Биопроизводство лентивирусных векторов

Изобретение относится к биотехнологии. Описана лентивирусная векторная трансферная плазмида, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую векторную кассету TL20c, нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал упаковки; нуклеотидную последовательность, кодирующую центральный полипуриновый тракт; нуклеотидную последовательность, кодирующую респонсивный элемент Rev; и нуклеотидную последовательность, кодирующую самоинактивирующийся длинный концевой повтор; и где плазмида включает сайт множественного клонирования, включающий четыре сайта рестрикционных эндонуклеаз, где четыре сайта рестрикционных нуклеаз выбраны из группы, состоящей из BstBI, MluI, NotI, ClaI, ApaI, XhoI, XbaI, HpaI, NheI, PacI, NsiI, SphI, Sma/Xma, AccI, BamHI и SphI. Представлена конкатамерная матрица для применения в получении и/или трансфекции упаковывающей клеточной линии, содержащая фрагменты ДНК, полученные из векторной кассеты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. Описана упаковочная клеточная линия, трансфицированная конкатамерной матрицей по любому из пп. 11, 12, для получения стабильной линии клеток-продуцентов, где упаковочная клеточная линия представляет собой GPRG. Также описана стабильная клеточная линия-продуцент, выбранная из трансфицированной упаковочной клеточной линии по п. 13. Изобретение обеспечивает способ получения стабильной линии клеток-продуцентов. Получение стабильных линий клеток-продуцентов, таких как представленные в соответствии с настоящим изобретением, повышает воспроизводимость и простоту создания лентивирусных стоков с высоким титром, одновременно уменьшая проблемы биобезопасности, а изменение экспрессируемых белков оболочки определяет тропизм получаемого вируса. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 20 ил., 5 табл., 7 пр.

 

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет даты подачи предварительной заявки на патент США № 62/161,133 от 13 мая 2015 года; а также заявляет приоритет даты подачи предварительной заявки на патент США № 62/161, 152, поданной 13 мая 2015 года, раскрытие которых включено в данный документ ссылкой в полном объеме.

Область техники, к которой принадлежит изобретение

Это раскрытие, в общем, относится к областям молекулярной биологии и вирусологии. В частности, раскрытие относится к биопроизводству лентивирусных векторов и лентивирусных трансферных плазмид.

Заявление о промышленной применимости

Настоящее раскрытие имеет промышленную применимость в области генной терапии и биопроизводства.

Предшествующий уровень техники

ВИЧ-1 является возбудителем синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) с порядка 30 миллионами инфицированных во всем мире. ВИЧ вызывает сбои в работе иммунной системы и увеличивает вероятность смерти из-за оппортунистических инфекций. ВИЧ-инфекция является одной из основных проблем глобального здравоохранения, о чем свидетельствует ее определение в качестве пандемии Всемирной организацией здравоохранения. У большинства людей, инфицированных ВИЧ, особенно в развивающихся странах, в конечном итоге развивается СПИД, который ежегодно уносит жизни более миллиона человек.

ВИЧ-1 относится к семейству вирусов Retroviridae и представляет собой покрытый оболочкой вирус, геном которого состоит из двух одноцепочечных молекул РНК (ssRNA). Первичной мишенью ВИЧ-1 является CD4+ экспрессирующие клетки, такие как CD4+ Т-клетки. Гликопротеин вируса ВИЧ-1 взаимодействует с молекулой CD4 клеток-мишеней и с хемокиновыми рецепторами, CCRS или CXCR4 на поверхности клеток-мишеней. После слияния и входа в клетку-мишень нуклеокапсид, содержащий вирусный геном, диссоциирует, высвобождая содержимое вируса, включающее ssRNA, в цитоплазму. Фермент обратной транскриптазы (RT) ВИЧ-1 синтезирует вирусную двухцепочечную ДНК (dsDNA) из генома ssRNA. После синтеза двухцепочечной молекулы ДНК ВИЧ-1 интегрируется в геном хозяина.

Интегрированная ДНК ВИЧ-1 фланкирована идентичными последовательностями 5'- и 3'-длинных концевых повторов (LTR), с которых ВИЧ-1 может инициировать транскрипцию интегрированного генома ВИЧ-1. Транскрипция вирусной ДНК требует факторов транскрипции, таких как NF-kB, которые активируются в активированных Т-клетках. Как следствие, вирусная транскрипция наиболее активна в Т-клетке после активации Т-клетки, например, во время инфекции. Вирусная РНК, полученная в результате транскрипции интегрированного генома ВИЧ-1, впоследствии транслируется и упаковывается в вирусные частицы, которые затем выходят из клетки, чтобы стать инфекционным вирусом.

Терапия инфекции ВИЧ-1 включает комбинированную антиретровирусную терапию (cART). cART, которая включает комбинации нуклеозидных аналогов ингибиторов обратной транскриптазы, ингибиторов протеазы, ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы, ингибиторов интегразы и слияния, замедляет прогресс ВИЧ. Это, в свою очередь, резко снижает уровень заболеваемости и смертности от ВИЧ/СПИД в регионах мира, где имеется терапия. Однако cART не вылечивает или полностью не устраняет все симптомы ВИЧ/СПИД. Кроме того, терапия cART может быть скомпрометирована мутациями, устойчивыми к лекарственным средствам, и имеет ряд побочных эффектов, которые могут быть серьезными и кажутся кумулятивными. Кроме того, прерывание терапии почти всегда приводит к повторному появлению выявляемой вирусной репликации и прогрессу СПИД и, как было показано, связано с увеличением числа всех причин смертности и серьезных не связанных со СПИД событий. По этим причинам, а также из-за высокой стоимости лечения и необходимости строгого соблюдения, такая терапия может быть относительно неэффективной для большого числа пациентов.

Лентивирусные векторы на основе ВИЧ быстро стали альтернативной ретровирусной векторной системой для исследований и клинических применений по переносу генов. Повышенная способность лентивирусных векторов трансформировать как покоящиеся стволовые клетки, так и не делящиеся терминально дифференцированные клетки, привела к разработке широкого спектра векторов доставки терапевтических генов, а также перспективных исследовательских инструментов, таких как библиотеки нокаута генов с помощью коротких шпилечных РНК (shRNA) и векторы для индукции плюрипотентности в терминально дифференцированных клетках. Ранние гамма-ретровирусные векторы для клинической генной терапии восстановили иммунную функцию у пациентов с Х-связанным тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID-X1), но впоследствии было обнаружено, что они вызывают пролиферативные расстройства из-за трансактивации протоонкогенов. Новые лентивирусные векторные конструкции могут значительно снизить этот риск, и они ждут клинического тестирования для окончательной проверки их прогнозируемой безопасности. Данная область постоянно меняется, и результаты клинического тестирования непредсказуемы.

Масштабное получение SIN-лентивирусных векторов для поддержки клинических испытаний является важной задачей в этой области. В то время как гамма-ретровирусные векторы могут быть получены либо с помощью транзиторной трансфекции, либо с образованием клеточных линий стабильных продуцентов, лентивирусы требуют экспрессии множества цитотоксичных вспомогательных генов, что делает более сложным получение клеток-продуцентов (Greene et al., Transduction of Human CD34+ Repopulating Cells with a Self – Inactivating Lentiviral Vector for SCID-Xl Produced at Clinical Scale by a Stable Cell Line, HGTM, 23, 297-308 (октябрь 2012 г.), которая полностью включена в настоящее описание ссылкой). Транзиторная трансфекция - это современная технология пилотного производства LV, которая непрактична для крупномасштабных приложений с точки зрения безопасности, стоимости и воспроизводимости. Фактически, эта технология является дорогостоящей, ее трудно стандартизировать и масштабировать, и она страдает вариативностью между партиями и низкой точностью обратной транскриптазы (Stornaiuolo et al., RD2-MolPack-Chim3, a Packaging Cell Line for Stable Production of Lentiviral Vectors for Anti-HIV Gene Therapy, HGTM, 24:228-240 (август 2013 г.), который полностью включен в настоящее описание ссылкой).

Сущность изобретения

В одном аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность идентична, по меньшей мере, 95% последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых воплощениях лентивирусный вектор получают из плазмиды. В некоторых воплощениях полученный лентивирусный вектор содержит одну или несколько дополнительных последовательностей, кодирующих короткую шпилечную РНК для отрицательной регуляции корецептора ВИЧ-1 и/или ингибитор слияния ВИЧ-1. В некоторых воплощениях лентивирусный вектор, полученный из него, представляет собой LVsh5/C46 (как определено в данном документе).

В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1. В некоторых воплощениях лентивирусный вектор получают из плазмиды. В некоторых воплощениях полученный лентивирусный вектор содержит одну или несколько дополнительных последовательностей, кодирующих короткую шпилечную РНК для отрицательной регуляции корецептора ВИЧ-1 (например, CCR5) и/или ингибитор слияния ВИЧ-1 (например, C46). Информация, относящаяся к CCR5 и C46, включая их нуклеотидные последовательности, изложена дополнительно в публикации пат. США № US2012/0201794, раскрытие которой включено в данном документе ссылкой в полном объеме.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 80% последовательности SEQ NO: 2. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ NO: 2. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 95% последовательности SEQ NO: 2. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 97% последовательности SEQ NO: 2. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность SEQ NO: 2. В некоторых воплощениях лентивирусный вектор получают из плазмиды. В некоторых воплощениях полученный лентивирусный вектор содержит одну или несколько дополнительных последовательностей, кодирующих короткую шпилечную РНК для отрицательной регуляции корецептора ВИЧ-1 (например, CCR5) и/или ингибитор слияния ВИЧ-1 (например, C46).

В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, имеющая последовательность, которая отличается не более чем на 500 нуклеотидов от последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1 (например, непоследовательно или последовательно). В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, имеющая последовательность, которая отличается не более чем 250 нуклеотидами от последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1 (например, непоследовательно или последовательно). В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, имеющая последовательность, которая отличается не более чем на 150 нуклеотидов от последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1 (например, непоследовательно или последовательно). В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, имеющая последовательность, которая отличается не более чем на 100 нуклеотидов из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1 (например, непоследовательно или последовательно). В некоторых воплощениях последовательность отличается не более чем 50 нуклеотидами от последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 (например, непоследовательно или последовательно).

В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, содержащая около 6500 нуклеотидов и около 6750 нуклеотидов, где плазмида включает последовательность или ее фрагмент, идентичный, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях плазмида содержит от около 6600 нуклеотидов до около 6700 нуклеотидов. В некоторых воплощениях плазмида содержит около 6611 нуклеотидов.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, показанная на фиг. 11 как pUC57-TL20c. В некоторых воплощениях лентивирусный вектор получают из плазмиды. В некоторых воплощениях полученный лентивирусный вектор включает одну или несколько дополнительных последовательностей, кодирующих короткую шпилечную РНК для отрицательной регуляции корецептора ВИЧ-1 и/или ингибитор слияния ВИЧ-1.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, содержащая сайт множественного клонирования, состоящий в основном из сайтов эндонуклеаз рестрикции BstBI, MluI, NotI и ClaI. В некоторых воплощениях плазмида дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал упаковки; нуклеотидную последовательность, кодирующую центральный полипуриновый тракт; нуклеотидную последовательность, кодирующую Rev-респонсивный элемент; и нуклеотидную последовательность, кодирующую самоиннактивирующийся длинный концевой повтор. В других воплощениях плазмида содержит сайт множественного клонирования, состоящий из сайтов эндонуклеаз рестрикции BstBI, MluI, NotI и ClaI. В некоторых воплощениях лентивирусный вектор получают из плазмиды. В некоторых воплощениях полученный лентивирусный вектор содержит одну или несколько дополнительных последовательностей, кодирующих короткую шпилечную РНК для отрицательной регуляции корецептора ВИЧ-1 и/или ингибитор слияния ВИЧ-1.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, содержащая (а) нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал упаковки; (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую центральный полипуриновый тракт (cPPT); (c) нуклеотидную последовательность, кодирующую Rev-респонсивный элемент; (d) нуклеотидную последовательность, кодирующую самоиннактивирующийся длинный концевой повтор; и (e) нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт множественного клонирования, имеющий сайты рестрикции для ферментов BstBI, Mlu I, Not I и Cla I. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал упаковки, включает последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая центральный полипуриновый тракт (cPPT), включает последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая Rev-респонсивный элемент, включает последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая самоиннактивирующийся длинный концевой повтор, включает последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт множественного клонирования, включает последовательность SEQ ID NO: 7.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, содержащая (а) упаковочную последовательность, которая присутствует от около нуклеотида 762 до около нуклеотида 1104 нуклеотидной последовательности плазмиды; (b) центральный полипуриновый тракт, который присутствует от нуклеотида 1121 до около нуклеотида 1597 нуклеотидной последовательности плазмиды; (c) Rev-респонсивный элемент, который присутствует от около нуклеотида 1598 до около нуклеотида 2366 нуклеотидной последовательности плазмиды; (d) самоиннактивирующийся длинный концевой повтор, который присутствует от около нуклеотида 409 до около нуклеотида 589 нуклеотидной последовательности плазмиды; и (e) сайт множественного клонирования, который присутствует от около нуклеотида 2376 до около нуклеотида 2400 нуклеотидной последовательности плазмиды. В некоторых воплощениях плазмидная нуклеотидная последовательность включает последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал упаковки, включает последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая центральный полипуриновый тракт (cPPT), включает последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая Rev-респонсивный элемент, включает последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая самоиннактивирующийся длинный концевой повтор, включает последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт множественного клонирования, включает последовательность SEQ ID NO: 7.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, содержащая сайт множественного клонирования, включающий сайты рестрикционных эндонуклеаз BstBI, MluI, NotI и ClaI, где плазмида содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 80% последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых воплощениях лентивирусный вектор получают из плазмиды. В некоторых воплощениях полученный лентивирусный вектор содержит одну или несколько дополнительных последовательностей, кодирующих короткую шпилечную РНК для отрицательной регуляции корецептора ВИЧ-1 и/или ингибитора слияния ВИЧ-1.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую векторный каркас, идентичную, по меньшей мере, на 95% последовательности SEQ ID NO: 2, и где векторный каркас фланкирован, по меньшей мере, двумя дополнительными сайтами рестрикционных эндонуклеаз, где, по меньшей мере, два дополнительных сайта рестрикционных эндонуклеаз независимо выбраны из группы, состоящей из sfiI и Bsu36I. В некоторых воплощениях лентивирусный вектор получают из плазмиды. В некоторых воплощениях полученный лентивирусный вектор содержит одну или несколько дополнительных последовательностей, кодирующих короткую шпилечную РНК для отрицательной регуляции корецептора ВИЧ-1 и/или ингибитора слияния ВИЧ-1.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую векторный каркас, идентичный, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 2, векторный каркас, содержащую сайт множественного клонирования, имеющий сайты рестрикционных эндонуклеаз BstBI, MluI, NotI и ClaI, где плазмида дополнительно содержит тетрациклин-репрессируемый промотор перед векторным каркасом. В еще одном аспекте настоящего раскрытия представлена плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую векторный каркас, идентичный, по меньшей мере, на 85% последовательности SEQ ID NO: 2, где векторный каркас включает сайт множественного клонирования, имеющий сайты рестрикционных эндонуклеаз BstBI, MluI, NotI и ClaI.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена клетка, содержащая плазмиду или лентивирусный вектор, полученные из них, как описано в данном документе. В некоторых воплощениях клетка представляет собой гемопоэтический предшественник/стволовую клетку, моноцит, макрофаг, мононуклеарную клетку периферической крови, CD4 + Т-лимфоцит, CD8 + Т-лимфоцит или дендритную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения предлагается набор, содержащий гемопоэтические предшественники/стволовые клетки в первом контейнере и плазмиду по фиг. 11 или лентивирусный вектор, полученный из нее.

В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ получения стабильной линии клеток-продуцентов, включающий: (а) синтез лентивирусного вектора путем клонирования одного или нескольких генов в плазмиду, как описано в данном документе, например pUC57-TL20c; (b) получение фрагментов ДНК из синтезированного лентивирусного вектора; (c) формирование конкатемерной матрицы из полученных фрагментов ДНК синтезированного лентивирусного вектора и из фрагментов ДНК плазмиды с кассетой устойчивости к антибиотику; (d) трансфекцию упаковочной клеточной линии GPR, GPRG, GPRT, GPRGT или GPRT-G или ее производного с образованной контамерной матрицей; и (e) выделение одного или нескольких стабильных клонов линии клеток-продуцентов. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает индуцирование стабильной продуцирующей клеточной линии для продуцирования лентивирусного вектора.

В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ получения стабильной линии клеток-продуцентов, включающий: (а) синтез лентивирусного вектора, который кодирует короткую шпилечную РНК для снижения регуляции корецептора ВИЧ-1 и который кодирует ингибитор слияния ВИЧ-1, лентивирусный вектор, синтезированный путем клонирования кДНК, кодирующей как короткую шпилечную РНК, так и ингибитор слияния, в плазмиде, описанной в данном документе; (b) получение фрагментов ДНК из синтезированного лентивирусного вектора; (c) формирование конкатемерной матрицы из полученных фрагментов ДНК из синтезированного лентивирусного вектора и из фрагментов ДНК плазмиды с кассетой устойчивости к антибиотику; (d) трансфекция упаковочной клеточной линии GPR, GPRG, GPRT, GPRGT или GPRT-G или ее производного сформированной контамерной матрицей, и (e) выделение одного или нескольких клонов стабильной линии клеток-продуцентов. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает индуцирование стабильной линии клеток-продуцентов для продуцирования лентивирусного вектора, который кодирует короткую шпилечную РНК для отрицательной регуляции корецептора ВИЧ-1 и который кодирует ингибитор слияния ВИЧ-1 (LVsh5/C46).

В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ сбора содержащей вектор надосадочной жидкости стабильной линии клеток-продуцентов, где содержащую вектор надосадочную жидкость собирают примерно каждые 48 часов. В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ сбора содержащей вектор надосадочной жидкости из стабильной линии клеток-продуцентов, где содержащую вектор надосадочную жидкость собирают каждые 40-56 часов.

В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ сбора содержащей вектор надосадочной жидкости, содержащей лентивирусный вектор LVsh5/C46, где содержащую вектор надосадочную жидкость собирают примерно каждые 48 часов.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена стабильная линия клеток-продуцентов, подходящая для получения LVsh5/C46. В некоторых воплощениях стабильная линия клеток-продуцентов основана на упаковочной клеточной линии GPRG. В некоторых воплощениях стабильная линия клеток-продуцентов основана на упаковочной клеточной линии GPRT. В некоторых воплощениях стабильная линия клеток-продуцентов основана на упаковочной клеточной линии GPR. В некоторых воплощениях стабильная линия клеток-продуцентов основана на упаковочной клеточной линии GPRT-G.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена стабильная линия клеток-продуцентов, подходящая для получения самоинактивирующегося лентивирусного вектора, идентичного, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 8. В некоторых воплощениях стабильная линия клеток-продуцентов основана на упаковочной клеточной линии GPRG. В некоторых воплощениях стабильная линия клеток-продуцентов основана на упаковочной клеточной линии GPRT. В некоторых воплощениях стабильная линия клеток-продуцентов основана на упаковочной клеточной линии GPR. В некоторых воплощениях стабильная линия клеток-продуцентов основана на упаковочной клеточной линии GPRT-G.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена конкатемерная матрица, содержащая фрагменты ДНК из первой плазмиды и второй плазмиды; где первая плазмида получена из pUC57-TL20c; вторая плазмида включает кассету устойчивости к антибиотику блеомицину; где отношение фрагментов ДНК из первой плазмиды ко второй плазмиде находится в пределах от около 50:1 до около 1:50. В некоторых воплощениях отношение фрагментов ДНК первой плазмиды ко второй плазмиде составляет от около 25:1 до около 1:25. В некоторых воплощениях отношение фрагментов ДНК первой плазмиды ко второй плазмиде составляет от около 15: 1 до около 1:15.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена стабильная линия клеток-продуцентов, где стабильная линия клеток-продуцентов получена путем трансфекции упаковочной клеточной линии, выбранной из группы, состоящей из GPR, GPRG, GPRT, GPRT-G и их производных конкатамерной матрицей, где конкатамерная матрица содержит фрагменты ДНК из первой плазмиды и второй плазмиды; где первая плазмида получена из pUC57-TL20c; вторая плазмида содержит кассету устойчивости к антибиотику блеомицину; где отношение фрагментов ДНК первой плазмиды ко второй плазмиде составляет от около 25:1 до около 1:25. В некоторых воплощениях стабильная линия клеток-продуцентов продуцирует LVsh5/C46. В некоторых воплощениях LVsh5/C46 может собираться примерно каждые 48 часов.

В другом аспекте настоящего изобретения представлен выделенный вектор, имеющий карту плазмиды по фиг. 11, который включает сайт множественного клонирования, и имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.

В другом аспекте настоящего изобретения представлен набор, содержащий (1) плазмиду, описанную в данном документе, и (2) кассету с устойчивостью к блеомицину. В некоторых воплощениях набор дополнительно включает инструкции для получения лентивирусного вектора и/или конкатамерной матрицы, например, в соответствии с процедурами, описанными в данном документе.

В другом аспекте настоящего изобретения представлен набор, содержащий (а) лентивирусную трансферную векторную плазмиду, описанную в данном документе; и (b) упаковочные клетки. В некоторых воплощениях упаковочные клетки выбирают из группы, состоящей из GPR, GPRG, GPRT, GPRTG и их производных. В некоторых воплощениях набор дополнительно включает кассету с устойчивостью к блеомицину. В некоторых воплощениях набор дополнительно включает инструкции для получения лентивирусного вектора и/или конкатамерной матрицы, например, в соответствии с процедурами, описанными в данном документе.

В другом аспекте настоящего изобретения представлен лентивирусный вектор, полученный из плазмиды, как описано в данном документе. В некоторых воплощениях лентивирусный вектор содержит, по меньшей мере, одну дополнительную нуклеотидную последовательность. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, одна дополнительная нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, которая кодирует короткую шпилечную РНК для отрицательной регуляции корецептора ВИЧ-1 и нуклеотидную последовательность, которая кодирует ингибитор слияния ВИЧ-1. В некоторых воплощениях лентивирусный вектор представляет собой LVsh5/C46. В некоторых воплощениях лентивирусный вектор включает последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 95% последовательности SEQ ID NO: 8.

В другом аспекте настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция, содержащая лентивирусный вектор, описанный выше, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемый носитель включает растворители, буферы, растворы, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и агенты задержки абсорбции и тому подобное, приемлемые для применения в фармацевтических препаратах, таких как фармацевтические препараты, подходящие для введения людям. Способы получения соединений с фармацевтическими носителями известны в данной области и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Science, (17th ed. Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1985); и Goodman & Gillman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics (11th Edition, McGraw-Hill Professional, 2005); раскрытие каждой из которых включено в настоящее описание ссылкой во всей их полноте.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показано, что один и тот же лентивирусный вектор получали повторно либо путем транзиторной трансфекции в клетках HEK293T/17 в соответствии с установленными процедурами, либо с использованием стабильной линии клеток-продуцентов на основе GPRG. Векторсодержащую среду (VCM) концентрировали в 100 раз ультрацентрифугированием, а лентивирусный (LV) титр определяли путем анализа генной трансдукции.

На фигуре 2 показана структурная схема последовательности операций, иллюстрирующая способ создания стабильной линии клеток-продуцентов и сбора лентивирусных векторов, продуцируемых полученной стабильной линией клеток-продуцентов.

На фигуре 3 показана оценка стабильности клеточной линии продуцента для двух разных клеточных линий MWCB в течение трехмесячного периода непрерывных пассажей. Через определенные промежутки времени LV индуцировались удалением тетрациклина (ТЕТ), а VCM оценивали по титру LV путем анализа генной трансдукции. Обе клеточные линии были стабильными и способны продуцировать LV более 1 е6/мл в течение трехмесячного периода и более чем около 25 пассажей.

На фигуре 4 показана кинетика продуцирования лентивирусного вектора после индукции путем удаления ТЕТ. Векторный титр оценивали в VCM методом генной трансдукции. Во всех случаях стабильные линии продуцирования GPRG способны поддерживать продукцию LV на уровнях выше 1е6 TU/ мл (без концентрирования) в течение, по меньшей мере, 5 дней после индукции.

На фигуре 5 показана кинетика продуцирования лентивирусных векторов устойчивыми клеточными линиями. (A) Во время продуцирования вектора среду заменяли свежей средой ежедневно (n) или каждые 2 дня (☐). (B) Общее количество LV в собранной среде титровали на клетках 293T. Приведенные данные представляют собой средние значения ± SD (N = 2). TU, единицы трансдукции.

Фигура 6-(А) иллюстрирует клетки GPRG и 293T, индуцированные в среде без доксициклина (Dox). Индуцированные клетки окрашивали анти-VSVG антителами для определения экспрессии VSVG и измеряли проточной цитометрией; (B) иллюстрирует способность GPRG продуцировать LV, что оценивали после продолжительной культуры.

Фигура 7 иллюстрирует продуцирование лентивирусов в разных условиях культивирования. (A) Культивируется/продуцируется в сывороткосодержащей среде. (B, слева). Культивируется в сывороткосодержащей/продуцируется в бессывороточной среде; (B, справа). Культивируется/продуцируется в бессывороточной среде. D10: 500 мл DMEM/GlutaMAX ™; 50 мл FBS (10% масс./об.); 5 мл Pen/Strep; SFM: бессывороточная среда.

На фигуре 8 представлен анализ FACS клеток 293T или TF-1a, инкубированных либо со свежей средой (без вектора), либо с векторами LVsh5/C46.

На фигуре 9 показана количественная оценка копий лентивирусных векторов в инфицированных клетках. qPCR C46 использовали для определения количества копий вектора на геном хозяина после трансдукции в двух дозах (MOI = 1 или 0,3).

Фигура 10 - клетки Ghost-CCR5 трансдуцировали с помощью векторов LVsh5/C46. Сниженный уровень экспрессии CCR5 измеряли FACS.

На фигуре 11 представлена схема pUC57-TL20.

На фигуре 12 показан лентивирусный трансферный вектор на основе ВИЧ-1 в соответствии с некоторыми воплощениями настоящего изобретения. Этот конкретный трансферный вектор кодирует короткую шпилечную РНК (shRNA) для отрицательной регуляции корецептора CCR5 ВИЧ-1 в комбинации с ингибитором слияния ВИЧ-1 (C46).

Фигура 13 иллюстрирует индукцию лентивируса с использованием способов, описанных в данном документе, с сывороткой и без нее. Клетки, культивированные в бессывороточной среде, продуцировали почти столько же вируса, сколько культивированные с 10% PBS. Считается, что описанные в данном документе способы могут быть адаптированы к культурам, свободным от сыворотки.

На фигуре 14 показана структурная схема, иллюстрирующая способ получения фрагментов ДНК.

На фигуре 15 показана структурная схема, иллюстрирующая способ синтеза конкатамерной матрицы.

На фигуре 16 показана структурная схема, иллюстрирующая способ введения конкатамерной матрицы в упаковочную клеточную линию.

На фигуре 17 показана структурная схема, иллюстрирующая способ выбора трансфицированных клонов.

На фигуре 18 показана структурная схема, иллюстрирующая способ осуществления выделения одиночной колонии.

На фигуре 19 показана структурная схема, иллюстрирующая способ оценки вирусной продукции.

На фигурах 20А, 20В и 20С в целом описываются клетки-продуценты для синтеза векторов TL20-Cal1-wpre и TL20-Unc-GFP. На фигуре 20А показан проточный цитометрический анализ клеток 293Т, инкубированных либо со свежей средой (слева: без вектора), либо с TL20-Cal1-WPRE (справа), собранной из наиболее эффективного клона-продуцента. На фигуре 20В показан проточный цитометрический анализ клеток 293Т, инкубированных либо со свежей средой (темно-серый столбик: без вектора), либо с TL20-UbcGFP (светло-серый столбик), собранной из наиболее эффективного клона-продуцента. На фигуре 20С показана зависимость измеренных векторных титров надосадочных жидкостей из независимых клонов-продуцентов для создания вектора TL20-Cal1-WPRE (слева) или TL20-UbcGFP (справа). Векторы титровали на 293Т-клетках и анализировали с помощью проточной цитометрии. Наивысший титр, достигнутый для векторов, полученных с использованием поликлональных клеток-продуцентов (до отбора одиночного клона), обозначен пунктирной линией. Легенда: Ubc: промотор убиквитина C; GFP: усиленный зеленый флуоресцентный белок.

Подробное описание

В общем, настоящее раскрытие обеспечивает способ создания стабильной линии клеток-продуцентов. Получение стабильных линий клеток-продуцентов, таких как представленные в соответствии с настоящим изобретением, повышает воспроизводимость и простоту создания лентивирусных стоков с высоким титром, одновременно смягчая проблемы биобезопасности, и варьирование экспрессированных белков оболочки определяет тропизм полученного вируса. Настоящее раскрытие также предусматривает новую лентивирусную трансферную векторную плазмиду.

Используемые в данном документе термины единственного числа «a», «an» и «the» включают референты множественного числа, если контекст явно не указывает иное. Точно так же слово «или» предназначено для включения «и», если контекст явно не указывает иное.

Термины «содержащий», «включающий», «имеющий» и т.п. используются взаимозаменяемо и имеют одинаковое значение. Аналогично, «содержит», «включает», «имеет» и т.д., используются взаимозаменяемо и имеют одинаковое значение. В частности, каждый из терминов определяется в соответствии с общим определением «включающий» патентного права Соединенных Штатов и поэтому интерпретируется как открытый термин, означающий «по меньшей мере, следующее», и также интерпретируется не для исключения дополнительных признаков, аспектов и т.д. Таким образом, например, «устройство, имеющее компоненты a, b и c», означает, что устройство включает, по меньшей мере, компоненты a, b и c. Аналогично, фраза: «способ, включающий стадии a, b и c», означает, что этот способ включает, по меньшей мере, стадии a, b и c. Более того, хотя стадии и процессы могут быть описаны в данном документе в конкретном порядке, квалифицированный специалист признает, что порядок стадий и процессов может различаться.

Используемый в данном документе термин «клонирование» относится к процессу лигирования молекулы нуклеиновой кислоты в плазмиду и переносу ее в подходящую клетку-хозяина для дублирования во время размножения хозяина.

Используемый в данном документе термин «ВИЧ» включает не только ВИЧ-1, но также различные штаммы ВИЧ-1 (например, штамм BaL или штамм SF162) и различные подтипы ВИЧ-1 (например, подтипы A, B, C, D, F, GH, J и K).

Используемый в данном документе термин «сайт множественного клонирования» (MCS) относится к нуклеотидным последовательностям, содержащим сайты рестрикции для клонирования фрагментов нуклеиновых кислот в клонирующую векторную плазмиду. MCS, также называемый полилинкером или поликлонирующим сайтом, представляет собой кластер сайтов клонирования, так что многие рестрикционные ферменты могут работать в пределах сайта. Сайт клонирования в некоторых воплощениях представляет собой известную последовательность, отличающаяся тем, что фермент рестрикции действует линеаризуя или разрезая плазмиду.

Используемый в данном документе термин «клетка-продуцент» относится к клетке, которая содержит все элементы, необходимые для получения лентивирусных векторных частиц.

Используемый в данном документе термин «упаковочная клетка» относится к клетке, которая содержит те элементы, которые необходимы для продуцирования инфекционного рекомбинантного вируса, которые отсутствуют в рекомбинантном вирусном векторе или лентивирусной трансферной векторной плазмиде. Как правило, такие упаковочные клетки содержат одну или несколько кассет экспрессии, которые способны экспрессировать вирусные структурные белки (такие как gag, pol и env), но они не содержат упаковочного сигнала.

Используемый в данном документе термин «рестрикционная эндонуклеаза» или «рестрикционный фермент» относится к представителю или представителям класса каталитических молекул, которые связывают узнаваемую последовательность молекулы нуклеиновой кислоты (например, ДНК) и расщепляют ее в точном месте в пределах этой последовательности.

Используемый в данном документе термин «самоинактивирующийся» или «SIN», используемый в данном документе взаимозаменяемо, относится к вектору, который модифицирован, причем модификация значительно снижает способность вектора мобилизоваться после его интеграции в геном реципиента, тем самым повышая безопасность использования вектора в качестве вектора доставки гена.

Используемый в данном документе термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной опосредовать проникновение, например, перенос, транспорт и т.д. другой молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. Передаваемая нуклеиновая кислота обычно связывается, например, с молекулой векторной нуклеиновой кислоты. Вектор может включать последовательности, которые направляют автономную репликацию, или могут включать последовательности, достаточные для интеграции в ДНК клетки-хозяина. Как будет очевидно специалисту в данной области техники, вирусные векторы могут включать различные вирусные компоненты в дополнение к нуклеиновой кислоте (кислотам), которые опосредуют введение переносимой нуклеиновой кислоты.

Обзор способа

Лентивирусные векторы (LV) являются важными инструментами для переноса генов из-за их эффективности и способности стабильно трансформировать как делящиеся, так и не делящиеся клетки. В результате, исследователи используют их в качестве носителей генов в широком спектре клинических применений. Тем не менее, крупномасштабное клиническое производство, использующее способы текущих правил организации производства и контроля качества лекарственных средств (cGMP), сопряжено с рядом проблем, которые должны рассматриваться как дополнительные клинические испытания с использованием лентивирусных векторов, получающих одобрение регулирующих органов. Одним из важных соображений при разработке cGMP-совместимых процессов является необходимость интеграции особенностей регулирования в производственные процессы, которые способны продуцировать согласованный лентивирус для нескольких производств cGMP. Подавляющее большинство лентивирусных векторов, используемых клинически, было получено путем транзиторной трансфекции. Однако производство на основе транзиторной трансфекции часто является трудоемким и вариативным. По этой причине недавно были разработаны несколько стабильных упаковочных клеточных линий. Хотя использование этих клеточных линий для биопроизводства LV особенно привлекательно как из-за масштабируемости, так и из-за совместимости, разработка таких линий требует много времени, и регуляторный путь для использования этих линий в cGMP не был четко разработан.

В связи с этим настоящее раскрытие представляет собой процесс клинического производства самоинактивирующих лентивирусных векторов (SIN-LV). Считается, что с посредством новой лентивирусной трансферной векторной плазмиды вместе с упаковочными клеточными линиями GPR, GPRG, GPRT, GPRGT или GPRT-G (или производной или аналогичной упаковочной клеточной линии, полученной из нее) могут быть получены стабильные линии клеток-продуцентов так, чтобы была возможность получения самоинактивирующихся лентивирусных векторов (например, LVsh5/C46). Хотя некоторые воплощения и примеры, описанные в данном документе, относятся к продуцированию LVsh5/C46, который представляет собой самоинактивирующийся лентивирусный вектор, кодирующий короткую шпилечную РНК (shRNA) для отрицательной регуляции корецептора CCR5 ВИЧ-1 в комбинации с ингибитором слияния ВИЧ-1 (а именно, C46), специалист должен признать, что описанные в данном документе способы пригодны для создания стабильных линий клеток-продуцентов, способных продуцировать любые SIN-LV, содержащие любые искомые или клиентские гены или последовательности.

Заявители продемонстрировали, что по сравнению с SIN-LV, полученными с помощью транзиторной трансфекции, раскрытый в настоящее время способ (i) способен давать SIN-LV схожего качества и количества; (ii) производит LV, которые могут иметь лучшую эффективность; и (iii) сохраняет выход, в то же время значительно уменьшая изменчивость между выделениями, наблюдаемую при транзиторной трансфекции.

pUC57-TL20c

В одном аспекте настоящего изобретения представлена плазмида самоиннактивирующегося (SIN) лентивирусного трансферного вектора (далее называемая «pUC57-TL20») третьего поколения на основе вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), содержащая новый универсальный сайт множественного клонирования (MCS) (см. фиг. 11).

В некоторых воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора включает векторный каркас («TL20c»), который сам по себе не содержит внутреннего промотора (следовательно, каркас является «беспромоторным»). В некоторых воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит один промотор, например, промотор, репрессируемый тетрациклином, перед векторным каркасом (см. фиг. 12). Не желая связывать себя какой-либо конкретной теорией, считаем, что беспромоторный дизайн векторного каркаса позволяет получать плазмиду лентивирусного трансферного вектора, которая обеспечивает доставку и последующую экспрессию представляющего интерес гена с определяемого пользователем промотора.

На фиг. 11 представлена карта генов, иллюстрирующая элементы, входящие в состав плазмиды лентивирусного трансферного вектора. В некоторых воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит от около 6500 нуклеотидов и около 6750 нуклеотидов. В других воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит от 6600 нуклеотидов до около 6700 нуклеотидов. В некоторых воплощениях векторный каркас плазмиды лентивирусного трансферного вектора содержит от около 3850 нуклеотидов и около 3950 нуклеотидов. В некоторых воплощениях векторный каркас плазмиды лентивирусного трансферного вектора содержит около 3901 нуклеотидов.

Как показано на фиг. 11, плазмида содержит 5'-фланкирующий LTR ВИЧ, сигнал упаковки или ψ +, центральный полипуриновый тракт (cPPT), Rev-респонсивный элемент (RRE), сайт множественного клонирования (MCS) и 3 'фланкирующий LTR ВИЧ. Регионы LTR дополнительно содержат U3 и U5-область, а также R-область.

В соответствии с определенными воплощениями раскрытия, трансферная плазмида включает самоиннактивирующий (SIN) LTR. Как известно в данной области техники, во время жизненного цикла ретровируса область U3 из 3'-LTR дублируется с образованием соответствующей области 5'-LTR в ходе обратной транскрипции и синтеза вирусной ДНК. Создание SIN LTR достигается путем инактивации U3-области 3'-LTR (предпочтительно путем делеции ее части, например удаления последовательности TATA). Изменение переносится на 5'-LTR после обратной транскрипции, тем самым исключая блок транскрипции из LTR в провирусе, который, как полагают, предотвращает мобилизацию с помощью компетентного по репликации вируса. Дополнительное повышение безопасности обеспечивается за счет замены области U3 в 5'-LTR на гетерологичный промотор для управления транскрипцией вирусного генома при продуцировании вирусных частиц.

В некоторых воплощениях сигнал упаковки содержит около 361 пар оснований последовательности Gag и около 448 пар оснований последовательности Pol из ВИЧ дикого типа (например, HIV01 HXB2_LAI_IIIB). В некоторых воплощениях cPPT содержит около 85 пар оснований последовательности Vif вируса дикого типа. В некоторых воплощениях полипуриновый тракт ВИЧ (pPu) содержит около 106 пар оснований последовательности Nef вируса дикого типа. В некоторых воплощениях RRE содержит около 26 пар оснований последовательности Rev, около 25 пар оснований последовательности tat и около 769 пар оснований последовательности Env вируса дикого типа. В некоторых воплощениях трансферная плазмида содержит инсулятор хроматина и/или сигнал полиаденилирования бета-глобулина.

В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал упаковки, включает последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 85% последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал упаковки, включает последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал упаковки, включает последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 95% последовательности SEQ ID NO: 3.

В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая центральный полипуриновый тракт (cPPT), включает последовательность SEQ ID NO: 4 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 85% последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая центральный полипуриновый тракт (cPPT), включает последовательность SEQ ID NO: 4 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая центральный полипуриновый тракт (cPPT), включает последовательность SEQ ID NO: 4 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 95% последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая Rev-респонсивный элемент, включает последовательность SEQ ID NO: 5 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 85% последовательности SEQ ID NO: 5. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая Rev-респонсивный элемент, включает последовательность SEQ ID NO: 5 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 5. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая Rev-респонсивный элемент, включает последовательность SEQ ID NO: 5 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 95% последовательности SEQ ID NO: 5.

В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая самоиннактивирующийся длинный концевой повтор, включает последовательность SEQ ID NO: 6 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 85% последовательности SEQ ID NO: 6. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая самоиннактивирующийся длинный концевой повтор, включает последовательность SEQ ID NO: 6 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 6. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая самоиннактивирующийся длинный концевой повтор, включает последовательность SEQ ID NO: 6 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 95% последовательности SEQ ID NO: 6.

В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую доксициклин-репрессируемый промотор, который идентичен, по меньшей мере, на 85% SEQ ID NO: 10. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую доксициклин-репрессируемый промотор, который идентичен, по меньшей мере, на 90% SEQ ID NO: 10. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую доксициклин-репрессируемый промотор, который идентичен, по меньшей мере, 95% SEQ ID NO: 10.

В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область R5 LTR ВИЧ, которая идентична, по меньшей мере, на 85% SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область R5 LTR ВИЧ, которая идентична, по меньшей мере, на 90% SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область R5 LTR ВИЧ, которая идентична, по меньшей мере, на 95% SEQ ID NO: 11.

В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область U5 LTR ВИЧ, которая идентична, по меньшей мере, на 85% SEQ ID NO: 12. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область U5 LTR ВИЧ, которая идентична, по меньшей мере, на 90% SEQ ID NO: 12. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область U5 LTR ВИЧ, которая имеет, по меньшей мере, на 95% SEQ ID NO: 12.

В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую инсулятор хроматина, который идентична, по меньшей мере, на 85% SEQ ID NO: 13. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую инсулятор хроматина, который идентичен, по меньшей мере, на 90% SEQ ID NO: 13. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую инсулятор хроматина, который идентичен, по меньшей мере, на 95% SEQ ID NO: 13.

В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал полиаденилирования бета-глобина, которая идентична, по меньшей мере, на 85% SEQ ID NO: 14. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал полиаденилирования бета-глобина, который идентичен, по меньшей мере, на 90% SEQ ID NO: 14. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал полиаденилирования бета-глобина, которая идентична, по меньшей мере, на 95% SEQ ID NO: 14.

В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, которая идентична, по меньшей мере, на 85% SEQ ID NO: 15. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, которая идентична, по меньшей мере, на 90% SEQ ID NO: 15. В некоторых воплощениях плазмида содержит нуклеотидную последовательность, которая идентична, по меньшей мере, на 95% SEQ ID NO: 15.

В раскрытии представлены плазмиды лентивирусного трансферного вектора, включающие MCS для различных рестрикционных ферментов. Согласно некоторым воплощениям раскрытия MCS включает последовательность, содержащую от около 20 до 40 нуклеотидов. В некоторых воплощениях MCS, описанной в настоящем изобретении плазмиды, содержит, по меньшей мере, два сайта для ферментов рестрикции. В других воплощениях MCS описанной в настоящем изобретении плазмиды содержит, по меньшей мере, три сайта для ферментов рестрикции. В других воплощениях MCS описанной в настоящем изобретении плазмиды содержит от около 2 до около 10 рестрикционных сайтов. В некоторых воплощениях сайты рестрикции в MCS выбирают из группы, состоящей из BstBI, MluI, NotI, ClaI, ApaI, XhoI, XbaI, HpaI, NheI, PacI, NsiI, SphI, Sma/Xma, AccI, BamHI и SphI, или любых производных или аналогов.

В некоторых воплощениях область MCS плазмиды лентивирусного трансферного вектора несет четыре уникальных участка разрезания рестрикционных ферментов, которые, как полагают, облегчают легкое субклонирование искомой трансгенной кассеты. В некоторых воплощениях сайт множественного клонирования содержит сайты эндонуклеаз рестрикции BstBI, MluI, NotI и ClaI. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт множественного клонирования, включает последовательность SEQ ID NO: 7 или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 7. Сайты рестрикции могут быть расположены в любом порядке.

В некоторых воплощениях трансферная плазмида содержит один или несколько дополнительных сайтов рестрикционных ферментов, фланкирующих векторный каркас (см. фиг. 11). Не желая связывать себя какой-либо конкретной теорией, считаем, что дополнительные фланкирующие сайты рестрикционных ферментов позволяют создавать направленную («голова к хвосту») конкатемерную матрицу. В некоторых воплощениях сайты рестрикционных ферментов выбирают из Sfil и Bsu36I. В некоторых воплощениях из плазмиды получают лентивирусный вектор, содержащий один или несколько генов.

В некоторых воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 80% последовательности SEQ ID NO: 1. В других воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 85% последовательности SEQ ID NO: 1. В других воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 1. В других воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 95% последовательности SEQ ID NO: 1. В еще одном воплощении плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 97% последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора включает последовательность SEQ ID NO: 1. В некоторых воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора имеет последовательность, которая отличается не более чем 100 нуклеотидами от последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 80% последовательности SEQ ID NO: 2. В других воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 85% последовательности SEQ ID NO: 2. В других воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 2. В других воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 95% последовательности SEQ ID NO: 2. В еще одном воплощении плазмида лентивирусного трансферного вектора содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 97% последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора включает последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора имеет последовательность, которая отличается не более чем на 100 нуклеотидами от последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

В некоторых воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора синтезируется в соответствии с теми способами, которые известны специалистам в данной области. Например, плазмиды могут быть синтезированы с использованием традиционных способов рестрикционного гидролиза и лигирования, известных специалистам в данной области техники. Например, плазмида-донор, содержащая векторный каркас TL20c, может быть субклонирована в плазмиду-реципиент pU57C (например, такую, как коммерчески доступная у Genescript), используя стандартные процедуры гидролиза и лигирования, известные специалистам в данной области (см., Например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor, N.Y., раскрытие которого включено в данном документе ссылкой в полном объеме).

Настоящее раскрытие также включает способ получения лентивирусного вектора, например LVsh5/C46. В одном воплощении способ включает синтез кДНК гена и клонирование синтезированной кДНК в сайт рестрикции плазмиды, такой как pUC57-TL20c. Гены могут быть вставлены в подходящий сайт клонирования с использованием методов, известных специалистам в данной области. Например, ген может быть амплифицирован с помощью ПЦР и затем клонирован в плазмиду, содержащую искомый промотор или элемент контроля экспрессии гена.

В некоторых воплощениях и исключительно в качестве примера способ включает синтез кДНК гена, который экспрессирует белок, способный предотвращать слияние ВИЧ с клеткой или репликацию ВИЧ; и затем клонирование синтезированной кДНК в сайт рестрикции в плазмиде, как описано в данном документе.

Получение стабильной линии клеток-продуцентов и сбор лентивирусных векторов, продуцируемых этими клетками

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описаны способы получения стабильной линии клеток-продуцентов и сбора лентивирусных векторов, полученных из полученной стабильной линии клеток-продуцентов. На основании фиг. 2 первая стадия получения стабильной линии клеток-продуцентов-продуцентов заключается в создании фрагментов ДНК (10), таких как плазмида лентивирусного трансферного вектора и вторая плазмида, такая как плазмида с кассетой устойчивости к антибиотику. После получения фрагмента ДНК (10) ДНК затем используется для получения конкатемерной матрицы (20). Затем конкатемерная матрица вводится, например, трансфекцией, в упаковочную клеточную линию (30) (например, упаковочные клеточные линии GPR, GPRG, GPRT, GPRG, GPRT-G или их производные). После введения матрицы (30) и последующей трансфекции отбирают (40) и выделяют (50) клон для создания стабильной линии клеток-продуцентов (60). Затем можно собирать надосадочную жидкость, содержащую лентивирусный вектор.

Формирование и очистка конкатамерной матрицы

«Конкатамер» или «конкатамерная матрица» (используемые в данном документе взаимозаменяемо) (длинная непрерывная молекула ДНК, которая содержит несколько копий одних и тех же последовательностей ДНК, которые последовательно связаны прямо или косвенно) получают и используют при трансфекции линии упаковочных клеток. В некоторых воплощениях конкатамеры представляют собой большие матрицы связанных векторных экспрессирующих кассет, причем в них помещены кассеты устойчивости к антибиотикам.

На основании фиг. 14, для формирования конкатемерной матрицы получают фрагменты ДНК из плазмиды лентивирусного трансферного вектора (стадия 100) и плазмиды с кассетой устойчивости к антибиотику (стадия 110). В некоторых воплощениях фрагменты ДНК могут быть получены путем гидролиза каждой из плазмид в соответствии с протоколами, известными специалистам в данной области, с последующим лигированием расщепленных фрагментов. В некоторых воплощениях электрофорез и агарозный гель используют для получения искомых фрагментов ДНК (стадия 120). В некоторых воплощениях концентрация фрагмента ДНК может быть определена с использованием спектрофотометра NanoDrop (стадия 130). Существует множество стратегий для лигирования фрагментов ДНК, выбор которых зависит от характера концов фрагментов ДНК и которые легко выбираются квалифицированным специалистом.

В некоторых воплощениях плазмида лентивирусного трансферного вектора основана на pUC57-TL20c. В некоторых воплощениях плазмида с кассетой устойчивости к антибиотику управляется промотором PGK. В некоторых воплощениях плазмида с кассетой устойчивости к антибиотику содержит фланкирующие сайты для контамеризации с лентивирусной кассетой в плазмиде лентивирусного трансферного вектора. В некоторых воплощениях кассета с устойчивостью к антибиотику представляет собой PGK-ble (устойчивость к блеомицину). В некоторых воплощениях плазмида PGK-ble содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 9. В некоторых воплощениях конкатамерные матрицы формируются путем лигирования in vitro фрагментов ДНК из плазмиды лентивирусного трансферного вектора и плазмиды PGK-ble.

На фиг. 15 показаны общие стадии, используемые для формирования конкатамерной матрицы. На стадии 200 полученные фрагменты ДНК смешивают и объем фрагментов в реакции лигирования максимизируют для поддержания желаемого соотношения (стадия 210). В некоторых воплощениях отношение количества ДНК плазмиды лентивирусного трансферного вектора к количеству ДНК плазмиды с кассетой устойчивости к антибиотику составляет от около 100:1 до около 1:100. В некоторых воплощениях отношение количества ДНК плазмиды лентивирусного трансферного вектора к количеству ДНК плазмиды с кассетой устойчивости к антибиотику составляет от около 50:1 до около 1:50. В некоторых воплощениях отношение количества ДНК плазмиды лентивирусного трансферного вектора к количеству ДНК плазмиды с кассетой устойчивости к антибиотику составляет от около 25: 1 до около 1:25. В других воплощениях отношение количества ДНК плазмиды лентивирусного трансферного вектора к количеству ДНК плазмиды с кассетой устойчивости к антибиотику составляет от около 10: 1 до около 1:10.

В некоторых воплощениях конкатамерную реакционную смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре (стадия 220). Затем концентрацию фрагмента ДНК для каждого образца можно измерить, используя спектрофотометр NanoDrop (стадия 230).

В некоторых воплощениях формируют направленную конкатамерную матрицу и используют для трансфекции упаковочной клеточной линии. В некоторых воплощениях формирование направленной матрицы достигается за счет использования сайтов рестрикционных ферментов плазмиды лентивирусного трансферного вектора, которые фланкируют лентивирусный векторный каркас. В некоторых воплощениях рестрикционный гидролиз использует сайты рестрикционных ферментов, фланкирующих векторную кассету TL20c, и позволяет получать нуклеотидные непалиндромные выступы, которые могут использоваться для лигирования «от головы к хвосту». В некоторых воплощениях направленное лигирование, в соответствии со способами, описанными в данном документе, позволяет получать конкатамерную матрицу, которая содержит преимущественно продукты ДНК «от головы к хвосту».

В некоторых воплощениях конкатамерная матрица формируется в соответствии со способом, описанным в примере 3 в данном документе. Разумеется, квалифицированный специалист признает, что процедура, представленная в примере 3, может быть адаптирована для образования конкатемерной матрицы, имеющей разные отношения первой плазмиды ко второй плазмиде и для переноса плазмид, отличных от LVsh5/C46.

В некоторых воплощениях конкатамерную матрицу очищают путем экстракции фенолом и осаждением этанолом перед трансфекцией в линию клеточных клеток. Хотя этот традиционный метод дешев и эффективен, однако, эта процедура требует много времени и не может давать воспроизводимые выходы. Считается, что есть риск переноса фенола/хлороформа в окончательный образец. Кроме того, считается, что этот процесс включает опасные химические вещества и может давать токсичные отходы, которые следует утилизировать с осторожностью и в соответствии с правилами обращения с опасными отходами.

В ином случае, в других воплощениях способ на основе силикагеля используется для очистки вновь синтезированной конкатамерной матрицы после лигирования. Считается, что этот способ обеспечивает простой, надежный, быстрый и удобный путь выделения высококачественной конкатамерной матрицы, подходящей по качеству для трансфекции. В некоторых воплощениях конкатамерную матрицу очищают с использованием спин-колонки DNeasy Mini, доступной у Qiagen, например, с использованием процедуры, изложенной в примере 6.

Трансфекция/выделение одиночного клона

После очистки конкатамерной матрицы, матрицу затем использовали для трансфекции клеток упаковочной линии. Используемые в данном документе термины «трансформация» и «трансфекция» предназначены для обозначения множества методов, известных в данной области техники, для введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК) в клетки. Как будет видно из приведенных в данном документе примеров, когда клетка-хозяин, пермиссивная в отношении продуцирования лентивирусных частиц, трансфицируется полученной конкатамерной матрицей, клетка становится клеткой-продуцентом, то есть клеткой, которая продуцирует инфекционные лентивирусные частицы.

В общем, конкатамерную матрицу или направленную конкатамерную матрицу можно вводить в клетки с помощью обычных методов трансфекции. На основании фиг. 16, в некоторых воплощениях клетки собирают и высевают за 20-24 часа до трансфекции (стадия 300), а затем трансфицируют (стадия 320) с помощью синтезированной конкатамерной матрицы (стадия 310). Процедура трансфекции упаковочной клеточной линии приведена в примере 4.

Одной из упаковочных клеточных линий, подходящих для трансфекции с помощью образованных контемерных матриц, является упаковочная клеточная линия GPR. Линия GPR представляет собой упаковочную клеточную линию на основе ВИЧ-1, полученную из клеток 293T/17 с необходимыми вирусными компонентами gagpol и rev (см. Throm et al., Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Кровь 113: 5104-5110, раскрытие которой полностью включено в данный документ ссылкой).

Другой упаковочной клеточной линией, подходящей для трансфекции образованными конкатамерными матрицами, является упаковочная клеточная линия GPRG. В некоторых воплощениях упаковочная клеточная линия GPRG содержит gagpol, rev и VSV-G.

Еще одной упаковочной клеточной линией, подходящей для трансфекции полученными конкатамерными матрицами, является упаковочная клеточная линия GPRT (gagpol, rev и tat). Упаковочные клеточные линии GPRG и GPRT, а также способы их получения также раскрыты Throm et. al, раскрытие которого и в этом случае включено в данный документ ссылкой в полном объеме. Другие подходящие упаковочные клеточные линии (например, GPRT-G) описаны в Wielgosz et al. "Generation of a lentiviral vector producer cell clone for human Wiskott-Aldrich syndrome gene therapy," Molecular Therapy—Methods & Clinical Development 2, Article number: 14063 (2015), раскрытие которой включено в данный документ ссылкой в полном объеме.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что также могут быть использованы другие упаковочные клеточные линии, подходящие для применения с раскрытым в настоящее время способом. В некоторых воплощениях другие упаковочные клеточные линии могут быть получены из упаковочных клеточных линий GPR, GPRG, GPRT или GPRT-G. Не желая связывать себя какой-либо конкретной теорией, считаем, что линия клеток GPRT-G имеет более высокую эффективность трансдукции в клетках CD34+ (см. Wielgosz). Под «производной от» подразумевается популяция клеток, клонально происходящих из отдельной клетки и имеющих некоторые избранные качества, такие как способность продуцировать активный белок при заданном титре или способность пролиферировать до определенной плотности.

Фиг. 17 иллюстрирует общий процесс отбора трансфицированных клеток. В некоторых воплощениях и через около 72 часа после трансфекции клетки GPRG культивируют с помощью селективной среды (зеоцин и доксициклин) (стадия 400). Затем клетки подкармливаются селективной средой (зеоцин и доксициклин) каждые 3-4 дня, пока не идентифицируются клеточные фокусы (стадия 410). Затем линии клеток размножают и оценивают (стадия 420).

В некоторых воплощениях, после трансфекции, используется процесс отбора/отбора одиночных фокусов для идентификации клонов одиночной клетки, которые имеют хороший производственный потенциал. В соответствии с этим способом в некоторых воплощениях выбранные клетки редко рассевали в чашках размером 150 × 25 мм и им позволяли размножаться и формировать заметные колонии в течение 2-3 недель. Затем отдельные колонии могут быть перенесены в другой более мелкий культуральный сосуд для моноклонального размножения. Этот способ считается экономически эффективным и часто применяемым методом; однако из-за природных ограничений в методе отбора одиночных фокусов, достижение высокой вероятности моноклональности хорошо продуцирующей клеточной линии может быть сложной задачей.

Фиг. 18 иллюстрирует выделение одиночной колонии. На стадии 500 проточная цитометрия используется для подготовки сортировки по одной клетке. Затем клетки высевали (стадия 510) в кондиционированную культуральную среду и размножали (стадия 520).

В других воплощениях при создании стабильной линии клеток-продуцентов лентивирусного вектора с высоким титром для выделения отдельных клонов использовали флуоресцентно активируемый клеточный сортировщик (FACS) (см., например, фиг. 8). Кондиционированная среда, например, зеоцин (50 мкг/мл) и доксициклин (1 нг/мл), также может быть добавлена во время процесса сортировки для увеличения прикрепления и жизнеспособности клеток и содействия образованию колоний. Считается, что применение кондиционированных ростовых сред и высокопропускной способности системы FACS позволяет осуществить скрининг большого количества клонов и, как считается, увеличивает вероятность обнаружения продуцирующих клонов лентивирусных векторов с высоким титром.

В некоторых воплощениях клон с хорошей скоростью роста и способностью к вирусному продуцированию тестировали на стабильность в течение около 20 пассажей.

Индукция линий клеток-продуцентов для генерации вируса

После отбора и размножения выбранных клонов, выбранные клоны индуцируются для продуцирования содержащих вектор надосадочных жидкостей, и индукция может быть проведена в соответствии с процедурами, известными специалистам в данной области техники. Для получения лентивирусных векторов, продуцируемых индуцированными стабильными линиями-продуцентами, культуральную надосадочную жидкость собирали в некоторых воплощениях каждый день в течение вплоть до 7 дней. Этот производственный протокол может быть легко использован для создания множества тестовых векторов в небольших масштабах. Повторный протокол сбора вирусов также может увеличить конечный выход вирусных векторов. Тем не менее, ежедневный сбор и замена среды часто не являются экономичными, и в качестве альтернативы ежедневному сбору был разработан новый двухдневный протокол сбора. Этот новый протокол производства вирусных векторов, описанный ниже, позволяет получать такое же количество вирусных векторов с меньшей потребностью в питательных средах.

Фиг. 19 иллюстрирует процесс индукции и оценки. На стадии 600 индуцировали вирусные векторы и затем проводили центрифужную инокуляцию 293T для определения эффективности трансдукции (стадия 610). Верхние три клона подвергали скринингу (стадия 620) и размножали (стадия 630). Затем клоны хранили (например, в жидком азоте) (стадия 640).

Сбор каждые два дня

Заявители неожиданно обнаружили, что сбор каждые два дня позволяет получать почти такое же количество вирусных векторов, что и с более традиционным ежедневным сбором, а также требует меньше культуральной среды.

В одном воплощении предлагается первый способ получения вирусных векторов из сбора каждые два дня в соответствии с настоящим изобретением, причем первый способ включает следующие стадии:

(1) Удаление старой культуральной среды культуры линии-продуцента как можно полнее, и промывка клеток 1 × PBS.

(2) Добавление фермента TrypLE™ Express Enzyme (1×) в чашку для культивирования (доступно у ThermoFisher Scientific).

(3) Помещение в инкубатор 37°C на 2 минуты.

(4) Промывка клеток путем добавления среды D10 (без лекарственного средства) и диссоциация кластеров клеток в отдельные клетки путем пипетирования вверх и вниз (среда D10: модифицированная Дульбекко среда Игла с высоким содержанием глюкозы, добавкой GlutaMAX™ и 10% (масс./об.), FBS и 1% (масс./об.) Pen/Strep).

(5) Центрифугирование клеток в течение 5 минут при 4°С при 1200 об./мин.

(6) Аспирирование среды и осторожное суспендирование осадка в свежей среде D10 (без лекарственного средства).

(7) Высевание клеток при около 95% конфлюэнтности в культуральной чашке (грубо путем покрытия 4 × 106 клеток/6-миллиметровой культуральной чашки, индукция векторов).

(8) Засеянные клетки дополняли свежей, предварительно нагретой средой D10 через 24 часа (1-й день после индукции).

(9) Вирусные векторы могут быть впервые собраны с клеток через 48 часов после первой замены среды (3-й день после индукции).

(10) Добавление свежей, предварительно подогретой теплой среды в культуральную чашку.

(11) Проведение второго сбора вирусных векторов через 48 часов после второй замены среды (5-й день после индукции).

(12) Добавление свежей предварительно подогретой среде в культуральную чашку.

(13) Проведение третьего вирусного вектора через 48 часов после третьей замены среды (день 7 после индукции).

Заявители обнаружили, что вирусный титр может быть получен во второй раз, когда вирусные векторы собираются в 4 день и 5 день после индукции по сравнению с более традиционными способами, в которых вирусные векторы могут собираться через семь дней после индукции.

В другом воплощении предлагается второй способ получения вирусных векторов из сбора каждые два дня в соответствии с настоящим изобретением, причем первый способ включает следующие стадии:

(1) Удаление среды из культуральной чашки линии-продуцента насколько это возможно, и промывка клеток 1 × PBS.

(2) Аккуратное пипетирование 1 × TrypLE Express на промытом монослое клеток с помощью 3 мл для 100-миллилитровой культуральной чашки.

(3) Поворачивание флакона для того, чтобы покрыть монослой с помощью TrypLE Express.

(4) Возвращение флакона в инкубатор на 2 минуты.

(5) Осторожное постукивание боков флакона для того, чтобы освободить все оставшиеся прикрепленные клетки.

(6) Повторное суспендирование клеток в 2 мл свежей среды D10 (без антибиотиков) и перенос в 15 мл коническую центрифужную пробирку.

(7) Центрифугирование клеток в течение 5 минут при 1200 об./мин.

(8) Аспирирование среды и осторожное суспендирование осадка в 5 мл свежей культуральной среды D10 (без антибиотиков).

(9) Определение количества клеток с помощью автоматического цитометра TC10™.

(10) Высевание клеток до > 95% конфлюэнтности в культуральной чашке (путем покрытия 4 × 106 живых клеток в 60 мм культуральной чашке)

(11) Обогащение засеянных клеток свежей подогретой средой D10 ежедневно (каждые 24 часа).

Заявители обнаружили, что вирусные векторы можно собирать с клеток через 48 часов после индукции и что самый высокий вирусный титр может быть получен через 72 часа после индукции. Заявители с другой стороны неожиданно обнаружили, что вирусные векторы можно собирать через 2-4 дня после индукции.

В некоторых воплощениях собранные векторы очищают путем фильтрации. В некоторых воплощениях собранные векторы характеризуют путем определения вирусного титра, копий вируса на клеточный геном и концентрации p24.

Ежедневное сравнение ежедневного сбора и сбора каждые два дня показано на фигуре 5.

Пример 1. Подробное сравнение самоинактивирующихся лентивирусных векторов, полученных с помощью транзиторной трансфекции, и векторов, продуцируемых раскрытым способом стабильной клеточной линии

Способы, описанные в данном документе, использовали для получения стабильной клеточной линии для получения LVsh5/C46, самоинактивирующегося лентивирусного вектора (SIN-LV), кодирующего короткую шпилечную РНК (shRNA) для отрицательной регуляции корецептора CCR5 ВИЧ-1, в комбинации с ингибитором слияния ВИЧ-1, C46. Эти LV, полученные путем транзиторной трансфекции, в настоящее время оцениваются в клинических испытаниях на ВИЧ-инфицированных людях. В данном документе мы провели сравнительный анализ LVsh5/C46, полученный путем транзиторной трансфекции, и LVsh5/C46, полученный с использованием способов, описанных в данном документе, для поддержки применения этой системы при клиническом изготовлении LVsh5/C46 и других SIN-LV.

Лентивирусные векторы (LV) были получены путем трансфекции фосфатом кальция в клетках 293Т с использованием 4-плазмидной системы (один трансферный вектор, два вектора упаковки и один вектор оболочки). Вирус-содержащие среды (VCM) собирали через 48 ч после трансфекции и концентрировали ультрацентрифугированием через 20% сахарозную подушку.

Для производства клеточной линии клетки-продуценты индуцировали в средах без доксициклина (Dox), а VCM собирали через 72 часа и концентрировали с помощью ультрацентрифугирования. С учетом таблицы 1 и фиг. 8 и 9, LV, произведенные каждым способом, сравнивались на основании титра частиц и с использованием трех независимых анализов эффективности трансдукции гена на 293T и линии Т-клеток TF-1a. К ним относятся анализы с помощью FACS экспрессии C46 на клеточной поверхности и опосредуемого с помощью shRNA нокдауна экспрессии CCR5, а также анализ с помощью qPCR количества копий вектора (VCN) на геном клетки-хозяина. Для всех анализов титр определяли в диапазоне векторных разведений для определения линейной зависимости. В анализе qPCR использовали геномную ДНК, экстрагированную из трансдуцированных клеток, и детектировали трансген C46 и последовательность гена эндогенного β-глобина. Таким образом, C46 VCN может быть нормализован к клеточному геному.

Таблица 1. Сравнение стабильного и транзиторного продуцирования вирусных векторов
Способ	Титр 293Т (TU/мл)	Титр TF-1a (TU/мл)	P24 (нг/мл)
Транзиторная трансфекция	2,78 × 108	2,64 × 108	5250
Стабильная клетка-продуцент	1,40 × 108	1,46 × 108	13430
1. Аббревиатура: TU, единица трансдукции; VCM, среда, содержащая вирусы 2. VCM концентрировали в 100 раз через 20% сахарозную подушку ультрацентрифугированием

Более высокая концентрация p24 наблюдалась в VCM, продуцируемой линиями клеток-продуцентов по сравнению со способом транзиторной трансфекции. Однако выход и эффективность LVsh5/C46, производимого с использованием двух разных систем, были схожими. Векторы сначала оценивали по титру C46 с помощью FACS с использованием равных объемов VCM. Тогда как вектор, полученный транзиторной трансфекцией, имел умеренно повышенный титр, когда титры C46 были нормализованы, а векторные препараты были проанализированы на предмет трансдукции генов с использованием анализа qPCR или посредством функционального нокдауна CCR5, вектор, полученный с помощью стабильных линий клеток-продуцентов, показал большую эффективность (см. таблицу 2). Отрицательная регуляция экспрессии CCR5 и геномного C46-трансгена (VCN) были значительно выше в клетках-мишенях, обработанных LVsh5/C46, продуцируемого описанными в данном документе способами, чем в обработанных вектором, полученным с помощью транзиторной трансфекции (см. таблицу 3 и фигуру 10).

Таблица 2. Анализ C46 с помощью qPCR в трансдуцированных клетках
Состояние	MOI 3	копии C46/клетку
нет вируса, отрицательный контр.	-	ND
TF-1a2, положительный контр.	-	1,36 ± 0,58
Транзиторная трансфекция	1	5,34 ± 0,55
Стабильная линия-продуцент	1	10.7 ± 2.17
Транзиторная трансфекция	0,3	1,01 ± 0,30
Стабильная линия-продуцент	0,3	3,67 ± 0,66
1. Аббревиатура: ND, не обнаружено; MOI, множественность заражения 2. Клеточная линия из одиночной копии LVsh5/C46 3. MOI, основанная на титре трансдукции C46

Таблица 3. Анализ C46 с помощью qPCR в трансдуцированных клетках
Состояние	MOI 3	копии C46/клетку
нет вируса, отрицательный контр.	-	ND
TF-1a2, положительный контр.	-	1,36 ± 0,58
Транзиторная трансфекция	1	5,34 ± 0,55
Стабильная линия-продуцент	1	10,7 ± 2,17
Транзиторная трансфекция	0,3	1,01 ± 0,30
Стабильная линия-продуцент	0,3	3,67 ± 0,66
1. Аббревиатура: ND, не обнаружено; MOI, множественность заражения 2. Клеточная линия из одиночной копии LVsh5/C46 3. MOI, основанная на титре трансдукции C46

На основе трех независимых анализов мы показали, что описанные в данном документе способы обеспечивают стабильную систему продуцирования LV, способную генерировать аналогичное качество и количество SIN-LV по сравнению со способом транзиторной трансфекции. Более высокая эффективность отрицательной регуляции CCR5 и C46 VCN в трансдуцированных клетках (нормализованных по титру C46) показывает, что LVsh5/C46, продуцируемый клетками-продуцентами, обладает большей эффективностью, чем векторы, которые получали с использованием обычной 4-плазмидной транзиторной трансфекции. Устраняя утомительную переходную стадию трансфекции, не желая связывать себя какой-либо конкретной теорией, считаем, что эта производственная система может быть легко адаптирована к условиям cGMP при изготовлении клинических материалов для использования на людях.

Пример 2. Разработка и описание клеточных линий на основе GPRG для биопроизводства лентивирусных векторов для генной терапии ВИЧ

Ранее была выведена система клеточной линии GPRG для клинического производства самоинактивирующихся лентивирусных векторов (SIN-LV). Здесь мы стремились получить линии клеток-продуцентов на основе GPRG для получения LVsh5/C46, SIN-LV, который в настоящее время проходит клиническую оценку для лечения ВИЧ-инфицированных индивидуумов. Этот вектор кодирует два ингибитора вирусного входа: sh5, короткую шпилечную РНК к корецептору ВИЧ CCR5, и C46, ингибитор вирусного слияния. Мы также стремились определить стабильность упаковочной клеточной линии GPRG, линии клеток-продуцентов LVsh5/C46 на основе GRPG и продуцирование LVsh5/C46 после индукции тетрациклином в соответствии с требованиями официальной отчетности и клинического применения системы GPRG для биопроизводства LVsh5/C46.

GPRG клетки культивировали в среде D10 с доксициклином (Dox) и пуромицином (Puro). Для получения клеток-продуцентов LVsh5/C46 клетки GPRG трансфицировали трансферной плазмидой TL20-LVsh5/C46 и плазмидой, резистентной к зеоцину, в виде конкатамерной матрицы. Индивидуальные клоны оценивали по их способности продуцировать вектор LVsh5/C46 и поддерживали в среде D10 с Dox, Puro и зеоцином. Для оценки стабильности родительской клеточной линии GPRG для продуцирования LV, клетки GPRG трансфицировали трансферным вектором каждые 10 пассажей в течение 3-месячного периода (всего 50+ пассажей) (см. фиг. 3 (А) и 3 В). Вируссодержащую среду (VCM) собирали через 48 ч после трансфекции, а векторный титр оценивали с помощью анализов трансдукции комплементарных генов. Для оценки стабильности продуцирования LV стабильными клонами клеток-продуцентов, клетки индуцировали в среде D10 без Dox. VCM собирали через 72 часа после индукции, а титр оценивали аналогичным образом в диапазоне векторных разведений. Для анализа стабильности экспрессии VSV-G после индукции после длительного прохождения клетки GPRG индуцировали удалением Dox и затем окрашивали с использованием биотин-конъюгированного антитела против VSV-G с последующим вторичным окрашиванием со стрептавидином-фикоэритрином.

GPRG-клетки демонстрируют строгую экспрессию VSV-G, регулируемую тетрациклином. Эта упаковочная клеточная линия способна производить до 107 единиц трансдукции LV (TU)/мл после трансфекции вектором переноса LV и поддерживать высокоуровневое производство LV в течение более чем 50 пассажей в непрерывной культуре (см. фиг. 6А и 6В). Используя трансфекцию конкатамерных матриц, мы демонстрируем эффективное построение линии клеток-продуцентов на основе GPRG для получения LVsh5C46. Эта клеточная линия последовательно давала титры выше 106 TU/мл. Дальнейшее увеличение титра может быть достигнуто путем повторного клонирования и отбора вторичных линий клеток-продуцентов. Титры достигали пика от 2 до 5 дней после индукции. Мы также показали, что полученные стабильные линии клеток-продуцентов могут регулярно поддерживать продуцирование LVsh5/C46 с титрами, превышающими 106 TU/мл, при непрерывном культивировании, превышающем 25 пассажей.

Линия клеток GPRG эффективно экспрессировала VSV-G на поверхностях клеток после удаления Dox. Она также может генерировать высокие титры LV после трансфекции плазмидами трансферных векторов. Более того, эта клеточная линия позволила получить линии клеток-продуцентов для SIN-LV с высоким титром. Линии клеток-продуцентов демонстрировали стабильное продуцирование векторов во время продолжительного культивирования, и была изучена возможность оценки адаптируемости для адаптации производства вектора к системам бессывороточного и суспензионного культивирования (см. фиг. 7А и 7В).

Пример 3. Протокол получения конкатамерной матрицы

Стадия 1.

Подготовьте 500 мл 1× загрузочного буфера TAE, объединив 490 мл деионизированной воды с 10 мкл 50 × буфера TAE ((Трис-ацетат-EDTA)).

Сделайте 1% агарозный гель, добавив 1 г агарозы и 100 мл 1× TAE-буфера (добавьте 2 мл 50× TAE к 98 мл автоклавированной воды) в химический стакан и подогрейте в микроволновой печи смесь до тех пор, пока не останется твердых частиц или пузырьков (около 2,5 минут).

Дайте смеси остыть в течение 3 минут.

Добавьте 10 мкл GelRed^TM в смесь агарозного геля и перемешайте (доступно у Biotium).

Соберите рамку для заливки геля и гребенку для геля. Вылейте смесь в гелевую форму и дайте ей остыть в течение 30 минут (емкость: 60 мкл для большой гребенки).

После охлаждения геля заполните контейнер 1 × TAE буфером, пока гель не будет полностью погружен в воду.

Подготовьте реакционную смесь для гидролиза при комнатной температуре для линеаризации ДНК.

Гидролизуйте 25 мкг векторной плазмиды с помощью рестрикционного фермента SfiI. В отдельной реакции гидролизуйте резистентную кассетную плазмиду PGK-ble с помощью PflMI (10 мкг более чем достаточно).

Компонент	Маркер ble	Вектор
Название ДНК	PGK-ble
буфер 10 FastDigest Green Buffer	5 мкл	10 мкл
Плазмидная ДНК	10 мкг	25 мкг
фермент FastDigest Enzyme 1: PflMI	5 мкл	0 мкл
фермент FastDigest Enzyme 2: SfiI	0 мкл	5 мкл
Безнуклеазная вода	До 50	До 100
Общий объем	50 мкл	100 мкл

Аккуратно перемешайте и инкубируйте при 37 °C в тепле в течение 15 мин.

Добавьте 10 мкл маркерной смеси фрагментов ДНК GeneRuler 1kb plus DNA ladder (2 мкл ДНК-маркера + 8 мкл безнуклеазной воды) и 50 мкл смеси образца в доступные слоты.

Включите электрофорезную машину и запустите с напряжением 150 В в течение 1 часа.

Перенесите гель в систему UVD PhotoDoc-It Imaging и получите изображение результата.

Загрузите изображения геля с веб-сайта Eye-Fi.

Определите концентрацию ДНК каждого образца с использованием спектрофотометра NanoDrop 2000.

Стадия 2

Вырежьте полоски ДНК из агарозного геля.

Добавьте 3 объема буфера QG к 1 объему геля (обычно добавляют 500 мкл QG).

Инкубируйте при 50°C в течение 10 минут после полного растворения ломтика геля.

Нанесите образец на колонку QIAquick и центрифугируйте в течение 1 минуты при 17 900 об./мин. (доступно у Qiagen).

Отбросьте элюат и поместите колонку QIAquick в ту же пробирку для сбора.

Добавьте 0,5 мл буфера QG в колонку QIAquick и центрифугируйте в течение 1 мин.

Добавьте 0,75 мл буфера PE в колонку QIAquick и центрифугируйте в течение 1 мин.

Отбросьте элюат и центрифугируйте колонку QIAquick еще 1 минуту при 17900 об./мин.

Поместите колонку QIAquick в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Для элюирования ДНК, добавьте 35 мкл буфера EB в центр мембраны QIAquick и центрифугируйте колонку в течение 1 минуты при 17900 об./мин. (буфер EB представляет собой 10 мМ Tris-cl, pH 8,5).

Измерьте концентрацию фрагментов ДНК с использованием спектрофотометра NanoDrop 2000 (таблица 1, используя буфер EB для контрольного измерения)

Стадия 3

Подготовьте реакцию лигирования в 1,7 мл микроцентрифужной пробирке Eppendorf на льду.

Используйте предварительно созданную электронную таблицу (Concatemeric Ligations.xlsx) для расчета объемов каждого фрагмента, который необходимо смешать, чтобы создать молярное отношение 25:1 к вектору PGK-ble.

Доведите до максимального значения объем фрагментов в реакции лигирования и поддерживайте искомое молярное отношение.

Буфер ДНК-лигазы T4 следует разморозить и ресуспендировать при комнатной температуре (буфер ДНК-лигазы T4 включает следующие компоненты: 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ATP, 10 мМ DTT, pH 7,5).

Пипетируйте реакцию лигирования. В приведенном выше примере мы использовали 90 мкл смеси ДНК, добавляя 10 мкл 10X-лигирующего буфера (набор для быстрой лигирования NEB) и 0,5 мкл фермента лигазы (доступный у New England BioLabs).

Подготовьте следующую реакционную смесь, содержащую при комнатной температуре:

Компонент	Вектор
Фрагмент вектора
фрагмент устойчивости к ble
10 × буфер для T4 ДНК-лигазы	10
T4 ДНК-лигаза	0,5
Безнуклеазная вода	До 90
Общий объем	90

Осторожно перемешайте пипетированием вверх и вниз.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение ночи

Стадия 4

Конкатамерную матрицу собирали и очищали перед трансфекцией в клетки GPRG с помощью мембраны на основе диоксида кремния (набор DNeasy Blood & Tissue Kit).

Нанесите смесь конкатамерных матриц на спин-колонку DNeasy Mini, помещенную в 2 мл пробирку для сбора.

Центрифугируйте при 8000×g в течение 1 мин. Отбросьте элюат и пробирку для сбора.

Поместите спин-колонку DNeasy Mini в новую пробирку для сбора объемом 2 мл (в комплекте) (поставляется Qiagen).

Добавьте 500 мкл буфера AW1 и центрифугируйте в течение 1 мин при 8000×g.

Отбросьте элюат и пробирку для сбора

Поместите спин-колонку DNeasy Mini в новую пробирку для сбора объемом 2 мл (прилагается)

Добавьте 500 мкл буфера AW2 и центрифугируйте в течение 3 мин при 20000×g для сушки мембраны DNeasy.

Отбросьте элюат и пробирку для сбора.

Поместите спин-колонку DNeasy Mini в чистую 1,7 мл микроцентрифужную пробирку Eppendorf

Добавьте 200 мкл буфера AE непосредственно на мембрану DNeasy.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение 4 минут

Центрифугируйте в течение 1 мин при 8000×g для элюирования смесей ДНК.

Повторите элюирование

Измерьте концентрацию конкатамерной ДНК с помощью спектрофотометра NanoDrop Lite

Пример 4. Протокол для получения линий клеток-продуцентов с использованием конкатамерной матрицы

Проведите пассаж клеток, по меньшей мере, 4 раза после оттаивания перед их использованием при получении вирусного вектора.

Убедитесь, что клетки здоровы и более чем на 95% жизнеспособны до введения векторов с использованием метода Trypan Blue (Trypan Blue обычно используется в процедурах исключения красителей для подсчета жизнеспособных клеток. Этот способ основан на принципе который заключается в том, что живые (жизнеспособные) клетки не абсорбируют определенных красителей, тогда как мертвые (нежизнеспособные) клетки - абсорбируют. Окрашивание облегчает визуализацию морфологии клеток).

Культивируйте искомое количество GPRG-клеток

Субкультивируйте клетки, по меньшей мере, дважды ежедневным пассажем перед посевом клеток.

В первый день удалите среду культуральной чашки клеточных линий GPRG и промойте клетки с помощью 1 × PBS.

Аккуратно пипетируйте 1 × TrypLE Express на промытом монослое клеток, используя 3 мл для матраса T75 или 1 мл для матраса T25.

Поверните матрас для того, чтобы покрыть монослой TrypLE Express.

Верните матрас в инкубатор и оставьте на 2 минуты.

Осторожно постукивайте стороны матрасов для того, чтобы освободить все оставшиеся прикрепленные клетки.

Повторно суспендируйте клетки в 2 мл свежей среды D10 и перенесите в 15 мл коническую центрифужную пробирку.

Центрифугируйте клетки в течение 5 минут при 1200 об./мин.

Аспирируйте среду и осторожно суспендируйте осадок в 5 мл свежей культуральной среды D10 с доксициклином (1 нг/мл)

Определите количество клеток с помощью автоматического цитометра TC10™ (таблица 5)

Высейте клетки за 20-24 часа до трансфекции при 80% конфлуентности в культуральной чашке (путем посева 3,2 × 106 живых клеток в 60 мм культуральной чашке с доксициклином, таблица 9)

Подготовьте конкатамерные матрицы (см., например, пример 3).

Во второй день, доведите набор CalPhosTM Mammalian Transfection Kit до комнатной температуры перед трансфекцией (таблица 7) (доступно у ClonTech).

Очистите конкатемерную ДНК и измерьте концентрацию (конкатамерная матрица может быть очищена в соответствии с описанными в данном документе способами)

Подготовьте таблицу трансфекции ДНК плазмиды (таблица 8, 4 мл, 60 мм культуральная чашка).

Для каждой трансфекции подготовьте раствор А и раствор В в отдельной 15 мл конической центрифужной пробирке

Барботируйте раствор B (2 × HBS) с помощью пипетки и добавьте раствор A (смесь ДНК) по каплям.

Инкубируйте раствор для трансфекции при комнатной температуре в течение 15 минут

Аккуратно добавьте раствор для трансфекции в культуральную чашку.

Аккуратно перемещайте планшеты назад и вперед, чтобы равномерно распределить раствор для трансфекции.

Инкубируйте планшеты при 37 °C в течение 4 часов в СО2-инкубаторе.

Подогрейте по 5 мл свежей среды D10 на 60-миллилитровую культуральную чашку при 37°C CO2-инкубаторе

Через 4 часа промойте 1 мл предварительно нагретой D10 и замените 4 мл предварительно нагретой свежей среды D10

Инкубируйте в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C

Через 48 часов после трансфекции конкатемера соберите трансфицированные клетки GPRG (выполните субкультивирование клеток).

Повторно рассейте клетки в культуральном флаконе T150 или в 30 мл, 150 мм культуральной чашке со свежей средой D10, содержащей зеоцин (50 мкг/мл) и доксициклин (1 нг/мл)

Подкармливайте клетки селективной средой (зеоцин, 50 мкг/мл) с доксициклином (1 нг/мл) каждые 3-4 дня, пока не идентифицируются клеточные фокусы (обычно наблюдаются в течение 1-2 недель)

Пример 5. Описание клеточных линий и последовательностей, используемых для создания упаковочной клеточной линии GPRG

HEK-293T/17 являются субклоном HEK-293T. Эти клетки стабильно экспрессируют антиген SV-40T, и конкретный клон выбирался специально по его высокой трансфицируемости. Был создан маточный банк клеток на основе HEK-293T/17 (HEK-293T/17 MCB).

SFG-IC-HIVgp-Ppac2 является гамма-ретровирусным вектором, который экспрессирует кодон-оптимизированный gagpol ВИЧ под контролем промотора CMV с устойчивостью к пуромицину. Плазмиду (pSFG-IC-HIVgp-Ppac2), которая использовалась для изготовления этого вектора, была сконструирована с использованием следующих компонентов:

(1) pSFG tcLuc ECT3 представляет собой производную от ретровирусной векторной основной плазмиды (SFG), адаптированную для регулируемой экспрессии гена с использованием промоторной системы, регулируемой тетрациклином (Lindemann, D., Patriquin, E., Feng, S., & Mulligan, R.C. Versatile retrovirus vector systems for regulated gene expression in vitro and in vivo. Mol. Med. 3, 466–476 (1997));

(2) управляемый CMV-энхансером/промотором кодоноптимизированный ген gagpol HIV NL4-3;

(3) ген устойчивости к пуромицину под управлением промотора PGK, полученный из pMSCVpac (Hawley, R.G., Lieu, F.H., Fong, A.Z., & Hawley, T.S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136–138 (1994)).

Инфекция HEK-293T/17 MCB с помощью ретровирусного вектора SFG-IC-HIVgp-Ppac2 продуцируемого клеточной линией GP.

SFG-tc-revco представляет собой гамма- ретровирусный вектор, который экспрессирует кодоноптимизированный HIV rev под контролем тетрациклин-респонсивного промотора. Плазмиду, используемую для получения этого вектора (pSFG-tc-revco), сконструировали с использованием следующих компонентов:

(1) ген HIV rev, основанный на последовательности штаммов NL4-3, как указано выше, и

(2) pSFG tcLuc ECT3 (описано выше)

SFG-tTA представляет собой гамма-ретровирусный вектор, который экспрессирует химерный транскрипционный трансактиватор под контролем ретровирусного LTR (Lindemann, D., Patriquin, E., Feng, S., and Mulligan, R.C. Versatile retrovirus vector systems for regulated gene expression in vitro and in vivo. Mol. Med. 3, 466–476 (1997)). Он основан на ретровирусном векторе SFG, включает элемент промотора Tet из плазмиды pUHD15-1 (Gossen M и Bujard, H. (1992) PNAS 89 12:5547-5551).

Инфекция клеточной линии GP с помощью SFG-tc-revco и SFG-tTA-продуцирующей клеточной линии GPR

SFG-tc-VSVG представляет собой гамма- ретровирусный вектор, который экспрессирует VSV-гликопротеин G под контролем тетрациклин-регулируемого промотора. Плазмиду, используемую для создания этого вектора (pSFG-tc-VSVG), получали с использованием той же самой системы pSFGtcLucECT3, что и другие векторы, и плазмиды pMD.G в качестве источника белка оболочки VSVG (см. Ory, D.S., Neugeboren, B.A., and Mulligan, R.C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11400–11406 (1996) и Rose, J. K. & Gallione, C. (1981) J. Virol. 39, 519-528).

Инфекция линии клеток GPR с помощью SFG-tc-VSVG-продуцирующей клеточной линии GPRG.

Инфекция линии клеток GPR с помощью Retro-SVGmu для получения клеточной линии GPRS описана в Lee, Chi-Lin et al. “Construction of Stable Producer Cells to Make High-Titer Lentiviral Vectors for Dendritic Cell-Based Vaccination.” Biotechnology and Bioengineering 109.6 (2012): 1551–1560. PMC. Web. 14 Apr. 2016.

Пример 6. Очистка конкатамерных матриц

Конкатамер собирали и очищали перед трансфекцией в клетки GPRG с помощью мембраны на основе диоксида кремния (набор DNeasy Blood & Tissue Kit).

Нанесите смесь конкатамерных матриц на колонку DNeasy Mini, помещенную в пробирку для сбора объемом 2 мл.

Центрифугируйте при 6000 × g в течение 1 мин. Отбросьте элюат и пробирку для сбора.

Поместите спин-колонку DNeasy Mini в новую пробирку для сбора объемом 2 мл (прилагается)

Добавьте 500 мкл буфера AW1 и центрифугируйте в течение 1 мин при 6000 × g.

Отбросьте элюат и пробирку для сбора.

Поместите спин-колонку DNeasy Mini в новую пробирку для сбора 2 мл (прилагается)

Добавьте 500 мкл буфера AW2 и центрифугируйте в течение 3 мин при 20 000 × g для сушки мембраны DNeasy.

Отбросьте элюат и пробирку для сбора.

Поместите колонку DNeasy Mini в чистую микроцентрифужную пробирку Eppendorf емкостью 1,7 мл

Добавьте 200 мкл буфера AE непосредственно на мембрану DNeasy.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение 4 минут

Центрифугируйте в течение 1 мин при 6000 × g для элюирования смесей ДНК.

Повторите элюцию еще раз (добавьте новый буфер для элюции)

Измерьте концентрацию конкатемерной ДНК с помощью спектрофотометра NanoDrop Lite.

Пример 7. Линия клеток-продуцентов TL20-UbcGFP & Cal1-WPRE

В приведенной ниже таблице суммируются данные по двум линиям клеток-продуцентов, которые были синтезированы в соответствии с описанными в данном документе способами. Данные, относящиеся к векторам TL20-Cal1-wpre и TL20-Unc-GFP, дополнительно проиллюстрированы на фиг. 20А, 20В и 20С.

Отбор и Скрининг	TL20c-Ubc-GFP	TL20c-Cal1-WPRE
Способ	Сортировка одиночных клеток2	Сортировка одиночных клеток2
Плотность посева клеток	1 клетка/лунку	1 клетка/лунку
Культуральная среда	Кондиционированная среда	Кондиционированная среда
Эффективность формирования клонов	28/96	22/96
Полностью размножены	16	17
Оцененные клоны	16	5
Поликлональное продуцирование векторов	5,77 × 105 TU/ мл	4,50 × 105 TU/ мл
Продуктивность лучших клонов	1,36 × 107 TU/ мл	3,0 × 106 TU/ мл

Все публикации, упомянутые в данном описании, включены в данный документ ссылкой во всей их полноте. Как будет понятно специалистам в данной области техники, с раскрытием могут быть осуществлены многочисленные вариации и/или модификации, как показано в конкретных воплощениях без отступления от сущности или объема раскрытия в широком смысле. Поэтому настоящие воплощения должны рассматриваться во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничительные.

Хотя раскрытие в данном документе описано со ссылкой на конкретные воплощения, следует понимать, что эти воплощения просто иллюстрируют принципы и применения настоящего раскрытия. Поэтому следует понимать, что в иллюстративные воплощения могут быть внесены многочисленные модификации и что могут быть разработаны другие устройства, не отступающие от сущности и объема настоящего раскрытия, как определено прилагаемой формулой изобретения.

1. Лентивирусная векторная трансферная плазмида, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую векторную кассету TL20c, нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал упаковки; нуклеотидную последовательность, кодирующую центральный полипуриновый тракт; нуклеотидную последовательность, кодирующую респонсивный элемент Rev; и нуклеотидную последовательность, кодирующую самоинактивирующийся длинный концевой повтор;, и где плазмида включает сайт множественного клонирования, включающий четыре сайта рестрикционных эндонуклеаз, где четыре сайта рестрикционных нуклеаз выбраны из группы, состоящей из BstBI, MluI, NotI, ClaI, ApaI, XhoI, XbaI, HpaI, NheI, PacI, NsiI, SphI, Sma/Xma, AccI, BamHI и SphI.

2. Лентивирусная векторная трансферная плазмида по п. 1, в которой нуклеотидная последовательность векторной кассеты включает последовательность SEQ ID NO: 2.

3. Лентивирусная векторная трансферная плазмида по п. 1, в которой четыре сайта рестрикционных эндонуклеаз представляют собой сайты рестрикционных эндонуклеаз BstBI, MluI, NotI и ClaI.

4. Лентивирусная векторная трансферная плазмида по п. 1, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт множественного клонирования, включает последовательность SEQ ID NO: 7.

5. Лентивирусная векторная трансферная плазмида по п. 1, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал упаковки, включает последовательность SEQ ID NO: 3.

6. Лентивирусная векторная трансферная плазмида по любому из предшествующих пунктов, которая включает тетрациклин-репрессируемый промотор, находящийся выше по последовательности относительно векторной кассеты.

7. Лентивирусная векторная трансферная плазмида по любому из предшествующих пунктов, в которой векторная кассета фланкирована, по меньшей мере, двумя сайтами рестрикционных эндонуклеаз, по меньшей мере, двумя сайтами рестрикционных эндонуклеаз, независимо выбранных из группы, состоящей из sfiI и Bsu36I.

8. Лентивирусная векторная трансферная плазмида по любому из предшествующих пунктов, которая содержит нуклеотидную последовательность, SEQ ID NO: 1.

9. Лентивирусная векторная трансферная плазмида по любому из предшествующих пунктов, которая содержит нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 95% последовательности SEQ ID NO: 1.

10. Лентивирусная векторная трансферная плазмида по любому из предшествующих пунктов, которая содержит от 6500 нуклеотидов до 6750 нуклеотидов.

11. Конкатамерная матрица для применения в получении и/или трансфекции упаковывающей клеточной линии, содержащая фрагменты ДНК, полученные из векторной кассеты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.

12. Конкатамерная матрица по п. 11, которая представляет собой направленную конкатамерную матрицу, содержащую фрагменты ДНК, полученные из плазмиды по п. 8.

13. Упаковочная клеточная линия, трансфицированная конкатамерной матрицей по любому из пп. 11, 12, для получения стабильной линии клеток-продуцентов, где упаковочная клеточная линия представляет собой GPRG.

14. Стабильная клеточная линия-продуцент, выбранная из трансфицированной упаковочной клеточной линии по п. 13.

15. Лентивирусная векторная трансферная плазмида по п. 1, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая центральный полипуринный тракт, включает последовательность SEQ ID NO: 4.

16. Лентивирусная векторная трансферная плазмида по п. 1, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая элемент ответа Rev, содержит последовательность SEQ ID NO: 5.

17. Лентивирусная векторная трансферная плазмида по п. 1, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая самоинактивирующийся длинный концевой повтор, включает последовательность SEQ ID NO: 6.