Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента слитый белок, в котором слиты проникающий в опухоль пептид и антиангиогенное средство, для предупреждения и лечения рака или связанных с ангиогенезом заболеваний

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены фармацевтические композиции для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания и для ингибирования метастазирования рака, содержащие в качестве активного ингредиента слитый белок, в котором проникающий в опухоль пептид слит со средством против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF). Предложены применение указанного слитого белка для получения средства для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания и для ингибирования метастазирования рака и способы лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания и ингибирования метастазирования у нуждающегося в этом субъекта. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффект нацеливания на рак, тем самым производя ингибирование ангиогенеза и оказывая терапевтический эффект на рак, демонстрирующий резистентность или невосприимчивость к средству против VEGF. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 12 ил., 2 табл., 9 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента слитый белок, образованный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению слитого белка для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем слитый белок обладает отличным эффектом ингибирования ангиогенеза из-за улучшения проникновения антиангиогенного средства в опухоль и проявления эффекта нацеливания на рак и может демонстрировать терапевтический эффект даже на раки, демонстрирующие резистентность или невосприимчивость к антиангиогенному средству, из-за увеличения эффективности антиангиогенного средства.

Уровень техники

По настоящей заявке испрашивается приоритет корейской патентной заявки № 10-2015-0123878, поданной 1 сентября 2015 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте.

Ангиогенез является процессом, с помощью которого образуются новые капилляры из уже существующих микросудов. Ангиогенез является нормальным физиологическим явлением, и известно, что он играет важную роль в развитии, заживлении ран и женских репродуктивных циклах. Кроме того, существует несколько заболеваний, вызванных нарушением саморегуляции ангиогенеза и аномальным ростом кровеносных сосудов. Например, известно, что аномальное увеличение ангиогенеза играет решающую роль в росте и метастазировании рака и в таких заболеваниях, как диабетическая ретинопатия, возрастная макулярная дегенерация, ревматоидный артрит, эндометриоз, псориаз и хроническое воспаление. Наоборот, недостаточный ангиогенез является причиной ишемической болезни сердца, инсульта, инфаркта миокарда, язвы или замедленного заживления ран.

Из этих заболеваний рак является заболеванием, при котором клетки, составляющие тело, неправильно делятся под действием определенного канцерогенного фактора, и, следовательно, клетки сами по себе не контролируются организмом, что приводит к бессистемной пролиферации. Кроме того, клетки вторгаются в окружающие ткани и производят отдаленные метастазы в других органах через кровеносные сосуды, лимфатические сосуды и т.п., вызывая нарушения. Пренебрежение таким состоянием является фатальным, и поэтому это состояние называется злокачественной опухолью или злокачественным новообразованием, а такие клетки называются раковыми клетками или злокачественными клетками.

Существуют различные виды терапии в зависимости от типа рака, причем обычно используют хирургию, химиотерапию, вызывающую апоптоз, лучевую терапию, направленную на раковые клетки терапию, иммунотерапию, высокотемпературную терапию, трансплантацию стволовых клеток, фотодинамическую терапию и т.п. В последнее время часто проводят направленные терапии для минимизации неблагоприятных эффектов из-за разрушения нормальных клеток и для увеличения эффективности лекарственных средств, причем к их типам относятся блокатор сигнализации для ингибирования специфичного для рака роста, ингибитор ангиогенеза для блокирования подачи кислорода и питательных веществ раковым клеткам, индуктор апоптоза, усилитель иммунитета и т.п.

Ангиогенез, который представляет собой процесс образования новых кровеносных сосудов из существующих кровеносных сосудов, является одним из процессов, которые необходимы для возникновения и развития кровеносных сосудов, деления и роста нормальных клеток и тканей и деления и роста раковых клеток.

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является одним из нескольких факторов роста, участвующих в ангиогенезе, причем известно, что роль VEGF-A среди этих факторов важна. Моноклональное анти-VEGF антитело бевацизумаб (авастин), которое специфически ингибирует VEGF-A для подавления ангиогенеза, было одобрено FDA и EMA в качестве первичного или вторичного лекарственного средства для метастатического рака толстой кишки в комбинации с 5-фторурацилом в 2004 и 2005 годах, соответственно. После этого бевацизумаб (авастин) был также одобрен после нескольких сотен клинических испытаний в качестве лекарственного средства для лечения различных раков, таких как метастатический рак почки, метастатическая немелкоклеточная карцинома, прогрессирующая глиобластома и метастатический рак молочной железы.

Средства против VEGF, такие как авастин, могут воздействовать на рак, сопровождающийся активным ангиогенезом. Однако побочные эффекты средств против VEGF зависят от дозы в таких органах, как почки и желудок, поскольку эти средства влияют не только на рак, но также и на другие органы с высокими уровнями VEGF.

Помимо VEGF-A в сигнальный механизм ангиогенеза вовлечены другие факторы роста, такие как фактор роста фибробластов (FGF), система лигандов/рецепторов Notch, фактор роста плаценты (PIGF) и тромбоцитарный фактор роста BB (PDGF-BB). Таким образом, даже когда VEGF-A заблокирован средствами против VEGF, такими как авастин, возможна компенсация с помощью других механизмов. Поэтому предполагается, что многие пациенты невосприимчивы к средствам против VEGF, таким как авастин, или обладают резистентностью к ним из-за многократного введения авастина, не приводящего к заметному эффекту.

Поскольку средства против VEGF, такие как авастин, обладают сильной противораковой активностью, блокируя опосредованную VEGF-A сигнализацию для ингибирования ангиогенеза, их можно использовать в качестве эффективного средства, которое отдельно или в составе комбинированной терапии можно применять при различных карциномах, включая трудноизлечимые метастатические раки. Тем не менее, средства против VEGF обладают резистентностью и побочными эффектами из-за механизмов их действия и дозы, поэтому средства против VEGF демонстрируют более низкие клинические эффекты, чем ожидалось, и используются ограничено. Поэтому существует необходимость в разработке новых средств, способных преодолеть такие недостатки средств против VEGF, таких как авастин, и увеличить их эффективность.

Подробное описание изобретения

Техническая проблема

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что слитый белок, в котором проникающий в опухоль пептид (TPP), воздействующий на нейропилиновый рецептор (NRP), слит с антиангиогенным средством, может увеличивать проникновение антиангиогенного средства в опухоль, повышать удобство для пациента и снижать зависящие от дозы побочные эффекты, поскольку TPP проявляет свой эффект нацеливания на рак, при снижении его высокой дозы и преодолении резистентности, вызванной изменением периваскулярного микроокружения из-за непрерывного применения антиангиогенного средства, и на этом завершили настоящее изобретение.

Поэтому, аспектом настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем данная фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, полученный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

Аспектом настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем данная фармацевтическая композиция состоит из слитого белка, полученного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Аспектом настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем данная фармацевтическая композиция состоит по существу из слитого белка, полученного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции для ингибирования метастазирования рака, причем данная фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, образованный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции для ингибирования метастазирования рака, причем данная фармацевтическая композиция состоит из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции для ингибирования метастазирования рака, причем данная фармацевтическая композиция состоит по существу из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является предоставление применения слитого белка для получения средства для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем данный слитый белок образован слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление способа лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, образованный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление способа лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция состоит из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление способа лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция состоит по существу из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление применения слитого белка для получения средства для ингибирования метастазирования рака, причем данный слитый белок образован слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление способа ингибирования метастазирования у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, образованный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление способа ингибирования метастазирования у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция состоит из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление способа ингибирования метастазирования у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция состоит по существу из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Техническое решение

В соответствии с аспектом настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем данная фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, полученный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем данная фармацевтическая композиция состоит из слитого белка, полученного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем данная фармацевтическая композиция состоит по существу из слитого белка, полученного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция для ингибирования метастазирования рака, причем данная фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, образованный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция для ингибирования метастазирования рака, причем данная фармацевтическая композиция состоит из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция для ингибирования метастазирования рака, причем данная фармацевтическая композиция состоит по существу из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается применение слитого белка для получения средства для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем данный слитый белок образован слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, образованный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция состоит из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция состоит по существу из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается применение слитого белка для получения средства для ингибирования метастазирования рака, причем данный слитый белок образован слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается способ ингибирования метастазирования у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, образованный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается способ ингибирования метастазирования у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция состоит из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается способ ингибирования метастазирования у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция состоит по существу из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Далее настоящее изобретение будет описано подробно.

Настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем данная фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, полученный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем данная фармацевтическая композиция состоит из слитого белка, полученного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем данная фармацевтическая композиция состоит по существу из слитого белка, полученного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Хорошо известно, что фактор-A роста эндотелия сосудов (VEGF-A) вызывает экстравазацию. Его также называют фактором проницаемости сосудов. Известно, что это воздействие индуцируется его связыванием с рецептором фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR2), причем интересно, что эксперименты по мутации фактора-A роста эндотелия сосудов продемонстрировали, что сосудистая проницаемость из-за фактора-A роста эндотелия сосудов возрастала, даже если фактор-A роста эндотелия сосудов не мог связаться с рецептором фактора роста эндотелия сосудов. Это позволило предположить, что существует еще один рецептор для фактора-A роста эндотелия сосудов (Stacker et al., 1999).

Нейропилин был впервые обнаружен в нервной системе Xenopus Takagi et al. (1987) и Fujisawa et al. (1989). Нейропилин представляет собой трансмембранный гликопротеин, причем существует два типа нейропилинов, NRP1 и NRP2. Нейропилин действует как корецептор рецепторов VEGF (VEGFR), связывая лиганды семейства VEGF. Благодаря тому, что NRP1 изменяет аффинность связывания между VEGF165 и VEGFR2, было обнаружено, что NRP1 связывается с различными VEGF-лигандами, действуя как корецептор для VEGFR1, VEGFR2 и VEGFR3, тем самым увеличивая силу связывания между лигандом и рецептором (Soker et al., 1998). С другой стороны, NRP2 вносит вклад в лимфангиогенез и клеточную адгезию, действуя как корецептор для VEGFR2 и VEGFR3. Кроме того, действуя как корецептор для рецепторов семейства плексинов, NRP1/NRP2 (NRP1/2) связывается как с лигандами с секретируемыми семафоринами класса 3 (Sema3A, Sema3B, Sema3C, Sema3D, Sema3E, Sema3F и Sema3G).

NRP1 действует как корецептор с VEGFR-2, увеличивая миграции клеток и ангиогенез в эндотелиальных клетках и участвуя в процедуре реконструкции сосудов, в которой перициты покрывают кровеносные сосуды, и поэтому NRP1 является основным фактором развития сосудов. Кроме того, NRP1 увеличивает экспрессию эндотелиального сосистого (VE)-кадгерина и эпителий-специфической молекулы адгезии клеток (E-кадгерина) для поддержания адгезионного контакта между клетками. В частности, NRP1 имеет высокий уровень экспрессии в различных клеточных линиях рака, включая рак легкого, молочной железы, предстательной железы, поджелудочной железы и толстой кишки, в то время как известно, что у пациентов с запущенной колоректальной карциномой высокая экспрессия NRP1 приводит к высокой вероятности метастазирования рака в лимфатические узлы или печень и приводит к снижению выживаемости. Таким образом, взаимосвязь между NRP1 и метастазированием рака также была подтверждена клинически.

Как используется в настоящем документе, термин "проникающий в опухоль" говорит о наличии любой характеристики из специфического распознавания сверхэкспрессирующих NRP тканей и накопления в них, расширения клеточного зазора между клетками эндотелия сосудов для облегчения экстравазации лекарственных средств и коррекции зазора между клетками роговицы, которые представляют собой ткань, служащую барьером для водорастворимых молекул, для способствования распределению лекарственного средства в ткани.

Ангиогенез требует ряда различных и сложных процессов, таких как простой рост клеток эндотелия сосудов, инвазия эндотелиальных клеток в базальные мембраны, их миграция и дифференцировка и образование капилляров. Сообщалось о большом количестве промоторов и ингибиторов для контроля процесса ангиогенеза. Кроме того, для ангиогенеза необходима активация гистолитических ферментов и т.п., причем такой ряд процессов очень похож на процедуру инвазии раковых клеток.

Наиболее известным фактором, усиливающим ангиогенез, является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). VEGF имеет размер 32-44 кДа, секретируется почти во всех клетках и сильно коррелирует с инвазией опухолей (Takahashi et al., 1995). Раньше VEGF был известен как фактор проницаемости сосудов, и он демонстрирует в 50000 раз более сильный эффект экстравазации, чем гистамин (Senger et al., 1983). Характеристики таких экстравазационных характеристик перемещают белки в кровь из кровеносных сосудов для облегчения образования новых кровеносных сосудов.

Недавно, в последние годы, были выделены и очищены белки-ангиопоэтины, и известно, что они играют ключевую роль в образовании ангиогенных структур. Белки-ангиопоэтины (ANG) классифицируются на Ang-1 и Ang-2, которые связываются с рецептором Tie-2, специфически присутствующим в эндотелиальных клетках. Ang-1 участвует в дифференцировке и стабилизации эндотелиальных клеток, тогда как Ang-2 связывается с рецептором Tie-2 для ингибирования связывания Ang-1, что приводит к нестабилизации и сосудистой регрессии эндотелиальных клеток. Для ангиогенеза в раковых тканях раковые клетки сначала выбирают существующий кровеносный сосуд и подвергаются кооптации сосудов и регрессии сосудов, которые опосредованы Ang-2 (Holash et al., 1999).

Известно, что ангиогенез стимулируется активацией ряда рецепторов с помощью различных лигандов, включая, в дополнение к вышеуказанным VEGF и ANG, фактор роста плаценты (PIGF), фактор роста фибробластов (FGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), трансформирующий фактор роста (TGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), эфрин, интерлейкин и костный морфогенетический белок (BMP).

Как используется в настоящем документе, к "антиангиогенным" относятся молекулы, которые препятствуют взаимодействиям между связанными с ангиогенезом молекулами и природными рецепторами, например молекулами, которые связываются с VEGF или с рецепторами VEGF, предотвращая или ингибируя взаимодействия между VEGF и рецепторами VEGF. Антагонисты VEGF включают анти-VEGF антитела, антитела против рецепторов VEGF и химерные молекулы на основе рецепторов VEGF. К "антиангиогенным" также относятся молекулы, которые связываются с PDGF, P1GF, FGF, TGF, ANG, HGF, IGF, эфрином A, интерлейкином, BMP и их рецепторами, предотвращая или ингибируя взаимодействия между ними. Их антагонисты включают антитела против PDGF, против P1GF, против FGF, против TGF, против ANG, против HGF, против IGF, против эфрина A, против интерлейкина и против BMP, антагонистические антитела к соответствующим рецепторам и химерные молекулы на основе рецепторов.

Как используется в настоящем документе, термин "слияние" относится к интеграции двух молекул с одинаковыми или различными функциями или структурами и может представлять собой слияние с помощью любого физического, химического или биологического способа, посредством которого проникающий в опухоль пептид может связываться с антиангиогенным средством. Слияние может осуществляться, предпочтительно, с помощью линкерного пептида, и такой линкерный пептид может связываться, например, с C-концом Fc-фрагмента в антителе.

В то же время антиангиогенные средства являются эффективными лекарственными средствами, которые можно использовать отдельно или в составе комбинированной терапии при различных раках, включая трудноизлечимые метастатические раки, поскольку антиангиогенные средства обладают сильной противораковой активностью, блокируя связанную с ангиогенезом сигнализацию для ингибирования ангиогенеза. Тем не менее, антиангиогенные средства обладают резистентностью и побочными эффектами из-за механизмов их действия и дозы, поэтому антиангиогенные средства демонстрируют более низкие клинические эффекты, чем ожидалось, и используются ограничено. Известно, что средство против VEGF, авастин (химическое название бевацизумаб), который является одним из наиболее типичных лекарственных средств среди антиангиогенных средств, не является рак-специфичным направленным лекарственным средством, в отличие от других медицинских препаратов на основе антител, и поэтому авастин для проявления его эффективности необходимо вводить в высокой дозе, и он может распределяться не только в раковых тканях, но также в других тканях с высоким уровнем VEGF, что приводит к неблагоприятным побочным эффектам.

Слитый белок настоящего изобретения воздействует на NRP, которые широко распространены при раке, поскольку с антиангиогенным средством слит проникающий в опухоль пептид, направленный на NRP, так что слитый белок может увеличивать рак-специфические эффекты антиангиогенного средства при уменьшении его дозы, тем самым увеличивая удобство для пациента и снижая зависящие от дозы побочные эффекты.

Кроме того, NRP1 связывается с VEGF-A, а также с другими факторами роста, такими как VEGF-B, -C, -D, -E и PDGF, при этом играя роль корецептора вместе с VEGFR-1 или -2, так что связывание NRP1 и факторов роста ингибируется благодаря проникающему в опухоль пептиду, слитому в слитом белке настоящего изобретения, и тем самым увеличивается эффект ингибирования ангиогенеза антиангиогенным средством.

Настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, отличающуюся тем, что рак или связанное с ангиогенезом заболевание является резистентным или невосприимчивый к антиангиогенному средству.

Термин "резистентный" или "невосприимчивый" относится к свойству отсутствия терапевтического эффекта при концентрации лекарственного средства, при которой терапевтический эффект обычно проявляется.

Помимо VEGF-A в сигнальный механизм ангиогенеза вовлечены другие факторы роста, такие как FGF, система лигандов/рецепторов Notch, P1GF и PDGF-BB, и поэтому даже когда один сигнал заблокирован, ангиогенез может непрерывно продолжаться благодаря компенсационному действию через другие механизмы. Поэтому предполагается, что многие пациенты невосприимчивы к антиангиогенным средствам или обладают резистентностью к ним из-за многократного введения, не приводящего к заметному терапевтическому эффекту.

Более конкретно, среди антиангиогенных средств примером может служить использование средства против VEGF. При ангиогенезе рост сосудов происходит через деление и рост клеток при высокой концентрации VEGF. После этого, когда концентрация VEGF снижается, возрастает концентрация PDGF, и, следовательно, происходит нормализация или реконструкция сосудов. Процедура нормализации включает в себя, наряду с уменьшением количества и размера незрелых кровеносных сосудов, процесс снижения сосудистого давления за счет интерстициальной жидкости из-за покрытия кровеносных сосудов перицитами. В тех случаях, когда концентрацию VEGF снижают с помощью введения средства против VEGF, такого как авастин, покрытие сосудов перицитами увеличивается за счет нормализации, тем самым снижая проникновение лекарственного средства в раковые ткани. Сообщалось, что совместное введение авастина и доцетаксела у пациентов с немелкоклеточным раком легкого фактически снижало проникновение лекарственного средств в рак. Эти результаты указывают на то, что совместное введение средства против VEGF, такого как авастин, и другого лекарственного средства имеет ограничение и вызывает резистентность к средству против VEGF.

В то же время слитый белок настоящего изобретения содержит антиангиогенное средство и слитый с ним проникающий в опухоль пептид, причем проникающий в опухоль пептид способен непосредственно связываться и воздействовать на NRP, тогда как NRP участвует в реконструкции сосудов посредством ассоциации перицитов. Таким образом, проникающий в ткань пептид в слитом белке настоящего изобретения ингибирует NRP, тем самым непосредственно подавляя развитие ангиогенеза и преодолевая резистентность, возникающую из-за изменения периваскулярного микроокружения из-за непрерывного применения антиангиогенного средства.

Кроме того, поскольку NRP1 регулирует экспрессию VE-кадгерина и E-кадгерина, участвующих в поддержании межклеточного соединения, слитый белок настоящего изобретения увеличивает межклеточный зазор посредством ингибирования NRP1, тем самым увеличивая способность к проникновению совместно введенных лекарственного средства, такого как существующий медицинский препарат на основе антител, и иммунных клеток в раковую массу, таким образом увеличивая эффективность лекарственного средства.

В соответствии с примером настоящего изобретения авторы настоящего изобретения оценивали различные физиологические активности путем изготовления слитого белка авастин-A22p, в котором проникающий в ткань пептид A22p слит с C-концом средства против VEGF, авастина, и слитого белка авастин-TPP11, в котором с ним слит TPP11. В частности, слитые белки в соответствии с настоящим изобретением продемонстрировали (i) отличную способность к связыванию с NRP1 и VEGF (пример 2), (ii) значительно увеличенную способность к нацеливанию на рак и способность к проникновению в ткань по сравнению с авастином дикого типа (пример 3), (iii) значительное уменьшение покрытия перицитами, которое, как полагают, является механизмом резистентности к средству против VEGF (пример 4), и (iv) отличную противоопухолевую активность даже в моделях опухолей на животных (пример 5).

Причиной, по которой слитый белок настоящего изобретения демонстрирует отличную физиологическую активность, как указано выше, считают то, что средство против VEGF и проникающий в опухоль пептид проявляют синергетический эффект, одновременно воздействуя на VEGF и NRP1, соответственно.

Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть составлена в подходящую форму, содержащую слитый белок отдельно или вместе с фармацевтически приемлемым носителем, и может дополнительно содержать вспомогательное вещество или разбавитель. Термин "фармацевтически приемлемая" композиция относится к нетоксичной композиции, которая является физиологически приемлемой и не вызывает аллергической реакции, такой как желудочно-кишечное нарушение или головокружение, или аналогичные реакции при введении людям.

Примеры фармацевтически приемлемых носителей могут дополнительно включать носитель для перорального введения или носитель для парентерального введения. Носитель для перорального введения может включать лактозу, крахмал, производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновую кислоту и т.п. Кроме того, носитель для перорального введения может включать различные материалы для доставки лекарственных средств, используемые для перорального введения пептидных препаратов. Кроме того, носитель для парентерального введения может включать воду, подходящее масло, солевой раствор, водную глюкозу и гликоль, и может дополнительно включать стабилизатор и консервант. Подходящие примеры стабилизатора включают антиоксидант, такой как гидросульфит натрия, сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Подходящие примеры консервантов включают хлорид бензалкония, метил- или пропилпарабен и хлорбутанол. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может дополнительно содержать в дополнение к вышеуказанным ингредиентам скользящее вещество, смачивающее средство, подслащивающее средство, ароматизирующее средство, эмульгатор, суспендирующее средство и т.п. Другие фармацевтически приемлемые носители и препараты могут быть найдены в литературе (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

Композиция настоящего изобретения может быть введена млекопитающим, включая людей, любым способом. Например, композиция настоящего изобретения может быть введена перорально или парентерально. Парентеральное введение может представлять собой, но без ограничения, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, внутрижелудочное, внутрисердечное, трансдермальное, подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, кишечное, местное, подъязычное или ректальное введение.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть составлена в виде средства для перорального введения или парентерального введения в соответствии со способом введения, как описано выше.

Для средства для перорального введения композиция настоящего изобретения может быть составлена в формах порошка, гранул, таблетки, пилюли, таблетки с сахарным покрытием, капсулы, жидкости, геля, сиропа, взвеси и суспензии с помощью способов, известных в данной области техники. Например, таблетка или таблетка с сахарным покрытием для перорального введения могут быть получены посредством смешивания активного ингредиента с твердым вспомогательным веществом, измельчения смеси, добавления к ней подходящего адъюванта и последующей переработки смеси в гранулированную смесь. Подходящие примеры вспомогательных веществ могут включать: сахара, включая лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит и мальтит; крахмалы, включая кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал и картофельный крахмал; целлюлозы, включая целлюлозу, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия и гидроксипропилметилцеллюлозу; и наполнители, такие как желатин и поливинилпирролидон. В некоторых случаях в качестве разрыхлителя можно добавлять сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновую кислоту или альгинат натрия. Кроме того, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может дополнительно содержать антикоагулянт, скользящее вещество, смачивающее средство, ароматизирующее средство, эмульгатор и консервант.

Для средства для парентерального введения композиция настоящего изобретения может быть составлена в формах инъекции, крема, лосьона, наружной мази, масла, увлажняющего крема, геля, аэрозоля и назального ингалятора с помощью способов, известных в данной области техники. Эти лекарственные формы раскрыты в литературе, представляющей собой справочник, общеизвестный во всей области фармацевтической химии (Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, East на, PA, 1995).

Общее эффективное количество композиции настоящего изобретения можно вводить пациенту в одной дозе или в нескольких дозах в течение длительного периода в соответствии с фракционированным протоколом лечения. В фармацевтической композиции настоящего изобретения содержание активного ингредиента может варьироваться в зависимости от тяжести заболевания. Общая доза фармацевтической композиции настоящего изобретения может составлять, предпочтительно, приблизительно от 0,01 мкг до 10000 мг и, более предпочтительно, от 0,1 мкг до 1000 мг по отношению к 1 кг веса тела пациента в день. Что касается дозы фармацевтической композиции настоящего изобретения, эффективную дозу для пациента определяют в соответствии с различными факторами, такими как способ составления, путь введения, число лечебных процедур, возраст пациента, вес тела, состояние здоровья и пол, тяжесть заболевания, рацион питания и уровень экскреции. Таким образом, учитывая эти факторы, специалист в данной области техники может определить подходящее эффективное количество композиции настоящего изобретения. Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением конкретно не ограничена ее лекарственной формой, путем введения и способом введения.

Настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, отличающуюся тем, что антиангиогенное средство выбирают из группы, состоящей из:

средства против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF), средства против тромбоцитарного фактора роста (анти-PDGF), средства против фактора роста плаценты (анти-PIGF), средства против фактора роста фибробластов (анти-FGF), средства против трансформирующего фактора роста (анти-TGF), средства против ангиопоэтина (анти-ANG), средства против фактора роста гепатоцитов (анти-HGF), средства против инсулиноподобного фактора роста (анти-IGF), средства против подобной активиновому рецептору киназы-1 (анти-ALK1), средства против эфрина A, средства против интерлейкина, средства против костного морфогенетического белка (анти-BMP);

антагонистических антител к рецепторам к VEGF, PDGF, PIGF, FGF, TGF, ANG, HGF, IGF, ALK1, эфрину A или интерлейкину; и

химерных молекул, основанных на этих рецепторах.

В настоящем изобретении средство против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF) может быть выбрано из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба, r84 (PLoS One. 2010 Aug 6; 5(8)), афлиберцепта, конберцепта, CT01 (WO2005056764A2), DOM15-10-11 (WO2008149147A2), DOM15-26-593 (WO2008149143A2), PRS-050 (PLoS One. 2013 Dec 13; 8(12)), CT-322 (BMC Cancer 2008, 8:352), ESBA903 (Eur J Pharm Biopharm. 2015 Mar 14. pii: S0939-6411(15)00089-2), EPI-0030(WO2011023130A1) и конъюгата антитело-лекарственное средство, в котором слиты анти-VEGF антитело и лекарственное средство. Средство против VEGF охватывает био-подобные ему и его варианты. Более предпочтительно, средство против VEGF может представлять собой ранибизумаб, бевацизумаб, афлиберцепт или конберцепт, но без ограничения ими.

Термин "био-подобный" относится к копии медицинского продукта, для которой подтверждена эквивалентность в отношении качества, эффективности и безопасности, имитирующей оригинальный биологический медицинский продукт с истекшим сроком действия патента, который уже был разработан или выведен на рынок с использованием биотехнологии, такой как технология рекомбинации генов и культивирования клеток.

При сохранении основной физиологической активности средства против фактора роста эндотелия сосудов вариант включает все аналогичные последовательности, которые содержат одно или более изменений в положениях аминокислот, которые не влияют на такую активность. То есть вариант может представлять собой функциональный вариант, который по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотным последовательностям приведенных выше средств против фактора роста эндотелия сосудов.

Как используется в настоящем документе, термин "антагонистические антитела к рецепторам" относится к антителам, которые могут подавлять по меньшей мере одну биологическую активность рецепторов к VEGF, PDGF, PIGF, FGF, TGF, ANG, HGF, IGF, ALK1, эфрину A и интерлейкину. Эти антитела могут проявлять функции ингибирования молекулярно-биологической сигнализации для ангиогенеза путем ингибирования связывания рецепторов с лигандами. Антитело может включать поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, Fv-фрагмент, Fab-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент и scFv-фрагмент, и антитело включает форму целого антитела и функциональный фрагмент молекулы антитела.

Как используется в настоящем документе, термин "связанное с ангиогенезом заболевание" относится к заболеванию, вызванному васкулогенезом, при котором капилляры простираются в форме, когда клетки эндотелия сосудов прорастают из существующего кровеносного сосуда и вторгаются в ткани. Неограниченные примеры заболеваний могут включать ревматоидный артрит, псориаз, воспаление, эндометриоз и гемангиому.

В настоящем изобретении рак может быть выбран из группы, состоящей из плоскоклеточной карциномы, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, перитонеального рака, рака кожи, кожной или интраокулярной меланомы, рака прямой кишки, перианального рака, эзофагеального рака, рака тонкой кишки, рака эндокринной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака уретры, хронической или острой лейкемии, лимфоцитарной лимфомы, гепатомы, рака желудочно-кишечного тракта, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака яичников, рака печени, рака мочевого пузыря, гепатоклеточной аденомы, рака молочной железы, рака толстой кишки, колоректального рака, рака эндометрия или матки, опухоли слюнной железы, рака почек, рака печени, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы и рака головы или шеи, но без ограничения ими.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, отличаючающуюся тем, что проникающий в опухоль пептид связывается как с нейропилином-1 (NRP1), так и с нейропилином-2 (NRP2) или специфически связывается только с нейропилином-1.

В настоящем изобретении проникающий в опухоль пептид, связывающийся как с нейропилином-1, так и с нейропилином-2, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 4, тогда как проникающий в опухоль пептид, специфически связывающийся только с нейропилином-1, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5 по SEQ ID NO: 7.

Проникающий в ткань пептид, представленный аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO:4, может связываться с обоими нейропилинами 1 и 2, и его конструируют исходя из анализа аминокислотной последовательности связывающей области лиганда VEGF₁₆₅, который связывается с доменом b1b2 нейропилина, и длины данной аминокислотной последовательности, и анализа нуклеотидных последовательностей фуриновых C-концевых последовательностей семафорина 3A и семафорина 3F, о которых известно, что они связываются с нейропилином, и, таким образом, последовательности их C-концов оказываются схожими друг с другом.

Проникающий в ткань пептид, представленный аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5 по SEQ ID NO: 7, специфически связывается только с нейропилином-1 без связывания с нейропилином-2. Авторы настоящего изобретения выделили и очистили пептиды, которые были получены путем конструирования пептидных библиотек, слитые с C-концом константной области тяжелой цепи (Fc), экспрессируя пептидные библиотеки на поверхностях дрожжевых клеток для конструирования библиотек Fc-слитых пептидов, и затем отбирая клоны, селективно связывающиеся с доменом b1 нейропилина-1. В то же время, для того чтобы выделить из библиотеки Fc-пептидов пептиды, которые специфичны к нейропилину-1 и связываются с нейропилином-1 с высокой аффинностью, пептиды получали, осуществляя селекцию с использованием белка домена b1b2 нейропилина-1 и одновременно осуществляя селекцию с использованием в качестве его конкурента белка домена b1b2 нейропилина-2.

Аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 7 имеют следующий вид:

TPP#1 (SEQ ID NO: 1)	HTPGNSNKWKHLQENKKGRNRR
TPP#2 (SEQ ID NO: 2)	HTPGNSNKWKHLQENKKGRPRR
TPP#3 (SEQ ID NO: 3)	REAPGAPRSPEPQDQKKPRNRR
TPP#4 (SEQ ID NO: 4)	REAPGAPRSPEPQDQKKPRPRR
TPP#5 (SEQ ID NO: 5)	HTPGNSNQFVLTSTRPPR
TPP#6 (SEQ ID NO: 6)	HTPGIATRTPR
TPP#7 (SEQ ID NO: 7)	HTPGNSKPTRTPRR

В настоящем изобретении слитый белок может отличаться тем, что проникающий в ткань пептид и средство против VEGF слиты с помощью линкера. Линкерный пептид может состоять из 1-100 аминокислот, предпочтительно 4-20 аминокислот, более предпочтительно 4-15 аминокислот. Кроме того, линкерный пептид может состоять из глицина (G), серина (S) или аланина (A), и последовательность линкерного пептида может, предпочтительно, представлять собой аминокислотную последовательность (GA)_n или (GGGGS)_m (причем каждый из n и m независимо представляет собой целое число от 1 до 20) и, более предпочтительно, аминокислотную последовательность GAGA или (GGGGS)₃. В варианте осуществления настоящего изобретения в качестве линкера использовали аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8 (GGGGSGGGGSGGGGS).

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения слитый белок, который представляет слияние авастина и проникающего в ткань пептида, может представлять собой слитый белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9 или 10 в качестве тяжелой цепи и аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11 в качестве легкой цепи. Кроме того, слитый белок, который представляет собой слияние варианта авастина и проникающего в ткань пептида, может представлять собой слитый белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12 в качестве тяжелой цепи и аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11 в качестве легкой цепи.

Настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для ингибирования метастазирования рака, причем данная фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, образованный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для ингибирования метастазирования рака, причем данная фармацевтическая композиция состоит из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для ингибирования метастазирования рака, причем данная фармацевтическая композиция состоит по существу из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Метастазированием рака является образование нового рака из-за распространения раковых клеток из первичного рака в другие органы. Поскольку метастазирование является одним из основных угрожающих жизни состояний у пациентов с различными раками, предупреждение или контроль метастазирования является важной целью исследования рака. При том, что хирургия, химиотерапия или лучевая терапия эффективны при ранней диагностике рака без метастазирования, эффекты от этих терапий снижаются при наличии метастазов на момент постановки диагноза. Кроме того, метастазирование часто подтверждается во время терапии или после нее, но не подтверждается во время постановки диагноза.

Метастазирование состоит из ряда стадий: инвазия, интравазация, остановка, экстравазация, колонизация и т.п. Посредством этой процедуры раковые клетки распространяются из первичного органа и, в конце концов, образуют рак в других органах. Первая стадия инвазии представляет собой стадию начала метастазирования и охватывает изменение взаимодействия между раковыми клетками или между раковыми клетками и внеклеточным матриксом, распад окружающих тканей и миграцию раковых клеток в ткани и т.п.

В примере настоящего изобретения было подтверждено, что обработка линий опухолевых клеток, проявляющих резистентность к авастину, слитым белком (авастин-A22p) в соответствии с настоящим изобретением значительно ингибирует миграцию опухолевых клеток. Причиной этого может быть то, что слитый белок в соответствии с настоящим изобретением ингибирует сигнализацию с помощью других факторов роста, а также VEGF-A, и, таким образом, также демонстрирует отличный эффект ингибирования метастазирования на опухолевых клетках, обладающих резистентностью к авастину.

В то же время известно, что связывание PDGF с рецептором PDGF в раковых клетках увеличивает фосфорилирование белка p130cas, стимулируя миграцию и инвазию раковых клеток. Однако было подтверждено, что фосфорилирование белка p130cas, которое не изменяется значительно обработкой авастином, подавляется до уровня фосфорилирования в контрольной группе обработкой с помощью авастина-A22p. То есть можно считать, что слитый белок в соответствии с настоящим изобретением ингибирует VEGF, а также ингибирует PDGF-опосредованную сигнализацию посредством связывания с NRP1, тем самым подавляя миграцию и инвазию опухолевых клеток из-за PDGF. Таким образом, можно предположить, что слитый белок настоящего изобретения проявляет эффект эффективного ингибирования метастазирования даже в отношении опухолевых клеток, обладающих резистентностью к средству против VEGF.

Поэтому в настоящем изобретении, рак может быть резистентным или невосприимчивым к антиангиогенныем средствам.

Настоящее изобретение предлагает применение слитого белка для получения средства для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, причем данный слитый белок образован слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

Настоящее изобретение предлагает способ лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, образованный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция состоит из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Кроме того настоящее изобретение предлагает способ лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция по существу состоит из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Настоящее изобретение предлагает применение слитого белка для получения средства для ингибирования метастазирования рака, причем данный слитый белок образован слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

Настоящее изобретение предлагает способ ингибирования метастазирования у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, образованный слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ ингибирования метастазирования у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция состоит из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ ингибирования метастазирования у нуждающегося в этом субъекта, причем данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, причем данная композиция по существу состоит из слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и антиангиогенного средства, в качестве активного ингредиента.

Термин "эффективное количество" относится к количеству, демонстрирующему эффект облегчения, лечения, предупреждения, обнаружения или диагностирования рака или связанного с ангиогенезом заболевания или эффект ингибирования или уменьшения метастазирования рака. Термин "субъект" относится к животному, предпочтительно млекопитающему, и, в частности, животному, включая человека, и может представлять собой клетку, ткань и орган или т.п., происходящий от животного. Субъектом может быть пациент, нуждающийся в таких эффектах.

Как используется в настоящем документе, термин "лечение" в широком смысле относится к облегчению рака или связанных с ангиогенезом заболеваний или симптомов рака или связанного с ангиогенезом заболевания, и может включать в себя излечивание, по существу предупреждение или облегчение состояния этих заболеваний, и может включать в себя облегчение, излечение или предупреждение одного или большинства симптомов, вызванных раком или связанным с ангиогенезом заболеванием, но без ограничения ими.

Как используется в настоящем документе, термин "содержащий" используется синонимично с "содержащий" или "характеризующийся", и не исключает дополнительных ингредиентов или этапов, которые не упомянуты в композициях и способах. Термин "состоящий из" исключает дополнительные элементы, этапы или ингредиенты, которые не указаны иным образом. Термин "состоящий по существу из" означает в отношении композиций или способов, что они включают в себя описанные материалы или этапы, а также любой материал или этап, который по существу не влияет на их основные характеристики.

Благоприятные эффекты

Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента слитый белок, образованный слиянием проникающего в ткань пептида и антиангиогенного средства, для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания может улучшать проникновение антиангиогенного средства в опухоль, может проявлять эффект нацеливания на рак, тем самым демонстрируя отличные лечебные эффекты даже в малой дозе, таким образом уменьшая побочные эффекты антиангиогенного средства, и может демонстрировать отличные лечебные эффекты даже в отношении рака или связанного с ангиогенезом заболевания, обладающего резистентностью к антиангиогенному средству, благодаря связыванию с ангиогенным фактором роста и NRP1 в одно и то же время.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой схему слитого белка (авастин-A22p), образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и средства против фактора роста эндотелия сосудов.

Фиг. 2 показывает результаты подтверждения слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и средства против фактора роста эндотелия сосудов, с помощью ДСН-ПААГ (дорожка 1: авастин, дорожка 2: авастин-A22p, дорожка 3: авастин-TPP11).

Фиг. 3 показывает результаты подтверждения слитого белка (авастин-A22p), образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и средства против фактора роста эндотелия сосудов, с помощью ЭВЭЖХ. (A: авастин, B: авастин-A22p).

Фиг. 4 показывает результаты оценки силы связывания авастин-A22p с NRP1 или VEGF (A: сила связывания с NRP1, B: сила связывания с VEGF).

Фиг. 5 показывает результаты наблюдения распределения белков в раковых тканях с помощью флуоресцентной микроскопии по истечении 3, 8 и 16 ч после введения авастина и авастина-A22p в ксенотрансплантатных моделях SW620 на животных (Veh: группа, которой вводили физиологический раствор).

Фиг. 6 показывает результаты оценки изменения покрытия перицитами в раковых клетках при обработке авастином-A22p (PECAM1: окрашивание кровеносных сосудов, NG2: окрашивание перицитов).

Фиг. 7 показывает результаты оценки противораковой эффективности авастина-A22p в ксенотрансплантатных моделях SW620 на животных.

Фиг. 8 показывает результаты подтверждения эффекта ингибирования миграции при обработке клеток HCT116/bev, демонстрирующих резистентность к авастину, для индуцирования миграции с помощью VEGF и последующей обработке авастином или авастином-A22p 1 мкМ (A: микроскопические изображения, B: результаты микроскопических наблюдений после количественной оценки построения в виде графика).

Фиг. 9 показывает результаты подтверждения фосфорилирования белка p130cas при обработке клеток U87MG 25 мкг/мл авастина или авастина-A22p и обработке через 30 мин 50 нг/мл PDGF, для того чтобы исследовать, ингибирует ли авастин-A22p PDGE-опосредованную сигнализацию (A: результаты вестерн-блоттинга, B: график для количественной оценки результатов вестерн-блоттинга, A22p+P: авастин-A22p 25 мкг/мл+PDGF 50 нг/мл, P: PDGF 50 нг/мл, C: контроль, A+P: авастин 25 мкг/мл+PDGF 50 нг/мл).

Фиг. 10 показывает результаты подтверждения слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и средства против фактора роста эндотелия сосудов, с помощью ДСН-ПААГ (дорожка 1: авастин(V)-A22p, дорожка 2: авастин-A22p).

Фиг. 11 показывает результаты подтверждения слитого белка, образованного слиянием проникающего в опухоль пептида и средства против фактора роста эндотелия сосудов, с помощью ЭВЭЖХ (A: авастин(V)-A22p, B: авастин-A22p).

Фиг. 12 показывает результаты оценки силы связывания авастина(V)-A22p с NRP1 или VEGF по сравнению с авастином-A22p (A: сила связывания с NRP1, B: сила связывания с VEGF).

Способ осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано подробно.

Нижеследующие примеры служат только для иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1: Получение слитого белка авастин-проникающий в ткань пептид (TPP)

Для повышения эффективности и преодоления резистентности в отношении средства против VEGF, авастина, авторы настоящего изобретения попытались слить проникающий в ткань пептид (TPP), который способен связываться как с нейропилином-1 (NRP1), так и с нейропилином-2 или способен специфически связываться только с нейропилином-1, с C-концом авастина. Аминокислотные последовательности TPP показаны в таблице 1 ниже. Из списка последовательностей в таблице 1 TPP с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 4 могут связываться с обоими нейропилинами 1 и 2, тогда как TPP с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 5 по SEQ ID NO: 7 могут специфически связываться только с нейропилином-1. Схема слитого белка, в котором TPP слит с авастином, показана на фиг. 1.

Авастин, как используется, в настоящем документе, представляет собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 тяжелой цепи и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 легкой цепи и используемый для настоящего эксперимента после покупки на www.Drugbank.com.

В то же время среди TPP, приведенных в таблице 1, A22p в качестве TPP, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, получали модификацией C-концевых областей VEGF₁₆₅ как собственного лиганда нейропилина и лигандов семафоринов класса 3; а TPP11 получали путем выделения и идентификации пептида, получаемого из клонов, селективно связывающихся с доменом b1 нейропилина-1 при использовании в качестве конкурентов как белка домена b1b2 нейропилина-1, так и белка домена b1b2 нейропилина-2. В данном случае авастин был слит с ними как линкер для двухвалентного воздействия на нейропилиновый рецептор, так что эти пептиды были сконструированы так, чтобы они обладали способностью проникать в ткань, имея при этом схожую аффинность к лигандам VEGF и Sema3A.

[Таблица 1]

TPP последовательность информация

TPP#1 (SEQ ID NO: 1)	HTPGNSNKWKHLQENKKGRNRR
TPP#2 (SEQ ID NO: 2)	HTPGNSNKWKHLQENKKGRPRR
TPP#3 (SEQ ID NO: 3)	REAPGAPRSPEPQDQKKPRNRR
TPP#4 (SEQ ID NO: 4)	REAPGAPRSPEPQDQKKPRPRR
TPP#5 (SEQ ID NO: 5)	HTPGNSNQFVLTSTRPPR
TPP#6 (SEQ ID NO: 6)	HTPGIATRTPR
TPP#7 (SEQ ID NO: 7)	HTPGNSKPTRTPRR

В частности, слитые белки, в которых TPP (A22p) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 и TPP (TPP11) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 были слиты с C-концом авастина, соответственно, и клеточные линии, продуцирующие данные слитые белки, были получены, как описано ниже.

<1-1> Конструирование вектора экспрессии и трансфекция клеток

Селективные маркерные гены DHFR вставляли в векторы pcDNA3.1(-), и тяжелые и легкие цепи авастина-A22p и авастина-TPP11 клонировали с помощью ферментов рестрикции NotI и BamHI, соответственно. Плазмиду, кодирующую белок, образованный слиянием каждой из сконструированных тяжелых константных областей антител и пептида, связывающегося с NRP1, и плазмиду, кодирующую белок легкой цепи, экспрессировали для получения белка в клетках CHO DG44 (получены от Prof. Chasin) с использованием электропореза Neon™. В колбе T25 3×10⁶ клеток, трансфицированных каждой плазмидой, инокулировали и инкубировали при 37°C. Стабильные клетки фиксировали с помощью селективного маркера и затем культивировали в плавающем состоянии в свободной от сыворотки SFM4CHO (Hyclone) в течение 7 дней в условиях 100 об/мин, 37°C, pH 7,2, 50% DO₂ в биореакторе. Супернатант отделяли от клеток центрифугированием и стерилизовали с помощью фильтра 0,22 мкм.

<1-2> Очистка слитого белка

Собирали культуры авастина, авастина-A22p и авастина-TPP11, и очищали их соответствующие белки в соответствии со стандартным протоколом. Для колонки очистки смолу с белком A (смола MabselectSure, GE healthcare) набивали до 20 мл в колонку XK16/20 (смола MabselectSure, GE healthcare), к которой прикладывали линейную скорость 200 см/ч. На колонку с белком A наносили 1 л антитела, и промывали колонку 15-кратным объемом колонки ФСБ (pH 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4). Антитело элюировали 100 мл 0,1 M глицинового буфера при pH 3,0. Белки собирали между 10 mAU и 10 mAU поглощения УФ при 280 нм, и 60 мл белков нейтрализовали до pH 7,0 с использованием 0,7 мл 1 M Трис-буфера. Фракции антител фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм (Milipore) и затем концентрировали с использованием концентратора Amicon (30 MWCO) (Milipore) при 3500 об/мин в течение 10 мин с последующим обменом с буфером ФСБ (pH 7,4). Очищенный слитый белок, образованный слиянием очищенной константной области тяжелой цепи антитела и выбранного пептида, специфически связывающегося с NRP1, количественно анализировали с использованием коэффициента поглощения и абсорбции на скорректированной длине волны 280 нм. Очищенный слитый белок, образованный слиянием очищенной константной области тяжелой цепи антитела и выбранного пептида, специфически связывающегося с NRP1, анализировали на 10% ДСН-ПААГ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.

Белки соответствующим образом очищали от культур, собранных из клеточных линий, экспрессирующих авастин, авастин-A22p и авастин-TPP11, и разделяли с помощью ДСН-ПААГ. Фиг. 2 подтверждает, что авастин-A22p и авастин-TPP11 успешно образовывали антитела, пептиды были слиты с авастином в восстанавливающих условиях, и авастин-A22p и авастин-TPP11 были больше авастина в восстанавливающих условиях. Кроме того, было подтверждено, что слияние с TPP не влияло значительно на экспрессию антител, поскольку экспрессия авастина-A22p и авастина-TPP11 была на том же уровне.

Для исследования чистоты очищенного белка авастина-A22p осуществляли анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Использовали Agilent 1200 (Agilent) и эксклюзионную колонку (Biosuite 250, Waters).

В частности, в качестве мобильной фазы использовали буферный раствор (pH 6,2), содержащий фосфат калия 0,2 M и хлорид калия 0,25 M, и ему позволяли стекать со скоростью потока 0,35 мл/мин в течение 20 мин. Размер белка проверяли по времени удерживания, а его чистоту проверяли по площади и высоте.

Как показано на фиг. 3, чистоту очищенного авастина-A22p анализировали с использованием ЭВЭЖХ. Было подтверждено, что чистота авастина-A22p составляла 97% или больше, и была больше, чем у авастина.

Далее авторы настоящего изобретения получали слитый белок авастин-A22p, в котором A22p в качестве TPP с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 2, был слит с авастином, и оценивали его активность.

Пример 2: Способность слитого белка авастин-проникающий в ткань пептид (TPP) к связыванию с NRP1 и VEGF

Для того чтобы оценить, может ли N-конец слитого белка авастин-A22p, полученного в примере 1, связываться с VEGF таким же образом, как авастин, при том, что его C-конец может связываться с NRP1, осуществляя таким образом двойную блокировку ассоциированной сигнализации, оценивали связывание авастина-A22p с NRP1 и VEGF, соответственно.

Способность к связыванию очищенного авастина-A22p с доменом b1b2 нейропилина 1 исследовали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELIA). Использовали герцептин-A22p (HCT-A22p) в качестве положительного контроля и авастин (Roche co., Швейцария) в качестве отрицательного контроля. Целевую молекулу домен b1b2 нейропилина 1 (273-586) вводили в реакцию по 1 мкг на лунку в 96-луночном планшете Maxibinding Immuno (SPL Life sciences., Корея) в течение 2 ч при 37°C, и затем три раза промывали 0,1% ФСБ-Т (0,1% Tween20, pH 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4) по 1 мин. После реакции в течение 1 ч с 0,1% ФСБ-Т, содержащим 5% обезжиренного молока, продукт реакции три раза промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. Использовали герцептин-A22p в качестве положительного контроля и авастин (Roche co., Швейцария) в качестве отрицательного контроля. Авастин-A22p в качестве экспериментальных групп разбавляли 0,1% ФСБ-Т до 50 нМ, 25 нМ, 12,5 нМ и 6,25 нМ, и затем растворы обрабатывали при 37°C в течение 1 ч для каждой из различных концентраций и три раза промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. HRP-конъюгированное антитело к легкой цепи каппа (конъюгированное с пероксидазой хрена mAb к легкой цепи каппа человека, SIGMA-ALDRICH Co., США) разбавляли в 100000 раз 0,1% ФСБ-Т, содержащим 5% обезжиренного молока, с последующей обработкой при 37°C в течение 30 мин. После этого продукт реакции пять раз промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. Для проявления цвета полученный продукт обрабатывали колориметрическим субстратом TMB HRP (Surmodics co., США), за чем следовали реакция при комнатной температуре в течение 10 мин, обработка таким же объемом 1 н HCl (останавливающий буфер) и затем измерение поглощения на 450 нм. Способность к связыванию экспрессированного и очищенного авастина-A22p с доменом b1b2 нейропилина 1 была подтверждена полученными результатами ELISA.

Способность к связыванию очищенного авастина-A22p с рекомбинантным человеческим VEGF 165 (R&D systems co., Китай) исследовали с помощью ELISA. Использовали авастин в качестве положительного контроля и HCT-A22p в качестве отрицательного контроля. Целевую молекулу рекомбинантного человеческого VEGF 165 вводили в реакцию по 0,2 мкг на лунку в 96-луночном планшете Maxibinding Immuno в течение 2 ч при 37°C, и затем три раза промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. После реакции в течение 1 ч с 1% ФСБ-Т, содержащим 5% обезжиренного молока, продукт реакции три раза промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. Использовали авастин в качестве положительного контроля и герцептин-A22p в качестве отрицательного контроля. Авастин-A22p в качестве экспериментальных групп разбавляли 0,1% ФСБ-Т до 1,5 нМ, 0,75 нМ, 0,35 нМ и 0,17 нМ, и затем растворы обрабатывали при 37°C в течение 1 ч для каждой из различных концентраций и три раза промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. HRP-конъюгированное антитело к легкой цепи каппа разбавляли в 100000 раз 0,1% ФСБ-Т, содержащим 5% обезжиренного молока, с последующей обработкой при 37°C в течение 30 мин. После этого продукт реакции пять раз промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. Для проявления цвета полученный продукт обрабатывали колориметрическим субстратом TMB HRP, за чем следовали реакция при комнатной температуре в течение 10 мин, обработка таким же объемом 1 н HCl, и затем измерение поглощения на 450 нм. Способность к связыванию экспрессированного и очищенного авастина-A22p с рекомбинантным человеческим VEGF 165 была подтверждена полученными результатами ELISA.

Соответствующие результаты показаны на фиг. 4.

Как показано на фиг. 4, было подтверждено, что авастин-A22p связывается с NRP1 на том же уровне, что и HCT-A22p, использованный в качестве контроля, а также связывается с VEGF на том же уровне, что и авастин.

Пример 3: Эксперимент по нацеливанию авастина-A22p на рак

Известно, что авастин не является рак-специфичным направленным лекарственным средством, в отличие от других медицинских препаратов на основе антител, и поэтому авастин для проявления эффективности необходимо вводить в высокой дозе, и он может распределяться не только в раковых тканях, но также в других тканях с высоким уровнем VEGF, что приводит к неблагоприятным побочным эффектам. Поэтому ожидается, что использование специфического для рака распределения NRP1 увеличит эффект нацеливания на рак для уменьшения дозы, что увеличит удобство для пациента и снизит зависящие от дозы побочные эффекты. Авторы настоящего изобретения предприняли попытку оценить, может ли авастин-A22p быть эффективно нацелен на рак.

Для того чтобы исследовать, распределен ли авастин-A22p в раковых клетках лучше, чем авастин, благодаря нацеливанию на NRP1, присутствующий в новых кровеносных сосудах внутри раковых тканей и раковой массы, ФСБ, авастин-A22p, или авастин вводили внутривенно по 5 мг/кг, соответственно, когда объем опухоли после трансплантации SW620 (получены из ATCC) голым мышам достигал примерно 250 мм³, опухоли собирали по истечении 3, 8 и 16 ч, и распределение белков в раковой ткани исследовали с помощью иммуногистохимии с использованием флуоресцентных микроскопов.

Более конкретно, собранную опухоль секционировали до толщины 8 мкм методом парафиновых срезов, и периваскулярные клетки окрашивали с помощью антитела NG2 как первичного антитела (Cell Signaling technology, США) и вторичного антитела, конъюгированного с Alexa (красная флуоресценция, Life Technologies), распознающего антитело NG2. Для того чтобы наблюдать авастин и авастин-A22p, распределенные в ткани, использовали антитело, конъюгированного с Alexa®488 (зеленая флуоресценция, Life Technologies), распознающее IgG.

Соответствующие результаты показаны на фиг. 5.

Как показано на фиг. 5, было подтверждено, что авастин-A22p имел более высокую концентрацию в раковой ткани, чем авастин, через 3 ч после введения; с течением времени возрастало также количество авастина-A22p, распределенное в клетках, удаленных от кровеносных сосудов; и авастин-A22p также эффективно уменьшал ангиогенез внутри раковой массы.

По результатам данного флуоресцентного микроскопического наблюдения можно ожидать, что авастин-A22p будет иметь отличную способность к нацеливанию на рак и способность к проникновению в ткань по сравнению с авастином, причем авастин-A22p, в отличие от авастина, может более эффективно ингибировать ангиогенез посредством ингибирования различных ангиогенных факторов, таких как VEGF-B, VEGF-C, P1GF, а также VEGF-A. В соответствии с этими результатами даже низкая доза авастина-A22p может воздействовать на опухоль, что ведет к снижению побочных эффектов. Кроме того, можно ожидать, что авастин-A22p будет достигать не только раковых клеток поблизости от кровеносных сосудов, но также раковых тканей внутри раковой массы благодаря его высокой способности к проникновению и, следовательно, будет ингибировать активность различных ангиогенных факторов, включая VEGF-A, секретируемых в этих клетках, тем самым ингибируя деление клеток и, следовательно, усиливая противораковую активность.

Таким образом, такие результаты подтверждают, что авастин-A22p можно применять для лечения невосприимчивых к авастину случаев, возникающих из-за относительно более слабой зависимости от VEGF-A, чем от других ангиогенных факторов.

Пример 4: Влияние авастина-A22p7 на покрытие перицитами

При ангиогенезе рост сосудов происходит через деление и рост клеток при высокой концентрации VEGF, а затем, когда концентрация VEGF снижается, возрастает концентрация PDGF, и, следовательно, происходит нормализация или реконструкция сосудов. Нормализация включает в себя, наряду с уменьшением количества и размера незрелых кровеносных сосудов, процесс снижения сосудистого давления за счет интерстициальной жидкости из-за покрытия кровеносных сосудов перицитами. Когда концентрацию VEGF снижают с помощью введения авастина, кровеносные сосуды повышают покрытие перицитами за счет нормализации, снижая проникновение лекарственного средства в раковую ткань. Сообщалось, что совместное введение авастина и доцетаксела у пациентов с немелкоклеточным раком легкого снижало проникновение лекарственных средств в рак (Arjaans et al., 2013). Это указывает на то, что совместное введение авастина и другого лекарственного средства имеет ограничение и может вызывать резистентность к авастину.

В соответствии с сообщением Fan et al. Постоянная обработка клеточных линий первичного или метастатического колоректального рака авастином в течение трех месяцев приводила к адаптации клеточных линий к авастину у обеих клеточных линий, и эти клеточные линии демонстрировали такой же рост клеток, как и существующие клеточные линии, но имели возросшую миграцию клеток и, таким образом, демонстрировали более быстрое метастазирование, чем существующие раковые клетки в ксенотрансплантате. Экспрессия VEGFR1 и NRP1 была особенно высокой в таких адаптированных к авастину клеточных линиях, который затем трансформировались в клетки, которые секретировали различные ангиогенные факторы, такие как VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C и P1GF, в больших количествах, демонстрируя резистентность к авастину (Fan et al., 2011). Поэтому возникло предположение, что обработка авастином-A22p или авастином-TPP11, способными связываться с NRP1, ингибируя сигнализацию различных ангиогенных факторов помимо VEGF-A, будет эффективно ингибировать рост и метастазирование клеточных линий, демонстрирующих резистентность к авастину.

Кроме того, исходя из сообщения о том, что когда анти-NRP1 антитело и ингибитор VEGF вводят совместно, уменьшение анти-NRP1 антителом покрытия перицитами кровеносных сосудов может быть непосредственно связано с увеличением противораковой эффективности посредством контроля нормализации сосудов и может принимать участие в преодолении резистентности, авторы настоящего изобретения провели флуоресцентный микроскопический сравнительный тест изменения покрытия перицитами в раковых тканях в ксенотрансплантатной модели при введении авастина и авастина-A22p, соответственно.

Для того чтобы исследовать ангиогенез и способность авастина-A22p к ингибированию стабилизации сосудов в моделях на мышах, SW620 трансплантировали голым мышам, которым затем вводили авастин-A22p и авастин, соответственно, и наблюдали за покрытием перицитами в раковой ткани с помощью флуоресцентной микроскопии. Когда после инъекции клеток SW620 голым мышам Balb/c объем опухоли достигал примерно 250 мм³, ФСБ, авастин и авастин-A22p вводили внутривенно по 5 мг/кг каждой мыши, соответственно. Через 16 ч опухоли у мышей собирали, за чем следовала иммуногистохимия. Собранную опухоль секционировали до толщины 8 мкм методом парафиновых срезов. Затем сосудистые клетки окрашивали с помощью PECAMl (Sigma) как первичного антитела и вторичного антитела, конъюгированного с Alexa®488, распознающего PECAMl, тогда как периваскулярные клетки окрашивали с помощью антитела NG2 как первичного антитела и вторичного антитела, конъюгированного с Alexa®594, распознающего антитело NG2.

Соответствующие результаты показаны на фиг. 6.

Как показано на фиг. 6, было подтверждено, что покрытие перицитами по отношению к кровеносным сосудам было заметно снижено в группе введения авастина-A22p, а не в группе введения авастина и, следовательно, можно ожидать, что увеличение противоракового эффекта у авастина-A22p влияет на покрытие перицитами. Эти результаты идентичны результатам тестов на животных, которым совместно вводили анти-NRP1 антитело, разработанное Genetech Inc., и авастин. Было подтверждено, что эффект ингибирования авастином-A22p VEGF и NRP1 был аналогичен ингибированию соответствующими независимыми антителами. То есть можно подтвердить, что авастин-A22p представляет собой белок концепции антитела с двойной специфичностью, которое одновременно ингибирует VEGF и NRP1.

Эти результаты позволяют предположить, что посредством уменьшения покрытия перицитами из-за A22p, авастин-A22p может увеличивать эффект ингибирования ангиогенеза и преодолевать резистентность, возникающую из-за постоянного введения авастина.

Пример 5: Оценка противораковой эффективности авастина-A22p in vivo

Для того чтобы исследовать противораковую эффективность авастина-A22p, был проведен сравнительный тест с авастином на ксенотрансплантатных моделях клеточной линии SW620 рака толстой кишки. Линия клеток SW620 является линией опухолевых клеток с 45% RGI к VEGF, и данный эксперимент на животных проводили с целью оценки противораковой эффективности в отношении обычных опухолей. С помощью предварительного эксперимента было подтверждено, что авастин-A22p демонстрирует эффективность, равную или более высокую, чем авастин (результаты не показаны), и в этом эксперименте голым мышам Balb/c с ксенотрансплантатом клеток SW620 вводили внутривенно авастин 5 мг/кг и авастин-A22p 0,5, 1,25, 2,5 мг/кг два раза в неделю в течение пяти недель, соответственно.

Соответствующие результаты показаны на фиг. 7.

Как показано на фиг. 7, было подтверждено, что группа введения 5 мг/кг авастина и группа введения 1,25 мг/кг авастина-A22p демонстрируют схожий эффект ингибирования в отношении роста рака. То есть можно видеть, что слитый белок авастин-A22p может проявлять эквивалентную противораковую эффективность даже в дозе, составляющей четверть от дозы авастина.

Полагают, что то, что слитый белок авастин-A22p может проявлять эквивалентную противораковую эффективность даже в дозе, составляющей четверть от дозы авастина, обусловлено блокировкой A22p сигнализации NRP1, что позволяет предположить, что неблагоприятные побочные эффекты могут быть также уменьшены благодаря снижению дозы в клинических применениях.

Пример 6: Тест на подтверждение ингибирования авастином-A22p миграции резистентной клеточной линии

Одной из причин резистентности и чувствительности к авастину является то, что VEGF-A, как мишень авастина, и другие факторы роста, такие как FGF, система лигандов/рецепторов Notch, PIGF и PDGF-BB, задействованы в механизмах сигнализации. Известно, что NRP1 влияет на сигнализацию, выступая в качестве корецептора вместе с VEGFR1, VEGFR3, C-met и PDGFR, а также на связывание VEGFR2 с VEGF-A. Авторы настоящего изобретения исследовали, ингибирует ли A22p, слитый с авастином, связывание с NRP1, конкурируя с другими ангиогенными факторами, которые связываются с NRP1.

Линии клеток HCT116/bev (предоставленные L M Ellis, MD anderson), которые получили резистентность к авастину из-за постоянной обработки клеток HCT116 (получены из ATCC) авастином, обрабатывали авастином и авастином-A22p, для того чтобы исследовать ингибирование ими способности к миграции, соответственно. По сравнению со своими родительскими клетками HCT116 HCT116/bev имеют более высокие уровни экспрессии VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C и P1GF с лучшей способностью к клеточной миграции и метастазированию (Fan et al., 2011). Таким образом, если авастин-A22p ингибирует миграцию клеток HCT116/bev, может быть подтверждена возможность того, что авастин-A22p преодолевает резистентность к авастину и увеличивает его эффективность. Конкретный метод тестирования был следующим.

Клетки HCT116 и HCT116/bev высевали по 4×10⁵ клеток на лунку в 6-луночном планшете и инкубировали в течение 2 дней. После этого в каждой лунке делали крестообразное свободное место. Среду удаляли, добавляли 50 нг/мл VEGF и дозировали в среду MEM-альфа, дополненную 1% FBS. Авастин и авастин-A22p обрабатывали так, чтобы получить 1 мкМ. Свободное место фотографировали немедленно после обработки лекарственным средством (0 ч), и то же самое место фотографировали с интервалами по 2 ч через 48 ч. Способность авастина-A22p и авастина к ингибированию миграции клеток сравнивали путем вычисления ширины пустого свободного места по результатам фотографирования с помощью программы Image J и количественного определения из нее степени миграции клеток путем инверсии.

Результаты показаны на фиг. 8.

Как показано на фиг. 8, VEGF увеличивал миграцию клеток HCT116 с 51,7% до 67,4%, тогда как обработка авастином и авастином-A22p снижала ее до одинакового уровня 61,2% и 61,7% для обработки авастином и авастином-A22p, соответственно. Напротив, что касается клеток HCT116/bev, миграция клеток HCT116/bev составляла 65,3% даже в группе без обработки VEGF, что указывает на то, что клетки HCT116/bev были более агрессивными, чем клетки HCT116, причем обработка VEGF повышала миграцию клеток HCT116/bev до 72,9%. Наблюдали, что при обработке авастином такая миграция составляла 74,1%, что указывает на отсутствие разницы в миграции, тогда как при обработке авастином-A22p такая миграция составляла 66,2%, что указывает на то, что миграция была подавлена до того же уровня, что и в группе без обработки VEGF.

Тот результат, что адаптированные к авастину клеточные линии HCT116/bev продемонстрировали повышенную миграцию по сравнению со своими родительскими клетками HCT116 независимо от добавления VEGF-A, указывает на то, что миграция HCT116/bev возрастала в зависимости не только от VEGF-A, но также и от других факторов роста. Обработка авастином не подавляла миграцию, тогда как обработка авастином-A22p снижала миграцию до того же уровня, что и при обработке без VEGF-A. Это означает, что авастин-A22p ингибирует сигнализацию посредством других факторов роста, а также VEGF-A, что указывает на то, что авастин-A22p может вносить вклад в преодоление резистентности к авастину. Кроме того, это результат свидетельствует о том, что авастин-A22p может способствовать противораковым эффектам и уменьшать вероятность возникновения резистентности путем ингибирования не только сигнализации VEGF-A, но также других процедур сигнализации.

Пример 7: Оценка ингибирования авастином-A22p сигнализации PDGF

NRP1 действует как корецептор для рецептора PDGF, усиливая сигнализацию PDGF. Известно, что связывание PDGF со своим рецептором в раковых клетках увеличивает фосфорилирование белка p130cas и стимулирует миграцию и инвазию раковых клеток. Авторы настоящего изобретения исследовали, ингибирует ли A22p, слитый с авастином, сигнализацию PDGF путем связывания с NRP1.

Клетки U87MG (получены из ATCC) обрабатывали 25 мкг/мл авастина или авастина-A22p и через 30 мин обрабатывали 50 нг/мл PDGF. Через 5 мин белки экстрагировали, а затем проводили сравнение фосфорилирования p130cas с использованием анти-фосфо-pl30 антитела и анти-pl30cas антитела.

Результаты показаны на фиг. 9.

Как показано на фиг. 9, было подтверждено, что фосфорилирование p130cas возрастало из-за PDGF, и обработка авастином не приводила к отличиям, но фосфорилирование в группе обработки авастином-A22p было подавлено до уровня носителя.

Этот результат означает, что авастин-A22p удаляет VEGF-A, а также подавляет сигнализацию PDGF путем связывания с NRP1, и что авастин-A22p может усиливать противораковые эффекты путем подавления миграции и инвазии из-за PDGF.

Пример 8: Получение слитого белка вариант авастина-проникающий в ткань пептид (TPP)

Для того чтобы исследовать слитый белок, в котором проникающий в ткань пептид (TPP) слит с вариантом, содержащим часто модифицируемую последовательность других медицинских препаратов на основе антител при сохранении его характеристик, была предпринята попытка слияния проникающего в ткань пептида (TPP), способного связываться как с нейропилином-1 (NRP1), так и с нейропилином-2, с C-концом пептида варианта авастина (далее называемого "авастин(V)") с модификациями аминокислот 362 и 364 в аминокислотной последовательности авастина.

В частности, были получены слитый белок, в котором TPP (A22p) с аминокислотной последовательностью SEQ ID: 2 был слит с C-концом авастина (V), и клеточная линия, продуцирующая этот слитый белок, соответственно. Селективные маркерные гены DHFR вставляли в векторы pcDNA3.1(-), и тяжелые и легкие цепи авастина(V)-A22p клонировали с помощью ферментов рестрикции NotI и BamHI. Плазмиду, кодирующую белок, образованный слиянием каждой из сконструированных тяжелых константных областей антител и пептида, связывающегося с NRP1, и плазмиду, кодирующую белок легкой цепи, экспрессировали для получения белка в клетках CHO DG44 с использованием электропореза Neon™. В колбе T25 3×10⁶ клеток, трансфицированных плазмидой, инокулировали и инкубировали при 37°C. Стабильные клетки фиксировали с помощью селективного маркера и затем культивировали в плавающем состоянии в свободной от сыворотки SFM4CHO (Hyclone) в течение 7 дней в условиях 100 об/мин, 37°C, pH 7,2, 50% DO₂ в биореакторе. Супернатант отделяли от клеток центрифугированием и стерилизовали на фильтре 0,22 мкм.

Собирали культуру авастина(V)-A22p, и очищали белки соответствующим образом в соответствии со стандартным протоколом. Для колонки очистки смолу с белком A (смола MabselectSure, GE healthcare) набивали до 20 мл в колонку XK16/20 (смола MabselectSure, GE healthcare), к которой прикладывали линейную скорость 200 см/ч. На колонку с белком A наносили 1 л антитела, и промывали колонку 15-кратным объемом колонки ФСБ (pH 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4). Антитело элюировали 100 мл 0,1 M глицинового буфера при pH 3,0. Белки собирали между 10 mAU и 10 mAU поглощения УФ при 280 нм, и 60 мл белков нейтрализовали до pH 7,0 с использованием 0,7 мл 1 M Трис-буфера. Фракции антител фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм (Milipore) и затем концентрировали с использованием концентратора Amicon (30 MWCO) (Milipore) при 3500 об/мин в течение 10 мин с последующим обменом с буфером ФСБ (pH 7,4), содержащим 10% глицерина. Очищенный слитый белок, образованный слиянием очищенной константной области тяжелой цепи антитела и выбранного пептида, специфически связывающегося с NRP1, анализировали на ДСН-ПААГ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.

Соответствующие белки очищали от культур, собранных из клеточных линий, экспрессирующих авастин(V)-A22p и авастин-A22p, и выделяли с помощью ДСН-ПААГ. Фиг. 10 подтверждает, что авастин(V)-A22p успешно образовывал антитело и имел молекулярный вес, аналогичный авастину-A22p.

Для исследования чистоты очищенного белка авастина(V)-A22p осуществляли анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Использовали Agilent 1200 (Agilent) и эксклюзионную колонку (Biosuite 250, Waters).

В частности, в качестве мобильной фазы использовали буферный раствор (pH 6,2), содержащий фосфат калия 0,2 M и хлорид калия 0,25 M, и ему позволяли стекать со скоростью потока 0,35 мл/мин в течение 20 мин. Размер белка проверяли по времени удерживания, а его чистоту проверяли по площади и высоте.

На фиг. 11 чистоту авастина(V)-A22p анализировали с использованием ЭВЭЖХ. Было подтверждено, что чистота авастина(V)-A22p составляла 97% или больше (фиг. 11A), что совпадает с чистотой авастина-A22p (фиг. 11B).

Далее авторы настоящего изобретения получали слитый белок авастин(V)-A22p, в котором A22p в качестве TPP с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 2, был слит с авастином (V), и оценивали его активность.

Пример 9: Способность слитого белка авастин(V)-проникающий в ткань пептид (TPP) к связыванию с NRP1 и VEGF

Для того чтобы оценить, может ли N-конец слитого белка авастин(V)-A22p, полученного в примере 8, связываться с VEGF таким же образом, как авастин, при том, что его C-конец может связываться с NRP1, осуществляя таким образом двойную блокировку ассоциированной сигнализации, оценивали связывание авастина(V)-A22p с NRP1 и VEGF, соответственно.

Способность к связыванию очищенного авастина(V)-A22p с доменом b1b2 нейропилина 1 исследовали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELIA). В качестве положительного контроля использовали авастин-A22p. Целевую молекулу домен b1b2 нейропилина 1 (273-586) вводили в реакцию по 1 мкг на лунку в 96-луночном планшете Maxibinding Immuno (SPL Life sciences., Корея) в течение 2 ч при 37°C, и затем три раза промывали 0,1% ФСБ-Т (0,1% Tween20, pH 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4) по 1 мин. После реакции в течение 1 ч с 0,1% ФСБ-Т, содержащим 5% обезжиренного молока, продукт реакции три раза промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. Авастин(V)-A22p в качестве экспериментальных групп разбавляли 0,1% ФСБ-Т до 50 нМ, 25 нМ и 12,5 нМ, и затем растворы обрабатывали при 37°C в течение 1 ч для каждой из различных концентраций и три раза промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. HRP-конъюгированное антитело к легкой цепи каппа (конъюгированное с пероксидазой хрена mAb к легкой цепи каппа человека, SIGMA-ALDRICH Co., США) разбавляли в 100000 раз 0,1% ФСБ-Т, содержащим 5% обезжиренного молока, с последующей обработкой при 37°C в течение 30 мин. После этого продукт реакции пять раз промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. Для проявления цвета полученный продукт обрабатывали колориметрическим субстратом TMB HRP (Surmodics co., США), за чем следовали реакция при комнатной температуре в течение 10 мин, обработка таким же объемом 1 н HCl (останавливающий буфер) и затем измерение поглощения на 450 нм. Способность к связыванию экспрессированного и очищенного авастина(V)-A22p с доменом b1b2 нейропилина 1 была подтверждена полученными результатами ELISA.

Способность к связыванию очищенного авастина(V)-A22p с рекомбинантным человеческим VEGF 165 (R&D systems co., Китай) исследовали с помощью ELISA. В качестве положительного контроля использовали авастин-A22p. Целевую молекулу рекомбинантного человеческого VEGF 165 вводили в реакцию по 0,2 мкг на лунку в 96-луночном планшете Maxibinding Immuno в течение 2 ч при 37°C, и затем три раза промывали 0,1 ФСБ-Т по 1 мин. После реакции в течение 1 ч с 0,1% ФСБ-Т, содержащим 5% обезжиренного молока, продукт реакции три раза промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. Авастин(V)-A22p в качестве экспериментальных групп разбавляли 0,1% ФСБ-Т до 6,25 нМ, 3,12 нМ, и 1,56 нМ, и затем растворы обрабатывали при 37°C в течение 1 ч для каждой из различных концентраций и три раза промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. HRP-конъюгированное антитело к легкой цепи каппа разбавляли в 100000 раз 0,1% ФСБ-Т, содержащим 5% обезжиренного молока, с последующей обработкой при 37°C в течение 30 мин. После этого продукт реакции пять раз промывали 0,1% ФСБ-Т по 1 мин. Для проявления цвета полученный продукт обрабатывали колориметрическим субстратом TMB HRP, за чем следовали реакция при комнатной температуре в течение 10 мин, обработка таким же объемом 1 н HCl, и затем измерение поглощения на 450 нм. Способность к связыванию экспрессированного и очищенного авастина(V)-A22p с рекомбинантным человеческим VEGF 165 была подтверждена полученными результатами ELISA.

Результаты показаны на фиг. 12.

Как показано на фиг. 12, было подтверждено, что авастин(V)-A22p связывается с NRP1 на том же уровне, что и авастин-A22p, использованный в качестве контроля (фиг. 12A), а также связывается с VEGF на том же уровне, что и авастин-A22p (фиг. 12B).

Промышленная применимость

Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента слитый белок, образованный слиянием проникающего в ткань пептида и антиангиогенного средства, для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания может улучшать проникновение антиангиогенного средства в опухоль и проявлять эффект нацеливания на рак, тем самым демонстрируя отличный терапевтический эффект даже в малой дозе и таким образом уменьшая побочные эффекты антиангиогенного средства, при этом демонстрируя отличный терапевтический эффект даже в отношении рака или связанного с ангиогенезом заболевания, обладающего резистентностью к антиангиогенному средству, благодаря связыванию с ангиогенным фактором роста и NRP1 в одно и то же время. Следовательно, настоящее изобретение в большой степени является промышленно применимым.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> IL DONG PHARMACEUTICAL CO., LTD.

<120> ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО ИНГРЕДИЕНТА СЛИTЫЙ БЕЛОК, В КОТОРОМ СЛИТЫ ПРОНИКАЮЩИЙ В ОПУХОЛЬ ПЕПТИД И АНТИАНГИОГЕННОЕ СРЕДСТВО, ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ РАКА ИЛИ СВЯЗАННЫХ С АНГИОГЕНЕЗОМ ЗАБОЛЕВАНИЙ

<130> OP18-0047/PCT/RU

<150> PCT/KR2016/009801

<151> 2016-09-01

<150> PCT/KR 10-2015-0123878

<151> 2015-09-01

<160> 13

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TPP#1

<400> 1

His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu Gln Glu Asn Lys

1 5 10 15

Lys Gly Arg Asn Arg Arg

20

<210> 2

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TPP#2

<400> 2

His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu Gln Glu Asn Lys

1 5 10 15

Lys Gly Arg Pro Arg Arg

20

<210> 3

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TPP#3

<400> 3

Arg Glu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Glu Pro Gln Asp Gln Lys

1 5 10 15

Lys Pro Arg Asn Arg Arg

20

<210> 4

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TPP#4

<400> 4

Arg Glu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Glu Pro Gln Asp Gln Lys

1 5 10 15

Lys Pro Arg Pro Arg Arg

20

<210> 5

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TPP#5

<400> 5

His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Gln Phe Val Leu Thr Ser Thr Arg Pro

1 5 10 15

Pro Arg

<210> 6

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TPP#6

<400> 6

His Thr Pro Gly Ile Ala Thr Arg Thr Pro Arg

1 5 10

<210> 7

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TPP#7

<400> 7

His Thr Pro Gly Asn Ser Lys Pro Thr Arg Thr Pro Arg Arg

1 5 10

<210> 8

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 9

<211> 490

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Авастин-HC-A22p

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu

465 470 475 480

Gln Glu Asn Lys Lys Gly Arg Pro Arg Arg

485 490

<210> 10

<211> 482

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Авастин-HC-TPP11

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser His Thr Pro Gly Asn Ser Lys Pro Thr Arg Thr Pro

465 470 475 480

Arg Arg

<210> 11

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Авастин-LC

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 12

<211> 490

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Авастин(V)-HC-A22p

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu

465 470 475 480

Gln Glu Asn Lys Lys Gly Arg Pro Arg Arg

485 490

<210> 13

<211> 453

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Авастин-HC

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<---

1. Фармацевтическая композиция для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, где данная композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, в котором проникающий в опухоль пептид слит с средством против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF),

где указанный проникающий в опухоль пептид содержит любую из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-7,

где указанное средство против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF) выбрано из группы, состоящей из ранибизумаба, бевацизумаба, афлиберцепта, конберцепта, r84, CT01, DOM15-10-11, DOM15-26-593, PRS-050, CT-322, ESBA903, EPI-0030, био-подобных им и их конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC).

2. Композиция по п. 1, где рак или связанное с ангиогенезом заболевание является резистентным или невосприимчивым к антиангиогенному средству.

3. Композиция по п. 1, в которой проникающий в опухоль пептид связывается как с нейропилином-1 (NRP1), так и с нейропилином-2 (NRP2) или специфически связывается только с нейропилином-1.

4. Композиция по п. 1, в которой проникающий в опухоль пептид и средство против фактора роста клеток эндотелия сосудов слиты с помощью линкера.

5. Композиция по п. 4, в которой линкер содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8.

6. Композиция по п. 1, в которой слитый белок содержит тяжелую цепь, представленную любой аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, и легкую цепь, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11.

7. Композиция по п. 1, где связанное с ангиогенезом заболевание выбирают из группы, состоящей из ревматоидного артрита, псориаза, воспаления, эндометриоза и ангиомы.

8. Композиция по п. 1, где рак выбирают из группы, состоящей из плоскоклеточной карциномы, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, перитонеального рака, рака кожи, кожной или интраокулярной меланомы, рака прямой кишки, перианального рака, эзофагеального рака, рака тонкой кишки, рака эндокринной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака уретры, хронической или острой лейкемии, лимфоцитарной лимфомы, гепатомы, рака желудочно-кишечного тракта, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака яичников, рака печени, рака мочевого пузыря, гепатоклеточной аденомы, рака молочной железы, рака толстой кишки, колоректального рака, рака эндометрия или матки, опухоли слюнной железы, рака почек, рака печени, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы и рака головы или шеи.

9. Фармацевтическая композиция для ингибирования метастазирования рака, где данная фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, в котором проникающий в опухоль пептид слит с средством против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF),

где указанный проникающий в опухоль пептид содержит любую из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-7,

где указанное средство против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF) выбрано из группы, состоящей из ранибизумаба, бевацизумаба, афлиберцепта, конберцепта, r84, CT01, DOM15-10-11, DOM15-26-593, PRS-050, CT-322, ESBA903, EPI-0030, био-подобных им и их конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC).

10. Композиция по п. 9, где рак является резистентным или невосприимчивым к антиангиогенному средству.

11. Применение слитого белка, в котором проникающий в опухоль пептид слит с средством против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF), для получения средства для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания,

где указанный проникающий в опухоль пептид содержит любую из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-7,

где указанное средство против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF) выбрано из группы, состоящей из ранибизумаба, бевацизумаба, афлиберцепта, конберцепта, r84, CT01, DOM15-10-11, DOM15-26-593, PRS-050, CT-322, ESBA903, EPI-0030, био-подобных им и их конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC).

12. Способ лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания у нуждающегося в этом субъекта, где данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, где данная композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, в котором проникающий в опухоль пептид слит с средством против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF),

где указанный проникающий в опухоль пептид содержит любую из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-7,

где указанное средство против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF) выбрано из группы, состоящей из ранибизумаба, бевацизумаба, афлиберцепта, конберцепта, r84, CT01, DOM15-10-11, DOM15-26-593, PRS-050, CT-322, ESBA903, EPI-0030, био-подобных им и их конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC).

13. Применение слитого белка, в котором проникающий в опухоль пептид слит с средством против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF), для получения средства для ингибирования метастазирования рака, где

указанный проникающий в опухоль пептид содержит любую из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-7,

где указанное средство против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF) выбрано из группы, состоящей из ранибизумаба, бевацизумаба, афлиберцепта, конберцепта, r84, CT01, DOM15-10-11, DOM15-26-593, PRS-050, CT-322, ESBA903, EPI-0030, био-подобных им и их конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC).

14. Способ ингибирования метастазирования у нуждающегося в этом субъекта, где данный способ содержит введение эффективного количества композиции нуждающемуся в этом субъекту, где данная композиция содержит в качестве активного ингредиента слитый белок, в котором проникающий в опухоль пептид слит с средством против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF),

где указанный проникающий в опухоль пептид содержит любую из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-7,

где указанное средство против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF) выбрано из группы, состоящей из ранибизумаба, бевацизумаба, афлиберцепта, конберцепта, r84, CT01, DOM15-10-11, DOM15-26-593, PRS-050, CT-322, ESBA903, EPI-0030, био-подобных им и их конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC).