Полифункциональный биопрепарат с широким спектром антагонистической активности и его применение

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены полифункциональный препарат, включающий смесь культуральной жидкости кристаллообразующего штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 и целевых добавок, иммобилизованную на гранулах диатомита; и его применение: в качестве фунгицидного средства; в качестве альгицидного средства против сине-зеленых и зеленых микроводорослей; в качестве средства, обладающего ларвицидной активностью против личинок комаров отряда Diptera: Anopheles stephensi, Aedes aegypti и Culex pipiens; в качестве средства с антибактериальной активностью против грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Rhodococcus rhodochrous и грамотрицательных бактерий Acinetobacter baumannii. Изобретения обеспечивают расширение арсенала полифункциональных биопрепаратов - биологических средств защиты растений. 5 н.п. ф-лы, 6 табл., 7 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к производству и применению биологических средств защиты растений от поражения фитопатогенными грибами, патогенными бактериями, для борьбы с микроскопическими водорослями и комарами.

Микроорганизмы являются наиболее востребованными продуцентами различных соединений и обладают широким спектром антагонистической активности. Большинство бактериальных препаратов представляют собой продукт микробиологического синтеза на основе спор и белковых кристаллов, губительных для вредных насекомых, фитопатогенных грибов, бактерий.

Поиск новых штаммов-антагонистов является одной из актуальных задач биотехнологии. Бактерии рода Bacillus могут рассматриваться как объекты, имеющие наибольший потенциал в системе поиска новых биологически активных соединений с полифункциональным спектром антагонистической активности [1].

Среди микроорганизмов, продуцирующих биологически активные соединения различной направленности, особое место занимают спорообразующие грамположительные бактерии рода Bacillus, имеющие наибольшее значение для биологической защиты растений. Интерес к этим бактериям обусловлен также отсутствием у них токсичности для теплокровных животных.

Штаммы Brevibacillus laterosporus (BL) обладают рядом биотехнологических преимуществ: растут на относительно дешевых питательных средах, не требуют специальных условий для культивирования, способны поддерживаться в лабораторных условиях в течение длительного времени, сохраняя свои уникальные антагонистические свойства.

Бациллы BL способны к синтезу инсектицидных факторов [2-4], продуцируют целый спектр антагонистических факторов, которые обуславливают антибактериальный эффект [5], фунгицидную и цианолитическую активности [6], активны против фито- и зоонематод и моллюсков [7-10]. Штаммы BL применяют также в качестве эффективных пробиотиков [11-13].

Штаммы BL используют в медицине [14], так как они продуцируют большое число антибиотиков различной химической структуры и механизмов действия. Латероспорамин - водорастворимый антибиотик небелковой природы - обладает ингибирующей активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий [15].

Антибиотик 15-дезоксиспергуалин - аналог спергуалина, обладает противоопухолевой активностью и выраженным иммунодепрессантным действием на различные трансплантационные модели [16-17].

Лолоатин А, В, С, Д выделяют из штаммов BL. Лолоатины - группа циклических декапептидов тироцидинового семейства. Они обладают высокой антибиотической активностью против патогенных грамположительных бактерий [5].

Латероцидин - циклический декапептид с молекулярной массой 1224,4 Да выделен из штамма BL ВКПМ В-8287, имеющего широкий спектр антагонистической активности против цианобактерий, фитопатогенных грибов, грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей и простейших [18].

Штаммы BL используют как эффективные пробиотики, учитывая их токсикологическую безопасность и способность к быстрой колонизации кишечника теплокровных. В состав препаратов-пробиотиков входят бактерии BL (АТСС 55122), применяемые в гастроэнтерологии для лечения заболеваний, связанных с нарушением микрофлоры кишечника человека, оказывая антибактериальное и фунгицидное действие [19]. Данные бактерии проявляют себя как экологически безвредные транзитные организмы, обеспечивающие подавление опасной микрофлоры пищеварительной системы и способствующие развитию полезной. Штамм BL, входящий в состав пробиотика «Flora Balance», за 28 дней снижает долю Candida albicans в кишечном тракте человека со 100% до 20% [19].

Штаммы BL обладают инсектицидным эффектом против домашней мухи, личинок двукрылых насекомых (комаров), кукурузного корневого червя [20-24].

Штамм BL ВКПМ В-7767 использован для создания биологического фунгицида для защиты картофеля от фитопатогенных грибов [25].

Бациллы BL, наряду с другими почвенными бактериями, предлагают включать в состав многофункциональных комплексных бактериальных препаратов, для усиления бинарного действия и возможного расширения эффективности ряда химических гербицидов [26].

Ряд штаммов BL подавляют развитие патогенных грибов, поражающих человека и животных. Введение животным культуры BL снижает за 7 дней рост Candida albicans на 95-99% [27].

Штамм BL, выделенный из морского осадка, продуцирует пептидный антибиотик с молекулярной массой 1608 Да, обладающий фунгицидной активностью против Candida albicans и Aspergillus fumigatus, а также антибактериальной активностью против ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий [28].

Обработка почвы бактериями BL улучшает развитие растений, снижает заболеваемость и повышает урожайность зерновых культур почти на 30% по сравнению с не обработанной почвой [23]. Предпосевная обработка почвы бактериями BL снижает количество аэробных бактерий кишечной группы, что обеспечивает фиксацию щелочной среды почвы. А также предпосевная обработка самих сельскохозяйственных целевых растений бактериями данного вида ингибирует развитие фитопатогенных микроскопических грибов и бактерий, что повышает урожайность растений [29].

Щелочная протеиназа с молекулярной массой около 30 кДа, синтезируемая штаммами BL, является фактором патогенности для нематод [30]. Доказана антагонистическая активность BL против белых червей [31].

Для некоторых штаммов BL показан альгицидный эффект - способность подавлять рост микроскопических водорослей в водной среде [32-34].

Проблема борьбы с микроводорослями становится все более актуальной во всем мире в связи с потеплением климата. Иррациональное ведение хозяйства в последние годы: поступление хозяйственно-бытовых, промышленных и сельскохозяйственных сточных вод, приводит к интенсивному загрязнению природных водоемов, что сопровождается так называемым «цветением» воды. «Цветение» происходит за счет развития различных типов микроскопических водорослей, и, прежде всего, сине-зеленых микроводорослей (цианобактерий). Выделение токсинов при «цветении», нарушение кислородного режима водоемов, органолептические проявления гниения вызывают ряд серьезных социальных и экономических последствий, приводящих к ухудшению, как качества питьевой воды, так и нежелательным последствиям для бытового, рекреационного, рыбо-хозяйственного использования. Отрицательные последствия «цветения» водных объектов предопределяют необходимость борьбы с микроводорослями и токсическими продуктами их метаболизма. Латероцин - пептид, относящийся к семейству тироцидиновых антибиотиков, выделенный из штамма BL ВКПМ В-10531, обладает высокой цианолитической активностью [35].

Насекомые отряда двукрылых (Diptera - комары родов Aedes, Anopheles, Culex) способны переносить возбудителей серьезных инфекционных заболеваний, таких как малярия и лимфатический филяриоз, а также ряда вирусных инфекций (энцефалит, денге, онкоцерциоз и др.) и представляют собой существенную угрозу для здоровья людей. Кристаллообразующий штамм-продуцент спорообразующих бацилл получен путем селекции без применения мутагенов из штамма, выделенного из природных источников. На основе изученных культуральных (наличие параспоральных каноэвидных включений, прикрепленных к споре, помимо которых обнаружены кристаллические включения), физиологических и биохимических свойств и проведенной генетической идентификации штамма по 16S рРНК, штамм отнесен к Brevibacillus laterosporus и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером Brevibacillus laterosporus (BL) ВКПМ В-13186 [36-37].

Задача заявляемого изобретения:

расширить арсенал полифункциональных биопрепаратов на основе штаммов Brevibacillus

laterosporus.

Задача решена путем:

- разработки полифункционального биопрепарата на основе кристаллообразующего штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 с широким спектром антагонистической активности;

- применения биопрепарата в качестве фунгицидного средства для борьбы с фитопатогенными микроскопическими грибами;

- применения биопрепарата в качестве альгицидного средства для борьбы с микроводорослями микроводорослей;

- применения биопрепарата в качестве средства, обладающего ларвицидной активностью против личинок комаров Anopheles stephensi, Aedes aegypti и Culex pipiens (отряд Diptera);

- применения биопрепарата в качестве средства, обладающего способностью подавлять вирулентные свойства патогенных бактерий.

Заявляемый биопрепарат имеет форму сухого порошка, которая обладает рядом преимуществ по сравнению с жидкими и эмульсионными формами: возможность сохранения биологической активности действующего начала в биопрепарате, а также удобство и простота при его транспортировке и применении.

В качестве ближайшего аналога заявляемого биопрепарата рассмотрен биопрепарат [38] на основе BL ВКПМ В-10531 [35], обладающий альгицидным и фунгицидными действием. Заявляемый биопрепарат отличается от ближайшего аналога спектром антагонистической активности, так как наряду с альгицидной, фунгицидной, обладает антибактериальной, а также инсектицидной активностью.

Заявляемый биопрепарат получают на основе штамма BL ВКПМ В-13186. Для этого спорообразующий штамм культивируют в следующих питательных средах:

- среда NBY, мас. %: nutrient broth "Difco" (питательный бульон) - 0,8; yeast extract "Difco" (дрожжевой экстракт) - 0,3; вода - остальное, рН 6,8-7,2

- среда YM, мас. %: гидролизные дрожжи - 4,5; вода - остальное, рН 6,8-7,2

Для приготовления агаризованных питательных сред в жидкие среды дополнительно добавляют агар-агар (мас. % - 2,0).

Культурально-морфологические признаки штамма-продуцента

При культивировании на агаризованной среде NBY через 48 часов при температуре 28-30°С штамм образует округлые колонии диаметром 3-5 мм светлого кремового цвета с гладкой поверхностью и неровным краем. Через 72-96 часа роста на питательной среде NBY штамм образует споры.

Исследование морфологических особенностей штамма-продуцента с помощью светового микроскопа выявило у них признаки, характерные для данного вида бактерий. Грамположительные подвижные вегетативные палочковидные клетки, перитрихи, размером 0,4 - 0,7 × 3,2-5,0 мкм, цепочек не образуют. Штамм хорошо спорулирует в жидкой и на твердой питательной среде NBY. В процессе споруляции образует характерную каноэвидную структуру, примыкающую к споре с одной из сторон. Свободные споры имеют эллиптическую форму. Размер спор 0,7-1,2 × 2,5-4,7 мкм. Параспоральное каноэвидное включение прикреплено к одной стороне споры. По данным световой микроскопии помимо каноэвидных включений обнаружены кристаллические включения. Кристаллы штамма при лизисе спорангия высвобождаются от споры.

2. Свойства носителя для иммобилизации активного фактора.

В качестве носителя для иммобилизации активного начала - культуральной жидкости штамма бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 использован диатомит [39]. Диатомит - рыхлая, светлая, осадочная порода, которая состоит из кремнистых скелетных останков диатомовых водорослей. Это экологически чистая природная, многофункциональная, наноструктурированная, пористая структура с мелким размером частиц и низким удельным весом. В составе диатомита содержится до 85% окиси кремния и около половины ее - в аморфной форме. Высококремнистые породы обладают рядом свойств, важных с биотехнологической точки зрения. Эти породы - природные эффективные сорбенты со специфическим характером пористости, обладающие высокой адсорбционной и ионообменной емкостью (0,8-0,12 г⋅экв/кг), что позволяет использовать их в качестве носителя для иммобилизации активного начала биопрепарата - культуральной жидкости бактерий. Диатомит может поглощать и удерживать количество жидкости, эквивалентное его собственному весу, что позволяет удерживать в пахотном корнеобитаемом слое почвы также влагу, элементы питания и внесенную биологически активную культуральную жидкость, которые затем постепенно высвобождаются, используются растениями в процессе жизнедеятельности и защищают их. Диатомит, содержит в своем составе до 1,5-2,0% калия и серы, а также ряд других микроэлементов. Установлено, что кремний играет защитную роль при любых стрессовых для растений ситуациях, будь то насекомые-вредители, заболевания, вызванные фитопатогенными грибами, воздействие низких температур или химические загрязнения и т.д. Такая универсальность заключена в способности активных кремниевых соединений способствовать быстрому и направленному синтезу специфических органических молекул внутри растительной клетки, которые помогают растению преодолеть все отрицательные воздействия. Вышеуказанные особенности диатомитов - природных сорбентов, делают возможным их использование в современных технологиях возделывания сельскохозяйственных культур не только в качестве многофункционального удобрения, но и открывают большие перспективы для создания новых видов полифункциональных биопрепаратов для защиты растений, в силу того, что диатомиты обладают наиболее рациональным режимом защиты и взаимодействия с растениями. Свойства диатомита, которые делают его использование технологичным в качестве носителя для иммобилизации активного начала - культуральной жидкости бактерий штамма BL ВКПМ В-13186, следующие: малый размер частиц, обуславливающий большую площадь их поверхностей; высокая пористость, относительно инертная кремнистая композиция; низкий удельный вес.

3. Состав и преимущества биологического препарата.

Заявляемый биопрепарат включает культуральную жидкость штамма BL ВКПМ В-13186, состоящую из комплекса спор, вегетативных клеток (с титром КОЕ/мл ~8,0×10⁸ /мл), продуктов их метаболизма, целевых добавок, а также гранул диатомита, на которых этот комплекс иммобилизован, придающих биопрепарату при приготовлении из него рабочих растворов, необходимые потребительские свойства, как-то: эмульсионную структуру, прилипаемость, стабильность, защиту от потери жизнеспособности спор и биологической эффективности при высушивании, при следующем соотношении целевых компонентов мас. %:

Культуральная жидкость штамма BL

ВКПМ В-13186 (2-8×108 КОЕ/мл)	60-62
Диатомит	28-30
Твин-80	3-5
Бензойная кислота	0,2-0,3
Глицерин	остальное

В качестве целевых добавок используют:

Глицерин - спирт многоатомного ряда, введенный в препарат как стабилизатор для торможения деструкции, не способствует возрастанию титра бактерий, но действует как стабилизатор их титра.

Твин-80 вводят в препарат как ПАВ (поверхностно активное вещество). Применяют его для снижения поверхностного натяжения воды с целью создания такой препаративной формы биопрепарата, которая при смешивании с водой дает стабильную суспензию. Бензойная кислота вводится в препарат в качестве стабилизатора и консерванта, препятствует деструкции биологических компонентов и способствует сохранению всех антагонистических свойств культуральной жидкости. Это безвредное вещество, его используют даже в пищевой промышленности.

К приготовленной жидкой смеси добавляют диатомит, тщательно перемешивают и высушивают при температуре 50°С в течение 30 часов.

Биопрепарат получают в форме сухого однородного смачивающегося порошка, стабильного при хранении не менее 12 месяцев, его хранят в герметичной упаковке при комнатной температуре.

Антагонистическая активность

Заявляемый биопрепарат подавляет развитие следующих микроскопических водорослей (таблица 1).

Заявляемый биопрепарат обладает антагонистической активностью по отношению к:

фитопатогенным грибам: Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusahum graminearum, Fusarium nivale, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Phoma solanicola, Alternaria tenuis, Botrytis cinerea; Magnaporthe grisea;

грамположительным бактериям: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Rhodococcus rhodochrous;

грамотрициательным бактериям: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumniae, Acinetobacter baumannii;

инсектицидной активностью для личинок II-ой стадии развития комаров трех видов: Culex pipiens (Liston), Aedes aegypti (L.) и Anopheles stephensi (L.) (отряда Diptera).

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами:

Пример 1.

Приготовление заявляемого биопрепарата

Заявляемый биологический препарат получают следующим образом: штамм-продуцент BL ВКПМ В-13186 высевают на твердую среду NBY и помещают в термостат при температуре 30°С, культивируют в течение 2 дней; получают вегетативную культуру штамма, которую затем инокулируют в жидкую среду NBY. Выращивают для получения посевной культуры при 30°С на качалке при 250 об/мин в течение 16 часов. Полученную посевную культуру затем вносят в ферментационную среду, содержащую мас. %: гидролизные дрожжи 2,0; дрожжевой экстракт 1,5; мелассы 2,0; мука кукурузная 1,5; мука соевая 1,5; сульфата магния 0,02; дигидрофосфата калия 0,02; карбоната кальция 0,1; остальное - вода; рН 7,0. Глубинное культивирование осуществляют при 30°С, рН 7,0 и перемешивании, постепенно меняя скорость вращения мешалки от 200 об/мин до 350 об/мин в ферментере, при заполнении ферментационной средой на 1/3 объема, в течение 72 часов. Контроль за ростом культуры, стерильностью и рН среды проводят путем отбора проб через каждые 24 часа от начала культивирования, определяя титр колониеобразующих единиц путем высева проб на агаризованную среду NBY с последующим подсчетом КОЕ. Отсутствие посторонней микрофлоры контролируют микроскопически. К 72 часам культивирования штамм-продуцент образует до 95% спор. Продуктивность штамма-продуцента определяют методом серийных разведений с последующим высевом на агаризованную среду, которая составляет ~8,0×10⁸ КОЕ/мл. Биопрепарат получают путем смешивания культуральной жидкости заявляемого штамма-продуцента ВКПМ В-13186 и целевых добавок с последующей иммобилизацией смеси на гранулах диатомита с последующим высушиванием при температуре 50°С в течение 30 часов. Качество биопрепарата оценивают по титру колониеобразующих единиц методом серийных разведений. Титр биопрепарата составляет до 8,8⋅× 10⁹ КОЕ/мл.

Пример 2.

Культивирование микроскопических водорослей, используемых для выявления альгицидных свойств заявляемого биопрепарата

Используют штаммы азотфиксирующих нитчатых видов микроскопических водорослей цианобактерий Anabaena sp.5781 (получен с кафедры микробиологии ЛГУ) и Nostoc sp.А-10 (получен из коллекции IMET, Йена, ГДР); штаммы азотнефиксирующих цианобактерий Microcystis aeroginosa 905 и 562 (получены из Института гидробиологии Китайской Академии Наук, провинция Хубей, г. Ухань); штаммы цианобактерий Amorphonostoc sp. и Synechocystis sp.; штаммы зеленых микроводорослей Cosmarium sp. и Chlorella sp. (получены с кафедры гидробиологии Биологического факультета МГУ).

Штаммы цианобактерий Anabaena и Nostoc и зеленых водорослей Cosmarium выращивают в модифицированной среде BG-11 [40]. Штамм Chlorella vulgaris выращивают в среде Тамийя [41]. Штаммы Microcystis aeruginosa выращивают в среде В-12 [42]. Штаммы микроводорослей выращивают в соответствующих каждому виду средах в 50-100 мл в стеклянных плоскодонных колбах емкостью 250 мл при 25-30°С без аэрации при комнатной температуре и круглосуточном освещении. Используют люминесцентные лампы дневного белого света СВЕ ЛБУ-30, которые обеспечивают освещенность 40 мкмоль квантов м^-2⋅с^-1 в области ФАР. Продолжительность светового периода составляет 14 часов в сутки. Через 10-12 суток выросшую культуру микроводорослей используют в качестве тест-культуры для выявления альгицидной активности.

Пример 3.

Оценка спектра альгицидной активности заявляемого биопрепарата

Альгицидную активность оценивают по изменению окраски инкубационных смесей тестируемых микроводорослей при совместном культивировании с заявляемым биопрепаратом. 100 мг сухого порошка биопрепарата вносят непосредственно в 5 мл жидкой пробы тест-микроводорослей. Микроводоросли синтезируют различные пигменты (хлорофилл, фикобилины, каротиноиды), которые и определяют их цвет. Обесцвечивание инкубационных смесей тест-микроводорослей с заявляемым биопрепаратом наблюдают во всех опытах (таблица 2).

Как следует из таблицы 2, тестируемые штаммы сине-зеленых и зеленых микроводорослей чувствительны к альгицидному действию заявляемого биопрепарата, но уровень их чувствительности различен в зависимости от видовой принадлежности и времени воздействия. При оптической микроскопии выявлен полный лизис клеток всех изученных тест-микроводорослей под воздействием заявляемого биопрепарата.

Пример 4.

Оценка альгицидной активности заявляемого препарата в лабораторных условиях

Альгицидную активность биопрепарата, приготовленного как в примере 1, выявляют при совместном инкубировании с микроводорослями Nostoc, Anabaena или Microcystis, выращенными как в примере 2, в течение 96 часов при комнатной температуре. 100 мг биопрепарата вносят непосредственно в 5 мл микроводорослей. Активность препарата оценивают по изменению оптической плотности инкубационной смеси, которую измеряют при длине волны 590 нм в нулевой момент времени и после совместной инкубации. Альгицидную активность оценивают как остаточную оптическую плотность смеси при длине волны 590 нм по формуле (ОП), как (ОП_Т/ОП_Н)×100, где ОП_Н - начальная ОП, ОП_Т - ОП после инкубации в течение Т часов соответственно. Отмечено снижение оптической плотности смеси с Nostoc и Anabaena в 10 раз, а смеси с Microcystis или Cosmarium или Chlorella в полтора - два раза (таблица 3). Лизис клеток микроводорослей выявляют также при оптической микроскопии.

Следует отметить мутность инкубационных смесей с Chlorella или Microcystis, или Amorphonostoc sp., или Synechocystis sp,. или Cosmarium с заявляемым биопрепаратом. Измерение оптической плотности затруднено из-за физико-химических свойств - высокой мутности суспензий. Следует отметить, что происходит обесцвечивание полученных инкубационных смесей, при этом цианобактерий Anabaena и Nostoc более чувствительны к воздействию заявляемого препарата и обесцвечивание смесей наступает уже через 24 часа совместного инкубирования. При световой микроскопии к концу культивирования инкубационных смесей выявлен лизис клеток всех видов тест-микроводорослей.

Пример 5.

Оценка фунгицидной активности заявляемого биопрепарата

Для выявления фунгицидной активности используют метод лунок. Готовят исходную 1% рабочую суспензию, из которой делают кратные разведения (0,1% и 0,01%). Тестируемые фитопатогенные грибы высевают в центр чашки Петри на агаризованную картофельно-сахарозную среду (мас. %: агар-агар - 2,0; сахароза - 2,0; картофельный отвар - остальное, рН - при 25°С - 7,2). В лунки, вырезанные в среде, диаметром 10 мм вносят по 150 мкл кратных разведений. Чашки инкубируют в темноте при комнатной температуре. Через 48 часов оценивают наличие или отсутствие зон подавления роста микроскопических грибов. Эффективность фунгицидного действия препарата определяют по диаметру зоны отсутствия роста фитопатогенных грибов (таблица 4).

Как следует из таблицы 4, заявляемый препарат подавляет рост мицелия всех исследованных фитопатогенных тест-грибов.

Пример 6.

Оценка антибактериальной активности заявляемого биопрепарата

Антибактериальное действие заявляемого препарата выявляют на грамположительных и грамотрицательных тест-бактериях. Тест-микроорганизмы культивируют при 37°С с аэрацией при 220 оборотов/мин в течение 24 часов в бульоне Мюллера-Хинтона (Mueller-Hinton Broth, "HIMEDIA", India), мас. %: кислотный гидролизат казеина - 3,0; вытяжка из говядины - 0,175; растворимый крахмал - 0,015; вода - остальное, рН - (при 25°С) -7,4±0,2. Тестирование антибактериальной активности проводят методом лунок на плотной агаризованной среде. Для этого бактериальные тест-культуры с оптической плотностью 0,5 высевают на чашки Петри с 20 мл агаризованной среды Мюллера-Хинтона. Чашки оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего в агаре вырезают лунки диаметром 4 мм, в которые вносят по 25 мкл образца каждого разведения заявляемого биопрепарата, приготовленные как в примере 5. Антибактериальное действие разведений препарата оценивают по наличию зоны задержки роста тест-бактерий через 24 часа и измерению величины этих зон (таблица 5).

Как следует из таблицы 5, заявляемый биопрепарат проявляет антибактериальную активность против грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Rhodococcus rhodochrous; и грамотрицательных бактерий Acinetobacter baumannii; но не активен против грам-отрициательных бактерий: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumniae.

Пример 7.

Оценка ларвицидной активности заявляемого биопрепарата

Для тестирования ларвицидной активности заявляемого биопрепарата используют разведения порошка заявляемого биопрепарата, приготовленные как в примере 5. Ларвицидную активность заявляемого биопрепарата тестируют на личинках комаров отряда Diptera согласно методу оценки инсектицидной активности бактериальных препаратов по отношению к насекомым отряда Diptera [43]. В таблице 6 представлены результаты исследования ларвицидной активности биопрепарата на личинках комаров И-ой стадии развития Aedes aegypti (Liston), и Anopheles stephensi (L.) Culexpipiens (L.) (Diptera).

Сравнительный анализ активности заявляемого биопрепарата в отношении насекомых отряда Diptera показал, что биопрепарат в разной степени токсичен для личинок комаров II-ой стадии развития трех видов отряда Dipera: Culex pipiens, Anopheles stephensi и Aedes aegypti. Биопрепарат наиболее активен против личинок Culex pipiens. Для заявляемого биопрепарата в зависимости от вида комаров 50% уровень летальной концентрации - LC₅₀ составляет от 10^-5 до 10^-6, или в пересчете на клетки - от 10⁷ до 10⁵ КОЕ/мл. По уровню ларвицидной активности заявляемый биопрепарат соответствует штаммам В. thuringiensis и В. sphaericus [44].

Список литературы.

1. Азизбекян Р.Р.Биологические препараты для защиты сельскохозяйственных растений. (Обзор). Биотехнология, 2018, т. 34, №5, 37-47.

2. Favret, М.Е., and Yousten, А. А. 1985. Insecticidal activity of Bacillus laterosporus. J. Invertebr. Pathol. Vol .45, p. 195-203.

3. Rivers D B, Vann С N, Zimmack H L, & Dean D H. 1991. Mosquitocidal activity of Bacillus laterosporus. Journal Invertebrate Patholology 58: 444-447.

4. Ruiu, L., G. Delrio, D.J. Ellar, I. Floris, B. Paglietti, S. Rubino and A. Satta. (2006). Lethal and sublethal effects of Brevibacillus laterosporus on the housefly (Musca domestica). Entomologia Experimentalis et Applicata, 118: 137-144.

5. Gerard, J.M., Haden, P., Kelly, M.T., Andersen, R.J., 1999. Loloatins A-D, cyclic decapeptide antibiotics produced in culture by a tropical marine bacterium. J. Nat. Prod. 62:80-85.

6. Barsby, Т., Kelly, M.Т., and R.J. Andersen. 2002. Tupuseleiamides and basiliskamides, new acyldipeptides and antifungal polyketides produced in culture by a Bacillus laterosporus isolate obtained from a tropical marine habitat. J. Nat. Prod. V. 65(10), p.1447-1451.

7. Singer, S. 1977. Isolation and development of bacterial pathogens of vectors. In Biological regulation of vectors, p. 3-18. DHEW Publ. No. (NIH) 77-1180. Bethesda, MD: NIH.

8. De Oliviera, E.J., L. Rabinovitch, R.G. Monnerat, L.K.J. Passos and V. Zahner. 2004. Molecular characterization of Brevibacillus laterosporus and its potential use in biological control. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 70, pp. 6657-6664.

9. Huang, X., Tian, В., Niu, Q., Yang, J., Zhang, L., and Zhang, K. 2005. An extracellular protease from Bacillus laterosporus G4 without parasporal crystals can serve as a pathogenic factor in infection of nematodes. Res.Microb 156(5-6):719-727.

10. Baoyu, Т., Jinki, Y., Lihui, L., Chunyan, W., Ning, L., Zhang, K.Q. 2007. Role of an extracellular neutral protease in infection against nematodes by Brevibacillus laterosporus strain G4. Appl. Microbiol. Biotechn. Vol.74, N. 2, p. 372-380.

11. Sanders, M.E., Morelly, L., and T.A. Tompkins. 2002. Sporeformers as human probiotics: Bacillus, Sporolactobacillus and Brevibacillus. Comp. Rev. Food Sci. Food Saf. Vol. 2, p. 101-110.

12. Desjardine, K., Pereira, A., Wright, H., Matainaho, Т., Kelly, M., and R. J. Andersen. 2007. Tauramamide, a lipopeptide antibiotic produced in culture by Brevibacillus laterosporus isolated from a marine habitat: structure elucidation and synthesis. J. Nat. Prod. V. 70 (12), p. 1850-1853.

13. Сорокулова И.Б., Рыбалко С.Л., Руденко А.А., Берестовая Т.Г., Легеза К.Н., Подгорский В.С., Курищук К.В. Пробиотик субалин - принципиально новый подход к лечению бактериальных и вирусных инфекций, Киев, 2007 г.

14. Youshida, S., Naganawa, Н., Aoyagi, Т., Takeuchi, Т, Takeuchi, Y., and Kodama, Y. 1991. Leuhistin, a new inhibitor of aminopeptidase M, produced by Bacillus laterosporus BMI156-14F1. II. Structure determination of leuhistin. J. Antibiotics, Vol. 44, No. 6, p. 579-581.

15. Shoji, J., Sakazaki, R., Wakisaka, Y., Koizumi, K., Mayama, M., Matsuura, S. and K. Matsumoto. J. Antibiotics. 1976, V. 29, No. 4, p.3 90-393.

16. Fudaba, Y., Fukuda, Y., Yamamoto, H., Ohdan, H., Shintaku, S., Shibata, S., Miyata, Y., Marubayashi, S, Asahara, Т., and Dohi, K. 1998. Transplant. Proa, 1998, V. 30, No. 7, p. 3582-3583.

17. Tanabe, K., Takahashi, K., Nemoto, K., Okada, M., Yasuo, M., Hayasaka, Y., Toma, H., and Ota, K. J. Urol. Vol., 1994, V. 152, No. 2, part 1, p. 562-566.

18. Патент RU 2229520.

19. US 5455028

20. Huynh H., Le Hong Due, Cutting S. FEMS Microbiology Rev., 2005, V. 29, p. 813-835

21. Кузнецова Н.И., Смирнова T.A., Шамшина Т.Н., Ганушкина Л.А., Азизбекян P.P. Биотехнология, 1995, т. 3-4, с. 11-16.

22. Orlova М.В.. Smirnova Т.А., Ganushkina L.A., Yacubovich V.Y., Azizbekyan R.R. Appl. Environ. Microbiol., 1998, v. 64, N7, p. 2723-2728.

23. Aronson A., Dunn P. U.S. Patent, No.5,055, 293, 1993.

24. Ruiu L., Satta A., Boris I. Environ Entomol., 2008, V. 37(2), p. 505-509.

25. Патент RU 2242125

26. Branly K., Atkins R. U.S. Patent, No.6,232,270. 2001.

27. O'Dormell B. US 5455028. 1995.

28. Ren Z.Z., Zheng Y., Sun M., Liu J.Z., Wang Y.J., Wei Sheng, Wu Xue Bao, 2007, V.47 (6), p.997-1001.

29. O'Donnell B. US 5702701.1997.

30. Qiuhong N., Xiaowei H., Baoyu Т., Jinkui Y., Jiang L., Lin Z., Keqin Z.. Appl Microbiol Biotechnol., 2007, V. 74(2), p. 372-380.

31. Chang S.F., Wan Y.L., Cui J.Y., Wang B.S. Acta Entomol. Sin., 1984, V. 26, p. 419-425.

32. Кузнецова Н.И., Азизбекян P.P., Конюхов И.В., Погосян С.И., Рубин А.Б. Доклады Академии наук, 2007, т. 241, №2, с. 262-266.

33. Патент RU 2323968

34. Shida О., Takagi Н., Kadowaki K., Komagata K. 1996. J. Sysyt.Bacteriol., 45: 939-946

35. Патент RU 2430966

36. Pavlicek A., et al. Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol. (Praha). 1999. 45(3): 97-99.

37. Ruiz-Garcia C. et. al. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiol. 2005. - V. 55. - P. 191-195.

38. Патент RU 2430515.

39. ТУ-2189-004-25463066-2014

40. Stanier, R.Y., Kunisawa, R., Mandel M., Cohen-Basire, G. Bacteriool. Rev. 1971, т. 35 (2), 171-205.

41. Воншак А.В кн. Фотосинтез и биопродуктивность: методы определения. М. Агропромиздат.1989. С. 310-328.

42. Nakagawa, М., Y. Takamura, and 0. Yagi. 1987. Agric. Biol. Chem. 51:329-337.

43. Войцик A.A., Расницын С.П. 1992. Мед. паразитол. №4. С. 55-57.

44. De Barjac, Н. 1990. Bacterial Control of Mosquitoes and Blackflies. New Brunswick, NJ: Rutgers Univ. Press., p. 228-236.

1. Полифункциональный биопрепарат с широким спектром антагонистической активности, представляющий собой смесь культуральной жидкости кристаллообразующего штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 и целевых добавок, иммобилизованную на гранулах диатомита.

2. Применение биопрепарата по п. 1 в качестве фунгицидного средства для борьбы с фитопатогенными микроскопическими грибами.

3. Применение биопрепарата по п. 1 в качестве альгицидного средства для борьбы с сине-зелеными и зелеными микроводорослями.

4. Применение биопрепарата по п. 1 в качестве средства, обладающего ларвицидной активностью против личинок комаров отряда Diptera: Anopheles stephensi, Aedes aegypti и Culex pipiens.

5. Применение биопрепарата по п. 1 в качестве средства, обладающего антибактериальной активностью против грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Rhodococcus rhodochrous; и грамотрицательных бактерий Acinetobacter baumannii.