит два последовательных домена, включающих одну константную область и одну вариабельную область.
[0016] Вариабельная область относится к области антитела, которая связывается с антигеном.
[0017] Вариабельная область тяжелой цепи может включать: область, определяющую комплементарность-H1 (CDR-H1), включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:61-68; CDR-H2, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:69-77 и 102; и CDR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:78-85. Например, вариабельная область тяжелой цепи может включать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-30. Термин "область, определяющая комплементарность (CDR)" относится к участку вариабельной области антитела, который придает специфичность связывания антителу или его антигенсвязывающему фрагменту с антигеном.
[0018] Вариабельная область легкой цепи может включать: CDR-L1, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:86, 87 и 103; CDR-L2, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:88-93; и CDR-L3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:94-101. Например, вариабельная область легкой цепи может включать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:31-60.
[0019] Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из вариабельных областей тяжелой цепи CDR-H1, CDR-H2, и CDR-H3, которые представляют аминокислотные последовательности, приведенные в Таблице 5.
[0020] [Таблица 5]
| № | CDR-H1 | CDR-H2 | CDR-H3 |
| 1 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTYYADSVQG (SEQ ID NO:69) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 2 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
TIDLDSGSIYYADSVQG (SEQ ID NO:70) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 3 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTDYADSVQG (SEQ ID NO:71) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 4 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIEPDFGSSYYADSVRG (SEQ ID NO:72) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 5 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
IIEPDSGSIYYADSVQG (SEQ ID NO:73) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 6 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTDYADSVQG (SEQ ID NO:71) |
DRHMWPEGPFDY (SEQ ID NO:79) |
| 7 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTYYADSVQG (SEQ ID NO:69) |
DRHMWPEGPFDY (SEQ ID NO:79) |
| 8 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTYYADSVQG (SEQ ID NO:69) |
DRHMWPEGPFDY (SEQ ID NO:79) |
| 9 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTYYADSVQG (SEQ ID NO:69) |
DRHMWPEGPFDY (SEQ ID NO:79) |
| 10 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
TIDLDSGSIYYADSVQG (SEQ ID NO:70) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 11 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
TIDLDSGSIYYADSVQG (SEQ ID NO:70) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 12 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIEPDSGSTDYADSVQG (SEQ ID NO:74) |
DRHMWPEGPFDY (SEQ ID NO:79) |
| 13 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
TIEPDSGSTYYADSVQS (SEQ ID NO:75) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 14 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTYYADSVQG (SEQ ID NO:69) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 15 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTDYADSVQG (SEQ ID NO:71) |
DLHMWPEGPFDY (SEQ ID NO:80) |
| 16 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
TIEPDYGSTLYADSVQG (SEQ ID NO:102) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 17 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
GISYDGGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:76) |
DPSWCLQDLCYYADGMDV (SEQ ID NO:81) |
| 18 | WYDMT (SEQ ID NO:62) |
GISYDGGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:76) |
DPSWCLQDLCYYADGMDV (SEQ ID NO:81) |
| 19 | WYDLA (SEQ ID NO:63) |
GISYDGGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:76) |
DPSWCLQDLCYYADGMDV (SEQ ID NO:81) |
| 20 | WYDMS (SEQ ID NO:64) |
GISYDGGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:76) |
DPSWCLQDLCYYADGMDV (SEQ ID NO:81) |
| 21 | WYDIA (SEQ ID NO:65) |
GISYDGGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:76) |
DPSWCLQDLCYYADGMDV (SEQ ID NO:81) |
| 22 | WYDLS (SEQ ID NO:66) |
GISYDGGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:76) |
DPSWCLQDLCYYADGMDV (SEQ ID NO:81) |
| 23 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFVSDSTFDY (SEQ ID NO:82) |
| 24 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFMSDSTFDY (SEQ ID NO:83) |
| 25 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFASDSTFDY (SEQ ID NO:84) |
| 26 | HYDMS (SEQ ID NO:67) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFASDSTFDY (SEQ ID NO:84) |
| 27 | YYDMS (SEQ ID NO:68) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFASDSTFDY (SEQ ID NO:84) |
| 28 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFESDSTFDY (SEQ ID NO:85) |
| 29 | HYDMS (SEQ ID NO:67) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFESDSTFDY (SEQ ID NO:85) |
[0021] Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут включать вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:61, CDR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:69, и CDR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:78.
[0022] Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут включать вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из вариабельных областей легкой цепи CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, которые включают аминокислотные последовательности, приведенные в Таблице 6.
[0023] [Таблица 6]
| № | CDR-L1 | CDR-L2 | CDR-L3 |
| 31 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 32 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
QGWDTSLSGHV (SEQ ID NO:95) |
| 33 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 34 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 35 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 36 | SGSSSNIGSNSGS (SEQ ID NO:87) |
ADNWRPS (SEQ ID NO:89) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 37 | SGSSSNIGSNSGS (SEQ ID NO:87) |
ADNHRPS (SEQ ID NO:90) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 38 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 39 | SGSSSNIGSNSGS (SEQ ID NO:87) |
ADNWRPS (SEQ ID NO:89) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 40 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
VGWDSSLYGHV (SEQ ID NO:96) |
| 41 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
HAWDSSLWGDV (SEQ ID NO:97) |
| 42 | SGSSSNIGSNSGS (SEQ ID NO:87) |
ADNWRPS (SEQ ID NO:89) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 43 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 44 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
HAWDSSLYVDV (SEQ ID NO:98) |
| 45 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADNFRPS (SEQ ID NO:91) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 46 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
HAWDSSLSGDF (SEQ ID NO:99) |
| 47 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADSNRPS (SEQ ID NO:92) |
GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO:100) |
| 48 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADSNRPS (SEQ ID NO:92) |
GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO:100) |
| 49 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADSNRPS (SEQ ID NO:92) |
GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO:100) |
| 50 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADSNRPS (SEQ ID NO:92) |
GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO:100) |
| 51 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADSNRPS (SEQ ID NO:92) |
GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO:100) |
| 52 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADSNRPS (SEQ ID NO:92) |
GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO:100) |
| 53 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 54 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 55 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 56 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 57 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 58 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 59 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 60 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
[0024] Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:86, CDR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:88, и CDR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:94.
[0025] ErbB3 может представлять собой полипептид ErbB3 или его фрагмент. Полипептид ErbB3 может представлять собой человеческую аминокислотную последовательность с учетным номером в GenBank № NP_001005915 или мышиную аминокислотную последовательность с учетным номером в GenBank № NP_034283. Фрагмент полипептида ErbB3 может быть полипептидом, включающим частичную аминокислотную последовательность полипептида ErbB3. ErbB3 представляет собой рецепторную тирозинкиназу семейства рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR или ErbB) и также известен как HER3.
[0026] Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с ErbB3, могут иметь сродство к полипептиду ErbB3 или его фрагменту.
[0027] Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут ингибировать связывание белка ErbB3 с веществом, которое специфически связывается с белком ErbB3, димеризацию белка ErbB1 и белка ErbB3, димеризацию белка ErbB1 и белка ErbB3, димеризацию белка ErbB2 и белка ErbB3, фосфорилирование ErbB3 или Akt или их комбинацию. Вещество, специфически связывающееся с белком ErbB3, может представлять собой херегулин (HRG).
[0028] Термин "антитело" применяют взаимозаменяемо с термином "иммуноглобулин (Ig)." Полное антитело имеет структуру, включающую две непроцессированных легких цепи и две непроцессированных тяжелых цепи, которые соединены посредством дисульфидных связей (SS). Антитело может представлять собой, например, IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. Антитело может быть моноклональным антителом или поликлональным антителом. Антитело может представлять собой антитело животного происхождения, мышиное-человеческое химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело.
[0029] Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к фрагменту целой иммуноглобулиновой структуры, который может являться частью полипептида, включающей антигенсвязывающий участок. Например, антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой scFv, (scFv)2, Fv, Fab, Fab', Fv F(ab')2, или их комбинацию.
[0030] Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть модифицированы. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть модифицированы посредством конъюгирования или связывания, гликозилирования, присоединения метки или их комбинации. Антитело может быть конъюгировано с другими лекарственными средствам, такими как противоопухолевое лекарственное средство. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть конъюгированы с пероксидазой хрена (HRP), щелочной фосфатазой, гаптеном, биотином, стрептавидином, флуоресцентным веществом, радиоактивным веществом, квантовыми точками, полиэтиленгликолем (ПЭГ), гистидиновой меткой или их комбинацией. Флуоресцентное вещество может представлять собой Alexa Fluor®532, Alexa Fluor®546, Alexa Fluor®568, Alexa Fluor®680, Alexa Fluor®750, Alexa Fluor®790, или Alexa Fluor™350.
[0031] Согласно одному другому аспекту настоящего раскрытия, фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания, относящегося к активации или сверхэкспрессии белка ErbB3, включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из описанных выше примеров вариантов осуществления.
[0032] Антитело, антигенсвязывающий фрагмент и белок ErbB3 являются такими же, как описано выше.
[0033] Заболевание, относящееся к активации или сверхэкспрессии белка ErbB3, может представлять собой злокачественное новообразование. Злокачественное новообразование может представлять собой солидный рак или несолидный рак. Солидные раки относятся к случаям возникновения злокачественных опухолей в твердых органах, таких как печень, легкое, молочная железа или кожа, в то время как несолидные раки относятся к злокачественным новообразованиям, поражающим кровь, и таким образом, их называют гемобластозы. Например, злокачественное новообразование может быть выбрано из группы, состоящей из рака молочной железы, рака кожи, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, рака легких, рака толстой кишки, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, рака яичника, рака простаты, рака мочевого пузыря, рака матки, рака печени, рака почки, светлоклеточной саркомы, меланомы, цереброспинальных опухолей, рака мозга, тимомы, мезотелиомы, рака пищевода, рака желчных протоков, рака яичка, эмбрионального рака, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака шейки матки, рака эндометрия, лимфомы, миелодиспластических синдромов (MDS), миелофиброза, острого лейкоза, хронического лейкоза, множественной миеломы, болезни Ходжкина, эндокринного рака, и саркомы.
[0034] Термин "профилактика" относится к любому действию, которое подавляет или замедляет наступление заболевания, относящегося к активации или сверхэкспрессии белка ErbB3, посредством введения фармацевтической композиции. Термин "лечение" относится к любому действию, которое частично снимает симптомы заболевания, относящегося к активации или сверхэкспрессии белка ErbB3, посредством введения фармацевтической композиции.
[0035] Фармацевтическая композиция может включать фармацевтически приемлемый носитель. Носитель может рассматриваться в значении эксципиента, разбавителя или адъюванта. Например, носитель может быть выбран из группы, состоящей из лактозы, декстрозы, сахарозы, сорбита, маннита, ксилита, эритрита, мальтита, крахмала, гуммиарабика, альгината, желатина, фосфата кальция, силиката кальция, целлюлозы, метилцеллюлозы, поливинилпирролидона, воды, физиологического раствора, буфера, такого как забуференный раствором физраствор (PBS), метилгидроксибензоата, пропилгидроксибензоата, талька, стеарата магния, глицина, гистидина, серина, полисорбата и минерального масла. Фармацевтическая композиция может включать наполнитель, антикоагулянт, смазывающее средство, увлажнитель, вкусовой агент, эмульгатор, консервант или их комбинацию.
[0036] Фармацевтическая композиция может быть составлена в любой форме с использованием любого общепринятого способа в данной области. Например, фармацевтическая композиция может быть составлена в виде пероральной дозированной формы (например, порошков, таблеток, капсул, сиропов, пилюль или гранул) или в виде парентеральной дозированной формы (например, инъекции). Фармацевтическая композиция может быть получена в виде лекарственной формы для системной доставки или лекарственной формы для местной доставки.
[0037] Фармацевтическая композиция может дополнительно включать противоопухолевое лекарственное средство. Противоопухолевое лекарственное средство может представлять собой Цетуксимаб, Панитумумаб, Эрлотиниб, Гефитиниб, Трастузумаб, T-DM1, Пертузумаб, Лапатиниб, Паклитаксел, Тамоксифен, Цисплатин, антитело против CTLA-4, антитело против PD-1, антитело против PD-L-1, 5-фторурацил (5FU), Гемцитабин, или их комбинацию. Фармацевтическая композиция может включать единственную композицию или раздельные композиции. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент фармацевтической композиции могут представлять собой композицию в парентеральной дозированной форме, а противоопухолевое лекарственное средство может являться композицией в пероральной дозированной форме.
[0038] Фармацевтическая композиция может включать эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, противоопухолевое лекарственное средство или их комбинацию. Термин "эффективное количество", используемый в данном описании, относится к количеству, достаточному для профилактики или лечения заболевания, относящегося к активации или сверхэкспрессии белка ErbB3, при введении индивидууму, который нуждается в такой профилактике или таком лечении. Эффективное количество может быть подходящим образом выбрано в зависимости от выбранной клетки или индивидуума рядовым специалистом в данной области. Например, эффективное количество может быть определено в зависимости от тяжести заболевания, возраста, массы тела, состояния здоровья, половой принадлежности пациента, чувствительности пациента к лекарственному средству, продолжительности введения, пути введения, скорости экскреции, продолжительности лечения и других факторов, включающих применение лекарственного средства в комбинации или в одновременно с фармацевтической композицией, и других факторов, известных в области медицины. Эффективное количество может составлять от около 0,5 мкг до около 2 г, от около 1 мкг до около 1 г, от около 10 мкг до около 500 мг, от около 100 мкг до около 100 мг, или от около 1 мг до около 50 мг фармацевтической композиции.
[0039] Доза фармацевтической композиции может составлять, например, от около 0,001 мг/кг до около 100 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 10 мг/кг или от около 0,1 мг/кг до около 1 мг/кг, при введении взрослому человеку. Количество введений может составлять, например, один или множество раз в день, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели или один раз в год.
[0040] Согласно одному другому аспекту настоящего раскрытия, способ профилактики или лечения заболевания, относящегося к активации или сверхэкспрессии белка ErbB3 у индивидуума, включает введение индивидууму антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно описанным выше примерам вариантов осуществления.
[0041] Антитело, антигенсвязывающий фрагмент, белок ErbB3, заболевание, относящееся к активации или сверхэкспрессии белка ErbB3, профилактика или лечение могут быть такими же, как описано выше.
[0042] Индивидуум может являться млекопитающим, например, человеком, коровой, лошадью, свиньей, собакой, овцой, козой или кошкой. Индивидуум может представлять собой индивидуума, который страдает от заболевания, относящегося к активации или сверхэкспрессии белка ErbB3, или который является восприимчивым к заболеванию, которое может быть злокачественным новообразованием.
[0043] Способ может дополнительно включать введение противоопухолевого лекарственного средства индивидууму. Противоопухолевое лекарственное средство может вводиться в одно и то же время, раздельно, или последовательно с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом согласно любому из описанных выше примеров вариантов осуществления.
[0044] Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, противоопухолевое лекарственное средство или их комбинация могут непосредственно вводиться индивидууму посредством любого способа, например, посредством перорального, внутривенного, внутримышечного, чрескожного, чресслизистым путем, интраназального, интратрахеального или подкожного введения. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, противоопухолевое лекарственное средство или их комбинация могут вводиться системно или местно. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, противоопухолевое лекарственное средство или их комбинация могут вводиться по отдельности или вместе с фармацевтически активным соединением.
[0045] Доза антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, противоопухолевого лекарственного средства или их комбинации может варьировать в зависимости от состояния, массы тела, тяжести заболевания пациента, формы лекарственного средства, пути введения, продолжительности введения, и может быть подходящим образом выбрана рядовым специалистом в данной области. Например, доза антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, противоопухолевого лекарственного средства или их комбинации может составлять от около 0,001 мг/кг до около 100 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 10 мг/кг или от около 0,1 мг/кг до около 1 мг/кг при введении взрослому пациенту. Количество введений может составлять, например, один или множество раз в день, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели или один раз в год.
[0046] Согласно одному другому аспекту настоящего раскрытия, способ профилактики или лечения резистентности к противоопухолевому средству у индивидуума включает введение индивидууму антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из п.п. 1-10.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0047] Эти и/или другие аспекты станут очевидными и более понятными, исходя из следующего описания примеров вариантов осуществления, взятых в сочетании с сопроводительными чертежами, на которых:
[0048] ФИГ. 1A и 1B иллюстрируют аминокислотные последовательности и области, определяющие комплементарность (CDR), в вариабельных областях тяжелых цепей (ФИГ. 1A) и легких цепей (ФИГ. 1B) антител-лидеров и модифицированных на их основе антител;
[0049] ФИГ. 2 представляет собой график, показывающий сродство к связыванию (%) белка ErbB3 и HRG в присутствии антител против ErbB3;
[0050] ФИГ. 3 представляет собой график, показывающий сродство к связыванию (%) белка ErbB2 и белка ErbB3 в присутствии антител против ErbB3;
[0051] ФИГ. 4A и 4B представляют собой графики, показывающие отношения фосфорилирования (%) ErbB3 и Akt, соответственно, в присутствии антител против ErbB3;
[0052] ФИГ. 5 представляет собой график относительной пролиферации (%) клеток BxPC3 рака поджелудочной железы в присутствии антител против ErbB3;
[0053] ФИГ. 6 представляет собой график объема опухоли (мм3) для ксенотрансплантатной модели рака молочной железы BT474 после введения антител против ErbB3;
[0054] ФИГ. 7 представляет собой график объема опухоли (мм3) для ксенотрансплантатной модели рака молочной железы MDA-MB-468 после введения антител против ErbB3;
[0055] ФИГ. 8 представляет собой график объема опухоли (мм3) ксенотрансплантатной модели рака кожи A431 после введения антител против ErbB3;
[0056] ФИГ. 9 представляет собой график объема опухоли (мм3) для ксенотрансплантатной модели рака головы и шеи FaDu после введения антител против ErbB3 или комбинированного введения антител против ErbB3 и Цетуксимаб;
[0057] ФИГ. 10 представляет собой график активности каспазы 3/7 (в относительных единицах яркости (RLU)) для клеток рака молочной железы после комбинированного введения паклитаксела, HRG и антитела против ErbB3;
[0058] ФИГ. 11 представляет собой график степени пролиферации раковых клеток (%) для клеток рака ободочной и прямой кишки после комбинированного введения Цетуксимаб, HRG и антитела против ErbB3; и
[0059] ФИГ. 12 представляет собой график объема опухоли для резистентной к Цетуксимаб ксенотрансплантатной модели после комбинированного введения Цетуксимаб и антитела против ErbB3.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0060] Один или несколько вариантов осуществления настоящего раскрытия будут теперь подробно описаны при ссылке на следующие примеры. Однако эти примеры приведены только с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения одного или нескольких вариантов осуществления настоящего раскрытия.
[0061] Пример 1. Получение антитела против ErbB3
[0062] 1. Скрининг антитела-лидера
[0063] Для получения человеческих антител против ErbB3, проводили скрининг человеческой синтетической библиотеки scFv-фагового отображения (предоставленной H.B. SHIM из Ewha Womans University, Korea) против белка ErbB3 (R&D systems) для получения фрагментов фагового отображения scFv, которые связываются с ErbB3.
[0064] Анализировали последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих фрагменты scFv полученного фага, и аминокислотные последовательности доменов VH и VL фрагментов scFv, которые связываются с ErbB3, идентифицировали посредством анализа аминокислотной последовательности. После получения последовательностей фрагментов scFv, которые связываются с ErbB3, домены VH и VL реконструировали, используя вектор Selexis 085 (Selexis), кодирующий IgG1, чтобы, таким образом, собрать полный ген антител. Реконструированные векторы экспрессии, кодирующие IgG1, трансформировали и экспрессировали в небольшом масштабе в линиях клеток яичника китайского хомяка (CHO). Экспрессированные антитела против ErbB3 подвергали измерению сродства к связыванию с Erb3 и анализу на основе клеток, чтобы, таким образом, провести скрининг антител-лидеров против ErbB3, 442P, 472P, и 451P, которые ингибируют херегулин (HRG)-зависимую передачу сигнала от ErbB3.
[0065] 2. Скрининг модифицированных антител из антител-лидеров
[0066] Библиотеки отображения Fab-фагов создавали посредством введения мутаций в шесть участков CDR, прошедших скрининг антител-лидеров против ErbB3, 442P, 472P и 451P из Примера 1.1 посредством случайного мутагенеза. Библиотеки отображения Fab-фагов амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами (от Integrated DNA Technologies, Inc.), которые были сделаны на заказ, и полимеразой Phusion (New England Biolabs).
[0067] Построенные библиотеки отображения Fab-фагов подвергали скринингу против рекомбинантного человеческого белка ErbB3 (R&D Systems) для скрининга антител с улучшенным сродством к связыванию с рекомбинантным человеческим ErbB3 в сравнении с антителами-лидерами. Прошедшие через скрининг антитела реконструировали до IgG, как описано в Примере 1.1 и трансформировали и экспрессировали в небольшом масштабе в линиях клеток CHO.
[0068] Сродство к связыванию антител против ErbB3 измеряли, используя систему Octet® QK384 (Pall Life Sciences). Антитела с улучшенным сродством к связыванию в сравнении с антителами-лидерами подвергали скринингу на основании результатов и подвергали анализу на основе клеток для подтверждения эффективности действия. Аминокислотные последовательности вариабельных областей антител-лидеров против ErbB3 и модифицированных антител анализировали, и области, определяющие комплементарность (CDR) определяли согласно определению Кэбат. Аминокислотные последовательности (SEQ ID NO:1-60) в различных областях тяжелых цепей и легких цепей, прошедших через скрининг антител, представлены на ФИГ. 1A и 1B, и аминокислотные последовательности CDR тяжелых цепей и легких цепей показаны в Таблице 1 и 2, соответственно.
[Таблица 1]
| Антитело | CDR-H1 | CDR-H2 | CDR-H3 |
| 442P | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTYYADSVQG (SEQ ID NO:69) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 442S1 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
TIDLDSGSIYYADSVQG (SEQ ID NO:70) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 442S2 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTDYADSVQG (SEQ ID NO:71) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 442S4 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIEPDFGSSYYADSVRG (SEQ ID NO:72) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 442S5 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
IIEPDSGSIYYADSVQG (SEQ ID NO:73) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 442S6 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTDYADSVQG (SEQ ID NO:71) |
DRHMWPEGPFDY (SEQ ID NO:79) |
| 442S9 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTYYADSVQG (SEQ ID NO:69) |
DRHMWPEGPFDY (SEQ ID NO:79) |
| 442S10 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTYYADSVQG (SEQ ID NO:69) |
DRHMWPEGPFDY (SEQ ID NO:79) |
| 442M3 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTYYADSVQG (SEQ ID NO:69) |
DRHMWPEGPFDY (SEQ ID NO:79) |
| 442M4 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
TIDLDSGSIYYADSVQG (SEQ ID NO:70) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 442M5 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
TIDLDSGSIYYADSVQG (SEQ ID NO:70) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 442M6 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIEPDSGSTDYADSVQG (SEQ ID NO:74) |
DRHMWPEGPFDY (SEQ ID NO:79) |
| 442M7 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
TIEPDSGSTYYADSVQS (SEQ ID NO:75) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 442M8 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTYYADSVQG (SEQ ID NO:69) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 442M10 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
SIYPDSGSTDYADSVQG (SEQ ID NO:71) |
DLHMWPEGPFDY (SEQ ID NO:80) |
| 442M11 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
TIEPDYGSTLYADSVQG (SEQ ID NO:102) |
DLHMGPEGPFDY (SEQ ID NO:78) |
| 472P | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
GISYDGGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:76) |
DPSWCLQDLCYYADGMDV (SEQ ID NO:81) |
| 472S1 | WYDMT (SEQ ID NO:62) |
GISYDGGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:76) |
DPSWCLQDLCYYADGMDV (SEQ ID NO:81) |
| 472S2 | WYDLA (SEQ ID NO:63) |
GISYDGGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:76) |
DPSWCLQDLCYYADGMDV (SEQ ID NO:81) |
| 472S3 | WYDMS (SEQ ID NO:64) |
GISYDGGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:76) |
DPSWCLQDLCYYADGMDV (SEQ ID NO:81) |
| 472S4 | WYDIA (SEQ ID NO:65) |
GISYDGGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:76) |
DPSWCLQDLCYYADGMDV (SEQ ID NO:81) |
| 472M1 | WYDLS (SEQ ID NO:66) |
GISYDGGNTYYADSVKG (SEQ ID NO:76) |
DPSWCLQDLCYYADGMDV (SEQ ID NO:81) |
| 451P | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFVSDSTFDY (SEQ ID NO:82) |
| 451M1 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFMSDSTFDY (SEQ ID NO:83) |
| 451M2 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFASDSTFDY (SEQ ID NO:84) |
| 451M3 | HYDMS (SEQ ID NO:67) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFASDSTFDY (SEQ ID NO:84) |
| 451M4 | YYDMS (SEQ ID NO:68) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFASDSTFDY (SEQ ID NO:84) |
| 451M5 | DYDMS (SEQ ID NO:61) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFESDSTFDY (SEQ ID NO:85) |
| 451M6 | HYDMS (SEQ ID NO:67) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFESDSTFDY (SEQ ID NO:85) |
| 451M7 | YYDMS (SEQ ID NO:68) |
AIYYDSGSIYYADSAKG (SEQ ID NO:77) |
DRLFESDSTFDY (SEQ ID NO:85) |
[Таблица 2]
| Антитело | CDR-L1 | CDR-L2 | CDR-L3 |
| 442P | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 442S1 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
QGWDTSLSGHV (SEQ ID NO:95) |
| 442S2 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 442S4 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 442S5 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 442S6 | SGSSSNIGSNSGS (SEQ ID NO:87) |
ADNWRPS (SEQ ID NO:89) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 442S9 | SGSSSNIGSNSGS (SEQ ID NO:87) |
ADNHRPS (SEQ ID NO:90) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 442S10 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 442M3 | SGSSSNIGSNSGS (SEQ ID NO:87) |
ADNWRPS (SEQ ID NO:89) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 442M4 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
VGWDSSLYGHV (SEQ ID NO:96) |
| 442M5 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
HAWDSSLWGDV (SEQ ID NO:97) |
| 442M6 | SGSSSNIGSNSGS (SEQ ID NO:87) |
ADNWRPS (SEQ ID NO:89) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 442M7 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 442M8 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
HAWDSSLYVDV (SEQ ID NO:98) |
| 442M10 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADNFRPS (SEQ ID NO:91) |
AAWDSSLSGYV (SEQ ID NO:94) |
| 442M11 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
SDNHRPS (SEQ ID NO:88) |
HAWDSSLSGDF (SEQ ID NO:99) |
| 472P | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADSNRPS (SEQ ID NO:92) |
GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO:100) |
| 472S1 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADSNRPS (SEQ ID NO:92) |
GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO:100) |
| 472S2 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADSNRPS (SEQ ID NO:92) |
GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO:100) |
| 472S3 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADSNRPS (SEQ ID NO:92) |
GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO:100) |
| 472S4 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADSNRPS (SEQ ID NO:92) |
GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO:100) |
| 472M1 | SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO:86) |
ADSNRPS (SEQ ID NO:92) |
GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO:100) |
| 451P | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 451M1 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 451M2 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 451M3 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 451M4 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 451M5 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 451M6 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
| 451M7 | SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103) |
YDSHRPS (SEQ ID NO:93) |
GSWDASLNGYV (SEQ ID NO:101) |
[0069] Пример 2. Эффект антитела против ErbB3 in-vitro
[0070] 1. Сродство к связыванию антитела против ErbB3 c человеческим белком ErbB3
[0071] Измеряли значения сродства связывания прошедших скрининг антител (Пример 1.2) к белку ErbB3 (антигену).
[0072] Конкретно, значения сродства связывания антител против ErbB3 с рекомбинантным человеческим белком ErbB3 (R&D systems) и интерактивную динамику антиген-антитело измеряли, используя систему Octet® QK384 (Pall Life Sciences). После активации карбоксильных групп в растворе 20 мМ гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и 40 мМ N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-NHS) на датчике AR2G (ForteBio), раствор 10 мкг/мл человеческого белка ErbB3, разбавленный 10 мМ ацетата натрия (pH 4,0) (ForteBio) добавляли для иммобилизации человеческого белка ErbB3 на датчике AR2G. Датчик AR2G, на котором человеческий белок ErbB3 был иммобилизован, обрабатывали 1 M этаноламина (ForteBio) для инактивации оставшихся непрореагировавших карбоксильных групп. Каждый из растворов антитела с 12,5 нМ, 25 нМ, и 50 нМ добавляли на датчик AR2G, и затем фазу связывания продукта реакции наблюдали в течение около 900 секунд. Далее, 1× буфера для кинетического анализа (ForteBio) добавляли к продукту реакции, и фазу диссоциации продукта реакции наблюдали в течение около 1200 секунд, с последующим определением константы ассоциации (ka), константы диссоциации (kd) и равновесной константы диссоциации (KD) каждого типа антитела с использованием программного обеспечения для анализа Octet® (Pall Life® Sciences).
[Таблица 3]
| Антитело | KD (M) | ka(1/Ms) | kd(1/с) |
| 442P | 2,83E-10 | 1,25E+06 | 3,52E-04 |
| 442S1 | <1,0E-12 | 5,22E+05 | 3,94E-07 |
| 442S2 | 7,11E-11 | 1,17E+06 | 8,28E-05 |
| 442S4 | 3.71E-11 | 1,48E+06 | 5,47E-05 |
| 442S5 | 1.75E-11 | 1,57E+06 | 2.74E-05 |
| 442S6 | <1,0E-12 | 8.72E+05 | <1,0E-07 |
| 442S9 | 7,16E-11 | 8,21E+05 | 5,87E-05 |
| 442S10 | 1,14E-10 | 8,14E+05 | 9,29E-05 |
| 442M3 | 3,40E-12 | 7.71E+05 | 2,62E-06 |
| 442M4 | <1,0E-12 | 5.73E+05 | <1,0E-07 |
| 442M5 | <1,0E-12 | 6,65E+05 | <1,0E-07 |
| 442M6 | 2,01E-11 | 9,69E+05 | 1,95E-05 |
| 442M7 | 2,91E-11 | 1,56E+06 | 4,55E-05 |
| 442M8 | 2,56E-12 | 8.70E+05 | 2,23E-06 |
| 442M10 | <1,0E-12 | 4.71E+05 | <1,0E-07 |
| 442M11 | 5,43E-12 | 1,49E+06 | 8,09E-06 |
| 472P | 2,84E-10 | 1.79E+06 | 5,08E-04 |
| 472S1 | <1,0E-12 | 6,49E+05 | 3,33E-07 |
| 472S2 | <1,0E-12 | 1,07E+06 | <1,0E-07 |
| 472S3 | <1,0E-12 | 5,22E+05 | 1,43E-07 |
| 472S4 | 9,41E-12 | 1,15E+06 | 1,09E-05 |
| 472M1 | 1,25E-11 | 1,39E+06 | 1.74E-05 |
| 451P | 5,35E-11 | 1,18E+06 | 6,33E-05 |
| 451M1 | 2,48E-11 | 1,24E+06 | 3,08E-05 |
| 451M2 | 1,26E-11 | 1,24E+06 | 1,56E-05 |
| 451M3 | <1,0E-12 | 1,87E+06 | 2,30E-07 |
| 451M4 | 6,12E-12 | 2,01E+06 | 1,23E-05 |
| 451M5 | 2,17E-11 | 1,52E+06 | 3,29E-05 |
| 451M6 | 3,47E-12 | 1,20E+06 | 4,17E-06 |
| 451M7 | 4,92E-12 | 1,35E+06 | 6,63E-06 |
[0073] При ссылке на Таблицу 3, было установлено, что выбранные антитела имеют равновесную константу диссоциации (KD), от около 0,1 нМ до около 0,1 пМ, указывая на высокие значения сродства связывания с рекомбинантным человеческим белком ErbB3.
[0074] 2. Способность антитела против ErbB3 к ингибированию связывания белка ErbB3 с HRG
[0075] Исследовали, ингибируют ли антитела Примера 1.2 связывание белка ErbB3 и HRG как его лиганда.
[0076] Конкретно сродство к связыванию HRG (R&D systems) с человеческим белком ErbB3 (R&D systems) измеряли, используя систему Octet® QK384 (Pall Life Sciences). После иммобилизации 10 мкг/мл белка HRG на датчике AR2G согласно такому же методу, какой применяли в Примере 2.1, оставшиеся непрореагировавшие карбоксильные группы инактивировали, используя 1M этаноламин (ForteBio). Далее, смешанный раствор 5 мкг/мл человеческого белка ErbB3 (R&D systems) и 10 нМ или 100 нМ антител против ErbB3 добавляли на датчик AR2G вместе с иммобилизованным на нем белком HRG, и затем фазу связывания наблюдали в течение около 900 секунд. Продукт реакции, к которому не добавляли антитела против ErbB3, использовали в качестве группы отрицательного контроля. Количество оставшегося человеческого белка ErbB3, связанного с белком HRG, иммобилизованным на датчике AR2G, измеряли. Рассчитывали сродство к связыванию (%) белка ErbB3 и HRG в присутствии антител против ErbB3 относительно группы отрицательного контроля. Результаты показаны на ФИГ. 2, на которой ось Y представляет сродство к связыванию (%)относительно группы отрицательного контроля, и ось X представляет антитела при различных концентрациях, равных 0 нМ, 10 нМ и 100 нМ.
[0077] При ссылке на ФИГ. 2, было установлено, что выбранные антитела ингибируют связывание человеческого белка ErbB3 и белка HRG, в зависимости от концентраций антител, в то время как контрольная группа hIgG не показала эффекта на связывание ErbB3 и HRG.
[0078] 3. Способность антитела против ErbB3 к ингибированию димеризации ErbB2-ErbB3
[0079] Исследование проводили для оценки способности выбранных антител Примера 1.2 ингибировать димеризацию белка ErbB2 и белка ErbB3.
[0080] Конкретно, 100 мкл рекомбинантного человеческого белка ErbB2 (1 мкг/мл) вносили в многослойный 96-луночный планшет (Thermo scientific) и инкубировали при 4°С в течение около 16 часов для покрытия белком ErbB2 многослойного 96-луночного планшета. 200 мкл 5% (м/об) раствора BSA/PBS добавляли к покрытому планшету и инкубировали при 37°С в течение около 1 часа. Смесь 50 мкл рекомбинантного человеческого белка ErbB3 (0,6 мкг/мл) и 50 мкл выбранного антитела против ErbB3 (0,2 мкг/мл) добавляли в планшет, и реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение около 2 часов. Полученный в результате планшет промывали три раза 0,05% (об/об) раствором Tween/PBS. 100 мкл козьего поликлонального антитела против ErbB3 (1 мкг/мл, R&D systems) добавляли в промытый планшет и инкубировали при 37°С в течение около 1 часа. Планшет затем промывали три раза 0,05% (об/об) раствором Tween/PBS. 100 мкл козьего антитела против Fc-пероксидазы хрена (HRP) (Jackson Immunoresearch), разбавленного 1:5000 5% (м/об) раствором BSA/PBS, вносили в планшет и затем инкубировали при 37°С в течение около 1 часа. Планшет затем промывали три раза 0,05% (об/об) раствором Tween/PBS. 100 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) в качестве субстрата добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение около 5 минут, с последующей остановкой реакции 100 мкл раствора 2N серной кислоты. Реакционную смесь, к которой не добавляли антитела против ErbB3, применяли в качестве группы отрицательного контроля. Измеряли поглощение планшета при длине волны 450 нм. Значения сродства связывания белка ErbB2 и белка ErbB3 в присутствии антител против ErbB3 рассчитывали по измеренному поглощению. Человеческий IgG, который не связывается с ErbB3, использовали в качестве другой группы отрицательного контроля.
[0081] Рассчитывали значения сродства связывания (%) белка ErbB2 и белка ErbB3 в присутствии антител против ErbB3 относительно группы отрицательного контроля. Результаты показаны на ФИГ. 3, где ось Y обозначает сродство к связыванию (%) относительно группы отрицательного контроля, а hIgG обозначает человеческий IgG.
[0082] При ссылке на ФИГ. 3, было установлено, что выбранные антитела ингибируют димеризацию белка ErbB2 и белка ErbB3, в то время как контрольная группа с hIgG не демонстрировала какое-либо ингибирование димеризации.
[0083] 4. Способность антитела против ErbB3 к ингибированию фосфорилирования ErbB3 и Akt
[0084] Исследование проводили, чтобы оценить способность выбранных антител Примера 1.2 ингибировать фосфорилирование белка ErbB3 и Akt.
[0085] Конкретно около 5×105 клеток MCF7 рака молочной железы (из Национального Института Здравоохранения) инокулировали в 24-луночный планшет, и среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (Invitrogen), включающую антибиотик пенициллин-стрептомицин (Invitrogen) и 10% (об/об) эмбриональную телячью сыворотку (FBS) добавляли к клеткам в 24-луночный планшет и инкубировали при 37°С в условиях 5% CO2 в течение около 24 часов. Далее, среду заменяли на свежую среду RPMI-1640, и клетки культивировали в условиях дефицита сыворотки в течение около 24 часов. Далее, выбранные антитела против ErbB3 добавляли к клеткам и инкубировали при 37°С в условиях 5% CO2 в течение около 2 часов. Каждое из антител 442P и 472P добавляли к клеткам при концентрациях около 67 нМ, 13 нМ, 3 нМ, 534 пМ, 107 пМ, 21 пМ и 4 пМ, в то время как антитела 442S1, 442S5, 442M6, 472S2 и 472M1 добавляли к клеткам при концентрациях 13 нМ, 3 нМ, 834 пМ, 208 пМ, 52 пМ и 13 pM. Через 1 час и 45 минут к клеткам добавляли HRG и инкубировали при 37°С в условиях 5% CO2 в течение около 15 минут для стимуляции клеток (общее время обработки антител:2 часа). Клетки промывали охлажденным PBS и раствор для лизиса клеток (Cell Signaling Technology) добавляли, чтобы, таким образом, собрать клетки. После проведения количественного измерения белка в выбранных клетках посредством анализа BCA анализировали уровни фосфорилирования ErbB3 или Akt.
[0086] Уровень фосфорилирования ErbB3 анализировали, используя набор для обнаружения Phospho-ErbB3 Detection Kit (Cell Signaling Technology). После связывания клеточного белка с планшетом для ELISA, покрытым антителом против ErbB3, мышиное детекторное антитело с фосфотирозином и HRP-конъюгированное антитело против мышиного антитела проявляли на планшете для ELISA. Далее, тетраметилбензидиновый (TMB) субстрат добавляли к продукту реакции, реакцию останавливали раствором для остановки реакции из набора, и поглощение измеряли с помощью считывающего устройства для планшетов.
[0087] Уровень фосфорилирования Akt1 анализировали, используя набор для обнаружения Phospho-Akt1 Detection Kit (Cell Signaling Technology). После связывания клеточного белка с планшетом для ELISA, покрытым антителом против фосфосерина, Akt1-специфичное детекторное антитело и HRP-конъюгированное антитело проявляли на планшете для ELISA. Далее, после реакции с TMB субстратом, реакцию останавливали раствором для остановки реакции из набора, и поглощение измеряли с помощью считывающего устройства для планшетов.
[0088] ФИГ. 4A и 4B представляют собой графики отношений фосфорилирования ErbB3 и Akt, соответственно, относительно концентрации антитела, с нанесенными на график значениями на основании измеренного поглощения. Рассчитывали полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC50) антител. Результаты показаны в Таблице 4.
[Таблица 4]
| Анализ | Антитело | IC50 (нМ) |
| Ингибирование фосфорилирования ErbB3 |
442P | 1,046 |
| 472P | 1,451 | |
| 442S1 | 0,2221 | |
| 442S5 | 0,08537 | |
| 442M6 | 0,271 | |
| 472S2 | 0,1478 | |
| 472M1 | 0,2761 | |
| Ингибирование фосфорилирования Akt |
442S1 | 0,2393 |
| 442S5 | 0,1674 | |
| 442M6 | 0,3041 | |
| 472S2 | 0,1953 | |
| 472M1 | 0,2463 |
[0089] При ссылке на ФИГ. 4A и 4B и Таблицу 4, было установлено, что выбранные антитела ингибируют фосфорилирование ErbB3 и Akt.
[0090] Аналогично, также было установлено, что выбранные антитела ингибируют фосфорилирование ErbB3 и Akt в линиях клеток MDA-MB-468 и BT474 рака молочной железы, линии клеток A431 рака кожи, линии клеток BxPC3 рака поджелудочной железы, линии клеток FaDu рака головы и шеи, линии клеток A549 рака легких и линии клеток LoVo рака ободочной и прямой кишки, линии клеток MALME-3M меланомы, линии клеток OVCAR-8 рака яичника и линии клеток DU145 рака простаты.
[0091] 5. Способность антитела против ErbB3 к ингибированию пролиферации линии клеток BxPC3 рака поджелудочной железы
[0092] Исследование проводили, чтобы оценить способность выбранных антител Примера 1.2 ингибировать пролиферацию клеток BxPC3 рака поджелудочной железы.
[0093] Конкретно около 1×104 клеток BxPC3 рака поджелудочной железы (Американская коллекция типовых культур) инокулировали в 96-луночный планшет, и среду RPMI-1640 (Invitrogen), включающую 10% FBS, добавляли к клеткам в 96-луночный планшет и инкубировали при 37°С в условиях 5% CO2 в течение около 24 часов. Далее, среду заменяли на среду RPMI-1640, включающую 0,1% (об/об) FBS. 0,02 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 2 мкг/мл, и 20 мкг/мл антитела 442S1 или антитела 442M6 добавляли к инкубируемым клеткам и культивировали при 37°С в условиях 5% CO2 в течение около 2 часов. 50 нг/мл HRG дополнительно добавляли к культивируемым клеткам и инкубировали при 37°С в условиях 5% CO2 в течение около 120 часов. Культивируемые клетки без добавленных антител использовали в качестве группы отрицательного контроля. Число жизнеспособных клеток измеряли, используя люминесцентный анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega). Относительные скорости пролиферации рассчитывали на основании измеренных результатов. Результаты показаны на ФИГ. 5.
[0094] При ссылке на ФИГ. 5, было установлено, что выбранные антитела ингибируют пролиферацию клеток BxPC3 рака поджелудочной железы зависимым от концентрации способом.
[0095] Пример 3. Эффект антитела против ErbB3 in-vivo
[0096] 1. Ингибирование роста опухоли с использованием ксенотрансплантатной модели BT474 рака молочной железы
[0097] Исследование проводили, чтобы оценить способность выбранных антител Примера 1.2 ингибировать рост опухолей у животной клеточной ксенотрансплантатной модели рака молочной железы.
[0098] Конкретно, клетки BT474 человеческого рака молочной железы (Американская коллекция типовых культур) культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (Hyclone), включающей 10% FBS. Гранулы с замедленным высвобождением 17β-эстрадиола (0,36 мг/60 дней, Innovative Research of America) подкожно инокулировали самкам мышей NOD/сCID (HFK Bio-Technology Co. Ltd.) за один день перед× инокуляцией раковых клеток, чтобы поддержать уровень эстрогенов в крови. Около 1×107 раковых клеток BT474 суспендировали в 100 мкл PBS, содержащих 50% Матригель, и суспендированные раковые клетки инъекционно вводили в жировую ткань под сосок каждой мыши. Массу мышей измеряли дважды в неделю, и объем опухоли рассчитывали, используя уравнение "0,5 a x b2", где a и b представляют собой длинный и короткий диаметры опухоли, соответственно. Когда объем опухоли достигал около 210 мм3 через 7 дней после инокуляции раковых клеток, мышей рандомизированно разделяли на 7 групп, каждая из которых включала 10 мышей. PBS (группа отрицательного контроля), антитела 442P, 442S1, 442S5, 442M6, 472S2, и 472M1 вводили в хвостовые вены мышей в каждой группе дважды в неделю при дозе 10 мг/кг массы тела в течение 4 недель. После инокуляции раковых клеток, рассчитывали объем опухоли после введения антител. Результаты показаны на ФИГ. 6.
[0099] При ссылке на ФИГ. 6, было установлено, что объем опухоли снижался посредством введения антител относительно группы отрицательного контроля, и выбранные антитела ингибировали рост опухоли.
[00100] 2. Ингибирование роста опухоли с использованием ксенотрансплантатной модели MDA-MB-468 рака молочной железы
[00101] Клетки человеческого рака молочной железы MDA-MB-468 (Американская коллекция типовых культур) инкубировали в среде L-15 (Hyclone), включающей 10% мкл эмбриональной телячьей сыворотки. Около 5×106 раковых клеток суспендировали в 100 мкл PBS, включающего 50% Матригель и посредством подкожной инъекции вводили в боковую область самок мышей Nu/Nu (Vital River laboratories, Ltd). Массы мышей измеряли дважды в неделю, и объем опухоли рассчитывали, используя уравнение "0,5 a × b2", где a и b представляли собой длинный и короткий диаметры опухоли, соответственно. Когда объем опухоли достигал около 210 мм3 через 7 дней после инъекции раковых клеток, мышей рандомизированно разделяли на 7 групп, каждая из которых включала 10 мышей. PBS (группа отрицательного контроля), антитела 442P, 442S1, 442S5, 442M6, 472S2 и 472M1 вводили в хвостовые вены мышей в каждой группе дважды в неделю при дозе 10 мг/кг массы тела в течение 4 недель. После инокуляции раковых клеток объем опухоли рассчитывали после введения антител. Результаты показаны на ФИГ. 7.
[00102] При ссылке на ФИГ. 7 было установлено, что объем опухоли снижался посредством введения антител относительно группы отрицательного контроля, и выбранные антитела ингибировали рост опухоли.
[00103] 3. Ингибирование роста опухоли с использованием ксенотрансплантатной модели A431 рака кожи
[00104] Клетки A431 рака кожи человека (Американская коллекция типовых культур) инкубировали в среде DMEM (Hyclone), включающей 10% FBS. Около 5×106 раковых клеток суспендировали в 100 мкл PBS, включающего 50% Матригель и посредством подкожной инъекции вводили в боковую область самок голых мышей Balb/c (HFK Bio-Technology Co. Ltd.). Массы мышей измеряли дважды в неделю, и объем опухоли рассчитывали, используя уравнение "0,5 a × b2", где a и b представляли собой длинный и короткий диаметры опухоли, соответственно. Когда объем опухоли достигал около 160 мм3 через 7 дней после инокуляции раковых клеток, мышей рандомизированно разделяли на 7 групп, каждая из которых включала 10 мышей. PBS (группа отрицательного контроля), антитела 442P, 442S1, 442S5, 442M6, 472S2 и 472M1 вводили в хвостовые вены мышей в каждой группе дважды в неделю при дозе 10 мг/кг массы тела в течение 4 недель. После инокуляции раковых клеток, объем опухоли рассчитывали после введения антител. Результаты показаны на ФИГ. 8.
[00105] При ссылке на ФИГ. 8 было установлено, что объем опухоли снижался посредством введения антител относительно группы отрицательного контроля, и выбранные антитела ингибировали рост опухоли.
[00106] 4. Ингибирование роста опухоли с использованием ксенотрансплантатной модели опухоли
[00107] Антитело 442S1 вводили животным моделям рака головы и шеи FaDu, рака поджелудочной железы, или рака легких, и антитела 442P или антитела 472P вводили животной модели рака желудка, таким же способом, как описано в Примерах 3.1-3.3. В результате было установлено, что объем опухоли снижался посредством введения антител относительно группы отрицательного контроля, и выбранные антитела ингибировали рост опухоли.
[00108] Пример 4. Эффект комбинированного введения противоопухолевого лекарственного средства и антитела против ErbB3
[00109] Исследование проводили, чтобы оценить способность комбинированного применения антитела 442S1 и Цетуксимаб для улучшения противоопухолевых эффектов у модели FaDu рака головы и шеи.
[00110] Клетки FaDu рака головы и шеи человека (Шанхайский Инситут Биологических Наук) инкубировали в среде EMEM (Hyclone), включающей 10% FBS. Около 5×106 раковых клеток суспендировали в 100 мкл PBS, включающего 50% Матригель, и посредством подкожной инъекции вводили в боковую область самок мышей NOD/сCID (HFK Bio-Technology Co. Ltd). Массы мышей измеряли дважды в неделю, и объем опухоли рассчитывали, используя уравнение "0,5 a × b2", где a и b представляли собой длинный и короткий диаметры опухоли, соответственно. Когда объем опухоли достигал около 150 мм3 через 7 дней после инокуляции раковых клеток, мышей рандомизированно разделяли на 4 группы, каждая из которых включала 10 мышей. PBS (группа отрицательного контроля), антитела 442S1 и Цетуксимаб (Merck) вводили в хвостовые вены мышей в каждой группе дважды в неделю при дозе 5 мг/кг массы тела в течение 4 недель. При комбинированном применении в группе лечения, антитела 442S1 и Цетуксимаб вводили в хвостовые вены мышей дважды в неделю при дозе 5 мг/кг массы тела в течение 4 недель. Затем, в течение одной недели антитела не вводили. Размеры опухолей измеряли дважды в неделю. Рассчитывали объемы опухолей после введения антитела или комбинированного введения. Результаты показаны на ФИГ. 9, на которой стрелки "вниз" (↓) обозначает время инъекции раковых клеток, а *** обозначает результаты теста множественного сравнения Тьюки после однофакторного дисперсионного анализа (p<0,001).
[00111] При ссылке на ФИГ. 9 при комбинированном применении антитела 442S1 и Цетуксимаб в группе лечения, объем опухоли снижался от стадии первоначального введения и составлял около в среднем 68 мм3 в конце теста (n=10/группу). Соответственно, было установлено, что комбинированное введение выбранного антитела и Цетуксимаб улучшает эффективность противоопухолевого действия.
[00112] Пример 5. Эффект антитела против ErbB3 по улучшению преодоления резистентности к противоопухолевому лекарственному средству
[00113] 1. Эффект улучшения преодоления резистентности рака молочной железы к Паклитакселу
[00114] Апоптотические эффекты Паклитаксела в линии клеток ZR-75-30 рака молочной железы могут снижаться в присутствии HRG вследствие активации пути передачи сигнала от ErbB3 (Wang S et al., Oncogene, 29, 4225-4236, 2010). Исследование проводили, чтобы оценить способность прошедших скрининг антител улучшать преодоление резистентности к Паклитакселу, применяемому в качестве противоопухолевого лекарственного средства и придавать протвоопухолевый эффект.
[00115] Около 1×104 клеток ZR-75-30 (Американская коллекция типовых культур) инокулировали в планшет и инкубировали в среде RPMI 1640 (Invitrogen), включающей 10% (об/об) FBS при 37°С в условиях 5% CO2 в течение около 24 часов. Среду затем заменяли на свежую среду (с добавлением 100 нг/мл HRG), включающую 0,1% (об/об) FBS, и дополнительную инкубацию проводили при 37°С в условиях 5% CO2 в течение около 24 часов. 10 нМ Паклитаксела (Bristol-Myers Squibb) и 25 мкг/мл антитела 442S1 добавляли к культивируемым клеткам и инкубировали при 37°С в условиях 5% CO2 в течение около 72 часов. Культивируемые клетки собирали, и активность каспазы 3/7 как анапоптотического маркера измеряли, используя тест на субстрат Каспазы 3/7 (Promega). Измеренная активность каспазы 3/7 показана на ФИГ. 10, на которой RLU обозначает относительные единицы люминесценции, и ** обозначает результаты t-теста (p< 0,01).
[00116] При ссылке на ФИГ. 10, активность каспазы 3/7 снижалась под действием Паклитаксела, но улучшалась при комбинированном лечении Паклитакселом и антителом 442S1, в сравнении с лечением с использованием только Паклитаксела (n=3). Соответственно, было установлено, что апоптотический эффект Паклитаксела может быть снижен в присутствии HRG, но восстановлен посредством введения антитела 442S1.
[00117] 2. Эффект улучшения преодоления резистентности к Цетуксимабу при раке ободочной и прямой кишки
[00118] Цетуксимаб является эффективным при подавлении пролиферациии раковых клеток, а именно, клеток DiFi рака ободочной и прямой кишки, но теряет свою эффективность действия в присутствии HRG вследствие активации пути передачи сигнала от ErbB3. Исследование проводили, чтобы оценить способность прошедших скрининг антител преодолевать резистентность к Цетуксимаб и придавать эффекты подавления пролиферации раковых клеток.
[00119] Конкретно, клетки DiFi рака толстой кишки инкубировали в среде RPMI-1640 (Invitrogen), включающей антибиотик (Пенициллин-Стрептомицин, Invitrogen) и 10% FBS. Около 1×104 клеток DiFi инокулировали в 96-луночный планшет и инкубировали при 37°С в условиях 5% CO2 в течение около 24 часов. Цетуксимаб и антитело против ErbB3 смешивали вместе в равных концентрациях, 200 мкг/мл, для получения раствора Цетуксимаб/антитело против ErbB3, который затем смешивали с равным количеством HRG (40 нг/мл). Раствор Цетуксимаб/антитело против ErbB3/HRG добавляли в 96-луночный планшет и инкубировали при 37°С в условиях 5% CO2 в течение около 72 часов. Клетки, культивируемые без добавления антитела, и HRG использовали в качестве группы отрицательного контроля. Число жизнеспособных клеток измеряли, используя люминесцентный анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega). Скорости пролиферации клеток рассчитывали на основании результатов измерений. Результаты показаны на ФИГ. 11, на которой *** обозначает результаты t-теста (p<0,001).
[00120] При ссылке на ФИГ. 11 эффект подавления пролиферации клеток от Цетуксимаб снижался в присутствии HRG, но восстанавливался в группе лечения, которая получала Цетуксимаб и антитела 442S1 в комбинации. Соответственно, было установлено, что эффект Цетуксимаб по подавлению пролиферации клеток может быть снижен в присутствии HRG, т.е., лиганда ErbB3, но может быть восстановлен посредством антител 442S1, блокирующих сигнальный путь от HRG-ErbB3.
[00121] 3. Эффект улучшения преодоления резистентности к Цетуксимаб у резистентной к Цетуксимаб ксенотрансплантатной модели
[00122] Клетки FaDu рака головы и шеи человека (Шанхайский Институт Биологических Наук) инкубировали в среде EMEM (Hyclone), включающей 10% FBS (Invitrogen), 0,01 мМ NEAA (Заменимые аминокислоты, Hyclone), и 2 мМ L-глутамина (Invitrogen). Около 5×106 раковых клеток FaDu суспендировали в 100 мкл PBS и затем посредством подкожной инъекции вводили в боковую область мышей NOD SCID (HFK Bio-Technology Co., Ltd.). Массы мышей измеряли дважды в неделю, и объем опухоли рассчитывали, используя уравнение "0,5 a × b2", где a и b представляли собой длинный и короткий диаметры опухоли, соответственно. Когда объем опухоли достигал около 165 мм3 через 8 дней после инокуляции раковых клеток, мышей рандомизированно отбирали. PBS (группа отрицательного контроля) или Цетуксимаб вводили в хвостовые вены мышей в каждой группе дважды в неделю при дозе 5 мг/кг массы в течение 6,5 недель. Когда эффект подавления роста опухоли от Цетуксимаб не поддерживался, таким образом, что такой объем опухоли увеличивался до около 840 мм3, десять мышей рандомизированно выбирали из каждой группы, и 5 мг/кг Цетуксимаб, 10 мг/кг антитела 442S1 или комбинацию из 5 мг/кг Цетуксимаб и 10 мг/кг антитела 442S1 вводили мышам дважды в неделю в течение 2 недель. Объемы опухолей измеряли дважды в неделю. Результаты показаны на ФИГ. 12.
[00123] При ссылке на ФИГ. 12, было установлено, что значительный эффект подавления опухоли наблюдали в группе лечения, которая получала только антитело 442S1 или антитело 442S1 и Цетуксимаб в комбинации, в сравнении с группой лечения, которая получала только Цетуксимаб, указывая на то, что антитело 442S1 может преодолеть резистентность к Цетуксимаб и подавлять рост опухоли.
[00124] Следует понимать, что примеры вариантов осуществления, описанные в настоящем документе, следует рассматривать лишь в описательном смысле, но не с целью ограничения. Описания признаков или аспектов в каждом примере варианта осуществления должны обычно рассматриваться, как доступные для других подобных признаков или аспектов в других вариантах осуществления.
[00125] В то время как один или несколько примеров вариантов осуществления были описаны при ссылке на чертежи, рядовому специалисту в данной области будет понятно, что различные изменения формы и деталей в них могут быть сделаны без отступления от существа и объема идеи изобретения, определенной следующей формулой изобретения.
1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с ErbB3, содержащее области определения комплементарности тяжелой цепи (CDR-H) и области определения комплементарности легкой цепи (CDR-L),
где антитело выбрано из группы, состоящей из:
(1) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:69,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:78,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:88, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:94;
(2) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:70,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:78,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:88, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:95;
(3) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:71,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:78,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:88, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:94;
(4) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:72,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:78,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:88, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:94;
(5) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:73,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:78,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:88, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:94;
(6) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:71,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:79,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:87,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:89, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:94;
(7) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:69,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:79,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:87,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:90, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:94;
(8) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:69,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:79,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:88, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:94;
(9) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:69,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:79,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:87,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:89, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:94;
(10) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:70,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:78,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:88, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:96;
(11) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:70,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:78,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:88, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:97;
(12) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:74,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:79,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:87,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:89, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:94;
(13) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:75,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:78,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:88, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:94;
(14) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:69,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:78,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:88, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:98;
(15) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:71,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:80,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:91, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:94;
(16) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью TIEPDYGSTLYADSVQG (SEQ ID NO:102),
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:78,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:88, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:99;
(17) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:76,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:81,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:92, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:100;
(18) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:62,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:76,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:81,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:92, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:100;
(19) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:63,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:76,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:81,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:92, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:100;
(20) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:64,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:76,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:81,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:92, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:100;
(21) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:65,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:76,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:81,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:92, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:100;
(22) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:66,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:76,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:81,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:86,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:92, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:100;
(23) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:77,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:82,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:103,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:93, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:101;
(24) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:77,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:83,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:103,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:93, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:101;
(25) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:77,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:84,
CDR-L1 с последовательностью SGSPSNIGNNSVT (SEQ ID NO:103),
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:93, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:101;
(26) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:67,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:77,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:84,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:103,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:93, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:101;
(27) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:68,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:77,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:84,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:103,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:93, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:101;
(28) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:61,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:77,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:85,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:103,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:93, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:101;
(29) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:67,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:77,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:85,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:103,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:93, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:101; и
(30) антитела, содержащего
CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO:68,
CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO:77,
CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO:85,
CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO:103,
CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO:93, и
CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO:101.
2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в котором вариабельная область тяжелой цепи дополнительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-30.
3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в котором вариабельная область легкой цепи дополнительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:31-60.
4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое ингибирует связывание белка ErbB3 с веществом, специфически связывающимся с ним, димеризацию белка ErbB1 и белка ErbB3, димеризацию белка ErbB2 и белка ErbB3, фосфорилирование ErbB3 или Akt, или их комбинацию.
5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.4, где веществом, специфически связывающимся с белком ErbB3, является герегулин (HRG).
6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое представляет собой IgA, IgD, IgE, IgG, или IgM; моноклональное антитело или поликлональное антитело; или
где антигенсвязывающим фрагментом является scFv, (scFv)2, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или их комбинация; или
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент модифицированы конъюгацией или связыванием, гликозилированием, прикреплением метки или их комбинацией.
7. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания, связанного с активацией или сверхэкспрессией белка ErbB3, содержащая эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемый носитель.
8. Фармацевтическая композиция по п.7, где заболеванием, связанным с активацией или сверхэкспрессией белка ErbB3, является злокачественное новообразование.
9. Фармацевтическая композиция по п.8, где злокачественное новообразование выбрано из группы, состоящей из рака молочной железы, рака кожи, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, рака легкого, рака толстой кишки, колоректального рака, рака желудка, рака яичников, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака матки, рака печени, рака почки, светлоклеточной саркомы, меланомы, опухолей спинного мозга, рака мозга, тимомы, мезотелиомы, рака пищевода, рака желчевыводящих путей, рака яичек, рака зародышей, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака шейки матки, рака эндометрия, лимфомы, миелодиспластических синдромов (MDS), миелофиброза, острого лейкоза, хронического лейкоза, множественной миеломы, болезни Ходжкина, рака эндокринной системы и саркомы.
10. Фармацевтическая композиция по п.7, дополнительно содержащая противораковое лекарственное средство.
11. Фармацевтическая композиция по п.10, где противораковым средством является Цетуксимаб, Панитумумаб, Эрлотиниб, Гефитиниб, Трастузумаб, Т-DM1, Пертузумаб, Лапатиниб, Паклитаксел, Тамоксифен, Цисплатин, анти-CTLA-4 антитело, анти-PD-1 антитело, анти-PD-L1 антитело, 5-фторурацил (5FU), Гемцитабин, или их комбинация.
12. Фармацевтическая композиция по п.10, которая дополнительно содержит одну композицию или отдельные композиции.
13. Способ профилактики или лечения заболевания, связанного с активацией или сверхэкспрессией белка ErbB3, у индивидуума, включающий введение индивидууму антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-6.
14. Способ по п.13, дополнительно включающий введение индивидууму противоракового препарата.
15. Способ по п.14, в котором противораковое лекарственное средство вводят одновременно, по отдельности или последовательно с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп.1-6.
16. Способ по п.14, в котором антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, противораковое лекарственное средство или их комбинацию вводят индивидууму перорально, внутривенно, внутримышечно, трансдермально, чрезслизистым путем, интраназально, интратрахеально, подкожно и их комбинацией.
17. Способ по п.14, в котором антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, противораковое лекарственное средство или их комбинацию вводят системно или применяют местно.
18. Способ профилактики или лечения резистентности к противораковым лекарственным средствам у индивидуума, включающий введение индивидууму антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-6,
где индивид страдает злокачественным новообразованием или имеет к нему предрасположенность,
где злокачественное новообразование связано с активацией или сверхэкспрессией белка ErbB3.
