Иммуностимулирующие композиции

Группа изобретений относится к медицине и касается иммуностимулирующей композиции, содержащей макромолекулу меланина, находящуюся в комплексе с антигеном, где меланин представляет собой эумеланин или феомеланин. Группа изобретений также касается применения меланина или предшественника меланина для получения иммуностимулирующей композиции, предназначенной для вызова клеточного и/или гуморального иммунного ответа против антигена при введении в организм хозяина; способа получения указанной иммуностимулирующей композиции. Группа изобретений обеспечивает формирование специфического клеточного и гуморального иммунного ответа. 5 н. и 17 з.п. ф-лы, 15 ил., 3 табл., 20 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области иммунологии, в частности, к области адъювантов, т.е. элементов, которые потенцируют иммуногенное свойство антигенов, и является применимым, в частности, в области вакцин, как профилактических, так и терапевтических.

Исторические вакцины были основаны на живых ослабленных патогенах, целых инактивированных организмах и модифицированных токсинах. Чтобы ограничить возможные побочные эффекты, недавние разработки были сконцентрированы на субъединичных вакцинах, которые, как правило, состоят из 30-60 аминокислот, но могут ограничиваться одним эпитопом с длиной всего из 8 аминокислот. Применение небольшой части антигена ограничивает риск потенциальной перекрестной реактивности посредством направления иммунного ответа против желательной части антигена. Однако, субъединичные вакцины, и, в особенности, пептидные субъединичные вакцины, часто бывают слабо иммуногенными, вследствие отсутствия производных от патогена молекул, действующих как сигналы об опасности. Субъединичным вакцинам, таким образом, чтобы быть эффективными, требуются дополнительные адъюванты (Fujita et al, Chem Cent J. 2011;5(1):48; Azmi et al, Hum Vaccin Immunother. 2014;10(3):778-96).

Механизмы, посредством которых адъюванты проявляют свои иммуноусиливающие воздействия, являются различными (Siegrist 2007, Vaccines, Plotkin, Orenstein & Offit, Elsevier; Azmi et al 2014, op. cit.), и могут основываться, среди прочего, на следующих активностях:

- Презентирование антигенов в иммунной системе оптимальным образом; например, посредством перемещения антигенов в лимфатические узлы, посредством обеспечения антигенам физической защиты против разрушения и/или депо-эффекта, которые обеспечивают пролонгированную доставку антигена, и посредством увеличения захвата антигена иммунными клетками.

- Активация иммунной системы; например, посредством активации рецепторов распознавания структур (PRR), экспрессируемых на иммунных клетках и в них. Рецепторы распознавания структур (PRR) врожденной иммунной системы распознают консервативные ассоциированные с патогеном молекулярные структуры и ассоциированные с опасностью молекулярные структуры. Было идентифицировано несколько PRR, таких как толл-подобные рецепторы (TLR), нуклеотидсвязывающий олигомерный домен (NOD)-подобные рецепторы (NLR), ген индуцируемый ретиноевой кислотой (RIG)-подобные рецепторы (RLR), ДНК-рецепторы, скэвенджер-рецепторы, и лектиновые рецепторы C-типа (CLR) (Siegrist 2007 op.cit.; Conniot et al, Front Chem 2014;2:105). Активация PRR приводит к выработке провоспалительных цитокинов, но также активирует антиген-презентирующие клетки (APC), такие как дендритные клетки (DC) и макрофаги для запуска адаптивного иммунного ответа (Maisonneuve et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111(34):12294-9).

Некоторые адъюванты активируют либо секрецию антител B-лимфоцитами (гуморальный ответ) или ответ цитотоксических T-лимфоцитов (CTL; также именуемых как CD8 T-клетки) (клеточный ответ), и их обоих. B-лимфоциты распознают длинные пептиды, начиная с длины, составляющей около 15 аминокислот, презентируемые на поверхности антигенпрезентирующей клетки (APC) посредством молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II. Цитотоксические T-лимфоциты распознают короткие пептиды из восьми-десяти аминокислотных остатков, презентируемые на поверхности APC, и клетки-мишени, посредством молекул MHC класса I. Основной путь процессинга для презентирования в случае MHC класса I включает деградацию цитозольных белков. В некоторых случаях, внеклеточные растворимые антигены и пептиды, обычно презентируемые MHC класса II, презентируются MHC класса I, посредством процесса, называемого перекрестным презентированием (Foged et al., Eur J Pharm Sci. 2012 Mar 12;45(4):482-91). Разрешение на перекрестное презентирование посредством DC может инициироваться CD4+ T-клетками (CD40:CD40L лигирование) или, путем, независимым от CD4+ T-клеток, через лигирование врожденных PPR, таких как TLR (в основном, TLR3, TLR7/8 и TLR9) (Foged et al., op.cit.). Как для клеточного, так и гуморального иммунного ответов также требуются T-хелперные клетки (TH-клетки; также называемые CD4 T-клетками) для активации антигенпрезентирующих клеток (так называемый “второй сигнал”). Следовательно, компоненты вакцины обычно содержат по меньшей мере два антигенных эпитопа: антиген мишени, который вызывает антиген-специфичный B-клеточный и CTL-ответ, и эпитоп TH. С учетом большого числа полиморфизмов у генов MHC класса II в популяции, были сконструированы несколько “универсальных” эпитопов TH, связывающих большое число молекул MHC класса II, предназначенных для включения в вакцины (P25, ptt-30, PADRE,...). TH-клетки дополнительно подразделяют на линии (Th1, Th2, Th17, …) согласно их цитокиновым профилям и их способности модулировать B-клеточный и цитотоксический CD8 ответ. Адъюванты могут смещать иммунные ответы в сторону Th1 и Th2 ответов и могут также модулировать T-регуляторные лимфоциты (Treg). Например, соли алюминия (Квасцы), широко применяемые при вакцинации людей, индуцируют преобладающим образом Th2 иммунный ответ. Напротив, комбинации с полным адъювантом Фрейнда (CFA), катионными пептидами, такими как IC31 и полиаргинин (Schellack et al, Vaccine 24 (2006) 5461-5472; Mitsui et al, J Invest Dermatol. 2006;126(8):1804-12), белок теплового шока (Moroi et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97(7):3485-90), агонисты TLR9, включение антигенов в ISCOMS (иммуностимулирующий комплекс) и липосомы (Taneichi et al, J Immunol 2006; 177:2324-2330) могут смещать иммунный ответ в сторону профиля Th1.

Несмотря на весь достигнутый прогресс, современные вакцины все еще сталкиваются с несколькими ограничениями. Субъединичные антигены часто являются слабо иммуногенными. Доза антигена, требуемая для запуска иммунитета (обычно в интервале от 10 до 100 мкг), может быть ограничивающим фактором, особенно, когда антиген трудно производить, и когда потребность превышает производственную мощность. Кроме того, индукция CD8+ ответов остается трудной проблемой, поскольку внеклеточные молекулы обычно презентируются MHC класса II, а не MHC класса I. В конце концов, готовые формы вакцин, такие как эмульсия, липосомы, гибридные молекулы могут быть как нестабильными, так и трудными для синтеза, иногда делая затраты на изготовление недопустимыми. Идеальный адъювант должен, таким образом, являться активным, чтобы запустить и поддерживать Ag-специфичный иммунный ответ (как гуморальные, так и клеточные ответы), быть простым для изготовления, нетоксичным и стабильным.

Катехины (также известные как пирокатехин и o-гидроксифенолы и 1,2-дигидроксибензол) играют основную роль в жизни и вовлечены в различные биологические процессы, такие как нейротрансмиссия, меланогенез, биология моря, меланизация у насекомых (Eleftherianos et al, J Innate Immun 2011;3:28-33; Viljakainen, Brief Funct Genomics. 2015;14(6):407-12), и склеротизация кутикулы членистоногих (Andersen, Insect Biochem Mol Biol. 2010;40(3):166-78).

Катехоламины представляют собой нейропередатчики, которые синтезируются из L-тирозина посредством ряда ферментативных путей. Во-первых, тирозингидроксилаза удаляет гидроксильную группу с получением L-ДОФА (3,4-дигидроксифенилаланина). L-ДОФА декарбоксилируется с образованием дофамина под действием декарбоксилазы L-ароматических аминокислот (LADCC); который затем катаболизируется в норадреналин и адреналин под действием гидроксилаз Дофаминбета-гидроксилазы (DB) и Фенилэтаноламин-N-метил-трансферазы (PNMT) (Eisenhofer 2003, FASEB J. 2003; 17(10):1248-55).

Помимо их роли в качестве предшественников катехоламинов, катехины обладают способностью окисляться, генерируя химические соединения с сильными адгезивными свойствами по отношению к субстрату/другим молекулам, как посредством ковалентных, так и нековалентых связываний. Такой окислительный процесс играет основную роль в различных биологических процессах, таких как меланогенез, биология моря, меланизация у насекомых и склеротизация кутикулы членистоногих.

Синтез меланина играет основную роль у животных для их защиты против вредных и мутагенных лучей ультрафиолетового света. У насекомых, активация фенолоксидазы (ФО) также приводит к образованию меланина вокруг вторгающихся микроорганизмов, процессу, имеющему название меланизация, который обеспечивает инкапсуляцию чужеродных частиц (Eleftherianos, 2011, op.cit.; Viljakainen 2015, op. cit.). Как правило, меланины представляют собой макромолекулы, образованные посредством окислительной полимеризации фенольных и индольных соединений посредством ряда ферментативных и неферментативных реакций (Slominski et al, Physiol Rev. 2004;84(4):1155-228). L-Дофа является хорошо известным предшественником меланина (Фиг. 1). Однако, меланины являются гетерогенными соединениями, и описано 4 типа меланинов: (1) Эумеланины, полученные посредством серийных окислений L-Дофа, и приводящие в-основном, к coполимерам Дигидроксииндолкарбоновой кислоты (ДГИКА), и 5,6-дигидроксииндолу (ДГИ); (2) Феомеланины, в которых L-Дофа претерпевает цистеинилирование, посредством конъюгации с глутатионом и цистеином, приводящие к полимерам, содержащим бензотиазин и бензотиазол; (3) Нейромеланин (NM), который продуцируется в специфичных популяциях катехоламинергических нейронов в мозге; (4) и, обнаруживаемые, преимущественно, во многих грибах и растениях, алломеланины и катехолмеланины, образующиеся в результате окисления и полимеризации различных соединений, таких как ди- или тетрагидроксинафталин, гомогентизиновая кислота, γ-глутаминил-4-гидроксибензол, катехины, 6-гидрокси-Дофа, дигидрокофеиновая кислота, кофеиновая кислота, катехины, лейкоантоцианидины, 3-амино-тирозин, 4-гидроксифенилуксусная кислота и другие катехины (Патент США 6,576,268; Langfelder et al, Fungal Genet Biol. 2003;38(2):143-58, Sugumaran et al, FEBS Lett. 1989;255(2):345-9).

Меланин, таким образом, является широким и общим термином для обозначения группы природных пигментов, обнаруживаемых в большинстве организмов (паукообразные являются одной из нескольких групп, у которой их не обнаруживают), обычно продуцируемых окислением аминокислоты тирозина, с последующей полимеризацией.

Wikipedia (https://en.wikipedia.org/wiki/Melanin) определяет меланин как природные пигменты (т.е. окрашенное вещество), получаемое окислением аминокислоты тирозина, с последующей полимеризацией. Это окисление, которое является основной стадией, как правило, опосредовано ферментом тирозиназой, который будет преобразовывать тирозин в ДОФА.

В News Medical Life Science (http://www.news-medical.net/health/What-is-Melanin.aspx) определяют меланин как комплексный полимер, производный от аминокислоты тирозина, посредством различных стадий, включающих катализ L-3,4-дигидроксифенилаланина тирозиназой.

Меланин также определяют и заявляют в EP 313380 как “основной класс широкого спектра поглощающих ультрафиолет органических полимеров, обнаруживаемых в природе у различных растительных видов (грибов), животных видов (кальмар, осьминог и т.д.) и, что очень важно, в человеческом эпидермисе. Они образуются в эпидермисе посредством ферментативного превращения L-тирозина в L-3,4-дигидроксифенилаланин, обычно называемый L-дофа. L-дофа дополнительно превращается в меланин посредством биологического пути, который хорошо описан в литературе”.

Из: http://www.skinwhiteningscience.com/melanin_synthesis_pathways.html, можно видеть, что меланин получают посредством сложного процесса (приведенного на Фиг. 1), который сочетает, как окисление предшественников меланина, так и их последующую полимеризацию. Этот комбинированный процесс, таким образом, отличается от простой полимеризации предшественников меланина такого, как, например, политирозин.

Меланин может синтетически производиться и поставляться как меланин, например, от Sigma Aldrich, полученный окислением тирозина пероксидом водорода. (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8631?lang=fr&region=FR

Их приведенного выше следует, что меланин представляет полимерный пигмент, известный и признанный в данной области, который не может быть спутан с простым полипептидом из амино-кислот, которые являются предшественниками меланина. В частности, политирозил, полученный без окислительной полимеризации, не мог бы рассматриваться квалифицированным специалистом в данной области как молекула меланина.

Синтез меланина включает несколько промежуточных соединений, несколько ферментов и может быть модифицирован посредством pH, присутствием катионных металлов, температуры.

В качестве промежуточных соединений, можно привести: L-фенилаланин, L-тирозин, L-дофа, дофахинон, циклодофа, дофахром, хиноновый метид, бензотиазол, бензотиазин, дигидроэскулетин, Дигидроксииндолкарбоновую кислоту (ДГИКА), 5,6-дигидроксииндол (ДГИ), дофамин-о-хинон, Дофамин Лейкоopаминохром, дофаминохром, норэпинефрин, нораденохром, эпинефрин, аденохром, 3-амино-тирозин и другие.

В качестве ферментов, вовлеченных в синтез, можно привести: Фенилаланингидроксилазу, тирозиназу (EC 1.14.18.1 и EC1.10.3.1), грибную тирозиназу, тирозингидроксилазы, пероксидазу, Фенол-оксидазу, Дофахромтаутомеразу (E.C,5.3.2.3, DCT/Trp2); ДГИКА-оксидазу (Trp1) ДГИ-оксидазу.

На синтез меланинов и преобладающий тип меланина сильно влияет присутствие остатков цистеина (приводящее к феомеланину, как упоминалось выше), pH (щелочных pH, инициирующих аутоокисление катехина), ионов металлов (таких как CU2+, Ni2+, Fe3+, Fe2+, Co2+ …) (Palumbo et al, Biochim Biophys Acta. 1987; 13;925(2):203-9; Palumbo et al, Biochim Biophys Acta. 1991;1115(1):1-5; WO 1995009629 A1), и ферментов, добавленных при инкубациях. Например, Pawelek (1993, 1995) описывает способ получения растворимого синтетического меланина посредством комбинирования дофахрома и соответствующего фермента, и посредством инкубации 5,6-дигидроксииндол-2-карбоновой кислоты, взятой отдельно, и вместе с 5,6-дигидроксииндолом, и вместе с 3-амино-тирозином (Патент США 5225435; Патент США 5384116).

В биологии моря, Адгезивные Белки Мидии (MAP) обладают способностью образовывать сильную адгезивную связь с различными субстратами во влажном окружении. Эти адгезивные белки содержат необычно высокую долю L-Дофа, который после окислительной полимеризации (таким образом, приводящей к меланин-подобным соединениям) в значительной степени является ответственным за их адгезивную прочность (Lee et al, Biomacromolecules 2002, 3, 1038-1047; Wang et al, Biomaterials 28 (2007) 3456-3468). Некоторые первичные катехоламины, такие как Норэпинефрин, Дофамин, и Дофа-содержащие полимеры, могут претерпевать аналогичную окислительную полимеризацию, которая может создавать адгезивные пленки на поверхностях твердых веществ (Lee, op. cit.; Wang, op.cit.; Guvendiren et al, Adhes. 2009; 85(9): 631-645; Wei et al, Colloids Surf B Biointerfaces. 2013;110:22-8).

У членистоногих, кутикулярная склеротизация является процессом, тесно связанным с меланизацией, посредством которой кутикулы стаблизируются посредством включения фенольных соединений. Склеротизация в основном включает 3 катехина (N-ацетилдофамин (NADA), дегидро-NADA и N-b-аланиндофамин (NBAD)), которые первыми окисляются до орто-хинонов тирозиназой и лакказой. Соответствующие орто-хиноны могут перегруппировываться в пара-хиноновые метиды и дополнительно окисляться до ненасыщенных хиноидных производных и дегидро-бензодиоксиновых производных. Орто-хиноны и пара-хиноновые метиды являются высокореакционноспособными соединениями и могут образовывать аддукты посредством реакции с нуклеофильными соединениями (такими как цистеин, гистидин, метионин, лизин, аланин, тирозин) с получением ацилдофаминов, замещенных в 6-положении ароматического кольца (в основном, для орто-хинона) и замещенных в бета-положении боковой цепи (для пара-хиноновых метидов) (Andersen 2010, op. cit.).

Некоторые авторы выдвигают гипотезу, что меланогенез может также играть роль при врожденном иммунитете (Mackintosh et al, J. theor. Biol. (2001) 211, 101-113). Эта гипотеза в-основном, подтверждается способностью насекомых активировать фенолoоксидазу (ФО), что приводит к образованию меланина вокруг вторгающихся микроорганизмов, процессу, имеющему название меланизация, который обеспечивает инкапсуляцию чужеродных частиц (Eleftherianos et al, J Innate Immun 2011; 3:28-33; Viljakainen 2015, op. cit.).

Ситуация может быть противоположной у млекопитающих, так как является общепризнанным, что синтез меланина у Cryptococcus neoformans (но также у нескольких видов патогенных бактерий и гельминтов) фактически увеличивает его вирулентность посредством защиты грибка против фагоцитоза и фагоцитарного уничтожения организмом-хозяином (Casadevall et al, 2000, Curr Opin Microbiol. 2000 Aug;3(4):354-8). Синтетический меланин подавляет выработку цитокинов у макрофагов, стимулируемую липополисахаридом (Mohagheghpour et al, Cell Immunol. 2000;199(1):25-36), немотря на то, что грибковый меланин может активировать альтернативный путь комплемента (Rosas et al, Clin Diagn Lab Immunol. 2002;9(1):144-8). Мыши C57BL/6, которые отличаются только геном, кодирующим тирозиназу, ключевой фермент при синтезе меланина, не показали никакого различия при клиническом протекании инфекции малярии (Waisberg et al, PLoS One. 2012;7(1):e29493).

В литературных источниках не упоминается, что L-Дофа и меланин могут инициировать адаптивный иммунный ответ, такой как антитела и цитотоксичные T-Лимфоциты. В частности, иммунологические исследования показали, что Дофа-содержащие полимеры являются слабыми антигенами (Lee et al, Adv Mater. 2009; 21(4): 431-434; Wei, 2013, op. cit.; Ball et al, J Colloid Interface Sci. 2012 15;386(1):366-72).

Для мышиной модели переднего увеита была описана иммунизация против фракции бычьего нерастворимого пигментного эпителия сетчатки (RPE) (Boral et al, Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995; 36(6):1056-66). Интересно, что патогенный антиген, до сих пор неизвестный, связан с крупными веретенообразными частицами зрелого меланина (приблизительно с длиной 2-3 мкм) (Broekhuyse et al, Exp Eye Res. 1992;55(3):401-11). Однако, меланин проявляется как компаньон во время процесса очистки, так как антиген остается патогенным даже после солюбилизации антигена посредством протеазы V8 (таблица 5, Bora 1995), что делает невозможной роль меланина в патофизиологии заболевания. Другие примеры такой ассоциации не были описаны в литературе.

Было сделано предположение о прямой модуляции иммунной системы нейротрансмиттером дофамином аутокринным/паракринным образом. Дофамин показывает конфликтующие воздействия на иммунную систему. Дофамин может потенцировать выработку цитокинов Th2 человеческими наивными CD4 T-клетками, цитокинов Th1 c активированными CD4 T-клетками; и цитокинов Th17 (IL-23) под действием DC. Дофамин может ингибировать супрессивную активность регуляторных T-клеток (T-reg), благоприятствовать миграции T-клеток, но может также ингибировать пролиферацию человеческих T-клеток (Sarkar et al, Brain Behav Immun. 2010; 24(4): 525-528; Pacheco et al, Front Immunol. 2014;5:117). Взятые вместе, воздействия Дофамина на иммунную систему являются комплексными и непрямыми. Эти воздействия не запускают непосредственно антиген-специфичный иммунный ответ, являются опосредованными DAR и не требуют непосредственной близсти между антигеном и дофамином.

Также сообщалось, что 5,6-дигидроксииндол-2-карбоновая кислота (ДГИКА)-меланин играет роль при поддержании иммунной гипореактивности по отношению к меланосомальным белкам через ДГИКА-опосредовнное антиокисление (Liu et al, Free Radic Biol Med. 2011 May 1;50(9):1177-85).

Другие авторы сообщают о некоторых противовоспалительных и иммуномодулирующих свойствах виноградного меланина, ингибирующих эффектах на отек лап и индуцированное адъювантом заболевание. (Avramidis et al; Arzneimittelforschung. 1998 Jul; 48(7):764-71). В частности, авторы сообщают про ингибирующий эффект меланина на индуцированный каррагенином отек, а также на отеки, при других воспалительных процессах, и то, что виноградный меланин показывает мощный ингибирующий ээффект на индуцированное адъювантом заболевание (AID) у крыс. Авторы указывают на то, что наблюдаемый эффект может быть обусловлен возможным ингибированием клеточных иммунных ответов, опосредованных субпопуляциями лимфоцитов Th1 (T4+ и T8+) под действием меланина.

В итоге, роль меланина и его предшественников по отношению к иммунитету остается невыясненной.

Arnon et al (1960 - Biochem. J., 75: 103-109) раскрывают среди прочего, антигенный белок, т.е. желатин, яичный альбумин и эдестин, связанные с политирозилом, который не является меланином l.

Sela et al (Biochem. J., vol. 75, 1 January 1960 (1960-01-01), pages 91-102) раскрывает функциональный процесс для получения полипептидилжелатина. Окислительная полимеризация отсутствует, и полученный продукт не содержит меланин и не может рассматриваться как меланин.

Akagi et al (In: "Bioactive Surfaces", 1 January 2011 (2011-01-01), Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg, Adv Polym Sci, vol. 247, pages 31-64) раскрывает Биодеградируемые Наночастицы в качестве Адъювантов Вакцины и Системы Доставки. Полиаминокислотные наночастицы получают с тирозином, но в этом документе не раскрывается и не упоминается меланин и то, что полимеризация могла бы предоставить меланин в качестве конечного продукта.

US 2004/057958 раскрывает иммуногенный носитель, который может представлять собой полиаминокислотный полимер. В этом документе не упоминают и не предлагают применять меланин в качестве иммуногена.

Fujita et al (Chemistry Central Journal, Biomed Central Ltd, vol. 5, no. 1, 23 August 2011 (2011-08-23), page 48) публикуют обзор по статусу множества антиген-презентирующих систем с пептидными вакцинами с использованием наночастиц. В этом документе не упоминают и не предлагают получать комплексы меланина и антигенов для увеличения иммуногенности антигена.

Cui et al (Biomacromolecules, vol. 13, no. 8, 13 August 2012 (2012-08-13), pages 2225-2228) описывает применение полидофаминовых пленок (которые отличаются от меланина) на капсуле для выполнения внутриклеточной доставки лекарственного средства. Частицы не применяются для получения иммуногенной композиции.

Cui et al (NANO, vol. 10, no. 05, 1 July 2015 (2015-07-01), pages 1530003-1 to 1530003-23) дополнительно раскрывают полидофаминовые капсулы. Частицы не применяются для получения иммуногенной композиции.

Lee et al (Advanced Materials, vol. 21, no. 4, 26 January 2009 (2009-01-26), pages 431-434) раскрывают, что пленки полидофамина могут быть биоконъюгированы с различными субстратами, но не указывают на то, что эти пленки проявляют иммуногенные свойства.

Park et al (ACS Nano, vol. 8, no. 4, 22 April 2014 (2014-04-22), pages 3347-3356) раскрывают наночастицы полидофамина, используемые для переноса лекарственных средств. В этом документе не упоминаются и не предполагаются комплексы меланин-антиген в качестве иммуногенных композиций.

В US 2012/237605 раскрыты наночастицы с поверхностью на основе полидофамина, но их применение в качестве иммуногенных композиций не предполагают и не раскрывают.

Liu et al (Small. 2016 Apr 6; 12(13):1744-57) раскрывают патоген-имитирующие полимерные наночастицы, основанные на полимеризации дофамина, которые в качестве адъювантов вакцин индуцируют устойчивый гуморальный и клеточный иммунные ответы. Антиген добавляют после образования меланина.

Настоящее изобретение основано на том факте, что меланин может применяться в качестве высокоактивного адъюванта для индуцирования иммунитета против антигена, при совместном введении с этим антигеном. Предпочтительно, когда меланин и антиген находятся в комплексе, в частности, когда антиген захвачен меланином.

Определения

В контексте настоящего изобретения, следующие термины имеют следующие значения:

Меланин

“Меланин” представляет собой пигмент, являющийся макромолекулой, полученной в результате окислительной полимеризации предшественников, относящихся к индолу и катехину. На Фиг. 1 представлен синтез одного типа меланина (эумеланина). Меланин согласно настоящему изобретению может представлять собой “природный” меланин, который может быть обнаружен в природе, такой как эумеланин, полученный врезультате полимеризации предшественников, как отображено на Фиг. 1, MAP-подобный полимер (содержащий высокую долю предшественника меланина), и меланин-подобную молекулу, полученную в результате полимеризации производных предшественника, таких как производные, описанные ниже.

Существует множество меланинов, которые получают окислением аминокислоты тирозина, с последующей полимеризацией: эумеланин, феомеланин, и нейромеланин и растительные меланины.

Предпочтительным меланином, в контексте настоящей заявки, является эумеланин. Однако, в композиции, описанной ниже и применяемой в композиции согласно настоящему изобретению, можно также применять другие типы меланинов, такие как феомеланины, нейромеланины, растительные меланины, MAP-подобные полимеры (полученные в результате окисления полимеров, содержащих высокую долю предшественника меланина, такого как L-Дофа), которые можно рассматривать как меланин-подобные молекулы, а также неприродные меланины, полученные полимеризацией производных предшественников меланина.

Первую стадию биосинтетического пути как для эумеланинов, так и для феомеланинов катализирует тирозиназа, которая инициирует окисление ее субстратов (Фиг. 1):

Тирозин → ДОФА → дофахинон

Дофахинон может сочетаться с цистеином по двум путям к бензотиазинам и феомеланинам

Дофахинон+цистеин → 5-S-цистеинилдофа → бензотиазиновое промежуточное соединение → феомеланин

Дофахинон+цистеин → 2-S-цистеинилдофа → бензотиазиновое промежуточное соединение → феомеланин

Также, дофахинон может быть преобразован в лейкодофахром и следовать еще двумя путями к эумеланинам

Дофахинон → лейкодофахром → дофахром → 5,6-дигидроксииндол-2-карбоновая кислота (ДГИКА) → хинон → эумеланин

Дофахинон → лейкодофахром → дофахром → 5,6-дигидроксииндол (ДГИ) → хинон → эумеланин

Предшественник меланина

“Предшественник меланина” представляет собой молекулу, которую применяют и синтезируют в процессе синтеза меланина. В частности, можно привести: L-фенилаланин, L-тирозин, L-дофа, дофахинон, циклодофа, дофахром, Дигидроксииндолкарбоновую кислоту и 5,6-дигидроксииндол-2-карбоновую кислоту (ДГИКА), индол 5,6 хинон, 5,6-дигидроксииндол (ДГИ), дофамин-о-хинон, Дофамин лейкодофаминохром, лейкодофахром (циклодофа), дофаминохром, норэпинефрин, норадехинон, нораденохром, эпинефрин, эпинефрин-о-хинон, аденохром, 3-амино-тирозин, 6-гидрокси-Дофа, дигидрокофеиновую кислоту, кофеиновую кислоту и другие.

L-тирозин является предпочтительным предшественником, и для него требуется окислительная полимеризация. L-дофа является предпочтительным предшественником.

D-дофа является предпочтительным предшественником.

6-гидрокси-Дофа является предпочтительным предшественником.

ДГИКА является предпочтительным предшественником.

ДГИ является предпочтительным предшественником.

Смесь ДГИКА и ДГИ является предпочтительным предшественником.

Дофамин является предпочтительным предшественником.

Термин “предшественник меланина” дополнительно включает производные таких предшественников и/или полимеры, содержащие высокую долю таких предшественников (такие как в адгезивных белках мидий).

Можно выбрать, в частности:

- химическое соединение, содержащее катехиновый фрагмент

или родственный ему орто-бензохиноновый фрагмент

такое как: L-Дофа, D-Дофа, Дофамин, норэпинефрин (норадреналин), эпинефрин (адреналин), 6-гидроксидофа, катехин, дигидрокофеиновая кислота, кофеиновая кислота, (3,4-дигидроксифенилуксусная кислота) ДОФУК; 3,4-Дигидроксиминдальная кислота, ацилдофамины, N-ацетилдофамин, дегидро-N-ацетилдофамин и N-б-аланиндофамин, дофахинон, дофамин-о-хинон, норэпинефрин-о-хинон, эпинефрин-о-хинон.

Особенно предпочтительным веществом является L-ДОФА (L-3,4-дигидроксифенилаланин), D-ДОФА (D-3,4-дигидроксифенилаланин), 6-гидроксидофа и его замещенные производные

в котором R1, R2 и R3 независимо представляют собой водород -OH, и C1 - C6 алкильные группы.

- Предшественник катехинового фрагмента, такой как: фенилаланин, Тирозин, триптамин

- химическое соединение, содержащее индол-5,6-диольный фрагмент

или родственный ему индолин-5,6-диольный фрагмент

,

такой как: Дофахром, Дофаминохром, норадренохром, адренохром, ДГИКА, Индол 5,6 хинон, ЛейкоДофахром (циклоДофа), Лейкодофаминхром; лейконорадренохром, 5,6-дигидроксииндол-2-карбоксил (ДГИКА), 5,6-дигидроксииндол (ДГИ)

Особенно предпочтительным веществом является ДГИКА.

- химическое соединение, содержащее индольный фрагмент формулы

в которой R1, R2 и R3 могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют собой водород, -OH и C1 - C6 алкильные группы.

Другие производные являются известными в данной области. В качестве иллюстрации можно привести

Производные 6-дигидроксииндола (ДГИ)

Примерами производных ДГИ, которые могут применяться в способе согласно настоящему изобретению, являются производные, описанные в WO 98051269, в частности, дигидроксииндол, представленный формулой (I):

(I)

где

- R выбирают из группы, состоящей из водорода, алкильной группы с 1-6 атомами углерода, гидроксиалкильной группы с 1-6 атомами углерода, аминоалкильной группы с 1-6 атомами углерода, арила, и замещенного арила, содержащего до трех реакционноинертных заместителей;

- R1 и R2, могут быть одинаковыми или различными, и их выбирают из группы, состоящей из водорода, алкила, содержащего от одного до шести атомами углерода, или, когда R2 представляет собой H, R1 может представлять COOR3, где R3 представляет собой H и алкил, имеющий от одного до шести атомов углерода.

Альтернативно, могут также применяться соединения, описанные в EP 441689, такие как соединения формулы (II):

(II)

где:

R представляет атом водорода, алкил, алкокси, гидроксиалкил, аминоалкил, SiR6R7R8, где R6, R7, R8 обозначают алкил, где алкил содержит от 1 до 8 атомов углерода, и незамещенный и замещенный арильный радикал, OH, NH₂, алкил, алкокси и NO₂;

R1 и R2, идентичные и различные, представляют C₁-C₃ алкил и вместе образуют метиленовую и этиленовую группу, необязательно замещенную одним и несколькими C₁-C₃ алкилами,

R3 представляет собой водород и COOH,

R4 и R5, идентичные и различные, представляют атом водорода, гидроксильную группу, метил и C₂-C₆ алкил.

Можно привести, в частности, 5,6-диметоксииндол, 5,6-метилендиоксииндол и 1-метил-5,6-диметоксииндол.

Производные ДОФА

Можно применять производные ДОФА, раскрытые в EP 58040, в частности, выбранные из:

(a) моно и/или дизамещенных сложноэфирных и формиатных производных ДОФА, имеющих формулу (III):

(III)

где R представляет собой -H, разветвленную и неразветвленную, алкильную и алкенильную группу, имеющую от 1 до 20 (предпочтительно от 1 до 6) атомов углерода, и аминокислотный и пептидный фрагмент,

Y¹ представляет собой -H и -OH, и -CH3 и любую другую C2 - C6 алкильную группу, и

Y² представляет собой -H и -CH₃;

(b) моно и/или дизамещенных карбонатных производных ДОФА, имеющих формулу:

(IV)

где R¹ представляет собой разветвленную и неразветвленную, алкильную и алкенильную группу, имеющую от 1 до 20 атомов углерода;

(c) моно и/или дизамещенных уретановых производных ДОФА, имеющих формулу (V):

(V)

где R1 представляет собой кислород и C1-C3 алкильную группу;

(d) моно и/или дизамещенных эфирных производных ДОФА, имеющих структуру (VI):

(VI)

где R1 представляет собой кислород и C1-C3 алкильную группу;

(e) моно и/или дизамещенных фосфатных и/или сульфатных производных ДОФА, имеющих структуру (VII):

(VII)

где один X представляет собой -PO₃H₂ и -SO₃H, а другой X представляет собой -H, -PO₃H₂ и -SO₃H;

(f) ацетальных и кетальных производных ДОФА, имеющих структуру (VIII):

(VIII)

где R² выбирают из -H, алкила и фенила;

(g) циклических карбонатных производных ДОФА, имеющих структуру (IX):

(IX)

(h) аминозамещенных производных ДОФА, имеющих структуру (X):

(X)

где R³=R¹, как раскрыто выше, и представляют собой аминокислотный остаток;

(i) карбоксилат-замещенных производных ДОФА, имеющих структуру (XI):

(XI)

где X¹ представляет собой NH, амидную (особенно, аминокислотную и пептидную) связь;

(j) связанных амино- и карбоксилат-замещенных производных ДОФА, имеющих структуру (XII):

(XII)

где R¹ является таким, как описано выше;

(k) структурных аналогов ДОФА, имеющих структуру (XIII):

(XIII)

где R³ выбирают из:

(i)

где X² является одинаковым или различным, и его выбирают из -H, -OH, -NH₂ и -SH

(ii)

(iii)

(iv)

(l) структурных аналогов ДОФА, имеющих структуру (XIV):

(XIV)

где

X³ представляет собой -OH и OR¹

X⁴ представляет собой =O и OR¹

(m) C-гомологов ДОФА, имеющих структуру (XV):

(XV)

где n является целым числом от 1 до 3;

(n) короткоцепочечных и гетероатомных аналогов ДОФА, имеющих структуру (XVI):

(XVI)

где

X⁵ представляет собой S, O и NH и

X⁶ представляет собой H и COOH; и

(o) производного глутатиона, имеющего структуру (XVII):

(XVII)

Замещенный ДОФА также может быть выбран из:

3,4-дигидроксифенилсерина, имеющего структуру:

2,4,5,-тригидроксифенилаланина, имеющего структуру:

6-гидрокси-Дофа, имеющего структуру:

2-метил-3-(3,4-дигидроксифенилаланина), имеющего структуру:

Другим возможным вариантом является метокситирозин, имеющий структуру:

и его изомер 3-гидрокси-4-метоксифенилаланин, имеющий структуру:

,

такие как описаны в EP 580409.

Производные ДГИКА

В качестве таких производных, для иллюстрации, можно использовать

где R выбирают из группы, состоящей из водорода, алкильной группы с 1-6 атомами углерода, гидроксиалкильной группы с 1-6 атомами углерода, аминоалкильной группы с 1-6 атомами углерода, арила, и замещенного арила, содержащего до трех реакционноинертных заместителей, COOH, NH₂.

Другие предшественники меланина и их производные описаны в данной области, такие как продукты, описанные в WO 93/021898.

Термин “предшественник меланина” также охватывает полимерные молекулы, содержащие высокую долю предшественников меланина, раскрытых выше, которые способны претерпевать окисление полимера. В качестве примера, можно привести поли-Дофа пептиды, поли-Тирозиновые пептиды, и, в более общем случае, любые полимеры, содержащие высокую долю предшественников меланина (таких как предшественники Адгезивных Белков Мидии).

Окислитель

“Окислитель” и “окисляющая молекула” представляет собой соединение, которое способно обеспечивать кислород в раствор, содержащий предшественники меланина и инициировать их полимеризацию и образование макромолекулы меланина.

Окислители, которые могут достигать этой цели, содержат кислород, пероксид водорода, персульфат аммония, ионы железа, йодид натрия вместе с пероксидом водорода, и участвуют в обработке с использованием соли катиона переходного металла, такой как сульфат меди в качестве катализатора для окисления на воздухе.

Таким образом, предпочтительно, когда окислитель выбирают из группы, состоящей из кислорода, пероксида водорода, персульфата аммония, и ионов железа.

Иммуногенные и иммуностимулирующие композиции

“Иммуногенная и иммуностимулирующая композиция” представляет собой композицию, которая способна генерировать иммунный ответ у животного при введении указанному животному. Предпочтительно, указанным животным является млекопитающее, но оно также может являться птицей (такой как курица, утка, гусь, индейка, перепелка), в частности, когда композицию применяют для домашней птицы. Животное может также быть рыбой, так как иммуногенная композиция может применяться в рыбоводстве.

Однако иммуногенную композицию согласно настоящему изобретению предпочтительно применяют для млекопитающих. Такие млекопитающие предпочтительно являются людьми, но также могут являться другими млекопитающими, когда композицию применяют в области ветеринарии, в частности, для индуцирования иммунитета у сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот (коровы), овцы, козы и лошади, но также у домашних животных, таких как собаки и кошки.

Иммуногенная композиция представляет собой, таким образом, композицию, которая содержит антиген, и, которая способна генерировать иммунный ответ против такого антигена. Генерируемый иммунный ответ может быть клеточным (опосредованным T-клетками) и гуморальным (опосредованной B-клетками выработкой антител) иммунным ответом. Иммуногенная композиция может также индуцировать как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ.

Клеточный иммунный ответ может представлять собой ответ, опосредованный CD8 T-лимфоцитами (т.е. цитотоксичный ответ), и ответ, опосредованный CD4 T-лимфоцитами (хелперный ответ). Он также может сочетать цитотоксичный и хелперный клеточный иммунный ответ. Хелперный ответ может вовлекать Th1, Th2 и Th17 лимфоциты (такие лимфоциты способны вызывать различные цитокиновые ответы, как известно в данной области).

Иммуногенная композиция может обеспечить лучшее презентирование антигена, присутствующего в ней, посредством путей MHC1 и MHC2.

Адъювант

“Адъювант” представляет собой вещество, которое обладает способностью модифицировать и усиливать иммунный ответ на антиген. Иначе говоря, иммунный ответ против антигена может быть выше и отличаться в присутствии адъюванта от ответа, когда адъювант не присутствует (что включает случай, когда ответ модифицируют, например, когда субпопуляция T-клеток, которая активируется в присутствии адъюванта, отличается от субпопуляции, активируемой в осутствие адъюванта). Адъюванты являются известными в данной области и широко применяются в области вакцин.

Можно привести квасцы, эмульсии (либо типа масло-в-воде или типа вода-в-масле, такие как неполный адъювант Фрейнда (IFA) и MF59®), Лиганды PRR (рецепторов распознавания структур), лиганды TLR3 (толл-подобного рецептора 3) и RLR (рецепторов подобных RIG-I), такие как двухцепочечная РНК (дцРНК), и синтетические аналоги дцРНК, такие как поли(I:C), лиганды TLR4, такие как бактериальные липополисахариды (LPS), MPLA (монофосфорилированный липид A), в частности, составленные вместе с квасцами, лиганды TLR5, такой как бактериальный флагеллин, лиганды TLR7/8, такие как имидазохинолины (т.е. имиквимод, гардиквимод и R848), лиганды TLR9, такие как олигодезоксинуклеотиды, содержащие специфичные CpG-мотивы (CpG ODN) и лиганды NOD2 (белка 2, содержащего нуклеотид-связывающий домен олигомеризации). Термин лиганд, приведенный выше, описывает предпочтительно агонист рецептора, т.е. вещество, которое связывается с рецептором и активирует рецептор, в частности, для рецепторов TLR3 и TLR9.

Антиген

В контексте настоящего изобретения, “антиген” представляет собой молекулу и комбинацию молекул, против которых желательно вызвать иммунный ответ, чтобы иммунная система живого животного могла распознать их. Такой антиген может быть чужеродным для организма хозяина, для которого предполагается иммунный ответ. В этом случае, антиген может представлять собой белок, экспрессируемый бактериями и вирусом. Антиген может также представлять собой аутоантиген, т.е. белок, который экспрессируется клетками хозяина, такой как опухолевые антигены.

Антигены могут состоять из целых организмов (вирусов и бактерий, грибков, простейших и даже раковых клеток), убитых и не убитых, клеток (облученных и необлученных, генетически модифицированных и немодифицированных), и субфракций этих организмов/клеток, таких как клеточные экстракты и клеточные лизаты. Антигены могут также состоять из одиночных молекул, таких как белки, пептиды, полисахариды, липиды, гликолипиды, гликопептиды и их смесей. Антигены могут также являться одной из приведенных выше молекул, которая была модифицирована посредством химической модификации и стабилизации. В частности, суммарный заряд антигена может быть модифицирован с использованием соответствующего замещения аминокислот и химических модификаций антигена.

Антиген может представлять собой полноразмерный белок и любую часть белка, такую как эпитоп белка. Антиген, в контексте настоящего изобретения, может также состоять из синтетического белка и молекулы, которая содержит множество эпитопов, которые связаны вместе.

В частности, антиген может представлять собой белок, содержащий множество эпитопов одного и того же антигена, причем эти эпитопы являются специфичными для гаплотипа MHC. В этом случае, можно применять уникальную иммуностимулирующую молекулу, описанную в настоящем документе, для получения иммунного ответа в различном генетическом (MHC) контексте.

В другом варианте осуществления, антиген может представлять собой белок, содержащий множество эпитопов, полученных из различных антигенов одного и того же патогена (термин патоген предпочтительно указывает на чужеродный патогенный агент, такой как бактерия, вирус, паразит и грибок, но может также распространяться на опухолевые клетки). В этом случае, можно применять иммуностимулирующую молекулу для получения сильного иммунного ответа против этого патогена.

Антиген, который может применяться вместе с макромолекулой меланина в раскрытой композиции, представляет собой любой антиген, против которого добиваются иммунного ответа.

Этот антиген может являться полноразмерным белком, обнаруживаемым в природе, и только частью белка, обнаруживаемого в природе.

Антиген, предназначенный для иммуногенной композиции, как описано в настоящем документе, также может представлять собой смесь антигенов.

Антиген может представлять собой белок, пептид, полисахарид и липид. Антиген может являться частью (оболочек, капсул, клеточных стенок, жгутиков, фимбрий и токсинов) бактерий, вирусов и других микроорганизмов. Антиген может представлять собой более сложную молекулу, такую как липид, комбинированный с белком и/или полисахаридом.

Эпитопы

В конкретном варианте осуществления антиген, применяемый в иммуногенной композиции, содержит один или несколько эпитопов МНС.

В конкретном варианте осуществления антиген, применяемый в иммуногенной композиции, состоит из эпитопа MHC.

В другом варианте осуществления, антиген, применяемый в иммуногенной композиции, состоит из эпитопа MHC, который фланкирован, по его N- и/или C-концу несколькими аминокислотами (между 1 и 10, предпочтительно между 1 и 6 аминокислотами по одному, и обоим C- и N-терминальным концам).

Эпитоп MHC (или T-клеточный эпитоп) презентирован на поверхности антигенпрезентирующей клетки, где они связаны с молекулами MHC. T-клеточные эпитопы, презентируемые молекулами MHC класса I обычно представляют собой пептиды, имеющие длину между 8 и 11 аминокислотами, в то время как молекулы MHC класса II презентируют более длинные пептиды, с длиной в 13-17 аминокислот (https://en.wikipedia.org/wiki/Epitope#T_cell_ epitopes).

Эпитоп MHC может быть синтезирован in vitro (с добавлением и без добавления аминокислот по его C и/или N-концам). Связанные с MHC пептиды могут экстрагироваться из живых клеток, в частности, опухолевых клеток, любым методом, известным в данной области, таким как обработка кислотой, в частности, хлористоводородной кислотой.

В другом варианте осуществления, антиген содержит один или несколько B-клеточных эпитопов, т.е. часть белка, которая распознается антителом, предпочтительно линейные эпитопы, образованные непрерывной последовательностью аминокислот из антигена.

В конкретном варианте осуществления антиген, применяемый в иммуногенной композиции, состоит из B-клеточного эпитопа.

В другом варианте осуществления, антиген, применяемый в иммуногенной композиции, состоит из B-клеточного эпитопа, который фланкирован, по его N- и/или C-концу несколькими аминокислотами (между 1 и 10, предпочтительно между 1 и 6 аминокислотами по одному и обоим C- и N-терминальным концам).

Различные методы, описанные в литературе, относящиеся к картированию эпитопов, делают возможным идентифицировать T-клеточные и B-клеточные эпитопы из данного антигена.

Однако композиция, раскрытая в настоящем описании, создает возможность применять лишь эпитопы, которые уже хорошо известны от известных антигенов (которые, таким образом, являются хорошо охарактеризованными), в отличие от полноразмерных белков. В действительности, применение лишь эпитопов (т.е. малых антигенных частей), чтобы вызывать иммунный ответ, является особенно интересным для ограничения каких-либо неблагоприятных воздействий, которые могли бы ассоциироваться с применением белков крупного размера.

Другие синтетические антигены

В частности, антиген может представлять собой синтетическую молекулу, содержащую множество эпитопов, разделенных участками аминокислот и любыми другими приемлемыми линкерами, такими как полиэфирные соединения, и другими линкерами, применяемыми в дендримерных конструкциях (Tam, Proc Natl Acad Sci USA. 1988, 85(15):5409-13; Seelbach et al, Acta Biomater. 2014 10(10):4340-50; Sadler и Tam, Reviews in Molecular Biotechnology 90, 3-4, pp195-229; Bolhassani et al, Mol Cancer. 2011 Jan 7; 10:3).

Множество эпитопов может представлять собой эпитопы, специфичные для различных генотипов HLA (чтобы генерировать одиночную иммуногенную и иммуностимулирующую композицию, которая способна вызывать иммунный ответ против данного антигена и патогена у широкой популяции пациентов.

В другом варианте осуществления, эпитопы могут происходить от одинаковых и множественных антигенов одного и того же патогенного агента, чтобы вызывать сильный иммунный ответ против указанного патогенного агента, имеющего множественные эпитопы.

В другом варианте осуществления, эпитопы могут происходить от различных патогенных агентов, чтобы вызывать иммунный ответ против этих различных агентов в одно время, посредством применения иммуногенной композиции.

Антиген может содержать универсальные T-хелперные эпитопы, такие как пан-DR эпитоп (PADRE) и эпитопы Pol₇₁₁. В литературе широко раскрыты другие универсальные T-хелперные эпитопы.

Источник антигенов

Антигены, которые могут применяться в настоящем изобретении, могут быть выбраны в частности, из:

- Экзогенных антигенов (антигенов, которые поступают в организм извне, например, посредством ингаляции, глотания и инъекции; эти антигены, как правило, презентируются молекулами MHC II).

- Эндогенных антигенов (антигенов, генерируемых в нормальных клетках в результате нормального клеточного метаболизма, и вследствие вирусной и внутриклеточной бактериальной инфекции; эти антигены, как правило, презентируются молекулами MHC I).

- Неоантигенов (таких как опухолевые антигены, такие как эпитопы, производные от вирусных открытых рамок считывания в вирус-ассоциированных опухолях, и другие опухолевые антигены презентируемые молекулами MHC I и MHC II на поверхности опухолевых клеток.

- Аллергенов (антигена, способного стимулировать реакцию гиперчувствительности типа-I у атопических индивидуумов посредством ответов с участием Иммуноглобулина E (IgE)).

В качестве примеров опухолевых антигенов, можно привести альфафетопротеин (AFP), обнаруживаемый в эмбрионально-клеточных опухолях и при гепатоклеточной карциноме, онкоэмбриональный антиген (CEA), обнаруживаемый в злокачественных новообразованиях кишечника, CA-125, обнаруживаемый при раке яичника, MUC-1, обнаруживаемый при раке молочной железы, эпителиальный опухолевый антиген (ETA), обнаруживаемый при раке молочной железы, антиген, ассоциированный с тирозиназой и меланомой (MAGE), обнаруживаемый при злокачественной меланоме, аномальные продукты ras, p53, обнаруживаемые в различныз опухолях, gp100 (Меланоцитарный белок PMEL, трансмембранный гликопротеин типа I, присутствующий в избытке в меланосомах), TRP2 (Тирозиназа-родственный Белок 2), EPHA2 (рецепторная тирозинкиназа, часто сверхэкспрессируемая при разнообразных прогрессирующих злокачественных новообразованиях, таких как глиома), сурвивин (бакуловирусный ингибитор апоптозных повтор-содержащих 5 и BIRC5, экспрессируемых, в частности, при раке молочной железы и легкого), EGFRvIII (мутант рецептора эпидермального фактора роста, экспрессируемый, в частности, в глиобластомах).

В качестве примеров патогенов, антигены из которых могут применяться в иммуногенной композиции, можно привести любые патогены, вовлеченные в инфекционные заболевания (вирусы, бактерии, паразиты, грибки).

Для инфекционных заболеваний, предпочтительные патогены выбирают из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусов гепатита А и B, вируса гепатита C (HCV), вируса саркомы Рауса (RSV), вирусов Эбола, Цитомегаловируса, вирусов Герпеса, вируса Варицелла Зостер, вируса Эпстейна-Барра (EBV), вируса гриппа, Аденовирусов, Ротавируса, вирусов Рубеолы и рубеллы, вируса Вариолы, Staphylococcus, Chlamydiae, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Helicobacter Pilorii, Salmonella, Plasmodium sp. (P. falciparum, P. vivax, и т.д.), Pneumocystis carinii, Giardia duodenalis (Giardiose), Schistosoma (Bilharziose), Aspergillus, Cryptococcus, Candida albicans, Listeria monocytogenes, и Toxoplasma gondii.

В качестве примеров заболеваний, при которых можно получить благоприятный эффект от иммунизаций с использованием соответствующего антигена можно привести: злокачественное новообразование (доброкачественные и злокачественные опухоли); гемобластозы, аллергии, аутоиммунные заболевания, хронические заболевания, такие как атеросклероз, и болезнь Альцгеймера.

Антиген, таким образом, предпочтительно является бактериальным и вирусным антигеном (или полипептидом и полимером, таким как полипептиды и полимеры, применимые в дендримерах), содержащим один и более эпитопов, изолированных из бактериального и вирусного антигена).

В другом варианте осуществления, антиген является аутоантигеном (эндогенным и неоантигенным), в частности, опухолеспецифичным антигеном (или полипептидом, содержащим один и более эпитопов, изолированных из таких антигенов).

В другом варианте осуществления, антиген представляет собой аллерген и полипептид, содержащий один и более эпитопов, изолированных из такого антигена.

Модификация антигенов

Предшественники меланина, как правило, имеют электрический заряд. В частности, присутствие карбоксильных групп в таком предшественнике будет обеспечивать отрицательные заряды. Таким образом, ДГИКА (5,6-дигидроксииндол-2-карбоновая кислота) является отрицательно заряженной. Напротив, другие предшественники, такие как ДГИ (5,6-дигидроксииндол) являются нейтральными и положительно заряженными.

Чтобы улучшить иммуностимулирующее свойство раскрытой композиции, предпочтительно, таким образом, когда антиген представляет нейтральный заряд и заряд, который является противоположным заряду меланина.

Таким образом, при использовании Дофа и ДГИКА в качестве предшественника меланина, можно преимущественно применять антиген, который заряжен положительно. В этом варианте осуществления однако важно отметить, что полный заряд антигена необязательно должен быть положительным, но антиген должен представлять по меньшей мере область, которая является положительно заряженной. Этот эффект может быть получен посредством добавления хвостов положительно заряженных аминокислот к антигену, но могут также применяться другие методы (прививка положительных фрагментов к антигену).

Когда применяют дофамин и ДГИ, антиген может иметь нейтральный заряд и быть отрицательно заряженным.

Цель этого варианта осуществления состоит в образовании комплекса меланин-антиген в иммуностимулирующей композиции, посредством обеспечения близости антигена и предшественника меланина друг с другом посредством притяжения зарядов (электростатического притяжения) перед окислительной полимеризацией.

Вакцина

В контексте настоящего изобретения, вакцина представляет собой композицию, которую вводят, чтобы продуцировать и искусственно увеличить иммунитет к конкретному антигену. Таким образом, следует понимать, что “иммуногенная композиция”, “иммуностимулирующая композиция” и “вакцина” являются синонимическими терминами.

Подробное описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение, таким образом, относится к иммуностимулирующей композиции, содержащей антиген и макромолекулу меланина. Указанная композиция может применяться в качестве вакцины, как будет обсуждаться ниже.

Предпочтительно, когда антиген и меланин находятся в комплексе друг с другом, можно легко провести проверку того, находится ли антиген в комплексе с меланином, проводя тонкослойную хроматографию композиции и подтверждая то, что антиген не является обнаруживаемым, и то, что большая часть (более чем 50%, более предпочтительно 60%, более предпочтительно 70%, более предпочтительно 80%, и более чем 90%) антигена, первоначально присутствующего в композиции изчезает. Меланин и антиген, таким образом, образуют комплекс, когда два молекулярных объекта связаны вместе таким образом, что они не перемещаются раздельно при тонкослойной хроматографии. Иначе говоря, не является возможным различить и разделить два молекулярных объекта в композиции. Другие методы могут применяться для подтверждения того, что антиген и меланин находятся в комплексе, такие как ВЭЖХ и полиакриламидные гели.

Следует отметить, что процентная доля антигена, который находится в комплексе с меланином, зависит от количества предшественника меланина, присутствующего перед его полимеризацией. В частности, если антиген находится в большом избытке в сравнении с предшественником, процентная доля антигена, находящегося в комплексе с макромолекулой меланина будет, низкой. В любом случае, метод количественного анализа, такой как ВЭЖХ, позволяет определить, что антиген находится в комплексе в образованном меланине и может применяться в контексте настоящей заявки.

Когда композицию получают посредством полимеризации антигена и предшественника меланина, не ограничиваясь этой теорией, предполагают, что антиген захватывается внутри макромолекулы меланина, полученной таким образом.

Как указано выше, меланин представляет собой макромолекулу, которую получают в результате окислительной полимеризации предшественников меланина. Предпочтительно, когда меланин представляет собой растворимый меланин в иммуностимулирующей композиции. Растворимый меланин является меланином, который находится в форме частиц малого размера, т.е. менее чем 500 нм, предпочтительно менее чем 250 нм и менее чем 200 нм.

Возможно получать композицию растворимого меланина фильтрацией композиции, полученной после полимеризации с использованием фильтра, имеющего адаптированный размер пор.

Следует отметить, что, в присутствии кислорода, ДГИ самопроизвольно образует осадок черного цвета, в то время как ДГИКА образует раствор золотисто-коричневого цвета (Pawelek, Pigment Cell Res. 1991 Mar;4(2):53-62) и то, что композицию, содержащую комплекс растворимый меланин-антиген таким образом, предпочтительно получают в результате использования ДГИКА, дофахрома (хотя и достаточно нестабильного), циклодофа, дофахинона и Дофа, в качестве предшественника меланина.

Получение иммуногенной композиции

Композиция, раскрытая выше, может быть получена после полимеризации предшественников меланина в присутствии антигена.

Композицию предпочтительно получают после полимеризации, в частности, окислительной полимеризации, предшественников меланина в присутствии антигена.

Антиген может присутствовать в растворе вместе с предшественником меланина, и может быть связан с предшественником меланина, в частности, посредством ковалентного связывания. Такой вариант осуществления может быть получен посредством связывания предшественника меланина с антигеном. Когда антиген является пептидом, возможно, в частности, связать предшественник меланина с N- и C-концом пептид. Это особенно просто сделать, когда предшественником меланина является тирозин и Дофа.

Как указано выше, композиция, раскрытая в настоящем описании, которая является иммуногенной, характеризуется как являющаяся растворимой композиция меланина, в которой антиген едва обнаруживается в виде свободной формы в растворе, и которая способна индуцировать иммунный ответ против антигена. Возможно добавлять свободные антигены в растворе, но композиция, описанная в настоящей заявке является такой, что она обладает иммуногенными свойствами без таких свободных антигенов в растворе. Иначе говоря, иммунный ответ может быть получен против антигена даже в осутствие свободного антигена в растворе. Таким образом, композиция, содержащая макромолекулу меланина, находящуюся в комплексе с антигеном, и антиген в растворе, также находится в пределах объема настоящего изобретения.

Можно отметить, что макромолекула меланина может быть разобрана любым способом, известным в данной области (таким как способ, раскрытый в Schraermeyer and Dohms, Pigment Cell Res. 1996 Oct; 9(5):248-54), и антиген, находящийся с ней в комплексе может, таким образом, высвобождаться, быть идентифицирован и проанализирован любым методом, известным в данной области, таким как масс-спектрометрия.

Полимеризацию предшественников меланина в присутствии антигена выполняют способами, раскрытыми в данной области.

В частности, предшественник меланина и антиген могут быть инкубированы, с использованием буфера или без буфера, с ферментом, таким как фенилаланингидроксилаза, тирозиназа, грибная тирозиназа, тирозингидроксилаза, пероксидаза, Фенол-оксидаза, Дофахром-таутомераза, ДГИКА-оксидаза, ДГИ-оксидаза. Выбор фермента будет сделан специалистом в области в зависимости от природы предшественника, присутствующего в растворе вместе с антигеном перед полимеризацией.

Смесь также подвергают действию окислителя, как раскрыто выше, чтобы инициировать полимеризацию с меланином. Когда эту полимеризацию выполняют в присутствии антигена, постулируют, что макромолекула, образованная таким образом, захватывает антиген, и/или что образуется комплекс между антигеном и меланином. Такой комплекс может содержать и может не содержать ковалентные связки между антигеном и меланином.

Когда модифицируют заряд антигена, характеристики комплекса могут также быть модифицированы.

В общем случае, несколько характеристик могут быть оптимизированы на основе принципа антиген-за-антигеном. Среди прочего, квалифицированный специалист в данной области может оптимизировать различные параметры, такие как отношение катехин (предшественник меланина)/антиген; степень окисления катехина (в частности, посредством оптимизации типа окислителя, pH, буфера, и продолжительности инкубации), и температуры реакции.

Раскрытая иммуностимулирующая композиция, может также содержать другую иммуностимулирующую молекулу, т.е. адъювант, раскрытый выше.

Это является предпочтительным, когда этот адъювант выбирают из группы, состоящей из агонистов TLR3 и агонистов TLR9 и, в частности, когда этот адъювант, который добавляют дополнительно, выбирают из смеси полиинозиновая кислота: полицитидиловая кислота (поли I:C) и олигонуклеотидов CpG.

Адъювант может быть добавлен вместе с антигеном перед инициацией полимеризации предшественника меланина. В этом случае, возможно, что он также будет находиться в комплексе с антигеном, в макромолекуле меланин/антиген.

Альтернативно, адъювант можно добавлять к иммуногенной композиции, содержащей комплекс меланин-антиген, после проведения полимеризации. В этом случае постулируют, что адъювант не находится в комплексе с макромолекулой меланин/антиген.

Применение иммуногенной композиции

Насоящее изобретение также относится к применению меланина и предшественника меланина для получения иммуностимулирующей композиции, и вакцины, предназначенной, чтобы вызывать иммунный ответ против антигена при введении животному (раскрытому выше, включая человека). Альтернативно, иммуностимулирующая композиция может применяться in vitro в присутствии живых клеток (например, макрофагов, дендритных клеток и лимфоцитов), чтобы сенсибилизировать их до введения (предпочтительно, инъекционного) у людей и животных. Полученная в результате композиция будет, таким образом, вызывать иммунный ответ против антигена у реципиента. В частности, US 6210662 раскрывает такой принцип образования терапевтических и иммуногенных композиций, состоящих из антиген-презентирующих клеток, активируемых контактом с антигенным комплексом. В случае настоящего изобретения, антиген-меланиновый комплекс представляет собой один комплекс, полученный согласно способам, описанным в настоящем документе.

Предшественник меланина подвергают воздействию антигена, и раствор затем подвергают воздействию условий полимеризации (воздействию агентов, таких как ферменты и химикаты для индуцирования полимеризации), приводящим, таким образом, к иммуностимулирующей композиции.

Настоящее изобретение также относится к применению меланина и предшественника меланина в качестве адъюванта для увеличения и вызова иммунного ответа против антигена мишени. Это является особенно применимым, когда антиген мишени не является, сам по себе, иммуногенным (т.е. никакого иммунного ответа не получают когда антиген вводят).

Настоящее изобретение также относится к меланину и предшественнику меланина в качестве иммуностимулирующей молекулы. В частности, меланин и предшественник меланина действуют для увеличения иммунного ответа на антиген, когда их презентируют вместе с этим антигеном. Следует отметить, что введение in vivo предшественника меланина и антигена может приводить к полимеризации предшественника меланина в меланин in vivo и к образованию иммуностимулирующей композиции, раскрытой выше. Это особенно актуально, когда предшественник меланина и антиген ассоциированы посредством электростатических связей, когда оба имеют противоположный заряд.

Настоящее изобретение также относится к комплексу, содержащему макромолекулу меланина, находящуюся в комплексе с антигеном, в качестве иммуностимулирующей композиции.

Настоящее изобретение также относится к комплексу, состоящему из макромолекулы меланина, находящейся в комплексе с антигеном, в качестве иммуностимулирующей композиции.

Настоящее изобретение также относится к меланину и предшественнику меланина для применения для увеличения и вызова иммунного ответа против антигена мишени.

Настоящее изобретение также относится к иммуностимулирующей композиции, содержащей меланин и антиген мишени для применения в качестве вакцины для защиты животных против заболевания, в которое вовлечены (т.е. включены и/или к которому имеют отношение) клетки, экспрессирующие внутри клеток и на их поверхности, и секретирующие антиген мишени и его эпитопы.

Вакцина может быть профилактической (т.е. предназначенной для защиты реципиента против развития заболевания) и терапевтической (т.е. предназначенной для помощи реципиенту, который уже борется с имкющимся заболеванием) вакциной.

Животное, подлежащее защите, было раскрыто выше, и может представлять собой человека.

Заболевание связано с антигеном мишени, применяемым в иммуностимулирующей композиции. Вследствие этого, антиген и его эпитоп экспрессируется и презентируется клетками животного (или патогенами) во время протекания заболевания. Заболевание, таким образом, вовлекает в себя клетки, экспрессирующие антиген мишени, и имеет отношение к этим клеткам. Такой экспрессией может быть секреция антигена (в качестве иллюстрации, антиген может являться бактериальным токсином), и поверхностная экспрессия антигена и его эпитопа (антиген может быть поверхностным белком вируса и опухолеспецифичным антигеном и его эпитопом, экспрессируемыми на поверхности опухолевых клеток), и презентация антигена и его эпитопа на поверхности клеток (такая как презентация MHC антигена и его эпитопа клеткой-мишенью).

Настоящее изобретение также относится к способу получения иммуностимулирующей композиции, включающему стадии:

a) предоставление композиции, содержащей предшественники меланина и антиген,

b) индуцирование полимеризации предшественника меланина таким образом, чтобы образовать комплекс меланин-антиген,

посредством которого получают иммуностимулирующую композицию, способную вызывать иммунный ответ против антигена при введению пациенту, и при инкубации с клетками in vitro (ими могут быть примирующие клетки, которые затем могут вводиться пациенту и животному).

Антиген, применяемый в этом способе, является антигеном, против которого предполагают иммунный ответ у реципиента.

Полимеризация индуцируется, как указано выше. Она представляет собой, таким образом, предпочтительно окислительную полимеризацию. Ее предпочтительно индуцируют in vitro, но можно также индуцировать in vivo, как указано выше.

В конкретном варианте осуществления, композиция со стадии a) также содержит адъювант. Указанный адъювант отличается от предшественника меланина, и является предпочтительно агонистом TLR3 и TLR9, такой как адъювант, выбранный из группы, состоящей из поли I:C и CpG-олигонуклеотидов.

Описание чертежей

Фиг. 1: схематическое описание синтеза эумеланина, исходя из фенилаланина.

Фиг. 2: Ответ CTL после иммунизации с использованием 1 мкг эпитопа SIINFEKL Овальбумина (pOVA, SEQ ID NO: 2) и 10 мкг человеческого gp100 эпитопа KVPRNQDWL (hgp100, SEQ ID NO: 3). Мышам C57-Bl6 посредством инъекции дважды вводили (день 0 и день 7) эпитоп+CpG-28 (SEQ ID NO: 1), эпитоп+ДОФА (D)+CpG-28; и [эпитоп+ДОФА, при совместной инкубации в течение 18 часов (D инкуб)]+10 мкг CpG-28 (10 мкг Дофа для pOVA; 100 мкг Дофа для hgp100). Иммунный ответ оценивали в день 14. Спленоциты повторно стимулировали in vitro соответствующим ограниченным пептидом MHC класса I и измеряли число IFNg-SFC (Клеток, образующих ореол). (Представительный эксперимент с n=4 мышей/группу).

Фиг. 3: Ответ CTL после 2 иммунизаций с использованием 10 мкг пептида KVPRNQDWL (hgp100, SEQ ID NO: 3) и 1 мкг SIINFEKL (pOVA, SEQ ID NO: 2), в комбинации с ДОФА (100 мкг для hgp100, 1 мкг для pOVA), и инкубации с различным молярным отношением (окислитель/Дофа) с H₂O₂ в течение 4 часов, и персульфатом аммония (APS) в течение 2 часов, соответственно. В каждой готовой форме, 10 мкг CpG-28 (SEQ ID NO: 1)/мышь добавляли перед иммунизациями. Иммунный ответ оценивали в день 14. Спленоциты повторно стимулировали in vitro соответствующим ограниченным пептидом MHC класса I и измеряли число IFNg-SFC (Клеток, образующих ореол). (n=4 мышей/группу).

Фиг. 4: Ответ CTL после иммунизации с использованием 1 мкг pOVA (SIINFEKL, SEQ ID NO: 2). Мышам C57-Bl6 посредством инъекции дважды вводили (день 0 и день 7) пептид+CpG-28 (SEQ ID NO: 1), [пептид+1 мкг ДОФА+APS] при инкубации в течение 4 часов+CpG-28; и [пептид+1 мкг Дофамина (Dn)+APS]+CpG-28. Иммунный ответ оценивали в день 14. Спленоциты повторно стимулировали in vitro соответствующим MHC класса I-ограниченным эпитопом SIINFEKL и измеряли число IFNg-SFC (Клеток, образующих ореол). (Представительный эксперимент с n=4 мышей/группу).

Фиг. 5: Ответ CTL после иммунизации с использованием 3,6 мкг длинного пептида OVA (pOVAl, SEQ ID NO: 4). Мышам C57-Bl6 посредством инъекции дважды вводили (день 0 и день 7) пептид+CpG-28 (SEQ ID NO: 1), и [пептид+100 мкг Дофамин (Dn)+ APS]+CpG-28. Иммунный ответ оценивали в день 14. Спленоциты повторно стимулировали in vitro соответствующим MHC класса I-ограниченным эпитопом SIINFEKL и измеряли число IFNg-SFC (Клеток, образующих ореол). (Представительный эксперимент с n=4 мышей/группу).

Фиг. 6: Ответ CTL после иммунизации с использованием 10 мкг человеческого эпитопа gp100 (hgp100, SEQ ID NO: 3). Мышам C57-Bl6 посредством инъекции дважды вводили (день 0 и день 7) эпитоп, coвместно инкубированный в течение 18 часов с 100 мкг ДОФА при pH 8,5 (Ag затем D); и с 100 мкг ДОФА, ранее инкубированными в присутствии кислорода перед добавлением эпитопа (D затем Ag). В каждой готовой форме, 10 мкг CpG-28 (SEQ ID NO: 1)/мышь добавляли перед иммунизациями. Иммунный ответ оценивали в день 14. Спленоциты повторно стимулировали in vitro соответствующим ограниченным пептидом MHC класса I и измеряли число IFNg-SFC (Клеток, образующих ореол). (Представительный эксперимент с n=4 мышей/группу).

Фиг. 7: Ответ CTL после иммунизации с использованием 1 мкг эпитопа Овальбумина (SIINFEKL=pOVA, SEQ ID NO: 2), и 1 мкг эпитопа, синтезированного с ДОФА в начале (D-pOVA) и в конце (pOVA-D) пептида. Мышам C57-B16 посредством инъекции дважды вводили (день 0 и день 7) пептиды+10 мкг CpG-28 (SEQ ID NO: 1). Иммунный ответ оценивали в день 14. Спленоциты повторно стимулировали in vitro с использованием пептида SIINFEKL (SEQ ID NO: 2) и измеряли число IFNg-SFC (Клеток, образующих ореол). (n=4 мышей/группу).

Фиг. 8: Тонкослойная хроматография (ТСХ) после 72-часовой инкубации при pH 8,5 (Трис-буфер). Слева: hgp100 (SEQ ID NO: 3), только; середина: hgp100 (1 мг/мл) и Дофа (10 мг/мл), совместно инкубированные с O2; справа: hgp100 (1 мг/мл) добавленный после инкубации Дофа (10 мг/мл) с O2. Пептид, захваченный окисленным ДОФА, более не виден, когда Дофа и пептид инкубируют совместно. (ТСХ проводят на алюминиевой фольге, покрытой тонким слоем силикагеля в качестве неподвижной фазы. После загрузки образцов смесь 1-Бутанол/уксусная кислота/H2O (2/1/1) применяют в качестве подвижной фазы. Пластинки для ТСХ затем опрыскивают нингидриновым реагентом).

Фиг. 9: Тонкослойная хроматография (ТСХ) после 72-часовой инкубации при pH 8,5 (Трис-буфер). Слева: hgp100 (SEQ ID NO: 3) только; другие полосы: hgp100 (1 мг/мл) инкубируемый с различными дозами Дофа (массовые отношения Дофа/hgp100: от 1/5 до 10/1). Пептид, находящейся в комплексе с меланином (окисленным ДОФА), более не виден, когда отношение превышает 2. (ТСХ: условия аналогичные Фиг. 8).

Фиг. 10: Ответ CTL после иммунизации с использованием 3,6 мкг различных пептидов OVA: SEQ ID NO: 5 (SMLVLLPKSVSGLSQLESIINFEKLTSWTS, нейтральный), и SEQ ID NO: 6 (SMLVLLPKKVSGLKQLESIINFEKLTKWTS, положительно заряженный). Мышам C57-Bl6 посредством инъекции дважды вводили (день 0 и день 7) эпитопы, coвместно инкубированные в течение 18 часов с 100 мкг ДОФА при pH 8,5. В каждой готовой форме, 10 мкг CpG-28 (SEQ ID NO: 1) на мышь добавляли перед иммунизациями. Иммунный ответ оценивали в день 14. Спленоциты повторно стимулировали in vitro соответствующим MHC класса I-ограниченным эпитопом SIINFEKL и измеряли число IFNg-SFC (Клеток, образующих ореол). (n=4 мышей/группу).

Фиг. 11: SDS-ПАГЭ (16% полиакриламидный гель) различных препаратов: полоса ММ: маркер молекулярной массы; полоса “Контроль EphA2”: контрольный пептид EphA2 отдельно (SEQ ID NO: 9); полоса “Фильтрат”: фильтрат комплекса меланин-EphA2 после фильтрации через фильтр 10 кДА; полоса “Ретентат”: ретентат комплекса меланин-EphA2 после фильтрации через фильтр 10 кДА, ресуспендирование, растворение и нагрев в загрузочном буфере, содержащем SDS. (Меланин-EphA2 получали совместной инкубацией пептида EphA2 с L-Дофа (массовое отношение 1:10) в условиях аэрации)

Фиг. 12: Физико-химические харктеристики gp100-связанного меланина: УФ-видимый спектр (Изменение с течением времени в процессе синтеза). УФ-видимые спекты получали, используя спектрофотометр JASCO V630 (JASCO, Lisses, France). Раствор полимеризуемого L-Дофа разбавляли 1/20, и спектры регистрировали, используя кварцевую кювету с длиной пробега 1 см, после различных значений времени инкубации.

Фиг. 13: Число IFNγ-секретирующих лимфоцитов на 10⁵ спленоцитов после иммунизации с использованием различных готовых форм. A. Воздействие TLR9-агониста в конкретной композиции с gp100 (SEQ ID NO: 3) и меланином. B. Эффект отношения антиген/L-Дофа в инкубационной среде для получения gp100-меланина на иммунный ответ. C. Сравнение различных композиций gp100-меланина (с различной дозировкой антигена) с композицией, ассоциирующей gp100, классический адъювант (неполный адъювант Фрейнда, IFA) и агонист TLR9.

Фиг. 14: Число IFNγ-секретирующих лимфоцитов на 10⁵ клеток (спленоцитов) при стимуляции эпитопами CD4 и CD8, после иммунизации мышей синтетическим пептидом (pOVALs) (SEQ ID NO: 12), содержащим оба, CD4 и CD8 эпитопы овальбумина, либо по отдельности или в композиции с меланином. Результаты показаны для мышей, иммунизированных в день 0 и 14 и умерщвленных в день 21 (A), и иммунизированных в день 0 и 21 и умерщвленных в день 42 (B).

Фиг. 15: Средний объем опухоли с течением времени для различных готовых форм вакцины.

Примеры

Методы

Во всех примерах, применяли эпитопы, презентируемые H-2Kb (мышиным MHC I) (за исключением примера 18, в котором также применяли эпитоп мышиного MHC-II).

Мышей C57-B16, 5-недельного возраста иммунизировали дважды (в день 1 и день 7) различными готовыми формами в комбинации с агонистом 9толл-подобного рецептора (TLR-9) (10 мкг олигонуклеотида CpG-28, TAAACGTTATAACGTTACGACGTCAT (SEQ ID NO: 1)). После 2 иммунизаций, CD8+ иммунный ответ оценивали в день 14, используя основанный на секреции гамма-интерферона (IFNg) метод иммуноферментных пятен, после повторной стимуляции общих спленоцитов соответствующим эпитопом MHC класса-I (SIINFEKL (SEQ ID NO: 2) для Овальбумина и KVPRNQDWL (SEQ ID NO: 3) для человеческого gp100)

Пример 1 - Инкубация антигена и предшественника меланина в присутствии окислителя индуцирует иммунный ответ

Эпитоп овальбумина (SIINFEKL, SEQ ID NO: 2) отдельно, и смешанный с 10 мкг ДОФА, или смешанный с ДОФА и дополнительно инкубированный в течение 18 часов в присутствии кислорода для инициации окисления, применяли в качестве препаратов вакцины. В то время как эпитоп по отдельности не запускал какого-либо значительного CD8 иммунного ответа, ассоциация с ДОФА, особенно после инкубации, могла индуцировать пятна IFNg.

Аналогичные данные получали при использовании слабо иммуногенного человеческого эпитопа gp100 (KVPRNQDWL, SEQ ID NO: 3). Могут применяться очень малые количества эпитопа.

Эти результаты показаны на Фиг. 2.

В частности, на этой модели, всего 10 нг SIINEFKL (SEQ ID NO: 2) было достаточно для обнаружения иммунного ответа (данные не показаны).

Пример 2 - иммунный ответ не зависит от используемого окислителя (либо химического или ферментативного окисления)

Могут применяться другие окислители, такие как пероксид водорода (H₂O₂) и персульфат аммония (APS) (Фиг. 3).

В каждом случае, в зависимости от используемых антигена и окислителя, оптимальную концентрацию легко определить.

Как описано прежде, ответ CTL наблюдали без добавления какого-либо окислителя, но эффективность действия вакцины, как правило, усиливалась окислением, причем оптимальное молярное отношение окислитель/Дофа составляло 1/4.

Другие окислители, такие как хлорид железа, также могут применяться и приводят к таким же результатам.

Как показано в Таблице 1, ферментативное окисление грибной тирозиназой также приводило к достижению сильного иммунного ответа.

Методика окисления	Протокол иммунизации	Число мышей	Число IFNγ-секрет лимфоцитов средн. +/- SD	Отрицательные контроли (Несоотв. эпитоп) средн. +/- SD
L-Дофа+Cu2+ 5 мМ (+O2), время инкубации: 18 ч	день 0 и 8, умерщвл день 14	4	47+/-47	1+/-1
L-Дофа+Fe3+ 5 мМ (+O2), время инкубации: 18 ч	день 0 и 8, умерщвл день 14	4	160+/-52	0+/-1
L-Дофа+Fe3+ 20 нМ (+O2), время инкубации: 18 ч	день 0 и 8, умерщвл день 14	4	162+/-118	1+/-2
L-Дофа +Грибная Тирозиназа (+O2), время инкубации: 18 ч	день 0 и 8, умерщвл день 14	8	246+/-164	1+/-1

Таблица 1

Пример 3 - Иммунный ответ наблюдают с другим предшественником меланина

Этот пример демонстрирует, что Дофамин может применяться вместо ДОФА (Фиг. 4). В этом эксперименте, 1 мкг ДОФА и 1 мкг Дофамин смешивали с 1 мкг SIINFEKL (pOVA, SEQ ID NO: 2), инкубировали 4 часа с окислителем-персульфатом аммония (APS) и затем применяли в качестве препаратов вакцины в ассоциации с 10 мкг CpG-28.

Пример 4 - Применение длинного антигена, содержащего эпитоп, все еще позволяет проводить процессинг и соответсвующее презентирование эпитопа

Эксперименты проводили, чтобы показать, что другие антигены, такие как длинный пептид, могут индуцировать ответ CTL с использованием одинаковых методик. Длинный пептид OVA (SMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTS (SEQ ID NO: 4)), содержащий эпитоп SIINFEKL (SEQ ID NO: 2), тестировали либо по отдельности или в комбинации с Дофамином и после 4-часовой инкубации с APS и затем примняли в качестве препарата вакцины в ассоциации с 10 мкг CpG-28. Лишь препарат, содержащий Дофамин, запускал иммунный ответ (Фиг. 5).

Пример 5 - В композиции могут применяться различные адъюванты

В этом эксперименте было показано, что различные адъюванты могут быть преимущественно добавлены к готовой форме [Антиген+Дофа].

В этом эксперименте, используемые адъюванты заменяли на CpG-ODN, согласно такому же протоколу, который раскрыт в Методах выше.

Эпитоп SIINFEKL (SEQ ID NO: 2), комбинировали (или не комбинировали) с 100 мкг Дофа, дополнительно инкубировали в течение 18 часов в присутствии кислорода для инициации окисления, и затем применяли в качестве вакцины в ассоциации с 10 мкг CpG-28 (агониста TLR9), 10 мкг смеси полиинозиновая кислота:полицитидиловая кислота (поли I:C) (агонист TLR3), и смешивали с адъювантом Фрейнда и солями алюминия (Квасцами) (об/об 1/1).

CD8 иммунный ответ в день 14 был значительно более высоким для композиции[ДОФА-антиген], чем ответ, наблюдаемый для антигена без ДОФА, особенно когда применяли лиганды TLR3 и TLR9.

Пример 6 - Иммунный ответ включает гуморальный ответ

Иммунизация с использованием композиции меланин/антиген индуцирует гуморальный ответ (циркулирующие антитела).

Белок овальбумина (1 мкг) смешивали с Дофа (1 мкг) при pH 7,4, инкубировали в течение 4 часов с APS (0,3 мкг), и посредством подкожной инъекции вводили 10 мкг мышам C57/Bml6 в день 0 и день 7.

В день 14, наблюдали значительные титры антител против овальбумина, как IgG1 (1/8000), так и IgG2b (1/5250) подтипов, что демонстрировало смешанный Th1 и Th2 иммунный ответ.

Пример 7 - Образование комплекса посредством совместной инкубации является благоприятным

Было показано, что совместная инкубация антигена и катехинового фрагмента во время его окисления делает возможным потенцирование включенного иммунитета.

10 мкг эпитопа hgp100 (KVPRNQDWL, SEQ ID NO: 3), смешивали с 100 мкг ДОФА при pH 8,5, затем инкубировали в течение 18 часов в присутствии кислорода для инициации окисления, и смешивали с раствором ДОФА, который прежде инкубировали в присутствии кислорода для инициации окисления перед добавлением эпитопа.

Значительный CD8 иммунный ответ наблюдали, когда эпитоп совместно инкубировали вместе с ДОФА (Фиг. 6).

Пример 8: Иммунный ответ может быть получен с различными предшественниками производных меланина

L-Дофа явлется удобным катехином для применения, приводящим к растворимому меланину. Однако могут применяться другие предшественники меланина. В этом эксперименте, 10 мкг эпитопп hgp100 (KVPRNQDWL, SEQ ID NO: 3), смешивали с одним из

- 100 мкг ДОФА,

- 100 мкг L-Тирозина,

- 100 мкг 3-(4-Гидроксифенил)пропионовой кислоты,

- 100 мкг 6-Гидрокси-ДОФА,

-100 мкг Дигидро кофеиновой кислоты,

- 100 мкг ДГИ,

- 100 мкг ДГИКА,

- 50 мкг ДГИ+50 мкг ДГИКА, и

100 мкг HICA,

при pH 8,5 в Трис-буфере.

Раствор затем инкубировали в течение 18 часов в присутствии кислорода для инициации окисления.

В каждую готовую форму добавляли 10 мкг CpG-28/мышь перед подкожными иммунизациями с использованием различных предшественников меланина. Мышей либо иммунизировали в день 0 и 8 и умерщвляли в день 14, или иммунизировали однократно в день 0 и умерщвляли в день 8.

Наблюдали значительный CD8 иммунный ответ, особенно, когда эпитоп совместно инкубировали вместе с Дофа (L-Дофа или D-Дофа), и 6-гидроксидофа, и дигидроксинафталином. Также наблюдали иммунные ответы пониженной величины, при использовании Дофамина и Boc-Дофа (N-(трет-Бутилоксикарбонил)-L-дофа).

Присутствие аминогруппы в боковой цепи, и 2-х гидроксильных фрагментов в фенольном кольце предшественника меланина, по-видимому, является очень благоприятным для биологической активности, и, таким образом, является предпочтительным.

Пример 9: Комплекс образуется между полимеризованным меланином и антигеном

Эксперименты in vitro с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ) подтверждают гипотезу, что инкубация пептида в то время как катехин окисляется, модифицирует характеристику конечной готовой формы и что между двумя молекулами образуется комплекс (Фиг. 8).

Свободный пептид был виден на ТСХ только тогда, когда hgp100 добавляют после окисления Дофа, но не тогда, когда Дофа и hgp100 совместно инкубируют с окислителем.

Следует отметить, что стабильность пептида в присутствии окислителя подвергалась проверке, и, что исчезновение пептида, таким образом, не обусловлена окислителем.

Используя тонкослойную хроматографию (ТСХ), возможно просто и рутинным образом определить минимальную дозировку катехина, требуемую для загрузки некоторого количества пептида. Например, при использовании hgp100, массовое отношение Дофа/пептид свыше 2 является благоприятным (Фиг. 9).

Пример 10 - Иммунный ответ получают после полимеризации ДОФА, ковалентно связанного с антигеном

Мышей иммунизировали либо 1 мкг эпитопа Овальбумина (pOVA, SIINFEKL, SEQ ID NO: 2), или 1 мкг эпитопа, синтезированного вместе с ДОФА в начале (D-SIINFEKL, D-pOVA) и в конце (SIINFEKL-D, pOVA-D) пептида. В то время как эпитоп по отдельности не запускал какого-либо значительного CD8 иммунного ответа, модифицированные пептиды, особенно один с C-концевым ДОФА, индуцировал сильный CTL иммунные ответы (Фиг. 7).

Пример 11 - Другой адъювант можно добавлять до и после окисления

L-ДОФА (100 мкг) инкубировали с эпитопом hgp100 (KVPRNQDWL, SEQ ID NO: 3), в присутствии олигонуклеотида CpG-28, затем инкубировали в течение 18 часов в присутствии кислорода для инициации окисления.

Альтернативно, олигонуклеотид CpG-28 добавляли после окисления L-ДОФА и эпитопа hgp100.

Иммунные ответы, полученные после иммунизации мышей полученными в результате композициями, были аналогичными, таким образом, указывая на то, что другой адъювант можно добавлять до и после реакции окисления (полимеризации).

Пример 12 - Композиция, содержащая комплекс меланин-антиген может быть получена в виде раствора растворимого меланина

Растворы Дофа (2 мг/мл) и Дофамина (2 мг/мл) инкубировали с pOVA (0,1 мг/мл) и без него при pH 7,4 и 8,5, и с различными окислителями (O2, персульфат аммония) в течение 20 часов. Все растворы потемнели в интервале нескольких часов. При использовании Дофамина, при оптической микроскопии наблюдали крупные агрегаты. При центрифугировании, растворы дофамина выделяли осадок, и некоторое темное вещество оставлось прилипшим к пробиркам.

Напротив, при некоторых условиях (например, при инкубации с кислородом при pH 8,5), растворы Дофа не осаждались, даже после центрифугирования (16000 g в течение 30 минут) и осадок не прилипал к пробиркам. Эти растворы Дофа оставались стабильными в течение нескольких недель, и никаких агрегатов нельзя было увидеть с помощью оптической микроскопии. Этот раствор может быть отфильтрован через фильтр 0,2 мкм, но не через фильтр с пределом пропускания 100 кДальтон (приблиз. 0,01 мкм).

В итоге, несмотря на то, что оба соединения можно успешно применять в готовых формах вакцин, их характеристики отличаются. Не ограничиваясь этой теорией, это может быть обусловлено различной процентной долей ДГИ и ДГИКА в каждой готовой форме.

Использование различных процентных долей ДОФА и Дофамина в исходной композиции, (особенно, в соответствии с характеристиками антигена и, в особенности, зарядом антигена) может преимущественно привести к получению различных галеновых готовых форм.

Пример 13 - Композиция, содержащая коплекс меланин-антиген является окрашенным раствором

Для получения готовых форм, предпочтительно, когда раствор L-Дофа смешивают с раствором пептида (массовое отношение L-Дофа: эпитоп между 1:100 и 1:1, предпочтительно между 1:10 и 1:2, в зависимости от эпитопов), и смесь затем окисляется при pH 8,5 в условиях аэрации.

При этих условиях, бесцветный раствор L-Дофа становится черным с генерацией синтетического меланина, процесс, который может подвергаться мониторингу с использованием УФ-спектроскопии (Фиг. 12). Кинетику окисления L-Дофа можно оценить по отношению 350/280 нм. При этих условиях, при фильтрации через фильтр 10 кДа, черное вещество удерживается в верхней камере, и может быть легко ресуспендировано в физрастворе. Полученный в результате продукт (содержащий как меланин, так и пептиды) может быть дополнительно охарактеризован с использованием инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FITR), Ядерного Магнитного Резонанса (ЯМР) и Трансмиссионной электронной микроскопии.

Пример 14 - Модификация заряда антигена может улучшить иммунный ответ и иммуногенность композиции

Заряд пептида pOVAl (SEQ ID NO: 4) является отрицательным, и его последовательность, таким образом, модифицировали, чтобы сделать ее нейтральной (SMLVLLPKSVSGLSQLESIINFEKLTSWTS, SEQ ID NO: 5) и положительной (SMLVLLPKKVSGLKQLESIINFEKLTKWTS, SEQ ID NO: 6). Когда эти пептиды применяли вместе с Дофа (который проявляет фрагмент COO-, который является отрицательно заряженным) в качестве предшественника меланина, иммунный ответ, полученный после 2 иммунизаций, был сильным с использованием положительно заряженного пептида, и промежуточным с использованием нейтрального пептида (Фиг. 10).

Результаты, полученные после иммунизации с использованием этих пептидов и Дофамина (который является положительно заряженным при физиологических pH) в качестве предшественника меланина, были противоположными (т.е. самый высокий иммунный ответ наблюдали с SEQ ID NO:4 (отрицательно заряженный пептид) и самый низкий иммунный ответ наблюдали с SEQ ID NO: 6 (положительно заряженный), в то время как ответ с SEQ ID NO: 5 был промежуточным).

Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что модификация антигена является благоприятной, чтобы его заряд не был одинаковым с зарядом полученного в результате меланина.

Аналогичные данные получали с эпитопом MHC I из Trp2 (VYDFFVWL, SEQ ID NO: 7), который не содержит каких-либо положительно заряженных аминокислот.

Добавление аргининов (R) и лизинов (K) к NH2-концу пептидов усиливало иммунный ответ, при сравнении с немодифицированным Trp2 (животных иммунизировали один раз, используя готовые формы, состоящие из пептида (10 мкг/мышь), совместно инкубированного с L-Дофа (100 мкг/мышь), затем смешанные с CpG-28 (10 мкг/мышь). CD8 иммунные ответы оценивали в день 8).

Аналогичные данные получали с использованием вирусного эпитопа у мышей Balb/c (gPr73: SFAVATTAL, SEQ ID NO: 8). Добавление Лизина к NH2-концу значительно усиливало иммунный ответ. В обоих случаях, если глутамат (E) добавляли вслед за лизином, эффективность действия снижалась (Таблица 2).

Структура эпитопа	Число мышей	Число IFNγ-секретирующих лимфоцитов среднее +/-SD	T-тест Стьюдента (в сравнении с природным эпитопом)
Trp2	7	30 +/- 34	/
K-Trp2	7	226 +/- 79	p<0,001
R-Trp2	7	220 +/- 56	p<0,001
KAR-Trp2	8	210 +/- 78	p<0,001
KE-Trp2	7	30 +/- 9	p=n.s.
gPr73	8	5 +/- 4	/
K-gPr73	8	21 +/- 16	p=0,02
KE-gPr73	8	14 +/- 22	p=n.s.

Таблица 2

Пример 15 - Распределение меланина в дренирующих лимфатических узлах

Десять (10) мкг эпитопа hgp100 (KVPRNQDWL, SEQ ID NO: 3) смешивали с 100 мкг ДОФА при pH 8,5, затем инкубировали в течение 18 часов в присутствии кислорода для инициации окисления и генерации gp100-связанного меланина (gp100-меланина).

Для оценки распределения этой готовой формы in vivo, мышам посредством подкожной инъекции вводили [gp100-меланин+CpG-28] и физраствор, и их умерщвляли на дни 2 и 7 (n=3/группу). Чтобы избежать любых отклонений, вызванных природным меланином, эти эксперименты проводили на мышах Balb/c, которые естественным образом лишены меланина. Черная пигментaция дренирующих паховых лимфатических узлов была макроскопически видимой в день 2 после инъекции у животных с инъекцией gp100-меланина. Окрашивание по методу Фонтана-Массон подтвердило многочисленные загруженные меланином макрофаги в синусах и, в меньшей степени, в паракортикальных областях, которые являются зоной T-клеток. Схема распределения меланина была аналогичной на дни 2 и 7 после инъекции. Никакого меланина не наблюдали у мышей, которые получали только физраствор. Эти результаты показывают, что готовая форма вакцины эффективно достигала дренирующих лимфатических узлов in vivo.

Это наблюдение согласуется с тем фактом, что индукция антиген-специфичного иммунитета основана на прямом взаимодействии DC с наивными T-клетками, которое происходит в зоне T-клеток лимфатических узлов.

Пример 16 - Улучшение композиции вакцины

Свободный пептид gp100 и gp100-меланин применяли в качестве препаратов вакцины по отдельности и смешивали с агонистом TLR9, CpG-28 (CpG) (n=8 мышей/группу).

При комбинировании с CpG, gp100-меланин, но не gp100, индуцировал значительное число IFNγ-секретирующих лимфоцитов (p<0,001) (Фиг. 13A).

Если эпитоп gp100 добавляли в готовую форму вакцины после оксления L-Дофа вместо добавления L-Дофа перед окислением, наблюдали уменьшение ответа CTL (p<0,01).

Значительный иммунитет получали при массовом отношении L-Дофа:эпитоп, начиная с 1:1, причем наилучший ответ наблюдали при отношении, равном 4:1 (Фиг. 13B). Минимальная доза эпитопа gp100, требуемая для индуцирования CTL составляла 0,5 мкг (p<0,01, при сравнении с наименьшей тестируемой концентрацией) (Фиг. 3c). Как при 10, так и при 50 мкг эпитопа gp100, готовая форма вакцины согласно настоящему изобретению показала благоприятные результаты (p<0,01)при сравнении с комбинацией неполного адъюванта Фрейнда (IFA) и агониста TLR9, комбинацией, которую обычно применяют для запуска ответов CTL (Фиг. 13C).

Пример 17 - Комплекс меланин-антиген

Получали подтверждение включения пептида в меланин.

Раствор L-Дофа смешивали с пептидом EPHA2 (FSHHNIIRL, SEQ ID NO: 9) при массовом отношении L-Дофа: эпитоп, равном 1:4. Смесь затем окисляли при pH 8,5 в условиях аэрации.

Когда этот препарат фильтровали через фильтр 10 кДа, меланин удерживался на фильтре и в фильтрате не могли обнаружить никакого пептида (Фиг. 11, полоса Фильтрат), что позволяет предположить, что пептид EPHA2 был связан с меланином. Несомненно, когда этот ретентат ресуспендировали, растворяли и нагревали в буфере для загрузки, содержащем сильный детергент (SDS), пептид EPHA2 диссоциировал из меланина, и мог быть индивидуально идентифицирован на SDS-ПАГ (16% полиакриламидном геле) (Фиг. 11, полоса Ретентата).

Пример 18 - Анализ иммунного ответа

Оценивали способность готовой формы согласно настоящему изобретению запускать иммунный ответ CD4 (эпитопы MHC класса II).

С этой целью, синтетический синтезировали пептид (pOVALs) содержащий как CD4 (ISQAVHAAHAEINEA, SEQ ID NO: 10), так и CD8 (SIINFEKL, SEQ ID NO: 11) эпитопы овальбумина. Этот пептид несет последовательность SLKISQAVHAAHAEINEAGRLRGSIINFEKLTKWR, SEQ ID NO: 12).

Этот пептид (10 мкг/мышь) смешивали с раствором L-Дофа (40 мкг/мышь), инкубировали в течение 18 часов в условиях аэрации, для генерации pOVAs-меланина, и применяли в качестве вакцины (без какого-либо агониста TLR9 и какого-либо дополнительного адъюванта).

Мышей иммунизировали либо в день 0 и 14 и умерщвляли в день 21, или в день 0 и 21 и умерщвляли в день 42.

Эпитоп-специфичную выработка IFNγ спленоцитами определяли после стимуляции in vitro эпитопами CD4 и CD8.

Готовая форма с меланином запускала значительный иммунный ответ CD4, в обоих случаях. Кроме того, также наблюдали иммунный ответ CD8, показывающий, что нет необходимости в добавлении агониста TLR9 к готовой форме (Фиг. 14).

Пример 19 - Применение различных адъювантов

Оценивали способность хорошо описанных агонистов TLR9s, отличных от CpG-28, запускать и улучшать иммунный ответ у мышей с использованием комплекса меланин/антиген.

Пептид gp100 (10 мкг/мышь) смешивали с L-Дофа (40 мкг/мышь), инкубировали в течение 18 часов в условиях аэрации, смешивали с различными агонистами TLR9 CpG-28, ODN-1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT, SEQ ID NO: 13, и ISS (TGACTGTGAACGTTCGAGATGA, SEQ ID NO: 14), затем применяли в качестве препаратов вакцины.

Величина иммунного ответа была сходной для всех агонистов TLR9.

Агонист TLR9	Число мышей	Число IFNγ-секретирующих лимфоцитов, средн. +/-SD	T-тест Стьюдента (в сравнении с CpG-28)
CpG-28 (агонист TLR9)	4	211 +/- 83	/
1826 (агонист TLR9)	4	134 +/- 54	p=n.s.
ISS (агонист TLR9)	4	147 +/- 63	p=n.s.

Таблица 3

Также оценивали эффективность действия поли I:C (поли I:C= Полиинозиновая:полицитидиловая кислота), агониста TLR3.

Мышей C57BL/6 иммунизировали с использованием gp100 (10 мкг/мышь)+поли I:C (10 мкг/мышь) и пептида gp100 (10 мкг/мышь), смешанного с L-Дофа (40мкг/мышь), инкубировали в течение 18 часов в условиях аэрации, и смешивали с поли I:C (10 мкг/мышь).

Аналогично с тем, что наблюдали при использовании агонистов TLR9, при комбинировании с поли I:C, образование меланина превосходило свободный пептид (среднее число IFNγ-секретирующих лимфоцитов +/-SD: 20+/- 18 в сравнении 1+/-1, соответственно, p=0,02).

Пример 20 - Подкожные инъекции pOVA30-меланина защищают против установленных сингенных опухолей

Далее исследовали, являлись ли эти CD8+ T-клетки функциональными in vivo.

Овальбумин-трансфсцированные клетки (E.G7-OVA) вводили посредством подкожной инъекции мышам C57BL/6, и мышей (n=10/группу) иммунизировали в дни 4 и 18 с использованием [меланин+CpG-28], [pOVA30-меланин+CpG-28], [pOVA30+CpG-28]. У всех мышей развивались измеряемые опухоли.

Пептид pOVA30 (SMLVLLPKKVSGLKQLESIINFEKLTKWTS, SEQ ID NO: 15), содержит эпитоп CD8 (SIINFEKL, SEQ ID NO: 11) белка овальбумина. pOVA30-меланин генерировался посредством совместной инкубации пептида с L-Дофа в условиях аэрации, как описано ранее.

Значительное уменьшение роста опухоли в сравнении с ростом опухоли в контрольных группах наблюдали лишь после иммунизации с использованием [pOVA30-меланин+CpG-28] (p<0,001) (Фиг. 15). Полная регрессия опухоли происходила у 2/10 мышей.

Обсуждение и комментарии

Приведенные выше примеры демонстрируют, что иммунизация с использованием комплекса меланина и антигена позволяет получать иммунный ответ у хозяина. Этот иммунный ответ является более высоким, чем в случае применения антигена по отдельности. Иммунный ответ может быть потенцирован, когда заряд антигена и заряд предшественника меланина, полимеризованного в комплексе, приспособлены друг к другу (предпочтительно, когда они не имеют одинакового знака).

Следует также отметить, что большинство пептидов, используемых в этих экспериментах содержат одиночные эпитопы МНС. Следовательно, адъювант обычно был предпочтительным для наблюдения оптимального иммунного ответа.

Однако также было показано, что комбинирование T-хелперов и эпитопов MHC класса-I обеспечивает иммуногенным композициям согласно настоящему изобретению индуцирование значительных иммунных ответов без необходимости в адъюванте, эпитопы T-хелперов вероятно обеспечивают мобилизацию T-хелперных клеток и потенцирование цитотоксического ответа, связанного с эпитопами MHC класса-I.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> АССИСТАНС ПЮБЛИК - ОПИТО ДЕ ПАРИ

ЮНИВЕРСИТЕ ПАРИ 13

<120> ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ КОМПОЗИЦИИ

<130> BRV 110 - WO

<150> EP15306887.9

<151> 2015-11-27

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> олигонуклеотид ODN CpG-28

<400> 1

taaacgttat aacgttacga cgtcat 26

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп овальбумина

<400> 2

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> человеческий эпитоп gp100

<400> 3

Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu

1 5

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> длинный пептид OVA

<400> 4

Ser Met Leu Val Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu

1 5 10 15

Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser

20 25 30

<210> 5

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> нейтральный длинный пептид OVA

<400> 5

Ser Met Leu Val Leu Leu Pro Lys Ser Val Ser Gly Leu Ser Gln Leu

1 5 10 15

Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Ser Trp Thr Ser

20 25 30

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> положительный длинный пептид OVA

<400> 6

Ser Met Leu Val Leu Leu Pro Lys Lys Val Ser Gly Leu Lys Gln Leu

1 5 10 15

Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Lys Trp Thr Ser

20 25 30

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> эпитоп Trp2 MHC I

<400> 7

Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вирусный эпитоп gPr73

<400> 8

Ser Phe Ala Val Ala Thr Thr Ala Leu

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> эпитоп пептида EphA2

<400> 9

Phe Ser His His Asn Ile Ile Arg Leu

1 5

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> эпитоп овальбумина CD4

<400> 10

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala

1 5 10 15

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> эпитоп овальбумина CD8

<400> 11

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<210> 12

<211> 35

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Пептид, содержащий эпитопы овальбумина CD4 и CD8

<400> 12

Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn

1 5 10 15

Glu Ala Gly Arg Leu Arg Gly Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr

20 25 30

Lys Trp Arg

35

<210> 13

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> лиганд 1826 TLR-9

<400> 13

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 14

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> лиганд ISS TLR-9

<400> 14

tgactgtgaa cgttcgagat ga 22

<210> 15

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> пептид pOVA30

<400> 15

Ser Met Leu Val Leu Leu Pro Lys Lys Val Ser Gly Leu Lys Gln Leu

1 5 10 15

Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Lys Trp Thr Ser

20 25 30

<---

1. Иммуностимулирующая композиция, содержащая макромолекулу меланина, находящуюся в комплексе с антигеном, где меланин представляет собой эумеланин или феомеланин.

2. Иммуностимулирующая композиция по п. 1, где меланин находится в форме частиц менее чем 500 нм.

3. Иммуностимулирующая композиция по пп. 1 и 2, в которой меланин получен in vitro посредством окислительной полимеризации предшественников меланина.

4. Иммуностимулирующая композиция по п. 1 или 2, где окислительная полимеризация выполнена в присутствии окислителя, такого как кислород, пероксид водорода, персульфат аммония, ионы железа или йодид натрия, и необязательно, в присутствии фермента, выбранного из группы, состоящей из фенилаланингидроксилазы, тирозиназы, грибной тирозиназы, тирозингидроксилазы, пероксидазы, фенол-оксидазы, дофахром-таутомеразы, дигидроксииндолкарбоновой кислоты (ДГИКА)-оксидазы и 5,6-дигидроксииндол (ДГИ)-оксидазы.

5. Иммуностимулирующая композиция по п. 3, где антиген и предшественник меланина являются ковалентно связанными до полимеризации.

6. Иммуностимулирующая композиция по п. 3, где антиген и предшественник меланина не являются ковалентно связанными до полимеризации.

7. Иммуностимулирующая композиция по п. 3, где предшественник меланина выбран из группы, состоящей из L-дофа, L-тирозина, D-дофа, 6-гидрокси-Дофа, дофахинона, циклодофа, дофахрома, дигидроксииндолкарбоновой кислоты (ДГИКК), 5,6-дигидроксииндола (ДГИ), дофамин-о-хинона, дофамина, лейкодофаминохрома и дофаминохрома.

8. Иммуностимулирующая композиция по любому из пп. 1-7, которая также содержит адъювант.

9. Иммуностимулирующая композиция по п. 8, где адъювант находится в комплексе с макромолекулой меланина, находящейся в комплексе с антигеном.

10. Иммуностимулирующая композиция по п. 8, где адъювант не находится в комплексе с макромолекулой меланина, находящейся в комплексе с антигеном.

11. Иммуностимулирующая композиция по п. 8, где адъювант выбран из группы, состоящей из квасцов, эмульсий лигандов PRR, лигандов TLR3 и RLR, лигандов TLR4, лигандов TLR5, лигандов TLR7/8, лигандов TLR9, в частности поли I:C и CpG ODN.

12. Иммуностимулирующая композиция по любому из пп. 1-11, где антиген содержит по меньшей мере один эпитоп, выбранный из группы, состоящей из эпитопов МНС и эпитопов B-клеток.

13. Применение меланина или предшественника меланина для получения иммуностимулирующей композиции, предназначенной для вызова клеточного и/или гуморального иммунного ответа против антигена при введении в организм хозяина.

14. Применение меланина или предшественника меланина для увеличения или вызова клеточного и/или гуморального иммунного ответа против антигена мишени in vivo или in vitro.

15. Применение иммуностимулирующей композиции, содержащей меланин и антиген мишени, в качестве вакцины для защиты животного против заболевания, в которое вовлечены клетки, экспрессирующие антиген мишени.

16. Способ получения иммуностимулирующей композиции, включающий стадии:

a) предоставление композиции, содержащей предшественник меланина и антиген,

b) индуцирование окислительной полимеризации предшественника меланина,

посредством которого получают иммуностимулирующую композицию, способную вызывать иммунный ответ против антигена при введении пациенту и при инкубации с клетками in vitro.

17. Способ по п. 16, где окислитель выбран из группы, состоящей из кислорода, пероксида водорода, персульфата аммония, ионов железа или йодида натрия, и необязательно, в присутствии фермента, выбранного из группы, состоящей из фенилаланингидроксилазы, тирозиназы, грибной тирозиназы, тирозингидроксилазы, пероксидазы, фенол-оксидазы, дофахром-таутомеразы, дигидроксииндолкарбоновой кислоты (ДГИКА)-оксидазы и 5,6-дигидроксииндол (ДГИ)-оксидазы.

18. Способ по п. 16, где антиген и предшественник меланина в композиции со стадии a) являются ковалентно связанными.

19. Способ по п. 16, где антиген и предшественник меланина в композиции со стадии a) не являются ковалентно связанными.

20. Способ по любому из пп. 16-19, где предшественник меланина выбирают из группы, состоящей из L-дофа, L-тирозина, D-дофа, 6-гидрокси-Дофа, дофахинона, циклодофа, дофахрома, дигидроксииндолкарбоновой кислоты (ДГИКК), 5,6-дигидроксииндола (ДГИ), дофамин-о-хинона, дофамина, лейкодофаминохрома и дофаминохрома.

21. Способ по любому из пп. 16-20, где композиция со стадии a) также содержит адъювант.

22. Способ по любому из пп. 16-20, где адъювант добавляют к композиции, полученной после стадии b).