Способ производства ингаляционной лекарственной формы гексапептида
Изобретение относится к способу производства лекарственной формы для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора диацетата гексапептида формулы (I) H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH диацетат (I), включающему следующие стадии: а) подготовку вентиляционного воздуха с общим содержанием микрорганизмов не более 10 КОЕ/м3; (б) подготовку воды с общим содержанием микрорганизмов не более 100 КОЕ/л; (в) растворение гексапептида формулы (I) в воде с общим числом микрорганизмов не более 100 КОЕ/л; (г) стерилизующую фильтрацию водного раствора гексапептида формулы (I); и (д) розлив фильтрованного раствора в стерильную упаковку с герметизацией после разлива. Предпочтительно, содержание гексапептида формулы (I) в водном растворе составляет 1 мг/мл. Предпочтительно, стерилизующая фильтрация осуществляется с использованием стерилизующего фильтра 0,22 мкм. Предпочтительно, стерильная упаковка выбирается из группы, состоящей из флаконов и ампул.
Изобретение относится к лекарственной форме гексапептида тирозил-D-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетата, предназначенной для ингаляционного внутрилегочного введения пациентам с болезнями легких.
Гесксапептид тирозил-D-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат, формула H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH, известен как средство лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, панкреатита и панкреонекроза. Применение даларгина в составе лекарственных средств раскрыто в следующих патентах РФ (№№): 2032422, 2241488, 2198641, 2104717, 2270025, 2351334, 2343885, 2405534, 2363455, 2515550, 2180598, 2635083, 2436588, 2473325, 2144831, 2646569, 2200026, 2146530, 2155608, 2185176, 2139725, 2266130, 2326661, 2299742, 2218896, 2416398, 2318503, 2430753, 2299438, 2258529, 2099077, 2122415, 2261713, 2006039, 2366416, 2228762, 2185849, 2496493, 2366417, 2017488, 2167671, 2181564, 2284192, 2290203, 2286793, 2366432, 2299065, 2429002, 2196603, 2142814, 2285522, 2203693, 2230549, 2180591, 2142736, 2113856, 2217139, 2266752, 2261722, 2362580, 2223741, 222814869, 2217186, 2266130, 2326661, 2299742, 2218896, 2672888, 2416398, 2318503, 2430753, 2299438, 2258529, 2099077, 2122415, 2261713, 2006039, 2366416. Наиболее часто используемая лекарственная форма даларгина представляет собой твердый лиофилизат, который растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия непосредственно перед внутримышечным или внутривенным введением пациенту, чтобы избежать проблем, связанных с возможной нестабильностью пептида в растворе при хранении. Известна стабильная жидкая лекарственная форма даларгина для инъекций, содержащая даларгин, натрия хлорид и воду для инъекций (патент РФ № 2241488), в которой устойчивость (стабильность) даларгина при хранении обеспечивается введением натрия хлорида в состав раствора в качестве стабилизатора и консерванта.
Применение тирозил-D-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетата для лечения болезней легких ограничено очень низкой абсорбцией этого вещества легкими при инъекционном введении, не более 0,4% от вводимой дозы и временем полувыведения несколько минут. Каленикова ЕИ и др. Фармакокинетика даларгина. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.1988, 34(1): 75-83. Нами обнаружено, что ингаляционное введение водных растворов тирозил-D-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетата обеспечивает значительный терапевтический эффект при лечении болезней легких, обеспечивает более высокую доставку этого вещества в легкие, чем инъекционное введение, и более удобно для пациентов, чем инъекционное введение. Водные лекарственные формы пептидов подвержены быстрой деградации в растворе при наличии микробной контаминации и/или следов бактериальных пептидаз, поэтому лекарственные формы, содержащие пептиды в качестве основного вещества, часто содержат консерванты и стабилизаторы. Однако, наличие консервантов в ингаляционных лекарственных формах может вызывать ряд нежелательных побочных эффектов таких как кашель, раздражение слизистых оболочек бронхов и бронхоспазм. Kuhn RJ. Formulation of aerosolized therapeutics. Chest. 2001, 120(3 Suppl):94S-98S. Поэтому, целью настоящего изобретения было создание способа производства ингаляционной лекарственной формы гексапепида тирозил-D-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетата без консервантов и стабилизаторов.
Нами установлено, что стабильная ингаляционная лекарственная форма гексапептида в виде водного раствора может быть произведена без использования стабилизаторов и консервантов при включении в производственный процесс технологической стадии стерилизующей фильтрации, исключающей микробную контаминацию и, как следствие, присутствие в растворе бактериальных пептидаз, ответственных за деградацию гекспептида в растворе. При этом, все стадии производства также должны исключить микробную контаминацию лекарственной формы в процессе производства, которая может привести к присутствию в растворе бактериальных пептидаз, которые могут привести к деградации гексапептида в растворе при последующем хранении указанной лекарственной формы.
Настоящее изобретение относится к способу производства лекарственной формы для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора диацетата гексапептида формулы (I)
H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH диацетат (I),
включающему следующие стадии:
(а) подготовку вентиляционного воздуха с общим содержанием микрорганизмов не более 10 КОЕ/м3;
(б) подготовку воды с общим содержанием микрорганизмов не более 100 КОЕ/л;
(в) растворение гексапептида формулы (I) в воде с общим числом микрорганизмов не более 100 КОЕ/л; и
(г) стерилизующую фильтрацию водного раствора гексапептида формулы (I); и
(д) розлив фильтрованного раствора в стерильную упаковку с герметизацией после разлива.
В предпочтительном воплощении, содержание гексапептида формулы (I) в водном растворе составляет 1 мг/мл.
Техническим результатом настоящего изобретения является то, что способ производства настоящего изобретения обеспечивает долговременную стабильность лекарственной формы препарата гексапептида формулы (I) в виде водного раствора для ингаляционного введения без применения в ее составе стабилизаторов и консервантов.
Гексапептид формулы (I), короткое название гексапептид (I), имеет химическое название тирозил-D-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат и может быть получен любым способом известным из уровня техники, в частности, твердофазным синтезом. Гексапептид формулы (I), его соли и сольваты коммерчески доступны, например, в каталоге Bachem № 4030569.0100 (https://shop.bachem.com/4030569.html). Кроме того, диацетат гексапептида формулы (I) производится в качестве коммерчески доступной фармацевтической субстанции в Российской Федерации несколькими производителями.
Термин «лекарственная форма» означает состояние лекарственного препарата, соответствующее способам его введения и применения и обеспечивающее достижение необходимого лечебного эффекта.
Термин «лекарственный препарат» означает лекарственное средство в виде лекарственной формы, применяемой для профилактики, лечения заболевания, и реабилитации.
Термин «лекарственная форма в виде стабильного водного раствора» означает, что лекарственная форма настоящего изобретения удовлетворяет требованию отсутствия значительных изменений (более 5%) содержания гексапептида (I) по показателю "количественное определение" от первоначального значения, как установлено ГОСТ Р 57129-2016 «Лекарственные средства для медицинского применения. Часть 1. Изучение стабильности новых фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов». Срок годности лекарственной формы для ингаляционного введения настоящего изобретения по критерию «стабильность» может быть от 3 до 36 месяцев, предпочтительно не менее 3 месяцев.
В предпочтительном воплощении, лекарственная форма содержит гексапептид (I) и воду при следующем содержании компонентов: гексапептид (I) 1 мг/мл; вода до 100,0 мас.%.
Термин «подготовка вентиляционного воздуха» относится к системе очистки воздуха для его использования в производственных помещениях, где происходит подготовка сырья, приготовление водных растворов, стерилизующая фильтрация и розлив растворов во флаконы или ампулы.
В некоторых воплощениях, подготовка вентиляционного воздуха происходит с использованием оборудования состоящего из приточной системы, вытяжной системы, и ламинарной системы, обеспечивающих уменьшение общего содержания микрорганизмов до уровня не превышающего 10 КОЕ/м3. Приточная система включает вентилятор с производительностью достаточной для обеспечения кратности воздухообмена в чистой зоне класса «А/В» не менее 20 и фильтры очистки воздха; вытяжная система включает фильтры выходящего воздуха; ламинарная зона включает конструкцию из фильтромодулей с самостоятельным вентилятором в каждом модуле и автоматическим регулированием потока воздуха, 100% рециркуляцию воздуха рабочей зоны, фильтр тонкой очистки воздуха в каждом фильтромодуле.
Термин «КОЕ» означает колониеобразующие единицы, т.е. показатель количества жизнеспособных микроорганизмов в единице объема или единице массы.
Термин «подготовка воды» относится к системе очистки воды для использования в качестве вспомогательного вещества в составе лекарственной формы настоящего изобретения.
В некоторых воплощениях, подготовка воды происходит с использованием оборудования состоящего из установки для получения воды и конструкций для хранения и раздачи воды, обеспечивающих получение и использование в производстве воды с общим содержанием микрорганизмов не более 100 КОЕ/л (10 КОЕ в 100 мл).
Полученная в результате подготовки вода должна удовлетворять требованиям фармакопеи и нормативных документов РФ и других стран, в частности, требованиям ФС.2.2.0020.15 «вода очищенная»; требованиям ФС.2.2.0019.15 «вода для инъекций»; нормативным документам «Руководство по качеству воды для применения в фармации. Методические рекомендации», Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ, 2009» и «CPMP/QWP/158/01 «Note for Guidance on Quality of Water for Pharmaceutical Use», EMEA, 2002»; или любым другим нормативным актам действующим в этой сфере. Предпочтительно, вода в составе лекарственной формы настоящего изобретения выбирается из группы, состоящей из воды очищенной и воды для инъекций.
В одном воплощении, подготовка воды производится с использованием установки для получения воды умягченной, воды очищенной, многоколоночного дистиллятора фармацевтического класса и накопительной емкости для хранения и раздачи воды.
В другом воплощении, подготовка воды производится с использованием установки обратного осмоса-деионизации и накопительной емкости для хранения и раздачи воды.
Термин «стерилизующая фильтрация» означает процесс, при котором водный раствор освобождается от загрязнения организмами путем прохождения потока раствора через фильтрующий материал. Неэксклюзивные примеры фильтрующих материалов включают фильтр стерилизующий в сборе (Merck Millipore, США), состоящий из префильтра 0,45 мкм и стерилизующего фильтра 0,22 мкм, площадь фильтрации не менее 0,1 м2, автоклавируемый; фильтр стерилизующий (Merck Millipore, США), состоящий из дыхательного гидрофобного стерилизующего фильтра 0,22 мкм, одноразового, площадь фильтрации не менее 0,02 м2.
Лекарственная форма настоящего изобретения может содержать вспомогательные вещества. Термин «вспомогательное вещество» означает вещество неорганического или органического происхождения, используемое в процессе производства, изготовления лекарственного препарата для придания ему необходимых физико-химических свойств. Неэксклюзивные примеры вспомогательных веществ включают буферные системы, регуляторы тоничности растворов, поверхностно-активные вещества и эмульгаторы. Подбор вспомогательных веществ для использования в составе лекарственной формы настоящего изобретения может быть осуществлен на основе следующих критериев: вспомогательное вещество не должно влиять на основное терапевтическое действие композиции, не должно быть токсичными в используемых количествах и не должно неблагоприятно воздействовать на функции слизистой оболочки дыхательных путей и ее реснитчатого эпителия. В некоторых воплощениях настоящего изобретения, лекарственные формы могут содержать от 0,001 до 99,999% вспомогательного вещества.
Термин «буферная система» описывает комбинацию кислоты и основания, предпочтительно сопряженного основания, в количествах достаточных для поддержания требуемого уровня рН. Неэксклюзивные примеры фармацевтически приемлемых буферных систем для поддержания рН в интервале от 3,0 до 8,5 описаны в фармакопее РФ (ОФС.1.3.0003.15 «Буферные растворы») и включают ацетатный буфер, цитратный буфер, сукинатный буфер, фосфатный буфер, имидазольный буфер, трис-натрий ацетатный буфер. Диацетат гексапептида (I) также представляет собой буферную систему, содержащую комбинацию уксусной кислоты и ее опряженного основания ацетата в форме моноацетата гексапептида (I), при молярном соотношении кислоты и сопряженого основания 1:1.
В одном из воплощений, лекарственная форма для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора содержит 1 мг/мл гексапептида формулы (I) и имеет рН от 4,8 до 6,8.
В предпочтительном воплощении, лекарственная форма для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора содержит 1 мг/мл гексапептида формулы (I), имеет рН от 4,8 до 6,8, и разливается в стерильную упаковку, выбранную из группы, состоящей из флаконов и ампул.
Термин «лекарственная форма для ингаляционного введения» означает лекарственную форму в виде стабильного водного раствора, предназначенную для введения действующего вещества в легкие в виде паров или дисперсий жидких частиц в газовой среде с целью получения эффекта. Размер частиц дисперсии (аэрозоля) составляет от 0,1 до 10 мкм, предпочтительно от 1 до 5 мкм.
В одном из воплощений настоящего изобретения, ингаляционное внутрилегочное введение осуществляется путем распыления с помощью небулайзера.
В одном из воплощений настоящего изобретения, лекарственное средство является дозированным и содержит от 0,1 до 50 мг гексапептида формулы (I) в одной дозе, предпочтительно 10 мг в одной дозе. Термин «доза» означает количество действующего вещества, которое должно быть введено субъекту за один раз.
Термин «небулайзер» обозначает устройство для ингаляций, обеспечивающее преобразование жидкого лекарственного средства для распыления в дисперсию в газовой среде для доставки действующего вещества в легкие. Примеры небулайзеров включают компрессорные, ультразвуковые, либо небулайзеры иного типа.
В одном из воплощений настоящего изобретения, терапевтически эффективное количество стабильного водного раствора вводят субъекту с помощью небулайзера, преобразующего жидкую композицию в дисперсию в газовой среде для доставки действующего вещества в легкие в течение 10-120 мин, предпочтительно от 30 до 90 мин, один раз в день или чаще. Введение может быть однократным или курсовым, курсом до 30 дней.
Следующие примеры демонстрируют изобретение. Примеры иллюстрируют изобретение и не предназначены для ограничения объема изобретения тем или иным образом.
Пример 1.
Таблица 1. Состав лекарственной формы для ингаляционного введения.
| Состав | Содержание |
| Гексапептид (I) | 1 мг |
| Вода для инъекций | 1 мл |
| рН | 4,8-6,8 |
В таблице 1 показан состав лекарственной формы для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора настоящего изобретения.
Пример 2.
Пример иллюстрирует способ производства лекарственной формы для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора.
Подготовка производства.
Санитарная подготовка производства проводится для предотвращения загрязнения микроорганизмами и механическими частицами и включает в себя: подготовку дезрастворов, подготовку производственных помещений, оборудования, а также подготовку персонала и одежды. Для производственных помещений используют дезинфицирующие средства с широким спектром антимикробного действия, которые имеют минимальное время экспозиции и не оставляют следов на обрабатываемых поверхностях. Подготовка производственных помещений включает в себя комплекс мероприятий, состоящий из влажной уборки, дезинфекции и УФ-облучения стен, полов и других поверхностей, направленных на достижение соответствующего класса чистоты помещений.
Подготовка вентиляционного воздуха.
Процесс производства раствора для ингаляций осуществляется в помещениях определенного класса чистоты, нормируемых по содержанию жизнеспособных микроорганизмов и частиц в воздухе. Проведение подготовительных технологических операций осуществляется в помещениях класса чистоты D, приготовление раствора перед фильтрацией осуществляется в помещении класса чистоты С, проведение операций, непосредственно связанных с получением готовой лекарственной формы (асептический розлив), осуществляется в помещениях класса чистоты В, имеющих огражденную зону чистоты А с ламинарным потоком воздуха. Вентиляционный воздух, поступающий в помещения производства, проходит через систему очистки и систему кондиционирования. В помещениях класса чистоты В (с зоной А) создают двадцатикратный (и более) воздухообмен и подпор воздуха относительно наружной атмосферы для создания барьера для проникновения на участок наружных загрязнений с перепадом давления 40-45 Па. Система очистки состоит из фильтров, позволяющих уменьшать в зоне А максимально-допустимое количество частиц размером 0,5 и 5 мкм не более 352 тыс/м3 и 2,9 тыс/м3 воздуха, соответственно. Микробиологический контроль проводится при проведении каждого технологического процесса с использованием седиментационного метода. Вентиляционный воздух в чистых помещениях класса В (с зоной А) содержит не более 10 КОЕ/м3 в расчете на общее содержание микрорганизмов.
Подготовка воды.
Питьевая вода проходит предварительную обработку на установке, состоящую из сетчатого самопромывного фильтра, установки обезжелезивания, накопительных емкостей с повышающей насосной станцией, фильтра тонкой очистки, установки умягчения и установки УФ обеззараживания. Комбинацией обратного осмоса, мембранной дегазации и электродеионизации достигается производство воды очищенной. Установка производства воды очищенной состоит из следующих компонентов: умягчитель, станция декарбонизации, фильтр, установка обратного осмоса, мембранная дегазация, электродеионизация, установки УФ обеззараживания. Для производства воды, соответствующей требованиям ФС.2.2.0019.15 «вода для инъекций», вода очищенная подается на установку дистилляции и подвергается дистилляции. Исследование на содержание микрорганизмов проводят методом мембранной фильтрации в асептических условиях в соответствии с методами ОФС «Микробиологическая чистота», п.12. Для производства лекарственной формы настоящего изобретения используется вода с общим содержанием микрорганизмов не более 100 КОЕ/л (10 КОЕ в 100 мл).
Приготовление раствора гексапептида (I).
Порошок гексапептида (I) смешивают с водой фармакопейного качества с с общим содержанием микрорганизмов не более 100 КОЕ/л (10 КОЕ в 100 мл) в соотношениях, указанных в таблице 1 примера 1, выдерживают 10-15 мин до образования прозрачного раствора. Выход 100% в пересчете на гексапептид (I).
Стерилизующая фильтрация.
Приготовленный прозрачный водный раствор гексапептида (I) подают в фильтрационную установку, состоящую из префильтра 0,45 мкм, стерилизующего фильтра 0,22 мкм (Merck Millipore, США), дыхательного гидрофобного стерилизующего фильтра, 0,22 мкм (Merck Millipore, США), автоклавируемой приемной емкости с подающим и приемным патрубком, стерилизованных чистых силиконовых шлангов. Все компоненты поступают в рабочее помещение через передаточный шлюз в защитной упаковке, сохраняющей стерильность. Упаковку удаляют внутри ламинарной зоны А после протирки с наружной стороны стерильным дезинфицирующим средством. Приемную емкость со стерильным раствором передают на розлив путем подсоединения силиконового шланга к разливочной игле машины. Выход 99% в пересчете на гексапептид (I).
Розлив стерильного раствора по флаконам.
Подключают стерильный силиконовый шланг от емкости со стерильным раствором гексапептида (I) к наполняющей игле разливочной машины через перистальтический насос. Получают через передаточный шлюз стерильные флаконы 10R (полезный объем 10 мл) и пробки в защитной упаковке. После наполнения стерильных флаконов стерильным раствором, флаконы герметически укупориваются стерильными пробками в асептических условиях (вентиляционный воздух с общей микробной нагрузкой не более 10 КОЕ/м3). Произведенная лекарственная форма в виде стабильного водного раствора гексапептида (I) во флаконах может быть использована для ингаляционного введения субъекту, нуждающемуся в этом, при помощи небулайзера.
Пример 3
Пример иллюстрирует способ производства ампулированной лекарственной формы для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора.
Подготовка вентиляционного воздуха, подготовка воды, подготовка производства, приготовление раствора гексапептида (I), стерилизующая фильтрация раствора гексапептида (I) производятся как описано в Примере 2 настоящего изобретения.
Розлив стерильного раствора по ампулам.
Подключают стерильный силиконовый шланг от емкости со стерильным раствором гексапептида (I) к наполняющей игле разливочной машины через перистальтический насос. Получают через передаточный шлюз стерильные ампулы 10R (полезный объем 10 мл). После наполнения стерильных ампул стерильным раствором, ампулы герметически укупориваются путем запаивания в асептических условиях (вентиляционный воздух с общей микробной нагрузкой не более 10 КОЕ/м3). Произведенная лекарственная форма в виде стабильного водного раствора гексапептида (I) в ампулах может быть использована для ингаляционного введения субъекту, нуждающемуся в этом, при помощи небулайзера.
Пример 4
Пример иллюстрирует стабильность лекарственной формы для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора.
Лекарственная форма для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора с составом, указанным в таблице 1, была приготовлена как описано в примере 2 настоящего изобретения (Лекформа). Контрольный водный раствор гексапептида (I) с тем же составом (Контроль) был приготовлен без соблюдения требований снижения микробной контаминации в технологическом процессе, а именно без соблюдения требований подготовки вентиляционного воздуха с общим содержанием микрорганизмов не более 10 КОЕ/м3, подготовки воды с общим содержанием микрорганизмов не более 100 КОЕ/л, растворения гексапептида формулы (I) в воде с общим числом микрорганизмов не более 100 КОЕ/л. Кроме того, стерилизующая фильтрация водного раствора гексапептида формулы (I) не проводилась и розлив раствора производился в нестерильные флаконы, но с герметизацией после разлива. В каждой серии было по пять флаконов.
Испытания стабильности проводилось при температуре 25±2°С в течение 12 месяцев. Измерение содержания гексапептида (I) проводилось до (0 мес) и через 12 месяцев после начала испытаний методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным детектированием с применением времяпролетного масс-детектора ВЭЖХ-МС-МС (Agilent 1260, оснащенный автодозатором, с масс-селективным детектором Agilent 6545XT Accurate mass Q-TOF LC/MS) в следующем режиме: объемная скорость подвижной фазы через колонку 0,4 см3/мин; температура термостата колонки 35°С; объем вводимой пробы 20 мкл; состав подвижной фазы: компонент А - 0,1% раствор муравьиной кислоты с рН 2,5% в воде, компонент Б - ацетонитрил; режим элюирования - градиент: 5% Б (0 - 5 мин), от 5% до 20%Б (5 - 15 мин), 20% Б (15 - 25 мин), 5%Б (25 - 35мин). Результаты испытаний стабильности показаны в таблице 2 как изменение среднего содержания гексапептида (I) в продукте через 12 мес хранения в указанных условиях.
Таблица 2. Исследования стабильности.
| Продукт | Содержание гексапептида (I), мг/мл | Изменение содержания гексапептида (I), % | |
| 0 мес | 12 мес | ||
| Контроль | 1,051 | 0,962 | 8,47 |
| Лекформа | 1,020 | 0,989 | 3,03 |
Таблица 2 показывает, что лекарственная форма для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора настоящего изобретения была стабильна в течение по меньшей мере одного года, так как в процессе хранения не происходят значимые изменения содержания гексапатида (I) более 5% показателя "количественное определение" от первоначального значения, как установлено ГОСТ Р 57129-2016 «Лекарственные средства для медицинского применения. Часть 1. Изучение стабильности новых фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов». Контрольный раствор водный раствор гексапептида (I) с тем же составом, приготовленный без соблюдения требований снижения микробной контаминации в технологическом процессе, в том числе без проведения производственной стадии стерилизующей фильтрации был нестабилен. Таким образом, способ производства настоящего изобретения обеспечивает стабильность лекарственной формы произведенной для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора, не содержащего стабилизаторов и консервантов.
Пример 5.
Пример иллюстрирует эффективность лекарственной формы для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора, не содержащего стабилизаторов и консервантов.
Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) моделировали на мышах C57Bl/6 как описано в D'Alessio FR. Mouse Models of Acute Lung Injury and ARDS. Methods Mol Biol. 2018, 1809:341-350, с модификацией Aoyagi T et al., Shock. 2019, 52(1):83-9. Мышам вводили интратрахеально альфа-галактозилкерамид (1 мкг/мышь) и через 24 часа интратрахеально липополисахарид (ЛПС из E.coli; 300 мкг/мышь). Для оценки эффективности лекарственной формы через 30 мин после введения ЛПС мышам вводили ингаляционно однократно 100 мкг/кг гексапептида (I) в виде свежеприготовленной лекарственной формы из примера 1 (n=6) (Лекформа 0 мес) или лекарственной формы из примера 1, но после 12 мес хранения, как описано в примере 4 (n=6) (Лекформа 12 мес). Еще одна группа мышей с ОРДС получила однократно ингаляцию дистиллированной воды (Контроль). Через 7 часов после введения ЛПС интерлейкин-6 (ИЛ-6) измеряли в водном экстракте легочной ткани, взятой у мышей всех трех групп. Для сравнения, были измерены уровни ИЛ-6 в легочной ткани у интактных здоровых животных (n=6) (Интактные). Измерения проводились на мультиплексном ридере Bio-Plex® MAGPIX™ Multiplex Reader (Bio-Rad, SN: 12250707) с использованием стандартной коммерчески доступной панели (Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine Th17 Panel A 6-Plex #M6000007NY). Экстракт лёгочной ткани, стабилизированный ЭДТА, вносили в лунки планшета. Дальнейшие операции выполняли в соответствии с протоколом производителя. Результаты представлены в таблице 3 как среднее ± ошибка среднего содержания ИЛ-6 в легочной ткани.
Таблица 3.
| Группа | Содержание ИЛ-6, пг/мл |
| Интактные | 110±13 |
| Контроль | 943±128# |
| Лекформа 0 мес | 78±8* |
| Лекформа 12 мес | 92±11* |
*Достоверно отличается от контроля (p<0,05). #Достоверно отличается от группы «Интактные» (p<0,05).
Таблица 3 показывает, что ЛПС вызывает достоверное восьмикратное повышение ИЛ-6 в легких у контрольных животных по сравнению с интактными (p<0,05). Ингаляционное введение гексапептида (I) в составе свежеприготовленной лекарственной формы (Лекформа 0 мес) или лекарственной формы после хранения 12 мес (Лекформа 12 мес) достоверно снизило ЛПС-индуцированное повышение уровней ИЛ-6 в легких в 12 и 10 раз, соответственно, причем не было статистически достоверных отличий между группами «Лекформа 0 мес» и «Лекформа 12 мес» (p>0,05). Таким образом, способ производства настоящего изобретения обеспечивает стабильность лекарственной формы для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора, не содержащего стабилизаторов и консервантов, по критерию терапевтической эффективности.
1. Способ производства лекарственной формы для ингаляционного введения в виде стабильного водного раствора диацетата гексапептида формулы (I)
H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH диацетат (I),
включающий следующие стадии:
(а) подготовку вентиляционного воздуха с общим содержанием микроорганизмов не более 10 КОЕ/м3;
(б) подготовку воды с общим содержанием микроорганизмов не более 100 КОЕ/л;
(в) растворение гексапептида формулы (I) в воде с общим числом микроорганизмов не более 100 КОЕ/л;
(г) стерилизующую фильтрацию водного раствора гексапептида формулы (I); и
(д) розлив фильтрованного раствора в стерильную упаковку с герметизацией после разлива.
2. Способ по п.1, где содержание гексапептида формулы (I) в водном растворе составляет 1 мг/мл.
3. Способ по любому из пп.1 и 2, где стерилизующая фильтрация осуществляется с использованием стерилизующего фильтра 0,22 мкм.
4. Способ по любому из пп.1-3, где стерильная упаковка выбирается из группы, состоящей из флаконов и ампул.
