Анти-cll1-специфические одноцепочечные химерные антигенные рецепторы (sccar) для иммунотерапии рака

Авторы патента:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (CAR), обладающий способностью перенаправлять специфичность и реактивность иммунных клеток на CLL1-позитивные клетки. Также изобретение относится к кодирующим CAR полинуклеотидным молекулам, к получению и использованию сконструированной Т-клетки, экспрессирующей на своей клеточной поверхности CAR по изобретению. Сконструированные иммунные клетки, наделенные указанными CAR, наиболее пригодны для иммунотерапии при лечении рака, в частности лейкозов. 6 н. и 39 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл., 2 пр.

Область техники, к которой относится изобретение

Лектинподобная молекула-1 С-типа (молекула 1 с доменом, подобным лектину С-типа) (CLL1) идентифицирована в качестве молекулы, для которой часто характерна сверхэкспрессия в основном на (миелоидных) стволовых клетках (LSC) при остром миелоидном лейкозе (AML) по сравнению со здоровыми гематопоэтическими стволовыми клетками или другими типами клеток. В настоящем изобретении предложены способы целенаправленного воздействия на CLL1-позитивные злокачественные клетки с помощью химерных антигенных рецепторов (анти-CLL1-CAR), которые представляют собой рекомбинантные химерные белки, обладающие способностью перенаправлять специфичность и реактивность иммунных клеток на выбранный мембранный антиген CLL1. Более конкретно, указанные анти-CLL1 CAR содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, содержащий scFV из некоторых специфичских моноклональных антител к CLL1. Сконструированная иммунные клетки, несущие указанные CAR, обеспечивают адаптивный иммунитет против CLL1-позитивных клеток в качестве компонента различных клеточных терапий, предназначенных для лечения рака, прежде всего гематологических видов рака, с более высокой эффективностью.

Предпосылки создания изобретения

Адаптивная иммунотерапия, в которой применяют перенос аутологичных антигенспецифических Т-клеток, созданных ex vivo, представляет собой перспективную стратегию для лечения вирусных инфекций и рака. Т-клетки, применяемые для адаптивной иммунотерапии, можно создавать либо путем размножения антигенспецифических Т-клеток, либо посредством перенаправления Т-клеток с помощью методов генетической инженерии (Park, Rosenberg и др., 2011). Перенос Т-клеток, специфических в отношении вирусных антигенов, является хорошо зарекомендовавшей себя процедурой, которую применяют для лечения ассоциированных с трансплантацией вирусных инфекций и редких связанных с вирусами злокачественных заболеваний. Продемонстрировано также, что выделение и перенос специфических в отношении опухоли Т-клеток приводит к успеху при лечении меланомы.

В Т-клетках были успешно созданы новые специфичности посредством генетического переноса трансгенных Т-клеточных рецепторов или химерных антигенных рецепторов (scCAR) (Jena, Dotti и др., 2010). scCAR представляют собой синтетические рецепторы, состоящие из «нацеливающего» фрагмента, ассоциированного с одним или несколькими сигнальными доменами в одной слитой молекуле. В целом, связывающий фрагмент scCAR состоит из антигенсвязывающего домена одноцепочечного антитела (scFv), который содержит фрагменты моноклонального антитела, представляющие собой вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, соединенные гибким линкером. Успешно применяли также связывающие фрагменты на основе доменов рецептора или лиганда. Сигнальные домены для первого поколения scCAR получали из цитоплазматической области дзета-цепей CD3 или гамма-цепей Fc-рецептора. Было продемонстрировано, что первое поколение scCAR позволяло успешно перенаправлять Т-клеточную цитотоксичность, однако для них не удалось обеспечить пролонгированное размножение и противоопухолевую активность in vivo. Для повышения выживаемости и усиления пролиферации модифицированных с помощью scCAR Т-клеток осуществляли добавление сигнальных доменов из костимуляторных молекул, включая CD28, ОХ-40 (CD134) и 4-1 ВВ (CD137), по отдельности (второе поколение) или в комбинации (третье поколение). scCAR позволяли успешно перенаправлять Т-клетки на антигены, экспрессируемые на поверхности опухолевых клеток при различных злокачественных заболеваниях, включая лимфомы и солидные опухоли (Jena, Dotti и др., 2010)

Следует отметить, что индукционные терапии острого миелоидного лейкоза (AML) в основном не изменялись в течение практически 50 лет, и AML остается заболеванием с плохим прогнозом. AML представляет собой заболевание, характеризующееся быстрой пролиферацией незрелых миелоидных клеток в костном мозге, что приводит к нарушению гематопоэза. Хотя стандартная индукционная химиотерапия может приводить к полным ремиссиям, у многих пациентов, в конце концов, наступает рецидив и смерть в результате заболевания, что требует разработки новых терапевтических средств для лечения AML. Достигнутые в последние годы успехи в иммунофенотипировании AML-клеток позволили обнаружить несколько ассоциированные с AML антигенов клеточной поверхности, которые могут действовать в качестве мишеней для будущих терапий.

Среди прочего, CLL1 (лектинподобная молекула-1 С-типа), вероятно, может являться представляющим интерес опухолевым антигеном-мишенью, поскольку экспрессируется лейкозными бластными клетками у 85-92% проанализированных пациентов с диагностированным AML. Она является представителем семейства молекул группы V лектинподобного рецептора С-типа с молекулярной массой 75 кДа. Молекулы группы V имеют лектинподобный домен, который связывается с лигандами, не относящимися к сахарам. CLL1 представляет собой состоящий из 265 аминокислот трансмембранный гликопротеин типа II (база данных Uniprot: Q5QGZ9 для человеческого белка, кодируемого геном, имеющим код доступа (n°) 160364 в базе данных «Entrez Gene»), который содержит состоящий из 200 ак внеклеточный домен. CLL1 обозначают также в литературе и в базах данных как MICL, CLEC12 и KLRL1.

Bakker с соавторами (Bakker и др., 2004) продемонстрировали, что антиген CLL1 ассоциирован со стволовыми клетками AML. Подобно некоторым другим антигенам (таким как CD33), CLL1 представляет собой белок клеточной поверхности, который специфически экспрессируется на большинстве злокачественных лимфоидных стволовых клетках (AML LSC), но не экспрессируется на здоровых HSC (Van Rhenen и др., 2007). Поэтому CLL1 рассматривается в качестве диагностического маркера при AML (Larsen и др., 2012). Антитела к CLL-1 дают возможность как выявлять AML-специфические стволовые клетки и, вероятно, осуществлять направленный перенос к антигену, так и отличать злокачественные клетки от здоровых стволовых клеток, как при диагностировании, так и при определении ремиссии (van Rhenen и др., 2007). Однако ни одно из описанных к настоящему времени антител не прошло испытания в клинических условиях в качестве терапевтических антител.

Для лечения лимфом часто используются моноклональные антитела, но их применение при лейкозах является более ограниченным. Гемтузумабозогамицин (Mylotarg^®) представляет собой моноклональное антитело с присоединенным к нему токсичным для клеток агентом. Ранее одобренный для лечения AML у престарелых пациентов этот препарат был отозван с рынка после проведения исследований, в которых была обнаружена некоторая токсичность, ассоциированная с этим препаратом (пресс-релиз от 10 декабря 2010 г. в PMLIVE «ASH: Pfizer eyes re-launch of Mylotarg»). В последние 10 лет побочные действия обнаружены у других моноклональных терапевтических антител (Klastersky J. «Adverse effects of the humanized antibodies used as cancer therapeutics» Current Opinion in Oncology. 18(4), 2006, сс. 316-320).

В публикации Zhang и др., 2011 описаны мицеллярные наночастицы, ковалентно сшитые с «нацеливающими» на CLL1 пептидами для направленного переноса лекарственного средства (даунорубицин); эти «нацеливающие наномицеллы» транспортируют груз в виде лекарственного средства к внутренней области клеток, экспрессирующих CLL1, и к LSC, выделенным из клинических образцов in vitro. Было установлено, что применение «нацеливающих» на CLL1 наномицелл является перспективным для направленного переноса лекарственных средств к лейкозным стволовым клеткам. Однако никакие терапевтические действия не связаны с самим «нацеливающим» на CLL1 пептидом.

В свете вышеизложенного при создании изобретения осуществлен поиск нового подхода к нацеливанию на CCL1 с использованием иммунных клеток, наделенных специфическими химерными антигенными рецепторами, на основе моноклональных антител к CLL1, которые перенаправляют специфичность иммунных клеток к CLL1-позитивным клеткам.

Для сконструированных иммунных клеток, полученных с помощью указанного подхода, доказана способность эффективно элиминировать CLL1-позитивные злокачественные клетки. В частности, они вероятно могут оказаться особенно ценными в контексте производства аллогеннных TCR-негативных сконструированных иммунных клеток, что позволяет снижать побочные действия, такие как GvHD.

Таким образом, настоящее изобретение открывает путь к лечению пациентов, пораженных состоянием, для которого характерен избыток CLL1-экспрессирующих клеток, с помощью адаптивной иммунотерапии. Более того, при создании настоящего изобретения сконструированы аллогенные иммунные клетки, которые можно применять в качестве «готовых (имеющихся в наличии)» аллогенных терапевтических продуктов. В качестве дополнительного преимущества изобретения CAR-позитивные сконструированные клетки можно получать так, чтобы они были совместимы (т.е. устойчивы) с химиотерапевтическими или истощающими иммунную систему режимами лечения, приводя к достижению синергетических действий между химиотерапией и иммунотерапией.

Краткое изложение сущности изобретения

При создании изобретения созданы CLL1-специфические одноцепочечные scCAR, обладающие различной структурой и содержащие различные scFV, полученные из различных специфических в отношении CLL1 антител.

В частности, при создании изобретения разработаны специфические в отношении CLL1 одноцепочечные CAR (scCAR), которые содержат VH- и VL-цепи, полученные из антител SC02-357, SC02-378, SC02-161, М26, М31, G4, М22, М29, М2, М5, G12, 21.26 и 1075.7 с различными структурами, и идентифицированы высокоспецифические и обладающие очень высокой селективностью конструкции scCAR, которые связываются с экспрессирующими CLL1 клетками и избирательно разрушают экспрессирующие CLL1 раковые клетки.

После неспецифической активации in vitro (например, с использованием покрытых CD3/CD28 гранул и рекомбинантного IL2) Т-клетки из доноров трансформировали полинуклеотидами, экспрессирующими указанные scCAR, используя вирусную трансдукцию. В некоторых случаях Т-клетки подвергали дополнительному конструированию для создания менее аллореактивных или неаллореактивных Т-клеток, более конкретно путем разрушения компонента TCR (αβ-цепи Т-клеточных рецепторов) для предупреждения реакции «трансплантат-против хозяина».

Т-клетки конструировали также с целью создания Т-клеток, устойчивых к противораковым лекарственным средствам, для их применения в комбинации с указанными классическими противораковыми лекарственными средствами.

Полученные сконструированные Т-клетки обладали разной степенью реактивности in vitro в отношении CLL1-позитивных клеток, что свидетельствует о том, что scCAR, предлагаемые в настоящем изобретении, принимали участие в антигензависимой активации, а также пролиферации Т-клеток, что делает возможным их применение для иммунотерапии.

Полученные сконструированные Т-клетки обладали реактивностью in vivo в отношении CLL1-позитивных клеток и значительно снижали количество раковых клеток in vivo.

Сконструированные Т-клетки, предлагаемые в изобретении, которые созданы для проявления реактивности in vivo в отношении CLL1-позитивных клеток, хорошо переносятся при их применении в сочетании с противораковыми лекарственными средствами. В конкретном варианте осуществления изобретения сконструированные Т-клетки, предлагаемые в изобретении, сохраняют эффективность даже после несколько введений, что делает их ценными для иммунотерапии в качестве первой обработки (индукции), в качестве консолидированного лечения, в качестве лечения в комбинации с классической противораковой химиотерапией.

В настоящей заявке подробно описаны полипептиды и полинуклеотидные последовательности, которые кодируют CAR, предлагаемые в настоящем изобретении.

Сконструированные иммунные клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, наиболее пригодны для таких терапевтических применений, как лечение острого миелолейкоза (AML).

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - схематическое изображение сконструированной иммунной клетки, предлагаемой в изобретении. Сконструированная иммунная клетка, указанная на этом чертеже, представляет собой Т-клетку, трансдуцированную ретровирусным вектором, кодирующим CLL1-scCAR. Указанную Т-клетку конструировали также с целью обеспечения улучшенного и более безопасного приживления трансплантата пациенту, что необязательно подпадает под объем настоящего изобретения. Ген Х может представлять собой, например, ген, экспрессирующий компонент TCR (TCRальфа или TCRбета), ген Y может представлять собой ген, с которым связана чувствительность Т-клетки к иммуносупрессорным лекарственным средствам типа средств, мишенью которых является CD52 (таких как Campath (Кэмпас) или HPRT (таких как 6-тиогуанин);

на фиг. 2 - схематическое изображение различной архитектуры scCAR (V1-V6), предлагаемого в изобретении (анти-CLL1 scCAR), с компонентами, которые представлены ниже в таблице 1;

на фиг. 3А и фиг. 3Б - схематическое изображение приведенных в качестве примера CLL1-специфических CAR, предлагаемых в изобретения, которые включают различные эпитопы МАт, являющиеся метками для Т-клеточного истощения, прежде всего мимеотоп(ы) CD20, которые создают для уменьшения возможности возникновения побочных действий, связанных с инъекцией CAR-позитивных клеток;

(A) CLL1-специфический прототип CAR, предлагаемый в настоящем изобретении, не включающий метящую эпитоп последовательность для сортировки или истощения клеток: V1 и v2 обозначают либо VH-, либо VL-цепь соответственно антитела, которое связывается с CLL1, ТМ: трансмембранный домен, L: линкер, ТМ: трансмембранный домен (предпочтительно трансмембранный домен CD8α), 4-1BB: внутриклеточной костимуляторный домен, CD3 ITAM: активирующий домен.

(Б) Архитектуры CLL1-специфических CAR, предлагаемых в изобретении, которые дополнительно включают по меньшей мере один эпитоп, встроенный во внеклеточный лигандсвязывающий домен CAR, где указанный эпитоп встроен между VH- и VL-цепями; к указанному эпитопу могут примыкать («окаймлять») различные линкеры;

(B): Архитектуры CLL1-специфических CAR, предлагаемых в изобретении, в которых два эпитопа встроены во внеклеточный лигандсвязывающий домен CAR, один встроен между N-концом CAR и VH-цепью, к указанному эпитопу может примыкать по меньшей мере один или два линкера; второй эпитоп встроен между VH- и VL-цепями, к указанному 2-ому эпитопу могут также примыкать по меньшей мере один или два линкера. Архитектуры, проиллюстрированные в настоящем описании, различаются линкерами, применяемыми для «окаймления» 2-ого эпитопа.

(Г): Архитектуры CLL1-специфических CAR, предлагаемых в изобретении, в которых два эпитопа встроены во внеклеточный лигандсвязывающий домен CAR, один встроен между VH- и VL-цепями; другой эпитоп встроен между VL-цепью и шарниром, к каждому из указанных эпитопов может примыкать также по меньшей мере один или два линкера. Архитектуры, проиллюстрированные в настоящем описании, различаются линкерами, применяемыми для «окаймления» 1-го эпитопа.

(Д): Архитектуры CLL1-специфических CAR, предлагаемых в изобретении, в которых два эпитопа встроены во внеклеточный домен CAR, один встроен между N-концом CAR и VH-цепью, к указанному эпитопу примыкает по меньшей мере один или два линкера; второй эпитоп встроен между VL-цепью и шарниром, к указанному 2-ому эпитопу примыкают также указанные линкеры.

(Е): Архитектуры CLL1-специфических CAR, предлагаемых в изобретении, в которых два эпитопа встроены во внеклеточный домен CAR, один встроен между N-концом CAR и VH-цепью, к указанному эпитопу примыкает по меньшей мере один или два линкера; второй эпитоп встроен между VH- и VL-цепями, к указанному эпитопу примыкают также указанные линкеры, и третий эпитоп встроен между VL-цепью и шарниром. Эти две архитектуры различаются линкерами, применяемыми для «окаймления» 2-ого эпитопа.

(Ж): Архитектуры CLL1-специфических CAR, предлагаемых в изобретении, в которых по меньшей мере два эпитопа (предпочтительно эпитопы CD20) встроены во внеклеточный лигандсвязывающий домен между шарниром и VH- и VL-цепями анти-CLL1. В третьей приведенной в качестве примера архитектуре один эпитоп CD34 включен между двумя эпитопами CD20. Можно предусматривать дополнительные архитектуры, в которых CD34 заменяет любой другой из указанных ранее эпитопов CD20.

(З): Архитектуры CLL1-специфических CAR, предлагаемых в изобретении, в которых по меньшей мере два эпитопа встроены на конец внеклеточного лигандсвязывающего домена.

Подробное описание изобретения

Если специально не указано иное, то все технические и научные понятия, использованные в настоящем описании, имеют значение, которое является общепринятым для специалистов в области генной терапии, биохимии, генетики и молекулярной биологии.

Для осуществления на практике или тестирования настоящего изобретения можно применять все методы и материалы, сходные или эквивалентные тем, которые указаны в настоящем описании, при этом в настоящей заявке описаны приемлемые методы и материалы. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. В случае разночтения следует руководствоваться настоящим описанием, включая определения. Кроме того, материалы, методы и примеры представлены только для иллюстрации и не направлены на ограничение объема изобретения, если не указано иное.

При осуществлении на практике настоящего изобретения следует применять, если не указано иное, общепринятые методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, известные специалисту в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, см., например, Frederick M. AUSUBEL, Current Protocols in Molecular Biology, изд-во Wiley and son Inc, Library of Congress, USA, 2000; Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001; Oligonucleotide Synthesis, под ред. M.J. Gait, 1984; Mullis и др., US №4683195; Nucleic Acid Hybridization, под ред. В.D. Harries и S.J. Higgins, 1984; Transcription And Translation, под ред. В.D. Hames и S.J. Higgins, 1984; R.I. Freshney, Culture Of Animal Cells, изд-во Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells And Enzymes, изд-во IRL Press, 198; В. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984; серия: Methods In ENZYMOLOGY, под. ред. J. Abelson и M. Simon, изд-во Academic Press, Inc., New York, прежде всего т. 154 и т. 155, под ред. Wu и др., и т. 185, «Gene Expression Technology», под ред. D. Goeddel; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, под ред. J.H. Miller и M.P. Calos, 1987, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, под ред. Mayer и Walker, изд-во Academic Press, London, 1987; Handbook Of Experimental Immunology, тома I-IV, под ред. D.M. Weir и С.С. Blackwell, 1986; и Manipulating the Mouse Embryo, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986.

В настоящем изобретении предложены:

1. CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR), который содержит по меньшей мере:

- внеклеточный лигандсвязывающий домен анти-CLL1,

- трансмембранный домен и

- цитоплазматический сигнальный домен.

2. CLL1-специфический химерный антигенный рецептор по варианту осуществления изобретения 1, дополнительно содержащий костимуляторный домен.

3. CLL1-специфический химерный антигенный рецептор по варианту осуществления изобретения 1, дополнительно содержащий костимуляторный домен CD28 или 4-1 ВВ.

4. CLL1-специфический химерный антигенный рецептор по одному из вариантов осуществления изобретения 1-3, в котором трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD8a.

5. CLL1-специфический химерный антигенный рецептор по одному из вариантов осуществления изобретения 1-4, дополнительно содержащий шарнирную область.

6. CLL1-специфический химерный антигенный рецептор по одному из вариантов осуществления изобретения 1-5, в котором указанный цитоплазматический сигнальный домен представляет собой активирующий Т-клетку домен.

7. CLL1-специфический химерный антигенный рецептор по одному из вариантов осуществления изобретения 1-6, где указанный химерный антигенный рецептор экспрессируется в форме единичного полипептида.

8. CLL1-специфический химерный антигенный рецептор по одному из вариантов осуществления изобретения 1-7, в котором указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен происходит из моноклонального антитела к CLL1.

9. CLL1-специфический химерный антигенный рецептор по варианту осуществления изобретения 8, в котором внеклеточный лигандсвязывающий домен содержит CDR из VH- и VL-доменов моноклонального(ых) антитела(л) к CLL1.

10. CLL1-специфический химерный антигенный рецептор по варианту осуществления изобретения 9, в котором указанные CDR выбраны из SEQ ID NO: 109-190.

11. CLL1-специфический scCAR no одному из вариантов осуществления изобретения 1-10, который имеет одну из полипептидных структур, выбранных из V1, V3 и V5, которые проиллюстрированы на фиг. 2, указанная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир, трансмембранный домен CD8α, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен СD3дзета и костимуляторный домен из 4-1 ВВ.

12. CLL1-специфический scCAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-11, в котором указанная структура V1 содержит шарнир FcγRIIIα и трансмембранный домен CD8α.

13. CLL1-специфический scCAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-11, в котором указанная структура V3 содержит шарнир CD8α и трансмембранный домен CD8α.

14. CLL1-специфический scCAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-11, в котором указанная структура V5 содержит шарнир IgG1 и трансмембранный домен CD8α.

15. CLL1-специфический scCAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-14, в котором указанные VH и VL идентичны по меньшей мере на 80% полипептидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 11-34.

16. CLL1-специфический scCAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-15, в котором костимуляторный домен из 4-1 ВВ идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 8.

17. CLL1-специфический scCAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-16, в котором указанный сигнальный домен CD3дзeта идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 9.

18. CLL1-специфический scCAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-12 или 15-17, в котором указанный шарнир FcγRIIIα идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 3.

19. CLL1-специфический scCAR no одному из вариантов осуществления изобретения 1-11, 13 или 15-17, в котором указанный шарнир CD8α идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 4.

20. CLL1-специфический scCAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-11 или 14-19, в котором указанный шарнир IgG1 идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 5.

21. CLL1-специфический scCAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-20, в котором указанный трансмембранный домен CD8α идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 6.

22. CLL1-специфический scCAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-21, который дополнительно содержит другой внеклеточный лигандсвязывающий домен, не обладающий специфичностью в отношении CLL1.

23. CLL1-специфический scCAR, имеющий структуру V1, по одному из вариантов осуществления изобретения 1-12, 15-17 или 21-22, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101 или 107.

24. CLL1-специфический scCAR, имеющий структуру V3, по одному из вариантов осуществления изобретения 1-11, 13, 15-17 или 21-22, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103 или 109.

25. CLL1-специфический scCAR, имеющий структуру V5, по одному из вариантов осуществления изобретения 1-11, 14-19 или 21-22, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% SEQ IDNO: 39, 45,51, 57,63,69, 75, 81, 87, 93, 99, 105 или 111.

26. CLL1-специфический scCAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-25, дополнительно содержащий сигнальный пептид.

27. CLL1-специфический scCAR по варианту осуществления изобретения 26, в котором указанный сигнальный пептид имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

28. CLL1-специфический scCAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-27, в котором внеклеточный связывающий домен содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 МАт-специфических эпитопов.

29. Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1-28, в котором внеклеточный связывающий домен содержит 1, 2, 3 или 4 МАт-специфических эпитопа.

30. Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1-29, в котором внеклеточный связывающий домен содержит 2, 3 или 4 МАт-специфических эпитопа.

31. Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1-30, в котором внеклеточный связывающий домен содержит следующую последовательность

V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп1-(L)_x-;

V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-;

V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-эпитоп4-(L)_x-;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-эпитоп4-(L)_x-;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-эпитоп4-(L)_x;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₂; или

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-V₂-(L)_х-эпитоп3-(L)_x;

где

V₁ обозначает V_L и V₂ обозначает V_H или V₁ обозначает V_H и V₂ обозначает V_L;

L₁ обозначает линкер, который можно применять для связи V_H-цепи с V_L-цепью;

L обозначает линкер, содержащий глициновые и сериновые остатки, и каждый из присутствующих во внеклеточном связывающем домене L может быть идентичен или отличаться от другого L, присутствующего в том же самом внеклеточном связывающем домене, и

х обозначает 0 или 1 и каждый из присутствующих х выбирают независимо от других; и

эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 3 представляют собой МАт-специфические эпитопы, и они могут быть идентичными или различными.

32. Полипептид по варианту осуществления изобретения 31, в котором внеклеточный связывающий домен содержит следующую последовательность V₁-L₁-V₂-L-эпитоп; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3; V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L; V₁-L₁-V₂-эпитоп1; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3; V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L; эпитоп1-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-V₁ -L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-L-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-V₁-L₁-V₂; эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-V₁-L₁-V₂; L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L-V₁-L₁-V₂; V₁-L-эпитоп1-L-V₂; L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-эпитоп3; V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3-эпитоп4; L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3-L; эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3-L; L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3; L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-эпитоп3 или эпитоп1-L-V₁-L₁ -V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3-эпитоп4,

где

V₁ обозначает V_L и V₂ обозначает V_H или V₁ обозначает V_H и V₂ обозначает V_L;

L₁ обозначает любой линкер, который можно применять для связи V_H-цепи с V_L-цепью;

L обозначает линкер, содержащий глициновые и сериновые остатки, и каждый из присутствующих во внеклеточном связывающем домене L может быть идентичен или отличаться от другого L в том же самом внеклеточном связывающем домене, и

33. Полипептид по варианту осуществления изобретения 31 или 32, в котором L₁ обозначает линкер, содержащий глицин и/или серии.

34. Полипептид по варианту осуществления изобретения 33, в котором L₁ обозначает линкер, содержащий аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)_n или (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n, где n обозначает 1, 2, 3, 4 или 5.

35. Полипептид по варианту осуществления изобретения 34, в котором L₁ обозначает линкер, содержащий аминокислотную последовательность (Gly₄Ser)₄ или (Сly₄Ser)₃.

36. Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 31-35, в котором L обозначает линкер, содержащий глицин и/или серин.

37. Полипептид по варианту осуществления изобретения 36, в котором L обозначает линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS или SGGGGSGGGGS.

38. Полипептид по варианту осуществления изобретения 37, в котором L обозначает SGGGG, GGGGS или SGGGGS.

39. Полипептид по одному из варианту осуществления изобретения 31-38, в котором эпитоп 1, эпитоп 2, эпитоп 3 и эпитоп 4 независимо выбирают из МАт-специфических эпитопов, которые специфически распознаются ибритумомабом, тиоксетаном, муромонабом-CD3, тозитумомабом, абциксимабом, базиликсимабом, брентуксимабом ведотином, цетуксимабом, инфликсимабом, ритуксимабом, алемтузумабом, бевацизумабом, цертолизумаба пеголом, даклизумабом, экулизумабом, эфализумабом, гемтузумабом, натализумабом, омализумабом, паливизумабом, ранибизумабом, тоцилизумабом, трастузумабом, ведолизумабом, адалимумабом, белимумабом, канакинумабом, деносумабом, голимумабом, ипилимумабом, офатумумабом, панитумумабом, QBEND-10, алемтузумабом или устекинумабом.

40. Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 31-38, в котором эпитоп 1, эпитоп 2, эпитоп 3 и эпитоп 4 независимо выбраны из МАт-специфических эпитопов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, EQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 или SEQ ID NO: 199.

41. Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 31-40, в котором эпитоп 1 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113.

42. Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 31-41, в котором эпитоп 2 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113.

43. Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 31-42, в котором эпитоп 3 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 198 или SEQ ID NO: 199.

44. Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 31-43, в котором эпитоп 4 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113.

45. Полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор по одному из вариантов осуществления изобретения 1-44.

46. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по варианту осуществления изобретения 45.

47. Сконструированная лимфоидная иммунная клетка, экспрессирующая на поверхности клеточной мембраны анти-CLL1 CAR по одному из вариантов осуществления изобретения 1-44.

48. Сконструированная лимфоидная иммунная клетка по варианту осуществления изобретения 41, происходящая из воспалительных Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или хелперных Т-лимфоцитов.

49. Сконструированная клетка по варианту осуществления изобретения 47 или 48, предназначенная для применения в терапии.

50. Сконструированная лимфоидная иммунная клетка по одному из вариантов осуществления изобретения 41-43, предназначенная для применения в терапии, где пациент представляет собой человека.

51. Сконструированная клетка по одному из вариантов осуществления изобретения 47-50, предназначенная для применения в терапии, где состояние представляет собой предзлокачественное или злокачественное связанное с раком состояние, отличающееся присутствием экспрессирующих CLL1 клеток.

52. Сконструированная клетка по одному из вариантов осуществления изобретения 47-51, предназначенная для применения в терапии, где состояние представляет собой состояние, отличающееся избыточным количеством экспрессирующих CLL1 клеток.

53. Сконструированная клетка по одному из вариантов осуществления изобретения 51-52, предназначенная для применения в терапии, где состояние представляет собой связанное с гематологическим раком состояние.

54. Сконструированная клетка по варианту осуществления изобретения 53, предназначенная для применения в терапии, где связанное с гематологическим раком состояние представляет собой лейкоз.

55. Сконструированная клетка по варианту осуществления изобретения 54, предназначенная для применения в терапии, где лейкоз представляет собой острый миелогенный лейкоз (AML).

56. Сконструированная клетка по одному из вариантов осуществления изобретения 47-55, где экспрессия TCR подавляется в указанной иммунной клетке.

57. Сконструированная клетка по одному из вариантов осуществления изобретения 47-55, где экспрессия по меньшей мере одного белка ГКГС, предпочтительно β2m или HLA, ингибируется или подавляется в указанной иммунной клетке.

58. Сконструированная клетка по одному из вариантов осуществления изобретения 47-57, где указанная клетка изменена в результате мутации для придания устойчивости по меньшей мере к одному иммуносупрессорному или химиотерапевтическому лекарственному средству.

59. Способ ослабления клетки гематологического рака, включающий приведение в контакт указанной клетки со сконструированной клеткой по одному из вариантов осуществления изобретения 47-58 в количестве, эффективном для ослабления указанной раковой клетки.

60. Способ конструирования иммунной клетки, включающий:

(а) получение иммунной клетки,

(б) экспрессию на поверхности указанной клетки по меньшей мере одного CLL1-специфического одноцепочечного химерного антигенного рецептора по одному из вариантов осуществления изобретения 1-44.

61. Способ конструированная иммунной клетки по варианту осуществления изобретения 60, включающий:

(а) получение иммунной клетки,

(б) интродукцию в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, который кодирует указанный CLL1-специфический одноцепочечный химерный антигенный рецептор,

(в) экспрессию указанного полинуклеотида в указанной клетке.

62. Способ конструированная иммунной клетки по варианту осуществления изобретения 61, включающий:

(а) получение иммунной клетки,

(в) интродукцию по меньшей мере одного другого химерного антигенного рецептора, не специфического в отношении CLL1.

63. Способ лечения индивидуума, который нуждается в этом, включающий:

(а) получение иммунной клетки, экспрессирующей на поверхности анти-CLL1-специфический одноцепочечный химерный антигенный рецептор по одному из вариантов осуществления изобретения 1-44;

(б) введение указанных иммунных клеток указанному пациенту.

64. Способ по варианту осуществления изобретения 63, в котором иммунную клетку получают из донора.

65. Способ по варианту осуществления изобретения 63, в котором указанную иммунную клетку получают из самого пациента.

CLL1-специфические одноцепочечные химерные антигенные рецепторы

Настоящее изобретение относится к CLL1-специфическому химерному антигенному рецептору, содержащему внеклеточный лигандсвязывающий домен, который специфически направлен против одной части антигена CLL1, трансмембранный домен и домен трансдукции сигнала.

Под химерным антигенным рецептором (CAR) подразумеваются молекулы, в которых объединены внеклеточный связывающий домен, направленный против компонента, который присутствует на клетке-мишени, например, происходящая из антитела специфичность в отношении требуемого антигена (например, опухолевого антигена), с компонентом рецептора иммунной клетки, с образованием химерного белка, который может трансдуцировать активирующий или ингибирующий сигнал для иммунной активности клеток.

Более конкретно настоящее изобретение относится к CLL1-специфическому химерному антигенному рецептору (анти-CLL1 CAR), содержащему по меньшей мере:

- внеклеточный лигандсвязывающий домен анти-CLL1,

- трансмембранный домен и

- цитоплазматический сигнальный домен.

Предпочтительно CLL1-специфический химерный антигенный рецептор, предлагаемый в изобретении, содержит также костимуляторный домен, более предпочтительно костимуляторный домен из CD28 или 4-1ВВ, описанный, например, у Jena В., G. Dotti и др., 2010). Он может содержать также трансмембранный домен, который может представлять собой трансмембранный домен CD8α, а также необязательную шарнирную область.

Домен трансдукции сигнала или «цитоплазматический сигнальный домен» CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, ответствен за внутриклеточную передачу сигнала после связывания внеклеточного лигандсвязывающего домена с мишенью, что приводит к активации или ингибированию иммунной клетки и иммунного ответа. Другими словами, домен трансдукции сигнала ответствен для активацию или инактивацию по меньшей мере одной из обычных эффекторных функций иммунной клетки, в которой экспрессируется CAR. Например, эффекторная функция Т-клетки может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов. Таким образом, понятие «цитоплазматический сигнальный домен» относится к части белка, которая трансдуцирует сигнал эффекторной сигнальной функции и принуждает клетку осуществлять специализированную функцию.

Цитоплазматический сигнальный домен, который предпочтительно имеет происхождение из человеческого белка, участвующего в пути(ях) трансдукции сигнала, в зависимости от природы сигнала определяет, представляет ли собой анти-CLL1 CAR позитивный CAR (PCAR), или негативный CAR (NCAR). Соответственно CAR представляет собой PCAR, когда сигнальный домен, такой как CD3дзета из человеческого TCR-рецептора, обладает способностью стимулировать клеточную иммунную активность иммунной клетки, когда внеклеточный лигандсвязывающий домен связывается с CLL1. И наоборот, анти-CLL1 CAR представляет собой NCAR или ингибирующий CAR (iCAR), когда сигнальный домен обладает способностью снижать клеточную иммунную активность, что имеет место в случае сигнальных доменов человеческих ингибирующих иммунную систему рецепторов CTLA-4 и PD-1 (Federov и др., Sci Transl Med. 5 (215), 11 декабря 2013 г., 215ra172). Предпочтительными примерами домена трансдукции сигнала для применения в анти-CLL1 CAR могут служить цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора и корецепторов, совместное действие которых состоит в инициации трансдукции сигнала после контакта с рецептором антигена, а также любое производное или любой вариант указанных последовательностей и любой синтетической последовательности, которая имеет такую же функциональную способность. Домен трансдукции сигнала содержит два различных класса цитоплазматических сигнальных последовательностей, те, которые инициируют антигензависимую первичную активацию, и те, которые действуют независимым от антигена образом, обеспечивая вторичный или костимуляторный сигнал. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность может содержать сигнальные мотивы, известные как мотивы активации иммунных рецепторов на основе тирозина, ITAM. ITAM представляют собой хорошо известные сигнальные мотивы, присутствующие во внутрицитоплазматическом «хвосте» различных рецепторов, которые служат в качестве сайтов связывания для класса syk/zap70 тирозинкиназ. Примерами ITAM, применяемых согласно изобретению, могут служить (но не ограничиваясь только ими) ITAM, происходящие из ТСRдзета, FcR-гамма, FcRбета, FcRэпсилон, CD3гамма, СD3дельта, СD3эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В предпочтительном варианте осуществления изобретения домен трансдукции сигнала анти-CLL1 CAR может содержать происходящий из CD3дзета сигнальный домен, который имеет аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99%, или 100% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 9.

Костимуляторная молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от антигенного рецептора или его лигандов, которая требуется для эффективного иммунного ответа. Понятие «костимуляторный лиганд» относится к молекуле на антигенпрезентирующей клетке, которая специфически связывается с когнатной костимуляторной молекулой на Т-клетке, создавая тем самым сигнал, который, в дополнение к первичному сигналу, создаваемому, например, при связывании комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, загруженной пептидом, опосредует Т-клеточный ответ, включая (но не ограничиваясь только ими) активацию пролиферации, дифференцировку и т.п. Костимуляторный лиганд может включать (но не ограничиваясь только ими) CD7, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцибельный костимуляторный лиганд (ICOS-L), молекулу межклеточной адгезии (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, рецептор лимфотоксина бета, 3/TR6, ILT3, ILT4, агонист или антитело, который/которое связывается с лигандом Толл-рецептора, и лиганд, который специфически связывается с В7-Н3. Под понятие «костимуляторный лиганд» подпадает, среди прочего, антитело, которое специфически связывается с костимуляторной молекулой, присутствующей на Т-клетке, такой как (но не ограничиваясь только ими) CD27, CD28, 4-1ВВ, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, антиген-1, ассоциированный с функцией лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, В7-Н3, лиганд, специфически связывающийся с CD83. Понятие «костимуляторная молекула» относится к когнатному связывающему партнеру, присутствующему на Т-клетке, который специфически связывается с костимуляторным лигандом, опосредуя тем самым костимуляторный ответ клетки, такой как (но не ограничиваясь только им) пролиферация. Костимуляторные молекулы включают (но не ограничиваясь только ими) молекулу ГКГС класса I, BTLA и лиганд Толл-рецептора. Примерами костимуляторных молекул являются CD27, CD28, CD8, 4-1ВВ (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, антиген-1, ассоциированный с функцией лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-Н3 и лиганд, специфически связывающийся с CD83, и т.п.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения костимуляторный домен анти-CLL1 CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит часть костимуляторной сигнальной молекулы, выбранной из группы, состоящей из фрагмента 4-1ВВ (GenBank: AAA53133.) и CD28 (NP_006130.1). В частности, домен трансдукции сигнала анти-CLL1 CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8.

Анти-CLL1 CAR, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит также трансмембранный домен (ТМ). Отличительными особенностями соответствующих трансмембранных доменов являются способность экспрессироваться на поверхности клетки, согласно настоящему изобретению предпочтительно на поверхности иммунной клетки, прежде всего лимфоцитов или естественных клеток-киллеров (NK), и взаимодействовать друг с другом, направляя клеточный ответ иммунной клетки на заранее определенную клетку-мишень. Трансмембранный домен можно получать как из встречающегося в естественных условиях, так и из синтетического источника. Трансмембранный домен можно получать из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка. Примерами трансмембранных полипептидов могут служить (но не ограничиваясь только ими) субъединица Т-клеточного рецептора, такая как α-, β-, γ- или ζ-субъединица, полипептид, образующий комплекс с CD3, р55 (α-цепь), р75 (β-цепь) или γ-цепь рецептора IL2, цепь субъединицы Fc-рецепторов, в частности, Fcγ-рецептора III, или CD-белки. Альтернативно этому, трансмембранный домен может быть синтетическим, и он может содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный трансмембранный домен получают из альфа-цепи человеческого CD8 (например, NP_001139345.1). Трансмембранный домен может содержать также шарнирную область между указанным внеклеточным лигандсвязывающим доменом и указанным трансмембранным доменом.

В контексте настоящего описания понятие «шарнирная область, шарнир», как правило, обозначает любой олиго- или полипептид, функция которого заключается в сцеплении трансмембранного домена с внеклеточным лигандсвязывающим доменом. В частности, шарнирную область используют для обеспечения большей гибкости и доступности внеклеточного лигандсвязывающего домена. Шарнирная область может содержать вплоть до 300 аминокислот, предпочтительно от 10 до 100 аминокислот, и наиболее предпочтительно от 25 до 50 аминокислот.Шарнирную область можно получать из полных встречающихся в естественных условиях молекул, или их частей, таких как полная внеклеточная область CD8, CD4 или CD28, или ее часть, или полная константная область антитела или ее часть. Альтернативно этому, шарнирная область может представлять собой синтетическую последовательность, которая соответствует встречающейся в естественных условиях шарнирной последовательности, или может представлять собой полностью синтетическую шарнирную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная шарнирная область представляет собой часть альфа-цепи человеческого CD8, FcγRIIIα-рецептора или IgG1 соответственно, которые обозначены в настоящем описании как SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, или шарнирные полипептиды, последовательности которых идентичны предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% последовательностям указанных полипептидов. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения шарнир может представлять собой также шарнир человеческого Ig (иммуноглобулин), например, шарнир PD-1, шарнир IgG4.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения анти-CLL1 CAR, предлагаемый в изобретении, содержит трансмембранный домен, более предпочтительно выбранный из CD8α и 4-1ВВ, который идентичен полипептидам, имеющим SEQ ID NO: 6 или 7.

Анти-CLL1 CAR, предлагаемый в изобретении, как правило, дополнительно содержит трансмембранный домен (ТМ), более предпочтительно выбранный из CD8α и 4-1ВВ, и еще более предпочтительно идентичный полипептидам, имеющим SEQ ID NO: 6 или 7.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения анти-CLL1 CAR, предлагаемый в изобретении, дополнительно содержит ТМ-домен из CD8α, имеющий SEQ ID NO: 6, или идентичный по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности SEQ ID NO: 6.

В раковых клетках часто имеет место понижающая регуляция или мутация антигенов-мишеней, что приводит к появлению так называемых вариантов «потерянных антигенов» (антигенов, ускользающих от иммунологического надзора). Таким образом, для того, чтобы противостоять ускользанию опухоли от иммунологического надзора и придавать иммунной клетке большую специфичность в отношении мишени, CLL1-специфический анти-CLL1 CAR, предлагаемый в изобретении, может содержать другие внеклеточные лигандсвязывающие домены, предназначенные для одновременного связывания с другими элементами на мишени и усиления тем самым активации и функции иммунной клетки. В одном из вариантов осуществления изобретения внеклеточные лигандсвязывающие домены можно размещать тандемно на одном и том же трансмембранном полипептиде и их необязательно можно отделять друг от друга с помощью линкера. В другом варианте осуществления изобретения указанные другие внеклеточные лигандсвязывающие домены можно размещать на различных трансмембранных полипептидах, из которых состоит анти-CLL1 CAR. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является популяция анти-CLL1 CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. В частности, настоящее изобретение относится к способу создания иммунных клеток, включающему получение иммунной клетки и экспрессию на поверхности указанной клетки популяции анти-CLL1 CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу создания иммунной клетки, включающему получение иммунной клетки и интродукцию в указанную клетку полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, из которых состоит популяция анти-CLL1 CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Под популяцией анти-CLL1 CAR подразумевают по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть или большее количество анти-CLL1 CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Согласно настоящему изобретению различные внеклеточные лигандсвязывающие домены, предлагаемые в настоящем изобретении, предпочтительно могут связываться одновременно с различными элементами на мишени, усиливая тем самым активацию и функцию иммунной клетки. Настоящее изобретение относится также к выделенной иммунной клетке, которая содержит популяцию анти-CLL1 CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены.

CLL1-специфические химерные антигенные рецепторы, предлагаемые в изобретении, могут иметь различные архитектуры, в которых они могут экспрессироваться, например, в форме одноцепочечного химерного белка (scCAR) или в форме нескольких полипептидов (несколько цепей), включающих по меньшей мере один указанный химерный белок. Такие включающие несколько цепей архитектуры CAR описаны в WO 2014/039523, включенной в настоящее описание в качестве ссылки, прежде всего на фиг. 2-4 и на страницах 14-21.

В целом, анти-CLL1 CAR содержит внеклеточное одноцепочечное антитело (scFv Fc), слитое с внутриклеточным сигнальным доменом дзета-цепи из комплекса Т-клеточного рецептора антигена (scFv Fc:ζ), который обладает способностью при экспрессии в Т-клетках перенаправлять распознавание антигена на основе специфичности моноклонального антитела.

В настоящем описании представлено несколько анти-CLL1 одноцепочечных CAR, направленных против антигена CLL1, которые, например, содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 35-112 (но не ограничиваясь только ими).

CLL1 CAR, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой также ранее упомянутые «многоцепочечные CAR», это означает, что внеклеточный связывающий домен и сигнальные домены предпочтительно локализованы на различных полипептидных цепях, в то время как костимуляторные домены могут быть локализованы на этом же или на третьем полипептиде. Указанные многоцепочечные CAR можно получать из FcεRI (Ravetch и др., 1989) путем замены высокоаффинного IgE-связывающего домена альфа-цепи FcεRI на внеклеточный лигандсвязывающий домен, такой как scFv, в то время как N- и/или С-концевые хвосты бета и/или гамма цепей FcεRI сливают с доменами трансдукции сигнала и костимуляторными доменами соответственно. Внеклеточный лигандсвязывающий домен играет роль специфичности, перенаправляющей Т-клетку к клеткам-мишеням, а домен трансдукции сигнала активирует или снижает ответ иммунных клеток. Тот факт, что различные полипептиды, имеющие происхождение из альфа-, бета- и гамма-полипептидов FcεRI, представляют собой трансмембранные полипептиды, находящиеся в положении вблизи мембраны, делает архитектуру CAR более гибкой, повышая специфичность в отношении целевой молекулы и снижая фоновую активацию иммунных клеток, что описано в WO 2014/039523.

Внеклеточный лигандсвязывающий домен

Понятие «внеклеточный лигандсвязывающий домен» обозначает олиго- или полипептид, который обладает способностью связываться с лигандом. Предпочтительно домен должен обладать способностью взаимодействовать с молекулой клеточной поверхности. Например, можно выбирать внеклеточный лигандсвязывающий домен для распознавания лиганда, который функционирует в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированных с конкретным болезненным состоянием. Они могут представлять собой, например, связывающие домены, полученные из лиганда, рецептора, человеческих или мышиных антител, или антигенраспознающие домены, полученные из верблюдов или хрящевых рыб.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен содержит одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), содержащий вариабельный фрагмент легкой (V_L) и тяжелой (V_H) цепи специфического в отношении антигена-мишени моноклонального антитела к CLL1, сцепленный с помощью гибкого линкера. Указанные V_L и V_H предпочтительно выбирают из антител, известных из литературы, таких как SCO02-357, SC02-378 и SC02-161, описанные в WO 2005/00894 (заявитель: фирма Crucell Holland BV); М26, М31, G4, М22, М29, М2, М5, G12, описанные в WO 2013/169625 (заявитель: фирма Cellerant Therapeutics); и 21.26, 1075.7, описанные в WO 2009/051974 (заявитель: фирма Nuvelo Inc.), и более конкретно содержащие CDR VH- и VL-доменов моноклональных антител к CLL1, выбранные из представленных ниже SEQ ID NO: 119-190.

Последовательности CDR VH-цепи моноклонального антитела к CLL1 можно выбирать из GSISSSNWWS (SEQ ID NO: 119), WIGEIYHSGSPDY (SEQ ID NO: 120), KVSTGGFFDY (SEQ ID NO: 121) и GSISSSNWWS (SEQ ID NO: 122), WIGEIYHSGSPNY (SEQ ID NO: 123), RSSSGGFFDY (SEQ ID NO: 124), и GSISSSNWWS (SEQ ID NO: 125), WIGEIYHSGSPNY (SEQ ID NO: 126), RQTTAGSFDY (SEQ ID NO: 127), и GYTFTSYFIH (SEQ ID NO: 131), WIGFINPYNDGSKY (SEQ ID NO: 132), TRDDGYYGYAMDY (SEQ ID NO: 133), и GYTFTSYVMH (SEQ ID NO: 137), WIGYINPYNDGTKY (SEQ ID NO: 138), ARPIYFDNDY (SEQ ID NO: 139), и QQNNYDPW (SEQ ID NO: 143), WIGPINPYNDGTI (SEQ ID NO: 144), ARTDDYDDYTMDY (SEQ ID NO: 145), и GYTFTRYWMH (SEQ ID NO: 149), WIGNIDPSDTETHY (SEQ ID NO: 150), AIYYGNPSYYAMDY (SEQ ID NO: 151), и GYIFTSYVMY (SEQ ID NO: 155), WIGYINPY (SEQ ID NO: 156), ARYYDYDYYFDY (SEQ ID NO: 157), и GYTFTSYFMH (SEQ ID NO: 161), WIGFINPYNDGTKY (SEQ ID NO: 162), TRDDGYYDYAMDY (SEQ ID NO: 163), и GFNIKDDYIH (SEQ ID NO: 167), WIGWIDPEKGDTAYA (SEQ ID NO: 168), TLTGRFDY (SEQ ID NO: 169), и GYTFPSSNIH (SEQ ID NO: 173), WIGVIYPGNGDTSY (SEQ ID NO: 174), AIYFVYNWHFDV (SEQ ID NO: 175) и GYTFTRYWMH (SEQ ID NO: 179), MIHPSSGSTSYNEKVK (SEQ ID NO: 180), RDGDYYYGTGDY (SEQ ID NO: 181), и GYSITSAYYWN (SEQ ID NO: 185), YISYDGRNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 186) и AKEGDYDVGNYYAMDY (SEQ ID NO: 187).

Аналогично этому, последовательности CDR VL-цепи моноклонального антитела к CLL1 можно выбирать из: QSISSYLN (SEQ ID NO: 128), LLIYAASSLQS (SEQ ID NO: 129), QQSYSTPP (SEQ ID NO: 130) и QELSGYLS (SEQ ID NO: 134), RLIYAASTLDS (SEQ ID NO: 135), LQYAIYPY (SEQ ID NO: 136), и ESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO: 140), LLIYLASNLES (SEQ ID NO: 141), QQNNYDPW (SEQ ID NO: 142), HDISNYLN (SEQ ID NO: 146), LLIYYTSRLHS (SEQ ID NO: 147), QQGKTLLW (SEQ ID NO: 148) и QNLLNSGNQKKYLN (SEQ ID NO: 152), LLIYWASTRES (SEQ ID NO: 153), QNDYSYPF (SEQ ID NO: 154), и QDINKYIA (SEQ ID NO: 158), LLIHYTSTLQP (SEQ ID NO: 159), LQYDYLW (SEQ ID NO: 160), и QEISVYLS (SEQ ID NO: 164), RLIYAASTLDS (SEQ ID NO: 165), LQYASYPY (SEQ ID NO: 166), и QSLLYSSNQKNNLA (SEQ ID NO: 170), LLIYWASTRES (SEQ ID NO: 171), QQYYSYR (SEQ ID NO: 172), и ESVDGYGDIFML (SEQ ID NO: 176), LLIYFASNLES (SEQ ID NO: 177), QQNNEDPY (SEQ ID NO: 178), и RASSSINYMH (SEQ ID NO: 182), PWIFATSNLAS (SEQ ID NO: 183), QQWRSDRALT (SEQ ID NO: 184), и RASSNVISSYVH (SEQ ID NO: 188), LWIYSTSNLAS (SEQ ID NO: 189), и QQYSGYPLT (SEQ ID NO: 190).

Внеклеточный домен и трансмембранный домен предпочтительно связаны друг с другом с помощью гибкого линкера, содержащего SEQ ID NO: 10. Другими словами, указанные анти-CLL1 CAR предпочтительно содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90%, 95% 97% или 99% аминокислотной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 34 (см. таблицу 2).

В контексте настоящего описания понятие «рекомбинантное антитело» означает антитело или фрагмент антитела, созданное/созданный с помощью технологии рекомбинантной ДНК, такое, например, как антитело или фрагмент антитела, экспрессируемое/экспрессируемый бактериофагом, системой экспрессии дрожжей или системой экспрессии клеток млекопитающих. Подразумевается также, что понятие относится к антителу или фрагменту антитела, созданному с помощью синтеза молекулы ДНК, которая кодирует антитело или фрагмент антитела, и эта молекула ДНК экспрессирует белок антитела или фрагмента антитела или аминокислотную последовательность, специфическую для антитела или фрагмента антитела, при этом ДНК или аминокислотную последовательность получали с использованием технологии создания рекомбинантной или синтетической ДНК или аминокислотной последовательности, которая доступна и хорошо известна в данной области.

В настоящем изобретении предложен CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 scCAR), описанный выше, в котором указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен содержит VH- и VL-цепи, которые являются гуманизированными.

В контексте настоящего описания понятие «гуманизированное антитело» означает, что полипептиды включают гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи и гуманизированную вариабельную область легкой цепи. Например, полипептиды могут включать каркасные (FR) участки вариабельных областей тяжелой и легкой цепи человеческого антитела, практически сохраняя при этом антигенсвязывающую специфичность родительского моноклонального антитела. Гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи и/или гуманизированная вариабельная область легкой цепи являются гуманизированными по меньшей мере примерно на 87%, гуманизированными по меньшей мере примерно на 90%, гуманизированными по меньшей мере примерно на 95%, гуманизированными по меньшей мере примерно на 98% или гуманизированными по меньшей мере примерно на 100% за исключением гипервариабельных участков (CDR). Молекулы антигенсвязывающих полипептидов могут происходить из донорских моноклональных антител (например, мышиных донорских моноклональных антител) и могут включать CDR из моноклональных антител (например, CDR из мышиных моноклональных антител).

В контексте настоящего описания понятие «моноклональное антитело» означает, что антитело получено с использованием выращенного в лаборатории клона клетки, либо гибридомы, либо трансформированного вирусом лимфоцита, такие антитела являются более многочисленными и однородными, чем встречающиеся в естественных условиях антитела, и обладают способностью специфически связываться с одним сайтом на антигене CLL1. Они представляют собой моноспецифические антитела, создающиеся идентичными иммунными клетками, которые все представляют собой клоны одной родительской клетки, в отличие от поликлональных антител, которые получают из нескольких различных иммунных клеток. Моноклональные антитела обладают одновалентной аффинностью, это означает, что они связываются с одним и тем же эпитопом. Современные методики, применяемые для гуманизации, описаны у Lefranc M.P. и др. (Lefranc, M.P., Ehrenmann F., Ginestoux С., Giudicelli V., Duroux P., «Use of IMGT (®) databases and tools for antibody engineering and humanization». Methods Mol Biol. 907, 2012, cc. 3-37). В этой публикации представлены данные о четырех выровненных последовательностях.

Гуманизированное антитело можно получать с помощью различных методов, известных в данной области, включая (но не ограничиваясь только ими) трансплантацию CDR (см., например, европейский патент ЕР 239400; международную публикацию WO 91/09967; и US №№5225539, 5530101 и 5585089, каждый из указанных документов полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки), «облицовку» или «нанесение покрытия» (см, например, европейский патент ЕР 592106 и ЕР 519596; Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5), 1991, cc. 489-498; Studnicka и др., Protein Engineering, 7(6), 1994, cc. 805-814; и Roguska и др., PNAS, 91, 1994, cc. 969-973, каждый из указанных документов полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки), перестановку цепи (см., например, US №5565332, который полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки) и методы, описанные, например, в публикации заявки на патент США US №2005/0042664, публикации заявки на патент США US 2005/0048617, патентах US №6407213, US №5766886, публикации международной заявки на патент WO 9317105, Tan и др., J. Immunol., 169, 2002, cc. 1119-1125, Caldas и др., Protein Eng., 13(5), 2000, cc. 353-360, Morea и др., Methods, 20(3), 2000, cc. 267-279, Васа и др., J. Biol. Chem., 272(16), 1997, cc. 10678-10684, Roguska и др., Protein Eng., 9(10), 1996, cc. 895-904, Couto и др., Cancer Res., 55 (приложение 23), 1995, cc. 5973-5977, Couto и др., Cancer Res., 55(8), 1995, cc. 1717-1722, Sandhu J.S., Gene, 150(2), 1994, cc. 409-410 и Pedersen и др., J. Mol. Biol., 235(3), 1994, cc. 959-973, каждый из указанных документов полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки. Часто каркасные остатки в каркасных областях требуется заменять на соответствующие остатки из CDR донорского антитела для изменения, например, для улучшения, связывания с антигеном. Такие замены в каркасном участке идентифицируют с помощью методов, хорошо известных в данной области, например, путем моделирования взаимодействий остатков CDR и каркасного участка с целью идентификации остатков каркасного участка, важных для связывания с антигеном, и сравнения последовательностей для идентификации необычных остатков каркасного участка в определенных положениях (см., например. Queen и др., US №5585089; и Riechmann и др., Nature, 332, 1988, с. 323, указанные документы включены в настоящее описание в качестве ссылки).

Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, известны в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фениланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в анти-CLL1 CAR, предлагаемом в изобретении, можно заменять на другие аминокислотные остатки из того же семейства боковых цепей и измененный анти-CLL1 CAR можно тестировать в отношении способности связывать CLL1, используя функциональные анализы, представленные в настоящем описании.

Анти-CLL1 CAR, предлагаемый в изобретении, необязательно включает домен суицида, предназначенный для истощения иммунных клеток, несущих CAR, в случае, который позднее может вызывать нежелательные действия in vivo. Указанный домен суицида можно получать, например, путем включения двух копий мимеотопа CD20, предпочтительно последовательность CPYSNPSLCS (SEQ ID NO: 113), в полипептидную последовательность CAR. Указанные две копии мимеотопа CD20 можно связывать друг с другом, а также с V_L с помощью линкера. Их можно встраивать между анти-CLL1 scFv и шарниром (таким как CD8альфа) с помощью необязательного линкера. Мимеотопы CD20 можно связывать с помощью антител к CD20, таких как ритуксимаб (McLaughlin P. и др., 1998). Таким образом, анти-CLL1 CAR, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать VH- и VL-цепи, которые обладают способностью связываться с антигеном клеточной поверхности CLL1, необязательно гуманизированные, линкер L, домен суицида, шарнирную область или ее часть, трансмембранный домен, костимуляторный домен и стимуляторный домен.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения описан анти-CLL1-специфический одноцепочечный химерный антигенный рецептор («анти-CLL1 scCAR» или «scCAR»), который имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1-V6, которые проиллюстрированы на фиг. 2 и в таблицах 3-8, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир, трансмембранный домен, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен и костимуляторный домен.

Более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является описанный выше CLL1-специфический scCAR, в котором указанная структура V1, V3 или V5 содержит шарнир FcγRIIIα, СD8альфа или IgG1 и трансмембранный домен СD8альфа.

В другом более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный CLL1-специфический scCAR содержит костимуляторный домен из 4-1ВВ или CD28 или более предпочтительно костимуляторный домен из 4-1ВВ.

В настоящем изобретении предложен CLL1-специфический scCAR, описанный выше, в котором указанная структура V1, V3 или V5 содержит шарнир FcγRIIIα, CD8альфа или IgG1 и трансмембранный домен 4-1ВВ.

В настоящем изобретении предложен CLL1-специфический scCAR, описанный выше, в котором указанная структура V1, V3 или V5 содержит шарнир FcγRIIIα, СD8альфа или IgG1, цитоплазматический домен 4-1ВВ и трансмембранный домен СD8альфа.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения анти-CLL1 scCAR, предлагаемый в изобретении, имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1-V6, которые проиллюстрированы на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир, трансмембранный домен, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен СОЗдзета и костимуляторный домен, где указанный сигнальный домен СОЗдзета предпочтительно имеет последовательность SEQ ID NO: 9.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения анти-CLL1 scCAR, предлагаемый в изобретении, имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1-V6, которые проиллюстрированы на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир, трансмембранный домен, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ, где указанный костимуляторный домен из 4-1ВВ предпочтительно имеет последовательность SEQ ID NO: 8.

В настоящем изобретении описан анти-CLL1 scCAR, который имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1-V6, которые проиллюстрированы на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир FcγRIIIα, трансмембранный домен CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 6, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен.

В настоящем изобретении описан анти-CLL1 scCAR, который имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1-V6, которые проиллюстрированы на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир CD8α, трансмембранный домен CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 6, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзeта и костимуляторный домен.

В настоящем изобретении описан анти-CLL1 scCAR, который имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1-V6, которые проиллюстрированы на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир IgG1, трансмембранный домен CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 6, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзeта и костимуляторный домен.

В настоящем изобретении описан анти-CLL1 scCAR, который имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1-V6, которые проиллюстрированы на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир FcγRIIIα, трансмембранный домен 4-1ВВ, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 7, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен.

В настоящем изобретении описан анти-CLL1 scCAR, который имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1-V6, которые проиллюстрированы на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир CD8α, трансмембранный домен 4-1ВВ, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 7, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзeта и костимуляторный домен.

В настоящем изобретении описан анти-CLL1 scCAR, который имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1-V6, которые проиллюстрированы на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир IgG1, трансмембранный домен 4-1ВВ, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 7, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзeтa и костимуляторный домен.

Конкретным объектом настоящего изобретения является анти-CLL1-специфический scCAR, который имеет полипептидную структуру VI, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир FcγRIIIα, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 3, трансмембранный домен CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 6, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзeта, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 9, и костимуляторный домен из 4-1ВВ, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 8.

Более конкретно в настоящем изобретении описан анти-CLL1-специфический scCAR, который имеет полипептидную структуру V1, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир FcγRIIIα, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 3, трансмембранный домен CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 6, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзeта, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 9, и костимуляторный домен из 4-1ВВ, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 8, где указанная VH-цепь идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 11-13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 или 33, и указанная VL идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 или 34.

Другим конкретным объектом настоящего изобретения является анти-CLL1-специфический scCAR, который имеет полипептидную структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 4, трансмембранный домен CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 6, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 9, и костимуляторный домен из 4-1ВВ, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 8.

Более конкретно в настоящем изобретении описан анти-CLL1-специфический scCAR, который имеет полипептидную структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 4, трансмембранный домен CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 6, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзeта, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 9, и костимуляторный домен из 4-1 ВВ, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 8, где указанная VH-цепь идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 11-13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 или 33, и указанная VL-цепь идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 или 34.

Другим конкретным объектом настоящего изобретения является анти-CLL1-специфический scCAR, который имеет полипептидную структуру V5, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир IgG1, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 5, трансмембранный домен CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 6, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 9, и костимуляторный домен из 4-1ВВ, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 8.

Более конкретно в настоящем изобретении описан анти-CLL1-специфический scCAR, который имеет полипептидную структуру V5, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир IgG1, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 5, трансмембранный домен CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 6, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзeта, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 9, и костимуляторный домен из 4-1ВВ, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 8, где указанная VH-цепь идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 11-13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 или 33, и указанная VL-цепь идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24 ,26, 28, 30, 32 или 34.

В настоящем изобретении описан анти-CLL1-специфический scCAR, который имеет полипептидную структуру V1, проиллюстрированную на фиг. 2, где указанный полипептид идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101 или 107.

В частности, указанный анти-CLL1-специфический scCAR имеет полипептидную структуру V1, проиллюстрированную на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир FcγRIIIα, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 3, трансмембранный домен CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 6, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 9, и костимуляторный из домен 4-1ВВ, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 8, где указанная VH-цепь идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 или 33, и указанная VL идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 или 34, и где указанный полипептид идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101 или 107.

В настоящем изобретении описан анти-CLL1 -специфический scCAR, который имеет полипептидную структуру V3, проиллюстрированную на фиг. 2, где указанный полипептид идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103 или 109.

Более конкретно в настоящем изобретении описан анти-CLL1-специфический scCAR, который имеет полипептидную структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 4, трансмембранный домен CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 6, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзeта, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 9, и костимуляторный домен из 4-1ВВ, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 8, где указанная VH-цепь идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 или 33, и указанная VL-цепь идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 или 34, и где указанный полипептид идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103 или 109.

В настоящем изобретении описан анти-CLL1-специфический scCAR, который имеет полипептидную структуру V5, проиллюстрированную на фиг. 2, где указанный полипептид идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105 или 111.

Более конкретно в настоящем изобретении описан анти-CLL1-специфический scCAR, который имеет полипептидную структуру V5, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигансвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CLL1, шарнир IgG1, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 5, трансмембранный домен CD8α, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 6, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзeта, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 9, и костимуляторный домен из 4-1ВВ, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 8, где указанная VH-цепь идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 или 33, и указанная VL-цепь идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 или 34, и где указанный полипептид идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105 или 111.

Более конкретно в настоящем изобретении описан CLL1-специфический одноцепочечный химерный антигенный рецептор (scCAR), который имеет полипептидную структуру V1, V3 или V5, проиллюстрированную на 2 и описанную выше, где указанная структура содержит VH внеклеточного лигандсвязывающего домена из моноклонального антитела к CLL1, содержащую следующие последовательности CDR: GSISSSNWWS (SEQ ID NO: 119), WIGEIYHSGSPDY (SEQ ID NO: 120), KVSTGGFFDY (SEQ ID NO: 121) и GSISSSNWWS (SEQ ID NO: 122), WIGEIYHSGSPNY (SEQ ID NO: 123), RSSSGGFFDY (SEQ ID NO: 124), и GSISSSNWWS (SEQ ID NO: 125), WIGEIYHSGSPNY (SEQ ID NO: 126), RQTTAGSFDY (SEQ ID NO: 127), и GYTFTSYFIH (SEQ ID NO: 131), WIGFINPYNDGSKY (SEQ ID NO: 132), TRDDGYYGYAMDY (SEQ ID NO: 133), и GYTFTSYVMH (SEQ ID NO: 137), WIGYINPYNDGTKY (SEQ ID NO: 138), ARPIYFDNDY (SEQ ID NO: 139), и QQNNYDPW (SEQ ID NO: 143), WIGPINPYNDGTI (SEQ ID NO: 144), ARTDDYDDYTMDY (SEQ ID NO: 145), и GYTFTRYWMH (SEQ ID NO: 149), WIGNIDPSDTETHY (SEQ ID NO: 150), AIYYGNPSYYAMDY (SEQ ID NO: 151), и GYIFTSYVMY (SEQ ID NO: 155), WIGYINPY (SEQ ID NO: 156), ARYYDYDYYFDY (SEQ ID NO: 157), и GYTFTSYFMH (SEQ ID NO: 161), WIGFINPYNDGTKY (SEQ ID NO: 162),TRDDGYYDYAMDY (SEQ ID NO: 163), и GFNIKDDYIH (SEQ ID NO: 167), WIGWIDPEKGDTAYA (SEQ ID NO: 168), TLTGRFDY (SEQ ID NO: 169), и GYTFPSSNIH (SEQ ID NO: 173), WIGVIYPGNGDTSY (SEQ ID NO: 174), AIYFVYNWHFDV (SEQ ID NO: 175), and GYTFTRYWMH (SEQ ID NO: 179), MIHPSSGSTSYNEKVK (SEQ ID NO: 180), RDGDYYYGTGDY (SEQ ID NO: 181), и GYSITSAYYWN (SEQ ID NO: 185), YISYDGRNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 186), AKEGDYDVGNYYAMDY (SEQ ID NO: 187), и предпочтительно

VL внеклеточного лигандсвязывающего домена из моноклонального антитела к CLL1, содержащую следующие последовательности CDR: QSISSYLN (SEQ ID NO: 128), LLIYAASSLQS (SEQ ID NO: 129), QQSYSTPP (SEQ ID NO: 130) и QELSGYLS (SEQ ID NO: 134), RLIYAASTLDS (SEQ ID NO: 135), LQYAIYPY (SEQ ID NO: 136), и ESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO: 140), LLIYLASNLES (SEQ ID NO: 141), QQNNYDPW (SEQ ID NO: 142), HDISNYLN (SEQ ID NO: 146), LLIYYTSRLHS (SEQ ID NO: 147), QQGKTLLW (SEQ ID NO: 148), и QNLLNSGNQKKYLN (SEQ ID NO: 152), LLIYWASTRES (SEQ ID NO: 153), QNDYSYPF (SEQ ID NO: 154), и QDINKYIA (SEQ ID NO: 158), LLIHYTSTLQP (SEQ ID NO: 159), LQYDYLW (SEQ ID NO: 160), и QEISVYLS (SEQ ID NO: 164), RLIYAASTLDS (SEQ ID NO: 165), LQYASYPY (SEQ ID NO: 166), и QSLLYSSNQKNNLA (SEQ ID NO: 170), LLIYWASTRES (SEQ ID NO: 171), QQYYSYR (SEQ ID NO: 172), и ESVDGYGDIFML (SEQ ID NO: 176), LLIYFASNLES (SEQ ID NO: 177), QQNNEDPY (SEQ ID NO: 178), и RASSSINYMH (SEQ ID NO: 182), PWIFATSNLAS (SEQ ID NO: 183), QQWRSDRALT (SEQ ID NO: 184), и RASSNVISSYVH (SEQ ID NO: 188), LWIYSTSNLAS (SEQ ID NO: 189), QQYSGYPLT (SEQ ID NO: 190),

и где указанная структура, как правило, содержит:

шарнир, трансмембранный домен и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.

В настоящем изобретении описан CLL1-специфический одноцепочечный химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 scCAR), указанный выше, в котором VH и VL указанного внеклеточного лигандсвязывающего домена гуманизированы.

В настоящем изобретении описан CLL1-специфический одноцепочечный химерный антигенный рецептор (scCAR), указанный выше, в котором VH указанного внеклеточного лигандсвязывающего домена из антитела к CLL1 содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей:

(соответствует SC02-357),

(соответствует SC02-378),

(соответствует SC02-161),

(соответствует М26),

(соответствует М31),

(соответствует G4),

(соответствует М22),

(соответствует М29),

(соответствует М2),

(соответствует М5),

(соответствует G12),

(соответствует 21.26),

(соответствует 1075.7),

a VL из моноклонального антитела к CLL1 содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей:

(соответствует SC02-357, SC02-378 и SC02161),

(соответствует М26),

(соответствует М31),

(соответствует G4),

(соответствует М22),

(соответствует М29),

(соответствует М2),

(соответствует М5),

(соответствует G12),

(соответствует 21.26),

(соответствует 1075.7)

В настоящем изобретении описаны также CLL1-специфические scCAR, указанные выше, которые дополнительно содержат другой внеклеточный лигандсвязывающий домен, не являющийся специфическим для CLL1, например, специфический в отношении антигена CD33, антигена CD44, антигена CD47, антигена CD123, антигена CD96 и Т-клеточного иммуноглобулина и домена 3 муцина (TIM-3).

В настоящем изобретении описаны также CLL1-специфические scCAR, указанные выше, которые дополнительно содержат сигнальный пептид, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, помогающий полипептиду CAR достигать мембраны иммунной клетки.

В настоящем изобретении описаны также CLL1-специфические scCAR, указанные выше, в которых линкер, имеющий SEQ ID NO: 10, встроен между VH и VL.

Полинуклеотиды, векторы:

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам и векторам, обеспечивающим гетерологичную экспрессию в клетках анти-CLL1 CAR, предлагаемого в изобретении, которые кодируют полипептидные последовательности, подробно описанные выше.

Полинуклеотиды могут быть включены в кассету экспрессии или экспрессионный вектор (например, в плазмиду, предназначенную для интродукции в бактериальную клетку-хозяина, или вирусный вектор, такой как бакуловирусный вектор, предназначенный для трансфекции клетки насекомого-хозяина, или плазмидный или вирусный вектор, такой как лентивирус, предназначенный для трансфекции клетки млекопитающего-хозяина).

В конкретном варианте осуществления изобретения можно включать различные нуклеотидные последовательности в один полинуклеотид или вектор, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую рибосомальную skip-последовательность, такую как последовательность, кодирующую пептид 2А. Пептиды 2А, которые были идентифицированы в подгруппе афтовирусов группы пикорнавирусов, приводят к рибосомальному «перескоку» (skip) от одного кодона к следующему без образования пептидной связи между двумя аминокислотами, кодируемыми кодонами (см. Donnelly и Elliott, 2001; Atkins, Wills и др., 2007; Doronina, Wu и др., 2008). Под «кодоном» понимают три нуклеотида на мРНК (или на смысловой цепи молекулы ДНК), которые транслируются рибосомой в один аминокислотный остаток. Таким образом, можно синтезировать два полипептида из одной непрерывной рамки считывания в мРНК, если полипептиды разделены последовательностью олигопептида 2А, присутствующей в рамке считывания. Такие рибосомальные skip-механизмы хорошо известны в данной области и известно их применение в нескольких векторах для экспрессии нескольких белков, кодируемых одной матричной РНК.

Для направления трансмембранного полипептида в секреторный путь клетки-хозяина, в последовательность полинуклеотида или в последовательность вектора помещают секреторную сигнальную последовательность (известную также как лидерная последовательность, пре-про-последовательность или пре-последовательность). Секреторную сигнальную последовательность функционально связывают с трансмембранной нуклеотидной последовательностью, т.е. две последовательности соединяют в правильной рамке считывания и размещают так, чтобы направлять новый синтезированный полипептид в секреторный путь клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности, как правило, размещают в 5'-направлении относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые секреторные сигнальные последовательности можно размещать и в другом месте представляющей интерес нуклеотидной последовательности (см., например, Welch и др., US №5037743; Holland и др., US №5143830). В предпочтительном варианте осуществления изобретения сигнальный пептид содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 и 2 или идентичные по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% SEQ ID NO: 1 и/или 2.

Специалистам в данной области должно быть очевидно, что с учетом вырожденности генетического кода могут иметь место значительные вариации последовательности указанных полинуклеотидных молекул. Предпочтительно нуклеотидные последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют оптимизированные кодоны для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно для экспрессии в человеческих клетках. Оптимизация кодонов относится к замене в представляющей интерес последовательности кодонов, встречающихся относительно редко в генах с высоким уровнем экспрессии, на кодоны, которые, как правило, часто встречаются в генах с высоким уровнем экспрессии в указанных видах, такие кодоны кодируют те же аминокислоты, что и подлежащие замене кодоны.

Методы доставки

В настоящем изобретении описаны различные средства, обеспечивающие экспрессию анти-CLL1 химерного антигенного рецептора (CAR), указанного в настоящем описании, в иммунных клетках.

Методы интродукции полинуклеотидной конструкции в клетки известны в данной области и включают, например (но не ограничиваясь только ими), методы стабильной трансформации, при осуществлении которых полинуклеотидную конструкцию, кодирующую указанный CAR, интегрируют в геном клетки, методы кратковременной трансформации, при осуществлении которых полинуклеотидную конструкцию не интегрируют в геном клетки, и опосредуемые вирусами методы.

Указанные полинуклеотиды можно интродуцировать в клетку, например, с использованием рекомбинантных вирусных векторов (например, ретровирусов, аденовирусов), липосом и т.п.Например, методы кратковременной трансформации включают микроинъекцию, электропорацию или бомбардировку частицами, слияние клеток. Указанные полинуклеотиды можно включать в векторы, более конкретно, в плазмиды или вирусы, с целью экспрессии в клетках. Указанный плазмидный вектор может содержать также селектируемый маркер, обеспечивающий идентификацию и/или отбор клеток, в которые встроен указанный вектор.

В один вектор можно включать различные трансгены. Указанный вектор может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую рибосомальную skip-последовательность, такую как последовательность, кодирующую пептид 2А. Пептиды 2А, которые были идентифицированы в подгруппе афтовирусов группы пикорнавирусов, приводят к рибосомальному «перескоку» (skip) от одного кодона к следующему без образования пептидной связи между двумя аминокислотами, кодируемыми кодонами (см. Donnelly и др., J. of General Virology 82, 2001, сс. 1013-1025; Donnelly и др., J. of Gen. Virology 78, 1997, сс. 13-21; Doronina и др., Mol. And. Cell. Biology 28(13), 2008, сс. 4227-4239; Atkins и др., RNA 13, 2007, сс. 803-810).

Под «кодоном» понимают три нуклеотида на мРНК (или на смысловой цепи молекулы ДНК), которые транслируются рибосомой в один аминокислотный остаток. Таким образом, можно синтезировать два полипептида из одной непрерывной рамки считывания в мРНК, если полипептиды разделены последовательностью олигопептида 2А, присутствующей в рамке считывания. Такие рибосомальные skip-механизмы хорошо известны в данной области и известно их применение в нескольких векторах для экспрессии нескольких белков, кодируемых одной матричной РНК.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой мРНК, которые интродуцируют непосредственно в клетки, например, путем электропорации. При создании изобретения были определены оптимальные условия для электропорации мРНК в Т-клетку. При создании изобретения применяли технологию cytoPulse, которая позволяет с помощью пульсирующих электрических полей кратковременно повышать проницаемость (пермеабилизовывать) живые клетки для доставки материала в клетки. Технология, основанная на применении системы создания волновых форм для электропорации PulseAgile® (фирма ВТХ Havard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, MA 01746, США), гарантирует точный контроль продолжительности, интенсивности импульса, а также интервала между импульсами (US №6010613 и международная заявка РСТ WO 2004/083379). Все указанные параметры можно модифицировать для достижения наилучших условий для высокоэффективной трансфекции с минимальной смертностью. В целом, первые электрические импульсы высокой интенсивности приводят к образованию пор, а последующие электрические импульсы более низкой интенсивности позволяют полинуклеотиду проникать в клетку.

Различные методы, описанные выше, предполагают интродукцию scCAR в клетку. Например (но не ограничиваясь только этим), указанный scCAR можно интродуцировать в виде трансгенов, кодируемых одним плазмидным вектором. Указанный плазмидный вектор может содержать также селектируемый маркер, обеспечивающий идентификацию и/или отбор клеток, в которые встроен указанный вектор.

Полипептиды можно синтезировать in situ в клетке в результате интродукции в клетку полинуклеотидов, кодирующих указанные полипептиды. Альтернативно этому, указанные полипептиды можно получать вне клетки и затем интродуцировать в нее. Методы интродукции полинуклеотидных конструкций в клетки известны в данной области и их примерами являются (но не ограничиваясь только ими) методы стабильной трансформации, в которых полинуклеотидную конструкцию интегрируют в геном клетки, методы кратковременной трансформации, в которых полинуклеотидную конструкцию не интегрируют в геном клетки, и методы, основанные на использовании вирусов. Указанные полинуклеотиды можно интродуцировать в клетку, например, с использованием рекомбинантных вирусных векторов (например, ретровирусов, аденовирусов), липосом и т.п. Например, методы кратковременной трансформации включают микроинъекцию, электропорацию или бомбардировку частицами. Указанные полинуклеотиды можно включать в векторы, более конкретно, в плазмиды или вирусы, с целью экспрессии в клетках.

Активация и размножение Т-клеток

Как до, так и после осуществления генетической модификации Т-клеток, даже в том случае, если активация и пролиферация генетически модифицированных иммунных клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, не зависит от механизмов связывания с антигеном, иммунные клетки, прежде всего Т-клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, можно подвергать дополнительной активации и размножать с помощью методов, описанных, например, в US №№6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681;7144575;7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041 и публикации заявки на патент США №2006/0121005. Т-клетки можно размножать in vitro или in vivo.

Как правило, Т-клетки, предлагаемые в изобретении, размножают путем приведения в контакт с агентом, который стимулирует комплекс CD3 TCR, и костимуляторной молекулой на поверхности Т-клеток с целью создания сигнала активации для Т-клетки. Например, для создания сигнала активации для Т-клетки можно применять химические соединения, такие как ионофор кальция А23187, форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА), или митогенные лектины, такие как фитогемагглютинин (ФГА).

Например (но не ограничиваясь только этим), популяции Т-клеток можно стимулировать in vitro путем приведения в контакт с антителом к CD3 или его антигенсвязывающим фрагментом, или антителом к CD2, иммобилизованным на поверхности, или путем приведения в контакт с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) в сочетании с ионофором кальция. Для костимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клеток используют лиганд, который связывается с вспомогательной молекулой. Например, популяцию Т-клеток можно приводить в контакт с антителом к CD3 и антителом к CD28 в условиях, обеспечивающих стимуляцию пролиферации Т-клеток. Условия, пригодные для культивирования Т-клеток, включают соответствующие среды (например, минимальную поддерживающую среду или среду RPMI 1640, или X-vivo 5, (фирма Lonza)), которые могут содержать факторы, необходимые для обеспечения пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку (например, фетальную бычью сыворотку или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, -2, 1L-15, TGFp и TNF, или любые другие добавки для роста клеток, известные специалисту в данной области. Другие добавки для роста клеток включают (но не ограничиваясь только ими) сурфактант, плазманат и восстановители, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут представлять собой RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 и X-Vivo 20, Optimizer, содержащие в качестве добавок аминокислоты, пируват натрия и витамины, они могут быть бессывороточными или могут содержать в качестве добавок в определенном количестве сыворотку (или плазму) или определенный набор гормонов, и/или цитокин(ы) в количестве, достаточном для роста и размножения Т-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, но не в культуры клеток, которые предназначены для введения путем инфузии индивидууму. Клетки-мишени поддерживают в условиях, необходимых для поддержания роста, например, при соответствующей температуре (например, при 37°С) и атмосфере (например, в воздухе плюс 5% СО₂). Клетки, которые подвергали стимуляции в течение различных промежутков времени, могут обладать различными характеристиками.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные клетки можно размножать путем совместного культивирования с тканью или клетками. Указанные клетки можно размножать также in vivo, например, в крови индивидуума после введения указанной клетки индивидууму.

Сконструированные иммунные клетки

Понятие «клетка» согласно настоящему изобретению относится, как правило, к клетке гематопоэтического происхождения, которая функционально участвует в инициации и/или реализации врожденного и/или адаптивного иммунного ответа. Клетка, предлагаемая в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой выделенную иммунную клетку и более предпочтительно Т-клетку, полученную из донора. Указанную иммунную клетку, предлагаемую в настоящем изобретении, можно получать также из стволовой клетки. Стволовые клетки могут представлять собой зрелые стволовые клетки, нечеловеческие эмбриональные стволовые клетки, более предпочтительно нечеловеческие стволовые клетки, стволовые клетки из пуповинной крови, клетки-предшественники, стволовые клетки костного мозга, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, тотипотентные стволовые клетки или гематопоэтические стволовые клетки. Репрезентативными человеческими клетками являются CD34⁺-клетки. Указанная выделенная клетка может представлять собой также дендритную клетку, дендритную киллерную клетку, тучную клетку, NK-клетку, В-клетку или Т-клетку, выбранную из группы, состоящей из воспалительных Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или хелперных Т-лимфоцитов. В другом варианте осуществления изобретения указанная клетка может иметь происхождение из группы, состоящей из CD4⁺-Т-лимфоцитов и CD8⁺-Т-лимфоцитов. Перед осуществлением размножения и генетической модификации клеток, предлагаемых в изобретении, из организма индивидуума можно получать источник клеток с помощью различных методов, не ограничивающих объем изобретения. Клетки можно получать из многочисленных источников, включая (но не ограничиваясь только ими) мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из инфицированной области, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно применять любое количество Т-клеточных линий, доступных и известных специалистам в данной области.

В другом варианте осуществления изобретения указанную клетку можно получать из организма здорового донора, пациента, у которого диагностирован рак, или пациента, у которого диагностирована инфекция. В другом варианте осуществления изобретения указанная клетка представляет собой часть смешанной популяции клеток, обладающих различными фенотипическими характеристиками. Под объем настоящего изобретения подпадает также клеточная линия, полученная из Т-клетки, трансформированной согласно ранее описанному методу. Под объем настоящего изобретения подпадают модифицированные клетки, полученные с помощью ранее описанного метода, которые являются устойчивыми или чувствительными к иммуносупрессорной обработке.

Предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются описанные выше Т-клетки или популяция Т-клеток, наделенных CLL1 CAR, которые не экспрессируют функциональный TCR и которые обладают реактивностью в отношении CLL1-позитивных клеток, предназначенные для их аллогенной трансплантации пациентам.

Более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения являются Т-клетки или популяция Т-клеток, наделенных CLL1 scCAR, и которые обладают реактивностью в отношении CLL1-позитивных клеток, которые не экспрессируют функциональный TCR и обладают устойчивостью к отобранному лекарственному средству, предназначенные для аллогенной трансплантации пациентам, которых лечат указанным отобранным лекарственным средством.

Настоящее изобретение относится к способу получения сконструированных иммунных клеток, предназначенных для иммунотерапии, который включает интродукцию ex vivo в указанные иммунные клетки полинуклеотидов или векторов, кодирующих CLL1 CAR, в соответствии с методами трансформации, описанными ранее в WO 2014/130635, WO 2013/176916, WO 2013/176915, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные полинуклеотиды интродуцируют в иммунные клетки с помощью ретровирусных векторов с целью стабильной интеграции в клеточный геном.

Способы конструирования иммунных клеток, наделенных CAR, предлагаемыми в изобретении

Настоящее изобретение относится также к получению иммунных клеток, наделенных анти-CLL1 CAR, которые являются менее аллореактивными или неаллореактивными, что позволяет применять их для аллогенных обработок (т.е. с пониженным риском индукции реакции трансплантат-против-хозяина и/или придает устойчивость к различным стандартным медицинским мероприятиям).

Как будет указано ниже в настоящем описании, указанные способы могут дополнительно включать стадию генетической модификации указанной иммунной клетки с использованием по меньшей мере одной эндонуклеазы.

- Понятие «эндонуклеаза» относится к ферменту дикого типа или его варианту, обладающему способностью катализировать гидролиз (расщепление) связей между нуклеиновыми кислотами в молекуле ДНК или РНК, предпочтительно в молекуле ДНК. Эндонуклеазы не расщепляют молекулу ДНК или РНК независимо от ее последовательности, но они распознают и расщепляют молекулу ДНК или РНК в специфических полинуклеотидных последовательностях, в дальнейшем обозначенных как «последовательности-мишени» или «сайты-мишени». Эндонуклеазы можно классифицировать как редко расщепляющие эндонуклеазы, для которых, как правило, полинуклеотидный сайт распознавания имеет длину более 12 пар оснований (bp), более предпочтительно 14-55 пар оснований.

Предпочтительно в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, используют редко расщепляющие эндонуклеазы. Редко расщепляющие эндонуклеазы могут представлять собой, например, хоминг-эндонуклеазу (Paques и Duchateau, 2007), химерную нуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN), образованную слиянием сконструированных доменов «цинковых пальцев» с каталитическим доменом рестриктазы, такой как FokI (Porteus и Carroll, 2005), TALE-нуклеазу, эндонуклеазу Cas9 из системы CRISPR (Gasiunas, Barrangou и др., 2012; Jinek, Chylinski и др., 2012; Cong, Ran и др., 2013; Mali, Yang и др., 2013) или химическую эндонуклеазу (Eisenschmidt, Lanio и др., 2005; Arimondo, Thomas и др., 2006). В химических эндонуклеазах химический или пептидный расщепляющий компонент конъюгируют либо с полимером нуклеиновой кислоты, либо с другой ДНК, распознающей специфическую последовательность-мишень, тем самым обеспечивая направление расщепляющей активности на специфическую последовательность. Химические эндонуклеазы включают также синтетические нуклеазы типа конъюгатов ортофенантролина, ДНК-расщепляющей молекулы и триплекс-образующих олигонуклеотидов (TFO), которые, как известно, связываются со специфическими последовательностями ДНК (Kalish и Glazer, 2005). Редко расщепляющие эндонуклеазы можно применять для инактивации генов в определенном локусе или для интеграции трансгенов с помощью гомологичной рекомбинации (HR), т.е. путем индукции двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) в локусе и встраивания в этот локус экзогенной ДНК с помощью механизма генной репарации (Perrin, Buckle и др., 1993; Rouet, Smih и др., 1994; Choulika, Perrin и др., 1995; Pingoud и Silva, 2007).

- Под «TALE-нуклеазой» (TALEN) понимают слитый белок, который состоит из связывающего нуклеиновую кислоту домена, как правило, происходящего из подобного активатору транскрипции эффектора (TALE), и одного нуклеазного каталитического домена для расщепления последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Каталитический домен предпочтительно представляет собой нуклеазный домен и более предпочтительно домен, обладающий эндонуклеазной активностью, например, типа I-TevI, ColE7, NucA и Fok-I. В конкретном варианте осуществления изобретения домен TALE может быть слит с мегануклеазой, например, типа I-CreI и I-OnuI, или ее функциональным вариантом. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная нуклеаза представляет собой мономерную TALE-нуклеазу. Мономерная TALE-нуклеаза представляет собой TALE-нуклеазу, которая не требует димеризации для специфического распознавания и расщепления, например, в виде слияний сконструированных повторов TAL с каталитическим доменом I-TevI, описанным в WO 2012/138927. Подобные активатору транскрипции эффекторы (TALE) представляют собой белки из видов бактерий рода Xanthomonas, содержащие несколько повторяющихся последовательностей, где каждый повтор содержит di-остатки (двойные остатки) в положениях 12 и 13 (RVD), обладающие специфичностью в отношении каждого нуклеотидного основания последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Связывающие домены, обладающие сходными модульными свойствами связывания нуклеиновых кислот по типу основание-с-основанием («base-per-base») (MBBBD), могут быть получены также из новых модульных белков, недавно обнаруженных заявителями в различных видах бактерий. Преимущество новых модульных белков заключается в том, что они характеризуются большей вариабельностью последовательности, чем TAL-повторы. Предпочтительно RVD, ассоциированные с распознаванием различных нуклеотидов, представляют собой HD для распознавания С, NG для распознавания Т, NI для распознавания А, NN для распознавания G или A, NS для распознавания А, С, G или Т, HG для распознавания Т, IG для распознавания Т, NK для распознавания G, НА для распознавания С, ND для распознавания С, HI для распознавания С, HN для распознавания G, NA для распознавания G, SN для распознавания G или А и YG для распознавания Т, TL для распознавания А, VT для распознавания А или G и SW для распознавания А. В другом варианте осуществления изобретения имеющие решающее значение аминокислоты 12 и 13 можно изменять путем мутации на другие аминокислотные остатки для модуляции их специфичности в отношении нуклеотидов А, Т, С и G и, прежде всего, для повышения их специфичности. Ранее уже была описана TALE-нуклеаза, и ее применяли для стимуляции генного таргетинга и генных модификаций (Boch, Scholze и др., 2009; Moscou и Bogdanove, 2009; Christian, Cermak и др., 2010; Li, Huang и др., 2011). Сконструированные TAL-нуклеазы поступают в продажу под товарным знаком TALEN™ (фирма Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013, Париж, Франция) и их можно заказывать у производителей, таких как фирма Life Technologies (Карсбад, шт. Калифорния, США).

Предпочтительные TALE-нуклеазы, которые распознают и расщепляют последовательность-мишень, описаны в РСТ/ЕР2014/075317. В частности, можно также интродуцировать дополнительный каталитический домен в клетку с указанной редко расщепляющей эндонуклеазой для усиления мутагенеза с целью повышения способности к инактивации генов-мишеней. Более конкретно, указанный дополнительный каталитический домен представляет собой фермент, процессирующий конец ДНК. Примерами ферментов, процессирующих конец ДНК, являются (но не ограничиваясь только ими) 5-3'-экзонуклеазы, 3-5'-экзонуклеазы, щелочные 5-3'-экзонуклеазы, 5'-флэп-эндонуклеазы, геликазы, фосфатаза, гидролазы и независимые от матриц ДНК-полимеразы. Примером указанного каталитического домена является (но не ограничиваясь только им) белковый домен или каталитически активное производное белкового домена, выбранного из группы, состоящей из hExoI (EXO1_HUMAN), ExoI дрожжей (EXO1_YEAST), ExoI E. coli, человеческой TREX2 (3'-репарационная экзонуклеаза), мышиной TREX1, человеческой TREX1, бычьей TREX1, крысиной TREX1, TdT (концевая дезоксинуклеотидил-трансфераза), человеческой ДНК2, ДНК2 дрожжей (DNA2_YEAST). В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный дополнительный каталитический домен обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью и в более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный дополнительный каталитический домен представляет собой каталитический домен TREX, более предпочтительно каталитический домен TREX2 (WO 2012/058458). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный каталитический домен описывается одноцепочечным полипептидом TREX2. Указанный дополнительный каталитический домен можно сливать с содержащим нуклеазу слитым белком или химерным белком, предлагаемым в изобретении, необязательно с помощью пептидного линкера.

- Под «Cas9-эндонуклеазой» подразумевается любой созданный с помощью генной инженерии инструмент на основе РНК-направляемой нуклеазы Cas9 (Gasiunas, Barrangou и др., 2012; Jinek, Chylinski и др., 2012; Cong, Ran и др., 2013; Mali, Yang и др., 2013) из адаптивной иммунной системы CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats)) типа II прокариот (см. обзор Sorek, Lawrence и др., 2013). CRISPR-ассоциированная (Cas) система впервые была обнаружена в бактериях, и ее функция состоит в защите от чужой вирусной или плазмидной ДНК, При осуществлении опосредуемой CRISPR генетической инженерии сначала проводят отбор последовательности-мишени, часто фланкированной короткой последовательностью мотива, который обозначают как примыкающий к протоспейсеру мотив (РАМ). После отбора последовательности-мишени конструируют специфическую crРНК (CRISPR-РНК), комплементарную указанной последовательности-мишени. Для систем CRISPR типа II требуется трансактивирующая crРНК (tracrPHК), спаренная с crРНК и связанная с внесенным белком Cas9. Cas9 функционирует в качестве молекулярного якоря, облегчающего спаривание оснований tracPHК с сРНК (Deltcheva, Chylinski и др., 2011). В этом тройном комплексе двойная структура tracrPHК:crРНК функционирует в качестве направляющей РНК, которая направляет эндонуклеазу Cas9 к когнатной последовательности-мишени. Распознавание мишени комплексом Cas9-tracrPHК:crPHК инициируется путем сканирования последовательности-мишени для обнаружения гомологии между последовательностью-мишенью и crРНК. Помимо комплементарности последовательности-мишени и crРНК, таргетинг ДНК требует присутствия короткого мотива, примыкающего к протоспейсеру (примыкающий к протоспейсеру мотив - РАМ). После спаривания двойной РНК и последовательности-мишени Cas9 интродуцирует «тупой» двухцепочечный разрыв на расстоянии 3 пар оснований в обратном направлении относительно мотива РАМ (Garneau, Dupuis и др., 2010). Применение Cas9 в иммунных клетках, прежде всего в Т-клетках, описано ранее в WO 2014191128.

Модификация Т-клетки путем инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент Т-клеточного рецептора (TCR)

Согласно одному из объектов изобретения иммунную клетку можно делать менее аллогенной, например, путем инактивации по меньшей мере одного гена, экспрессирующего один или несколько компонентов Т-клеточного рецептора (TCR), согласно методу, описанному в WO 2013/176915. Указанную инактивацию можно объединять с инактивацией другого гена, такого как ген, кодирующий или регулирующий экспрессию белка HLA или β2m. Таким образом, существенно снижают риск возникновения реакции «трансплантат-против-хозяина» и отторжение трансплантата.

Методы получения менее аллогенных Т-клеток могут включать стадию инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент Т-клеточного рецептора (TCR), в частности, генов ТСRальфа и/или ТСRбета.

Описанные в WO 2013/176915 методы получения экспрессирующей CAR иммунной клетки, пригодной для аллогенной трансплантации, путем инактивации одного или нескольких компонентов Т-клеточного рецептора (TCR), все включены в настоящее описание в качестве ссылки.

В настоящем изобретении предложена экспрессирующая анти-CLL1 CAR иммунная клетка, в которой инактивирован по меньшей мере один ген, экспрессирующий один или несколько компонентов Т-клеточного рецептора (TCR). Таким образом, настоящее изобретение относится к экспрессирующей анти-CLL1 CAR Т-клетке, в которой инавтивирован по меньшей мере один ген, экспрессирующий один или несколько компонентов Т-клеточного рецептора (TCR).

Под инактивированным геном TCR подразумевается, что представляющий интерес ген не экспрессируется в форме функционального белка. В конкретных вариантах осуществления изобретения способ генетической модификации основан на экспрессии в предназначенной для конструирования клетке редко расщепляющей эндонуклеазы, которая катализирует расщепление в требуемом гене, инактивируя тем самым указанный требуемый ген. Разрывы нуклеотидной цепи, вызываемые редко расщепляющей эндонуклеазой, как правило, репарируются с помощью различных механизмов гомологичной рекомбинации или соединения негомологичных концов (NHEJ). Однако NHEJ представляет собой несовершенный процесс репарации, который часто приводит к изменениям последовательности ДНК в сайте расщепления. Механизмы включают повторное соединение остатков двух концов ДНК посредством прямого повторного лигирования (Critchlow и Jackson, 1998) или посредством так называемого опосредуемого микрогомологией соединения концов (Betts, Brenchley и др., 2003; Ма, Kim и др., 2003). Репарация посредством соединения негомологичных концов (NHEJ) часто приводит к небольшим инсерциям или делециям и ее можно применять для создания специфических «выключений» генов. Указанная модификация может представлять собой замену, делецию или добавление по меньшей мере одного нуклеотида. Клетки, в которых произошел случай индуцированного расщеплением мутагенеза, т.е. случай мутагенеза, являющегося результатом NHEJ, можно идентифицировать и/или отбирать с помощью метода, хорошо известного в данной области. В конкретном варианте осуществления изобретения стадия инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент Т-клеточного рецептора (TCR) в клетках каждого индивидуального образца, включает интродукцию в клетку редко расщепляющей эндонуклеазы, которая обладает способностью разрушать по меньшей мере один ген, кодирующий компонент Т-клеточного рецептора (TCR). В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные клетки каждого индивидуального образца трансформируют нуклеиновой кислотой, кодирующей редко расщепляющую эндонуклеазу, которая обладает способностью разрушать по меньшей мере один ген, кодирующий компонент Т-клеточного рецептора (TCR), и указанную редко расщепляющую эндонуклеазу экспрессируют в указанных клетках.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный способ дополнительного конструирования иммунных клеток включает интродукцию в указанные Т-клетки полинуклеотидов, в частности мРНК, которые кодируют специфические редко расщепляющие эндонуклеазы, для избирательной инактивации вышеупомянутых генов путем расщепления ДНК. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные редко расщепляющие эндонуклеазы представляют собой TALE-нуклеазы или Cas9-эндонуклеазы. В настоящее время установлено, что TAL-нуклеазы обладают более высокой специфичностью и эффективностью расщепления по сравнению с другими типами редко расщепляющих эндонуклеаз, что обусловливает выбор этих эндонуклеаз для получения сконструированных иммунных клеток в промышленном масштабе с постоянным оборотом.

Согласно изобретению предполагается, что несущие анти-CLL1 CAR иммунные клетки с инактивированным одним или несколькими компонентами Т-клеточного рецептора (TCR), можно применять в качестве лекарственного средства.

Устойчивые к лекарственным средствам Т-клетки

Согласно другому объекту изобретения экспрессирующие анти-CLL1 CAR иммунные клетки, предлагаемые в изобретении, можно подвергать дополнительной генетической инженерии для повышения их устойчивости к иммуносупрессорным лекарственным средствам или химиотерапевтическим обработкам, которые применяют в качества стандартной медицинской помощи для лечения рака, ассоциированного с CLL1-позитивными злокачественными клетками, прежде всего AML.

Для уничтожения раковых клеток разработан ряд цитотоксических агентов (противораковых лекарственных средств), таких как антиметаболиты, алкилирующие агенты, антрациклины, ингибиторы ДНК-метилтрансферазы, соединения платины и веретенные яды. Однако применение этих агентов в сочетании с новыми терапиями, такими как иммунотерапии, является проблематичным. Например, химиотерапевтические агенты могут оказаться вредными при разработке сильных противоопухолевых иммунокомпетентных клеток из-за неспецифических профилей токсичности этих агентов. Основанные на применении малых молекул терапии, мишенью которых являются пути клеточной пролиферации, могут также мешать созданию противоопухолевого иммунитета. Если химиотерапевтические режимы, которые обладают кратковременной эффективностью, удается объединять с новыми терапиями на основе иммунокомпетентных клеток, то можно достигать значительного усиления антинеопластической терапии (см. обзор Dasgupta, McCarty и др., 2011).

Для усиления противораковой терапии и избирательного приживления аллогенных иммунных клеток указанным аллогенным иммунным клеткам придают устойчивость к лекарственным средствам для их защиты от токсических побочных действий химиотерапевтических агентов. Устойчивость иммунных клеток к лекарственным средствам также приводит к увеличению их количества in vivo или ex vivo, поскольку Т-клетки, которые экспрессируют ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, должны выживать и размножаться в отличие от чувствительных к лекарственному средству клеток.

Методы создания Т-клеток, устойчивых к химиотерапевтическим агентам, описаны в РСТ/ЕР2014/075317, документ полностью включен в настоящем описание в качестве ссылки.

В частности, настоящее изобретение относится к способу создания аллогенных клеток, пригодных для иммунотерапии, в которых по меньшей мере один ген, кодирующий компонент Т-клеточного рецептора (TCR), инактивируют, и один ген модифицируют с целью придания устойчивости к лекарственному средству, включающему:

• получение Т-клетки, экспрессирующей анти-CLL1 scCAR;

• модификацию указанной экспрессирующей анти-CLL1 scCAR Т-клетки путем инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент Т-клеточного рецептора (TCR);

• модификацию указанной экспрессирующей анти-CLL1 scCAR, предпочтительно гуманизированный CLL1 scCAR, Т-клетки для придания устойчивости к лекарственному средству указанной экспрессирующей анти-CLL1 scCAR Т-клетке;

• размножение указанной сконструированной экспрессирующей анти-CLL1 scCAR Т-клетки в присутствии указанного лекарственного средства.

Альтернативно этому, настоящее изобретение относится к способу, включающему:

- получение Т-клетки, экспрессирующей анти-CLL1 scCAR;

предпочтительно гуманизированный CLL1 scCAR;

- модификацию указанной экспрессирующей анти-CLL1 scCAR Т-клетки для придания устойчивости к лекарственному средству указанной экспрессирующей анти-CLL1 scCAR Т-клетке;

- модификацию указанной экспрессирующей анти-CLL1 scCAR Т-клетки путем инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент Т-клеточного рецептора (TCR);

- размножение указанной сконструированной экспрессирующей анти-CLL1 scCAR Т-клетки в присутствии указанного лекарственного средства.

В частности, настоящее изобретение относится также к способу создания аллогенных клеток, пригодных для иммунотерапии, в которых по меньшей мере один ген, кодирующий компонент Т-клеточного рецептора (TCR), инактивируют и один ген модифицируют с целью придания устойчивости к лекарственному средству, включающему:

- получение Т-клетки, экспрессирующей анти-CLL1 scCAR;

предпочтительно гуманизированный CLL1 scCAR;

Альтернативно этому, настоящее изобретение относится к способу, включающему:

- получение Т-клетки, экспрессирующей анти-CLL1 scCAR;

предпочтительно гуманизированный CLL1 scCAR;

Экспрессия генов, обусловливающих устойчивость к лекарственным средствам, в экспрессирующих анти-CLL1 scCAR иммунных клетках

В конкретном варианте осуществления изобретения указанную устойчивость к лекарственным средствам можно придавать Т-клетке путем экспрессии по меньшей мере одного гена, обусловливающего устойчивость к лекарственному средству. Указанный ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, представляет собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует «устойчивость» к агенту, такому как химиотерапевтический агент (например, метотрексат). Другими словами, экспрессия гена, обусловливающего устойчивость к лекарственному средству, в клетке обеспечивает пролиферацию клетки в присутствии агента в большей степени, чем пролиферация соответствующей клетки, в которой отсутствует ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству. Экспрессия гена, обусловливающего устойчивость к лекарственному средству, в клетке обеспечивает пролиферацию клеток в присутствии агента и не влияет на их эффективность. Ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, может кодировать устойчивость к антиметаболиту, метотрексату, винбластину, цисплатину, алкилирующим агентам, антрациклинам, цитотоксическим антибиотикам, анти-иммунофилинам, их аналогам или производным и т.п.

В одном из вариантов осуществления изобретения ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, предлагаемый в изобретении, может придавать устойчивость к лекарственному средству (или агенту), в частности, к противораковому лекарственному средству, выбранному из арацитина, цитозин-арабинозида, амсакрина, даунорубицина, идарубицина, новантрона, митоксантрона, вепезида, этопозида (VP16), триоксида мышьяка, транс-ретиноевой кислоты, комбинации триоксида мышьяка и транс-ретиноевой кислоты, мехлорэтамина, прокарбазина, хлорамбуцила, цитарабина, антрациклинов, 6-тиогуанина, гидроксимочевины, преднизона и их комбинации.

Идентифицировано несколько генов, обусловливающих устойчивость к лекарственному средству, которые потенциально пригодны для придания устойчивости к лекарственному средству требуемым клеткам (Takebe, Zhao и др., 2001; Sugimoto, Tsukahara и др., 2003; Zielske, Reese и др., 2003; Nivens, Felder и др., 2004; Bardenheuer, Lehmberg и др., 2005; Kushman, Kabler и др., 2007).

Одним из примеров гена, обусловливающего устойчивость к лекарственному средству, может являться также мутантная или модифицированная форма дигидрофолат-редуктазы (DHFR). DHFR представляет собой фермент, участвующий в регулировании количества тетрагидрофолата в клетке, и является важным для синтеза ДНК. Аналоги фолата, такие как метотрексат (МТХ), ингибируют DHFR и поэтому применяются в качестве антинеопластических агентов в клинических условиях. Описаны различные мутантные формы DHFR, которые обладают повышенной устойчивостью к ингибированию антифолатными агентами, которые применяют в терапии. В конкретном варианте осуществления изобретения ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, предлагаемый в настоящем изобретении, может представлять собой нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантную форму человеческой DHFR дикого типа (GenBank: ААН71996.1), которая содержит по меньшей мере одну мутацию, обусловливающую устойчивость к лечению антифолатным средством, таким как метотрексат. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантная форма DHFR содержит по меньшей мере одну измененную в результате мутации аминокислоту в положении G15, L22, F31 или F34, предпочтительно в положениях L22 или F31 (Schweitzer, Dicker и др., 1990); международная заявка на патент WO 94/24277; патент США US №6642043). В конкретном варианте осуществления изобретения указанная мутантная форма DHFR содержит две измененные в результате мутации аминокислоты в положении L22 и F31. Соответствие аминокислотным положениям, указанным в настоящем описании, часто выражают в виде положений аминокислот в полипептиде DHFR дикого типа, зарегистрированного в GenBank: AAH71996.1. В конкретном варианте осуществления изобретения остаток серина в положении 15 предпочтительно заменяют на остаток триптофана. В другом конкретном варианте осуществления изобретения остаток лейцина в положении 22 предпочтительно заменяют на аминокислоту, которая может нарушать связывание мутантной DHFR с антифолатными агентами, предпочтительно на незаряженные аминокислотные остатки, такие как фенилаланин или тирозин. В другом конкретном варианте осуществления изобретения остаток фенилаланина в положениях 31 или 34 предпочтительно заменяют на остаток низкомолекулярной гидрофильной аминокислоты, такой как аланин, серин или глицин.

В контексте настоящего описания понятие «антифолатный агент» или «аналоги фолатов» относится к молекуле, которая должна оказывать некоторое воздействие на путь метаболизма фолатов. Примеры антифолатных агентов включают, например, метотрексат (МТХ); аминоптерин; триметрексат (Neutrexin™); эдатрексат; N10-пропаргил-5,8-дидеазафолиевую кислоту (СВ3717); ZD1694 (тумодекс), 5,8-дидеазафолиевую кислоту (IAHQ); 5,10-дидеазатетрагидрофолиевую кислоту (DDATHF); 5-деазафолиевую кислоту; РТ523 (N-альфа-(4-амино-4-дезоксиптероил)-N-дельта-гемифталоил-L-орнитин); 10-этил-10-дезаминоптерин (DDATHF, ломатрексол); пиритрексим; 10-EDAM; ZD1694; GW1843; пеметрексат и PDX (10-пропаргил-Ю-дезаминоптерин).

Другим примером гена, обусловливающего устойчивость к лекарственному средству, может являться также мутантная или модифицированная форма инозин-5'-монофосфатдегидрогеназы II (IMPDH2), фермента, ограничивающего скорость синтеза de novo гуанозиновых нуклеотидов. Мутантная или модифицированная форма IMPDH2 представляет собой ген, обусловливающий устойчивость к ингибитору IMPDH. Ингибиторы IMPDH могут представлять собой микофеноловую кислоту (МРА) или ее пролекарство микофенолата мофетил (MMF). Мутант IMPDH2 может содержать по меньшей мере одну, предпочтительно две мутации в сайте связывания MAP человеческой IMPDH2 дикого типа (NP_000875.2), которые приводят к значительному повышению устойчивости к ингибитору IMPDH. Мутации предпочтительно затрагивают положения Т333 и/или S351 (Yam, Jensen и др., 2006; Sangiolo, Lesnikova и др., 2007; Jonnalagadda, Brown и др., 2013). В конкретном варианте осуществления изобретения остаток треонина в положении 333 заменяют на остаток изолейцина и остаток серина в положении 351 заменяют на остаток тирозина. Соответствие аминокислотным положениям, указанным в настоящем описании, часто выражают в виде положений аминокислот в человеческом полипептиде IMPDH2 дикого типа, зарегистрированном под номером NP_000875.2.

Другим геном, обусловливающим устойчивость к лекарственному средству, является мутантная форма кальциневрина. Кальциневрин (РР2В) представляет собой повсеместно экспрессируемую серин/треониновую протеинфосфатазу, которая участвует во многих биологических процессах и которая играет центральную роль в активации Т-клеток. Кальциневрин представляет собой гетеродимер, состоящий из каталитической субъединицы (CnA; три изоформы) и регуляторной субъединицы (CnB; две изоформы). После контакта с Т-клеточным рецептором кальциневрин дефосфоририлирует фактор транскрипции NFAT, что приводит к его транслокации в ядро, где он активирует имеющий решающее значение ген, такой как IL2. FK506 в комплексе с FKBP12 или циклоспорин А (CsA) в комплексе с СуРА блокируют доступ NFAT к активному сайту кальциневрина, препятствуя его дефосфорилированию и ингибируя тем самым активацию Т-клеток (Brewin, Mancao и др., 2009). Ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, предлагаемый в настоящем изобретении, может представлять собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует мутантную форму кальциневрина, устойчивую к ингибитору кальциневрина, такому как FK506 и/или CsA. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная мутантная форма может содержать по меньшей мере одну мутантную аминокислоту в гетеродимере кальциневрина дикого типа в положениях: V314, Y341, М347, Т351, W352, L354, K360, предпочтительно двойные мутации в положениях Т351 и L354 или V314 и Y341. В конкретном варианте осуществления изобретения остаток валина в положении 341 можно заменять на остаток лизина или аргинина, остаток тирозина в положении 341 можно заменять на остаток фенилаланина; метионин в положении 347 можно заменять на остаток глутаминовой кислоты, аргинина или триптофана; треонин в положении 351 можно заменять на остаток глутаминовой кислоты; остаток триптофана в положении 352 можно заменять на остаток цистеин, глутаминовой кислоты или аланина, серин в положении 353 можно заменять на остаток гистидина или аспарагина, лейцин в положении 354 можно заменять на остаток аланина; лизин в положении 360 можно заменять на остаток аланина или фенилаланина в последовательности, соответствующей последовательности, зарегистрированной в GenBank: ACX34092.1. Соответствие аминокислотным положениям, указанным в настоящем описании, часто выражают в виде положений аминокислот в человеческом полипептиде гетеродимера кальциневрина дикого типа, зарегистрированном в GenBank: ACX34092.1.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная мутантная форма может содержать по меньшей мере одну мутантную аминокислоту в гетеродимере кальциневрина дикого типа в положениях: V120, N123, L124 или K125, предпочтительно двойные мутации в положениях L124 и K125. В конкретном варианте осуществления изобретения валин в положении 120 можно заменять на остаток серина, аспарагиновой кислоты, фенилаланина или лейцина; аспарагин в положении 123 можно заменять на триптофан, лизин, фенилаланин, аргинин, гистидин или серин; лейцин в положении 124 можно заменять на остаток треонина; лизин в положении 125 можно заменять на аланин, глутаминовую кислоту, триптофан, или два остатка, такие как лейцин-аргинин или изолейцин-глутаминовая кислота, можно добавлять после лизина в положении 125 в аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности, зарегистрированной в GenBank: ACX34095.1. Соответствие аминокислотным положениям, указанным в настоящем описании, часто выражают в виде положений аминокислот в человеческом полипептиде гетеродимера кальциневрина дикого типа, зарегистрированном в GenBank: АСХ34095.1.

Другим геном, обусловливающим устойчивость к лекарственному средству, является ген O(6)-метилгуанинметилтрансферазы (MGMT), кодирующий человеческую алкилгуанинтрансферазу (hAGT). AGT представляет собой репарирующий ДНК белок, который придает устойчивость к цитотоксическим действиям алкилирующих агентов, таких как нитрозомочевины и темозоломид (TMZ). 6-бензилгуанин (6-BG) является ингибитором AGT, который усиливает токсичность нитрозомочевины и его вводят совместно с TMZ для усиления цитотоксических действий этого агента. Несколько мутантных форм MGMT, которые кодируют варианты AGT, обладают высокой устойчивостью к инактивации с помощью 6-BG, но сохраняют их способность к репарации повреждения ДНК (Maze, Kurpad и др., 1999). В конкретном варианте осуществления изобретения мутантная форма AGT может содержать мутантную аминокислоту в положении Р140 AGT дикого типа в аминокислотной последовательности, представленной в базе данных UniProtKB под регистрационным номеров Р16455. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный пролин в положении 140 заменяют на остаток лизина.

Другим геном, обусловливающим устойчивость к лекарственному средству, может являться ген обусловливающего устойчивость ко многим лекарственным средствам белка 1 (MDR1). Этот ген кодирует мембранный гликопротеин, известный как Р-гликопротеин (P-GP), который участвует в транспорте побочных продуктов метаболизма через клеточную мембрану. Белок P-GP обладает широким спектром специфичности в отношении нескольких структурно неродственных химиотерапевтических агентов.

Установлено, что сверхэкспрессия обусловливающего устойчивость ко многим лекарственным средствам белка 1, приводит к устойчивости к таким лекарственным средства как митоксантрон (Charles S. Morrow, Christina Peklak-Scott, Bimjhana Bishwokarma, Timothy E. Kute, Pamela K. Smitherman и Alan J. Townsend. Multidrug Resistance Protein 1 (MRP1, ABCC1) Mediates Resistance to Mitoxantrone via Glutathione-Dependent Drug Efflux Mol Pharmacol, 69, апрель 2006 г., сс. 1499-1505).

Таким образом, устойчивость к лекарственному средству можно придавать клеткам в результате экспрессии нуклеотидной последовательности, которая кодирует MDR-1 (NP_000918).

Еще один путь получения клеток, устойчивых к лекарственному средству, состоит в получении клеток со специфической(ими) мутацией(ями), такими как мутации Arg486 и Glu571 в гене человеческой топоизомеразы II, для придания устойчивости к амсакрину (S. Patel, В.A. Keller и L.M. Fisher. Molecular Pharmacology, т. 57, 2000, сс. 784-791).

Еще один путь получения клеток, устойчивых к лекарственному средству, состоит в получении клеток, сверхэкспрессирующих микроРНК-21, для придания устойчивости к даунорубицину (Haitao и др.. Involvement of miR-21 in resistance to daunorubicin by regulating PTEN expression in the leukaemia K562 cell line Bai, FEBS Letters, т. 585, вып. 2, сс. 402-408).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетки, которые несут указанную обусловливающую устойчивость к лекарственному средству мРНК или белок, содержат также ингибирующую мРНК или ген, обусловливающий ее экспрессию, что позволяет избирательно разрушать указанные устойчивые к лекарственному средству клетки в присутствии указанного лекарственного средства или после введения указанного лекарственного средства.

Ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, может придавать также устойчивость к цитотоксическим антибиотикам и может представлять собой ген ble или ген mcrA. Эктопическая экспрессия гена ble или гена mcrA в иммунной клетке обеспечивает избирательное преимущество при воздействии химиотерапевтического средства, т.е. блеомицина или митомицина С соответственно.

Наиболее широко распространенным практическим подходом к генной терапии является добавление гена для создания Т-клетки посредством эффективной доставки гена с помощью векторов, предпочтительно вирусного вектора. Таким образом, в конкретном варианте осуществления изобретения указанный ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, можно экспрессировать в клетке в результате интродукции в клетку трансгена, предпочтительно кодируемого по меньшей мере одним вектором.

В одном из вариантов осуществления изобретения клетки, которые несут ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, или модифицированный ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, содержат также индуцибельный ген суицида, индукция которого провоцирует клеточную гибель, что обеспечивает их избирательное разрушение.

Случайная инсерция генов в геном может приводить к несоответствующей экспрессии встроенного гена или гена, расположенного вблизи сайта инсерции. Специфическая генная терапия с использованием гомологичной рекомбинации экзогенной нуклеиновой кислоты, содержащей эндогенные последовательности для направления генов к специфическим сайтам в геноме, может позволять конструировать безопасные Т-клетки. Как описано выше, стадия генетической модификации в способе может включать стадию интродукции в клетки экзогенной нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере последовательность, кодирующую ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, и часть эндогенного гена, в результате чего имеет место гомологичная рекомбинация между эндогенным геном и экзогенной нуклеиновой кислотой. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный эндогенный ген может представлять собой ген дикого типа, «обусловливающий устойчивость к лекарственному средству», в результате чего после гомологичной рекомбинации ген дикого типа заменяется мутантной формой гена, которая обусловливает устойчивость к лекарственному средству.

Известно, что эндонуклеолитические разрывы стимулируют скорость гомологичной рекомбинации. Таким образом, в конкретном варианте осуществления изобретения способ, предлагаемый в изобретении, дополнительно включает стадию экспрессии в клетке редко расщепляющей эндонуклеазы, которая может расщеплять последовательность-мишень в эндогенном гене. Указанный эндогенный ген может кодировать, например, DHFR, IMPDH2, кальциневрин или AGT. Указанная редко расщепляющая эндонуклеаза может представлять собой TALE-нуклеазу, нуклеазу с цинковыми пальцами, нуклеазу CRISPR/Cas9, MBBBD-нуклеазу или мегануклеазу.

Инактивация генов, повышающих чувствительность к лекарственным средствам в иммунных клетках, экспрессирующих анти-CLL1 CAR

В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанную устойчивость к лекарственному средству можно придавать клетке, предлагаемой в изобретении (экспрессирующей анти-CLL1 CAR иммунной клетке), путем инактивации гена, повышающего чувствительность к лекарственному средству.

При создании изобретения предпринимали попытку инактивировать потенциально повышающий чувствительность к лекарственному средству ген для создания предназначенной для иммунотерапии Т-клетки, в частности, для создания экспрессирующей анти-CLL1 CAR иммунной клетки, которую можно применять в комбинации с терапевтическим агентом (противораковым лекарственным средством).

Под инактивацией гена подразумевается, что представляющий интерес ген не экспрессируется в форме функционально белка. В конкретном варианте осуществления изобретения метод генетической модификации, применяемый при конструировании клеток, основывается на экспрессии одной редко расщепляющей эндонуклеазы, которая специфически катализирует расщепление в одном гене-мишени, инактивируя тем самым указанный ген-мишень. В конкретном варианте осуществления изобретения стадия инактивации по меньшей мере одного повышающего чувствительность к лекарственному средству гена включает интродукцию в клетку редко расщепляющей эндонуклеазы, которая может разрушать по меньшей мере один повышающий чувствительность к лекарственному средству ген. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные клетки трансформируют нуклеиновой кислотой, которая кодирует редко расщепляющую эндонуклеазу, которая может разрушать повышающий чувствительность к лекарственному средству ген, и экспрессируют указанную редко расщепляющую эндонуклеазу в указанных клетках. Указанная редко расщепляющая эндонуклеаза может представлять собой мегануклеазу, нуклеазу с «цинковыми пальцами», нуклеазу CRISPR/Cas9, MBBBD-нуклеазу или TALE-нуклеазу. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная редко расщепляющая эндонуклеаза представляет собой TALE-нуклеазу.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения повышающий чувствительность к лекарственному средству ген, который можно инактивировать для придания устойчивости к лекарственному средству Т-клетке, представляет собой ген человеческой дезоксицитидинкиназы (dCK). Этот фермент требуется для фосфорилирования дезоксирибонуклеозидов дезоксицитидина (dC), дезоксигуанозина (dG) и дезоксиаденозина (dA). Пуриновые нуклеотидные аналоги (PNA) метаболизируются dCK с образованием моно-, ди- и трифосфата PNA. Указанные трифосфатные формы, и прежде всего клофарабина трифосфат, конкурируют с АТФ при синтезе ДНК, действуют в качестве проапоптозного агента и являются сильными ингибиторами рибонуклеотидредуктазы (RNR), которая участвует в производстве тринуклеотидов.

Предпочтительно инактивация dCK в Т-клетках опосредуется TALE-нуклеазой. Для достижения указанной цели разработано несколько пар TALE-нуклеаз для dCK, которые собраны на полинуклеотидном уровне и подтверждены секвенированием. Примеры пар TALE-нуклеаз, которые можно применять согласно изобретению, описаны в РСТ/ЕР2014/075317.

Указанная инактивация dCK в Т-клетках обусловаливает устойчивость к аналогам пуриновых нуклеозидов (PNA), таким как клофарабин, флударабин или децитабин (дакоген).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения инактивацию dCK в Т-клетках объединяют с инактивацией генов TRAC, получая указанные Т-клетки с двойным «выключением» (KO), которые обладают устойчивостью к лекарственному средству, такому как клофарабин, и являются менеее аллогенными. Указанные двойные свойства являются наиболее ценными для терапевтичесих целей, позволяя применять «имеющиеся в наличии» аллогенные клетки для иммунотерапии в сочетании с химиотерапией для лечения срадающих раком пациентов. Указанную двойную инактивацию посредством KO dCK/TRAC можно осуществлять одновременно или последовательно. Один из примеров пары TALE-нуклеаза dCK/TRAC, которая обеспечивает успех согласно изобретению, описан в РСТ/ЕР2014/075317, при этом, в частности, последовательности-мишени находятся в 2 локусах (dCK и TRAC).

Другим примером фермента, который можно инактивировать, является ген человеческой гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (HPRT) (Genbank: М26434.1). В частности, HPRT можно инактивировать в сконструированных Т-клетках для придания устойчивости к цитостатическому метаболиту 6-тиогуанину (6TG), который под действием HPRT превращается в цитотоксический тиогуаниновый нуклеотид и который в настоящем время применяют для лечения страдающих раком, прежде всего лейкозами, пациентов (Hacke, Treger и др., 2013). Аналоги гуанинов метаболизируются трансферазой HPRT, которая катализирует добавление фосфорибозильного фрагмента и позволяет получать гуаниновые аналоги TGMP, включая 6-меркаптопурин (6МР) и 6-тиогуанин (6TG), которые можно применять в качестве очищающих лимфу лекарственных средств, предназначенных для лечения ALL. Они метаболизируются HPRT (гипоксантин-фосфорибозилтрансфераза, которая катализирует добавление фосфорибозильного фрагмента и позволяет получать TGMP). Их последующее фосфорилирование приводит к образованию их трифосфорилированных форм, которые в конце концов интнгрируются в ДНК. После включения в ДНК тио-ГТФ нарушает правильность репликации ДНК посредством их тиолатной группировки и создают точки случайной мутации, которые являются очень опасными для целостности клеток.

Таким образом, в настоящем изобретении предложена экспрессирующая анти-CLL1 scCAR клетка, прежде всего экспрессирующая анти-CLL1 scCAR Т-клетка, в которой scCAR имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 35-112 (необязательно гуманизированную) и в которой ген dCK инактивирован.

В другом варианте осуществления изобретения инактивация CD3, который в норме экспрессируется на поверхности Т-клетки, может обусловливать устойчивость к антителам к CD3, таким как теплизумаб.

Устойчивые ко многим лекарственным средствам экспрессирующие анти-CLL1 scCAR иммунные клетки

Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения при создании изобретения предусматривалась разработка стратегии иммунотерапии на основе «имеющихся в наличии» аллогенных Т-клеток, в частности, аллогенной экспрессирующей анти-CLL1 scCAR Т-клетки, устойчивой ко многим лекарственным средствам, для отбора сконструированных Т-клеток, когда пациента лечат различными лекарственными средствами. Терапевтическую эффективность можно значительно повышать путем создания методами генетической инженерии устойчивых ко многим лекарственным средствам аллогенных Т-клеток. Указанная стратегия может быть особенно эффективной при лечении опухолей, которые дают ответ на комбинации лекарственных средств, обладающих синергетическими действиями. Более того, сконструированные Т-клетки с устойчивостью ко многим лекарственным средствам можно размножать и отбирать с использованием минимальной дозы лекарственных средств.

Так, способ, предлагаемый в настоящем изобретении, может включать модификацию Т-клетки для придания устойчивости ко многим лекарственным средствам указанной Т-клетке. Указанную устойчивость ко многим лекарственным средствам можно получать либо путем экспрессии более одного гена, обусловливающего устойчивость к лекарственному средству, либо путем инактивации более одного гена, повышающего чувствительность к лекарственному средству. В другом конкретном варианте осуществления изобретения устойчивость ко многим лекарственным средствам можно придавать указанной Т-клетке путем экспрессии по меньше мере одного гена, обусловливающего устойчивость к лекарственному средству, и инактивации по меньшей мере одного гена, повышающего чувствительность к лекарственному средству. В частности, устойчивость ко многим лекарственным средствам можно придавать указанной Т-клетке путем экспрессии по меньшей мере одного гена, обусловливающего устойчивость к лекарственному средству, такого как мутантная форма DHFR, мутантная форма IMPDH2, мутантная форма кальциневрина, мутантная форма MGMT, ген ble и ген vcrA, и инактивации по меньшей мере одного гена, повышающего чувствительность к лекарственному средству, такого как ген HPRT. В предпочтительном варианте осуществления изобретения устойчивость ко многим лекарственным средствам можно придавать путем инактивации гена HPRT и экспрессии мутантной формы DHFR; или путем инактивации гена HPRT и экспрессии мутантной формы IMPDH2; или путем инактивации гена HPRT и экспрессии мутантной формы кальциневрина; путем инактивации гена HPRT и экспрессии мутантной формы MGMT; путем инактивации гена HPRT и экспрессии гена ble; путем инактивации гена HPRT и экспрессии гена mcrA.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является аллогенная экспрессирующая анти-CLL 1 scCAR Т-клетка, которая экспрессирует ген, обусловливающий устойчивость более чем к одному лекарственному средству, или в которой инактивирован ген, повышающий чувствительность более чем к одному лекарственному средству.

Гены суицида в экспрессирующих анти-CLL1 scCAR иммунных клетках

В некоторых случаях, в связи с тем, что сконструированные Т-клетки могут размножаться и сохраняться в течение нескольких лет после введения, может оказаться желательным включать безопасный механизм для избирательной делеции введенных Т-клеток. Так, согласно некоторым вариантам осуществления изобретения способ, предлагаемый в изобретении, может включать трансформацию указанных Т-клеток рекомбинантным геном суицида. Указанный рекомбинантный ген суицида применяют для снижения риска непосредственной токсичности и/или неконтролируемой пролиферации указанных Т-клеток после введения индивидууму (Quintarelli С., Vera F., Blood, 2007; Теу S.K, Dotti G., Rooney C.M, Boil blood marrow transplant, 2007). Гены суицида позволяют осуществлять избирательную делецию трансформированных клеток in vivo. В частности, ген суицида обладает способностью превращать нетоксичное пролекарство в цитотоксическое лекарственное средство или экспрессировать токсичный продукт экспрессии гена. Другими словами, «ген суицида» представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую продукт, где продукт вызывает гибель клеток сам или в присутствии других соединений.

Репрезентативным примером указанного гена суицида является ген, который кодирует тимидинкиназу вируса герпеса простого. Другими примерами являются тимидинкиназа вируса ветряной оспы и бактериальный ген цитозиндеаминазы, которая может превращать 5-фторцитозин в высокотоксичное соединение 5-фторурацил. Гены суицида также включают, например (но не ограничиваясь только ими) ген каспазы-9 или каспазы-8 или цитозиндеаминазы. Каспазу-9 можно активировать с помощью специфического химического индуктора димеризации (CID).Гены суицида могут также представлять собой гены полипептидов, которые экспрессируются на поверхности клетки и могут придавать клетке чувствительность к терапевтическим моноклональным антителам. В контексте настоящего описания «пролекарство» обозначает любое соединение, которое можно применять в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, которое может превращаться в токсичный продукт. В способе, предлагаемом в настоящем изобретении, пролекарство превращается в токсичный продукт с помощью генного продукта гена суицида. Репрезентативным примером такого пролекарства является ганцикловир, который превращается in vivo в токсичное соединение с помощью тимидинкиназы HSV. После этого производное ганцикловира проявляет токсичность в отношении опухолевых клеток. Другие репрезентативные примеры пролекарств включают ацикловир, FIAU [1-(2-дезокси-2-фтор-β-D-арабинофуранозил)-5-йодурпцил], 6-метоксиарабинозид для VZV-TK и 5-фторцитозин для цитозиндеаминазы.

В одной из предпочтительных систем гена суицида применяется рекомбинантный антигенный полипептид, который содержит антигенный мотив, распознаваемый МАт к CD20 ритуксимабом, прежде всего QBen10, такой как так называемый полипептид RQR8, описанный в WO 2013/153391, который экспрессируется независимо от анти-CLL1 CAR. Ритуксимаб, запатентованное лекарственное средство, представляющее собой антитело, затем можно применять при необходимости для клеточного истощения.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является аллогенная экспрессирующая анти-CLL1 scCAR Т-клетка, которая экспрессирует ген, обусловливающий устойчивость более чем к одному лекарственному средству, или в которой инактивирован ген, повышающий чувствительность более чем к одному лекарственному средству, и в которой присутствует ген суицида, позволяющий разрушать указанные клетки.

В частности, настоящее изобретение относится к аллогенной Т-клетке, в частности, аллогенной экспрессирующей анти-CLL1 scCAR Т-клетке, и предпочтительно аллогенной экспрессирующей анти-CLL1 scCAR Т-клетке, которая содержит пептид, идентичный на 80%-100% scFv из антител SC02-357, SC02-378, SC02-161, М26, М31, G4, М22, М29, М2, М5, G12, 21.26 или 1075.7, указанная аллогенная экспрессирующая анти-CLL1 scCAR Т-клетка, которая содержит пептид, идентичный на 80%-100% scFv из антител SC02-357, SC02-378, SC02-161, М26, М31, G4, М22, М29, М2, М5, G12, 21.26 и 1075.7, обладает более предпочтительной устойчивостью к лекарственным средствам и особенно пригодна для иммунотерапии.

Устойчивость к лекарственному средству можно придавать путем инактивации генов, повышающих чувствительность к лекарственным средствам, или путем экспрессии генов, обусловливающих устойчивость к лекарственным средствам. Некоторыми примерами лекарственных средств, которые можно применять согласно изобретению, являются аналоги пуриновых нуклеозидов (PNA), такие как клофарабин и флударабин, или другие лекарственные средства, такие как 6-меркаптопурин (6МР) и 6-тиогуанин (6TG).

Одним из объектов настоящего изобретения являются способы конструирования иммунных клеток таким образом, чтобы сделать их устойчивыми к аналогам пуриновых нуклеотидов (PNA), таким как клофарабин или флударабин, в результате чего их можно применять для противораковой иммунотерпии пациентов, которых предварительно лечили указанными общепринятыми химиотерапевтическими средствами.

Устойчивость к лекарственным средствам можно придавать Т-клеткам путем инактивации одного или нескольких гена(ов), ответственного(ых) за чувствительность клеток к лекарственному средству (повышающий(ие) чувствительность к лекарственному средству ген(ы)), такие как гены dcK и/или HPRT.

Согласно другому объекту изобретения устойчивость к лекарственным средствам можно придавать Т-клетке путем экспрессии гена, обусловливающего устойчивость к лекарственному средству. Установлено, что аллельные варианты некоторых генов, таких как ген дигидрофолат-редуктазы (DHFR), инозин-монофосфат-дегидрогеназы 2 (IMPDH2), кальциневрина или метилгуанинтрансферазы (MGMT), придают устойчивость к лекарственному средству клетке, предлагаемой в изобретении.

Например, CD52 и глюкортикоидные рецепторы (GR), которые являются мишенями лекарственных средств при лечении Campath® (алемтузумаб) или ритуксимабом и глюкокортикоидами, можно инактивировать, придавая клеткам устойчивость к указанным обработкам и давая конкурентное преимущество по сравнению с собственными Т-клетками пациента, не наделенными анти-CLL1 scCAR. Можно также подавлять или снижать экспрессию гена CD3, придавая устойчивость к теплизумабу, который представляет собой другое иммуносупрессорное средство. Согласно изобретению можно также подавлять или снижать экспрессию HPRT, придавая устойчивость к 6-тиогуанину, цитостатическому агенту, обычно применяемому для химиотерапии, прежде всего для лечения острого лимфобластного лейкоза.

Клетки со сконструированными иммунными контрольными точками

Согласно другому объекту изобретения на иммунные клетки можно дополнительно оказывать воздействие, делая их более активными или ограничивая их истощение, путем инактивации генов, кодирующих белки, которые действуют в качестве «иммунных контрольных точек», выступая в качестве регуляторов активации Т-клеток, таких как гены, выбранные из CTLA4, РРР2СА, РРР2СВ, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, НМОХ2, IL6R, IL6ST, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1 (orblimp1), BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, предпочтительно указанный ген представляет собой PDCD1 или CTLA-4. Примеры генов, экспрессию которых можно снижать или подавлять, представлены в таблице 9.

В настоящем изобретении предложены также аллогенные Т-клетки, экспрессирующие анти-CLL1 scCAR, в частности, анти-CLL1, в которых по меньшей мере один ген, экспрессирующий один или несколько компонентов Т-клеточного рецептора (TCR), инактивирован и/или инактивирован один ген, выбранный из следующих генов: CTLA4, РРР2СА, РРР2СВ, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, НМОХ2, IL6R, IL6ST, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1 (orblimp1), BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, что описано в WO 2014/184741.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный ген представляет собой ген, который действует в качестве регулятора активации Т-клеток, кодирующий белок бета-2-микроглобулина.

Согласно другому объекту изобретения несущие анти-CLL1 scCAR иммунные клетки, предлагаемые в изобретении, можно подвергать дополнительным манипуляциям, придавая им устойчивость к лекарственному средству, в частности к лекарственному средству, которое применяют при химиотерапии против рака, в частности, рака, опосредуемого экспрессирующими CLL1 клетками, такого как AML. Для достижения этого можно интродуцировать ген, придающий устойчивость к указанному лекарственному средству. Указанный ген можно «включать» и «выключать», используя описанный ранее ген, индуцирующий ингибирование/экспрессию системы (Garcia E.L., Mills A.A. Getting around lethality with inducible Cremediated excision. Semin Cell Dev Biol 13, 2002, сс. 151-158; Lewandoski M., Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet 2, 2001, сс. 743-755; Scharfenberger L., Hennerici Т., Kirly G. и др., Transgenic mouse technology in skin biology: Generation of complete or tissue-specific knockout mice. J Invest Dermatol 134:e16, 2014; Schwenk F., Kuhn R., Angrand P.O. и др., Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Res 26, 1998, сс. 1427-1432).

Таким образом, объектом настоящего изобретения является экспрессирующая анти-CLL1 scCAR устойчивая к лекарственному средству иммунная клетка, в которой (I) по меньшей мере один ген, экспрессирующий один или несколько компонентов Т-клеточного рецептора (TCR), инактивирован, (II) по меньшей мере один ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, встроен или ген, обусловливающий чувствительность к указанному лекарственному средству, удален или изменен в результате мутации для его инактивации, (III) необязательно другой ген, выбранный из генов, указанных в таблице 9, инактивирован.

В настоящем изобретении предложены выделенные несущие анти-CLL1 scCAR иммунные клетки или клеточные линии, которые можно получать способом, предлагаемым в изобретении, более конкретно выделенные клетки, содержащие любые белки, полипептиды, аллельные варианты, измененные или удаленные гены или векторы, представленные в настоящем описании.

Иммунные клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, или клеточные линии могут содержать дополнительно экзогенные рекомбинантные полинуклеотиды, в частности, scCAR, или гены суицида, и они могут содержать измененные гены или из них могут быть удалены гены, которые кодируют белки контрольных точек или их лиганды, которые влияют на их эффективность в качестве терапевтического продукта, в идеальном варианте «имеющегося в наличии» продукта. Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения или предупреждения рака у пациента, включающий введение по меньшей мере одной сконструированной иммунной клетки, которую можно получать с помощью описанных выше способов.

Устойчивые к лекарственному средству CLL1⁺/luc⁺-клетки Дауди для тетирования цитотоксичности устойчивых к лекарственному средству аллогенных scCAR-T-клеток

Настоящее изобретения относится также к способу получения клеток-мишеней, которые экспрессируют как рецептор клеточной поверхности, специфический в отношении scCAR Т-клеток, так и ген устойчивости. Указанные клетки-мишени являются особенно ценными для тестирования цитотоксичности scCAR-T-клеток. Эти клетки уже являются устойчивыми к применяемой в клинических условиях дозе клофарабина и обладают люциферазной активностью. Указанная комбинация признаков позволяет отслеживать их на мышиной модели in vivo или при необходимости разрушать их.

Более конкретно, их можно применять для оценки цитотоксических свойств устойчивых к лекарственному средству Т-клеток у мышей в присутствии клофарабина или других PNA. Устойчивые к клофарабину клетки Дауди имитируют физиологическое состояние страдающих острым миелолейкозом (AML) пациентов с рецидивом после индукционной терапии, которые имеют устойчивые к лекарственному средству В-клеточные злокачественные состояния. Таким образом, указанные клетки представляют большой интерес для оценки достоверности и цитотоксичности устойчивых к лекарственному средству scCAR-T-клеток. Предпочтительно эти клетки-мишени представляют собой CLL1⁺-люцифераза⁺-клетки Дауди.

Инсерция по меньшей мере одного эпитопа во внеклеточный домен анти-CLL1-одноцепочечного CAR

В случае анти-CLL1 CAR, предлагаемого в изобретении, во внеклеточный домен указанного CAR можно включать посредством инсерции по меньшей мере один эпитоп.Это должно приводить к предварительному истощению иммунных клеток, наделенных CAR, в случае вредных воздействий in vivo, таких как цитокиновый шторм. Кроме того, указанная инсерция эпитопа или «эпитопное мечение» можно применять для сортинга или очистки сконструированных иммунных клеток in vitro в процессе их получения. Указанный по меньшей мере один эпитоп может представлять собой любой антигенный пептид, который является в достаточной степени иммуногенным для того, чтобы связываться специфическим антителом, которое распознает такой пептид. Например, для достижения этого можно встраивать по меньшей мере одну и предпочтительно две копии мимеотопа CD20, предпочтительно имеющего последовательность PYSNPSLCS (SEQ ID NO: 113), в полипептидную последовательность CAR. Далее для простоты принимается следующий порядок расположения scFv, начиная с N-конца к С-концу: VH-цепь и затем VL-цепь. Однако под объем настоящего изобретения подпадает случай с обратным порядком расположения: VL-цепь и затем VH-цепь.

Различные положения по меньшей мере одного мимеотопа CD20 в анти-CLL1 CAR, предлагаемом в изобретении, схематически изображены на фиг. 3. Указанные две копии мимеотопа CD20 можно сшивать друг с другом, а также с V_L с помощью линкера. Их можно также встраивать между анти-CLL1 scFv и шарниром (таким как шарнир CD8альфа) с помощью необязательного линкера. Мимеотопы CD20 могут связываться с антителами к CD20, такими как ритуксимаб (McLaughlin P. и др., 1998).

Таким образом, анти-CLL1 CAR, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать VH- и VL-цепи, которые могут связываться с антигеном клеточной поверхности CLL1, необязательно гуманизированным, линкер L, домен суицида, шарнир или его часть, трансмембранный домен, костимуляторный домен и стимуляторный домен.

Согласно другому варианту осуществления изобретения эпитоп представляет собой мимеотоп.В качестве макромалекулы, часто пептида, которая имитирует структуру эпитопа, преимуществом мимеотопа является меньший по сравнению с обычным эпитопом размер, и это является ценным для неконформационной последовательности и повышает простоту воспроизводства в длинном полипептиде, таком как CAR. Мимеотопы известны для некоторых МАт, разрешенных для применения в качестве фармацевтических средств, например, два состоящих из 10 аминокислот пептида для цетуксимаба (Riemer и др., 2005), или 24 ак для паливизумаба (Arbiza и др., 1992). Поскольку эти мимеотопы можно идентифицировать с помощью фагового дисплея, то можно использовать некоторые из них для получения последовательности, которая не нарушают scFv этого же МАт.Кроме того, их применение может повышать комплементзависимую цитотоксичность (CDC).

Некоторые примеры таких эпитопов и мимеотопов в сочетании со связывающими их МАт приведены ниже в таблице 10.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения эпитоп, интродуцированный в химерный scFv, представляет собой мимеотоп CD20 (SEQ ID NO: 113), и неслитый МАт, обладающий аффинностью к этому мимеотопу, который применяют для цели(ей) сортировки и/или истощения, представляет собой ритуксимаб.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный по меньшей мере один эпитоп встраивают между VH-и VL-цепями анти-CLL1.1 CAR, который необязательно связывают с указанными VH- и VL-цепями с помощью одного линкера.

В некоторых вариантах осуществления изобретения понятие «линкер» в контексте scFv относится к пептидному линкеру, который состоит из аминокислот, таких как остатки глицина и/или серина, которые используют индивидуально или в комбинации, предназначенному для соединения вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи. В одном из вариантов осуществления изобретения гибкий полипептидный линкер представляет собой глицин/сериновый линкер, и он содержит аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)_n или (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n, в которой n обозначает положительное целое число, равное или превышающее 1. Например, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 и n=10. В одном из вариантов осуществления изобретения гибкие полипептидные линкеры представляют собой (но не ограничиваясь только ими) (Gly₄Ser)₄ или (Gly₄Ser)₃. В другом варианте осуществления изобретения линкеры включают несколько повторов (Gly_xSer)_n, где х=1, 2, 3, 4 или 5 и n обозначает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, например, несколько повторов (GlySer), (Gly₂Ser) или (Gly₅Ser). Под объем изобретения подпадают также линкеры, описанные в WO 2012/138475, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1, V3 или V5, проиллюстрированных на фиг. 2, в которой один мимеотоп CD20 встроен между VH- и VL-цепями анти-CLL1.1 CAR, который необязательно связан с указанными VH- и VL-цепями с помощью одного линкера.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур версии V3, проиллюстрированных на фиг.2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8α, костимуляторный из домен 4-1ВВ, сигнальный домен CD3 дзета, и в которой встроен один мимеотоп CD20 между VH- и VL-цепями анти-CLL1.1 CAR, который необязательно связан с указанными VH- и VL-цепями с помощью одного линкера.

В другом варианте осуществления изобретения указанный по меньшей мере один эпитоп встроен на N-конец CAR - т.е. перед scFv-, который необязательно связан с VH-цепью и с N-концом CAR с помощью одного линкера.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1, V3 или V5, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8α, костимуляторный домен из 4-1ВВ, сигнальный домен CD3дзeта, и в которой один эпитоп встроен на N-конец CAR -т.е. перед scFv-, который необязательно связан с VH-цепью и с N-концом CAR с помощью одного линкера.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур версии V3, проиллюстрированных на фиг.2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8a, костимуляторный из домен 4-1ВВ, сигнальный домен CD3 дзета, и в которой один эпитоп встроен на N-конец CAR, т.е. перед scFv-, который необязательно связан с VH-цепью и с N-концом CAR с помощью одного линкера.

В другом варианте осуществления изобретения указанный по меньшей мере один эпитоп встроен между scFv-фрагментами и шарниром CAR, который необязательно связан с VL-цепью и с шарниром с помощью одного линкера.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1, V3 или V5, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8a, костимуляторный домен из 4-1ВВ, сигнальный домен CD3дзета, и в которой один эпитоп встроен между scFv-фрагментами и шарниром CAR, который необязательно связан с VL-цепью и с шарниром с помощью одного линкера.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур версии V3, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8α, костимуляторный из домен 4-1ВВ, сигнальный домен CD3 дзета, и в которой один эпитоп встроен между scFv-фрагментами и шарниром CAR, который необязательно связан с VL-цепью и с шарниром с помощью одного линкера.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере два эпитопа встроены во внеклеточный домен анти-CLL1 CAR, предлагаемого в настоящем изобретении.

В одном из вариантов осуществления изобретения CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1, V3 или V5, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8α, костимуляторный из домен 4-1ВВ, сигнальный домен CD3 дзета и два мимеотопа CD20, где

указанный внеклеточный связывающий домен содержит VH- и VL-цепи, направленные против CLL1, и шарнир FcγRIIIα или CD8α, или IgG1;

указанные два эпитопа встроены в виде тандема между scFv и указанным шарниром,

и необязательно линкер (SEQ ID NO: 10) помещен между двумя эпитопами и/или между VH и двумя эпитопами.

указанный внеклеточный связывающий домен содержит VH- и VL-цепи, направленные против CLL1, и шарнир FcyRIIIa или CD8α, или IgG1;

указанные два эпитопа встроены в виде тандема перед scFv, т.е. на N-конце CAR,

и необязательно линкер (SEQ ID NO: 10) помещен между двумя эпитопами и/или на N-конце CAR.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере два эпитопа встроены во внеклеточный домен таким образом, чтобы VH был локализован между ними, где все указанные компоненты необязательно разделены с помощью по меньшей мере одного линкера.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1, V3 или V5, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8α, костимуляторный домен из 4-1ВВ, сигнальный домен CD3 дзета, и в которой два эпитопа встроены во внеклеточный домен таким образом, чтобы VH был локализован между ними, где все указанные компоненты необязательно разделены с помощью по меньшей мере одного линкера.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур версии V3, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8α, костимуляторный из домен 4-1ВВ, сигнальный домен СВ3дзета, и в которой два эпитопа встроены во внеклеточный домен таким образом, чтобы VL был локализован между ними, где все указанные компоненты необязательно разделены с помощью по меньшей мере одного линкера.

Согласно другому варианту осуществления изобретения два эпитопа встроены во внеклеточный домен таким образом, чтобы VL был локализован между ними, где все указанные компоненты необязательно разделены с помощью по меньшей мере одного линкера.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1, V3 или V5, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8α, костимуляторный домен из 4-1ВВ, сигнальный домен CD3 дзета, и в которой два эпитопа встроены во внеклеточный домен таким образом, чтобы VL был локализован между ними, где все указанные компоненты необязательно разделены с помощью по меньшей мере одного линкера.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур версии V3, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8α, костимуляторный из домен 4-1ВВ, сигнальный домен CD3 дзета, и в которой два эпитопа встроены во внеклеточный домен таким образом, чтобы VL был локализован между ними, где все указанные компоненты необязательно разделены с помощью по меньшей мере одного линкера.

Согласно другому варианту осуществления изобретения указанный CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) содержит внеклеточный связывающий домен, где по меньшей мере два эпитопа встроены во внеклеточный домен таким образом, чтобы VH- и VL-цепи были локализованы между ними, где все указанные компоненты необязательно разделены с помощью по меньшей мере одного линкера.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1, V3 или V5, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8α, костимуляторный домен из 4-1ВВ, сигнальный домен CD3дзета, и в которой два эпитопа встроены во внеклеточный домен таким образом, чтобы VH- и VL-цепи были локализованы между ними, где все указанные компоненты необязательно разделены с помощью по меньшей мере одного линкера.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур версии V3, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8α, костимуляторный из домен 4-1ВВ, сигнальный домен СD3дзета, и в которой два эпитопа встроены во внеклеточный домен таким образом, чтобы VH- и VL-цепи были локализованы между ними, где все указанные компоненты необязательно разделены с помощью по меньшей мере одного линкера.

В другом варианте осуществления изобретения три эпитопа встраивают во внеклеточный домен анти-CLL1 CAR, предлагаемого в настоящем изобретении.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения указанный CLL1-специфический CAR, предлагаемый в изобретении, содержит внеклеточный связывающий домен, где три эпитопа встроены во внеклеточный домен таким образом, чтобы VH- и VL-цепи были локализованы между ними, где все указанные компоненты необязательно разделены с помощью по меньшей мере одного линкера.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1, V3 или V5, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8α, костимуляторный домен из 4-1ВВ, сигнальный домен СD3дзета, и в которой три эпитопа встроены во внеклеточный домен таким образом, чтобы VH- и VL-цепи были локализованы между ними, где все указанные компоненты необязательно разделены с помощью по меньшей мере одного линкера.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур версии V3, проиллюстрированных на фиг.2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8a, костимуляторный из домен 4-1ВВ, сигнальный домен CD3 дзета, и в которой три эпитопа встроены во внеклеточный домен таким образом, чтобы VH- и VL-цепи были локализованы между ними, где все указанные компоненты необязательно разделены с помощью по меньшей мере одного линкера.

В другом варианте осуществления изобретения, CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1, V3 или V5, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8α, костимуляторный из домен 4-1ВВ, сигнальный домен CD3 дзета и три эпитопа CD20, где

указанные три эпитопа встроены в виде тандема между scFv и указанным шарниром,

и необязательно линкер (SEQ ID NO: 10) помещен между тремя эпитопами и/или между VH и тремя эпитопами.

В другом варианте осуществления изобретения, CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR) имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1, V3 или V5, проиллюстрированных на фиг. 2, где указанная структура содержит по меньшей мере анти-CLL1 внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен CD8a, костимуляторный домен из 4-1ВВ, сигнальный домен CD3дзета, два эпитопа CD20 и один эпитоп CD34;где

указанные два эпитопа встроены в виде тандема между scFv и указанным шарниром и

указанный эпитоп CD34 встроен между двумя указанными эпитопами CD20, где все компоненты разделены между собой с помощью линкера (SEQ ID NO: 10) и линкера между эпитопом и между VH и тремя эпитопами.

Все вышеизложенные варианты осуществления изобретения относятся к эпитопсодержащим анти-CLL1 CAR, где VH- и VL-цепи, которые используются в качестве внеклеточного связывающего домена, связываются предпочтительно с человеческим расположенным на мембране CLL1-1.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные выше анти-CLL1 CAR содержат по меньшей мере внеклеточный лигандсвязывающий домен, который включает VH- и VL-цепи, полученные из моноклональных антител к CLL1.

Более конкретно в CAR, предлагаемый в настоящем изобретении можно включать следующие варианты эпитопов:

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 МАт-специфических эпитопов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит по меньшей мере 1, 2 или 3 МАт-специфических эпитопа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, когда внеклеточный связывающий домен содержит несколько МАт-специфических эпитопов, все МАт-специфические эпитопы являются идентичными.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, когда внеклеточный связывающий домен содержит несколько МАт-специфических эпитопов, МАт-специфические эпитопы не являются идентичными. Например, внеклеточный связывающий домен может содержать три МАт-специфических эпитопа, два из которых являются идентичными, а третий отличается от них.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит VH, VL, один или несколько МАт-специфических эпитопов, предпочтительно 1, 2 или 3, более предпочтительно 2 или 3 МАт-специфических эпитопа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит следующую последовательность (N-конец расположен слева):

V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп1-(L)_x;

V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x;

V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_x;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-эпитоп4-(L)_x;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-эпитоп4-(L)_x;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-эпитоп4-(L)_x;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₂;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-V₂-(L)_х-эпитоп3-(L)_x;

V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1;

V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L;

V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2;

V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L;

V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3;

V₁-L₁-V₂-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L;

V₁-L₁-V₂-эпитоп1;

V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L;

V₁-L₁-V₂-эпитоп1-эпитоп1-L-эпитоп2;

V₁-L₁-V₂-эпитоп1-эпитоп1-L-эпитоп2-L;

V₁-L₁-V₂-эпитоп1-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3;

V₁-L₁-V₂-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L;

эпитоп1-V₁-L₁-V₂;

эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂;

L-эпитоп1-V₁-L₁-V₂;

L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂;

эпитоп1-L-эпитоп2-V₁-L₁-V₂;

эпитоп1-L-эпитоп2-L-V₁-L₁-V₂;

L-эпитоп1-L-эпитоп2-V₁-L₁-V₂;

L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-V₁-L₁-V₂;

эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-V₁-L₁-V₂;

эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-L-V₁-L₁-V₂;

L-эпитоп1-L-эпитоп2-L-эпитоп3-V₁-L₁-V₂;

L-эпитоп1-L-эпитоп2-L- эпитоп3-L-V₁-L₁-V₂;

V₁-L-эпитоп1-L-V₂;

L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂;

V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L- эпитоп2-L;

V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3;

V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-эпитоп3;

V₁-L-эпитоп1-L-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3-эпитоп4;

L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3-L;

эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3-L;

L-эпитоп1-L-V₁-L-эпитоп2-L-V₂-L-эпитоп3;

L-эпитоп1-L- V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L;

L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп 3;

L-эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-эпитоп3 или

эпитоп1-L-V₁-L₁-V₂-L-эпитоп2-L-эпитоп3-эпитоп4,

где

V₁ и V₂ обозначают V_H и V_L scFv (т.е. V₁ обозначает V_L и V₂ обозначает V_H или V₁ обозначает V_H и V₂ обозначает V_L);

L₁ обозначает любой линкер, пригодный для соединения VH-цепи с VL-цепью в scFv;

L обозначает линкер, предпочтительно содержащий глициновые и сериновые остатки, и каждый из присутствующих во внеклеточном связывающем домене L может быть идентичен или отличаться от другого L, присутствующего в том же самом внеклеточном связывающем домене, и

х обозначает 0 или 1 и каждый из присутствующих х выбирают независимо от других; и

V_H-L₁-V_L-L-эпитоп1-L-эпитоп2-L;

L-эпитоп1-L-V_H-L- эпитоп2-L-V_L-L-эпитоп3-L;

V_L-L¹-V_H-L- эпитоп1-L- эпитоп2-L; или

L-эпитоп1-L-V_L-L-эпитоп2-L-V_H-L-эпитоп3-L.

где L, L1, эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 3 имеют указанные выше значения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения L₁ обозначает линкер, содержащий глицин и/или серин. В некоторых вариантах осуществления изобретения L₁ обозначает линкер, содержащий аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)_n или (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n, где n обозначает 1, 2, 3, 4 или 5. В некоторых вариантах осуществления изобретения L₁ обозначает (Gly₄Ser)₄ или (C1y₄Ser)₃.

В некоторых вариантах осуществления изобретения L обозначает гибкий линкер, предпочтительно содержащий глицин и/или серин. В некоторых вариантах осуществления изобретения L имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS или SGGGGSGGGGS, предпочтительно SGG, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS или SGGGGSGGGGS. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых внеклеточный связывающий домен содержит несколько указанных L, все L являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых внеклеточный связывающий домен содержит несколько указанных L, не все L являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления изобретения L обозначает SGGGGS. В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный связывающий домен содержит несколько указанных L, и все L представляют собой SGGGGS.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 3 являются идентичными или различными и их выбирают из МАт-специфических эпитопов, которые имеют любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 33-SEQ ID NO: 42.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 3 являются идентичными или различными и их выбирают из МАт-специфических эпитопов, которые специфическим распознаются ибритумомабом, тиоксетаном, муромонабом-CD3, тозитумомабом, абциксимабом, базиликсимабом, брентуксимаб ведотином, цетуксимабом, инфликсимабом, ритуксимабом, алемтузумабом, бевацизумабом, цертолизумаба пеголом, даклизумабом, экулизумабом, эфализумабом, гемтузумабом, натализумабом, омализумабом, паливизумабом, ранибизумабом, тоцилизумабом, трастузумабом, ведолизумабом, адалимумабом, белимумабом, канакинумабом, деносумабом, голимумабом, ипилимумабом, офатумумабом, панитумумабом, QBEND-10, алемтузумабом или устекинумабом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 1 представляет собой МАт-специфический эпитоп, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 2 представляет собой МАт-специфический эпитоп, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 3 представляет собой МАт-специфический эпитоп, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 4 представляет собой МАт-специфический эпитоп, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 4 представляет собой МАт-специфический эпитоп, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп 2 представляет собой МАт-специфический эпитоп, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и эпитоп 3 представляет собой МАт-специфический эпитоп, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:41 или 42.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один из эпиопов, таких как эпитоп 1, эпитоп 2, эпитоп 3 и эпитоп 4, представляет собой эпитоп CD34, предпочтительно эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 41 или 42. В некоторых вариантах осуществления изобретения один из эпитопов, таких как эпитоп 1, эпитоп 2, эпитоп 3 и эпитоп 4, представляет собой эпитоп CD34, предпочтительно эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 41 или 42, а другие МАт-специфические эпитопы представляют собой мимеотопы CD20, предпочтительно мимеотоп, имеющий SEQ ID NO: 33.

Способ истощения экспрессирующих CAR иммунных клеток

Иммунные клетки, экспрессирующие CLL1-специфический CAR, предлагаемый в настоящем изобретении, могут содержать эпитоп(ы) во внеклеточном домене, например, описанный(ые) выше, поэтому их можно истощать у пациента в случае неблагоприятного или слишком острого иммунного ответа (например, цитокинового шторма) путем введения указанному пациенту антитела, предпочтительно моноклонального, специфического в отношении указанного(ых) эпитопа(ов).

Под «истощением in vivo» в настоящем изобретении подразумевается введение млекопитающему лекарственного средства, способствующего прекращению пролиферации экспрессирующих CAR иммунных клеток путем ингибирования или элиминации.

Одним из объектов изобретения является способ истощения in vivo сконструированной иммунной клетки, экспрессирующей CAR, который содержит ранее описанный МАт-специфический эпитоп, включающий приведение в контакт указанной сконструированной иммунной клетки или указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки по меньшей мере с одним из эпитопспецифических МАт. Другим объектом изобретения является способ истощения in vivo экспрессирующей CAR иммунной клетки, который содержит указанный выше химерный scFv (созданный путем инсерции МАт-специфического эпитопа), включающий приведение в контакт указанной сконструированной иммунной клетки с эпитопспецифическими антителами.

Предпочтительно указанные иммунные клетки представляют собой Т-клетки и/или антитела являются моноклональными.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения истощение in vivo иммунной сконструированной клетки осуществляют, используя сконструированную иммунную клетку, ранее отсортированную с помощью предлагаемого в настоящем изобретении способа in vitro. В этом случае следует с помощью такой же инфузии применять МАт.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения специфическим антигеном для МАт является антиген CD20 и эпитопспецифическое МАт представляет собой ритуксимаб.

Некоторыми вариантами осуществления изобретения является способ истощения in vivo описанной выше сконструированной иммунной клетки, экспрессирующей CAR, который содержит МАт-специфический эпитоп (экспрессирующая CAR иммунная клетка), у пациента, включающий приведение в контакт указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки по меньшей мере с одним из эпитопспецифических МАт.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный МАт-специфический эпитоп представляет собой эпитоп или мимеотоп CD20, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 35, и эпитопспецифическое МАт представляет собой ритуксимаб.

В некоторых вариантах осуществления изобретения стадия приведения в контакт указанной сконструированной иммунной клетки или указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки по меньшей мере с одним эпитопспецифическим МАт включает введение пациенту путем инфузии эпитопспецифического МАт, предпочтительно ритуксимаба.

В одном из вариантов осуществления изобретения, в котором истощают иммунные клетки, экспрессирующие CAR, который содержит МАт-специфический эпитоп (экспрессирующие CAR иммунные клетки), по данным анализа CDC с использованием специфического в отношении эпитопа МАт количество жизнеспособных экспрессирующих CAR иммунных клеток снижают предпочтительно по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. Предпочтительно анализ CDC представляет собой анализ, описанный в примере 3, примере 4 или примере 7.4. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный МАт-специфический эпитоп представляет собой эпитоп или мимеотоп CD20, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 35, и эпитопспецифический МАт представляет собой ритуксимаб.

Помимо обеспечения возможности истощения in vivo иммунных клеток, предлагаемых в изобретении, эпитопы, встроенные во внеклеточный домен CAR могут быть ценными для стадий сортинга или очистки иммунных клеток, экспрессирующих указанные CAR, в качестве стадии способа их получения.

Выделенные клетки

Образовавшиеся клетки представляют собой сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на поверхности клеточной мембраны CLL1-специфический химерный антигенный рецептор, описанный выше, в частности, сконструированные иммунные клетки, полученные из первичных Т-лимфоцитов, необязательно устойчивые к противораковому лекарственному средству и несущие делецию в гене, который кодирует альфа-цепь TCR или бета-цепь TCR.

В настоящем изобретении описана сконструированная иммунная клетка, указанная выше, в которой подавлена экспрессия TCR.

В настоящем изобретении описана сконструированная иммунная клетка, указанная выше, где экспрессия по меньшей мере одного белка ГКГС, предпочтительно β2m или HLA, понижена или подавлена в указанной сконструированной иммунной клетке. β2m обозначает бета 2 микроглобулин, а HLA обозначает человеческий лейкоцитарный антиген. Белок ГКГС представляет собой белок ГКГС класса I или класса II.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, где указанная сконструированная иммунная клетка подвергнута мутации для придания устойчивости по меньшей мере к одному иммуносупрессорному лекарственному средству, химиотерапевтическому лекарственному средству или противораковому лекарственному средству.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, предназначенная для применения в терапии.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где пациент представляет собой человека.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где состояние представляет собой предзлокачественное или злокачественное связанное с раком состояние, отличающееся наличием экспрессирующих CLL1 клеток.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где состояние представляет собой состояние, отличающееся избыточным количеством экспрессирующих CLL1 клеток.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где состояние представляет собой состояние, связанное с гематологическим раком.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где состояние, связанное с гематологическим раком, представляет собой лейкоз или злокачественные лимфопролиферативные нарушения.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанный лейкоз выбран из группы, состоящей из острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, мелодиспластического синдрома, острого лимфоидного лейкоза, хронического лимфоидного лейкоза и миелодиспластического синдрома.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанный лейкоз представляет собой острый миелогенный лейкоз (AML).

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанный гематологический рак представляет собой злокачественное лимфопролиферативное нарушение.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанное лимфопролиферативное нарушение представляет собой лимфому.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанная лимфома выбрана из группы, состоящей из множественной миеломы, неходжкинской лимфомы, лимфомы Беркитта и фолликулярной лимфомы (мелкоклеточной и крупноклеточной).

В настоящем изобретении предложен способ разрушения клетки гематологического рака, включающий приведение в контакт указанной клетки гематологического рака со сконструированной клеткой, которая экспрессирует по меньшей мере описанный выше анти-CLL1, в количестве, эффективном для разрушения указанной раковой клетки.

В настоящем изобретении предложен способ создания иммунной клетки, включающий:

(а) получение иммунной клетки,

(б) экспрессию на поверхности указанной клетки по меньшей мере одного CLL1-специфического одноцепочечного химерного антигенного рецептора, описанного выше.

В настоящем изобретении предложен способ создания описанной выше иммунной клетки, включающий:

(а) получение иммунной клетки,

(в) экспрессию указанного полинуклеотида в указанной клетке.

В настоящем изобретении предложен способ создания описанной выше иммунной клетки, включающий:

(а) получение иммунной клетки,

В настоящем изобретении предложен также способ лечения индивидуума, который нуждается в этом, включающий:

(а) получение иммунной клетки, экспрессирующей на поверхности CLL1-специфический одноцепочечный химерный антигенный рецептор, описанный выше,

(в) введение указанных иммунных клеток указанному пациенту.

В настоящем изобретении предложен способ лечения указанного выше индивидуума, нуждающегося в этом, в котором указанную иммунную клетку получают из донора.

В настоящем изобретении предложен способ лечения указанного выше индивидуума, нуждающегося в этом, в котором указанную иммунную клетку получают из организма самого пациента.

Терапевтические применения

В другом варианте осуществления изобретения выделенные клетки, полученные различными способами, или клеточную линию, полученную из указанной выделенной клетки, согласно описанному ранее методу, можно применять в качестве лекарственного средства.

В другом варианте осуществления изобретения указанное лекарственное средство можно применять для лечения рака, прежде всего для лечения лейкоза у пациента, нуждающегося в этом.

В другом варианте осуществления изобретения указанную выделенную клетку, предлагаемую в изобретении, или клеточную линию, полученную из указанной выделенной клетки, можно применять для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака у пациента, нуждающегося в этом.

В конкретном варианте осуществления изобретения предложена экспрессирующая анти-CLL1 CAR Т-клетка в качестве лекарственного средства, предназначенного для лечения AML, подтипа AML, связанного с AML осложнения или связанного с AML состояния.

Согласно другому варианту осуществления изобретения указанное лекарственное средство можно применять для лечения опосредуемого экспрессирующей CLL1 клеткой патологического состояния или состояния, отличающегося прямой или косвенной активностью экспрессирующей CLL1 клетки.

Другой объект настоящего изобретения относится к способам лечения пациентов, нуждающихся в этом, где указанный способ включает по меньшей мере одну из следующих стадий, на которых:

(а) получают иммунную клетку, которую можно создавать с помощью одного из ранее описанных способов;

(б) вводят указанные трансформированные иммунные клетки указанному пациенту.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанные Т-клетки можно подвергать интенсивному Т-клеточному размножению in vivo и их можно сохранять в течение продолжительного периода времени.

Указанное лечение может быть облегчающим, терапевтическим или профилактическим. Оно может представлять собой либо составную часть аутологичного иммунотерапевтического лечения, либо составную часть аллогенного иммунотерапевтического лечения. Понятие «аутологичный» означает, что клетки, клеточная линия или популяция клеток, применяемые для лечения пациентов, получают из организма указанного пациента или из организма совместимого по человеческому лейкоцитарному антигену (HLA) донора. Понятие «аллогенный» означает, что клетки или популяция клеток, применяемые для лечения пациентов, получают не из организма указанного пациента, а получают из организма донора.

В предыдущих разделах описаны клетки, которые можно применять в описанных выше способах. Указанное лечение можно применять для лечения пациентов, у которых диагностировано предзлокачественное или злокачественное связанное с раком состояние, отличающееся наличием экспрессирующих CLL1 клеток, прежде всего избыточным количеством экспрессирующих CLL1 клеток. Такие состояния имеют место при гематологических видах рака, таких как лейкоз.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является композиция, предназначенная для применения для лечения заболевания, опосредуемого экспрессирующими CLL1 клетками, в частности, опосредуемого экспресирующими CLL1 клетками гематологического рака, указанная композиция содержит указанную экспресирующую анти-CLL1 scCAR Т-клетку, предлагаемую в изобретении.

Любые другие опосредуемые CLL1 или включающие CLL1 злокачественные лимфопролиферативные нарушения, указанные в настоящем описании, можно облегчать с помощью экспрессирующих анти-CLL1 CAR клеток, предлагаемых в настоящем изобретении.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения рак, который можно лечить с помощью экспрессирующих анти-CLL1 CAR клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой лейкоз, заболевание, ассоциированное с лейкозом или с его осложнением. Лейкозы, которые можно лечить с помощью экспрессирующих анти-CLL1 CAR клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, могут представлять собой острый миелогенный лейкоз (AML). AML или подтипы AML, которые можно лечить с помощью экспрессирующих анти-CLL1 scCAR клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, могут представлять собой, в частности, острый миелобластный лейкоз, минимально-дифференцированный острый миелобластный лейкоз, острый миелобластный лейкоз без созревания (клеток), острый миелобластный лейкоз с созреванием гранулоцитов, промиелоцитарный или острый промиелоцитарный лейкоз (APL), острый миеломоноцитарный лейкоз, миеломоноцитарный лейкоз в сочетании с эозинофилией костного мозга, острый монобластный лейкоз (М5а) или острый моноцитарный лейкоз (M5b), острый эритроидный лейкоз, включая эритролейкоз (М6а) и очень редкий чистый эритроидный лейкоз (M6b), острый мегакариобластный лейкоз, острый базофильный лейкоз, острый панмиелоз с миелофиброзом, в которых участвуют CLL1-позитивные клетки.

Подтипы AML включают также волосатоклеточный лейкоз, лейкоз, позитивный по филадельфийской хромосоме. AML можно классифицировать как AML со специфическим генетическими аномалиями. Классификация основывается на возможности прогнозировать на основе кариотипа ответ на индукционную терапию, риск рецидива, продолжительность жизни.

Таким образом, AML, который можно лечить с помощью экспрессирующих анти-CLL1 CAR клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой AML с транслокацией между хромосомами 8 и 21, AML с транслокацией или инверсией в хромосоме 16, AML с транслокацией между хромосомами 9 и 11, APL (M3) с транслокацией между хромосомами 15 и 17, AML с транслокацией между хромосомами 6 и 9, AML с транслокацией или инверсией в хромосоме 3, AML (мегакариобластный) с транслокацией между хромосомами 1 и 22.

Настоящее изобретение является наиболее ценным для лечения AML, ассоциированного с указанными конкретными цитогенетическими маркерами.

В настоящем изобретении предложена также экспрессирующая анти-CLL1 CAR Т-клетка для лечения пациентов со специфическими цитогенетическими субпопуляциями AML, например, пациентов с t(15;17)(q22;q21), идентифицированных с помощью полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA) 16-19, и для лечения пациентов с t(8;21)(q22;q22) или inv(16)(p13q22)/t(16;16)(pl3;q22), идентифицированных с помощью повторяющихся высоких доз цитарабина.

Предпочтительно в настоящем изобретении предложена экспрессирующая анти-CLL1 CAR Т-клетка для лечения пациентов с аберрациям, такими как -5/del(5q), -7, аномалиями 3q или комплексным кариотипом, у которых обнаружены плохие уровни полной ремиссии и выживаемости.

В контексте настоящего описания понятия «терапевтический агент», «химиотерапевтический агент» или «лекарственное средство», или «противораковое лекарственное средство» относятся к медикаментозному препарату, предпочтительно соединению или его производному, которое может оказывать воздействие на раковую клетку, тем самым снижая пролиферативный статус клетки и/или уничтожая клетку. Примерами химиотерапевтических лекарственных средств или «противораковых лекарственных средств» являются (но не ограничиваясь только ими) алкилирующие агенты (например, бусульфан, карбоплатин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан, мехлорэтамин, оксалиплатин, урамустин, темозоломид, фотемустин), антагонисты метаболизма (например, антиметаболит пуриновых нуклеозидов, такой как клофарабин, флударабин или 2'-дезоксиаденозин, метотрексат (МТХ), 5-фторурацил или его производные, азатиоприн, капецитабин, цитарабин, флоксуридин, фторурацил, гемцитабин, метотрексат, пеметрексед), противоопухолевые антибиотики (например, митомицин, адриамицин, блеомицин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, гидроксимочевина, ударубицин, митомицин С, митоксантрон), противоопухолевые агенты растительного происхождения (например, винкристин, виндезин, таксол, винбластин, винорелбин, доцетаксел, паклитаксел), ингибитор топоизомеразы (иринотекан, топотекан, этопозид).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения понятия «терапевтический агент», «химиотерапевтическое лекарственное средство» в контексте настоящего описания относятся к соединению или его производному, которое можно применять для лечения рака, в частности, гематопоэтической раковой клетки и более конкретно AML, снижая тем самым пролиферативный статус раковой клетки и/или уничтожая раковую клетку. Примеры химиотерапевтических агентов включают (но не ограничиваясь только ими) арацитин, цитозин-арабинозид, амсакрин, даунорубицин, идарубицин, новантрон, митоксантрон, вепезид, этопозид (VP16), триоксид мышьяка, транс-ретиноевую кислоту, мехлорэтамин, прокарбазин, хлорамбуцил и их комбинации.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения клетки, предлагаемые в изобретении, вводят пациенту в сочетании с лекарственным средством (или агентом), выбранным из арацитина, цитозин-арабинозида, амсакрина, даунорубицина, идарубицина, новантрона, митоксантрона, вепезида, этопозида (VP16), триоксида мышьяка, транс-ретиноевой кислоты, цитарабина, антрациклинов, 6-тиогуанина, гидроксимочевины, преднизона и их комбинации.

Указанные агенты могут включать также (но не ограничиваясь только ими) противораковые агенты TRIMETHOTRIXATE™ (TMTX), TEMOZOLOMIDE™, RALTRITREXED™, S-(4-нитробензил)-6-тиоинозин (NBMPR), 6-бензилгуанидин (6-BG), бис-хлорнитрозомочевину (BCNU) и CAMPTOTHECIN™ или терапевтическое производное любого из указанных средств.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения Т-клетку, экспрессирующую анти-CLL1 scCAR, вводят пациенту в комбинации по меньшей мере с одним терапевтическим агентом, выбранным из арацитина, цитозин-арабинозида, амсакрина, даунорубицина, идарубицина, новантрона, митоксантрона, вепезида, этопозида (VP16), триоксида мышьяка, транс-ретиноевой кислоты и их комбинации.

В контексте настоящего описания понятие «клетка, устойчивая или толерантная» к агенту относится к клетке, которую генетически модифицировали так, чтобы клетка размножалась в присутствии агента в количестве, которое ингибирует или предупреждает пролиферацию клетки без модификации.

Группа пациентов

Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является лечение лейкоза, в частности, у страдающих AML пациентов, возрастом старше 60 лет, пациентов возрастом моложе 20 лет.

Более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является педиатрическое лечение, в частности педиатрическое лечение AML или ассоциированных с AML заболеваний или осложнений.

Еще более предпочтительным вариантом осуществления изобретения является применение для лечения страдающих AML пациентов с низким, плохим или неблагоприятным статусом, основой для определения которого является прогнозируемая выживаемость, составляющая менее 5 лет. В этой группе пациенты, страдающие AML со следующими цитогенетическими характеристиками: -5; 5q; -7; 7q- ; 11q23; non t(9; 11); inv(3); t(3; 3); t(6; 9); t(9; 22), имеют статус, ассоциированный с риском неблагоприятного исхода (Byrd J.C. и др., Blood, 100 (13), 15 декабря 2002 г.; и для них прежде всего пригодно лечение, предлагаемое в настоящем изобретении, или лечение на основе объекта настоящего изобретения.

В одном из вариантов осуществления изобретения экспрессирующую анти-CLL1 CAR Т-клетку, предлагаемую в настоящем изобретении, можно применять в качестве индукционной терапии, в качестве терапии после ремиссии AML или в качестве консолидирующей терапии для пациентов с AML.

В одном из вариантов осуществления изобретения экспрессирующую анти-CLL1 CAR Т-клетку, предлагаемую в настоящем изобретении, можно применять в случае рецидива AML или в случае рефракторного или устойчивого AML и более предпочтительно в комбинации по меньшей мере с одним другим противораковым лекарственным средством.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одну клетку, экспрессирующую анти-CLL1 CAR, применяют для предупреждения развития раковых клеток, что имеет место, в частности, после противоракового лечения, в процессе деплеции (очистки) костного мозга или перед трансплантацией костного мозга, после разрушения костного мозга.

Связанные с AML осложнения

Одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения является лекарственное средство, которое улучшает состояние здоровья пациента, в частности, пациента с осложнениями, связанными с AML. Более предпочтительно указанная сконструированная экспрессирующая анти-CLL1 CAR Т-клетка, предлагаемая в изобретении, экспрессирует по меньшей мере один анти-CLL1 CAR и ее применяют в качестве лекарственного средства для лечения осложнения, связанного с AML.

Осложнение или заболевание, связанное с AML, может включать предшествующую миелодисплазии фазу, вторичный лейкоз, в частности, вторичный AML, высокое содержание лейкоцитов и отсутствие палочек Ауэра. Среди прочего, в качестве осложнения или заболевания, связанного с AML, рассматриваются лейкостаз и затрагивающий центральную нервную систему (ЦНС) гиперлейкоцитоз, остаточные явления болезни также рассматриваются в качестве осложнения или заболевания, связанного с AML.

Ассоциированные с AML заболевания

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является также экспрессирующая анти-CLL1 CAR Т-клетка, предназначенная для лечения патологического состояния, связанного с AML.

В настоящем изобретении предложена терапия связанных с AML миелоидных неоплазм, острого миелоидного лейкоза и миелодиспластического синдрома, лечение рецидивирующего или рефракторного острого миелоидного лейкоза, лечение рецидивирующего или рефракторного острого промиелоцитарного лейкоза у взрослых, лечение острого промиелоидного лейкоза, лечение острого миелоидного лейкоза у взрослых возрастом старше 60 лет.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция, предназначенная для лечения ассоциированных с AML заболеваний, в частности, гематологических злокачественных связанных с AML заболеваний.

Гематологические злокачественные связанные с AML состояния включают миелодиспластический синдром (MDS, ранее известный как «предлейкоз»), который представляет собой широкий спектр гематологических состояний, объединенных неэффективным производством (или дисплазией) миелоидных клеток крови и риск трансформации в AML.

Другие патологические состояния или генетические синдромы, ассоциированные с риском AML, можно улучшать посредством соответствующего применения настоящего изобретения, указанные генетические синдромы включают синдром Дауна, трисомию, анемию Фанкони, синдром Блума, атаксию-телеангиэктазию, анемию Даймонда-Блекфена, синдром Швахмана-Даймонда, синдром Ли-Фраумени, нейтрофиброматоз типа 1, серьезную врожденную нейтропению (которую называют также синдромом Костмана).

Другие опосредуемые CLL1 патологические состояния

Другим объектом настоящего изобретения является композиция, предназначенная для лечения опосредуемых CLL1⁺-клеткой заболеваний. Указанные опосредуемые CLL1⁺-клеткой заболевания включают воспалительные заболевания, такие как ревматоидный артрит.

В частности, настоящее изобретение можно применять для лечения опосредуемых CLL1⁺-клеткой заболеваний, таких как воспаление и более предпочтительно ревматоидный артрит.

Композиции

Настоящее изобретение относится также к композиции, содержащей сконструированные Т-клетки, предлагаемые в изобретении, для применения в способе лечения заболевания.

Согласно одному из объектов изобретения заболевание представляет собой гематологический рак, в частности рак из стволовых клеток, включая (но не ограничиваясь только ими) лейкоз (такой как острый миелогенный лейкоз (AML)) или связанные с ним осложнения.

В настоящем изобретении предложена также композиция, предназначенная для применения, или способ ингибирования пролиферации или снижения численности популяции экспрессирующих CLL1 клеток или их активности у пациента. Приведенный в качестве примера способ включает приведение в контакт популяции клеток, содержащих экспрессирующую CLL1 клетку, с экспрессирующей анти-CLL1 CAR Т-клеткой, и в частности с scCAR-T-клеткой (scCART), предлагаемой в изобретении, которая связывается с экспрессирующей CLL1 клеткой.

Более конкретным объектом настоящего изобретения является предназначенная для применения композиция или способ ингибирования пролиферации или снижения численности популяции раковых клеток, которые экспрессируют CLL1, у пациента, где способы включают приведение в контакт популяции клеток, содержащей экспрессирующую CLL1 клетку, с экспрессирующей CLL1 CAR Т-клеткой, и в частности с scCART, предлагаемой в изобретении, которая связывается с экспрессирующей CLL1 клеткой, связывание экспрессирующей анти-CLL1 CAR клетки, и в частности scCART, предлагаемой в изобретении, с экспрессирующей CLL1 клеткой приводит к разрушению экспрессирующих CLL1 раковых клеток.

В некоторых объектах изобретения анти-CLL1 CAR Т-клетка, и в частности scCART, предлагаемая в изобретении, снижает уровень, число, количество или процент клеток и/или раковых клеток по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% (до неподдающегося обнаружению уровня) у индивидуума или на животной модели миелоидного лейкоза или другого вида рака, ассоциированного с экспрессирующими CLL1 клетками, относительно отрицательного контроля.

В настоящем изобретении предложены также предназначенная для применения композиция или способ предупреждения, лечения и/или контроля нарушения или состояния, ассоциированного с экспрессирующими CLL1 клетками (например, ассоциированного с гематологическим раком), где способы включают введение индивидууму, который нуждается в этом, экспрессирующей анти-CLL1 CAR Т-клетки, и в частности scCART, предлагаемой в изобретении, которая связывается с экспрессирующей CLL1 клеткой. В одном из объектов изобретения индивидуум представляет собой человека. Примерами нарушений, ассоциированных с экспрессирующими CLL1 клетками, являются (но не ограничиваясь только ими) воспалительные нарушения (такие как ревматоидный артрит) и разные виды рака (например, виды гематологического рака, в частности, AML или связанные с AML осложнения).

Настоящее изобретение относится также к предназначенной для применения композиции или способу предупреждения, лечения и/или контроля заболевания, ассоциированного с экспрессирующими CLL1 клетками, где способ включает введение индивидууму, который нуждается в этом, анти-CLL1 CAR Т-клетки, и в частности scCART, предлагаемой в изобретении, которая связывается с экспрессирующей CLL1 клеткой. В одном из объектов изобретения индивидуум представляет собой человека. Примерами заболеваний, ассоциированных с экспрессирующими CLL1 клетками, являются, в частности (но не ограничиваясь только ими), острый миелоидный лейкоз (AML),

Настоящее изобретение относится также к предназначенной для применения композиции или способу лечения или предупреждения рецидива рака, ассоциированного с экспрессирующими CLL1 клетками, где способ включает введение индивидууму, который нуждается в этом, анти-CLL1 CAR Т-клетки, и в частности scCART, предлагаемой в изобретении, которая связывается с экспрессирующей CLL1 клеткой. Согласно другому объекту изобретения способы включают введение индивиууму, который нуждается в этом, в эффективном количестве анти-CLL1 CAR Т-клетки, и в частности scCART, предлагаемой в изобретении, которая связывается с экспрессирующей CLL1 клеткой, в сочетании с применяемой в эффективном количестве другой терапией.

В одном из объектов изобретения CLL1 рассматривается в качестве маркера «раковой стволовой клетки» при AML. Таким образом, анти-CLL1 CAR Т-клетка, и в частности scCART, предлагаемая в изобретении, может предупреждать рецидив AML или даже лечить AML, который главным образом является CLL1-негативным, но имеет популяцию «стволовых» CLL1⁺-клеток (экспрессирующих CLL1 клеток).

Одним из объектов изобретения являются композиции и способы, предназначенные для лечения индивидуумов, которых подвергают лечению по поводу заболевания или нарушения, ассоциированного с повышенными уровнями экспрессии CD 19, и которые имеют заболевание или нарушение, ассоциированное с повышенными уровнями CLL1.

Лечение с помощью сконструированных иммунных клеток, предлагаемых в изобретении, можно осуществлять в сочетании с применением одного или нескольких типов противораковой терапии, выбранных из группы, включающей терапию на основе антител, химиотерапию, цитокиновую терапию, терапию с использованием дендритных клеток, генную терапию, гормональную терапию, свето-лазерную терапию и лучевую терапию.

Предпочтительно лечение сконструированными иммунными клетками, предлагаемыми в изобретении, можно осуществлять в комбинации (например, до, одновременно или после) с одним или несколькими противораковыми терапевтическими средствами, выбранным из арацитина, цитозин-арабинозида, амсакрина, даунорубицина, идарубицина, новантрона, митоксантрона, вепезида, этопозида (VP16), триоксида мышьяка, транс-ретиноевои кислоты, комбинации триоксида мышьяка, транс-ретиноевой кислоты, мехлорэтамина, прокарбазина, хлорамбуцила и их комбинации.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения указанное лечение можно применять для пациентов, подвергающихся иммуносупрессорной терапии. Фактически настоящее изобретение предпочтительно относится к клеткам или популяциям клеток, которым придана устойчивость по меньшей мере к одному иммуноспрессорному агенту в результате инактивации гена, который кодирует рецептор для указанного иммуносупрессорного агента. В этом аспекте иммуноспрессорное лечение должно способствовать отбору и размножению Т-клеток, предлагаемых в изобретении, в организме пациента.

Введение клеток или популяции клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, можно осуществлять любым пригодным методом, включая ингаляцию аэрозоля, инъекцию, прием внутрь, трансфузию, имплантацию или трансплантацию. Композиции, представленные в настоящем описании, можно вводить пациенту подкожно, внутрикожно, внутрь опухоли, интранодально, интрамедуллярно, внутримышечно, путем внутривенной или внутрилимфатической инъекции, или внутрибрюшинно. В одном из вариантов осуществления изобретения клеточные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, предпочтительно вводят путем внутривенной инъекции.

Введение клеток или популяции клеток может заключаться во введении 10⁴-10⁹ клеток/кг веса тела, предпочтительно от 10⁵ до 10⁶ клеток/кг веса тела, включая все целочисленные количества клеток в указанных диапазонах. Клетки или популяцию клеток можно вводить в виде одной или нескольких доз. В другом варианте осуществления изобретения указанное эффективное количество клеток вводят в виде однократной дозы. В другом варианте осуществления изобретения указанное эффективное количество клеток вводят в виде более чем одной дозы в течение некоторого периода времени. График введения находится в компетенции лечащего врача и зависит от клинического состояния пациента. Клетки или популяцию клеток можно получать из любого источника, такого как банк крови или донор. Поскольку индивидуальные потребности варьируются, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств рассматриваемого типа клеток для конкретного заболевания или состояний, находится в компетенции специалиста в данной области. Эффективное количество представляет собой количество, которое обеспечивает терапевтическое или профилактическое полезное действие. Вводимая доза должна зависеть от возраста, состояния здоровья и веса реципиента, вида одновременно применяемого лечения, если это имеет место, частоты обработки и природы требуемого действия.

В другом варианте осуществления изобретения клетки или композицию, содержащую эти клетки, вводят в указанном эффективном количестве парентерально. Указанное введение может представлять собой внутривенное введение. Указанное введение можно осуществлять непосредственно путем инъекции в опухоль.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки вводят пациенту в сочетании с осуществлением (например, до, одновременно или после) любого количества соответствующих форм лечения, включая (но не ограничиваясь только ими) лечение с помощью средств противовирусной терапии, таких как цидофовир и интерлейкин-2, цитарабин (известный также под названием ARA-C), или лечение натализумабом пациентов с MS (рассеянный склероз), или лечение эфализумабом пациентов с псориазом, или другие виды лечения пациентов с PML (прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия). В других вариантах осуществления изобретения Т-клетки, предлагаемые в изобретении, можно применять в сочетании с химиотерапией, лучевой терапией, иммунодепрессантами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антителами или другими иммунодеструктивными агентами, такими как САМРАТН, антитела к CD3, или с другими видами терапии на основе антител, цитоксином, флударибином, циклоспорином, FK506, рапамицином, микофеноловой кислотой, стероидами, FR901228, цитокинами и облучением. Эти лекарственные средства или ингибируют кальций-зависимую фосфатазу кальцинеурин (циклоспорин и FK506), или ингибируют киназу p70S6, которая важна для индуцируемой фактором роста передачи сигнала (рапамицин) (Henderson, Naya и др., 1991; Liu, Albers и др., 1992; Bierer, Hollander и др., 1993).

В другом варианте осуществления изобретения клеточные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, вводят пациенту в сочетании с (например, до, одновременно или после) трансплантацией костного мозга, Т-клеточной абляционной терапией с использованием либо химиотерапевтических средств, таких как флударабин, либо внешней лучевой терапии (XRT), циклофосфамида, либо антител, таких как OKT3 или САМРАТН.

В другом варианте осуществления изобретения клеточные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, вводят после осуществления В-клеточной абляционной терапии с использованием агентов, которые взаимодействуют с CD20, таких, например, как ритуксан. Например, в одном из вариантов осуществления изобретения индивидуумов можно подвергать стандартной обработке химиотерапевтическими средствами в высокой дозе с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В некоторых вариантах осуществления изобретения после трансплантации индивидуумам вводят путем инфузии размноженные иммунные клетки, предлагаемые в настоящем изобретении. В еще одном варианте осуществления изобретения размноженные клетки вводят до или после хирургического вмешательства.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессирующие анти-CLL1 scCAR клетки водят пациенту в сочетании с (например, до, одновременно или после) лекарственным средством, выбранным из арацитина, цитозин-арабинозида, амсакрина, даунорубицина, идарубицина, новантрона, митоксантрона, вепезида, этопозида (VP16), триоксида мышьяка, транс-ретиноевои кислоты, мехлорэтамина, прокарбазина, хлорамбуцила и их комбинации. В указанных вариантах осуществления изобретения экспрессирующие анти-CLL1 scCAR клетки могут обладать устойчивостью к конкретному лекарственному средству или комбинации лекарственных средств, которое/которые вводят в сочетании с экспрессирующими анти-CLL1 scCAR клетками.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессирующие анти-CLL1 scCAR клетки вводят пациенту в сочетании с лекарственным средством, выбранным из цитарабина, антрациклинов, 6-тиогуанина, гидроксимочевины, преднизона и их комбинации.

Другие определения

- Если специально не указано иное, то множественное число и единственное число и понятие «по меньшей мере один» используются взаимозаменяемо и означают «один» или «более чем один».

- Аминокислотные остатки в полипептидной последовательности обозначают в настоящем описании с помощью однобуквенного кода, согласно которому, например, Q обозначает Gln или остаток глутамина, R обозначает Arg или остаток аргинина и D обозначает Asp или остаток аспарагиновой кислоты.

- Аминокислотная замена обозначает замену одного аминокислотного остатка на другой, например, замена остатка аргинина на остаток глутамина в пептидной последовательности представляет собой аминокислотную замену.

- Нуклеотиды обозначают следующим образом: однобуквенный код используют для обозначения основания нуклеозида: а обозначает аденин, t обозначает тимин, с обозначает цитозин и g обозначает гуанин. Для вырожденных нуклеотидов r обозначает g или а (пуриновые нуклеотиды), k обозначает g или t, s обозначает g или с, w обозначает а или t, m обозначает а или с, у обозначает t или с (пиримидиновые нуклеотиды), d обозначает g, а или t, v обозначает g, а или с, b обозначает g, t или с, h обозначает а, t или с и n обозначает g, a, t или с.

- В контексте настоящего описания понятия «нуклеиновая кислота» или «полинуклеотиды» относятся к нуклеотидам и/или полинуклеотидам, таким как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), олигонуклеотидам, фрагментам, созданным с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и фрагментам, созданным путем лигирования, расщепления, обработки эндонуклеазами и обработки экзонуклеазами. Молекулы нуклеиновой кислоты могут состоять из мономеров, которые являются встречающимися в естественных условиях нуклеотидами (такими как ДНК или РНК) или аналогами встречающихся в естественных условиях нуклеотидов (например, энантиомерными формами встречающихся в естественных условиях нуклеотидов), или представляют собой их комбинацию. Модифицированные нуклеотиды могут иметь изменения в сахарных фрагментах и/или в фрагментах, содержащих пиримидиновые или пуриновые основания. Модификации сахаров включают, например, замену одной или нескольких гидроксильных групп на галогены, алкильные группы, амины и азидогруппы, или сахара могут быть функционализированы до простых или сложных эфиров. Кроме того, весь сахарный фрагмент может быть заменен стерически и электронно сходными структурами, такими как аза-сахара и карбоциклические аналоги сахаров. Примерами модификаций во фрагменте, представляющем собой основание, могут служить алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины или другие хорошо известные гетероциклические заместители. Мономеры нуклеиновой кислоты могут быть сшиты фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными.

- Под «вектором для доставки» или «векторами для доставки» понимают любой доставляющий вектор, который можно применять согласно настоящему изобретению для приведения в контакт с клеткой (т.е. для «контактирования») или доставки внутрь клетки или в субклеточные компартменты (т.е. для «интродукции») агентов/химических веществ и молекул (белков или нуклеиновых кислот), требующихся для осуществления настоящего изобретения. К ним относятся (но не ограничиваясь только ими) липосомальные векторы для доставки, вирусные векторы для доставки, векторы для доставки лекарственного средства, химические носители, полимерные носители, липоплексы, полиплексы, дендримеры, микропузырьки (ультразвуковые контрастные агенты), наночастицы, эмульсии или другие пригодные векторы для переноса. Такие векторы для доставки позволяют доставлять молекулы, химические вещества, макромолекулы (гены, белки) или другие векторы, такие как плазмиды, пептиды, разработанные фирмой Diatos. В этих случаях векторы для доставки представляют собой молекулы-носители. Под «вектором для доставки» или «векторами для доставки» понимают также методы доставки, предназначенные для осуществления трансфекции.

- Понятия «вектор» или «векторы» относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, обладающей способностью транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она сцеплена. К «векторам», применяемым согласно настоящему изобретению, относятся (но не ограничиваясь только ими) вирусный вектор, плазмида, РНКовый вектор или молекула линейной или кольцевой ДНК или РНК, которые могут состоять из хромосомальных, нехромосомальных, полусинтетических или синтетических нуклеиновых кислот.Предпочтительными векторами являются векторы, которые способны автономно реплицировать (эписомальный вектор) и/или экспрессировать нуклеиновые кислоты, с которыми они сцеплены (экспрессионные векторы). Специалистам в данной области известно большое количество пригодных векторов, которые поступают в продажу.

К вирусным векторам относятся ретровирус, аденовирус, парвовирус (например, аденоассоциированный вирусы), коронавирус, РНК-вирусы с негативной цепью, такие как ортомиксовирус (например, вирус гриппа), рабдовирус (например, вирус бешенства и вирус везикулярного стоматита), парамиксовирус (например, вирус кори и вирус Сендай), РНК-вирусы с позитивной цепью, такие как пикорнавирус и альфавирус, и вирусы с двухцепочечной ДНК, включая аденовирус, вирус герпеса (например, вирус герпеса простого типов 1 и 2, вирус Эпштейна-Барра, цитомегаловирус) и вирус оспы (например, вирус коровьей оспы, вирус оспы птиц и вирус оспы канарейки). Другие вирусы включают, например, вирус Норвалк, тогавирус, флавивирус, реовирусы, паповирус, гепаднавирус и вирус гепатита. Примерами ретровирусов являются: вирус птичьего лейкоза-саркомы, вирусы млекопитающих С-типа, В-типа, вирусы D-типа, группа HTLV-BLV, лентивирус, спумавирус (Coffin J.M., Retroviridae: The viruses and their replication, в: Fundamental Virology, 3-е изд., под ред. В.N. Fields и др., изд-во Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

- Под «лентивирусным вектором» подразумевают лентивирусные векторы на основе ВИЧ, которые являются очень перспективными с точки зрения доставки гена благодаря их относительно большой способности к упаковке, пониженной иммуногенности и их способности стабильно трансдуцировать с высокой эффективностью большой спектр различных типов клеток. Лентивирусные векторы, как правило, создают посредством кратковременной трансфекции клеток-продуцентов тремя (упаковывающая плазмида, оболочечная плазмида и плазмида переноса) или большим количеством плазмид. Подобно ВИЧ, лентивирусные векторы проникают в клетку-мишень посредством взаимодействия гликопротеинов вирусной поверхности с рецепторами на клеточной поверхности. После проникновения вирусная РНК подвергается обратной транскрипции, опосредуемой комплексом вирусной обратной транскриптазы. Продуктом обратной транскрипции является двухцепочечная линейная вирусная ДНК, которая служит субстратом для вирусной интеграции в ДНК инфицированных клеток. Понятие «интегрирующие лентивирусные векторы (или LV)» обозначает, например (но не ограничиваясь только ими), такие векторы, которые способны интегрироваться в геном клетки-мишени. В противоположность этому, понятие «неинтегрирующие лентивирусные векторы (или NILV)» обозначает эффективные векторы для доставки генов, которые не интегрируются в геном клетки-мишени под действием вирусной интегразы.

- Векторы для доставки и векторы можно объединять или комбинировать с любыми методами клеточной пермеабилизации, такими как сонопорация или электропорация, или вариантами этих методов.

- Под клеткой или клетками подразумевают любые эукариотические живые клетки, первичные клетки и клеточные линии, полученные из указанных организмов для получения культур in vitro.

- Под «первичной клеткой» или «первичными клетками» подразумевают клетки, взятые непосредственно из живой ткани (т.е. материал, полученный путем биопсии) и подготовленные для выращивания in vitro, в популяции которых имело место лишь небольшое количество удвоений, и следовательно они являются более репрезентативными с точки зрения основных функциональных компонентов и характеристик тканей, из которых они происходят, по сравнению с непрерывно поддерживаемыми или искусственно иммортализованными онкогенными клеточными линиями.

Примерами таких клеточных линий могут являться (но не ограничиваясь только ими) клеточные линии, выбранные из группы, состоящей из клеток линии СНО-K1; клеток линии HEK293; клеток линии Сасо2; клеток линии U2-OS; клеток линии NIH 3Т3; клеток линии NSO; клеток линии SP2; клеток линии CHO-S; клеток линии DG44; клеток линии K-562, клеток линии U-937; клеток линии MRC5; клеток линии IMR90; клеток линии Jurkat; клеток линии HepG2; клеток линии HeLa; клеток линии НТ-1080; клеток линии НСТ-116; клеток линии Hu-h7; клеток линии Huvec; клеток линии Molt 4.

Все эти клеточные линии можно модифицировать с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении, создавая модели клеточных линий для получения, экспрессии, количественной оценки, обнаружения, изучения представляющего интерес гена или белка; эти модели можно применять также для скрининга представляющих интерес биологически активных молекул для исследовательских и промышленных целей в различных областях, например, таких как (но не ограничиваясь только ими) химия, биотопливо, терапевтические средства и агрономия.

- Под «мутацией» подразумевают замену, делецию или инсерцию одного/одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати, пятнадцати, двадцати, двадцати пяти, тридцати, сорока, пятидесяти или большего количества нуклеотидов/аминокислот в полинуклеотидной (кДНК, ген) или полипептидной последовательности. Мутация может влиять на кодирующую последовательность гена или его регуляторную последовательность. Она может влиять также на структуру геномной последовательности или структуру/стабильность кодируемой мРНК.

- Под «вариантом(ами)» подразумевают вариант повтора, вариант, ДНК-связывающий вариант, вариант TALE-нуклеазы, вариант полипептида, полученный в результате мутации или замены по меньшей мере одного остатка в аминокислотной последовательности родительской молекулы.

- Под «функциональным вариантом» подразумевают обладающий каталитической активностью мутант белка или домена белка; такой мутант может обладать такой же активностью, что и родительский белок или домен белка, или дополнительными свойствами, или более высокой или более низкой активностью.

- Понятие «идентичность» относится к идентичности последовательностей двух молекул нуклеиновых кислот или полипептидов. Идентичность можно оценивать путем сравнения положений в каждой из последовательностей, которые можно выравнивать для целей сравнения. Если положение в сравниваемой последовательности занято тем же самым основанием, то молекулы являются идентичными в этом положении. Степень сходства или идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями является функцией количества идентичных или совпадающих нуклеотидов в положениях нуклеотидных последовательностей. Для расчета идентичности двух последовательностей можно использовать различные алгоритмы и/или программы сравнительного анализа первичной структуры последовательностей, включая FASTA или BLAST, которые доступны в виде компонента пакета программ анализа последовательностей GCG (Университет Висконсина, Мэдисон, шт. Висконсин), и их можно применять, например, с использованием задаваемых по умолчанию параметров. Например, можно рассматривать полипептиды, обладающие идентичностью, составляющей по меньшей мере 70%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, с конкретными полипептидами, представленными в настоящем описании, и предпочтительно обладающие практически такими же функциями, а также полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды.

- Понятие «сходство» характеризует степень родства между аминокислотными последовательностями двух или большего количества полипептидов. BLASTP можно применять также для идентификации аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% аминокислотной референс-последовательности, с использованием матриц сходства, таких как BLOSUM45, BLOSUM62 или BLOSUM80. Если специально не указано иное, то указанные в описании баллы сходства получены с использованием BLOSUM62. При использовании BLASTP процент сходства основан на рассчитанном программой BLASTP балле положительных оценок, а процент идентичности последовательностей основан на рассчитанном BLASTP балле идентичности. Рассчитанные с помощью BLASTP «идентичности» представляют собой количество и пропорцию идентичных остатков относительно общего количества остатков в парах последовательностей с высокими баллами; а рассчитанные с помощью BLASTP «положительные оценки» представляют собой количество и пропорцию остатков, для которых полученные при сравнительном анализе первичной структуры последовательностей баллы, являются положительными, и которые сходны друг с другом. В настоящей заявке предложены и подпадают под объем изобретения аминокислотные последовательности, имеющие указанные степени идентичности или сходства, или любую промежуточную степень идентичности или сходства с представленными в настоящем описании аминокислотными последовательностями. Полинуклеотидные последовательности сходных полипептидов выводят с использованием генетического кода и их можно получать с помощью общепринятых методов. Например, функциональный вариант рТальфа может иметь последовательность, сходную на 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 107, описанной в WO 2013/176916. Полинуклеотид, кодирующий такой функциональный вариант, можно получать путем обратной трансляции его аминокислотной последовательности с использованием генетического кода.

В контексте настоящего описания понятие «индивидуум» или «пациент» включает всех представителей царства животных, в том числе приматов кроме человека и человека.

Понятие «наличие рецидива» относится к ситуации, когда у индивидуума или млекопитающего, у которого наблюдалась ремиссия рака после терапии, вновь появляются раковые клетки.

Понятие «рефракторая или устойчивая» относится к ситуации, когда у индивидуума или млекопитающего даже после интенсивного лечения в организме присутствуют оставшиеся раковые клетки.

Понятие «устойчивость к лекарственному средству» относится к состоянию, когда заболевание не реагирует на лечение лекарственным средством или лекарственными средствами. Устойчивость к лекарственному средству может быть либо врожденная (или первичная устойчивость), это означает, что заболевание никогда не обладало чувствительностью к лекарственному средству или лекарственным средствам, либо может быть приобретенной, это означает, что заболевание перестало реагировать на лекарственное средство или лекарственные средства, к которому(ым) оно ранее обладало чувствительностью (вторичная устойчивость). В некоторых вариантах осуществления изобретения устойчивость к лекарственному средству является врожденной. В некоторых вариантах осуществления изобретения устойчивость к лекарственному средству является приобретенной.

Понятие «гематологическое злокачественное заболевание» или «гематологический рак» относится к раку крови - костного мозга и/или лимфатической ткани организма. Примеры гематологических злокачественных заболеваний включают, например, острый миелоидный лейкоз (AML), AML с трехлинейной миелодисплазией (AML/TMDS), смешанную линию лейкоза (миелоидная/лимфоидная) (MLL) и другие связанные с AM патологии.

Понятие «лейкоз» относится к злокачественным неоплазмам кроветворных тканей, включая, в частности, острый миелоидный лейкоз или острый миелогенный лейкоз (AML).

В представленном выше описании изобретения изложены подход и способ его осуществления и применения, так что любой специалист в данной области способен осуществлять и применять его, эта возможность относится, прежде всего, к сущности изобретения, изложенной в прилагаемой формуле изобретения, которая представляет собой составную часть исходного описания.

Если в настоящем описании указаны численные пределы или численный диапазон, то они включают их границы. Кроме того, считается, что включены все значения и поддиапазоны, находящиеся в указанных пределах или указанном численном диапазоне, как если бы они были специально указаны.

Приведенное выше описание представлено для того, чтобы дать возможность специалисту в данной области осуществлять и применять изобретение, и оно изложено в контексте конкретного применения и требуемых для этого условий. Специалистам в данной области должны быть очевидны различные модификации предпочтительных вариантов осуществления изобретения, и общие принципы, указанные в нем могут быть применены для других вариантов осуществления изобретения и применений без отклонения от сущности и объема изобретения. Таким образом, не следует считать, что настоящее изобретение ограничено представленными вариантами осуществления изобретения, напротив, оно соответствует наиболее широкому объему, согласующемуся с принципами и отличительными признаками, указанными в настоящем описании.

Имея общее описание настоящего изобретения, можно достичь более полного понимания после ознакомления с некоторыми конкретными примерами, которые представлены в настоящем описании только для целей иллюстрации и не направлены на ограничение объема, если специально не указано иное.

Примеры

Общие методы

Культуры первичных Т-клеток

Т-клетки очищали из образцов лейкоцитарных пленок, полученных на фирме EFS (Etablissement Francais du Sang, Париж, Франция), используя среду с градиентом плотности фиколла. Выделяли слой РВМС и Т-клетки очищали, используя поступающий в продажу набор для обогащения Т-клеток. Очищенные Т-клетки активировали в среде X-Vivo™-15 (фирма Lonza), дополненной человеческим IL-2 в концентрации 20 нг/мл, человеческой сывороткой в концентрации 5%, и используя гранулы Dynabeads® с активатором человеческих Т-клеток CD3/CD28 при соотношении гранулы:клетки 1:1 (фирма Life Technologies).

Трансфекция мРНК scCAR

Трансфекции осуществляли в день 4 или день 11 после очистки и активации Т-клеток. 5 миллионов клеток трансфектировали 15 мкг мРНК, кодирующих различные конструкции scCAR. мРНК scCAR получали, применяя трансфекции с использованием мРНК-полимеразы Т7 с помощью технологии Cytopulse путем применения двух импульсов по 0,1 мс при 3000 В/см с последующими 4 импульсами по 0,2 мс при 325 В/см в кюветах с расстоянием между электродами 0,4 см в конечном объеме 200 мкл буфера Т для цитопорации («Cytoporation buffer Т») (устройство ВТХ Harvard). Клетки немедленно разводили в среде X-Vivo™-15 (фирма Lonza) и инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. IL-2 добавляли через 2 ч после электропорации в концентрации 20 нг/мл.

Анализ дегрануляции (мобилизация CD107a)

Т-клетки инкубировали в 96-луночных планшетах (40000 клеток/лунку) вместе с равным количеством клеток, экспрессирующих различные уровни белка CLL1. Совместные культуры поддерживали в конечном объеме 100 мкл среды Х-Vivo™-15 (фирма Lonza) в течение 6 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. Окрашивание CD107a осуществляли в процессе стимуляции клеток, добавляя флуоресцентное антитело к CD107a в начале совместного культивирования, вместе с антителом к CD49d в концентрации 1 мкг/мл, антителом к CD28 в концентрации 1 мкг/мл, и 1-кратным раствором монензина. После периода инкубации, составляющего 6 ч, клетки окрашивали фиксирующим витальным красителем и конъюгированным с флуорохромом антителом к CD8 и анализировали с помощью проточной цитометрии. Дегранулирующую активность определяли в виде % CD8⁺/CD107a⁺-клеток и на основе определения средней интенсивности сигнала флуоресцении (MFI) для окрашивания CD107a в популяции CD8⁺-клеток. Анализы дегрануляции осуществляли через 24 ч после трансфекции мРНК.

Анализ высвобождения IFN гамма

Т-клетки инкубировали в 96-луночных планшетах (40000 клеток/лунку) вместе с клеточными линиями, экспрессирующими различные уровни белка CLL1. Совместные культуры поддерживали в конечном объеме 100 мкл среды X-Vivo™-15 (фирма Lonza) в течение 24 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. После указанного периода инкубации планшеты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин и супернатанты переносили в новый планшет.Обнаружение IFN гамма в супернатантах клеточных культур осуществляли с помощью ELISA-анализа. Анализы высвобождения IFN гамма осуществляли в начале совместного культивирования клеток через 24 ч после трансфекции мРНК.

Анализ цитотоксичности

Т-клетки инкубировали в 96-луночных планшетах (100000 клеток/лунку) вместе с 10000 клеток-мишеней (экспрессирующих CLL1) и 10000 контрольных (CLL1neg) клеток в одной и той же лунке. Клетки-мишени и контрольные клетки метили флуоресцентными внутриклеточными красителями (CFSE или Cell Trace Violet) перед их совместным культивированием с scCAR⁺-Т-клетками. Совместные культуры инкубировали в течение 4 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. После указанного периода инкубации клетки метили фиксирующим витальным красителем и анализировали с помощью проточной цитометрии. Определяли жизнеспособность каждой клеточной популяции (клетки-мишени или контрольные CLL1neg-клетки) и рассчитывали % удельного клеточного лизиса. Анализы цитотоксичности осуществляли через 48 ч после трансфекции мРНК.

Трансдукция Т-клеток

Трансдукцию Т-клеток рекомбинантными лентивирусными векторами, экспрссирующими scCAR, осуществляли через 3 дня после очистки/активации Т-клеток. Обнаружение scCAR на поверхности Т-клеток осуществляли, используя рекомбинантный белок, который состоит из белка внеклеточного домена человеческого белка CLL1, слитого с Fc-фрагментом мышиного IgG1. Связывание указанного белка с молекулой scCAR определяли с помощью конъюгированного с флуорохромом вторичного антитела, мишенью которого является белок мышиного Fc-фрагмента, и анализировали с помощью проточной цитомерии.

Мышиная модель для оценки противоопухолевого действия

Мышам с иммунодефицитом линии NOG инъецировали внутривенно (iv) клетки, экспрессирующие CLL1_MOLM13-люциферазу, в качестве мышиной модели ксенотрансплантата AML. Необязательно мышей подвергали противоопухолевой обработке. Затем мышам инъецировали iv (например, через 2 или 7 дней после инъекции линии опухолевых клеток) scCAR⁺-Т-клетки в тестируемых различных дозах или Т-клетки, не трансдуированные несущим scCAR лентивирусным вектором. Биолюминисцентые сигналы определяли в день инъекции Т-клеток (D0), в D7, 14, 21, 28 и 40 после инъекции Т-клеток, для отслеживания развития опухолей у различных животных.

Пример 1: Пролиферация клеток с инактивированным ТСRальфа, экспрессирующих CLL1-scCAR

Конструировали и получали гетеродимерную TALE-нуклеазу, нацеленную на две последовательности длиной 17 пар оснований (которые обозначали как полумишени), разделенные состоящим из 15 пар оснований спейсером в гене константной области альфа-цепи Т-клеточного рецептора (TRAC). Каждая из полумишеней распознавалась повторами половин TALE-нуклеаз, представленными в таблице 10.

Каждую конструкцию TALE-нуклеазы субклонировали с использованием расщепления рестриктазами в экспрессионном векторе для клеток млекопитающих под контролем промотора Т7. мРНК, кодирующую TALE-нуклеазу, которая расщепляла геномную последовательность TRAC, синтезировали с использованием плазмиды, несущей кодирующую последовательность, расположенную в прямом направлении относительно промотора Т7.

Очищенные Т-клетки, предварительно активированные в течение 72 ч покрытыми антителом к CD3/CD28 гранулами, трансфектировали каждой из 2 мРНК, кодирующих обе половины TRAC_T01 TALE-нуклеаз. Через 48 ч после трансфекции различные группы Т-клеток из одного и того же донора соответственно трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим один из ранее описанных анти-CLL1 scCAR (SEQ ID NO: 35-112). Через 2 для после трансдукции СD3_NEG-клетки очищали с использованием покрытых антителом к CD3 магнитных гранул и через 5 дней после трансдукции клетки реактивировали растворимым антителом к CD28 (5 мкг/мл).

Мониторинг клеточной пролиферации осуществляли в течение периода времени вплоть до 30 дней после реактивации, подсчитывая количество клеток 2 раза в неделю. Обнаружено увеличение пролиферации клеток с инактивированным ТСRальфа, экспрессирующих CLL1 scCAR, прежде всего в том случае, когда их реактивировали антителом к CD28, по сравнению с нетрансдуцированными клетками.

Для изучения вопроса о том, находятся ли человеческие Т-клетки, экспрессирующие CLL1 scCAR, в активированном состоянии, анализировали экспрессию маркера активации CD25 с помощью FACS через 7 дней после трансдукции. Очищенные клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, кодирующим CLL1 scCAR, анализировали в отношении экспрессии CD25 на их поверхности для оценки их активации по сравнению с нетрансдуцированными клетками. Повышенный уровень экспрессии CD25 обнаружен как в условиях после реактивации антителом к CD28, так и в условиях без реактивации.

Пример 2: Конструирование CLL1 scCAR с использованием фрагментов различных антител к CLL1

Культуры первичных Т-клеток

Т-клетки очищали из образцов лейкоцитарных пленок, полученных на фирме EFS (Etablissement Francais du Sang, Париж, Франция), используя среду с градиентом плотности фиколла (среда Ficoll Paque PLUS/фирма GE Healthcare Life Sciences). Выделяли слой РВМС и Т-клетки очищали, используя поступающий в продажу набор для обогащения Т-клеток (фирма Stem Cell Technologies). Очищенные Т-клетки активировали в среде X-Vivo™-15 (фирма Lonza), дополненной человеческим IL-2 в концентрации 20 нг/мл (фирма Miltenyi Biotech), человеческой сывороткой в концентрации 5% (фирма Sera Laboratories) и гранулами Dynabeads® с активатором человеческих Т-клеток CD3/CD28 при соотношении гранулы: клетки 1:1 (фирма Life Technologies). После активации клетки выращивали и поддерживали в среде X-Vivo™-15 (фирма Lonza), дополненной человеческим IL-2 в концентрации 20 нг/мл (фирма Miltenyi Biotech) и человеческой сывороткой в концентрации 5% (фирма Sera Laboratories).

Трансфекция мРНК scCAR

Трансфекции осуществляли в день 4 или день 11 после очистки и активации Т-клеток. 5 миллионов клеток трансфектировали 15 мкг мРНК, кодирующих различные конструкции scCAR. мРНК scCAR получали, применяя набор mMESSAGE mMACHINE T7 (фирма Life Technologies) и очищали, используя вращающиеся колонки RNeasy Mini (фирма Qiagen). Трансфекции осуществляли, используя технологию Cytopulse, применяя два импульса по 0,1 мс при 3000 В/см с последующими 4 импульсами по 0,2 мс при 325 В/см в кюветах с расстоянием между электродами 0,4 см в конечном объеме 200 мкл буфера Т для цитопорации («Cytoporation buffer Т») (фирма ВТХ Harvard). Клетки немедленно разводили в среде X-Vivo™-15 (фирма Lonza) и инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. IL-2 (фирма Miltenyi Biotec) добавляли через 2 ч после электропорации в концентрации 20 нг/мл.

Анализ дегрануляции (мобилизация СР107а)

Т-клетки инкубировали в 96-луночных планшетах (40000 клеток/лунку) вместе с равным количеством клеток, экспрессирующих различные уровни белка CLL1. Совместные культуры поддерживали в конечном объеме 100 мкл среды X-Vivo™-15 (фирма Lonza) в течение 6 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. Окрашивание CD107a осуществляли в процессе стимуляции клеток, добавляя флуоресцентное антитело к CD107a (конъюгированное с АРС, фирма Miltenyi Biotec) в начале совместного культивирования, вместе с антителом к CD49d (фирма BD Pharmingen) в концентрации 1 мкг/мл, антителом к CD28 (фирма Miltenyi Biotec) в концентрации 1 мкг/мл, и 1-кратным раствором монензина (фирма eBioscience). После периода инкубации, составляющего 6 ч, клетки окрашивали фиксирующим витальным красителем(eFluor 780, фирма eBioscience) и конъюгированным с флуорохромом антителом к CD8 (конъюгированное с РЕ, фирма Miltenyi Biotec) и анализировали с помощью проточной цитометрии. Дегранулирующую активность определяли в виде % CD8⁺/CD107a⁺-клеток и на основе определения средней интенсивности сигнала флуоресценции (MFI) для окрашивания CD107a в популяции CD8⁺-клеток. Анализы дегрануляции осуществляли через 24 ч после трансфекции мРНК.

Анализ высвобождения IFN гамма

Т-клетки инкубировали в 96-луночных планшетах (40000 клеток/лунку) вместе с клеточными линиями, экспрессирующими различные уровни белка CLL1. Совместные культуры поддерживали в конечном объеме 100 мкл среды X-Vivo™-15 (фирма Lonza) в течение 24 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. После указанного периода инкубации планшеты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин и супернатанты переносили в новый планшет.Обнаружение IFN гамма в супернатантах клеточных культур осуществляли с помощью ELISA-анализа (набор Human IFN-gamma Quantikine ELISA, фирма R&D Systems). Анализы высвобождения IFN гамма осуществляли в начале совместного культивирования клеток через 24 ч после трансфекции мРНК.

Анализ цитотоксичности

Т-клетки инкубировали в 96-луночных планшетах (100000 клеток/лунку) вместе с 10000 клеток-мишеней (экспрессирующих CLL1) и 10000 контрольных (CLL1neg) клеток в одной и той же лунке. Клетки-мишени и контрольные клетки метили флуоресцентными внутриклеточными красителями (CFSE или Cell Trace Violet, фирма Life Technologies) перед их совместным культивированием с scCAR⁺-Т-клетками. Совместные культуры инкубировали в течение 4 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. После указанного периода инкубации клетки метили фиксирующим витальным красителем (eFluor 780, фирма eBioscience) и анализировали с помощью проточной цитометрии. Определяли жизнеспособность каждой клеточной популяции (клетки-мишени или контрольные CLL1neg-клетки) и рассчитывали % удельного клеточного лизиса. Анализы цитотоксичности осуществляли через 48 ч после трансфекции мРНК.

Примеры анти-CLL1 одноцепочечных химерных антигенных рецепторов

sc SC02-357-CAR-v1 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 35)

sc SC02-357-CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 36)

sc SC02-357-CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 37)

sc SC02-357-CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 38)

sc SC02-357-CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 39)

sc SC02-357-CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 40)

sc SC02-378 CAR-v1 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 41)

sc SC02-378 CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 42)

sc SC02-378 CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 43)

sc SC02-378 CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 44)

sc SC02-378 CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 45)

sc SC02-378 CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 46)

sc SC02-161 CAR-v1 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 47)

sc SC02-161 CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 48)

sc SC02-161 CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 49)

sc SC02-161 CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 50)

sc SC02-161 CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 51)

sc SC02-161 CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 52)

sc M26 CAR-vl (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 53)

sc M26 CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 54)

sc M26 CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 55)

sc M26 CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 56)

sc M26 CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 57)

sc M26 CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 58)

sc M31 CAR-vl (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 59)

sc M31 CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 60)

sc M31 CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO. 61)

sc M31 CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 62)

sc M31 CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 63)

sc M31 CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 64)

sc G4 CAR-vl (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 65)

sc G4 CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 66)

sc G4 CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 67)

sc G4 CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 68)

sc G4 CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 69)

sc G4 CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 70)

sc M22 CAR-v1 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 71)

sc M22 CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 72)

sc M22 CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 73)

sc M22 CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 74)

sc M22 CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 75)

sc M22 CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 76)

sc M29 CAR-v1 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 77)

sc M29 CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 78)

sc M29 CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 79)

sc M29 CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 80)

sc M29 CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 81)

sc M29 CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 82)

sc M2 CAR-v1 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 83)

sc M2 CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 84)

sc M2 CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 85)

sc M2 CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 86)

sc M2 CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 87)

sc M2 CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 88)

sc M5 CAR-v1 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 89)

sc M5 CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 90)

sc M5 CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 91)

sc M5 CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 92)

sc M5 CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 93)

sc MS CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 94)

sc G12 CAR-v1 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 95)

sc G12 CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 96)

sc G12 CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 97)

sc G12 CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 98)

sc G12 CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 99)

sc G12 CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 100)

sc 21.26 CAR-v1 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 101)

sc 21.26 CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 102)

sc 21.26 CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 103)

sc 21.26 CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 104)

sc 21.26 CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 105)

sc 21.26 CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 106)

sc 1075.7 CAR-v1 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 107)

sc 1075.7 CAR-v2 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 108)

sc 1075.7 CAR-v3 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 109)

sc 1075.7 CAR-v4 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 110)

sc 1075.7 CAR-v5 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 111)

sc 1075.7 CAR-v6 (SEQ ID NO: 1+SEQ ID NO: 112)

Список процитированной литературы

Arbiza J., Taylor G., , Furze J., Wyld S., Whyte P., Stott E.J., Wertz G., Sullender W., Trudel M. и др., Characterization of two антигенный sites recognized by neutralizing моноклональн antibodies directed against the fusion glycoprotein of human respiratory syncytial virus, J Gen Virol.;73 (9), 1992, cc. 2225-2234.

Arimondo P.B., C.J. Thomas и др., "Exploring the cellular activity of camptothecin-triple-helix-forming oligonucleotide conjugates", Mol Cell Biol 26(1), 2006, cc. 324-333.

Atkins J.F., N.M. Wills и др., "A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go)." Rna 13(6), 2007, cc. 803-810.

Bakker A.B., Van den Oudenrijn S, Bakker A.Q., Feller N., van Meijer M., Bia J.A., Jongeneelen M.A., Visser T.J., Bijl N., Geuijen C.A., Marissen W.E., Radosevic K., Throsby M., Schuurhuis G.J., Ossenkoppele G.J., de KruifJ., Goudsmit J., Kruisbeek A.M., "C-type lectin-like molecule-1: a novel myeloid cell surface marker associated with acute myeloid leukemia", Cancer Res. 64(22), 2004, cc. 8443-8450).

Bardenheuer W., K. Lehmberg и др., "Resistance to cytarabine and gemcitabine and in vitro selection of transduced cells after retroviral expression of cytidine deaminase in human hematopoietic progenitor cells", Leukemia 19(12), 2005, cc. 2281-8.

Betts M.R., J.M. Brenchley и др., "Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation." J Immunol Methods 281(1-2), 2003, cc. 65-78.

Bierer B.E., G. Hollander и др., "Cyclosporin A and FK506: molecular mechanisms of immunosuppression and probes for transplantation biology", Curr Opin Immunol 5(5), 1993, cc. 763-773.

Boch J., H. Scholze и др., "Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors." Science 326(5959), 2009, cc. 1509-1512.

Brewin J., C. Mancao и др., "Generation of EBV-specific cytotoxic T cells that are resistant to calcineurin inhibitors for the treatment of posttransplantation lymphoproliferative disease." Blood 114(23), 2009, cc. 4792-4803.

Choulika A., A. Perrin и др., "Induction of homologous recombination in mammalian chromosomes by using the I-SceI system of Saccharomyces cerevisiae." Mol Cell Biol 15(4), 1995, cc. 1968-1973.

Christian M., T. Cermak и др., "Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases." Genetics 186(2), 2010, cc. 757-761.

Cong L., F.A. Ran и др., "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems." Science 339(6121), 2013, cc. 819-823.

Critchlow S.E. и S.P. Jackson, "DNA end-joining: from yeast to man." Trends Biochem Sci 23(10), 1998, cc. 394-398.

Dasgupta A., D. McCarty и др., "Engineered drug-resistant immunocompetent cells enhance tumor cell killing during a chemotherapy challenge." Biochem Biophys Res Commun 391(1), 2011, cc. 170-175.

Deltcheva E., K. Chylinski и др., "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Nature 471(7340), 2011, cc. 602-607.

Deng, D.C. Yan и др., "Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors". Science 335(6069), 2012, cc. 720-723.

Donnelly M. и G. Elliott, "Nuclear localization and shuttling of herpes simplex virus tegument protein VP13/14", J Virol 75(6), 2001, cc. 2566-2574.

Doronina V.A., C. Wu и др., "Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon." Mol Cell Biol 28(13), 2008, cc. 4227-4239.

Eisenschmidt K., T. Lanio и др., "Developing a programmed restriction endonuclease for highly specific DNA cleavage". Nucleic Acids Res 33(22), 2005, cc. 7039-7047.

Garneau J.E., M.E. Dupuis и др., "The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA", Nature 468(7320) 2010), cc. 67-71.

Gasiunas G., R. Barrangou и др., "Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates специфическ DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria", Proc Natl Acad Sci USA 109(39), 2012, cc. E2579-2586.

Geissler R., H. Scholze и др., "Transcriptional activators of human genes with programmable DNA-specificity", PLoS One 6(5), 2011, cc. e19509.

Hacke K., J.A. Treger и др., "Genetic modification of mouse bone marrow by lentiviral vector-mediated delivery of hypoxanthine-Guanine phosphoribosyltransferase short hairpin RNA confers chemoprotection against 6-thioguanine cytotoxicity". Transplant Proc 45(5), 2013, cc. 2040-2044.

Henderson D.J., I. Naya и др., "Comparison of the effects of FK-506, cyclosporin A and rapamycin on IL-2 production". Immunology 73(3), 1991, cc. 316-321.

Huang P., A. Xiao и др., "Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs", Nat Biotechnol 29(8), 2011, cc. 699-700.

Jena B., G. Dotti и др., "Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor". Blood 116(7), 2010, cc. 1035-1044.

Jinek M., K. Chylinski и др., "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity". Science 337(6096), 2012, cc. 816-821.

Jonnalagadda M., C.E. Brown и др., "Engineering human T cells for resistance to methotrexate and mycophenolate mofetil as an in vivo cell selection strategy", PLoS One 8(6), 2013, c. e65519.

Kalish J.M. и P.M. Glazer, "Targeted genome modification via triple helix formation", Ann N Y Acad Sci 1058, 2005, cc. 151-161.

Kushman M.E., S.L. Kabler и др., "Expression of human glutathione S-transferase PI confers resistance to benzo[a]pyrene or benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol mutagenesis, macromolecular alkylation and formation of stable N2-Gua-BPDE adducts in stably transfected V79MZ cells co-expressing hCYP1A1." Carcinogenesis 28(1), 2007, cc. 207-214.

Larsen H.∅., Roug A.S., Just T., Brown G.D., Hokland P., "Expression of the hMICL in acute myeloid leukemia-a highly reliable disease marker at diagnosis and during follow-up", Cytometry B Clin Cytom. 82(1), 2012, cc. 3-8.

Li L., M.J. Piatek и др., "Rapid and highly efficient construction of TALE-based transcriptional regulators and nucleases for genome modification". Plant Mol Biol 78(4-5), 2012, cc. 407-416.

Li T., S. Huang и др., "TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain". Nucleic Acids Res 39(1), 2011, cc. 359-372.

Li T., S. Huang и др., "Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes". Nucleic Acids Res 39(14), 2011,cc. 6315-6325.

Liu J., M.W. Albers и др., "Inhibition of T cell signaling by immunophilin-лиганд complexes correlates with loss of calcineurin phosphatase activity", Biochemistry 31(16), 1992, cc. 3896-3901.

Ma J.L., E.M. Kim и др., "Yeast Mre11 and Rad1 proteins define a Kuindependent mechanism to repair double-strand breaks lacking overlapping end sequences", Mol Cell Biol 23(23), 2003, cc. 8820-8828.

Mahfouz M.M., L. Li и др., "Targeted transcriptional repression using a chimeric TALE-SRDX repressor protein". Plant Mol Biol 78(3), 2012, cc. 311-321.

Mahfouz M.M., L. Li и др., "De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks", Proc Natl Acad Sci USA 108(6), 2011, cc. 2623-2628.

Mak A.N., P. Bradley и др., "The crystal structure of TAL effector PthXo1 bound to its DNA target". Science 335(6069), 2012, cc. 716-719.

Mali P., L. Yang и др., "RNA-guided human genome engineering via Cas9", Science 339(6121), 2013, cc. 823-826.

McLaughlin P и др., Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymphoma: half of patients respond to a four-dose treatment program, J Clin Oncol. 16(8), 1998, cc. 2825-8233.

Miller J.C., S. Tan и др., "A TALE nuclease architecture for efficient genome editing", Nat Biotechnol 29(2), 2011, cc. 143-148.

Morbitzer R., P. Romer и др., "Regulation of selected genome loci using de novo-engineered transcription activator-like effector (TALE)-type transcription factors", Proc Natl Acad Sci USA 107(50), 2011, cc. 21617-2122.

Moscou M.J. и A.J. Bogdanove, "A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors". Science 326(5959), 2009, c. 1501.

Mussolino C., R. Morbitzer и др., "A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity". Nucleic Acids Res 39(21), 2011, cc. 9283-9293.

Nivens M.C., T. Felder и др., "Engineered resistance to camptothecin and antifolates by retroviral coexpression of tyrosyl DNA phosphodiesterase-I and thymidylate synthase". Cancer Chemother Pharmacol 53(2), 2004, cc. 107-115.

Paques F. и P. Duchateau, "Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy", Curr Gene Ther 7(1), 2007, cc. 49-66.

Park T.S., S.A. Rosenberg h и др., "Treating cancer with genetically engineered T cells". Trends Biotechnol 29(11), 2011, cc. 550-557.

Peipp M., D. Saul и др., "Efficient eukaryotic expression of fluorescent scFv fusion proteins directed against CD antigens for FACS applications", J Immunol Methods 285(2), 2004, cc. 265-280.

Perrin A., M. Buckle и др., "Asymmetrical recognition and activity of the I-SceI endonuclease on its site and on intron-exon junctions", Embo J 12(7), 1993, cc. 2939-2347.

Pingoud A. и G.H. Silva, "Precision genome surgery", Nat Biotechnol 25(7), 2007,cc. 743-744.

Porteus M.H. и D. Carroll, "Gene targeting using zinc finger nucleases", Nat Biotechnol 23(8), 2005, cc. 967-973.

Ravetch J.V., Perussia B., "Alternative membrane forms of Fc gamma RIII(CD16) on human natural killer cells and neutrophils. Cell type-specific expression of two genes that differ in single nucleotide substitutions", J. Exp. Med. 170, 1989.cc. 481-497.

Riemer A.B., Kurz H., Klinger M., Scheiner O., Zielinski C. и Jensen-Jarolim E., Vaccination with cetuximab mimotopes and biological properties of induced antiepidermal growth factor receptor antibodies, J Natl Cancer Inst.; 97(22), 2005, cc. 1663-1670.

Rouet P., F. Smih и др., "Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease", Mol Cell Biol 14(12), 1994, cc. 8096-8106.

Sander J.D., L. Cade и др., "Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs", Nat Biotechnol 29(8), 2011, cc. 697-698.

Sangiolo D., M. Lesnikova и др., "Lentiviral vector conferring resistance to mycophenolate mofetil and sensitivity to ganciclovir for in vivo T-cell selection", Gene Ther 14(21), 2007, cc. 1549-1554.

Schweitzer B.I., A.P. Dicker и др., "Dihydrofolate reductase as a therapeutic target", Faseb J 4(8), 1990, cc. 2441-2452.

Sorek R., C.M. Lawrence и др., "CRISPR-mediated Adaptive Immune Systems in Bacteria and Archaea", Annu Rev Biochem., 2013).

Stoddard B.L., "Homing endonuclease structure and function." Q Rev Biophys 38(1), 2005, cc. 49-95.

Sugimoto Y., S. Tsukahara и др., "Drug-selected co-expression of P-glycoprotein and gp91 in vivo from an MDR1-bicistronic retrovirus vector Ha-MDR-IRES-gp91", J Gene Med 5(5), 2003, cc. cc. 366-376.

Takebe N., S.C. Zhao и др., "Generation of dual resistance to 4-hydroperoxycyclophosphamide and methotrexate by retroviral transfer of the human aldehyde dehydrogenase class 1 gene and a mutated dihydrofolate reductase gene", Mol Ther 3(1), 2001, cc. 88-96.

Tesson L., C. Usal и др., "Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs", Nat Biotechnol 29(8), 2011, cc. 695-696.

Van Rhenen A., van Dongen G.A., Kelder A., Rombouts E.J., Feller N., Moshaver B., Stigter-van Walsum M., Zweegman S., Ossenkoppele G.J., Jan Schuurhuis G., Blood. "The novel AML stem cell associated антиген CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood, 110(7), 2007, cc. 2659-2666.

Weber E., R. Gruetzner и др., "Assembly of designer TAL effectors by Golden Gate cloning", PLoS One 6(5), 2011, c. e19722.

Yam P., M. Jensen и др., "Ex vivo selection and expansion of cells based on expression of a mutated inosine monophosphate dehydrogenase 2 after HIV vector transduction: effects on lymphocytes, monocytes, and CD34+ stem cells", Mol Ther 14(2), 2006, cc. 236-244.

Zhang Hongyong, Luo Juntao, Li Yuanpei, Henderson Paul T., Wachsmann-Hogiu Sebastian, Lam Kit S. и Pan Chong-xian, «Characterization of high-affinity peptides and their feasibility for use in nanotherapeutics targeting leukemia stem cells", Nanomedicine; 8(7), 2011, cc. 1116-1124.

Zhang F., L. Cong и др., "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription", Nat Biotechnol 29(2), 2011, cc. 149-153.

Zielske S.P., J.S. Reese и др., "In vivo selection of MGMT(P140K) lentivirus-transduced human NOD/SCID repopulating cells without pretransplant irradiation conditioning", J Clin Invest 112(10), 2003, cc. 1561-1570.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> СЕЛЛЕКТИС

<120> АНТИ-CLL1-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ

РЕЦЕПТОРЫ (scCAR) ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ РАКА

<130> P81504846PCT00

<150> PA201570044

<151> 2015-01-26

<160> 199

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> signal peptide

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> signal peptide

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<223> FcgRIIIa hinge

<400> 3

Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln

1 5 10 15

<210> 4

<211> 45

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<223> CD8alpha hinge

<400> 4

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 5

<211> 231

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<223> IgG1 hinge

<400> 5

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<223> CD8alpha transmembrane domain

<400> 6

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

<210> 7

<211> 27

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<223> 41BB transmembrane domain

<400> 7

Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu

1 5 10 15

Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

20 25

<210> 8

<211> 42

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<223> Fragment of 4-1BB (residues 214-255)

<400> 8

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<223> fragment of T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain

<400> 9

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> linker

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 11

<211> 115

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-357 heavy chain variable region

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser

85 90 95

Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 118

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-378 heavy chain variable region

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 118

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-161 heavy chain variable region

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Thr Thr Ala Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-357 & SC02-378 & SC02-161 light chain variable region

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 120

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M26 heavy chain variable region

<400> 15

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Phe Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 108

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M26 light chain variable region

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Thr Gln Glu Leu Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Asn Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 17

<211> 120

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M31 heavy chain variable region

<400> 17

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 111

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M31 light chain variable region

<400> 18

Thr Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Tyr Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 120

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> G4 heavy chain variable region

<400> 19

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Glu Lys Asn Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Pro Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Ile Tyr Asn Pro Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ala Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Asp Asp Tyr Asp Asp Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> G4 light chain variable region

<400> 20

Glu Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 121

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M22 heavy chain variable region

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Glu Thr His Tyr Asn Gln Gln Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 113

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M22 light chain variable region

<400> 22

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 23

<211> 119

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M29 heavy chain variable region

<400> 23

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met Tyr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 106

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M29 light chain variable region

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 25

<211> 120

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M2 heavy chain variable region

<400> 25

Glu Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Phe Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 108

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M2 light chain variable region

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 27

<211> 115

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M5 heavy chain variable region

<400> 27

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Lys Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 112

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M5 light chain variable region

<400> 28

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 29

<211> 117

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> G12 heavy chain variable region

<400> 29

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Ser

20 25 30

Asn Ile His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Val Tyr Asn Trp His Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 112

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> G12 light chain variable region

<400> 30

Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr

20 25 30

Gly Asp Ile Phe Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 31

<211> 120

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 21.26 heavy chain variable region

<400> 31

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Val

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 32

<211> 106

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 21.26 light chain variable region

<400> 32

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asp Arg Ala Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105

<210> 33

<211> 123

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 1075.7 heavy chain variable region

<400> 33

Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 1075.7 light chain variable region

<400> 34

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser

20 25 30

Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105

<210> 35

<211> 455

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-357 scCAR-v1 polypeptide

<400> 35

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe

260 265 270

Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

275 280 285

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

290 295 300

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

305 310 315 320

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

325 330 335

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

340 345 350

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

355 360 365

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

370 375 380

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

385 390 395 400

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

405 410 415

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

420 425 430

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

435 440 445

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 36

<211> 458

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-357 scCAR-v2 polypeptide

<400> 36

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe

260 265 270

Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr

275 280 285

Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

290 295 300

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

305 310 315 320

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

325 330 335

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

340 345 350

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

370 375 380

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

385 390 395 400

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

405 410 415

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

420 425 430

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

435 440 445

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 37

<211> 484

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-357 scCAR-v3 polypeptide

<400> 37

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

275 280 285

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

290 295 300

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

305 310 315 320

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

340 345 350

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

355 360 365

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

370 375 380

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

385 390 395 400

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

405 410 415

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

420 425 430

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

435 440 445

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

450 455 460

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

465 470 475 480

Leu Pro Pro Arg

<210> 38

<211> 487

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-357 scCAR-v4 polypeptide

<400> 38

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

275 280 285

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

290 295 300

Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu

305 310 315 320

Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 39

<211> 670

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-357 scCAR-v5 polypeptide

<400> 39

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

275 280 285

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val

290 295 300

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

305 310 315 320

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

325 330 335

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

340 345 350

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

355 360 365

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

370 375 380

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

385 390 395 400

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

405 410 415

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

420 425 430

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

435 440 445

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

450 455 460

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

465 470 475 480

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr Ile Trp

485 490 495

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

500 505 510

Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

515 520 525

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

530 535 540

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

545 550 555 560

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

565 570 575

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

580 585 590

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

595 600 605

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

610 615 620

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

625 630 635 640

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

645 650 655

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

660 665 670

<210> 40

<211> 673

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-357 scCAR-v6 polypeptide

<400> 40

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

275 280 285

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val

290 295 300

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

305 310 315 320

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

325 330 335

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

340 345 350

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

355 360 365

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

370 375 380

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

385 390 395 400

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

405 410 415

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

420 425 430

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

435 440 445

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

450 455 460

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

465 470 475 480

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Ile Ser Phe

485 490 495

Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu

500 505 510

Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

515 520 525

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

530 535 540

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

545 550 555 560

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

565 570 575

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

580 585 590

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

595 600 605

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

610 615 620

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

625 630 635 640

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

645 650 655

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

660 665 670

Arg

<210> 41

<211> 455

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-378 scCAR-v1 polypeptide

<400> 41

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe

260 265 270

Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

275 280 285

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

290 295 300

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

305 310 315 320

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

325 330 335

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

340 345 350

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

355 360 365

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

370 375 380

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

385 390 395 400

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

405 410 415

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

420 425 430

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

435 440 445

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 42

<211> 458

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-378 scCAR-v2 polypeptide

<400> 42

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe

260 265 270

Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr

275 280 285

Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

290 295 300

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

305 310 315 320

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

325 330 335

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

340 345 350

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

370 375 380

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

385 390 395 400

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

405 410 415

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

420 425 430

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

435 440 445

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 43

<211> 484

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-378 scCAR-v3 polypeptide

<400> 43

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

275 280 285

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

290 295 300

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

305 310 315 320

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

340 345 350

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

355 360 365

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

370 375 380

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

385 390 395 400

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

405 410 415

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

420 425 430

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

435 440 445

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

450 455 460

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

465 470 475 480

Leu Pro Pro Arg

<210> 44

<211> 487

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-378 scCAR-v4 polypeptide

<400> 44

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

275 280 285

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

290 295 300

Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu

305 310 315 320

Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 45

<211> 670

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-378 scCAR-v5 polypeptide

<400> 45

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

275 280 285

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val

290 295 300

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

305 310 315 320

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

325 330 335

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

340 345 350

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

355 360 365

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

370 375 380

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

385 390 395 400

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

405 410 415

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

420 425 430

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

435 440 445

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

450 455 460

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

465 470 475 480

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr Ile Trp

485 490 495

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

500 505 510

Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

515 520 525

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

530 535 540

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

545 550 555 560

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

565 570 575

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

580 585 590

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

595 600 605

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

610 615 620

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

625 630 635 640

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

645 650 655

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

660 665 670

<210> 46

<211> 673

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-378 scCAR-v6 polypeptide

<400> 46

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

275 280 285

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val

290 295 300

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

305 310 315 320

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

325 330 335

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

340 345 350

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

355 360 365

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

370 375 380

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

385 390 395 400

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

405 410 415

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

420 425 430

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

435 440 445

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

450 455 460

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

465 470 475 480

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Ile Ser Phe

485 490 495

Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu

500 505 510

Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

515 520 525

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

530 535 540

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

545 550 555 560

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

565 570 575

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

580 585 590

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

595 600 605

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

610 615 620

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

625 630 635 640

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

645 650 655

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

660 665 670

Arg

<210> 47

<211> 455

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-161 scCAR-v1 polypeptide

<400> 47

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Ala Gly Ser Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe

260 265 270

Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

275 280 285

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

290 295 300

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

305 310 315 320

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

325 330 335

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

340 345 350

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

355 360 365

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

370 375 380

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

385 390 395 400

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

405 410 415

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

420 425 430

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

435 440 445

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 48

<211> 458

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-161 scCAR-v2 polypeptide

<400> 48

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Ala Gly Ser Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe

260 265 270

Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr

275 280 285

Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

290 295 300

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

305 310 315 320

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

325 330 335

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

340 345 350

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

370 375 380

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

385 390 395 400

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

405 410 415

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

420 425 430

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

435 440 445

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 49

<211> 484

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-161 scCAR-v3 polypeptide

<400> 49

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Ala Gly Ser Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

275 280 285

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

290 295 300

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

305 310 315 320

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

340 345 350

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

355 360 365

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

370 375 380

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

385 390 395 400

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

405 410 415

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

420 425 430

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

435 440 445

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

450 455 460

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

465 470 475 480

Leu Pro Pro Arg

<210> 50

<211> 487

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-161 scCAR-v4 polypeptide

<400> 50

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Ala Gly Ser Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

275 280 285

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

290 295 300

Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu

305 310 315 320

Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 51

<211> 670

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-161 scCAR-v5 polypeptide

<400> 51

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Ala Gly Ser Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

275 280 285

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val

290 295 300

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

305 310 315 320

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

325 330 335

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

340 345 350

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

355 360 365

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

370 375 380

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

385 390 395 400

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

405 410 415

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

420 425 430

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

435 440 445

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

450 455 460

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

465 470 475 480

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr Ile Trp

485 490 495

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

500 505 510

Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

515 520 525

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

530 535 540

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

545 550 555 560

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

565 570 575

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

580 585 590

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

595 600 605

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

610 615 620

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

625 630 635 640

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

645 650 655

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

660 665 670

<210> 52

<211> 673

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> SC02-161 scCAR-v6 polypeptide

<400> 52

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Ala Gly Ser Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

275 280 285

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val

290 295 300

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

305 310 315 320

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

325 330 335

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

340 345 350

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

355 360 365

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

370 375 380

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

385 390 395 400

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

405 410 415

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

420 425 430

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

435 440 445

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

450 455 460

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

465 470 475 480

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Ile Ser Phe

485 490 495

Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu

500 505 510

Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

515 520 525

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

530 535 540

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

545 550 555 560

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

565 570 575

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

580 585 590

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

595 600 605

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

610 615 620

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

625 630 635 640

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

645 650 655

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

660 665 670

Arg

<210> 53

<211> 458

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M26 scCAR-v1 polypeptide

<400> 53

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser

165 170 175

Leu Thr Cys Arg Ala Thr Gln Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Asn Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser

260 265 270

Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

275 280 285

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

290 295 300

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

305 310 315 320

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

325 330 335

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

340 345 350

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

370 375 380

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

385 390 395 400

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

405 410 415

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

420 425 430

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

435 440 445

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 54

<211> 461

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M26 scCAR-v2 polypeptide

<400> 54

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser

165 170 175

Leu Thr Cys Arg Ala Thr Gln Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Asn Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser

260 265 270

Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu

275 280 285

Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe

290 295 300

Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

305 310 315 320

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

325 330 335

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

340 345 350

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

355 360 365

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

370 375 380

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

385 390 395 400

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

405 410 415

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

420 425 430

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

435 440 445

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 55

<211> 487

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M26 scCAR-v3 polypeptide

<400> 55

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser

165 170 175

Leu Thr Cys Arg Ala Thr Gln Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Asn Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 56

<211> 490

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M26 scCAR-v4 polypeptide

<400> 56

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser

165 170 175

Leu Thr Cys Arg Ala Thr Gln Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Asn Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr

305 310 315 320

Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 57

<211> 673

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M26 scCAR-v5 polypeptide

<400> 57

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser

165 170 175

Leu Thr Cys Arg Ala Thr Gln Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Asn Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr

260 265 270

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

275 280 285

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr

290 295 300

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

305 310 315 320

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

325 330 335

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

340 345 350

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

355 360 365

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

370 375 380

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

385 390 395 400

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

405 410 415

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

420 425 430

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

435 440 445

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

450 455 460

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

465 470 475 480

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile

485 490 495

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

500 505 510

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

515 520 525

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

530 535 540

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

545 550 555 560

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

565 570 575

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

580 585 590

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

595 600 605

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

610 615 620

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

625 630 635 640

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

645 650 655

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

660 665 670

Arg

<210> 58

<211> 676

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M26 scCAR-v6 polypeptide

<400> 58

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser

165 170 175

Leu Thr Cys Arg Ala Thr Gln Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Asn Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr

260 265 270

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

275 280 285

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr

290 295 300

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

305 310 315 320

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

325 330 335

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

340 345 350

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

355 360 365

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

370 375 380

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

385 390 395 400

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

405 410 415

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

420 425 430

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

435 440 445

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

450 455 460

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

465 470 475 480

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile

485 490 495

Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu

500 505 510

Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys

515 520 525

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

530 535 540

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

545 550 555 560

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

565 570 575

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

580 585 590

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

595 600 605

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

610 615 620

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

625 630 635 640

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

645 650 655

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

660 665 670

Leu Pro Pro Arg

675

<210> 59

<211> 463

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M31 scCAR-v1 polypeptide

<400> 59

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp

115 120 125

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile

145 150 155 160

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg

165 170 175

Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn

180 185 190

Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

195 200 205

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val

225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Tyr Asp

245 250 255

Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala

260 265 270

Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile

275 280 285

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

290 295 300

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

305 310 315 320

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

325 330 335

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

340 345 350

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

355 360 365

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

370 375 380

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

385 390 395 400

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

405 410 415

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

420 425 430

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

435 440 445

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 60

<211> 466

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M31 scCAR-v2 polypeptide

<400> 60

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp

115 120 125

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile

145 150 155 160

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg

165 170 175

Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn

180 185 190

Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

195 200 205

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val

225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Tyr Asp

245 250 255

Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala

260 265 270

Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser

275 280 285

Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe

290 295 300

Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

305 310 315 320

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

325 330 335

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

340 345 350

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

355 360 365

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

370 375 380

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

385 390 395 400

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

405 410 415

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

420 425 430

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

435 440 445

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

450 455 460

Pro Arg

465

<210> 61

<211> 492

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M31 scCAR-v3 polypeptide

<400> 61

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp

115 120 125

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile

145 150 155 160

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg

165 170 175

Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn

180 185 190

Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

195 200 205

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val

225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Tyr Asp

245 250 255

Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

275 280 285

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

290 295 300

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

305 310 315 320

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

325 330 335

Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

340 345 350

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

355 360 365

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

420 425 430

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

435 440 445

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

450 455 460

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

465 470 475 480

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 62

<211> 495

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M31 scCAR-v4 polypeptide

<400> 62

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp

115 120 125

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile

145 150 155 160

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg

165 170 175

Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn

180 185 190

Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

195 200 205

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val

225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Tyr Asp

245 250 255

Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

275 280 285

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

290 295 300

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu

305 310 315 320

Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu

325 330 335

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

340 345 350

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

355 360 365

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

370 375 380

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

385 390 395 400

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

405 410 415

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

420 425 430

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

435 440 445

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

450 455 460

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

465 470 475 480

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490 495

<210> 63

<211> 678

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M31 scCAR-v5 polypeptide

<400> 63

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp

115 120 125

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile

145 150 155 160

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg

165 170 175

Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn

180 185 190

Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

195 200 205

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val

225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Tyr Asp

245 250 255

Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys

260 265 270

Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

275 280 285

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

290 295 300

Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

305 310 315 320

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

325 330 335

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

340 345 350

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

355 360 365

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

370 375 380

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

385 390 395 400

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

405 410 415

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

420 425 430

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

435 440 445

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

450 455 460

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

465 470 475 480

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

485 490 495

Ser Pro Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

500 505 510

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

515 520 525

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

530 535 540

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

545 550 555 560

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

565 570 575

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

580 585 590

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

595 600 605

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

610 615 620

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

625 630 635 640

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

645 650 655

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

660 665 670

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675

<210> 64

<211> 681

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M31 scCAR-v6 polypeptide

<400> 64

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp

115 120 125

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile

145 150 155 160

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg

165 170 175

Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn

180 185 190

Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

195 200 205

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val

225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Tyr Asp

245 250 255

Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys

260 265 270

Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

275 280 285

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

290 295 300

Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

305 310 315 320

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

325 330 335

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

340 345 350

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

355 360 365

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

370 375 380

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

385 390 395 400

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

405 410 415

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

420 425 430

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

435 440 445

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

450 455 460

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

465 470 475 480

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

485 490 495

Ser Pro Gly Lys Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala

500 505 510

Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys

515 520 525

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

530 535 540

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

545 550 555 560

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

565 570 575

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

580 585 590

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

595 600 605

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

610 615 620

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

625 630 635 640

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

645 650 655

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

660 665 670

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675 680

<210> 65

<211> 459

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> G4 scCAR-v1 polypeptide

<400> 65

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Glu Trp Ile Gly Pro Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Ile

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ala

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Thr Asp Asp Tyr Asp Asp Tyr

115 120 125

Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile

145 150 155 160

Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg

165 170 175

Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr

195 200 205

Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp

225 230 235 240

Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Leu Trp Thr Phe

245 250 255

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile

260 265 270

Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

275 280 285

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

290 295 300

Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

305 310 315 320

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

325 330 335

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

340 345 350

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

355 360 365

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

370 375 380

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

385 390 395 400

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

405 410 415

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

420 425 430

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

435 440 445

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 66

<211> 462

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> G4 scCAR-v2 polypeptide

<400> 66

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Glu Trp Ile Gly Pro Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Ile

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ala

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Thr Asp Asp Tyr Asp Asp Tyr

115 120 125

Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile

145 150 155 160

Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg

165 170 175

Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr

195 200 205

Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp

225 230 235 240

Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Leu Trp Thr Phe

245 250 255

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile

260 265 270

Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala

275 280 285

Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg

290 295 300

Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

305 310 315 320

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

325 330 335

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

340 345 350

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

355 360 365

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

370 375 380

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

385 390 395 400

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

405 410 415

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

420 425 430

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

435 440 445

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 67

<211> 488

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> G4 scCAR-v3 polypeptide

<400> 67

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Glu Trp Ile Gly Pro Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Ile

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ala

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Thr Asp Asp Tyr Asp Asp Tyr

115 120 125

Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile

145 150 155 160

Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg

165 170 175

Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr

195 200 205

Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp

225 230 235 240

Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Leu Trp Thr Phe

245 250 255

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

305 310 315 320

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg

325 330 335

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

340 345 350

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

355 360 365

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

370 375 380

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

385 390 395 400

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

405 410 415

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

420 425 430

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

435 440 445

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

450 455 460

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

465 470 475 480

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 68

<211> 491

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> G4 scCAR-v4 polypeptide

<400> 68

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Glu Trp Ile Gly Pro Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Ile

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ala

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Thr Asp Asp Tyr Asp Asp Tyr

115 120 125

Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile

145 150 155 160

Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg

165 170 175

Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr

195 200 205

Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp

225 230 235 240

Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Leu Trp Thr Phe

245 250 255

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser

305 310 315 320

Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val

325 330 335

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

340 345 350

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

355 360 365

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

370 375 380

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

385 390 395 400

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

405 410 415

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

420 425 430

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

435 440 445

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

450 455 460

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

465 470 475 480

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 69

<211> 674

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> G4 scCAR-v5 polypeptide

<400> 69

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Glu Trp Ile Gly Pro Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Ile

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ala

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Thr Asp Asp Tyr Asp Asp Tyr

115 120 125

Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile

145 150 155 160

Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg

165 170 175

Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr

195 200 205

Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp

225 230 235 240

Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Leu Trp Thr Phe

245 250 255

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys

260 265 270

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

275 280 285

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg

290 295 300

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

305 310 315 320

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

325 330 335

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

340 345 350

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

355 360 365

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

370 375 380

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

385 390 395 400

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

405 410 415

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

420 425 430

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

435 440 445

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

450 455 460

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

465 470 475 480

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485 490 495

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

500 505 510

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

515 520 525

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

530 535 540

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

545 550 555 560

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

565 570 575

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

580 585 590

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

595 600 605

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

610 615 620

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

625 630 635 640

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

645 650 655

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

660 665 670

Pro Arg

<210> 70

<211> 677

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> G4 scCAR-v6 polypeptide

<400> 70

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Glu Trp Ile Gly Pro Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Ile

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ala

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Thr Asp Asp Tyr Asp Asp Tyr

115 120 125

Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile

145 150 155 160

Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg

165 170 175

Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr

195 200 205

Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp

225 230 235 240

Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Leu Trp Thr Phe

245 250 255

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys

260 265 270

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

275 280 285

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg

290 295 300

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

305 310 315 320

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

325 330 335

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

340 345 350

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

355 360 365

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

370 375 380

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

385 390 395 400

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

405 410 415

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

420 425 430

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

435 440 445

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

450 455 460

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

465 470 475 480

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485 490 495

Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu

500 505 510

Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys

515 520 525

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

530 535 540

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

545 550 555 560

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

565 570 575

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

580 585 590

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

595 600 605

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

610 615 620

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

625 630 635 640

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

645 650 655

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

660 665 670

Ala Leu Pro Pro Arg

675

<210> 71

<211> 464

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M22 scCAR-v1 polypeptide

<400> 71

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Glu Thr His

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Gln Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr Ala

115 120 125

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val

165 170 175

Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln

180 185 190

Lys Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

195 200 205

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg

210 215 220

Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

225 230 235 240

Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn Asp Tyr Ser

245 250 255

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Leu

260 265 270

Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr

275 280 285

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

290 295 300

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

305 310 315 320

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

325 330 335

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

340 345 350

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

355 360 365

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

370 375 380

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

385 390 395 400

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

405 410 415

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

420 425 430

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

435 440 445

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 72

<211> 467

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M22 scCAR-v2 polypeptide

<400> 72

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Glu Thr His

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Gln Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr Ala

115 120 125

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val

165 170 175

Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln

180 185 190

Lys Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

195 200 205

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg

210 215 220

Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

225 230 235 240

Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn Asp Tyr Ser

245 250 255

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Leu

260 265 270

Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile

275 280 285

Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe

290 295 300

Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

305 310 315 320

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

325 330 335

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

340 345 350

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

355 360 365

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

370 375 380

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

385 390 395 400

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

405 410 415

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

420 425 430

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

435 440 445

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

450 455 460

Pro Pro Arg

465

<210> 73

<211> 493

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M22 scCAR-v3 polypeptide

<400> 73

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Glu Thr His

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Gln Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr Ala

115 120 125

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val

165 170 175

Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln

180 185 190

Lys Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

195 200 205

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg

210 215 220

Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

225 230 235 240

Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn Asp Tyr Ser

245 250 255

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Thr Thr

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln

275 280 285

Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala

290 295 300

Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala

305 310 315 320

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

325 330 335

Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

340 345 350

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

355 360 365

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

370 375 380

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

385 390 395 400

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

405 410 415

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

420 425 430

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

435 440 445

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

450 455 460

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

465 470 475 480

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 74

<211> 496

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M22 scCAR-v4 polypeptide

<400> 74

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Glu Thr His

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Gln Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr Ala

115 120 125

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val

165 170 175

Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln

180 185 190

Lys Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

195 200 205

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg

210 215 220

Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

225 230 235 240

Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn Asp Tyr Ser

245 250 255

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Thr Thr

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln

275 280 285

Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala

290 295 300

Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe

305 310 315 320

Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr

325 330 335

Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

340 345 350

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

355 360 365

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

370 375 380

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

385 390 395 400

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

405 410 415

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

420 425 430

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

435 440 445

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

450 455 460

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

465 470 475 480

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490 495

<210> 75

<211> 679

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M22 scCAR-v5 polypeptide

<400> 75

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Glu Thr His

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Gln Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr Ala

115 120 125

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val

165 170 175

Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln

180 185 190

Lys Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

195 200 205

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg

210 215 220

Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

225 230 235 240

Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn Asp Tyr Ser

245 250 255

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Glu Pro

260 265 270

Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro

275 280 285

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

290 295 300

Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

305 310 315 320

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

325 330 335

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

340 345 350

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

355 360 365

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

370 375 380

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

385 390 395 400

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

405 410 415

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

420 425 430

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

435 440 445

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

450 455 460

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

465 470 475 480

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

485 490 495

Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

500 505 510

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

515 520 525

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

530 535 540

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

545 550 555 560

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

565 570 575

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

580 585 590

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

595 600 605

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

610 615 620

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

625 630 635 640

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

645 650 655

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

660 665 670

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675

<210> 76

<211> 682

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M22 scCAR-v6 polypeptide

<400> 76

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Glu Thr His

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Gln Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr Ala

115 120 125

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val

165 170 175

Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln

180 185 190

Lys Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

195 200 205

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg

210 215 220

Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

225 230 235 240

Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn Asp Tyr Ser

245 250 255

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Glu Pro

260 265 270

Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro

275 280 285

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

290 295 300

Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

305 310 315 320

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

325 330 335

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

340 345 350

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

355 360 365

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

370 375 380

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

385 390 395 400

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

405 410 415

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

420 425 430

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

435 440 445

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

450 455 460

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

465 470 475 480

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

485 490 495

Leu Ser Pro Gly Lys Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr

500 505 510

Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

515 520 525

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

530 535 540

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

545 550 555 560

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

565 570 575

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

580 585 590

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

595 600 605

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

610 615 620

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

625 630 635 640

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

645 650 655

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

660 665 670

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675 680

<210> 77

<211> 457

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M29 scCAR-v1 polypeptide

<400> 77

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ile Phe Thr Ser Tyr Val Met Tyr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Tyr

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val

165 170 175

Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr

195 200 205

Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile

225 230 235 240

Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser

260 265 270

Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

275 280 285

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys

290 295 300

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

305 310 315 320

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

325 330 335

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

340 345 350

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

355 360 365

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

370 375 380

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

385 390 395 400

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

405 410 415

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

420 425 430

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

435 440 445

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 78

<211> 460

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M29 scCAR-v2 polypeptide

<400> 78

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ile Phe Thr Ser Tyr Val Met Tyr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Tyr

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val

165 170 175

Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr

195 200 205

Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile

225 230 235 240

Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser

260 265 270

Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr

275 280 285

Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser

290 295 300

Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

305 310 315 320

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

325 330 335

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

340 345 350

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

355 360 365

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

370 375 380

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

385 390 395 400

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

405 410 415

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

420 425 430

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

435 440 445

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 79

<211> 486

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M29 scCAR-v3 polypeptide

<400> 79

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ile Phe Thr Ser Tyr Val Met Tyr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Tyr

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val

165 170 175

Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr

195 200 205

Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile

225 230 235 240

Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

340 345 350

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

355 360 365

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 80

<211> 489

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> M29 scCAR-v4 polypeptide

<400> 80

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ile Phe Thr Ser Tyr Val Met Tyr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Tyr

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val

165 170 175

Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr

195 200 205

Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile

225 230 235 240

Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala

305 310 315 320

Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys

325 330 335

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

340 345 350

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

355 360 365

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

420 425 430

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

435 440 445

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

450 455 460

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

465 470 475 480

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 81

<211> 672

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M29 scCAR-v5 polypeptide

<400> 81

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ile Phe Thr Ser Tyr Val Met Tyr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Tyr

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val

165 170 175

Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr

195 200 205

Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile

225 230 235 240

Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His

260 265 270

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe

275 280 285

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro

290 295 300

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

305 310 315 320

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

325 330 335

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

340 345 350

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

355 360 365

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

370 375 380

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

385 390 395 400

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

405 410 415

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

420 425 430

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

435 440 445

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

450 455 460

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

465 470 475 480

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr

485 490 495

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

500 505 510

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

515 520 525

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

530 535 540

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

545 550 555 560

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

565 570 575

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

580 585 590

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

595 600 605

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

610 615 620

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

625 630 635 640

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

645 650 655

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

660 665 670

<210> 82

<211> 675

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M29 scCAR-v6 polypeptide

<400> 82

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ile Phe Thr Ser Tyr Val Met Tyr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Ser Cys Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Tyr

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val

165 170 175

Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr

195 200 205

Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile

225 230 235 240

Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His

260 265 270

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe

275 280 285

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro

290 295 300

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

305 310 315 320

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

325 330 335

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

340 345 350

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

355 360 365

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

370 375 380

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

385 390 395 400

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

405 410 415

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

420 425 430

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

435 440 445

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

450 455 460

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

465 470 475 480

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Ile

485 490 495

Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe

500 505 510

Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

515 520 525

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

530 535 540

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

545 550 555 560

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

565 570 575

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

580 585 590

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

595 600 605

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

610 615 620

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

625 630 635 640

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

645 650 655

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

660 665 670

Pro Pro Arg

675

<210> 83

<211> 458

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M2 scCAR-v1 polypeptide

<400> 83

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser

165 170 175

Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr Leu Ser Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser

260 265 270

Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

275 280 285

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

290 295 300

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

305 310 315 320

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

325 330 335

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

340 345 350

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

370 375 380

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

385 390 395 400

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

405 410 415

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

420 425 430

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

435 440 445

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 84

<211> 461

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M2 scCAR-v2 polypeptide

<400> 84

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser

165 170 175

Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr Leu Ser Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser

260 265 270

Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu

275 280 285

Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe

290 295 300

Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

305 310 315 320

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

325 330 335

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

340 345 350

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

355 360 365

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

370 375 380

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

385 390 395 400

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

405 410 415

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

420 425 430

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

435 440 445

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 85

<211> 487

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M2 scCAR-v3 polypeptide

<400> 85

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser

165 170 175

Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr Leu Ser Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 86

<211> 490

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M2 scCAR-v4 polypeptide

<400> 86

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser

165 170 175

Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr Leu Ser Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr

305 310 315 320

Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 87

<211> 673

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M2 scCAR-v5 polypeptide

<400> 87

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser

165 170 175

Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr Leu Ser Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr

260 265 270

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

275 280 285

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr

290 295 300

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

305 310 315 320

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

325 330 335

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

340 345 350

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

355 360 365

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

370 375 380

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

385 390 395 400

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

405 410 415

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

420 425 430

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

435 440 445

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

450 455 460

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

465 470 475 480

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile

485 490 495

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

500 505 510

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

515 520 525

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

530 535 540

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

545 550 555 560

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

565 570 575

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

580 585 590

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

595 600 605

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

610 615 620

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

625 630 635 640

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

645 650 655

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

660 665 670

Arg

<210> 88

<211> 676

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M2 scCAR-v6 polypeptide

<400> 88

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser

165 170 175

Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr Leu Ser Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr

260 265 270

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

275 280 285

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr

290 295 300

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

305 310 315 320

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

325 330 335

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

340 345 350

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

355 360 365

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

370 375 380

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

385 390 395 400

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

405 410 415

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

420 425 430

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

435 440 445

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

450 455 460

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

465 470 475 480

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile

485 490 495

Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu

500 505 510

Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys

515 520 525

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

530 535 540

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

545 550 555 560

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

565 570 575

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

580 585 590

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

595 600 605

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

610 615 620

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

625 630 635 640

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

645 650 655

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

660 665 670

Leu Pro Pro Arg

675

<210> 89

<211> 457

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M5scCAR-v1 polypeptide

<400> 89

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Ile Lys Asp Asp Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Lys Gly Asp Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Ala Ser Lys Phe Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser

145 150 155 160

Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser

165 170 175

Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Asn Leu Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala

195 200 205

Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser

260 265 270

Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

275 280 285

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys

290 295 300

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

305 310 315 320

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

325 330 335

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

340 345 350

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

355 360 365

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

370 375 380

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

385 390 395 400

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

405 410 415

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

420 425 430

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

435 440 445

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 90

<211> 460

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M5 scCAR-v2 polypeptide

<400> 90

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Ile Lys Asp Asp Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Lys Gly Asp Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Ala Ser Lys Phe Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser

145 150 155 160

Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser

165 170 175

Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Asn Leu Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala

195 200 205

Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser

260 265 270

Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr

275 280 285

Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser

290 295 300

Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

305 310 315 320

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

325 330 335

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

340 345 350

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

355 360 365

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

370 375 380

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

385 390 395 400

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

405 410 415

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

420 425 430

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

435 440 445

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 91

<211> 486

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M5 scCAR-v3 polypeptide

<400> 91

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Ile Lys Asp Asp Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Lys Gly Asp Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Ala Ser Lys Phe Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser

145 150 155 160

Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser

165 170 175

Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Asn Leu Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala

195 200 205

Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

340 345 350

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

355 360 365

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 92

<211> 489

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M5 scCAR-v4 polypeptide

<400> 92

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Ile Lys Asp Asp Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Lys Gly Asp Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Ala Ser Lys Phe Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser

145 150 155 160

Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser

165 170 175

Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Asn Leu Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala

195 200 205

Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala

305 310 315 320

Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys

325 330 335

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

340 345 350

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

355 360 365

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

420 425 430

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

435 440 445

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

450 455 460

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

465 470 475 480

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 93

<211> 672

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M5 scCAR-v5 polypeptide

<400> 93

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Ile Lys Asp Asp Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Lys Gly Asp Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Ala Ser Lys Phe Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser

145 150 155 160

Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser

165 170 175

Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Asn Leu Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala

195 200 205

Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His

260 265 270

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe

275 280 285

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro

290 295 300

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

305 310 315 320

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

325 330 335

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

340 345 350

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

355 360 365

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

370 375 380

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

385 390 395 400

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

405 410 415

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

420 425 430

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

435 440 445

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

450 455 460

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

465 470 475 480

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr

485 490 495

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

500 505 510

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

515 520 525

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

530 535 540

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

545 550 555 560

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

565 570 575

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

580 585 590

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

595 600 605

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

610 615 620

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

625 630 635 640

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

645 650 655

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

660 665 670

<210> 94

<211> 675

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> M5 scCAR-v6 polypeptide

<400> 94

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Ile Lys Asp Asp Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Lys Gly Asp Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Ala Ser Lys Phe Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser

145 150 155 160

Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser

165 170 175

Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Asn Leu Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala

195 200 205

Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His

260 265 270

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe

275 280 285

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro

290 295 300

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

305 310 315 320

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

325 330 335

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

340 345 350

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

355 360 365

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

370 375 380

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

385 390 395 400

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

405 410 415

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

420 425 430

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

435 440 445

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

450 455 460

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

465 470 475 480

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Ile

485 490 495

Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe

500 505 510

Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

515 520 525

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

530 535 540

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

545 550 555 560

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

565 570 575

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

580 585 590

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

595 600 605

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

610 615 620

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

625 630 635 640

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

645 650 655

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

660 665 670

Pro Pro Arg

675

<210> 95

<211> 461

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> G12 scCAR-v1 polypeptide

<400> 95

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Pro Ser Ser Asn Ile His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Ile Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Val Tyr Asn Trp His Phe Asp

115 120 125

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ile Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile

165 170 175

Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe Met

180 185 190

Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

Phe Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp

225 230 235 240

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

245 250 255

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Leu Ala Val Ser

260 265 270

Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala

275 280 285

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

290 295 300

Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

305 310 315 320

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

325 330 335

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

340 345 350

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

355 360 365

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

370 375 380

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

385 390 395 400

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

405 410 415

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

420 425 430

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

435 440 445

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 96

<211> 464

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> G12 scCAR-v2 polypeptide

<400> 96

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Pro Ser Ser Asn Ile His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Ile Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Val Tyr Asn Trp His Phe Asp

115 120 125

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ile Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile

165 170 175

Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe Met

180 185 190

Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

Phe Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp

225 230 235 240

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

245 250 255

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Leu Ala Val Ser

260 265 270

Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr

290 295 300

Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

305 310 315 320

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

325 330 335

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

340 345 350

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

355 360 365

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

370 375 380

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

385 390 395 400

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

405 410 415

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

420 425 430

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

435 440 445

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 97

<211> 490

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> G12 scCAR-v3 polypeptide

<400> 97

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Pro Ser Ser Asn Ile His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Ile Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Val Tyr Asn Trp His Phe Asp

115 120 125

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ile Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile

165 170 175

Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe Met

180 185 190

Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

Phe Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp

225 230 235 240

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

245 250 255

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 98

<211> 493

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> G12 scCAR-v4 polypeptide

<400> 98

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Pro Ser Ser Asn Ile His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Ile Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Val Tyr Asn Trp His Phe Asp

115 120 125

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ile Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile

165 170 175

Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe Met

180 185 190

Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

Phe Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp

225 230 235 240

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

245 250 255

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu

305 310 315 320

Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe

325 330 335

Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

340 345 350

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

355 360 365

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

370 375 380

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

385 390 395 400

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

405 410 415

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

420 425 430

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

435 440 445

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

450 455 460

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

465 470 475 480

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 99

<211> 676

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> G12 scCAR-v5 polypeptide

<400> 99

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Pro Ser Ser Asn Ile His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Ile Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Val Tyr Asn Trp His Phe Asp

115 120 125

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ile Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile

165 170 175

Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe Met

180 185 190

Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

Phe Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp

225 230 235 240

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

245 250 255

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu Pro Lys Ser Pro

260 265 270

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

275 280 285

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

290 295 300

Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

305 310 315 320

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

325 330 335

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

340 345 350

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

355 360 365

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

370 375 380

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

385 390 395 400

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

405 410 415

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

420 425 430

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

435 440 445

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

450 455 460

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

465 470 475 480

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

485 490 495

Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

500 505 510

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

515 520 525

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

530 535 540

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

545 550 555 560

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

565 570 575

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

580 585 590

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

595 600 605

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

610 615 620

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

625 630 635 640

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

645 650 655

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

660 665 670

Leu Pro Pro Arg

675

<210> 100

<211> 679

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> G12 scCAR-v6 polypeptide

<400> 100

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Pro Ser Ser Asn Ile His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Ile Tyr Phe Ser Cys Cys Ala Arg Val Tyr Asn Trp His Phe Asp

115 120 125

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ile Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile

165 170 175

Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe Met

180 185 190

Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

Phe Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp

225 230 235 240

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

245 250 255

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu Pro Lys Ser Pro

260 265 270

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

275 280 285

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

290 295 300

Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

305 310 315 320

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

325 330 335

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

340 345 350

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

355 360 365

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

370 375 380

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

385 390 395 400

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

405 410 415

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

420 425 430

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

435 440 445

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

450 455 460

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

465 470 475 480

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

485 490 495

Gly Lys Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu

500 505 510

Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly

515 520 525

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

530 535 540

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

545 550 555 560

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

565 570 575

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

580 585 590

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

595 600 605

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

610 615 620

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

625 630 635 640

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

645 650 655

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

660 665 670

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675

<210> 101

<211> 456

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 21.26 scCAR-v1 polypeptide

<400> 101

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile His Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu

145 150 155 160

Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

165 170 175

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Ala Thr Ser Asn

195 200 205

Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asp Arg Ala Leu Thr Phe Gly Ala

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Leu Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe

260 265 270

Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

275 280 285

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg

290 295 300

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

305 310 315 320

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

325 330 335

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

340 345 350

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

355 360 365

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

370 375 380

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

405 410 415

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

420 425 430

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

435 440 445

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 102

<211> 459

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 21.26 scCAR-v2 polypeptide

<400> 102

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile His Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu

145 150 155 160

Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

165 170 175

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Ala Thr Ser Asn

195 200 205

Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asp Arg Ala Leu Thr Phe Gly Ala

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Leu Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe

260 265 270

Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser

275 280 285

Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val

290 295 300

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

305 310 315 320

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

325 330 335

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

340 345 350

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

355 360 365

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

370 375 380

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

385 390 395 400

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

405 410 415

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

420 425 430

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

435 440 445

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 103

<211> 485

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 21.26 scCAR-v3 polypeptide

<400> 103

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile His Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu

145 150 155 160

Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

165 170 175

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Ala Thr Ser Asn

195 200 205

Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asp Arg Ala Leu Thr Phe Gly Ala

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

305 310 315 320

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

325 330 335

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

340 345 350

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

370 375 380

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

420 425 430

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

435 440 445

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 104

<211> 488

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 21.26 scCAR-v4 polypeptide

<400> 104

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile His Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu

145 150 155 160

Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

165 170 175

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Ala Thr Ser Asn

195 200 205

Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asp Arg Ala Leu Thr Phe Gly Ala

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu

305 310 315 320

Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg

325 330 335

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

340 345 350

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

355 360 365

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

370 375 380

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

385 390 395 400

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

405 410 415

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

420 425 430

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

435 440 445

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

450 455 460

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

465 470 475 480

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 105

<211> 671

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 21.26 scCAR-v5 polypeptide

<400> 105

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile His Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu

145 150 155 160

Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

165 170 175

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Ala Thr Ser Asn

195 200 205

Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asp Arg Ala Leu Thr Phe Gly Ala

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Leu Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr

260 265 270

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu

275 280 285

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu

290 295 300

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

305 310 315 320

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

325 330 335

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

340 345 350

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

355 360 365

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

370 375 380

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

385 390 395 400

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

405 410 415

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

420 425 430

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

435 440 445

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

450 455 460

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

465 470 475 480

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr Ile

485 490 495

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

500 505 510

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

515 520 525

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

530 535 540

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

545 550 555 560

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

565 570 575

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

580 585 590

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

595 600 605

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

610 615 620

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

625 630 635 640

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

645 650 655

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

660 665 670

<210> 106

<211> 674

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 21.26 scCAR-v6 polypeptide

<400> 106

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile His Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu

145 150 155 160

Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr

165 170 175

Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Ala Thr Ser Asn

195 200 205

Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asp Arg Ala Leu Thr Phe Gly Ala

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Leu Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr

260 265 270

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu

275 280 285

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu

290 295 300

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

305 310 315 320

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

325 330 335

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

340 345 350

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

355 360 365

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

370 375 380

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

385 390 395 400

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

405 410 415

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

420 425 430

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

435 440 445

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

450 455 460

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

465 470 475 480

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Ile Ser

485 490 495

Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe

500 505 510

Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

515 520 525

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

530 535 540

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

545 550 555 560

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

565 570 575

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

580 585 590

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

595 600 605

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

610 615 620

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

625 630 635 640

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

645 650 655

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

660 665 670

Pro Arg

<210> 107

<211> 460

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 1075.7 scCAR-v1 polypeptide

<400> 107

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly

50 55 60

Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr

115 120 125

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu

165 170 175

Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr

180 185 190

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile

195 200 205

Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala

225 230 235 240

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu

245 250 255

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Gly Leu Ala Val Ser Thr

260 265 270

Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

290 295 300

Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

305 310 315 320

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

325 330 335

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

340 345 350

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

355 360 365

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

370 375 380

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

385 390 395 400

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

405 410 415

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

420 425 430

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

435 440 445

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 108

<211> 463

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 1075.7 scCAR-v2 polypeptide

<400> 108

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly

50 55 60

Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr

115 120 125

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu

165 170 175

Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr

180 185 190

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile

195 200 205

Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala

225 230 235 240

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu

245 250 255

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Gly Leu Ala Val Ser Thr

260 265 270

Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu

275 280 285

Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu

290 295 300

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

305 310 315 320

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

325 330 335

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

340 345 350

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

355 360 365

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

370 375 380

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

385 390 395 400

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

405 410 415

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

420 425 430

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

435 440 445

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 109

<211> 489

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 1075.7 scCAR-v3 polypeptide

<400> 109

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly

50 55 60

Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr

115 120 125

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu

165 170 175

Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr

180 185 190

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile

195 200 205

Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala

225 230 235 240

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu

245 250 255

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro

260 265 270

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

275 280 285

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

290 295 300

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

305 310 315 320

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys

325 330 335

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

340 345 350

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

355 360 365

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

420 425 430

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

435 440 445

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

450 455 460

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

465 470 475 480

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 110

<211> 492

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 1075.7 scCAR-v4 polypeptide

<400> 110

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly

50 55 60

Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr

115 120 125

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu

165 170 175

Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr

180 185 190

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile

195 200 205

Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala

225 230 235 240

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu

245 250 255

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro

260 265 270

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

275 280 285

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

290 295 300

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr

305 310 315 320

Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser

325 330 335

Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

340 345 350

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

355 360 365

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

420 425 430

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

435 440 445

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

450 455 460

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

465 470 475 480

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 111

<211> 675

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 1075.7 scCAR-v5 polypeptide

<400> 111

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly

50 55 60

Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr

115 120 125

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu

165 170 175

Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr

180 185 190

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile

195 200 205

Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala

225 230 235 240

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu

245 250 255

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Glu Pro Lys Ser Pro Asp

260 265 270

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro

275 280 285

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala

290 295 300

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

305 310 315 320

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

325 330 335

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

340 345 350

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

355 360 365

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

370 375 380

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

385 390 395 400

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

405 410 415

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

420 425 430

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

435 440 445

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

450 455 460

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

465 470 475 480

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

485 490 495

Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu

500 505 510

Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

515 520 525

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

530 535 540

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

545 550 555 560

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

565 570 575

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

580 585 590

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

595 600 605

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

610 615 620

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

625 630 635 640

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

645 650 655

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

660 665 670

Pro Pro Arg

675

<210> 112

<211> 678

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> 1075.7 scCAR-v6 polypeptide

<400> 112

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly

50 55 60

Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr

115 120 125

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu

165 170 175

Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr

180 185 190

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile

195 200 205

Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala

225 230 235 240

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu

245 250 255

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Glu Pro Lys Ser Pro Asp

260 265 270

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro

275 280 285

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala

290 295 300

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

305 310 315 320

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

325 330 335

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

340 345 350

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

355 360 365

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

370 375 380

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

385 390 395 400

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

405 410 415

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

420 425 430

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

435 440 445

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

450 455 460

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

465 470 475 480

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

485 490 495

Lys Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe

500 505 510

Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg

515 520 525

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

530 535 540

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

545 550 555 560

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

565 570 575

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

580 585 590

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

595 600 605

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

610 615 620

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

625 630 635 640

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

645 650 655

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

660 665 670

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675

<210> 113

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CD20 mimotope

<400> 113

Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser

1 5 10

<210> 114

<211> 49

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Target TALEN TRAC_T01

<400> 114

ttgtcccaca gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgaga 49

<210> 115

<211> 530

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> TAL binding domain TRAC_T01-L

<400> 115

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 116

<211> 530

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> TAL binding domain TRAC_T01-R

<400> 116

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 117

<211> 2814

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> polynucleotide encoding TRAC_T01-L TALEN

<400> 117

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 600

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1260

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1560

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 118

<211> 2832

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> polynucleotide encoding TRAC_T01-R TALEN

<400> 118

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 660

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 840

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1260

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1440

atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1680

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1860

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 119

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of SC02-357 heavy chain variable region

<400> 119

Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser

1 5 10

<210> 120

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of SC02-357 heavy chain variable region

<400> 120

Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asp Tyr

1 5 10

<210> 121

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of SC02-357 heavy chain variable region

<400> 121

Lys Val Ser Thr Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 122

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of SC02-378 heavy chain variable region

<400> 122

Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser

1 5 10

<210> 123

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of SC02-378 heavy chain variable region

<400> 123

Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr

1 5 10

<210> 124

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of SC02-378 heavy chain variable region

<400> 124

Arg Ser Ser Ser Gly Gly Phe Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 125

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of SC02-161 heavy chain variable region

<400> 125

Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser

1 5 10

<210> 126

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of SC02-161 heavy chain variable region

<400> 126

Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr

1 5 10

<210> 127

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of SC02-161 heavy chain variable region

<400> 127

Arg Gln Thr Thr Ala Gly Ser Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 128

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of SC02-357 & SC02-378 & SC02-161 light chain variable region

<400> 128

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5

<210> 129

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of SC02-357 & SC02-378 & SC02-161 light chain variable region

<400> 129

Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5 10

<210> 130

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of SC02-357 & SC02-378 & SC02-161 light chain variable region

<400> 130

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

1 5

<210> 131

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of M26 heavy chain variable region

<400> 131

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Ile His

1 5 10

<210> 132

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of M26 heavy chain variable region

<400> 132

Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr

1 5 10

<210> 133

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of M26 heavy chain variable region

<400> 133

Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 134

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of M26 light chain variable region

<400> 134

Gln Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser

1 5

<210> 135

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of M26 light chain variable region

<400> 135

Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser

1 5 10

<210> 136

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of M26 light chain variable region

<400> 136

Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr

1 5

<210> 137

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of M31 heavy chain variable region

<400> 137

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His

1 5 10

<210> 138

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of M31 heavy chain variable region

<400> 138

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr

1 5 10

<210> 139

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of M31 heavy chain variable region

<400> 139

Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Asn Asp Tyr

1 5 10

<210> 140

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of M31 light chain variable region

<400> 140

Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His

1 5 10

<210> 141

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of M31 light chain variable region

<400> 141

Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5 10

<210> 142

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of M31 light chain variable region

<400> 142

Gln Gln Asn Asn Tyr Asp Pro Trp

1 5

<210> 143

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of G4 heavy chain variable region

<400> 143

Gln Gln Asn Asn Tyr Asp Pro Trp

1 5

<210> 144

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of G4 heavy chain variable region

<400> 144

Trp Ile Gly Pro Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Ile Tyr

1 5 10

<210> 145

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of G4 heavy chain variable region

<400> 145

Ala Arg Thr Asp Asp Tyr Asp Asp Tyr Thr Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 146

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of G4 light chain variable region

<400> 146

His Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5

<210> 147

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of G4 light chain variable region

<400> 147

Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5 10

<210> 148

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of G4 light chain variable region

<400> 148

Gln Gln Gly Lys Thr Leu Leu Trp

1 5

<210> 149

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of M22 heavy chain variable region

<400> 149

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 150

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of M22 heavy chain variable region

<400> 150

Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Glu Thr His Tyr

1 5 10

<210> 151

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of M22 heavy chain variable region

<400> 151

Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 152

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of M22 light chain variable region

<400> 152

Gln Asn Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Lys Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 153

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of M22 light chain variable region

<400> 153

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5 10

<210> 154

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of M22 light chain variable region

<400> 154

Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe

1 5

<210> 155

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of M29 heavy chain variable region

<400> 155

Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Val Met Tyr

1 5 10

<210> 156

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of M29 heavy chain variable region

<400> 156

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr

1 5

<210> 157

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of M29 heavy chain variable region

<400> 157

Ala Arg Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 158

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of M29 light chain variable region

<400> 158

Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala

1 5

<210> 159

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of M29 light chain variable region

<400> 159

Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro

1 5 10

<210> 160

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of M29 light chain variable region

<400> 160

Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp

1 5

<210> 161

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of M2 heavy chain variable region

<400> 161

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Met His

1 5 10

<210> 162

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of M2 heavy chain variable region

<400> 162

Trp Ile Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr

1 5 10

<210> 163

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of M2 heavy chain variable region

<400> 163

Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 164

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of M2 light chain variable region

<400> 164

Gln Glu Ile Ser Val Tyr Leu Ser

1 5

<210> 165

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of M2 light chain variable region

<400> 165

Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser

1 5 10

<210> 166

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of M2 light chain variable region

<400> 166

Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr

1 5

<210> 167

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of M5 heavy chain variable region

<400> 167

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp Tyr Ile His

1 5 10

<210> 168

<211> 16

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of M5 heavy chain variable region

<400> 168

Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Lys Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Ser

1 5 10 15

<210> 169

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of M5 heavy chain variable region

<400> 169

Thr Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr

1 5

<210> 170

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of M5 light chain variable region

<400> 170

Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 171

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of M5 light chain variable region

<400> 171

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5 10

<210> 172

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of M5 light chain variable region

<400> 172

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg

1 5

<210> 173

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of G12 heavy chain variable region

<400> 173

Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Ser Asn Ile His

1 5 10

<210> 174

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of G12 heavy chain variable region

<400> 174

Trp Ile Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr

1 5 10

<210> 175

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of G12 heavy chain variable region

<400> 175

Ala Ile Tyr Phe Val Tyr Asn Trp His Phe Asp Val

1 5 10

<210> 176

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of G12 light chain variable region

<400> 176

Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe Met Leu

1 5 10

<210> 177

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of G12 light chain variable region

<400> 177

Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5 10

<210> 178

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of G12 light chain variable region

<400> 178

Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr

1 5

<210> 179

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of 21.26 heavy chain variable region

<400> 179

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 180

<211> 16

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of 21.26 heavy chain variable region

<400> 180

Met Ile His Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Val Lys

1 5 10 15

<210> 181

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of 21.26 heavy chain variable region

<400> 181

Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Asp Tyr

1 5 10

<210> 182

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of 21.26 light chain variable region

<400> 182

Arg Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His

1 5 10

<210> 183

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of 21.26 light chain variable region

<400> 183

Pro Trp Ile Phe Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5 10

<210> 184

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of 21.26 light chain variable region

<400> 184

Gln Gln Trp Arg Ser Asp Arg Ala Leu Thr

1 5 10

<210> 185

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of 1075.7 heavy chain variable region

<400> 185

Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn

1 5 10

<210> 186

<211> 16

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of 1075.7 heavy chain variable region

<400> 186

Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn

1 5 10 15

<210> 187

<211> 16

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of 1075.7 heavy chain variable region

<400> 187

Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 188

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR1 of 1075.7 light chain variable region

<400> 188

Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser Tyr Val His

1 5 10

<210> 189

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR2 of 1075.7 light chain variable region

<400> 189

Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5 10

<210> 190

<211> 9

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> CDR3 of 1075.7 light chain variable region

<400> 190

Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 191

<211> 24

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Epitope for palivizumab

<400> 191

Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp

1 5 10 15

Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn

<210> 192

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Mimotope 1 for cetuximab

<400> 192

Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys

1 5 10

<210> 193

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Mimotope 2 for cetuximab

<400> 193

Cys Gln Tyr Asn Leu Ser Ser Arg Ala Leu Lys Cys

1 5 10

<210> 194

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Mimotope 3 for cetuximab

<400> 194

Cys Val Trp Gln Arg Trp Gln Lys Ser Tyr Val Cys

1 5 10

<210> 195

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Mimotope 4 for cetuximab

<400> 195

Cys Met Trp Asp Arg Phe Ser Arg Trp Tyr Lys Cys

1 5 10

<210> 196

<211> 25

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Epitope 1 for nivolumab

<400> 196

Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp

1 5 10 15

Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg

20 25

<210> 197

<211> 19

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Epitope 2 for nivolumab

<400> 197

Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln

1 5 10 15

Ile Lys Glu

<210> 198

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Epitope 1 for CD34

<400> 198

Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu Thr

1 5 10

<210> 199

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Epitope 2 for CD34

<400> 199

Asn Thr Asn Ser Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser

1 5 10

<---

1. CLL1-специфический химерный антигенный рецептор (анти-CLL1 CAR), который содержит по меньшей мере:

- внеклеточный лигандсвязывающий домен анти-CLL1, который содержит фрагмент одноцепочечного антитела (scFv), содержащий вариабельные фрагменты тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей анти-CLL1 моноклонального антитела, связанные гибким линкером, в котором указанный VH содержит CDRs с SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132 и SEQ ID NO: 133 и указанный VL содержит CDRs с SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135 и SEQ ID NO: 136, или в котором указанный VH содержит CDRs с SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162 и SEQ ID NO: 163 и указанный VL содержит CDRs с SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165 и SEQ ID NO: 166 соответственно,

- шарнир, выбранный из шарниров FcγRIIIα, CD8α или IgG1,

- CD8α трансмембранный домен,

- цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3-дзета и костимуляторный домен 4-1 ВВ или CD28.

2. CLL1-специфический CAR по п.1, в котором указанный CAR содержит шарнир FcγRIIIα.

3. CLL1-специфический CAR по п.1, в котором указанный CAR содержит шарнир CD8α.

4. CLL1-специфический CAR по п.1, в котором указанный CAR содержит шарнир IgG1.

5. CLL1-специфический CAR по одному из пп.1-4, в котором указанный VH имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 15 и указанный VL - полипептидную последовательность SEQ ID NO: 16; или в котором указанная VH имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 25 и указанный VL - полипептидную последовательность SEQ ID NO: 26 соответственно.

6. CLL1-специфический CAR по одному из пп.1-5, в котором костимуляторный домен из 4-1 ВВ имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 8.

7. CLL1-специфический CAR по одному из пп.1-6, в котором указанный сигнальный домен CD3-дзета имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 9.

8. CLL1-специфический CAR по п.1 или 2, в котором указанный шарнир FcγRIIIα имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 3.

9. CLL1-специфический CAR по одному из пп.1 или 3, в котором указанный шарнир CD8α имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 4.

10. CLL1-специфический CAR по п.1 или 4, в котором указанный шарнир IgG1 имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 5.

11. CLL1-специфический CAR по одному из пп.1-10, в котором указанный трансмембранный домен CD8α имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 6.

12. CLL1-специфический CAR по п.1, который содержит полипептидную последовательность SEQ ID NO: 53 или 83.

13. CLL1-специфический CAR по п.1, который содержит полипептидную последовательность SEQ ID NO: 55 или 85.

14. CLL1-специфический CAR по п.1, который содержит полипептидную последовательность SEQ ID NO: 57 или 87.

15. CLL1-специфический CAR по одному из пп.1-11, дополнительно содержащий сигнальный пептид.

16. CLL1-специфический CAR по п.15, в котором указанный сигнальный пептид имеет последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

17. CLL1-специфический CAR по одному из пп.1-11, в котором внеклеточный связывающий домен включает по меньшей мере один мимеотоп CD20.

18. CLL1-специфический CAR по п.17, в котором мимеотоп CD20 специфически распознается ритуксимабом.

19. CLL1-специфический CAR по п.17 или 18, в котором мимеотоп CD20 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113.

20. CLL1-специфический CAR по одному из пп.1-11, в котором внеклеточный связывающий домен содержит следующую последовательность

V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп 1 -(L)_x-;

V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-;

V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-эпитоп4-(L)_x-;

(L)_x- эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_x- эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-3эпитоп4-(L)_x-;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-эпитоп4-(L)_x;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₂; или

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x;

где

V₁ обозначает V_L и V₂ обозначает V_H или V₁ обозначает V_H и V₂ обозначает V_L; L₁ обозначает линкер, который можно применять для связи V_H-цепи с V_L-цепью; L обозначает линкер, содержащий глициновые и сериновые остатки, и каждый из присутствующих во внеклеточном связывающем домене L может быть идентичен или отличаться от другого L, присутствующего в том же самом внеклеточном связывающем домене, и

x обозначает 0 или 1 и каждый из присутствующих x выбирают независимо от других; и

эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 4 представляют собой МАт-специфические эпитопы, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113, и эпитоп 3, выбранный из МАт-специфических эпитопов, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 198 или SEQ ID NO: 199.

21. CLL1-специфический CAR по п.20, в котором эпитоп 1, эпитоп 2 и эпитоп 4 представляют собой МАт-специфические эпитопы, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113, и эпитоп 3 представляет собой МАт-специфический эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 198 или SEQ ID NO: 199.

22. CLL1-специфический CAR по п.20 или 21, в котором L₁ обозначает линкер, содержащий глицин и/или серин.

23. CLL1-специфический CAR по п.22, в котором L₁ обозначает линкер, содержащий аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)_n или (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n, где n обозначает 1, 2, 3, 4 или 5.

24. CLL1-специфический CAR по п.23, в котором L₁ обозначает линкер, содержащий аминокислотную последовательность (Gly₄Ser)₄ или (Gly₄Ser)₃.

25. CLL1-специфический CAR по любому из пп.20-24, в котором L обозначает линкер, содержащий глицин и/или серин.

26. CLL1-специфический CAR по п.25, в котором L обозначает линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS или SGGGGSGGGGS.

27. CLL1-специфический CAR по п.26, в котором L обозначает SGGGG, GGGGS или SGGGGS.

28. Полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор по любому из пп.1-27.

29. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п.28.

30. Сконструированная Т-клетка, трансдуцированная экспрессионным вектором по п.29 и экспрессирующая на поверхности клеточной мембраны анти-CLL1 CAR по любому из пп.1-27.

31. Сконструированная Т-клетка по п.30, происходящая из воспалительных Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или хелперных Т-лимфоцитов.

32. Сконструированная Т-клетка по любому из пп.30 или 31, где экспрессия TCR подавляется в указанной Т-клетке.

33. Сконструированная Т-клетка по любому из пп.30-32, где экспрессия по меньшей мере одного белка ГКГС, предпочтительно β2m или HLA, ингибируется или подавляется в указанной Т-клетке.

34. Сконструированная Т-клетка по любому из пп.30-33, где указанная Т-клетка изменена в результате мутации для придания устойчивости по меньшей мере к одному иммуносупрессорному или химиотерапевтическому лекарственному средству.

35. Сконструированная Т-клетка по любому из пп.30-34 для применения в терапии пациента, которым является человек и у которого диагностировали предзлокачественное или состояние, связанное со злокачественным раком, отличающееся присутствием экспрессирующих CLL1 клеток.

36. Сконструированная Т-клетка для применения по п.35, где состояние отличается избыточным количеством экспрессирующих CLL1 клеток.

37. Сконструированная Т-клетка для применения по п.35 или 36, где состояние представляет собой связанное с гематологическим раком состояние.

38. Сконструированная Т-клетка для применения по п.37, где связанное с гематологическим раком состояние представляет собой лейкоз.

39. Сконструированная Т-клетка для применения по п.38, где лейкоз представляет собой острый миогенный лейкоз (AML).

40. Способ конструирования Т-клетки, включающий:

(а) получение Т-клетки,

(б) интродукцию в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, который кодирует по меньшей мере один CLL1-специфический химерный антигенный рецептор по одному из пп.1-27,

(в) экспрессию указанного полинуклеотида в указанной клетке.

41. Способ конструирования Т-клетки по п.40, в котором указанная сконструированная Т-клетка экспрессирует на поверхности по меньшей мере один CLL1-специфический химерный антигенный рецептор по одному из пп.1-27.

42. Способ конструирования Т-клетки по п.40, включающий:

(а) получение Т-клетки,

(в) интродукцию по меньшей мере одного другого полинуклеотида, кодирующего химерный антигенный рецептор, не специфический в отношении CLL1.

43. Способ лечения пациента, у которого диагностировали предзлокачественное или состояние, связанное со злокачественным раком, отличающееся присутствием экспрессирующих CLL1 клеток, включающий:

(а) получение Т-клетки, экспрессирующей на поверхности анти-CLL1 специфический химерный антигенный рецептор по одному из пп.1-27;

(б) введение указанных Т-клеток указанному пациенту.

44. Способ по п.43, в котором Т-клетку получают из организма донора.

45. Способ по п.43, в котором указанную Т-клетку получают из организма самого пациента.

Похожие патенты: