Растительная композиция для вакцинации против чумы свиней и способ ее приготовления

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантному вектору для получения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней. Также раскрыты трансформированное растение для получения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, состав вакцины и фармацевтическая композиция, содержащие указанный антигенный белок pmE2. Раскрыты способ получения антигенного белка pmE2, способ предотвращения классической чумы свиней, способ определения пути продуцирования антител вируса классической чумы свиней (CSFV). Изобретение позволяет эффективно лечить вирус классической чумы свиней. 8 н. и 6 з.п. ф-лы, 16 ил., 7 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору для трансформирования растения, растению, трансформированному рекомбинантным вектором, антигенному белку E2 (pmE2), вектора классической чумы свиней, продуцируемому в растении, и к их применению.

Предшествующий уровень техники

Классическая чума свиней - это тип инфекционного заболевания, которое является заболеванием, вызванным патогеном, то есть вирусом классической чумы свиней (CSFV), и не встречается у людей или других животных, но когда встречается у свиней, большая часть инфицированных свиней не излечивается и умирает (Penrith, M.-L., Vosloo, W. и Mather, C. ( 2011), Classical Swine Fever (Hog Cholera): Review of Aspects Relevant to Control. Transboundary and Emerging Diseases, 58: 187-196). Классическая чума свиней, классифицированная как заболевание из списка A эпидемических заболеваний Всемирной организацией здравоохранения животных (OIE), а также классифицированная как эпидемия первого класса в Корее в соответствии с Законом о профилактике эпидемий домашних животных, очень заразна для свиней, что приводит к высокой летальности, сопровождающаяся высокой лихорадкой и кровотечением, и развивается в острое, подострое или хроническое состояние. Как упоминалось выше, поскольку классическая чума свиней является инфекционным заболеванием с высокой смертностью и заболеваемостью, его предотвращение признается как критическая проблема настолько, что будущее свиноводческой отрасли не может быть гарантировано без искоренения классической чумы свиней. Что касается классической чумы свиней, свинья является единственным естественным хозяином, а распространение классической чумы свиней главным образом вызвано вирусом, который способен заразить свиней всех возрастов, чувствительных к вирусу. В Корее для борьбы с болезнями была проведена вакцинация живой вакциной, приготовленной с модифицированным живым вирусом, штаммом LOM. Так как живая вакцина для классической чумы свиней не может серологически отличаться от вируса дикого типа, рекомбинантные вакцины, такие как маркерная вакцина, разрабатываются в глобальном масштабе для дифференциации антител, полученных путем вирусной инфекции и вакцинации дикого типа. Корея также сосредоточилась на разработке вакцин для практического применения, чтобы просто и точно определить антитела, вызванные полевой инфекцией и антитела, образующиеся при вакцинации в рамках применения вакцины.

Тем временем значимое развитие в области молекулярной биологии и методов генной инженерии также применяется в области растений, и поэтому постоянно предпринимаются усилия по производству полезных биологически активных веществ в растениях. Выработка полезных веществ в растении предоставляет следующие преимущества: 1) исключительное снижение себестоимости продукции; 2) полное устранение различных загрязнений (вирус, онкоген, энтеротоксин и т.д.), которые могут быть получены при использовании популярного способа в данной области (для выделения и очистки белка после синтеза в клетках животных или микроорганизмов); 3) управление семенным запасом даже на стадии коммерциализации, в отличие от клеток животных или микроорганизмов; и 4) предоставление искомого вещества в соответствии с повышенным спросом в кратчайшие сроки, поскольку, когда потребность в искомом веществе быстро увеличивается, растительная система по настоящему изобретению является абсолютно предпочтительной по сравнению с традиционной системой на клетках животных с точки зрения инженерной техники или затрат, необходимых для массового производства.

Причина того, что способ получения полезного вещества из растения, трансформированного, как описано выше, привлек внимание, заключается в пути синтеза белка растения. Посттрансляционная модификация является ключевым процессом синтеза белка у млекопитающего, и поскольку растение имеет путь синтеза белка эукариотического организма, оно может продуцировать белок, очень похожий на белок, экспрессируемый млекопитающим. Однако, несмотря на несколько преимуществ, упомянутых выше, способы получения полезных биологически активных веществ (белки, полезные с медицинской точки зрения, вакцины и промышленно ценные ферменты и т.д.) в растениях с высокой эффективностью еще не достигли большого успеха.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема

Авторы провели исследования по улучшению низкой эффективности при продуцировании белка с помощью растения, сконструировав для этого рекомбинантный вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий белок GP55 вируса классической чумы свиней; и полинуклеотид, кодирующий белок домена, связывающего целлюлозу (CBD), и обнаружили, что применение трансформированного растения, трансформированного рекомбинантным вектором, может привести к получению антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого в растениях, с высокой эффективностью и продемонстрировали более высокую безопасность и стабильность, чем другие способы производства. Кроме того, они также обнаружили, что белок pmE2 можно использовать в качестве маркера для определения пути воздействия вируса и пути продуцирования антител, что и завершает настоящее изобретение.

Задачей настоящего изобретения является создание рекомбинантного вектора для получения антигенного белка pmE2 вируса классической свиной чумы, продуцируемого в растениях.

Другой целью настоящего изобретения является создание трансформированного растения для получения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого в растениях, с помощью рекомбинантного вектора.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, экспрессированный в трансформированном растении, и способ его получения.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание вакцинной, фармацевтической или кормовой композиции для предотвращения классической чумы свиней, включающей рекомбинантный белок в качестве активного ингредиента.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание композиции и набора для диагностики вируса классической чумы свиней, включающих рекомбинантный белок.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание способа предотвращения классической чумы свиней путем введения вакцинной композиции животному.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ обнаружения CSFV с использованием рекомбинантного белка и способ определения пути продуцирования антител против CSFV.

Техническое решение

Для достижения вышеупомянутых целей в настоящем изобретении предлагается рекомбинантный вектор для получения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, который включает полинуклеотид, кодирующий белок GP55 из CSFV; и полинуклеотид, кодирующий белок домена, связывающего целлюлозу.

Кроме того, настоящее изобретение относится к трансформированному растению для получения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, трансформированному рекомбинантным вектором.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антигенному белку pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемому растением, который экспрессируется в трансформированном растении.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, который включает (а) трансформацию Agrobacterium рекомбинантным вектором; (b) введение трансформированных Agrobacterium в растение; и (c) выделение и очистку антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, который экспрессируется в растении.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает вакцину, фармацевтическую или кормовую композицию для предотвращения классической чумы свиней, включающую рекомбинантный белок в качестве активного ингредиента.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает композицию и набор для диагностики CSFV, включающие рекомбинантный белок.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу предотвращения классической чумы свиней путем введения животному вакцинной композиции.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения CSFV путем обнаружения CSFV в образце посредством реакции антиген-антитело с использованием рекомбинантного белка.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает способ для обнаружения пути продуцирования антител к CSFV, который включает: 1) введение вакцинной композиции экспериментальному объекту и выделение крови у экспериментального объекта; 2) выделение сыворотки из крови, выделенной на стадии 1); и 3) обработку сыворотки, выделенной на стадии 2), с использованием антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, в качестве антигена для индукции реакции.

Полезные эффекты

С помощью рекомбинантного вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий белок GP55 из CSFV в соответствии с настоящим изобретением; и полинуклеотид, кодирующий белок домена, связывающего целлюлозу; и растения, трансформированного рекомбинантным вектором, с высокой эффективностью может быть получен антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый растением, который обладает большей безопасностью и устойчивостью, чем белки, которые получают другими способами производства. Кроме того, поскольку антигенный белок pmE2 классической чумы свиней, продуцируемый в растении, включает белок домена, связывающего целлюлозу (CBD), его можно использовать в качестве эффективного маркера для определения пути воздействия вируса и пути продуцирования антител.

Описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует карту рекомбинантного вектора для получения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней.

Фиг. 2 иллюстрирует экспрессию белка pmE2: CBD в трансформированном растении, которую оценивали вестерн-блоттингом.

Фиг. 3 иллюстрирует антигенность белка, экспрессируемого в трансформированном растении, которую оценивали с помощью ELISA.

Фиг. 4 иллюстрирует антигенность белка, экспрессируемого в трансформированном растении, которую оценивали вестерн-блоттингом.

Фиг. 5 иллюстрирует антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый растением, выделенный и очищенный из трансформированного растения.

Фиг. 6 иллюстрирует количественный результат антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, выделенного и очищенного из трансформированного растения.

Фиг. 7 иллюстрирует получение специфического антитела против CSFV и специфического антитела против белка CBD, включенного в антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растении, в сыворотке, полученной после введения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением.

Фиг. 8 иллюстрирует титры антител, измеренные у мышей, которым вводился антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый растением.

Фиг. 9 иллюстрирует путь заражения CSFV с использованием антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением.

Фиг. 10 иллюстрирует удобство применения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, при определении пути вирусной инфекции согласно реакциям между различными антигенами и иммунизированной мышиной сывороткой.

Фиг. 11 иллюстрирует схематический процесс эксперимента по защитной способности экспрессированного в растении белка.

Фиг. 12 иллюстрирует изменение температуры организма модельных животных (свиней) после заражения.

Фиг. 13 иллюстрирует изменение уровня лейкоцитов в модельных животных (свиньях) после заражения.

Фиг. 14 иллюстрирует обнаружение антигена после сбора крови и других образцов модельных животных (свиней) после заражения.

Фиг. 15 иллюстрирует обнаружение антигена после аутопсий модельных животных (свиней) после заражения.

Фиг. 16 иллюстрирует результат исследования титров защитных антител у модельных животных (свиней) после заражения.

Принципы изобретения

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору для получения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, который включает полинуклеотид, кодирующий белок GP55 из CSFV; и полинуклеотид, кодирующий белок CBD.

Используемый в данном документе термин «экспрессионный вектор» относится к плазмиде, вирусу или другому носителю, известному в данной области, в который может быть вставлен или введен ген или полинуклеотид. Полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением может быть функционально связан с последовательностью контроля экспрессии, и функционально связанный полинуклеотид может быть включен в один экспрессионный вектор, содержащий селективный маркер и точку начала репликации. Термин «функционально связанный» может обозначать ген и последовательность контроля экспрессии, которая связана с возможностью экспрессии гена, когда подходящая молекула связана с последовательностью контроля экспрессии. Термин «последовательность контроля экспрессии» относится к последовательности ДНК, контролирующей экспрессию полинуклеотидной последовательности, функционально связанной со специфической клеткой-хозяином. Такая контрольная последовательность содержит промотор для транскрипции, случайную операторную последовательность для управления транскрипцией, последовательность, кодирующую соответствующий сайт связывания с рибосомой мРНК, и последовательности для контроля прекращения транскрипции и трансляции.

Термин «вирус классической чумы свиней (CSFV)», используемый в данном документе, представляет собой покрытый оболочкой вирус с одноцепочечной РНК рода Pestivirus, который имеет антиген-определяющий сайт (эпитоп) на белке, относящемуся к типу ассоциированных с оболочкой гликопротеинов (E-белков) с размером приблизительно 12,3 ~ 12,5 тыс. о., который называется гликопротеином Е2. По этой причине белок E2 считается относительно важным структурным белком. Известно, что белок E2 CSFV вызывает нейтрализацию вируса и играет важную роль в иммунологическом защитном механизме против классической чумы свиней.

Полинуклеотид, кодирующий белок GP55 из CSFV, представлен в SEQ ID NO: 1, а полинуклеотид, кодирующий белок CBD, представлен в SEQ ID NO: 2, но настоящее изобретение не ограничено этим.

Рекомбинантный вектор может включать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из промотора 35S CaMV; 5'-нетранслируемой области (UTR) гена M17; полинуклеотида, кодирующего белок, связывающий шаперон (BiP); и полинуклеотида, кодирующего белок His-Asp-Glu-Leu (HDEL).

5 ' UTR (M17) может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, а нуклеотид, кодирующий белок BiP, может быть представлен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4, но настоящее изобретение не ограничено этим.

Вектор может быть представлен следующей векторной картой, включающей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, но настоящее изобретение не ограничено этим.

В настоящем изобретении полинуклеотиды или гены, содержащие нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1-5, могут быть искусственно синтезированы с использованием синтезатора нуклеиновых кислот на основании нуклеотидной последовательности соответствующего гена или могут быть получены с помощью ПЦР с олигонуклеотидами в виде праймеров, которые имеют комплементарные последовательности для обоих концов целевого полинуклеотида или гена, используя геномную ДНК или каждый ген CSFV в качестве матрицы. Между тем из-за вырождения кодонов нуклеотиды или гены по настоящему изобретению могут присутствовать в различных нуклеотидных последовательностях, все из которых включены в объем настоящего изобретения. Кроме того, в объем настоящего изобретения включены варианты нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-5. В частности, нуклеотиды или гены по настоящему изобретению могут включать нуклеотидную последовательность, имеющую 70% или более, предпочтительно 80% или более, более предпочтительно 90% или более и наиболее предпочтительно 95% или более гомологию последовательности с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1-5. Термин «гомология последовательности (%)» относительно полинуклеотида подтверждается сравнением двух оптимально расположенных последовательностей в области сравнения, и часть полинуклеотидной последовательности в области сравнения может быть добавлена или удалена (т.е. включен разрыв), по сравнению с эталонной последовательностью (без добавления или удаления) относительно оптимального расположения обеих последовательностей.

В настоящем изобретении белок GP55 является одним из доменов антигена E2 из CSFV, и 5' UTR (M17) можно использовать для увеличения количества синтезируемого белка, а белок BiP можно использовать для транслокации белка-мишени к N-концевому эндоплазматическому ретикулуму с использованием последовательности геномной ДНК. Кроме того, поскольку белок CBD можно использовать в качестве гибридной метки белка, а белок HDEL помогает белку оставаться в эндоплазматическом ретикулуме, могут быть улучшены сворачивание и сборка, опосредованные молекулярными шаперонами, и, следовательно, может быть дополнительно снижен протеолиз. Таким образом, белок CBD и белок HDEL могут использоваться в комбинации для накопления конечного целевого белка в эндоплазматическом ретикулуме.

В качестве векторов предпочтительно использовать бинарные векторы, такие как векторы pCHF3, pPZP, pGA и pCAMBIA, и в одном примерном воплощении настоящего изобретения использовали вектор pBI121, но настоящее изобретение не ограничено этим.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает растение, трансформированное рекомбинантным вектором.

Способ введения рекомбинантного вектора настоящего изобретения в растение может быть, без ограничения указанным, способом с использованием Agrobacterium sp., бомбардировкой генной пушкой, усами карбида кремния, ультразвуком, электропорацией или осаждением с использованием полиэтиленгликоля (PEG). В одном воплощении настоящего изобретения рекомбинантный вектор по настоящему изобретению вводили в растение, например Arabidopsis thaliana, с помощью Agrobacterium sp.-опосредованного способа.

В настоящем изобретении растение, трансформированное рекомбинантным вектором, может быть получено обычным способом в данной области, таким как способ полового размножения или способ бесполого размножения. В частности, растение по настоящему изобретению может быть получено путем полового размножения, включая получение семян путем опыления цветов и размножения из семян. Кроме того, после трансформации растения рекомбинантным вектором по настоящему изобретению растение по настоящему изобретению может быть получено неполовым способом, включающим индукцию каллюса, укоренение и акклиматизацию в почве в соответствии с обычным способом. То есть эксплант растения, трансформированного рекомбинантным вектором по настоящему изобретению, высевали в подходящую среду, известную в данной области, культивировали в надлежащих условиях, чтобы индуцировать образование каллюса, а затем, после образования побегов, переносили и культивировали в среде, не содержащей гормонов. Через две недели побег переносили в среду для корнеобразования для индукции корня. После того, как корень был индуцирован, растение можно посадить в почву и затем акклиматизировать, тем самым получив растение в соответствии с настоящим изобретением. Трансформированное растение в настоящем изобретении может включать ткань, клетки или семена, которые получены из него.

В настоящем изобретении растение может быть двудольным или однодольным, а двудольное может быть, без ограничения указанным, Arabidopsis thaliana, соей, табаком, баклажаном, перцем, картофелем, томатом, китайской капустой, дайконом, капустой, салатом, персиком, грушей, клубникой, арбузом, восточной дыней, огурцом, морковью и сельдереем, а однодольные могут быть, без ограничения указанным, рисом, ячменем, пшеницей, рожью, кукурузой, сахарным тростником, овсом и луком.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антигенному белку pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемому растением, который экспрессируется в трансформированном растении.

В соответствии с настоящим изобретением антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый растением, представляет собой слияние белка GP55 из CSFV и белка CBD, но настоящее изобретение не ограничено этим.

В настоящем изобретении антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый растением, включает белки, имеющие аминокислотную последовательность дикого типа и вариант такой аминокислотной последовательности. Вариант антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, относится к белку, имеющему разные последовательности из-за делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены одного или нескольких аминокислотных остатков или их комбинации. Замена аминокислот в белке и пептиде, которая в целом не изменяет активность молекулы, известна в данной области. Антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый растением, или его вариант могут быть экстрагированы или синтезированы из природного источника или могут быть получены методом рекомбинации генов на основе последовательности ДНК.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, который включает: (а) трансформацию Agrobacterium рекомбинантным вектором; (b) введение трансформированных Agrobacterium в растение; и (c) выделение и очистка антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, который экспрессируется в растении.

Растение может быть одним или несколькими растительными организмами, выбранными из группы, состоящей из Arabidopsis thaliana, пшеницы, ячменя, кукурузы, бобов, картофеля, красной фасоли, овса, сорго, риса, китайской капусты, дайкона, перца, клубники, помидора, арбуза, огурца, капусты, восточной дыни, тыквы, валлийского лука, лука, моркови, женьшеня, табака, хлопка, кунжута, сахарного тростника, свеклы, периллы, арахиса, рапса, яблони, груши, ююбы, персика, киви, винограда, мандарина, хурмы, сливы, абрикоса, банана, розы, гладиолуса, герберы, гвоздики, хризантемы, лилии, тюльпана, райграса, красного клевера, ежи сборной, люцерны, овсяницы тростниковой и многолетнего райграса, а предпочтительно Arabidopsis thaliana, но настоящее изобретение не ограничивается ими.

В настоящем изобретении способ выделения и очистки на стадии (с) может использовать известный способ, подходящий для физических и химических свойств соответствующего материала, например, с помощью аморфной целлюлозы (АМС), дистилляции, электродиализа, первапорации, хроматографии, экстракции растворителем, реакционной экстракции или ВЭЖХ, и предпочтительно AMC, но настоящее изобретение не ограничено этим.

В одном примерном воплощении настоящего изобретения был получен рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий белок GP55 из CSFV; полинуклеотид, кодирующий белок CBD; промотор CaMV 35S; 5' UTR (M17); полинуклеотид, кодирующий белок BiP; и полинуклеотид, кодирующий белок HDEL. После того как готовый рекомбинантный вектор трансформировали в Arabidopsis thaliana с использованием Agrobacterium, трансформированное растение культивировали для слияния белка GP55 из CSFV и белка CBD, и антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, получали путем выделения и очистки. Было подтверждено, что антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый растением, был экспрессирован в трансформированном растении на высоком уровне, что позволяет осуществить массовое производство, и вызвал иммунитет против CSFV и самый высокий титр, которые показали, что белок имеет вирус-нейтрализующий эффект. Кроме того, из-за детекции белка CBD, включенного в белок pmE2, антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый растением, был идентифицирован в качестве маркера пути воздействия вируса. Кроме того, когда животную модель инокулировали белком pmE2, было подтверждено, что белок pmE2 эффективен для предотвращения CSFV, ингибируя амплификацию и распространение вируса и обладая превосходной защитной способностью.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает вакцину или фармацевтическую композицию для предотвращения классической чумы свиней, которая включает рекомбинантный белок в качестве активного ингредиента.

Используемый в данном документе термин «вакцина» относится к биологическому агенту, содержащему антигенное вещество, обеспечивающее иммунитет организма, и иммуноген, генерирующий иммунные ответы в организме при введении или инъекции в живой организм с целью предотвращения классической чумы свиней.

Вакцинная композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать адъювант в дополнение к рекомбинантному белку. Адъювант может быть, без ограничения, любым известным в данной области, и вакцинная композиция может дополнительно включать, например, полные или неполные формы адъюванта Фрейнда для повышения ее иммуногенности.

Вакцина или фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены в виде композиции, в которой активный ингредиент включен в фармацевтически приемлемый носитель. В данном документе фармацевтически приемлемый носитель представляет собой носитель, эксципиент или разбавитель, который обычно используют в фармацевтической области. Примеры фармацевтически приемлемых носителей, используемых в вакцине или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, могут включать, без ограничения указанным, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло.

Вакцина или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут быть использованы в лекарственных формах, включая пероральную форму, такую как порошок, гранула, таблетка, капсула, суспензия, эмульсия, сироп или аэрозоль, лекарственное средство для наружного применения, суппозиторий или стерилизованный раствор для инъекций в соответствии с обычным способом, подходящим для каждой формы.

Вакцина или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут быть составлены с наполнителем, загустителем, связующим, смачивающим агентом, диспергирующим веществом, разбавителем, таким как поверхностно-активное вещество или эксципиентом, которые обычно используются. Твердая композиция для перорального введения может представлять собой таблетку, пилюлю, порошок, гранулу или капсулу, и такая твердая композиция может быть получена путем смешивания, по меньшей мере, одного из наполнителей, например крахмала, карбоната кальция, сахарозы, лактозы и желатина, с активным ингредиентом. Кроме того, в дополнение к простому эксципиенту могут также использоваться смазывающие вещества, такие как стеарат магния и тальк. В качестве жидкой композиции для перорального введения можно использовать суспензию, жидкость для внутреннего применения, эмульсию или сироп, а также обычно используемый разбавитель, такой как вода или жидкий парафин, различные типы наполнителей, например, может быть включен смачивающий агент, подсластитель, ароматизатор и консервант. Состав для парентерального введения включает стерилизованный водный раствор, неводный растворитель, суспензию, эмульсию, лиофилизированный агент и суппозиторий. В качестве неводного растворителя или суспензии могут быть использованы пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, или инъекционный эфир, такой как этилолеат. В качестве основания суппозитория могут использоваться Witepsol, Tween 61, масло какао, лауриновый жир или глицерожелатин.

Вакцина или фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением могут вводиться индивидууму различными путями. Введение может осуществляться любым из предсказуемых способов, например, пероральными, внутривенными, внутримышечными, подкожными и внутрибрюшинными инъекциями.

Дозу вакцины или фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением выбирают принимая во внимание возраст, массу тела, пол и физическое состояние индивидуума. Доза, необходимая для индукции защитного иммунного ответа у индивидуума без особых побочных эффектов, может варьироваться в зависимости от наличия эксципиента и рекомбинантного белка в качестве иммуногена. Как правило, вакцина или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит от 0,1 до 1000 мкг и предпочтительно от 0,1 до 100 мкг белка на мл стерилизованного раствора рекомбинантного белка по настоящему изобретению. Для вакцинной композиции после первоначального введения по мере необходимости могут проводиться произвольно повторяющиеся антигенные стимуляции.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает кормовую композицию для предотвращения классической чумы свиней, которая включает рекомбинантный белок в качестве активного ингредиента.

Корма включают кукурузу, рис, обычную рисовую солому, дикую траву, зеленый корм, силос, сухую траву, луговую траву, а также побочные продукты, такие как свинина, говядина и курятина, но настоящее изобретение не ограничено этим, и в животноводстве можно использовать любой тип используемого корма. Способ смешивания рекомбинантного белка по настоящему изобретению с таким кормом после добавления этих компонентов может быть механическим перемешиванием, адсорбцией или окклюзией, но настоящее изобретение не ограничено этим.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для диагностики CSFV, которая включает рекомбинантный белок.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает набор для диагностики CSFV, который включает рекомбинантный белок.

Набор для диагностики может быть изготовлен так, чтобы при необходимости включать реакционный раствор, который может быть легко реализован с использованием известной технологии. Набор по настоящему изобретению может дополнительно включать реагент, необходимый для диагностики CSFV, который может представлять собой, без ограничения, буфер. Кроме того, набор может включать техническую инструкцию. В технической инструкции печатается текст, описывающий, как использовать набор, например, способ приготовления буфера и представленные условия реакции. Инструкции включают брошюру в виде проспекта или информационного листа, этикетки, прикрепленной к набору, и описания на поверхности упаковки, включающей набор. Кроме того, инструкции включают информацию, раскрытую или предоставленную электронными носителями, такими как Интернет.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения классической чумы свиней путем введения вакцинной композиции животному.

Животное предпочтительно представляет собой млекопитающее и более предпочтительно свинью.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу обнаружения CSFV путем обнаружения CSFV в образце посредством реакции антиген-антитело с использованием рекомбинантного белка.

Реакция антиген-антитело может быть обнаружена одним или несколькими способами, выбранными из группы, включающей иммуноокрашивание тканей, радиоиммуноанализ (RIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), вестерн-блоттинг, иммунопреципитационный анализ, иммунодиффузионный анализ, анализ фиксации комплемента, клеточный сортер с активацией флуоресценции (FACS) и анализ на белковых чипах, но настоящее изобретение не ограничено этим.

Образец может быть одним или несколькими выбранными из группы, состоящей из клеток, крови, мочи, слюны и ткани, но настоящее изобретение не ограничено этим.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу определения пути продуцирования антител к CSFV, который включает:

1) введение вакцинной композиции экспериментальному объекту с последующим извлечением крови у экспериментального объекта; 2) выделение сыворотки из крови, выделенной на стадии 1); и 3) обработку сыворотки, выделенной на стадии 2), использование антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого в растении, в качестве антигена для индукции реакции.

В реакции на стадии 3), когда детектируются антитела как для белка GP55 из CSFV, так и для белка (CBD), можно определить, что антитела, образовавшиеся у экспериментального объекта, продуцируются из-за введения вакцинной композиции. Кроме того, когда в реакции стадии 3) обнаруживается только антитело к белку GP55 из CSFV, то можно сказать, что антитело вырабатывается из-за инфекции CSFV.

Далее, чтобы помочь в понимании настоящего изобретения, будут приведены иллюстративные примеры. Тем не менее, следующие примеры приведены для более простого понимания настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не ограничивается представленными ниже примерами.

Пример 1. Конструирование рекомбинантного вектора, включающего ген GP55 вируса классической чумы свиней

Для того чтобы сконструировать рекомбинантный вектор, имеющий ген GP55 вируса классической чумы свиней для продуцирования антигена вируса классической чумы свиней в растении с высокой эффективностью был проведен следующий эксперимент.

В частности, как показано на фиг. 1, был сконструирован рекомбинантный вектор, в котором промотор 35S CaMV; 5' UTR (M17) (SEQ ID NO: 3); нуклеотидная последовательность шаперон-связывающего белка (BiP) (SEQ ID NO: 4); нуклеотидная последовательность белка GP55 (SEQ ID NO: 1); нуклеотидная последовательность белка CBD (SEQ ID NO: 2); и нуклеотидная последовательность белка His-Asp-Glu-Leu (HDEL) были включены в вектор pBI121.

Белок GP55 является одним из доменов антигена E2 из CSFV, 5' - UTR (M17) использовали для увеличения количества синтезируемого белка, а белок BiP использовали для транслокации белка-мишени в N-концевой эндоплазматический ретикулум с использованием последовательности геномной ДНК. Кроме того, поскольку белок CBD использовался как гибридная белковая мишень, а белок HDEL помогал белку оставаться в эндоплазматическом ретикулуме, были улучшены сворачивание и сборка, опосредуемые молекулярными шаперонами, и, таким образом, был дополнительно снижен протеолиз. Поэтому белок CBD и белок HDEL использовали в комбинации для накопления конечного целевого белка в эндоплазматическом ретикулуме. Нуклеотидная последовательность сконструированного рекомбинантного вектора была представлена в SEQ ID NO: 5.

Пример 2. Получение трансформированного растения, экспрессирующего слитый белок, включающий антигенный белок GP55 из CSFV и белок CBD

Для получения трансформированного растения, экспрессирующего рекомбинантный слитый белок, который включает антигенный белок GP55 из CSFV и белок CBD, был проведен следующий эксперимент.

В частности, Arabidopsis thaliana, экспрессионный рекомбинантный слитый белок, содержащий белок GP55 из CSFV и белок CBD, получали с помощью Agrobacterium-опосредованного способа трансформации рекомбинантного вектора, сконструированного в Примере 1. Поскольку рекомбинантный вектор Примера 1 обладает резистентностью к канамицину в растении, после отбора трансгенных Arabidopsis thaliana проводили тест устойчивости к канамицину и вестерн-блоттинг с использованием антитела к CBD для подтверждения экспрессии рекомбинантного слитого белка. Также на фиг. 2. показаны экспрессия целевого белка в Arabidopsis thaliana и количественное определение уровня экспрессии.

Как показано на фиг. 2, с помощью вестерн-блоттинга было подтверждено, что белок CBD экспрессируется в трансформированном Arabidopsis thaliana, и, таким образом, также экспрессируется белок GP55 из CSFV, слитый с белком CBD.

Пример 3. Подтверждение антигенности белка GP55 из CSFV, полученного в трансформированном растении

Чтобы подтвердить антигенность белка GP55 из CSFV в рекомбинантном слитом белке, полученном из трансформированного растения в Примере 2, который включает антигенный белок GP55 из CSFV и белок CBD, был проведен следующий эксперимент.

В частности, гомозиготные семена со стабильной экспрессией белка-мишени были в конечном счете получены путем развития поколений трансформированного растения, созданного в Примере 2, и уровень экспрессии целевого белка определяли количественно для каждой линии семян для выявления линии, которая должна использоваться в эксперименте. Семена определенной линии культивировали для получения растения, белок экстрагировали с использованием экстракционного буфера, обычно используемого для экстракции белка в ELISA. Антигенность белка GP55 из CSFV в слитом белке антигенного белка GP55 и белка CBD, продуцируемого трансформированным растением, созданного в Примере 2, подтвердили с использованием набора для клинической диагностики (Jeno Biotech Inc. (в настоящее время Median Diagnostics), набор ELISA CSFV-Ag), используемого для обнаружения антигена CSFA, и результаты ELISA и вестерн-блоттинга представлены на фиг. 3 и 4, соответственно.

Как показано на фиг. 3 и 4, было подтверждено, что растительный белок, полученный в настоящем изобретении, демонстрирует высокую реакционную способность к коммерчески доступным антителам для клинической диагностики как в ELISA, так и вестерн-блоттинге. Поэтому было подтверждено, что в рекомбинантном слитом белке, содержащем антигенный белок GP55 из CSFV и белок CBD, продуцируемом трансформированным растением, которое было создано в Примере 2, белок GP55 из CSFV обладает антигенностью. Кроме того, было подтверждено, что белок GP55 из CSFV экспрессируется в трансформированном растении на высоком уровне, что позволяет осуществить массовое производство.

Пример 4. Выделение и очистка антигенного белка pmE2 классической чумы свиней, продуцируемого в растении, из трансформированного растения

4-1. Выделение и очистка рекомбинантного слитого белка

Так как трансформированное растение, полученное в соответствии с настоящим изобретением, также экспрессирует белок CBD, белки были выделены и очищены с высокой эффективностью с использованием целлюлозы. В данном случае в качестве смолы для выделения и очистки целевого белка, использовали аморфную целлюлозу (AMC), специально приготовленную в виде микрокристаллической целлюлозы (MCC).

4-2. Идентификация фракций выделенных и очищенных рекомбинантных белков

Рекомбинантные белки, выделенные и очищенные в соответствии с примером 4-1, идентифицировали двумя способами. В первом способе присутствие белка GP55 из CSFV в качестве белка-мишени было подтверждено вестерн-блоттингом. В выделенном и очищенном белке белок CBD слит с белком-мишенью, которым является белок GP55 из CSFV, и, таким образом, реакция по отношению к белку CBD, используемому в качестве мишени для первичного антитела, косвенно указывает на присутствие белка GP55 из CSFV. В данном случае для подтверждения проблем в процессах выделения и очистки путем сопоставления степени распределения белка GP55 из CSFV во фракциях растительного раствора, содержащего белок, фракции загружали в соответствующие лунки геля в равном соотношении, и Результат представлен на фиг. 5. Во втором способе, как показано на фиг. 5, белковая полоса была идентифицирована в геле SDS-PAGE после окрашивания фракций Кумасси, и общий паттерн сравнивали с результатом вестерн-блоттинга, окрашенного Кумасси. Результат представлен на фиг. 5.

Как показано на фиг. 5, в соответствии с результатом вестерн-блоттинга, было подтверждено, что значительное количество белка GP55 связано со смолой. Также было подтверждено, что небольшое количество остается на полосе Ub. На дорожках E1 и E2 было подтверждено, что после трехкратной промывки терялось незначительное количество белка, но большая часть белка была извлечена. При подтверждении извлеченного белка с помощью SDS-PAGE, была визуально идентифицирована чистая полоса белка GP55, а неспецифические полосы не были идентифицированы, что указывает на высокую степень чистоты.

4-3. Количественная оценка выделенных и очищенных белков

Для очистки белкового раствора, выделенного еще раз в 4-1, раствор белка диализовали против PBS. Затем полученный раствор концентрировали с использованием центрифужной фильтровальной пробирки и обрабатывали окрашиванием Кумасси на геле SDS-PAGE, результат представлен на фиг. 6. Путем сравнения с известной концентрацией раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA), количественно определяли концентрации полос белка-мишени (включая белок CBD). В данном случае выделенный белковый раствор (перед диализом), белковый раствор после диализа, белковый раствор после концентрирования и раствор с пониженной концентрацией (способный подтвердить потерю белков) загружали по отдельности, а затем количественно определяли вместе для того, чтобы обеспечить точность подтверждения очистки и количественной оценки. Результат представлен на фиг. 6.

Как показано на фиг. 6, было подтверждено, что замена буфера возможна без потери белка даже после диализа, и конечный материал вакцины, такой как белковый антиген, можно получить в искомой концентрации путем концентрирования, с последующей количественной оценкой путем сравнения с эталонным белком.

Соответственно, рекомбинантный слитый белок, экспрессированный в трансформированном растении, содержащий антигенный белок GP55 из CSFV и белок CBD, был назван «E2, продуцируемый в растении (plant-made E2, pmE2)).

Пример 5. Подтверждение иммуногенности и вируснейтрализующей активности антигенного белка pmE2 классической чумы свиней, продуцируемого в растении, на модельных животных

Чтобы подтвердить, обладает ли антигенный белок PME2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого в растении, иммуногенностью и вирус-нейтрализующей активностью путем индукции антител в животной модели, был проведен следующий эксперимент.

В частности, модельным животным, мышам, вводили антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого в растении. Мышей отрицательного контроля обрабатывали PBS, и обработанные группы обрабатывали комбинацией антигена, смешанного с адъювантом Фрейнда, в равных количествах три раза за две недели, а затем из каждой группы извлекали сыворотку. Продуцирование специфического антитела против введенного антигена было обнаружено с использованием набора антител для клинической диагностики CSFV (Jeno Biotech (в настоящее время Median Diagnostics), набор CSFV-Ab ELISA). Результат подсчета баллов согласно руководству для набора показан на фиг. 7. Кроме того, вирус-нейтрализующая активность в сыворотке той же самой мыши, проанализированная Агентством по карантину животных и растений, показана на фиг. 8.

Как показано на фиг. 7, было подтверждено, что титры антител регистрируются как положительные значения во всех обработанных группах, что указывает на то, что антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, полученный способом по настоящему изобретению, обладает иммуногенностью против CSFV у мышей.

Кроме того, как показано на фиг. 8, было подтверждено, что все обработанные группы показывают очень высокие титры.

Таким образом, было подтверждено, что антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, полученный в соответствии с настоящим изобретением, приводит к выработке специфических антител у мышей, и антитела имеют высокие титры вируснейтрализующей активности.

Пример 6. Подтверждение пригодности антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого в растениях, в качестве маркера для определения пути воздействия CSFV

Поскольку белок CBD слит с антигенным белком pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемым в растении (рекомбинантный слитый белок, включающий антигенный белок GP55 из CSFV и белок CBD) для подтверждения пригодности белка CBD в качестве маркера путей воздействия вируса, был проведен следующий эксперимент.

В частности, ELISA использовали белок CBD, включенный в антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, для определения специфических антител против антигенов в представленных ниже сыворотках. Специфические антитела к белку CBD, входящему в состав антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого в растении, детектировали в контрольной (свиной) сыворотке, включенной в набор для клинической диагностики (Jeno Biotech (в настоящее время Median Diagnostics) набор CSFV-Ab ELISA), сыворотке из 7 свиноматок и 28 поросят, выращиваемых на ферме, и сыворотке мышей, извлеченной в Примере 5. Для свиноматок-мишеней возраст во время сбора крови и последняя вакцинация против классической чумы свиней не могли быть подтверждены, а для поросят-мишеней возраст в момент сбора крови составлял примерно три недели, а вакцинация не могла быть подтверждена. Результаты подтверждения пригодности антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого в растении, в качестве маркера для определения пути воздействия CSFV показаны на фиг. 9.

Как показано на фиг. 9, в сыворотке мыши, подвергнутой воздействию белка, полученного из растений, также было обнаружено специфическое антитело против белка CBD, включенного в антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растении. С другой стороны, у всех экспериментальных объектов контрольные сыворотки, входящие в набор, и сыворотки свиноматок и поросят, демонстрировали специфические антитела против CSFV, которые детектировались как положительные значения титров, в соответствии с руководством к набору, но специфические антитела против белка CBD не были обнаружены. В данном случае, хотя происхождение специфических антител против CSFV, обнаруженных у свиноматок и поросят, не было идентифицировано, специфические антитела против белка CBD не были обнаружены, что указывает на то, что CSFV не был связан с белком, используемым в настоящем изобретении.

Поэтому было подтверждено, что антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растении, по настоящему изобретению полностью подходит для применения в качестве маркера для определения пути воздействия вируса.

Кроме того, предполагалось подтвердить, вызывает ли, как правило, белок CBD, включенный антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растении, по настоящему изобретению, иммунные ответы путем продуцирования специфических антител. Если белок CBD является обычным белком, который может вызывать продуцирование антител, то продуцирование антител к CBD из pmE2 может повысить надежность положительной проверки продуцирования CSFV-антител и pmE2-антител из-за вирусной инфекции дикого типа. Чтобы подтвердить такое предположение, белок, в котором зеленый флуоресцентный белок (GFP) слит с белком CBD, был получен из трансгенных E. coli и использован в качестве антигена для инъекции в мышь, а затем специфические антитела против GFP и CBD были идентифицированы с помощью ELISA в сыворотке, полученной после инъекции слитого белка в качестве антигена мышам. В данном случае в качестве антигена были протестированы несколько белков, полученных из разных источников.

Как показано на фиг. 10, поскольку сыворотка мыши, которой инъецировали GFP-CBD, полученный из E.coli, демонстрировала повышенную оптическую плотность по отношению к различным белкам GFP, то это демонстрирует, что α-GFP IgG легко продуцировалось, и α-CBD IgG против различных типов белков CBD также продуцировалось с высоким титром.

Таким образом, было подтверждено, что белки CBD, слитые в антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый растением, по настоящему изобретению приводят к продуцированию каждого типа специфических антител независимо от типа белка-мишени. Кроме того, антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый растением (рекомбинантный слитый белок, содержащий антигенный белок GP55 из CSFV и белок CBD) включает антигенный белок GP55 из CSFV, который может быть использован в качестве антигена. Так как антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый растением, также включает белок CBD, специфические антитела против белка CBD могут быть использованы для обнаружения инфекции, а также для определения пути воздействия вируса у животного при вакцинации или естественной инфекции.

Пример 7. Подтверждение защитной способности антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, у целевого животного (свиньи).

7-1. Инокуляция целевого животного (свиньи) антигенным белком pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением

Чтобы подтвердить защитную способность антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, в свиной животной модели, был проведен следующий эксперимент.

В частности, как показано на фиг. 11, были отобраны восемь свиней, отрицательных по антителам к классической чуме свиней, для использования в эксперименте. Среди них четыре свиньи использовали в качестве контрольной группы, которая не была вакцинирована антигенным белком pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемым растением, а в экспериментальных группах в одной группе каждую из двух свиней вакцинировали один раз 100 мкг антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, а в другой группе каждую из оставшихся двух свиней дважды за две недели вакцинировали 100 мкг антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением. Чтобы исследовать защиту от вируса дикого типа, CSFV дикого типа (штамм Yeoncheon: выделенный из корейских диких кабанов в 2012 году) инокулировали в концентрации 10 ^ 6,0 TCID 50/мл. Заражение было выполнено через 14 дней после инокуляции антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением. Две недели спустя эксперимент был прекращен, а затем животные были убиты для вскрытия.

7-2. Мониторинг клинических симптомов свиней после заражения

Было исследовано, имели ли свиньи, зараженные антигенным белком pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемым растением, высокий уровень лихорадки, которая является типичным симптомом фебрильных заболеваний, после заражения штаммом дикого типа. Результат представлен на фиг. 12.

Как показано на фиг. 12, было подтверждено, что четыре свиньи контрольной группы, которые не были инокулированы белком pmE2 по настоящему изобретению, начали демонстрировать повышенную температуру тела через 3 дня после заражения, при этом температура тела повышалась до более чем 40 градусов после 7 дней, и такая высокая температура поддерживалась до 11 дней. С другой стороны, у всех свиней, инокулированных белком pmE2 по настоящему изобретению один или два раза, температура тела не повышалась, и сохранялась ниже 40 градусов в течение 10 дней после заражения.

Кроме того, когда свиньи были инфицированы CSFV, уровень лейкоцитов обычно снижался ниже 9000, и поэтому был проведен эксперимент, описанный ниже, для исследования ингибирования снижения уровня лейкоцитов при инокуляции pmE2 по настоящему изобретению. Результат представлен на фиг. 13.

Как показано на фиг. 13, четыре свиньи контрольной группы продемонстрировали снижение уровня лейкоцитов через три дня после заражения, а на 7-й день уровни лейкоцитов всех четырех свиней были снижены ниже 9000. С другой стороны, хотя свиньи, инъецированные pmE2 по настоящему изобретению, имеют индивидуальные различия, было подтверждено, что через 10 дней после заражения уровни лейкоцитов всех свиней поддерживались на уровне более чем 9000.

Поэтому было подтверждено, что вакцинированные индивидуумы не проявляли клинических симптомов, связанных с классической чумой свиней, и соответственно инокуляция с белком pmE2 по настоящему изобретению была эффективной для защиты от CSFV.

7-3. Мониторинг детекции антигена в крови и образцах свиней после заражения

Чтобы подтвердить ингибирование распространения вируса белком pmE2 по настоящему изобретению после заражения, и подтвердить обнаружение антигена в крови и образцах свиней, был проведен следующий эксперимент.

В частности, на 3, 5, 7 и 10 дней после заражения отбирали цельную кровь, ринорею, слюну и кал свиней контрольной и экспериментальной групп, и с помощью ПЦР определяли антигены штамма дикого типа. ПЦР проводили для амплификации 5'NCR области (421 п.о.) в условиях 30 мин/42°С, 15 мин/94°С, (40 циклов: 30 с/94°С, 30 сек/55°С, 45 сек/72°С), и 5 мин/72°С. Результат представлен на фиг. 14.

Как показано на фиг. 14, на третий день после заражения у свиней контрольной группы антигены были обнаружены в цельной крови, а на 5-й день также были обнаружены антигены в ринорее, слюне и кале. С другой стороны, у свиней, инокулированных вакциной pmE2 по настоящему изобретению один раз, антигены не были обнаружены в ринорее и слюне, но были обнаружены в цельной крови, и многие образцы показали слабые положительные ответы. Кроме того, антиген не был обнаружен у одной из свиней, инокулированных вакциной pmE2 по настоящему изобретению дважды, при обследовании через три-десять дней после заражения, а у другой свиньи слабые антигенные ответы были показаны в кале на 3-й день, в цельной крови на 5-й день и в ринорее на 7-й день после заражения.

Поэтому было подтверждено, что из-за обработки белком pmE2 по настоящему изобретению амплификация вируса in vivo и его распространение были ингибированы.

7-4. Исследование детекции антигена в органах свиньи после заражения

Через 14 дней после заражения свиньи контрольных и экспериментальных групп были убиты для вскрытия и подвергнуты ПЦР для обнаружения антигенов использованного в заражении штамма дикого типа в различных органах, для исследования влияния белка pmE2 по настоящему изобретению на амплификацию вируса в органах свиньи. Результат представлен на фиг. 15.

Как показано на фиг. 15 у свиней контрольной группы выявленные вирусные антигены были обнаружены во всех органах из числа миндалин, сердца, почек, легких, печени, селезенки, тонкого кишечника, толстого кишечника, подчелюстного лимфатического узла, паховой области и брыжейки, тогда как у свиней, инъецированных белком pmE2 по настоящему изобретению, вирусные антигены были обнаружены в миндалинах, подчелюстном лимфатическом узле и в брыжейке, но не были обнаружены в сердце, почках, легких, печени, тонком кишечнике и толстом кишечнике. Кроме того, у одной из свиней, инъецированных белком pmE2 по настоящему изобретению дважды, антигены были обнаружены в миндалинах, и слабые положительные ответы были показаны в подчелюстном лимфатическом узле, паховой области и брыжейке, но во всех органах другой свиньи антигены не были обнаружены.

Поэтому было видно, что вакцина pmE2 по настоящему изобретению способна защитить свиней от вирусной атаки и оказывать дозозависимый эффект.

7-5. Подтверждение титра антител против антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого в растении

Был исследован ключевой показатель, представляющий предотвращаемость классической вакцины против чумы свиней, которым является титр защитных антител, и результат представлен на фиг. 16.

Как показано на фиг. 16, видно, что в контрольной группе титры антител были не более 10 до и после заражения, но у свиней, инъецированных антигенным белком pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемым в растении, по настоящему изобретению, титры антител резко выросли после заражения штаммом вируса дикого типа. Было подсчитано, что антитела, способные нейтрализовать вирус лихорадки, были предварительно запомнены из-за pmE2 по настоящему изобретению, а затем усилены вирусным заражением. Кроме того, у свиней, инокулированных белком pmE2 по настоящему изобретению, защитные титры антител составляли соответственно 16 и 8 до заражения, а затем через 5 дней после заражения титры составляли 32. Позже, спустя 14 дней после заражения, титры составляли 512. Было подтверждено, что у двух свиней, дважды инокулированных вакциной pmE2, через 14 дней после вакцинации титры составляли 16, через 28 дней после вакцинации, были показаны высокие титры защитных антител 512 и 2048, соответственно, а после вакцинации, титры антител дополнительно выросли до 4096.

Клинически считается, что когда титр защитных антител составляет 32 или более, то они обладают защитной способностью. В связи с этим было продемонстрировано, что антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, по настоящему изобретению обладает превосходной способностью к защите свиней от CSFV.

Далее будут описаны примеры получения фармацевтических и кормовых композиций по настоящему изобретению, но эти примеры предназначены не для ограничения настоящего изобретения, а для его конкретного объяснения.

Пример получения 1. Получение фармацевтической композиции

1-1. Получение порошка

Антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, 20 мг

Лактоза 100 мг

Тальк 10 мг

Порошок готовят путем смешивания вышеуказанных компонентов и заполнения смесью герметичного пакета.

1-2. Получение таблетки

Антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, 10 мг

Кукурузный крахмал 100 мг

Лактоза 100 мг

Стеарат магния 2 мг

Таблетку готовили смешиванием вышеуказанных компонентов и прессованием смеси с помощью пуансона.

1-3. Приготовление капсулы

Антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, 10 мг

Кристаллическая целлюлоза 3 мг

Лактоза 14,8 мг

Стеарат магния 0,2 мг

Капсулу получали смешиванием вышеуказанных компонентов и заполнением смеси в желатиновой капсуле в соответствии с обычным способом получения капсулы.

1-4. Приготовление инъекции

Антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, 10 мг

Маннит 180 мг

Стерилизованная дистиллированная вода для инъекций 2974 мг

Na₂HPO₄2H₂O 26 мг

Инъекцию готовили с вышеуказанным содержанием компонентов на ампулу (2 мл) в соответствии с обычным способом получения инъекции.

1-5. Подготовка жидкого лекарственного средства

Антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, 20 мг

Изомероза 10 г

Маннит 5 г

Дистиллированная вода в достаточном количестве

Жидкое лекарственное средство готовили путем растворения вышеуказанных компонентов в дистиллированной воде, добавления подходящего количества ароматизатора лимона для смешивания с вышеуказанной смесью, добавления дистиллированной воды к смеси для регулирования общего объема до 100 мл и заполнения полученным раствором коричневого флакона с последующей стерилизацией флакона в соответствии с обычным способом приготовления жидких составов.

Пример получения 2. Приготовление кормовой композиции

Антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, 100 мг

Витамин Е 0,7 мг

L-карнитин 0,7 мг

Корм был приготовлен смешением вышеуказанных компонентов обычным способом для получения корма.

1. Рекомбинантный вектор для получения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого в растениях, включающий:

промотор CaMV 35S;

5’UTR (M17) (SEQ ID NO: 3);

полинуклеотид, кодирующий шаперон-связывающий белок (BiP) (SEQ ID NO: 4); полинуклеотид, кодирующий белок GP55 вируса классической чумы свиней (CSFV) (SEQ ID NO: 1); и

полинуклеотид, кодирующий белок домена, связывающего целлюлозу (CBD) (SEQ ID NO: 2).

2. Рекомбинантный вектор по п. 1, отличающийся тем, что рекомбинантный вектор включает одно или несколько из выбранных из группы, состоящей из полинуклеотида, кодирующего белок His-Asp-Glu-Leu (HDEL) (SEQ ID NO: 6) и терминатора NOS.

3. Рекомбинантный вектор по п. 1, отличающийся тем, что рекомбинантный вектор включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5.

4. Рекомбинантный вектор по п. 1, отличающийся тем, что рекомбинантный вектор представлен следующей векторной картой:

Карта

5. Трансформированное растение для получения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого в растениях, которое трансформируется любым из рекомбинантных векторов по пп. 1-4.

6. Антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, экспрессируемый в трансформированном растении по п. 5,

где продуцируемый в растениях антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней содержит слияние белка GP55 из CSFV с белком домена, связывающего целлюлозу (CBD), и

где продуцируемый в растениях антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней индуцирует реакцию антиген-антитело с антителами против CSFV.

7. Способ получения антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого в растениях, отличающийся тем, что включает:

(а) трансформацию Agrobacterium рекомбинантным вектором по п. 1;

(b) введение трансформированных Agrobacterium в растение и

(c) выделение и очистку антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, экспрессированного в растении.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что растение является одним или несколькими из группы, состоящей из Arabidopsis thaliana, пшеницы, ячменя, кукурузы, бобов, картофеля, красной фасоли, овса, сорго, риса, китайской капусты, дайкона, перца, клубники, помидора, арбуза, огурца, капусты, восточной дыни, тыквы, валлийского лука, лука, моркови, женьшеня, табака, хлопка, кунжута, сахарного тростника, свеклы, периллы, арахиса, рапса, яблони, груши, ююбы, персика, киви, винограда, мандарина, хурмы, сливы, абрикоса, банана, розы, гладиолуса, герберы, гвоздики, хризантемы, лилии, тюльпана, райграса, красного клевера, ежи сборной, люцерны, овсяницы тростниковой и многолетнего райграса.

9. Состав вакцины для предотвращения классической чумы свиней, отличающийся тем, что включает:

антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, по п. 6 в качестве активного ингредиента.

10. Фармацевтическая композиция для предотвращения классической чумы свиней, отличающийся тем, что включает:

антигенный белок pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемый в растениях, по п. 6 в качестве активного ингредиента,

где фармацевтическая композиция содержит от 0,1 до 1000 мкг белка на мл стерильного раствора.

11. Способ предотвращения классической чумы свиней, отличающийся тем, что включает:

введение животному вакцинной композиции по п. 9.

12. Способ определения пути продуцирования антител вируса классической чумы свиней (CSFV), отличающийся тем, что включает:

1) введение вакцинной композиции по п. 9 экспериментальному объекту и затем сбор крови у экспериментального объекта;

2) выделение сыворотки из крови, собранной на стадии 1); и

3) обработку сыворотки, выделенной на стадии 2), с использованием антигенного белка pmE2 вируса классической чумы свиней, продуцируемого растением, по п. 6 в качестве антигена для индукции реакции.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что при реакции на стадии 3), когда антитела против белка GP55 из CSFV и белка домена, связывающего целлюлозу (CBD), детектируют вместе, антитела, образованные у экспериментального объекта, по-видимому, продуцируется из-за введения вакцинной композиции по п. 9.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что при реакции на стадии 3), если обнаружены только антитела против белка GP55 из CSFV, то считается, что они продуцируются в ответ на инфекцию CSFV.