Терапия стволовыми клетками при патологиях эндометрия
Настоящее изобретение относится к способности аутологичных CD133+ стволовых клеток костного мозга (BMDSC) к индукции регенерации эндометрия и лечению патологий эндометрия, таких как синдром Ашермана и атрофия эндометрия. Изобретение представляет собой эффективные способы индукции регенерации эндометрия, которые предусматривают введение эффективного количества аутологичных CD133+ стволовых клеток, полученных из костного мозга (BMDSC), в артерии матки у субъекта, нуждающегося в этом, для индукции регенерации эндометрия. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 2 пр.
Родственные заявки
Данная заявка испрашивает приоритет в соответствии с § 119(e) раздела 35 Кодекса законов США по предварительной заявке №62/013121, поданной 17 июня 2014 года, полное содержание которой тем самым включено посредством ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение, в целом, относится к применению аутологичных CD133+ стволовых клеток костного мозга (BMDSC) для индукции регенерации эндометрия и лечения патологий эндометрия, таких как синдром Ашермана и атрофия эндометрия.
Уровень техники
У женщины репродуктивного возраста можно выделить два слоя эндометрия: (I) функциональный слой, смежный с полостью матки, и (ii) базальный слой, смежный с миометрием и лежащий ниже функционального слоя. Функциональный слой нарастает после окончания менструации во время первой части предыдущего менструального цикла. Пролиферация индуцируется эстрогеном (фолликулярная фаза менструального цикла), и последующие изменения в этом слое вызываются прогестероном из желтого тела (лютеиновая фаза). Он адаптирован для обеспечения оптимальной среды для имплантации и роста эмбриона. Этот слой полностью отшелушивается во время менструации. В отличие от него, базальный слой не отшелушивается в любое время в ходе менструального цикла. Регенерация человеческого эндометрия под действием системных изменений стероидов яичников при каждом менструальном цикле является необходимой для подготовки этого органа к его главной функции, т.е. образованию эндометриального "окна имплантации" в хозяина имплантирующейся бластоцисты, обеспечивая возможность возникновения беременности. Следовательно, обновление всех клеточных компартментов эндометриального функционального слоя с каждым менструальным циклом является необходимым для нормальной репродуктивной функции.
Синдром Ашермана (AS) представляет собой состояние, при котором существует разрушение эндометрия, вызванное повторяющимися или агрессивными процедурами кюретажа и/или с эндометритом. Это создает облитерации полости матки с внутриматочными спайками и отсутствием функционального эндометрия во многих областях. Женщины с этим заболеваниями, а также с атрофическим эндометрием (<4 мм) часто испытывают трудности, связанные с бесплодием, нарушение менструального цикла, в том числе аменорею, гипоменорею и привычное невынашивание беременности. На данный момент не существует специфического лечения для этих патологий эндометрия. Следовательно, сохраняется потребность в разработке безопасных и эффективных методов терапии для лечения этих патологий.
Краткое описание изобретения
Настоящее раскрытие относится, по меньшей мере отчасти, к открытию того, что аутологичные CD133+ стволовые клетки, полученные из костного мозга (BMDSC), могут восстанавливать васкуляризацию, что ведет к образованию аутологичного функционального эндометрия de novo. Соответственно, в аспектах настоящего раскрытия предполагаются способы индукции регенерации эндометрия. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ предусматривает введение эффективного количества аутологичных CD133+ стволовых клеток, полученных из костного мозга (BMDSC), в маточные артерии субъекта, нуждающегося в этом, для индукции регенерации эндометрия.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления известно, что субъект имеет синдром Ашермана или атрофию эндометрия. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления субъект имеет атрофию эндометрия, которая является устойчивой к гормональному лечению. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у субъекта была одна или несколько предыдущих неудачных имплантаций эмбриона. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аутологичные CD133+ BMDSC получают с помощью введения субъекту средства для мобилизации BMDSC из костного мозга в периферическую кровь субъекта и выделения CD133+ BMDSC из периферической крови субъекта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления средство для мобилизации BMDSC представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аутологичные CD133+ BMDSC выделяют из периферической части системы кровообращения у субъекта с помощью афереза с использованием антитела к CD133. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления CD133+ BMDSC вводят в маточные артерии посредством катетера. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления CD133+ BMDSC вводят в спиральные артериолы матки субъекта.
В некоторых аспектах настоящего раскрытия предполагается способ индукции регенерации эндометрия, причем способ предусматривает выделение аутологичных CD133+ стволовых клеток, полученных из костного мозга (BMDSC), из субъекта, нуждающегося в этом; и введение эффективного количества выделенных CD133+ BMDSC в маточные артерии субъекта для индукции регенерации эндометрия.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) вводят субъекту перед выделением аутологичных BMDSC. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аутологичные CD133+ BMDSC выделяют из периферической части системы кровообращения у субъекта с помощью афереза с использованием антитела к CD133. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления CD133+ BMDSC вводят в маточные артерии посредством катетера. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления CD133+ BMDSC вводят в спиральные артериолы матки субъекта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления известно, что субъект имеет синдром Ашермана или атрофию эндометрия. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления субъект имеет атрофию эндометрия, которая является устойчивой к гормональному лечению. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у субъекта была одна или несколько предыдущих неудачных имплантаций эмбриона.
Каждым из ограничений настоящего изобретения могут охватываться различные варианты осуществления настоящего изобретения. Таким образом, предполагается, что каждое из ограничений настоящего изобретения, включающее любой элемент или комбинации элементов, может быть включено в каждый аспект настоящего изобретения. Настоящее изобретение не ограничивается в своем применении деталями структуры и расположением компонентов, изложенных в следующем описании или проиллюстрированных в графических материалах. Настоящее изобретение обеспечивает возможность создания других вариантов осуществления, а также его практическое осуществление или реализацию разными способами. Кроме того, формулировки и термины, используемые в данном документе, предназначены для описания, и их не следует рассматривать как ограничивающие. Применение в данном документе терминов "включающий", "содержащий" или "имеющий", "который содержит", "который включает", а также их вариантов, как предполагается, охватывает элементы, перечисленные после такого термина, и их эквиваленты, а также дополнительные элементы.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение плана исследования (А) и временных рамок (В) событий, изображенных на фиг. 1А.
Фиг. 2 представляет собой результаты ангиографии, демонстрирующие путь зонда из маточных артерий через спиральные артериолы, причем местонахождение CD133+ клеток определено посредством неинвазивного радиологического исследования.
На фиг. 3 показаны результаты гистероскопии полости матки у одной пациентки с атрофическим эндометрием до лечения аутологичными BMSC и через 3-6 и 9 месяцев после него.
На фиг. 4 демонстрируется толщина эндометрия у 6 пациенток с атрофическим эндометрием/синдромом Ашермана, включенных в это исследование, до терапии аутологичными BMSC и через 3 месяца после нее.
На фиг. 5 показано среднее значение + SD толщины эндометрия до и через 3 месяца после лечения аутологичными BMSC.
На фиг. 6 показаны 3D-эхограммы, демонстрирующие улучшение объема эндометрия, полученное через 3 месяца после терапии аутологичными BMSC, по сравнению с базальным состоянием до лечения.
На фиг. 7А-7В показаны изображения, полученные при предоперационной и послеоперационной гистероскопии. Результаты гистероскопии у пациенток с синдромом Ашермана (фиг. 7А) или атрофией эндометрия (фиг. 7В) до терапии стволовыми клетками (1-ый осмотр), через 2-3 месяца (2-ой осмотр) и 4-6 месяцев (3-ий осмотр) после терапии стволовыми клетками. Тяжесть эндометриальных спаек оценивали в соответствии с классификацией Американского общества репродуктивного здоровья (American Fertility Society).
На фиг. 8A-8I показаны результаты анализов тканей. Результаты иммуногистохимического анализа для выявления зрелых кровеносных сосудов в эндометрии у пациентки 7 до терапии аутологичными клетками (фиг. 8А), через 3 месяца (фиг. 8В) и 6 месяцев (фиг. 8С) после нее. α-sma+, CD31+ положительные клетки идентифицируют зрелые кровеносные сосуды (20х). На фиг. 8D показан человеческий миометрий, используемый в качестве положительного контроля для окрашивания α-sma, и человеческая небная миндалина, используемая в качестве положительного контроля для CD31 (фиг. 8Е). На фиг. 8F показан отрицательный контроль, полученный в результате отсутствия первичного антитела. На фиг. 8G представлен укрупненный вид сосуда, идентифицированного на фиг. 8С (40х). На фиг. 8Н представлены динамика роста и общее количество зрелых кровеносных сосудов у 8 пациенток до клеточной терапии и через 3 и 6 месяцев после нее, указывающие на времязависимый неоангиогенный эффект. На фиг. 8I показаны результаты статистического анализа в виде среднего значения ± SEM общего количества зрелых кровеносных сосудов перед лечением и через 3 и 6 месяцев после него.
На фиг. 9 показан план исследования. Повторное подтверждение и оценка AS или ЕА с помощью гистероскопии осуществлялись одним хирургом в пролиферативной фазе. Мобилизацию BMDSC индуцировали инъекцией G-CSF, и спустя пять суток CD133+ клетки выделяли из периферической крови посредством афереза и немедленно вливали в спиральные артерии с помощью инвазивной радиологии. Гистероскопию при втором и третьем осмотре проводили для оценки полости матки после лечения стволовыми клетками. Затем пациенткам предлагали попытаться забеременеть.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основывается, по меньшей мере отчасти, на открытии нового терапевтического подхода для индукции регенерации эндометрия с использованием терапии аутологичными стволовыми клетками. В частности, настоящая заявка основывается на полученных данных, что аутологичные CD133+ стволовые клетки, полученные из костного мозга (BMDSC), могут восстанавливать васкуляризацию, что ведет к образованию аутологичного функционального эндометрия de novo. Несмотря на то, что BMDSC, как известно, являются источником негемопоэтических клеток в разных клеточных эндометриальных компартментах (строма, железистый эпителий и люминальный эпителий), не было известно, какая(какие) субпопуляция (субпопуляции) BMDSC активирует(активируют) репарацию в эндометрии. В настоящей заявке представлены безопасные и эффективные виды клеточной терапии для индукции регенерации эндометрия и лечения патологий, ассоциированных с дегенерацией эндометрия, таких как синдром Ашермана и атрофия эндометрия.
Человеческая матка состоит, главным образом, из эндометрия и наружного гладкомышечного слоя, называемого миометрием. Функциональный слой человеческого эндометрия представляет собой ткань с высокой способностью к регенерации, проходящую ежемесячные циклы роста, дифференцировки и отшелушивания во время репродуктивного возраста женщины. Колеблющиеся уровни циркулирующих эстрогена и прогестерона управляют этим резким ремоделированием человеческого эндометрия. Регенерация эндометрия также следует за родовым актом и резекцией эндометрия. Регенерация эндометрия из базального слоя участвует в замене функционального слоя с последующим его сбрасыванием во время менструации и родового акта. Тем не менее, эндометрий может оказаться неспособным отвечать на эстроген и не регенерирует при определенных патологиях, например, при синдроме Ашермана и атрофии эндометрия. Такие субъекты могут испытывать аномальную пролиферацию эндометрия и становятся бесплодными.
Синдром Ашермана (AS) (или синдром Фритча) представляет собой состояние, характеризующееся спайками и/или фиброзом эндометрия, наиболее часто ассоциированное с дилатацией и кюретажом внутриматочной полости. Ряд других терминов был использован для описания состояния и связанных состояний: внутриматочные спайки (IUA), атрезия матки/шейки матки, травматическая атрофия матки, склеротический эндометрий, склероз эндометрия и внутриматочные синехии. Травма базального слоя эндометрия, например, после дилатации и кюретажа (D&C), осуществляемых после самопроизвольного аборта, или для доставки, или для медикаментозного аборта, может приводить к развитию внутриматочных рубцов, приводящих в результате к спайкам, которые могут облитерировать полость матки в различной степени. В крайнем случае вся полость может зарубцовываться и подвергаться окклюзии. Даже при относительно небольшом количестве рубцов эндометрий может оказаться неспособным отвечать на эстроген, и субъект может испытывать вторичные нарушения менструального цикла (такие как аменорея, гипоменорея или олигоменорея) и может стать бесплодным. AS также может являться результатом других хирургических операций в тазовой области, включающих операции кесарева сечения, удаление фиброидных опухолей (миомэктомия), и других причин, таких как IUD, облучение тазовой области, бильгарциоз и генитальный туберкулез. Хронический эндометрит в результате генитального туберкулеза является значительной причиной тяжелых внутриматочных спаек (IUA) в развивающихся странах, что часто приводит в результате к общей облитерации полости матки, лечение которой сложно осуществлять.
Гистероскопия представляет собой классическую стандартную методику для диагностики AS. Благодаря визуализации с помощью соногистерографии или гистеросальпингографии выявляют степень образования рубца. В зависимости от степени тяжести AS может приводить в результате к бесплодию, повторяющимся самопроизвольным абортам, боли от скопившейся крови и будущим акушерским осложнениям. Если оставлять его без лечения, затруднение течения менструальных выделений, являющееся результатом спаек, может приводить к эндометриозу в некоторых случаях.
При атрофии эндометрия эндометрий становится слишком тонким в результате низких уровней эстрогенов. Для того чтобы считать его атрофическим, толщина эндометрия должна иметь размер менее 4-5 мм на снимке, полученном с помощью трансвагинального ультразвукового исследования. Соотношение тела матки и шейки матки также будет проявлять тенденцию к уменьшению и может приближаться к 1:1. С помощью MRI (магнитно-резонансная томография) также можно продемонстрировать уменьшение толщины эндометрия, подобное наблюдаемому с использованием ультразвукового исследования. Факторы, которые могут вызывать атрофию эндометрия, включают в себя длительное использование пероральных контрацептивов, гипоэстрогенное состояние (дисфункция яичников) и применение тамоксифена.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предполагается способ индукции регенерации эндометрия. Способ предусматривает введение эффективного количества аутологичных CD133+ стволовых клеток, полученных из костного мозга (BMDSC), в маточные артерии субъекта, нуждающегося в этом, для индукции регенерации эндометрия.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предполагается способ индукции регенерации эндометрия. Способ предусматривает выделение аутологичных CD133+ стволовых клеток, полученных из костного мозга (BMDSC), из субъекта, нуждающегося в этом; и введение эффективного количества выделенных CD133+ BMDSC в маточные артерии субъекта для индукции регенерации эндометрия.
Используемый в данном документе термин "субъект" включает в себя всех млекопитающих, в том числе без ограничения собак, кошек, лошадей, овец, коз, коров, свиней, людей и приматов, за исключением человека. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления субъектом является женщина.
Субъект, нуждающийся в регенерации эндометрия, представляет собой субъекта, чей эндометрий оказывается неспособным к регенерации в ответ на эстроген и имеет тонкую эндометриальную выстилку. Такие субъекты часто испытывают аномальную пролиферацию эндометрия и становятся бесплодными. Оптимальная толщина для эндометриальной выстилки составляет от 10 до 15 мм, достигая своей максимальной толщины в момент имплантации примерно к 21 дню менструального цикла женщины. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления субъект, нуждающийся в лечении, имеет толщину эндометрия в момент имплантации, которая составляет менее 5 мм, менее 4 мм, менее 3 мм, менее 2 мм или менее 1 мм. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления субъект имеет нарушения менструального цикла, характеризующиеся уменьшением течения крови и длительности менструального кровотечения (аменорея, гипоменорея или олигоменорея) и/или привычным невынашиванием беременности. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления известно, что субъект имеет синдром Ашермана или атрофию эндометрия. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления субъект имеет атрофию эндометрия, которая является устойчивой к гормональному лечению. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у субъекта была одна или несколько предыдущих неудачных имплантаций эмбриона.
Было показано, что стволовые клетки, полученные из костного мозга (BMDSC), в качестве экзогенного источника способствуют восстановлению и регенерации ткани различных органов и тканей. В человеческом и мышином эндометрии BMDSC также представляют собой источник негемопоэтических клеток в различных клеточных компартментах эндометрия (строма, железистый эпителий и люминальный эпителий). Они вносят вклад преимущественно в образование клеток стромального компартмента эндометрия и в значительно меньшей степени в образование компартментов железистого и люминального эпителия эндометрия.
BMDSC включают в себя гемопоэтические стволовые клетки (HSC) и мезенхимальные стволовые клетки (MSC). Тем не менее, было неизвестно, какая(какие) субпопуляция(субпопуляции) BMDSC активирует(активируют) репарацию эндометрия.
Авторами настоящего изобретения впервые была продемонстрирована у людей способность CD133+ стволовых клеток, полученных из костного мозга, которые доставляют в маточные артерии посредством систем хирургической доставки и систем доставки с использованием катетера, к индукции регенерации эндометрия. Аутологичные циркулирующие CD133+ BMDSC выделяли после предварительной мобилизации из костного мозга и повторно имплантировали в спиральные артериолы матки той же пациентке. CD133+ BMDSC восстанавливают васкуляризацию, что приводит к образованию аутологичного функционального эндометрия de novo. CD 133 представляет собой гликопротеин, также известный у людей и грызунов как проминин 1 (PROM1). Он представляет собой холестеринсвязывающий трансмембранный белок, пять раз проходящий через мембрану, который локализуется в выростах мембраны и часто экспрессируется на стволовых клетках взрослого организма, где его функция, как полагают, заключается в поддержании свойств стволовых клеток посредством подавления дифференцировки.
CD133+ BMDSC в соответствии с настоящим изобретением можно получать из первичных стволовых клеток, или их можно получать из созданной линии стволовых клеток. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления стволовые клетки могут представлять собой эмбриональные стволовые клетки, стволовые клетки взрослого организма, стволовые клетки пуповинной крови, соматические стволовые клетки, стволовые клетки костного мозга или мобилизованные стволовые клетки костного мозга. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления стволовые клетки представляют собой стволовые клетки взрослого организма.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления CD133+ BMDSC получают с помощью введения субъекту средства для мобилизации BMDSC из костного мозга в периферическую кровь субъекта; выделения CD133+ BMDSC из периферической крови субъекта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления средство для мобилизации стволовых клеток выбрано из группы, состоящей из гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и плериксафора (AMD3100). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления средство для мобилизации стволовых клеток представляет собой G-CSF.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аутологичные CD133+ BMDSC выделяют из периферической части системы кровообращения субъекта с помощью процесса, называемого аферезом, с использованием антитела к CD133 (см., например, Sovalat Н, Scrofani М, Eidenschenk A, Pasquet S, Rimelen V, 
P. Identification and isolation from either adult human bone marrow or G-CSF-mobilized peripheral blood of CD34(+)/CD133(+)/CXCR4(+)/ Lin(-)CD45(-) cells, featuring morphological, molecular, and phenotypic characteristics of very small embryonic-like (VSEL) stem cells. Exp Hematol. 2011 Apr; 39(4):495-505, причем полное содержание данного источника включено в данный документ во всей его полноте). Аферез, который представляет собой хорошо известный в уровне техники процесс, относится к процессу или процедуре, при которой кровь забирают у субъекта-донора и разделяют на ее компоненты, некоторые из которых сохраняют, как например, популяции стволовых клеток, а остальную часть возвращают посредством переливания субъекту-донору. Аферез занимает больше времени, чем сдача донором цельной крови. Сдача донором цельной крови занимает приблизительно 10-20 минут для сбора крови, в то время как сдача донором крови для афереза может занимать приблизительно 1-2 часа. Продукт афереза относится к гетерогенной популяции клеток, собранных в результате процесса афереза.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления CD133+ BMDSC выделяют из выделенных BMDSC с использованием антитела к CD133. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления CD133+ BMDSC подвергают селекции с использованием антитела к CD133 до тех пор, пока чистота CD133+ BMDSC не будет составлять по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,9% или 100%. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления чистота CD133+ BMDSC составляет по меньшей мере 95%, 98%, 99%, 99,9% или 100%.
Введение CD133+ BMDSC или терапевтических композиций, содержащих такие клетки, субъекту, нуждающемуся в этом, можно осуществлять, например, с помощью трансплантации, имплантации (например, самих клеток или клеток в виде части комбинации матрица-клетки), инъекции (например, непосредственно в маточные артерии), инфузии, доставки посредством катетера или любых других средств, известных в уровне техники для обеспечения клеточной терапии. В соответствии с одним вариантом осуществления клетки доставляют посредством внутриартериальной катетеризации. Процедура катетеризации маточной артерии была хорошо описана и применялась в эмболизации миом матки (Ravina JH, Herbreteau D, Ciraru-Vigneron N, et al. Arterial embolisation to treat uterine myomata. Lancet 1995; 346(8976):671-2, причем полное содержание данного источника включено в данный документ во всей его полноте).
CD133+ BMDSC можно вводить в маточные артерии субъекта. Эти артерии поставляют кровь к матке. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления CD133+ BMDSC вводят в спиральные артериолы матки субъекта. Спиральные артерии представляют собой небольшие артерии, которые временно поставляют кровь к эндометрию матки во время лютеиновой фазы менструального цикла. Эти артерии являются высокочувствительными к эстрогенам и прогестерону, проходят через функциональный слой эндометрия, растут и дают ответвления внутри него, а также проявляют очень отличающиеся и уникальные конфигурации.
CD133+ BMDSC вводят в эффективном количестве. "Эффективное количество" относится к количеству, достаточному для того, чтобы вызвать желательный биологический ответ, т.е. индукцию регенерации эндометрия. Эффективное количество включает в себя такое количество, которое необходимо для замедления, снижения, подавления, ослабления или обращения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с AS или атрофией эндометрия. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления такие термины относятся к следующему:
- возобновление менструации после лечения стволовыми клетками с использованием CD133+ BMSC;
- увеличение толщины эндометрия (толщину эндометрия измеряют в виде длины от верхнего до нижнего предела миометрия на дне эндометриальной полости. Например, увеличение может представлять собой увеличение на 50% от максимальной толщины, когда-либо полученной с использованием гормональной заместительной терапии (HRT), измеренной с помощью вагинального ультразвукового исследования по продольной оси на дне матки (vgr от 4 до 6 мм);
- гистероскопические и гистологические признаки образования эндометрия de novo; и/или
- функциональность реконструированного эндометрия с точки зрения частоты живорождения, показателей частоты беременности и имплантации после помещения эмбрионов в этих пациенток.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления по меньшей мере 45 миллионов CD133+ BMDSC вливают субъекту. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления по меньшей мере 50, 55, 60, 65 миллионов CD133+ BMDSC вливают субъекту.
Эффективное количество может быть определено специалистом в данной области техники с использованием стандартных методов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эффективное количество представляет собой количество, которое обеспечивает в результате какое-либо улучшение при состоянии, подлежащем лечению. Специалист в данной области техники может определить соответствующие дозы и перечни терапевтических средств для применения, например, на основании in vitro и/или in vivo исследования и/или другой информации о дозировках соединений. При введении субъекту эффективные количества терапевтического средства будут, конечно, зависеть от конкретного заболевания, подлежащего лечению; тяжести заболевания; индивидуальных параметров пациентки, в том числе от возраста, физического состояния, роста и веса, одновременно осуществляемого лечения, частоты лечения и способа введения. Эти факторы являются хорошо известными специалисту в данной области техники, и связанные с ними вопросы можно разрешить с использованием не более чем стандартного проведения экспериментов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления применяют максимальную дозу, то есть наивысшую безопасную дозу по результатам тщательной медицинской оценки.
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые ни коим образом не следует толковать как дополнительное ограничение. Полное содержание всех источников (в том числе литературные источники, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и патентные заявки, находящиеся на совместном рассмотрении), цитируемых в данной заявке, тем самым специально включено с помощью ссылки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Материалы и способы
План
Ниже описано экспериментальное неконтролируемое исследование у 16 пациенток с невосприимчивым к лечению AS, одобренное IRB (экспертный совет по вопросам этики) клинической больницы Валенсии (Hospital Clinico de Valencia), Испания, и финансируемое Министерством здравоохранения Испании (код: ЕС 11-299). Мобилизацию BMDSC осуществляли с использованием гранулоцитарного CSF (G-CSF) (5 мг/кг/12 часов sc (подкожно) в течение 4 суток). Семь суток спустя осуществляли аферез периферической крови с выделением CD133+ клеток. Затем, аутологичные CD133+ клетки доставляли в спиральные артериолы с помощью неинвазивного радиологического вмешательства через маточную артерию с использованием микрокатетера размером 2,5 F. Состояние эндометриальной полости оценивали посредством гистероскопии, вагинального ультразвукового исследования и гистологического исследования до вмешательства с использованием стволовых клеток и через 3, 6 и 9 месяцев после него.
Пациенты и способы
Критерии включения
В исследование включали шестнадцать пациенток, у которых диагностировали невосприимчивый к лечению синдром Ашермана, лечение которого ранее осуществлялось с использованием хирургического вмешательства по меньшей мере семь раз, или атрофию эндометрия (<4 мм), устойчивую к гормональному лечению, с повторяющейся неудачной имплантацией. Все пациентки направлялись их соответствующими лечащими врачами по всему миру для участия в клиническом экспериментальном исследовании, поддерживаемом Министерством здравоохранения Испании. Возраст пациенток находился в диапазоне 20-45 лет, и все они имели нормальную функцию печени, сердца и почек. Подтверждали отсутствие менструального кровотечения в естественном цикле или после гормональной заместительной терапии (HRT). Также подтверждали отсутствие психиатрической патологии, ВИЧ (HIV), гепатита В или С и сифилиса, а также готовность участвовать в исследовании.
Критерии исключения
Пациенток исключали из исследования, если не было доступа к периферическим венам, или если они имели спленомегалию.
Методика
1. Мобилизация стволовых клеток костного мозга (BMSC)
Для того чтобы начать процедуру мобилизации, обеспечивали соответствие следующим условиям:
- Пациенток информировали о процедуре и давали им форму информированного согласия по меньшей мере за 24 часа до мобилизации.
- Соответствующую медицинскую оценку осуществляли с соответствующими дополнительными обследованиями, и она подтверждалась лечащим врачом, ответственным за сбор BMSC.
- Обеспечивали доступность результатов соответствующих серологических анализов (HIV, HBcAg, HBsAg, HCV, сифилис).
- Вены оценивали для определения их пригодности для процедуры.
Затем мобилизацию BMSC в периферическую кровь индуцировали с помощью G-CSF (5 мкг/кг sc каждые 12 часов) в течение 4 суток.
2. Сбор BMSC
Сбор BMSC выполняли с помощью традиционной процедуры афереза с использованием периферической вены. Положительную селекцию CD133+ клеток осуществляли, следуя протоколу РО-7610-02, одобренному Университетской клинической больницей (Hospital 
Universitario) с применением трех промываний и последующей селекцией CD133+ клеток. Вначале клетки промывали и инкубировали с моноклональным антителом, затем их промывали дополнительные два раза и, наконец, подвергали селекции по CD133+.
Процедуры селекции осуществляли максимум в течение 3 часов или до тех пор, пока не собирали по меньшей мере 50 миллионов CD133+ клеток.
3. Трансплантация CD133+ клеток в спиральные артериолы матки с помощью внутриартериальной катетеризации
Спустя двадцать четыре часа после их выделения аутологичные CD133+ клетки разводили в 15-30 см3 солевой раствор, а затем вливали в спиральные артерии. Клетки собирали посредством стерильного шприца в контейнер и направляли в радиологическое отделение перед их вливанием. Вливали по меньшей мере 45 миллионов клеток.
Процедура катетеризации маточной артерии была хорошо описана и применялась в эмболизации миом матки. Требующееся радиологическое оборудование для этой процедуры представляло собой радиохирургический рентгеновский аппарат типа С-дуга или кабинет для ангиографии с ультразвуковым сканером. Вкратце, после получения доступа к общей бедренной артерии с использованием методики Сельдингера катетер размером 4F помещали в артерию и использовали для катетеризации обеих подчревных артерий с использованием ангиографического катетера с проводом управления катетером типа cobra 2 и направляющим элементом Terumo размером 0,035 дюйма. Микрокатетер размером 2,5 F помещали с использованием направляющего элемента размером 0,014 дюйма через катетер типа cobra, и в маточную артерию вводили катетер до тех пор, пока восходящая часть провода управления катетером или микрокатетер не достигали своего наиболее дистального уровня. После того как катетер стабилизировали и его положение проверяли, CD133+ BMSC вливали в виде суспензии в солевом растворе. Диаметр катетера для инъекции клеток составлял 500-600 микрон, и объем раствора для перфузии составлял 15 см3.
После вмешательства пациентка оставалась в течение ночи в больнице, и ее выписывали на следующий день без осложнений.
Критерии ответа
Эта методика направлена на повторное заселение эндометриальной сосудистой ниши у пациенток, страдающих от синдрома Ашермана или атрофии эндометрия, с использованием CD133+ BMSC с целью реконструкции функционального эндометрия, способного обеспечивать возможность имплантации эмбриона у пациенток, подвергающихся ART, с повторяющейся неудачной имплантацией, обусловленной эндометрием. Таким образом, следующие показатели рассматривались как успешное лечение:
- конечный результат по менструации, менструация должна возобновляться после лечения с использованием CD133+ BMSC
- увеличение толщины эндометрия. Минимум 50% от максимальной толщины когда-либо полученной с использованием HRT, измеренное с помощью вагинального ультразвукового исследования по продольной оси на дне матки (vgr от 4 до 6 мм).
- гистероскопические и гистологические признаки образованного de novo эндометрия
- функциональность реконструированного эндометрия с точки зрения частоты живорождения, показателей частоты беременности и имплантации после реплантации эмбриона у этих пациенток
Результаты
Это первый пример серии исследований с использованием этого конкретного лечения стволовыми клетками, применяемого внутри сосудов при AS. Заболеваемость AS варьирует от 2 до 22% бесплодных женщин.
G-CSF является наиболее часто используемым цитокином для мобилизации BMSC у доноров как аутологичных, так и аллогенных клеток. Этот продукт обычно хорошо переносится. Тем не менее, было показано, что введение дозы, большей чем 5 мкг/кг/сутки, влечет за собой боль в костной и мышечной ткани в более чем 50% случаев. Если она имеет место, парацетамол следует вводить в качестве аналгезирующего средства (500 мг/8 часов) при продолжении введения G-CSF. Другие осложнения, наблюдаемые менее часто, представляют собой: тошноту и рвоту, мигрень и бессонницу. В каждом случае следует назначать симптоматическое лечение. В целом, симптомы исчезают за 3-4 суток после прекращения введения G-CSF, хотя ощущение астении может продолжаться вплоть до 2 недель с момента введения последней дозы. Наконец, разрыв селезенки у здоровых доноров был ассоциирован с введением G-SCF. Вследствие этого факта сканирование брюшной области следует проводить у всех пациенток, у которых присутствует боль в левой подреберной области. За спленомегалией, выявляемой в этих случаях, должно следователь немедленная приостановка введения G-CSF. Часто выявляли высокие уровни щелочной фосфатазы и LDH (лактат-дегидрогеназа) без каких-либо связанных симптомов. Лейкоцитоз является достаточно распространенным, и величины в норме составляют менее 70×109/л.
Пример 2
Участницы исследования
Для участия в исследовании приглашали шестнадцать пациенток (в возрастном диапазоне 30-45 лет), у которых диагностировали либо невосприимчивый к лечению синдром Ашермана (AS) на основании классификации Американского общества репродуктивного здоровья (N=11) или атрофию эндометрия (N=5). Подтверждали ранее поставленный диагноз тяжелый синдром Ашермана или атрофия эндометрия, и процедуры гистероскопии осуществляли в пролиферативной фазе. Пациенток, у которых диагностировали AS, классифицировали в соответствии с классификацией маточных спаек (Classification of Uterine Adhesions) AFS и получали образцы биопсии эндометрия. У всех пациенток присутствовало незначительное количество менструальных кровяных выделений или отсутствовали менструальные кровяные выделения во время их природных циклов или после гормональной заместительной терапии (HRT). Требования к участию в исследовании включали следующие: нормальная функция печени, сердца и почек, отсутствие HIV, гепатита В или С, сифилиса и психиатрической патологии и готовность к завершению исследования. Пациенток исключали в случаях, когда не было доступа к периферическим венам, или когда присутствовала спленомегалия.
Мобилизация и выделение BMDSC
Мобилизацию BMDSC индуцировали путем фармакологического введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) (10 мкг/кг/сутки в Дни -4, -3, -2 и -1). G-CSF представляет собой цитокин, широко используемый для этой цели у доноров как аутологичных, так и аллогенных доноров. Через пять суток после инъекции выделение CD133+ клеток осуществляли посредством афереза через периферические вены с использованием сепаратора CobeSpectra (Terumo ВСТ, Лейквуд, Колорадо). Два из трех образцов на пациентку обрабатывали и положительную селекцию CD133+ клеток получали, следуя установленному протоколу с использованием системы CliniMACS® (Miltenyi Biotec GmbH, Бергиш-Гладбах, Германия). Селекцию осуществляли в течение трех часов с момента сбора до тех пор, пока не будет собрано 50 миллионов клеток. Выделенные CD133+ клетки разводили в 15-30 см3 солевого раствора и транспортировали в стерильном шприце в радиологическое отделение для доставки в спиральные артериолы.
Доставка BMDSC
После успешного выделения CD133+ пациенток направляли в радиологическое отделение HCU, где осуществляли внутриартериальную катетеризацию для доставки клеток в эндометриальную нишу для стволовых клеток с использованием методики, применяемой для эмболизации фиброидных опухолей. Общей бедренной артерии достигали с использованием методики Сельдингера, при которой интродуктор размером 4 F обеспечивал возможность катетеризации обеих подчревных артерий с использованием провода управления ангиографическим катетером и направляющего элемента Terumo (0,035 дюйма). Через последний катетер вводили микрокатетер размером 2,5 F с направляющим элементом (0,014 дюйма) для того, чтобы ввести катетер в маточную артерию в наиболее дистальные спиральные артериолы, которых может достичь микрокатетер (фиг. 9). После того как положение катетера стабилизировалось и было подтверждено, 15 см3 суспензии отобранных CD133+ клеток в солевом растворе (содержащей 42-200×106 клеток, среднее значение 123,56×106±57,64) вводили инъекцией через каждую маточную артерию в спиральные артериолы.
Последующее врачебное наблюдение
Всем пациенткам назначали гормональную заместительную терапию (Progyluton™, Bayer, Берлин, Германия) после получения клеточной терапии.
Состояние полости эндометрия оценивали с помощью диагностической гистероскопии, вагинального ультразвукового исследования и гистологического анализа для определения толщины эндометрия и наличия или отсутствия эндометриальных спаек перед клеточной терапией, через 2, 3 и 6 месяцев после нее. Затем пациенткам предлагали подвергнуться ART для того, чтобы попытаться достичь оплодотворения (фиг. 9).
Иммуногистохимическое исследование эндометрия
Образование кровеносных сосудов оценивали с помощью иммуногистохимического исследования в отношении CD31 и α-sma-Су3 в залитых в парафин срезах с использованием антитела к человеческому CD31 (Dako, Глоструп, Дания) с меченым флуоресцентной меткой Alexa вторичным козьим антителом к мышиному антителу 488 и мышиного антитела к человеческому α-sma-Су3 (Sigma-Aldrich, Миссури, США). Срезы подвергали контр-окрашиванию DAPI (Invitrogen, Калифорния, США). Положительные контроли включали в себя человеческую небную миндалину для CD31 и миометрий для α-sma. Срезы оценивали под флуоресцентным микроскопом Nikon Eclipse 80i. Три отдельных поля при 20х увеличении использовали для анализа общего количества образованных кровеносных сосудов на единицу площади с помощью программного обеспечения ImageJ. Данные представлены в виде конкретных значений для каждой пациентки перед клеточной терапией и через 3 месяца и 6 месяцев после нее.
Статистический анализ
Статистический анализ осуществляли с использованием программного обеспечения SPSS 17.0 (IBM, Мэриленд, США). Т-критерий для парных выборок использовали для анализа различий, наблюдаемых при подсчете общего количества зрелых кровеносных сосудов. Р-значение, полученное в 2-сторонним критерием ≤0,05, считалось статистически значимым.
Результаты
Две пациентки первоначально исключали из исследования вследствие слабой мобилизации CD133+ клеток (<40 миллионов) в одном случае и отсутствия доступа к периферическим венам - в другом. Всего 16 пациенток завершили протокол. Не сообщалось о серьезных осложнениях.
Пациенток направляли в исследование с диагнозом невосприимчивый к лечению AS (N=11) (таблица 3). В истории менструальных циклов пациенток выявляли аменорею у двух пациенток и скудные мажущие выделения у девяти. Причины AS представляли собой травматическую дилатацию и кюретаж (D&C) (N=9), гистероскопическую миомэктомию (N=1) и неустановленной этиологии (N=1). Среднее число ранее предпринятых процедур восстановительной оперативной гистероскопии составляло две. Ни одна пациентка не сообщала о значительном улучшении состояния ее эндометрия несмотря на хирургическое лечение. Три пациентки классифицировали как имеющие оценку III AS, четыре пациентки классифицировали как имеющие оценку II+ЕА, две пациентки классифицировали как имеющие оценку II и одну пациентку классифицировали как имеющую оценку I AS (фиг. 7А). Максимальная толщина эндометрия с высокими дозами HRT, достигаемая перед клеточной терапией, составляла 4,3 мм ±0,74 (в диапазоне от 2,7 до 5 мм) (таблица 3).
Пациентки с ЕА и неудачной имплантацией (N=5) (таблица 4), вступающие в это исследование, имели предыдущую историю менструальных циклов с аменореей (N=3) или скудными мажущими выделениями (N=2). Этиология представляла собой предшествующие D&C (N=1), являлась невыясненной (N=1), представляла собой применение левоноргестрела IUD (N=1), синдром истощенных яичников (N=1) и предшествующую гистероскопическую миомэктомию (N=1). Среднее число предшествующих процедур восстановительной оперативной гистероскопии составляло две. Тяжелую атрофию эндометрия наблюдали в всех случаях (фиг. 7В). Максимальная толщина эндометрия с высокими дозами HRT, достигаемая перед клеточной терапией, составляла 4,2 мм ± 0,8 (в диапазоне от 2,7 до 5 мм) (таблица 4).
Реконструкция эндометрия после терапии стволовыми клетками
После терапии аутологичными CD133+ BMDSC менструальные циклы возобновлялись с помощью HRT у всех 16 пациенток, за исключением одной с ЕА. Тем не менее, длительность и интенсивность менструации, которые оценивались по числу используемых прокладок, постепенно уменьшалась от среднего значения 5,06 суток (диапазон 3-7 суток) в первом месяце до 2,12 (диапазон 1-3 суток) в шестом месяце после клеточной терапии (дополнительная фиг. 1А). Объем менструальных выделений также уменьшался от среднего значения 2,68 (диапазон 1-5) до 1,5 (диапазон 1-4) прокладки в сутки на шестом месяце.
Осмотр матки, осуществляемый через 2, 3 и 6 месяцев после клеточной терапии, выявил улучшения в эндометрии и полости матки (таблицы 3 и 4; фиг. 7). В частности, у всех пациенток, у которых была диагностирована стадия III AS, присутствовало улучшение до стадии I, в то время как одна из двух пациенток, у которых было поражение на стадии II, показывала полностью нормализованную эндометриальную полость, а у другой присутствовало улучшение до стадии I. У остальных пациенток, у которых изначально была диагностирована стадия I, проявлялось улучшение в отношении количественной оценки, как показано в таблице 3. Максимальная толщина эндометрия, полученная после операции, составляла 6,7 мм (диапазон 3,1-12 мм) (таблица 3, фиг. 7А). В группе ЕА нормальный эндометрий наблюдали после клеточной терапии у четырех из пяти пациенток (таблица 4; фиг. 7В). Максимальная толщина эндометрия, полученная после клеточной терапии, составляла 5,7 мм (диапазон 5-12 мм) (таблица 4).
Общее количество образованных зрелых кровеносных сосудов оценивали у 8 пациенток по совместной локализации CD31 и α-sma, причем оценку осуществляли перед клеточной терапией и через 3 и 6 месяцев после нее (фиг. 8). Постепенное повышение образования кровеносных сосудов наблюдали через 3 месяца от лечения (пациентки 4, 5, 7, 12 и 13), тогда как соответствующее количество зрелых кровеносных сосудов обнаруживали у других (пациентки 6, 9 и 10) (фиг. 8Н). Для сравнения результатов между отправной точкой эксперимента (называемой контролем) и моментом через 3 месяца после специфического лечения CD133+ клетками оценивали соответствующие средние значения и SEM данных. Повышенное общее количество зрелых кровеносных сосудов (CD31+/α-sma+) наблюдалось у пациенток через три месяца после лечения (р=0,021). Эти результаты говорят о характерном неоангиогенезе после инъекции аутологичных CD133+ клеток пациенткам с AS и ЕА, которые постепенно ослабевали после 6 месяцев (фиг. 8I).
Функциональность реконструированного эндометрия оценивали по репродуктивным результатам пациенток, желающих забеременеть после терапии аутологичными CD133+ BMDSC (таблицы 3 и 4). Две пациентки забеременели спонтанно через два и четыре месяца после клеточной терапии, соответственно, что привело в результате к продолжающейся беременности (пациентка 15) и самопроизвольному аборту на 17ой неделе вследствие преждевременного разрыва мембран (пациентка 7). Шесть положительных беременностей получали после 13 процедур пересадки эмбрионов, которые привели в результате к трем биохимическим беременностям, одному самопроизвольному аборту на девятой неделе, обусловленному хромосомной аномалией эмбриона, выявленной после самопроизвольного аборта, одной внематочной беременности и одной продолжающейся беременности (пациентка 12). В одном случае пересадку эмбриона отменяли вследствие хромосомных аномалий у всех из эмбрионов (пациентка 8), и в другом случае пересадку не осуществляли вследствие неудачи клеточной терапии (пациентка 14).
Обсуждение
С гистологической точки зрения AS соответствует замещению стромы эндометрия фиброзной тканью, воздействующему на эндометриальные стволовые клетки и, следовательно, на функцию ткани. Железы обычно заменяются неактивным кубо-цилиндрическим эпителием, который, в целом, не отвечает на гормональную стимуляцию и вызывает полное исчезновение эндометриальной структуры, воздействующее на нишу эндометриальных стволовых клеток и, следовательно, на функцию ткани. В течение первых 50-60 лет после открытия AS исследователи фокусировались на распространенности, этиологии и патологии состояния. С появлением эндоскопии были разработаны новые методы диагностики и лечения данного состояния; тем не менее, несмотря на технологические достижения приблизительно 50% случаев AS в настоящее время не имеют полного излечения.
В данном документе описан первый случай терапии стволовыми клетками, конкретной целью которой является ниша эндометриальных стволовых клеток. В условиях стационарного состояния циркулирующие ЕРС (сЕР) представляют только 0,01% клеток в кровотоке. Таким образом, планировалась мобилизация сЕР, связанная с непосредственной инфузией в пораженный орган. Аутологичные CD133+ BMDSC выделяли после мобилизации с использованием G-CSF, а затем повторно вводили в спиральные артериолы матки пациентки с использованием неинвазивных радиологических процедур. CD133+ BMDSC возобновляют васкуляризацию и индуцируют пролиферацию эндометрия, что приводит к образованию аутологичного реконструированного эндометрия. CD133+ BMDSC недавно были исследованы в клинических испытаниях для регенеративной медицины в применениях, отличных от гематологических.
Главной целью являлась реконструкция эндометрия, которую вначале оценивали по возобновлению менструации, имевшему место у 15 из 16 пациенток. Несмотря на то что длительность и интенсивность менструации постепенно уменьшались через шесть месяцев после клеточной терапии, терапия стволовыми клетками оказывает немедленное влияние на морфологию эндометрия. Гистероскопическая визуализация полости матки, толщина эндометрия, измеренная с помощью вагинального ультразвукового исследования, и данные неоангиогенеза, исследованного посредством иммуногистохимии, согласовались с эффективной, хотя и временной, реконструкцией эндометрия. Вторичная цель заключалась в том, чтобы исследовать функциональность реконструированного эндометрия при попытках забеременеть. Несколько спонтанных беременностей при использовании ART были достигнуты после клеточной терапии, и два самопроизвольных аборта, наблюдаемые в этом исследовании, не были связаны с функциональностью эндометрия.
Приживление клеток являлось главной проблемой вследствие того, что IRB не обеспечивает возможности мечения CD133+ BMDSC суперпарамагнитными наночастицами оксида железа (SPIO) для отслеживания введенных инъекцией клеток. Вместо этого, для данной цели применяли экспериментальную модель синдрома Ашермана с использованием иммунодефицитных мышей. Аликвоту с 1 миллионом CD133+ BMDSC от пациентки, включенной в исследование, использовали для дополнительной характеристики и анализировали в отношении доли Lgr5+ клеток и активности альдегид-дегидрогеназы 1 (ALDH1) с получением в результате 75,72±8% Lgr5+ клеток и активности ALDH1, составляющей 77,45±7,81%, причем данные показатели идентифицировали статус стволовой клетки и клетки-предшественника, соответственно. Еще одну аликвоту с 1 миллионом клеток инкубировали с 50 мкг/мл Molday ION Rhodamine В в течение 18 часов с получением в результате эффективности мечения более 97% во всех экспериментах. Затем SPIO-меченые клетки вводили инъекцией иммунодефицитной мыши, используемой в модели синдрома Ашермана, через хвостовую вену или посредством внутриматочной инъекции. Приживление клеток выявляли посредством идентификации внутриклеточных отложений железа с использованием окрашивания берлинской лазурью, которое выявляло, что CD133+ BMDSC приживались преимущественно вокруг эндометриальных кровеносных сосудов в травмированном эндометрии.
В сообщении о ранее рассматриваемом случае были показаны положительные результаты лечения AS с использованием выделения аутологичных CD9, CD40 и CD90 клеток из костного мозга и помещения их в эндометриальную полость, в то время как в сообщении о другом случае описывалось непосредственное помещение ^охарактеризованных мононуклеарных стволовых клеток в субэндометриальную зону с использованием иглы. Сообщения об обоих случаях отличались типом доставляемых клеток и намеченной целью нишей стволовых клеток.
В настоящем исследовании демонстрируется, что терапия аутологичными CD133+ BMDSC клетками является полезной при лечении пациенток с невосприимчивыми к лечению AS и ЕА, желающих забеременеть.
Список литературы:
1. Cha J, Vilella F, Dey SK and 
C. "Molecular Interplay in Successful Implantation" in Ten Critical Topics in Reproductive Medicine, S. Sanders. Science/AAAS, Washington, DC, 2013, pp. 44-48.
2. Cervello I, Gil-Sanchis C, Mas A, Delgado-Rosas F, Martinez-Conejero JA, Galan A, Martinez-Romero A, Martinez S, Navarro I, Ferro J, Horcajadas JA, Esteban FJ, et al. Human endometrial side population cells exhibit genotypic, phenotypic and functional features of somatic stem cells. PLoS ONE 2010; 5: e10964.
3. Cervello I, Mas A, Gil-Sanchis C, Peris L, Faus A, Saunders PT, Critchley HO, Simon C. Reconstruction of endometrium from human endometrial side population cell lines. PLoS ONE 2011; 6: e21221.
4. Masuda H, Matsuzaki Y, Hiratsu E, Ono M, Nagashima T, et al. (2010) Stem cell-like properties of the endometrial side population: implication in endometrial regeneration. PLoS One. 5(4): e10387.
5. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, et al. (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284 (5411): 143-7.
6. Taylor HS. (2004) Endometrial cells derived from donor stem cells in bone marrow transplant recipients. JAMA. 292(l): 81-5.
7. Du H, Taylor HS. (2007) Contribution of bone marrow-derived stem cells to endometrium and endometriosis. Stem Cells 25(8): 2082-6.
8. Mints M, Jansson M, Sadeghi B, Westgren M, Uzunel M, et al. (2008) Endometrial endothelial cells are derived from donor stem cells in a bone marrow transplant recipient. Hum Reprod. 23(1): 139-43.
9. Ikoma T, Kyo S, Maida Y, Ozaki S, Takakura M, et al. (2009) Bone marrow-derived cells from male donors can compose endometrial glands in female transplant recipients. Am J Obstet Gynecol. 201(6): 608. e1-8.
10. Cervello I, Gil-Sanchis C, Mas A, Faus A, Sanz J, Moscardo F, Higueras G, Sanz MA, Pellicer A, Simon C. Bone marrow-derived cells from male donors do not contribute to the endometrial side population of the recipient. PLoS ONE 2012; 7: e30260.
11. Du H, Taylor HS. Contribution of bone marrow-derived stem cells to endometrium and endometriosis. Stem Cells 2007; 25: 2082-2086.
12. Brantincsak A, Brownstein MJ, Cassiani-Ingoni R, Pastorino S, Szalayoval, Toth ZE, Key S, Nemeth K, Pickel J, Mezey E. CD45-positive blood cells give rise to uterine epithelial cells in mice. Stem Cells 2007; 25: 2820-2826.
13. Zhou Y, Gan Y, Taylor HS. Cigarette smoke inhibits recruitment of bone marrow-derived stem cells to the uterus. Reprod Toxicol 2011; 31:123-127.
14. Du H, Naqvi H, Taylor HS. Ischemia/reperfusion injury promotes and granulocyte-colony stimulating factor inhibits migration of bone marrow derived stem cells to endometrium. Stem Cells Dev 2012; 21: 3324-3331.
15. Morelli S, Rameshwar P and Goldsmith LT. Experimental Evidence for Bone Marrow as a Source of Nonhematopoietic Endometrial Stromal and Epithelial Compartment Cells in a Murine Model. Biol Reprod 2013; 89:7, 1-7.
16. Aghajanova L, Horcajadas JA, Esteban FJ, Giudice LC. The bone marrow derived human mesenchymal stem cell: potential progenitor of the endometrial stromal fibroblast. Biol Reprod 2010; 82:1076-1087.
17. Urbich С and Dimmeler S. Endothelial Progenitor Cells: Characterization and Role in Vascular Biology. Circ Res. 2004; 95:343-353
18. Yu D, Wong YM, Cheong Y, Xia E, Li TC. Asherman syndrome-one century later. Fertil Steril 2008; 89:759-79.
19. Ravina JH, Herbreteau D, Ciraru-Vigneron N, et al. Arterial embolisation to treat uterine myomata. Lancet 1995; 346(8976): 671-2).
20. Chaitanya В Nagori, Sonal Y Panchal, and Himanshu Patel. Endometrial regeneration using autologous adult stem cells followed by conception by in vitro fertilization in a patient of severe Asherman's syndrome. J Hum Reprod Sci; 4(1): 43-48 (2011)
21. Gargett CE, Healy DL. Generating receptive endometrium in Asherman's syndrome. J Hum Reprod Sci, 4(1): 49-52 (2011)
22. Bradley EA, Reidy JF, Forman RG, Jarosz J, Braude PR. Transcatheter uterine artery embolisation to treat large uterine fibroids. Br J Obstet Gynaecol 1998; 105(2): 235-40
23. Dmowski WP, Greenblatt RB. Asherman's syndrome and risk of placenta accreta. Obstet Gynecol 1969; 34: 288-299.
24. Ventolini G, Zhang M, Gruber J. Hysteroscopy in the evaluation of patients with recurrent pregnancy loss: a cohort study in a primary care population. Surg Endosc 2004; 18: 1782-1784.
25. Senturk LM, Erel CT. Thin endometrium in assisted reproductive technology. Curr Opin Obstet Gynecol. 2008; 20: 221-228.
26. Sher G, Fisch JD. Effect of vaginal sildenafil on the outcome of in vitro fertilization (IVF) after multiple IVF failures attributed to poor endometrial development. Fertil Steril 2002; 78: 1073-6.
27. Okusami AA, Moore ME, Hurwitz JM, Richlin SS. A case series of patients with endometrial insufficiency treatment with pentoxifylline and alphatocopherol. Fertil Steril 2007; 88: S200.
28. Brantincsak A, Brownstein MJ, Cassiani-Ingoni R, et al. CD45-positive blood cells give rise to uterine epithelial cells in mice. Stem Cells 2007; 25: 2820-2826.
29. Rafii S, Lyden D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med. 2003; 9: 702-12.
30. Uchida N, Buck DW, He D, et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc Natl Acad Sci 2000; 97: 14720-14725.
31. Sagrinati C, Netti GS, Mazzinghi B, et al. Isolation and characterization of multipotent progenitor cells from the Bowman's capsule of adult human kidneys. J Am Soc Nephrol 2006; 17: 2443-2456.
32. Richardson GD, Robson CN, Lang SH, Neal DE, Maitland NJ, Collins AT. CD 133, a novel marker for human prostatic epithelial stem cells. J Cell Sci 2004; 117: 3539-3545.
33. Kordes C, Sawitza I, 
A, et al. CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells. Biochem Biophys Res Commun 2007; 352: 410-417.
34. The American Fertility Society classifications of adnexal adhesions, distal tubal occlusion, tubal occlusion secondary to tubal ligation, tubal pregnancies, Mullerian anomalies and intrauterine adhesions. Fertil Steril 1988; 49: 944-55.
35. Gordon PR, Leimig T, Babarin-Dorner A, et al. Large-scale isolation of CD133+ progenitor cells from G-CSF mobilized peripheral blood stem cells. Bone Marrow Transpl 2003; 31: 17-22.
36. Goodwin SC, Spies JB, Worthington-Kirsch R, et al. Uterine artery embolization for treatment of leiomyomata: long-term outcomes from the FIBROID Registry. Obstet Gynecol. 2008; 111(1): 22-33.
37. Cervello I, Gil-Sanchis C, Santamaria X, Cabanillas S, Diaz A, Faus A, Pellicer A, 
C. Human bone marrow-derived stem cells improve endometrial regeneration in a murine experimental Asherman's syndrome model. Human Reprod 2015, in press.
38. Asherman JG. Amenorrhoea traumatica (atretica). J Obstet Gynaecol Br Emp 1948; 55: 23-30.
39. Donnez J, Nisolle M. Hysteroscopic lysis of intrauterine adhesions (Asherman' syndrome). In Donnez J (ed): Atlas of laser operative laparoscopy and hysteroscopy. New York: Press-Parthernon Publishers 1994: 3-12.
40. March CM, management of Ashermans Syndrome. Reprod Biomed Online 2011 (l): 63-76
41. Singh N, Mohanty S, Seth T, Shankar M, Bhaskaran S, Dharmendra S. Autologous stem cell transplantation in refractory Asherman's syndrome: A novel cell based therapy. J Hum Reprod Sci 2014; 7: 93-8.
Различные модификации настоящего изобретения в дополнение к показанным и описанным в данном документе будут очевидны специалисту в данной области техники из вышеизложенного описания, и они попадают в объем приложенной формулы изобретения. Преимущества и цели настоящего изобретения не обязательно охватываются каждым вариантом осуществления настоящего изобретения.
1. Способ индукции регенерации эндометрия, включающий:
введение эффективного количества аутологичных CD133+ стволовых клеток, полученных из костного мозга (BMDSC), в маточные артерии субъекта, нуждающегося в этом, для индукции регенерации эндометрия.
2. Способ по п. 1, в котором известно, что субъект имеет синдром Ашермана или атрофию эндометрия.
3. Способ по п. 2, в котором субъект имеет атрофию эндометрия, которая является устойчивой к гормональному лечению.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором у субъекта была одна или несколько предыдущих неудачных имплантаций эмбриона.
5. Способ по любому из пп. 1-3, в котором аутологичные CD133+ BMDSC получают посредством введения субъекту средства для мобилизации BMDSC из костного мозга в периферическую кровь субъекта и
выделения CD133+ BMDSC из периферической крови субъекта.
6. Способ по п. 5, в котором средство для мобилизации BMDSC представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF).
7. Способ по п. 5, в котором аутологичные CD133+ BMDSC выделяют из периферической части системы кровообращения у субъекта с помощью афереза с использованием антитела к CD 133.
8. Способ по любому из пп. 1, 3, 6-7, в котором CD133+ BMDSC вводят в маточные артерии посредством катетера.
9. Способ по любому из пп. 1, 3, 6-7, в котором CD133+ BMDSC вводят в спиральные артериолы матки субъекта.
10. Способ индукции регенерации эндометрия, включающий:
выделение аутологичных CD133+ стволовых клеток, полученных из костного мозга (BMDSC), из субъекта, нуждающегося в этом; и
введение эффективного количества выделенных CD133+ BMDSC в маточные артерии субъекта для индукции регенерации эндометрия.
11. Способ по п. 10, в котором гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) вводят субъекту перед выделением аутологичных BMDSC.
12. Способ по любому из пп. 10-11, в котором аутологичные CD133+ BMDSC выделяют из периферической части системы кровообращения у субъекта с помощью афереза с использованием антитела к CD133.
13. Способ по любому из пп. 10-11, в котором CD133+ BMDSC вводят в маточные артерии посредством катетера.
14. Способ по любому из пп. 10-11, в котором CD133+ BMDSC вводят в спиральные артериолы матки субъекта.
15. Способ по любому из пп. 10-11, в котором известно, что субъект имеет синдром Ашермана или атрофию эндометрия.
16. Способ по п. 15, в котором субъект имеет атрофию эндометрия, которая является устойчивой к гормональному лечению.
17. Способ по любому из пп. 10, 11, 16, в котором у субъекта была одна или несколько предыдущих неудачных имплантаций эмбриона.
