Способ идентификации штаммов vibrio chlerae o1, определения их токсигенности и биовара с дифференциацией биовара эльтор на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления с учетом результатов в режиме "реального времени"

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ идентификации штаммов Vibrio cholerae O1, определения их токсигенности и биовара с дифференциацией биовара Эль Тор на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени», включает: выделение ДНК из исследуемой культуры Vibrio cholerae O1; компоненты для проведения ПЦР: 10х буфер для TaqPol, MgCL₂ (50 мМ), смесь dNTPs (5 мМ), TaqPol (5 ед/мкл), деионизированную стерильную воду, смесь праймеров 1 - (F+R) ctxB праймеры (10 мМ), зонд G -FAM (10 мМ) и зонд A-VIC (10 мМ), смесь праймеров 2 - (F+R) rtxC праймеры (10 мкМ), зонд ROX на ген rtxC (10 мМ), два положительных (ПКО+Classical и ПКО+Е1 Tor) и один отрицательный (Н₂О) контроли; проведение полимеразной цепной реакции в один прием в двух реакционных смесях различного состава в объеме 25 мкл в режиме «реального времени»: 1 цикл 95°С - 3 мин, 40 циклов 95°С - 20 с, 57°С - 30 с (измерение флуоресценции), 72°С - 20 с; учет результатов по специфическим кривым полосам в каналах Green (ген ctxB^CL), Yellow (ген ctxB^EL), Orange (ген rtxC) при уровне пороговой линии на данных каналах учета - 0,05; Ct≤30. Способ с использованием набора обеспечивает возможность быстро и достоверно идентифицировать холерные вибрионы классического биовара или биовара Эльтор и дифференцировать выявленные токсигенные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор на типичные и измененные варианты. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 18 ил.

 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1, определению их биовара (классического или Эль Тор) и дифференциации V. cholerae O1 биовара Эль Тор на типичные изоляты и измененные варианты, и предназначено для идентификации холерных вибрионов O1 серологической группы, выделенных от человека или из объектов окружающей среды, на уровне генома с помощью полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» в специализированных лабораториях лечебно-профилактических и санитарно-эпидемиологических учреждений в Российской Федерации.

Область применения - клиническая лабораторная диагностика, научные исследования, эпидемиологический надзор.

Типичные токсигенные вибрионы Эль-Тор (Vibrio cholerae O1 biotype El Tor, Hly-, ctxA+), устойчивые к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды за счет присутствия в геноме дополнительных блоков генов, обеспечивающих высокий уровень адаптации к меняющимся условиям окружающей среды: островков патогенности (VPI-I,II) и пандемичности (VSP-I, II) [1, 2, 3], явились этиологическим фактором холеры в Азии (1961-1969 гг.), в (Азии, Африке, Европе, США, Океании (1970-1980 гг.), в Азии, Африке, Европе, США, Океании, Австралии (1981-1990 гг.).

В начале 90-х годов прошлого столетия появились штаммы холерного вибриона O1 серологической группы с типичными фенотипическими признаками биовара Эль-Тор, но продуцирующие классический тип энтеротоксина (СТ1) и с фенотипическими признаками биоваров Эль-Тор и классического, также с продукцией энтеротоксина классического типа (СТ-1). Изоляты V. cholerae O1 с генотипическими признаками обоих биоваров получили название «генетически измененные» (геноварианты) или «гибридные варианты биовара Эль-Тор» [4, 5], и они являются доминантными этиологическими агентами современного этапа развития седьмой пандемии холеры Эль-Тор, начавшегося в 90-е годы XX столетия, а в первые два десятилетия XXI века - получили глобальное распространение.

Эволюционные преобразования типичного токсигенного биовара Эль-Тор в гибридный вариант сопровождались изменениями структуры генов коровой области профага СТХ_ϕ и профага RSI_ϕ [6]. В результате горизонтального переноса генов образовались генотипы с различными комбинациями генов патогенности типичного Эль-Тор и классического биовара: ctxB^Сl, rstR^El, rstC, rstR^Cl (III генотип); ctxB^Cl rstR^El, rstC (IV генотип); ctxB^Cl, rstR^El, rstC (V генотип); ctxB^Cl, rstR^Cl, rstR^El (VI генотип); ctxB^Cl, rstR^Cl, rtxC (VII генотип) Следует отметить, что геномы названных вариантов биовара Эль-Тор обязательно содержат ген ctxB^Cl, кодирующий биосинтез энтеротоксина классического типа (СТ-1) [8.]. Вместе с тем эволюционные преобразования в гибридный вариант не затронули гены «домашнего хозяйства», в частности, гена rtxC, специфичного для типичного токсигенного биовара Эль Тор. При этом в реакции полимеразной цепной реакции типичные токсигенные штаммы биовара Эль Тор образуют ампликоны к генам ctxB^El и rtxC, а генетически измененные варианты биовара Эль Тор образуют ампликоны к генам ctxB^CL и rtxC.

Холера, обусловленная генетически измененными холерными вибрионами биовара Эль Тор, продуцирующие XT классического типа, наносит значительный вред здоровью населения и экономический ущерб той стране, где эта инфекция возникает [1, 3, 6, 7]. Поэтому для повышения эффективности системы эпидемиологического надзора за холерой и проведения противоэпидемических мероприятий в случае ее завоза необходима разработка способа быстрой и достоверной диагностики этиологического фактора болезни, основанной на дифференциации типичных токсигенных и генетически измененных вариантов V. cholerae биовара Эль Тор с использованием полимеразной цепной реакции.

Известно выявление измененных токсигенных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор методом ПЦР с использованием аллельспецифических праймеров для детекции классического или Эль Тор биовара гена ctxB [9]. Однако данный метод применим только для штаммов холерных вибрионов с предварительно установленными серогруппой и биоваром.

В то же время при мониторинговых исследованиях необходима не только идентификация токсигенных штаммов V. cholerae O1 серогруппы и определение их биовара, но и своевременная и быстрая дифференциация V. cholerae биовара Эль Тор по структуре гена ctxB с целью выявления измененных вариантов возбудителя холеры Эль Тор для повышения эффективности проводимых противоэпидемических мероприятий.

Из источников научно-технической информации известен способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae Ol, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара Эль Тор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления с электрофоретическим учетом результатов [10]. Согласно изобретению мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят в один прием в двух реакционных смесях, где каждая из смесей содержит специально подобранное сочетание праймеров: одна - к генам rfbO1, cas3 и ctxB^CL, вторая - к генам rfbO1, rtxC и ctxB^EL. Тест-система для осуществления способа включает компоненты для выделения ДНК, компоненты для проведения ПЦР и компоненты для анализа результатов. Компоненты для проведения ПЦР содержат: 10-кратный буферный раствор, рН 8,4, минеральное масло, деионизированную стерильную воду, два положительных контроля, фермент Taq-полимеразу, смесь дНТФ, смесь праймеров 1 - rfbO1-F - rfbO1-R, cas3-F - cas3-R, ctxB^CL -F-ctxB^CL-R и смесь праймеров 2 - rfbO1-F - rfbO1-R, rtxC-F - rtxC-R, ctxB^EL-F -ctxB^EL -R.

Заявленный способ позволяет быстро и достоверно выявлять биовар холерных вибрионов O1 серогруппы, определять их токсигенность и проводить дифференциацию выявленных токсигенных штаммов V.cholerae биовара Эль Тор на типичные изоляты и измененные варианты.

Для осуществления способа идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1, определения их биовара и дифференциации биовара Эль Тор на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции предложена тест-система с форезным методом учета результатов «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB-РЭФ)» [7]. С помощью указанного «Набора…» при идентификации выделенной культуры холерного вибриона определяется O1 серогруппа (по гену rfbO1, 638 п.н.), биовар (классический по гену cas3, 415 п. н.; Эль Тор по гену rtxC, 265 п.н.), токсигенность (по генам ctxB^Cl, 189 п.н. или ctxB^El, 189 п.н.), типичность (типичный биовар Эль Тор - по сочетанию генов rfbO1,638 п.н. + rtxC, 265 п.н. + ctxB^El, 189 п.н.); измененный биовар Эль Тор - ctxB^Cl, 189 п.н. + rfbO1, 638 п.н. + rtxC, 265 п.н.).

Таким образом, данная мультилокусная ПЦР, используемая для идентификации выделенной культуры возбудителя холеры, обеспечивает определение серогруппы, токсигенности, биовара и дифференциацию биовара Эль Тор на типичные токсигенные и генетически измененные (гибридные) варианты электрофоретическим методом учета результатов, что удлиняет время данного способа идентификации штаммов Vibrio cholerae O1.

Вместе с тем, в данной области существует очевидная потребность в разработке более информативного и быстрого способа идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1, определения их биовара и дифференциации биовара Эль Тор на типичные и генетически измененные варианты, а также тест-системы для реализации указанного способа идентификации токсигенных штаммов холерного вибриона O1 серогруппы.

Техническим результатом изобретения является обеспечение возможности осуществления одновременной идентификации штаммов V. cholereae O1 серогруппы классического и Эль Тор биоваров (на основе присутствия в их геноме биовароспецифических генов ctxB^CL, ctxB^EL и гена rtxC, специфичного для биовара Эль Тор), определения их токсигенности (на основе тестирования гена ctxB) и дифференциации V. cholerae биовара Эль Тор на типичные изоляты и измененные варианты по присутствию в их геноме одновремннно генов ctxB^EL + rtxC или ctxB^CL+rtxC.

Технический результат достигается способом идентификации и дифференциации типичных и измененных токсигенных штаммов V. cholerae O1 методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, характеризующимся тем, что ПЦР проводят в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит специально подобранную смесь праймеров SEQ ID NO: 1 к генам ctxB^CL и ctxB^EL с зондами G-FAM и A-VIC, соответственно, в первой, и праймеров SEQ ID NO: 2 F+R к гену rtxC с зондом ROX во второй, с температурой отжига праймеров 57°С в течение 30 с при числе циклов амплификации, равном 40, с последующим анализом путем сравнения амплифицированных фрагментов генов исследуемых и контрольных штаммов. Для штаммов V. cholerae классического биовара характерно наличие ампликона гена ctxB^CL, идентичных контрольному образцу. Для типичных токсигенных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор характерно наличие ампликонов генов ctxB^EL и rtxC, идентичных контрольному образцу, а для измененных вариантов V. cholereae O1 биовара Эль Тор характерно наличие ампликонов генов ctxB^CL и rtxC, идентичных контрольному образцу.

В качестве контроля используют ДНК типичных токсигенных штаммов V. cholerae классического и Эль Тор биоваров.

Технический результат также достигается тест-системой для идентификации и дифференциации типичных и измененных токсигенных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, включающей компоненты для выделения ДНК и компоненты для проведения ПЦР в режиме Real Time: 10х буфер для TaqPol, MgCL₂ (50 мМ), деионизованную стерильную воду, два положительных контроля (ПКО+Эль Тор и ПКО + Classical), фермент TaqPol (5 ед/мкл), смесь dNTPs (5 мМ), смесь 1, содержащую праймеры SEQ ID NO:l к F+R ctxB^CL (10 мМ) и F+R ctxB^EL(10 мМ), зонды G -FAM (10 мМ), A-VIC (10 мМ) и смесь 2, содержащую праймеры SEQ ID NO: 2, к гену rtxC (10 мМ) и зонд ROX (10 мМ).

При разработке способа особое значение придавали конструированию смеси праймеров и зондов, специфичных к генам классического и Эль Тор биоварам. В качестве мишений были выбраны гены ctxB и rtxC. Наша разработка набора зондов, оказавшихся высоко специфичными, позволила сконструировать тест-систему для проведения ПЦР в «реальном времени».

При этом накопление продукта амплификации с зондом, специфичным к соответствующей аллели (ctxB^CL или ctxB^EL) гена ctxB свидетельствует о наличии в пробе ДНК гена ctxB классического или Эль Тор биоваров. Накопление продукта амплификации с двумя зондами одновременно (в двух каналах) свидетельствует о наличии в пробе ДНК двух генов одновременно. Накопление продукта амплификации с зондом ROX, специфичным к гену rtxC в канале Orange, свидетельствует о наличии в пробе ДНК гена rtxC.

Экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения мультиплексной цепной реакции в режиме «реального времени», подобрано сочетание праймеров и зондов, необходимое и достаточное соотношение компонентов реакционной смеси и определен режим постановки ПЦР, что является важным при проведении ПЦР анализа.

Заявляемая ПЦР-тест-система «Гены Vibrio cholerae O1 вариант ctxB - rtxC, FL» разделена на 3 комплекта:

Комплект 1 содержит компоненты для выделения ДНК, упакованные в шесть пластиковых флаконов, содержащих раствор 1 (6 М раствор гуанидинтиоционата), раствор 2 (4 М раствор гуанидинтиоционата), раствор 3 (спиртосолевой раствор), ацетон, элюент для ДНК (ТЕ-буфер), 2 пластиковые пробирки с нуклеосорбентом;

Комплект 2 состоит из компонентов для проведения ПЦР со смесью 1: 1 пластиковая пробирка, содержащая F+R ctxB праймеры (10 мМ), зонд G -FAM (10 мМ), зонд A-VIC (10 мкМ), 10х буфер для TaqPol, MgCL₂ (50 мМ), смесь dNTPs (5 мМ), TaqPol (5 ед/мкл), Н₂O или РНК элюэнт; 1 пластиковая пробирка, содержащая контрольный положительный образец с ДНК типичного токсигенного штамма V. cholerae O1 классического биовара, и 1 пластиковая пробирка, содержащая контрольный положительный образец с ДНК типичного токсигенного штамма V. cholerae O1 биовара Эль Тор;

Комплект 3 состоит из компонентов для проведения ПЦР со смесью №2: 1 пластиковая пробирка, содержащая F+R rtxC праймеры (10 мкМ), зонд на rtxC (10 мкМ), 10х буфер для TaqPol, MgCL₂ (50 мМ), смесь dNTPs (5 мМ), TaqPol (5 ед/мкл), Н₂O или РНК элюэнт;1 пластиковая пробирка, содержащая контрольный положительный образец с ДНК типичного токсигенного штамма V. cholerae O1 классического биовара, и 1 пластиковая пробирка, содержащая контрольный положительный образец с ДНК типичного токсигенного штамма V. cholerae O1 биовара Эль Тор;

ПЦР-тест-система «Гены Vibrio cholerae O1 вариант ctxB - rtxC, FL» рассчитана на проведение 50 определений, включая контрольные образцы.

Заявляемый способ идентификации включает следующие этапы.

а) Выделение ДНК с использованием реагентов для экстракции ДНК «АмплиПрайм ДНК-сорб-АМ» (комплект 1).

б) Проведение ПЦР в «реальном времени»: (комплект 2, 3). Полимеразную цепную реакцию двух реакционных смесей различного состава с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» проводят в объеме 25 мкл. в один этап по следующей программе:

предварительная денатурация 1 цикл 95°С - 3 мин, 40 циклов 95°С -20 сек, 57°С - 30 сек (измерение флуоресценции), пролонгация 72°С - 20 сек.

в) Анализ и интерпретация результатов:

Способ осуществляют следующим образом.

1. Подготовку проб проводят согласно МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» в боксе биологической безопасности II класса в противочумном костюме IV типа в резиновых или латексных перчатках. Клетки холерных вибрионов, выращенные на щелочном агаре (рН 7,8) в течение 18 часов, ресуспендируют в 0,85% растворе натрия хлорида до концентрации 10⁹ микробных клеток в 1 мл и последующим разведением в деионизованной воде доводят до концентрации 1×10⁷ м.к./мл. Затем к суспензии добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) и прогревают его при 56°С в течение 30 мин. Далее, 100 мкл образца переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинизотиоцианата, и инкубируют 15 мин при 65°С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

Выделение ДНК осуществляют с использованием комплекта 1. - комплект 1 (Комплект реагентов для экстракции ДНК «АмплиПрайм ДНК-сорб-АМ») включает упакованные в двух пластиковых флаконов, содержащих соответственно раствор 1 (6 М раствор гуанидинтиоционата), раствор 2 (4 М раствор гуанидинтиоционата), раствор 3 (спиртосолевой раствор), ацетон, элюент для ДНК (ТЕ-буфер), 2 пластиковые пробирки с нуклеосорбентом.

Комплект для выделения ДНК извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре. Все реагенты комплекта добавляют отдельными наконечниками с помощью автоматических микропипеток. Раствор 1 прогревают при температуре 60-65°С до полного растворения кристаллов, после чего добавляют к обеззараженным пробам в объеме 300 мкл. Пробы тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхиватиле и инкубируют при температуре 65°С. Сорбент тщательно ресуспендируют на микроцентрифуге/встряхиватиле. В каждую пробирку вносят 25 мкл подготовленного сорбента, перемешивают на микроцентрифуге/встряхиватиле 30 с и оставляют в штативе на 2 минуты.

Процедуру повторяют дважды. Затем пробирки центрифугируют при 12000 g в течение 30 с, супернатант удаляют. К осадку добавляют 300 мкл раствора 2. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе до гомогенного состояния, центрифугируют при 12000 g в течение 30 с, супернатант удаляют.

Затем к осадку добавляют 500 мкл раствора 3. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе до гомогенного состояния и центрифугируют при 12000 g в течение 30 с. Супернатант удаляют, отмывку раствором 3 повторяют.К осадку добавляют 400 мкл ацетона. Содержимое перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе, затем центрифугируют при 12000 g в течение 30 с, супернатант удаляют. Осадок высушивают при температуре 65°С в течение 5-7 мин. К осадку добавляют 50 мкл ТЕ-буфера и выдерживают при температуре 65°С в течение 10 мин, встряхивая на микроцентрифуге/встряхивателе 2-3 раза. По окончании взвесь центрифугируют при 12000 g в течение 1 мин. Супернатант содержит очищенную ДНК.

2. Проведение ПЦР в «реальном времени»: (комплект 2, 3). Из морозильной камеры извлекают, размораживают содержимое пробирок комплектов 2, 3 и готовят реакционные смеси для проведения ПЦР: из комплекта 2 готовят необходимое количество микропробирок (соответствующее числу исследуемых проб) со смесью 1, а из комплекта 3 готовят такое же количество пробирок со смесью 2.

Смесь 1 состоит из следующих компонентов:

10х буфер для TaqPol	2,5 мкл
MgCL2 (50 мМ)	2,0 мкл
F+R ctxB праймеры (10 мМ)	2,5 мкл
Зонд G -FAM (10 мМ), Green	1 мкл
Зонд A-VIC (10 мМ),`Yellou	1 мкл
Смесь dNTPs (5 мМ)	4 мкл
TaqPol (5 ед/мкл)	1 мкл
Вода	до 25 мкл

Контроли:

К- (Н2O) - отрицательный контроль	2,0 мкл
ПКО+Эль Тор: ДНК штамма V.cholerae El Tor 484Ст (10 нг/мкл)	2 мкл
ПКО+Classical: ДНК штамма V.cholerae Classical 569В (10 нг/мкл)	2 мкл
ДНК (10 нг/мкл)	2 мкл

Смесь 2 состоит из следующих компонентов:

10х буфер для TaqPol	2,5 мкл
MgCL2 (50 мкМ)	2,0 мкл
F+R rtxC праймеры (10 мкМ)	2,5 мкл
Зонд ROX на rtxC	(10 мкМ),
Orange 1 мкл Смесь dNTPs (5 мкМ)	4 мкл
TaqPol (5 ед/мкл)	1 мкл
Вода	до 25 мкл
Контроли: К- (Н2O) - отрицательный контроль	2,0 мкл
ПКО+Эль Тор: ДНК штамма V.cholerae El Tor 484 Ст (10 нг/мкл)	2 мкл
ПКО+Classical: ДНК штамма V.cholerae Classical 569В (10 нг/мкл)	2 мк
ДНК (10 нг/мкл) изучаемая	2 мкл

Режим амплификации: 1 цикл 95°С-3 мин; 40 циклов 95°С - 20 сек; 57°С - 30 сек; 72°С - 20 сек. Накопление продукта амплификации только с зондом специфичным к гену ctxB^CL (G-FAM) в канале Green свидетельствует о наличии в пробе ctxB^CL (В1). Накопление продукта амплификации только с зондом, специфичного к гену ctxB^EL (A-VIC) в канале HEX/VIC (Yellow)- о наличии в пробе гена ctxB^EL (В3). Накопление продукта амплификации с двумя зондами одновременно (в двух каналах) свидетельствует о наличии в пробе ДНК двух генов одновременно. Накопление продукта амплификации только с зондом ROX, специфичного к гену rtxC в канале Orange, свидетельствует о наличии в пробе ДНК гена rtxC.

3. Анализ результатов амплификации ДНК исследуемых штаммов микроорганизмов с ПЦР-смесью №1 - анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:

- по каналу для флуорофлора G-FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК гена ctxB^CL (Вl) на канале Green;

- по каналу для флуорофлора A-VIC регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК гена ctxB^EL (B3) на канале Yellou.

- Анализ результатов амплификации ДНК исследуемых штаммов микроорганизмов с ПЦР-смесью №2. - по каналу для флуорофлора ROX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК гена rtxC на канале Orange.

Уровень пороговой линии (Порог) на всех каналах учета - 0,05. Ct (не ≥25).

Учет результатов ПНР-анализа проводят путем сравнения полученных ампликонов с контрольными образцами в соответствие с результатами амплификации по таблице 1.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример 1. Для определения эффективности заявляемого способа и тест-системы проведен ПЦР-анализ штаммов Vibrio cholerae O1, non 01/139 и гетерологичных микроорганизмов, выделенных на различных территориях и в разные годы таблица 2.

Протоколы результатов ПЦР-анализа ДНК штаммов V.cholerae O1, nonO1/O139 и гетерологичных микроорганизмов представлены на фиг. 1-18,

где на фиг. 1 - Дагестан, 1993, 1994, 1998 гг., В1+;

на фиг. 2 - Дагестан, 1993, 1994, 1998 гг. В3+ контроль, 484 штамм;

на фиг. 3 - Дагестан, 1993, 1994, 1998 гг., rtxC+ у всех исследованных штаммов;

на фиг. 4 - Мариуполь (Украина), 1994-2011 гг. В1+ у всех исследованных штаммов;

на фиг. 5 - Мариуполь (Украина), 1994-2011 гг. ВЗ3т олько у контрольного штамма;

на фиг. 6 - Мариуполь (Украина), 1994-2011 гг. rtxC+ у всех исследованных штаммов;

на фиг. 7 - Азербайджан, 1985 г., Ставрополь, 1990 г. В1+ только у контрольного штамма, 569В;

на фиг. 8 - Азербайджан, 1985 г., Ставрополь, 1990 г. В3 у всех исследованных штаммов;

на фиг. 9 - Азербайджан, 1985 г., Ставрополь, 1990 г. rtxC+ у всех исследованных штаммов;

на фиг. 10 - г. Сочи, 2015 г., ловушки В1+ только у контрольного штамма 569В;

на фиг. 11 - г. Сочи, 2015 г., ловушки В3+ у контрольного штамма 484 и штамма 647;

на фиг. 12 - г. Сочи, 2015 г., ловушки rtxC+ у всех исследованных штаммов;

на фиг. 13. - Азербайджан, V. choleraenonO1, В1+ только у контрольного штамма 569В;

на фиг. 14 - Азербайджан, V. choleraenonO1, В3+ только у контрольного штамма 484;

на фиг. 15 - Азербайджан, V. cholera поп O1, rtxC+ только у контрольного штамма 484;

на фиг. 16 - Гетерологичные штаммы: Shigella, Salmonella, Esherichia В1+ только у контрольного штамма 569В;

на фиг. 17 - Гетерологичные штаммы: Shigella, Salmonella, Esherichia В3+ только у контрольного штамма 484;

на фиг. 18 - Гетерологичные штаммы: Shigella, Salmonella, Esherichia ген rtxC - не содержат.

Результаты, представленные в таблице 2 и на фигурах 1-18, показали, что «Набор реагентов ПЦР-тест-системы Гены Vibrio cholerae вариант ctxB - rtxC, FL)» выявляет в геноме токсигенных V. cholera O1 фрагменты ДНК генов ctxB^Cl, ctxB^El, rtxC (обладает специфической активностью), и не выявляет данные гены у нетоксигенных V. cholera O1 и поп O1, а также у гетерологичных штаммах микроорганизмов - Shigella zonnei 20, 76; Salmonella typhimurium 160; Salmonella enteritidis165; Esherichia coli 406-1) (обладает специфичностью).

Таким образом, предлагаемый способ и мультиплексная ПЦР тест-система «Гены Vibrio cholerae вариант ctxB - rtxC, FL)» позволяют быстро и достоверно идентифицировать холерные вибрионы O1 серогруппы классического или Эль Тор биовара, определять их токсигенность и дифференцировать выявленные токсигенные штаммы V cholerae биовара Эль Тор на типичные изоляты и измененные варианты.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. De Haan L. Cholera toxin: a paradigm for multi-functional engagement of cellular mechanisms. / L. De Haan, T.R. Hirst // Mol. Membr. Biol. - 2004. - Vol. 21, N2. - P. 77-92.

2. Comparative genomicanalysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and handemic disease. / Dziejman M., Balon E., Boyd D. [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - Vol. 99, N 3. - P. 1556-1561.

3. The El Tor biotype of Vibrio cholerae exhibits Vibrio cholerae a growth advantage in the stationary phase in mixt cultures with the classical biotype. / S. Pradhan, A.K. Baidya, A. Ghosh [et al.] // J. Bacteriol. - 2010. - Vol. 192, N 4. - P. 955-963.

4. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCA assay to monitor tht dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor. / Morita M., Ohnishi M., Arakava E. [et al.] // Microbiol. Immunol. - 2008. - Vol. 52. - P. 314-317.

5. Vibrio cholera O1 Hybrid El Tor strains Asia and Africa / G.B. Nair, F. `Qadri, J. Holmgren [et al.] / G.B. Nair // J. Clin. Microbiol.- 2006. - Vol.44. - P. 3296-3299.

6. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Горяев A.A. и др. Эволюция генома Vibrio cholerae: пути формирования атипичных штаммов. Пробл. особо опасных инф. 2008, 3(97): 3-12

7. Эволюция генома холерного вибриона биовара Эль Тор и разработка ПЦР-тест-системы для идентификации штаммов возбудителя холеры / Савельева И.В., Куличенко А.Н., Ковалев Д.А. [и др.] // Холера и патогенные для человека вибрионы: материалы проблемной комиссии- Ростов-на-Дону, 2017. Вып. 30 - С. 172-177.

8. Шашкова А.В. Фенотипический и молекулярно-генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор: автореф. дисс.… канд. биол. наук / А.В. Шашкова - Саратов, 2012. - 21 с.

9. Morita М., Ohnishi М., Arakawa Е. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor. Microbiol. Immunol. 2008, 52(6): 314-317.

10. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Шубина А.В.,Заднова С.П., Кутырев B.B. Патент РФ №2458141, опубликован 10.08.2012.

Способ идентификации штаммов VIBRIOCHOLERAEO1,

определения их токсичности и биовара с дифференциацией

биовара Эль Тор на типичные и генетически измененные

варианты методом мультиплексной полимеразной цепной

реакции и тест-система для его осуществления с учетом

результатов в режиме «реального времени»

Перечень последовательностей праймеров и зондов 5’– 3’

SEQ ID NO: 1

ctxB-F = TGTGAATCTATATGTTGACTACCTGG

ctxB-R = CTCTAGCTGGAAAAAGAGAGATGG

ctxB-FAM-G = FAM-TCTACTTGAAAAGTTGCACC BHQ1

ctxB^CL= G(FAM), канал Green

ctxB-VIC-A = VIC-TCTACTTGAAAAATTGCACC-BHQ

ctxB^EL= A(VIC), каналYellou

SEQ ID NO: 2

rtxC-F = GCTCAAACGCAGGCAGAATG

rtxC-R = GATAGGTGGTGTGATGCTGCTC

rtxC-Probe = FAM/ROXCAGCCATTCTGCAACCACA AACGAC-BHQ1/2

rtxC-Probe = FAM/ROX,канал Orange

1. Способ идентификации штаммов V. cholerae O1, определения их токсигенности и биовара с дифференциацией штаммов биовара Эль Тор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, характеризующийся тем, что полимеразную цепную реакцию проводят в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит специально подобранное сочетание праймеров SEQ ID NO: 1 к генам ctxB^CL и ctxB^EL с зондами G-FAM и A-VIC в первой; и праймеров SEQ ID NO: 2 F+R к гену rtxC с зондом ROX во второй, с температурой отжига праймеров 57°С в течение 30 с при числе циклов амплификации, равном 40, с последующим анализом путем сравнения амплифицированных фрагментов генов исследуемых и контрольных штаммов; для типичных токсигенных штаммов V. cholerae O1 классического биовара характерно наличие ампликонов гена ctxB^CL, идентичных контрольному образцу; для типичных токсигенных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор характерно наличие ампликонов генов ctxB^EL и rtxC, идентичных контрольному образцу; для измененных вариантов V. cholerae биовара Эль Тор характерно наличие ампликонов к генам ctxB^CL и rtxC.

2. Тест-система «Гены Vibrio cholerae O1 вариант ctxB - rtxC, FL» для осуществления способа по п. 1 методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени» включает: выделение ДНК из исследуемой культуры Vibrio cholerae O1; компоненты для проведения ПЦР: 10х буфер для TaqPol, MgCL₂ (50 мМ), смесь dNTPs (5 мМ), TaqPol (5 ед/мкл), деионизированную стерильную воду, смесь праймеров SEQ ID NO: 1 к генам ctxB^CL и ctxB^EL с зондами G-FAM (10 мМ) и A-VIC (10 мМ), смесь праймеров SEQ ID NO: 2 F+R к гену rtxC с зондом ROX (10 мМ), два положительных ПКО+Classical (ДНК V. cholerae Classical 569В) и ПКО+El Tor (ДНК V. cholerae El Tor, 484Ст) и один отрицательный (Н₂О) контроли; проведение полимеразной цепной реакции в один прием в двух реакционных смесях различного состава в объеме 25 мкл в режиме «реального времени»: 1 цикл 95°С - 3 мин, 40 циклов 95°С - 20 с, 57°С - 30 с, 72°С - 20 с; учет результатов по специфическим кривым полосам в каналах Green (ген ctxB^CL), Yellow (ген ctxB^EL), Orange (ген rtxC) при уровне пороговой линии на данных каналах учета - 0,05; Ct≤30.