Зонд нуклеиновой кислоты и способ детектирования геномных фрагментов

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ обработки образца нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает а) гибридизацию образца, содержащего целевой фрагмент к зонду нуклеиновой кислоты, включающему: i) последовательность, расположенную в начале, и последовательность, расположенную в конце, причем последовательности, расположенные в начале и в конце, находятся на концах первой олигонуклеотидной молекулы; и ii) последовательность шунта, которая содержит, в следующем порядке: вышележащую фланкирующую последовательность, которая является комплементарной последовательности, расположенной в начале; последовательность, комплементарную цели, которая является комплементарной целевому фрагменту; и нижележащую фланкирующую последовательность, которая является комплементарной последовательности, расположенной в конце; в результате чего образуется гибридизационный продукт, в котором концы целевого фрагмента являются смежными для лигирования к концам последовательностей, расположенных в начале и в конце, в первой молекуле олигонуклеотида; и б) лигирование концов целевого фрагмента к концам последовательностей, расположенных в начале и в конце, первой молекулы олигонуклеотида, в результате чего получается кольцевой продукт, содержащий целевой фрагмент и последовательности, расположенные в начале и в конце. Также предложены зонды и комплекты для осуществления способа. 5 н. и 32 з.п. ф-лы, 10 ил., 3 пр.

 

Перекрестные ссылки

Настоящая заявка заявляет приоритет по заявке Великобритании №: 1321191.7, поданной 2 декабря 2013 года, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники

Настоящее описание относится к зондам для детектирования специфических последовательностей нуклеиновых кислот в биологических образцах, особенно к зондам для использования в мультиплексных способах детектирования множества специфических последовательностей параллельно, а также к способам, в которых такие зонды используются для обнаружения фрагментов нуклеиновой кислоты. В частности, настоящее описание относится к нацеливанию фрагментов ДНК специфических хромосом для дальнейшего анализа.

Уровень техники

Гаплоидный геном человека содержит 3 млрд пар оснований, которые упакованы в 23 хромосомы, а диплоидный геном имеет 6 миллиардов пар оснований в 23 парах хромосом. Быстрота и удобство современных технологий секвенирования позволяет решить многие диагностические вопросы, используя высокопроизводительное секвенирование всего индивидуального генома или всего количества ДНК в образце. Тем не менее, для многих вариантов применений ДНК-диагностики, необходимым является только исследование части генома, делая упор на участок или участки, которые, как известно, связаны с определенными нарушениями, которые исследуются.

Было описано ряд методов для уменьшения сложности генома перед проведением анализа. Если только один короткий участок генома требуется для анализа, это может быть осуществлено с помощью прямой ПЦР для амплификации последовательности с использованием праймеров к известным участкам по обе стороны последовательности. Тем не менее, если для анализа необходимо амплифицировать многие регионы геномного образца, в результате выполнения нескольких различных амплификаций одновременно в той же самой реакционной смеси могут возникнуть артефакты амплификации.

WO 2003/044216 (Параллель Биосаинс, Инк.) и US 20090004701 A1 (Malek Faham) был описан метод мультиплексной амплификации целевых нуклеиновых кислот, в котором общие олигонуклеотидные праймеры были лигированы с сайтами, внутренними относительно фрагментов одноцепочечных нуклеиновых кислот. Общие сайты праймеров были приложены к каждой из множества различных целевых последовательностей, чтобы сделать возможной их стехиометрическую амплификацию.

WO 2005/111236 (Olink АВ) также описан способ идентификации последовательностей в геноме человека путем амплификации специфических целевых последовательностей. Способ подразумевает фрагментирование геномного образца на фрагменты, имеющие по крайней мере одну определенную концевую последовательность. Все селекторные конструкции, содержащее мотив для связывания с праймером, вступают в контакт с фрагментами. После лигирования выбранные целевые последовательности параллельно амплифицировались с использованием пары праймеров, специфических к общему для селекторов мотиву для пары праймеров. Селекторные конструкции, описанные в WO 2005/111236 имеют длинный олигонуклеотид, который гибридизируется с коротким олигонуклеотидом, каждая селекторная конструкция содержит один или два выступающих конца, которые являются комплементарными к определенной концевой последовательности фрагмента, содержащего целевую последовательность. Контактирование селекторов с целевыми фрагментами приводит к гибридизации целевого фрагмента между выступающими концами селектора или селекторов. В случае одного селектора с двумя выступающими концами такая гибридизация создает округленную конструкцию. В случае пары селекторов, когда каждый имеет один выступающий конец, формируется линейная конструкция. Лигирование и секвенирование конструкций селекторов, содержащих целевые фрагменты, позволяет определить целевые последовательности. Поскольку селекторные конструкции гибридизируются только с концевыми частями фрагмента, содержащего целевую последовательность, (или с одним концевым фрагментом и одним внутренним фрагментом) способ позволяет выбирать целевые последовательности, которые различаются по фрагментам, которые не участвуют в гибридизации, таким образом, что каждая селекторная молекула может гибридизироваться с множеством различных целевых последовательностей. Затем идентичность конкретной цели определяется путем амплификации и секвенирования конструкции. WO 2005/111236 предлагает использовать селекторы в способах анализа генетической изменчивости или для измерения количества копий ДНК.

GB 2492042 описывает вариант способа селектора, в котором фрагменты контактировали с частично двухцепочечным зондом, содержащий селекторный олигонуклеотид и, по меньшей мере, один векторный олигонуклеотид. Селекторный олигонуклеотид содержит два непримыкающих региона, специфических к целевому фрагменту, и нецелевой специфический регион, который включает, по меньшей мере, два сайта связывания для векторного олигонуклеотида. Векторный олигонуклеотид не является комплементарным к целевой последовательности и включает нуклеотидную последовательность, комплементарную к сайту связывания вектора на селекторном олигонуклеотиде. Векторный олигонуклеотид также содержит элементы для обнаружения/усиления. В данном способе комплементарные участки олигонуклеотидов зондов гибридизируются с целевым фрагментом с последующим лигированием векторного олигонуклеотида(ов) и нацеливания для получения гибридного фрагмента зонд-мишень, который затем детектируется.

Развитие технологии селектора было описано в WO 2011/009941 (Olink Genomics АВ), где описано лигирование одного конца фрагмента расщепленной геномной ДНК с зондом. По сравнению с более ранними отборочными зондами, которые предусматривают связывание с двумя регионами целевого фрагмента, и где изолируемая последовательность, как правило, является ограниченной двумя регионами известной последовательности, зонды в WO 2011/009941 описаны для использования в тех случаях, когда известным является только один регион последовательности. Некоторые варианты реализации зондов в WO 2011/009941 содержали элементы для иммобилизации на твердой фазе. Лигирование целевого фрагмента нуклеиновой кислоты с зондом, приводит к стабильному захвату целевого фрагмента и позволяет использовать очень жесткие стадии промывки для удаления нелигированных фрагментов, что приводит к высокой специфичности.

Также известны замыкающие кольцо зонды. Замыкающие кольцо зонды являются линейными олигонуклеотидами с последовательностями, комплементарными цели на концах и последовательностью, которая не комплементарна цели, между ними. При гибридизации с правильной последовательностью целевой ДНК два конца зонда смыкаются вместе от головы до хвоста и могут быть соединены с помощью ДНК лигазы. Лигирование ингибируется несовпадениями в стыках лигирования, так что успешное лигирование замыкающего кольцо зонда зависит от высокоспецифической гибридизации с целевой последовательностью, что позволяет зонду различать весьма сходные целевые последовательности и выборочно замыкать точную цель. Как следствие спирального характера двухцепочечной ДНК, молекула округленного зонда соединятся с нитью целевой ДНК.

Известно, чтобы амплифицировать округленные замыкающие кольцо зонды необходимо использовать репликацию по типу катящегося кольца, также известную как амплификация по типу катящегося кольца. Репликация по типу катящегося кольца была описана в US 5854033 (Lizardi). Репликация по типу катящегося кольца является амплификацией кольцевой молекулы нуклеиновой кислоты с использованием ДНК-полимеразы, которая замещает цепь, что приводит к образованию больших молекул ДНК, содержащих тандемные повторы амплифицированной последовательности. ДНК-полимераза катализирует удлинение праймера и смещение цепи в процессивной реакции полимеризации по типу катящегося кольца, которая продолжается столько, сколько является необходимым. Это приводит к амплификации округленной последовательности зонда в больших порядках, чем за один цикл ПЦР репликации и в других методах амплификации, в которых каждый цикл ограничен удвоению числа копий целевой последовательности. Дополнительная амплификация может быть получена с помощью каскада реакций замещения цепи.

Fredriksson et al. (Nucleic Acids Res. 35(7): e47 2007) описали "Ген-коллектор", способ мультиплексной амплификации нуклеиновых кислот с использованием коллекторных зондов, которые содержат примыкающие последовательности, комплементарные к родственным праймерным концевым последовательностям необходимых продуктов ПЦР, таким образом, что связывание коллекторных зондов с продуктами ПЦР соединяет концы продуктов ПЦР вместе, чтобы сформировать кольцевую ДНК. Затем выполняется универсальная амплификация посредством амплификации по типу катящегося кольца для генерации конечного продукта конкатемеров целевых последовательностей. Данный способ позволяет в мультиплексной ПЦР-реакции селективно детектировать правильные ампликоны, поскольку конечные последовательности правильных ампликонов представляют собой пару родственных праймеров и округляются коллекторным зондом, в то время как артефакты ПЦР, состоящие из праймера от одной пары с праймером из другой пары не округляются.

Сущность изобретения

В настоящем описании предлагаются усовершенствованные способы и зонды для анализирования фрагментов нуклеиновой кислот, таких как фрагментированная геномная ДНК. Некоторые варианты реализации настоящего изобретения относятся к зондам и их применению в способах испытаний образцов на наличие целевых одноцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот. Некоторых варианты реализации настоящего изобретения относятся к зондам, которые содержат

нацеливающий олигонуклеотид, содержащий последовательность, комплементарную цели, которая является комплементарной к целевому фрагменту и фланкирующую последовательность, примыкающую к последовательности, комплементарной цели, и

олигонуклеотидную последовательность, имеющую свободный 5' или 3'-конец,

причем габридизация между фрагментом и зондом делает целевой фрагмент основой для лигирования с 5' или 3'-концом олигонуклеотидной последовательности.

Некоторые варианты реализации настоящего изобретения также относятся к зондам, которые гибридизируются по длине одного фрагмента одноцепочечной нуклеиновой кислоты и лигируют с каждым концом фрагмента. Такие зонды содержат олигонуклеотидную последовательность, имеющую свободный 5'-конец, и олигонуклеотидную последовательность, имеющую свободный 3'-конец, для лигирования с каждым концом целевого фрагмента. Затем продукт лигирования детектируется, что делает возможным высокоспецифическое нацеливание и детектирование определенных фрагментов нуклеиновых кислот.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения способ может включать в себя расщепление ДНК на фрагменты с определенной последовательностью, денатурирование полученных фрагментов ДНК до одноцепочечных целевых фрагментов (мишеней) и смешивание мишеней с зондами, как описано в настоящем документе. Гибридизация мишеней с зондами создает матрицы для лигирования, чтобы специфически присоединять мишень к соответствующему зонду для генерации либо кольца, либо линейного продукта лигирования. Затем продукты лигирования могут быть обогащены, например, с помощью экзонуклеаз или твердофазной химии, и, в некоторых случаях, амплифицированы с помощью амплификации по типу катящегося кольца, ПЦР или других способов амплификации ДНК.

Ключевое преимущество некоторых вариантов реализации настоящего изобретения заключается в возможности анализа множества фрагментов ДНК параллельно. Множество фрагментов ДНК могут быть специфически нацелены и отобраны для последующего анализа. Это является особенно актуальным для неинвазивного пренатального тестирования (НПТ) внеклеточной ДНК плода в материнской крови, где подсчет тысяч специфических к хромосомам фрагментов ДНК обеспечивает очень точную количественную оценку.

В одном аспекте предлагается способ анализа образца на наличие целевой нуклеиновой кислоты. Способ обычно включает в себя образование определенных целевых фрагментов нуклеиновой кислоты, контакт образца с зондом, который гибридизируется по всей длине целевого фрагмента и обеспечивает стыки, пригодные для лигирования, в обоих 3' и 5'-концах фрагмента, лигирование целевого фрагмента с зондом как на 5', так и на 3' концах, и затем детектирование новой молекулу нуклеиновой кислоты, которая образовалась в результате двойного лигирования.

Один аспект предлагает способ анализа для проверки образца на наличие целевой нуклеиновой кислоты, содержащей:

(i) получение образца фрагментированной нуклеиновой кислоты

(ii) обеспечение денатурирующих условий, при которых целевые фрагменты являются одноцепочечными

(iii) контактирование образца с зондом нуклеиновой кислоты, содержащий нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент и содержит внутреннюю последовательность, комплементарную цели, таким образом, что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида, и

последовательности, расположенные в начале и в конце, имеющие свободные 5'- и 3'-концы соответственно, причем последовательности, расположенные в начале и в конце, являются комплементарными вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно,

(iv) обеспечение условий отжига, при которых последовательности начала и конца гибридизируются с фланкирующими последовательностями, а целевые фрагменты, если они присутствуют, гибридизуются с последовательностями, комплементарными цели зондов, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 3'-концом последовательности начала и 3'-концом последовательности конца

(v) обеспечение условий для лигирования, при которых, если целевой фрагмент присутствует, 3'-конец целевого фрагмента лигирует с 5'-концом последовательности, расположенной в начале, с образованием первого стыка лигирования, и 5'-конец целевого фрагмента лигирует с 3'-концом последовательности, расположенной в конце, с образованием второго стыка лигирования, продуцируя продукт двойного лигирования, который включает в себя непрерывную цепь нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности, расположенные в начале и в конце и целевой фрагмент,

(vi) детектирование наличия продукта двойного лигирования,

причем детектирование продукта двойного лигирования указывает на присутствие целевого фрагмента в образце.

В отличие от большинства других методик отбора и детектирования ДНК, настоящий способ может быть особенно полезен, когда весь фрагмент нуклеиновой кислоты является предварительно определенным или заданным наперед, то есть, когда последовательность целевого фрагмента известна заранее. В некоторых вариантах реализации настоящего способа целевой фрагмент является продуктом специфической фрагментации нуклеиновой кислоты, а не случайной фрагментации, которая может возникнуть вследствие физических воздействий, таких как фрагментация или обработка ультразвуком. Специфическая фрагментация нуклеиновой кислоты может быть достигнута с использованием ферментов рестрикции, ПЦР или других методов целевого определения концов фрагмента.

Для нацеливающего олигонуклеотида желательным является связывание со всем целевым фрагментом, чтобы обеспечить специфическое связывание точной целевой последовательности. Это отличается от более ранних подходов, когда зонды были разработаны таким образом, чтобы гибридизироваться с концом или концами фрагмента и/или с внутренней областью, но не связывались по всей длине целевого фрагмента. В действительности, ограниченная способность связывания с целевым фрагментом, являлась преднамеренной конструктивной особенностью многих прежних зондов, поскольку это позволяло осуществлять нацеливание и детектирование фрагментов, последовательность которых была лишь частично известна. Специфическое нацеливание фрагментов известной последовательности - с учетом возможности незначительной изменчивости последовательности в результате наличия различных аллелей в популяции, где это применимо - зонды и способы настоящего способа, могут обеспечить точность связывания и детектирование требуемого целевого фрагмента с очень низким риском ложноположительных результатов.

Двойное лигирование целевого фрагмента может дополнительно способствовать высокой специфичности способа. Зонд лигирует с целевой последовательностью на каждом конце, то есть на 5' и 3'-концах одноцепочечного фрагмента нуклеиновой кислоты. Таким образом, концы целевой последовательности, которые были специфически генерированные путем фрагментации, могут быть специфически обнаружены посредством последовательность - специфического лигирования с последовательностями, расположенными в начале и в конце. Особенность последовательность - специфического лигирования достигается за счет потребности в гибридизации как целевого фрагмента, так и последовательностей, расположенных в начале и конце, с нацеливающим олигонуклеотидом, а также благодаря чувствительности ДНК лигазы, которая ингибируется в случае несовпадений пар основ. Гибридизация целевого фрагмента с нацеливающим олигонуклеотидом способствует специфичности связывания, но, в отличие от реакции лигирования, которая обеспечивает самую высокую селективность по отношению к несовпадениям на 3' и 5' концах целевого фрагмента, наибольшим образом гибридизация дестабилизируется внутренними несовпадениями в центральной части мишени.

Нацеливающий олигонуклеотид служит основой для лигирования целевого фрагмента с последовательностями, расположенными в начале и в конце. Последовательности, расположенные в начале и в конце, гибридизируются с фланкирующими последовательностями, задавая пробел между 5'-концом последовательности, расположенной в начале, и 3'-концом последовательности, расположенной в конце. Целевой фрагмент, гибридизируется с последовательностью, комплементарной цели в пробеле, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5'-концом последовательности, расположенной в начале и 3'-концом последовательностей, расположенной в конце. Предпочтительно, отжиг целевого фрагмента и последовательностей, расположенных в начале и в конце, с зондом генерирует два идеально подогнанных стыка лигирования. Продукт двойного лигирования является, таким образом, непрерывной цепью нуклеиновой кислоты, содержащей последовательности, расположенные в начале и в конце, и целевой фрагмент.

Рассматривается ряд возможных конструкций зонда. Например, 5' и 3' концы для лигирования с целевым фрагментом могут быть обеспечены последовательностями, расположенными в начале и в конце, на двух отдельных каркасных олигонуклеотид ах или последовательностями, расположенными в начале и в конце, на соответствующих концах одного каркасного олигонуклеотида, который образовывает петлю для позиционирования целевого фрагмента между 5' и 3' концами.

В первом случае (два отдельных каркасных олигонуклеотида) лигирование целевого фрагмента с двумя каркасными олигонуклеотидами производит линейную нить нуклеиновой кислоты, содержащую целевой фрагмент между последовательностями, расположенными в начале и в конце.

Во втором случае (одиночный петлевой каркасный олигонуклеотид) лигирование целевого фрагмента производит кольцевую нуклеиновую кислоту, содержащую целевую последовательность между последовательностями, расположенными в начале и в конце.

В дальнейших версиях, одна или обе последовательности, расположенные в начале и в конце, могут быть предусмотрены на самом нацеливающем олигонуклеотиде, таким образом, что нацеливающий олигонуклеотид образует петлевую структуру в условиях отжига. В зависимости от конструкции, продукт двойного лигирования в таких случаях может быть либо линейной или кольцевой молекулой нуклеиновой кислоты.

Детектирование продукта зависит от успешного лигирования целевого фрагмента с последовательностями, расположенными в начале и в конце, для формирования непрерывной цепи нуклеиновой кислоты. В целом, продукт двойного лигирования детектируется с использованием подхода, который требует, чтобы оба события лигирования происходили для генерации сигнала. Например, детектирование может включать в себя амплификацию по обеим стыкам лигирования (например, с помощью ПЦР или для кольцевых вариантов реализации зонда, репликации по типу катящегося кольца) или захват непрерывной нити нуклеиновой кислоты в одном ее конце и детектирование ее другого конца. Ковалентное присоединение целевого фрагмента к зонду путем лигирования образует прочную связь, так что жесткое отмывание может быть использовано для удаления нелигированных нуклеиновых кислот, в которых последовательности, расположенные в начале и в конце, не были ковалентно присоединены, их взаимная гибридизация с нацеливающим олигонуклеотидом разрушается во время отмывания.

Эти признаки способа и зонда позволяют осуществлять высокоспецифический отбор целевых фрагментов. Когда способы применяются для мультиплексного обнаружения множества целевых фрагментов параллельно, возможно очень точное детектирование и определение количества целевой нуклеиновой кислоты. В результате своей высокой специфичности, настоящий способ может особенно хорошо подходить для диагностического использования в небольших образцах и/или для детектирования очень незначительных различий в относительных количествах различных целевых нуклеиновых кислот, например, в диагностике анеуплоидии хромосом плода из образца материнской крови или при детектировании наличия следовых количеств опухолевой ДНК в образце нормальной ткани от пациента, или детектировании фрагментов нуклеиновых кислот инфекционных агентов.

Наличие высокоспецифического распознавание целевого фрагмента позволяет использовать относительно высокие концентрации зонда без генерации ложноположительных сигналов, тем самым увеличивая выход и эффективность реакции. Это может иметь большое значение в диагностических применениях, где низкая изменчивость имеет важное значение, и цели могут присутствовать в небольших количествах, например, в НПТ путем анализа внеклеточной ДНК, детектировании внеклеточной циркулирующей опухолевой ДНК и обнаружении ДНК инфекционных агентов. Некоторые варианты реализации настоящего способа позволяют осуществлять высокоспецифический анализ коротких фрагментов ДНК, что имеет важное значение в применениях для анализа фрагментированной ДНК, например, внеклеточной ДНК в крови, или фиксированной формалином и залитой парафином ДНК.

Со ссылками на фиг. 3 и 4, в данном документе, помимо всего прочего, предложен способ обработки образца нуклеиновой кислоты. В данных вариантах реализации изобретения способ может включать: а) гибридизацию образца (например, образца, который был расщеплен с помощью рестриктазы), содержащего целевой фрагмент ("целевая ДНК") с зондом нуклеиновой кислоты, включающему: i. последовательности, расположенные в начале и в конце, где данные последовательности являются концами первой молекулы олигонуклеотида; и ii. последовательность шунта (где термин "последовательность шунта" предназначен для обозначения последовательности в олигонуклеотид который, когда гибридизируется с двумя или более другими полинуклеотидами, действует в качестве "шунта", чтобы расположить полинуклеотиды рядом друг с другом так, чтобы они могли лигировать вместе, как показано на фиг. 3 и 4). Как показано на фиг. 3 и 4, последовательность шунта (которую в некоторых случаях называют "нацеливающий олигонуклеотид"), используется в этом способе, и она содержит фланкирующую последовательность, которая является комплементарной к последовательности, расположенной в начале; последовательность, комплементарную цели, которая является комплементарной к целевому фрагменту; и нижележащую фланкирующую последовательность, которая является комплементарной к последовательности, расположенной в конце. Данный этап гибридизации производит гибридизационный продукт, в котором концы целевого фрагмента являются смежными для лигирования с концами последовательностей, расположенных в начале и в конце, перовой олигонуклеотидной молекулы, где термин "смежный для лигирования" в контексте двух последовательностей, которые являются смежными для лигирования друг с другом, означает, что нет никаких промежуточных нуклеотидов между двумя олигонуклеотидами, и они могут быть литерованы друг с другом с помощью лигазы. Следующий этап способа включает б) лигирование концов целевого фрагмента с концами последовательностей, расположенных в начале и в конце, первой молекулы олигонуклеотида, в результате чего получают циклический продукт, содержащий целевой фрагмент, а также последовательности, расположенные в начале и в конце. Данный этап лигирования проиллюстрирован на фиг. 1 (хотя, как показано на фиг. 3 и 4, способ может быть реализован различными путями, и, как таковой, зонд нуклеиновой кислоты, используемый на первой стадии способа, может состоять из одного или двух олигонуклеотидов).

Округленные продукты обеспечивают значительное преимущество для выявления, так как они могут быть амплифицированы по типу катящегося кольца (RCA). RCA производит сотни или тысячи копий округленного продукта в форме одной молекулы, таким образом эффективно амплифицирует округленный продукт и делает его относительно легким для детектирования, используя, например, меченные олигонуклеотиды, которые гибридизируются с мотивом в продукте.

Как показано на фиг. 1, способ может дополнительно включать амплификацию циклического продукт по типу катящегося кольца с использованием праймера, который гибридизируется с последовательностью в зонде нуклеиновой кислоты (например, с последовательностями, расположенными в начале и в конце, или последовательностью между ними). В этих вариантах реализации способ может дополнительно включать количественное определение числа продуктов, полученных в результате амплификации по типу катящегося кольца, таким образом обеспечивая оценку количества указанного целевого фрагмента в образце. В этих вариантах реализации изобретения продукты могут быть амплифицированы по типу катящегося кольца, с использованием праймера, комплементарного к любой последовательности в циклическом продукте, для получения множества продуктов RCA, например, продукта, соответствующего одному "клонированному" фрагменту. Количество продуктов амплификации по типу катящегося кольца может быть оценена путем, например, распределения продуктов RCA на поверхности носителя (предметного стекла), гибридизации продуктов RCA с использованием меченых олигонуклеотидов (например, флуоресцентно меченых олигонуклеотидов), с последующим подсчетом числа дискретных сигналов в области носителя с помощью микроскопии, например, флуоресцентной микроскопии. Мечение может быть осуществлено до или после распределения продуктов на носителе, и, поскольку каждый продукт RCA содержит тысячи копий одних и тех же последовательностей, тысячи сайтов связывания меченых олигонуклеотидов должны проявляться тем самым увеличивая сигнал. В мультиплексных вариантах реализации изобретения (например, в которых подсчитываются продукты RCA соответствующие двум различным хромосомам), продукты RCA, соответствующие одной хромосоме, могут быть помечены одним флуорофором, и продукты RCA, соответствующие другой хромосоме, могут быть помечены другим флуорофором, таким образом, позволяя осуществить отдельный подсчет различных продуктов RCA.

Определенные количественно сигналы от отдельных продуктов RCA имеют большое значение, так как во многих областях применения (например, неинвазивная пренатальная диагностика с помощью анализа внеклеточной ДНК) количество фрагментов, соответствующих отдельным хромосомам (например, 21 хромосоме) должна быть определена достаточно точно и беспристрастно. Типичные способы анализа используют ПЦР, которая, как хорошо известно, является очень предвзятой процедурой в том смысле, что некоторые последовательности амплифицируются гораздо с более высокой эффективностью, чем другие. Это делает стратегии, основанные на ПЦР, непрактичными для многих диагностических действий.

В альтернативных вариантах реализации изобретения и как проиллюстрировано на фиг. 1, целевой фрагмент может быть амплифицирован с помощью ПЦР и количественно оценен. Как очевидно, фланкирующие последовательности, добавленные к целевому фрагменту и/или ПЦР-праймерам, могут быть совместимы с использованием в, например, методе обратного прекращения Illumina, методе пиросеквенирования Roche (454), секвенирования путем лигирования Life Technologies (платформа SOLiD) или платформе Ion Torrent компании Life Technologies. Примеры таких способов описаны в следующих публикациях: Margulies с соавт. (Nature 2005 437: 376-80); Ronaghi с соавт. (Analytical Biochemistry 1996 242: 84-9); Shendure (Science 2005 309: 1728); Imelfort с соавт. (Brief Bioinform. 2009 10: 609-18); Fox с соавт. (Methods Mol Biol. 2009; 553: 79-108); Appleby с соавт. (Methods Mol Biol. 2009; 513: 19-39) и Morozova (Genomics. 2008 92: 255-64), которые включены в качестве ссылки для общего описания способов и конкретных этапов способов, в том числе всех исходных продуктов, реагентов и конечных продуктов, для каждого из этапов. В этих вариантах реализации изобретения циклические продукты могут быть амплифицированы и секвенированы, а обилие фрагментов в образце может быть оценено путем подсчета числа считываний последовательности соответствующей фрагментам.

В определенных вариантах реализации изобретения и как проиллюстрировано на фиг. 3, последовательность шунта может находиться в другой молекуле чем последовательности, расположенные в начале и в конце, то есть, в молекуле "второго" олигонуклеотида. Таким образом, зонд нуклеиновой кислоты, используемый в начале способа, может состоять из двух олигонуклеотидов (из "каркаса" и "целевого" олигонуклеотида, как проиллюстрировано на фиг. 3).

В других вариантах реализации изобретения и как проиллюстрировано на фиг. 4, последовательность шунта может находиться в той же молекуле что и последовательности, расположенные в начале и в конце, то есть, в молекуле "первого" олигонуклеотида. Таким образом, зонд нуклеиновой кислоты, используемый в начале способа, может состоять из единого олигонуклеотида.

Последовательность, комплементарная цели может быть любой длины, в зависимости от длины последовательности, комплементарной цели, в зонде нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность, комплементарная цели имеет длину от 10 до 100, например, от 10 до 50 или от 10 до 30 нуклеотидов в длину. Как указывается ниже, последовательность, комплементарная цели, содержит одно или более несовпадений (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или более, вплоть до 10 или более) с целевым фрагментом и, в некоторых случаях, обратно комплементарная цепь последовательности, комплементарной цели, может быть, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 90% или, по меньшей мере, на 95% идентична целевому фрагменту.

Фланкирующие последовательности могут быть любой длины, в зависимости от конструкции. В некоторых вариантах реализации изобретения фланкирующие последовательности имеют длину 10 и 40 нуклеотидов, например, 10 и 30 нуклеотидов в длину.

В некоторых вариантах реализации изобретения, образец может содержать фрагменты геномной ДНК, например, геномной ДНК практически любого организма, в том числе, но не ограничиваясь, растений, животных (например, рептилий, млекопитающих, насекомых, червей, рыб и т.д.), образцы тканей, бактерии, грибы (например, дрожжи), фаги, вирусы, трупную ткань, археологические/древние образцы и т.д. В некоторых вариантах реализации изобретения геномная ДНК, используемая в способе, может быть получена из млекопитающего, и в некоторых вариантах реализации изобретения млекопитающее является человеком. В примерных вариантах реализации изобретения, геномный образец может содержать геномную ДНК из клеток млекопитающих, например, человека, мыши, крысы или обезьяны. Образец может быть изготовлен из культивируемых клеток или клеток клинического препарата, например, биопсии ткани, соскоба или смыва, или из клеток судебно-медицинской пробы (то есть, клеток из образца, собранного на месте преступления). В конкретном варианте реализации изобретения, образец нуклеиновой кислоты может быть получен из биологических образцов, таких как клетки, ткани, физиологические жидкости и испражнения. Биологические жидкости интереса включают в себя, но не ограничиваются ими, кровь, сыворотку, плазму, слюну, слизь, мокроту, спинномозговую жидкость, плевральную жидкость, слезы, жидкость молочных проток, лимфу, цереброспинальную жидкость, синовиальную жидкость, мочу, амниотическую жидкость и семенную жидкость. В конкретных вариантах реализации изобретения, образец может быть получен из субъекта, например, человека. В некоторых вариантах реализации изобретения, анализируемый образец может быть образцом внеклеточной ДНК, полученной из крови, например, из крови беременной особи женского пола. В некоторых вариантах реализации изобретения, геномная ДНК может быть амплифицирована, например, с использованием метода амплификации целого генома, до фрагментации.

В вариантах реализации изобретения, в которых последовательность шунта находится во второй олигонуклеотидной молекуле (как показано на фиг. 3), второй олигонуклеотид может дополнительно содержать фрагмент захвата, который может быть использован для приумножения циклического продукта. В данных вариантах реализации изобретения способ может включать: в) иммобилизацию циклического продукта путем связывания фрагмента захвата с твердой фазой; и г) промывание твердой фазы для удаления нелигированных нуклеиновых кислот и других компонентов реакции; тем самым приумножая для циклического продукта. Например, второй олигонуклеотид может содержать фрагмент биотина, например, биотин или биотиновый аналог, такой как детиобиотин, оксибиотин, 2'-иминобиотин, диаминобиотин, биотин сульфоксид, биоцитин и подобные, с линкером или без него, например, -LC-биотин, -LC-LC-биотин, -SLC-биотин или -ПЕГn-биотин, где n 3-12, и циклические продукты могут быть приумножены с использованием подложки, которая соединена со стрептавидином. Биотин связывается с стрептавидином с аффинностью по меньшей мере 10^-8 М.

Для неинвазивных пренатальных вариантов тестирования, целевой фрагмент может быть из человеческой хромосомы 21, 13 или 18.

В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает гибридизацию образца с множеством, по меньшей мере, 50 (например, по меньшей мере, 100, по меньшей мере, 200, по меньшей мере, 500, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 2000 или, по меньшей мере, 5000) указанных зондов, где указанные зонды метят различные фрагменты на той же самой хромосоме (например, 21, 13 или 18 хромосоме человека), и в котором способ приводит к получению множества циклических продуктов, среди которых имеются целевые фрагменты. Число произведенных циклических продуктов может быть количественно определено с помощью, например, их амплификации с помощью RCA и подсчета количества продуктов RCA, как описано выше.

В некоторых вариантах реализации способ содержит гибридизацию образца с первым набором и со вторым набором из указанных наборов зондов нуклеиновой кислоты, причем первый и второй наборы зондов нацелены (то есть, гибридизуются с фрагментами и лигируются с получением циклических продуктов, как описано выше) на первую хромосому в образце и на вторую хромосому в образце, соответственно, амплифицируя циклические продукты путем амплификации по типу катящегося кольца (RCA) и сравнивая количество продуктов RCA, соответствующих первой хромосоме с количеством продуктов RCA, соответствующих второй хромосоме, обеспечивая таким образом оценку относительных количеств ДНК из хромосом в образце.

В некоторых вариантах реализации способ содержит гибридизацию образца с первым набором и со вторым набором из указанных наборов зондов нуклеиновой кислоты, причем первый и второй наборы зондов нацелены (то есть, гибридизуются с фрагментами и лигируются с получением циклических продуктов, как описано выше) на первый и второй регионы на хромосоме в образце, соответственно, амплифицируя циклические продукты путем амплификации по типу катящегося кольца (RCA) и сравнивая количество продуктов RCA, соответствующих первому региону с количеством продуктов RCA, соответствующих второму региону, обеспечивая таким образом оценку относительных количеств ДНК из хромосомных регионов в образце. Этот вариант реализации изобретения может быть использован для идентификации, например, делеции или дупликации, к примеру.

Также, данный документ предусматривает композицию, содержащую зонд нуклеиновой кислоты, включающий: i. последовательность, расположенную в начале и последовательность, расположенную в конце, где последовательности, расположенные в начале и в конце, находятся на противоположных концах первой олигонуклеотидной молекулы; и ii. последовательность шунта, которая содержит, в следующем порядке: вышележащую фланкирующую последовательность, которая является комплементарной к последовательности, расположенной в начале, последовательность, комплементарную цели, которая является комплементарной к целевому фрагменту в геноме человека; и нижележащую фланкирующую последовательность, которая является комплементарной к последовательности, расположенной в конце; причем зонд разработан таким образом, что, когда первый олигонуклеотид, последовательность шунта, и целевой фрагмент гибридизуются друг с другом, то концы целевого фрагмента являются смежными для лигирования с концами последовательностей, расположенных в начале и в конце, в первой молекуле олигонуклеотида. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция может содержать первый набор из, по меньшей мере, 50 (например, по меньшей мере, 100, по меньшей мере, 200, по меньшей мере, 500, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 2000 или, по меньшей мере, 5000) зондов нуклеиновых кислот, в которых последовательности, комплементарные цели, зондов являются комплементарными к различным целевым фрагментам первой хромосомы человека (например, хромосомы 21, 13 или 18).

В определенных вариантах реализации изобретения, композиция может содержать второй набор из, по меньшей мере, 50 (например, по меньшей мере, 100, по меньшей мере, 200, по меньшей мере, 500, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 2000 или, по меньшей мере, 5000) указанных зондов нуклеиновых кислот, в которых последовательности, комплементарные цели, зондов во втором наборе зондов являются комплементарными к различным целевым фрагментам второй хромосомы человека. В некоторых вариантах реализации изобретения первой хромосомой человека может быть 21 хромосома и второй хромосомой человека может быть хромосома 13 или 18. В некоторых случаях, вторая хромосома человека не является хромосомой 21, 13 или 18.

Краткое описание графических материалов

Квалифицированному специалисту будет понятно, что графические материалы, описанные ниже, представлены здесь только для иллюстрационных целей. Графические материалы никоим образом не предназначены для ограничения объема данных принципов.

Фиг. 1 схематично иллюстрирует один вариант реализации заявленного способа, в котором кольцевая молекула ДНК формируется и амплифицируется с помощью RCA или ПЦР.

Фиг. 2 схематично иллюстрирует один вариант реализации заявленного способа, в котором линейный продукт лигирования формируется и модифицируется твердофазными реагентами.

Фиг. 3 иллюстрирует зонд, содержащий олигонуклеотид с округленным каркасом, связанный со своим целевым фрагментом. Зонд иллюстрируется в двух вариантах А и В.

Фиг. 4 иллюстрирует округленный одаонуклеотидный зонд, связанный с целевым фрагментом.

Фиг. 5 иллюстрирует округленный зонд с двойной петлей, содержащий нацеливающий олигонуклеотид и петлевой олигонуклеотидный каркас, связанный с целевым фрагментом.

Фиг. 6 иллюстрирует линейный зонд с петлей, содержащий нацеливающий олигонуклеотид и линейный каркасный олигонуклеотид, связанный с целевым фрагментом.

Фиг. 7 иллюстрирует линейный зонд, содержащий два каркасных олигонуклеотида, связанных со своим целевым фрагментом.

Фиг. 8 представляет собой изображение геля, показывающее специфичность способа, описанного в данном документе.

Фиг. 9 представляет собой график, показывающий точность способа, описанного в данном документе.

Фиг. 10 панель А изображает изображение меченых продуктов RCA на поверхности препарата; панель В изображает, как соотношение фрагментов разных хромосом может быть точно определено путем подсчета отдельных продуктов RCA.

Подробное описание

Фрагмент целевой нуклеиновой кислоты

Целевой фрагмент, который связан зондом, является одноцепочечным фрагментом нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения настоящий способ связывает целевые последовательности чья последовательность является заранее определенной. Может быть известна последовательность всего фрагмента, включая концы. Известные фрагменты заранее определенной последовательности могут быть получены посредством скорее специфической, чем произвольной, фрагментации нуклеиновой кислоты. Специфические методы фрагментации включают расщепление ферментами рестрикции, ПЦР (например, мультиплексную ПЦР), а также другие способы целевого определения концов фрагмента, включающие другие ферменты, рибозимы или сочетание таких методов.

Один способом фрагментации является расщепление с использованием рестриктазы или комбинации из двух либо более рестриктаз. Таким образом, образец фрагментированной нуклеиновой кислоты может быть расцеплен ферментом рестрикции, а целевой фрагмент может быть фрагментом рестрикции.

Известно большое разнообразие специфических ферментов, расщепляющих нуклеиновую кислоту, и любой подходящий фермент может быть использован в настоящем изобретении, в том числе ферменты, которые расщепляют в заранее определенной позиции внутри специфической последовательности нуклеиновой кислоты, или эндонуклеазы, которые расщепляют либо до, либо после специфической последовательности распознавания на нуклеиновой кислоте, и никазы. Каталитические нуклеиновые кислоты, такие как рибозимы, могут быть также использованы для фрагментации ДНК. Ферменты могут расщеплять две цепи нуклеиновой кислоты с образованием тупого конца или липкого конца, или могут расщеплять одну цепь нуклеиновой кислоты. Известны различные типы ферментов рестрикции, в том числе Тип I, Тип II, Тип III, Тип IV и Тип V. Подходящие ферменты или комбинации ферментов могут быть выбраны по желанию для использования в способе. Например, нуклеиновая кислота в образце (например, 10 нг ДНК) может быть расщеплена ферментом рестрикции (например, 1 U) в соответствующем, сочетаемым с рестриктазой, буфере. Реакция может быть инкубирована при подходящих условиях (например, 37°С на протяжении 1 часа) с последующей ферментативной дезактивацией (например, при 80°С на протяжении 20 минут).

Другой удобный способ предоставления фрагментированной нуклеиновой кислоты заключается в использовании праймеров для амплификации специфических линейных последовательностей из нуклеиновой кислоты. Может быть использована мультиплексная ПЦР, которая обрабатывает нуклеиновую кислоту с несколькими парами специфических праймеров для амплификации нескольких специфических фрагментов. В этом случае концы целевых фрагментов соответствуют последовательностям пары праймеров.

Для многих диагностических и других применений, образец является образцом фрагментированных хромосом (например, хромосом человека или микробных хромосом). Целевой фрагмент может быть фрагментом генома, специфичным для одной хромосомы генома организма. Другими словами, целевой фрагмент может быть найден только на одной хромосоме генома и отсутствовать на других хромосомах такого генома. Главным образом, способ будет использоваться для анализа генома человека, в этом случае целевой фрагмент может быть фрагментом, специфичным для одной хромосомы человека, то есть, находиться на такой хромосоме и отсутствовать на других человеческих хромосомах. Например, фрагмент может быть специфическим к 21-ой хромосоме.

Целевой фрагмент может быть специфическим к одному локусу хромосомы. Соответственно, он может быть найден в этом хромосомном локусе и отсутствовать на других локусах той же хромосомы или других хромосомах этого же генома. Так, например, целевой фрагмент может быть специфическим к одному локусу хромосомы человека.

Данные типы нуклеиновой кислоты в образце могут включать в себя некоторую вариабельность, например, образец может содержать хромосомы разных индивидуумов, таких как нуклеиновая кислота, полученная из материнской крови, которая содержит материнскую ДНК и ДНК плода. В этом случае, представляющие интерес типы могут быть конкретной хромосомой, что является подходящим для выявления всех копий такой хромосомы, будь она фетального или материнского происхождения. Таким образом, представляющие интерес типы могут являться одной хромосомой или хромосомным локусом, и тогда целевые последовательности находятся на такой хромосоме или локусе как в материнской, так и в фетальной копиях хромосомы или хромосомного локуса.

Образцы нуклеиновой кислоты могут быть предоставлены в любом подходящем виде, например, в качестве образцов биологической ткани или жидкости пациентов. Образцы могут быть образцами крови, цельной крови, плазмы или сыворотки крови, образцами тканей, например, залитыми в парафин фиксированными в формалине образцами ткани, или могут быть образцами нуклеиновой кислоты, выделенной из крови или ткани.

Образцом может быть любой образец, содержащий нуклеиновую кислоту. Нуклеиновая кислота, содержащаяся в образце, может быть представлена ДНК и/или РНК. Образцом может быть комплексное соединение, например, целая геномная ДНК, или кДНК из целого организма, ткани или популяции клеток, или их фракции. В связи с этим он может, например, быть прямым продуктом процедуры выделения нуклеиновой кислоты, или методики лизиса клеток, или же он может быть дополнительно фракционирован или очищен каким-либо образом, например, он может содержать нуклеиновые кислоты, которые частично или полностью разделены каким-либо образом, или обработаны каким-либо образом, например, РНК для получения кДНК. Образец может быть из любого эукариотического или прокариотического или вирусного источника, например, может быть микробным (например, бактериальным или грибковым), растением или животным. Предпочтительно образцы имеют человеческое происхождение, например, геномная ДНК человека. Образец может быть образцом ткани или крови из животного, где детектируемая нуклеиновая кислота, является микробной, например, бактериальной, вирусной или грибковой. Для способов, относящихся к неинвазивной пренатальной диагностике, образец получается из крови беременной женщины, и включает ДНК плода. В других примерах, детектируемая и определенная количественно нуклеиновая кислота является ассоциированной с опухолью ДНК.

Настоящий способ может быть осуществлен на образцах in vitro. Соответственно, способы, как правило, не включают в себя диагностику проводимую in vivo на организме человека или животного или способы лечения организма человека или животного путем хирургической операции или терапии. Тем не менее, результаты диагностических методов полученные in vitro могут быть использованы с целью предоставления информации для последующего лечения пациентов.

Денатурирование целевой нуклеиновой кислоты

Зонд распознает и связывает целевую нуклеиновую кислоту в одноцепочечной форме, через гибридизацию между одноцепочечным фрагментом и последовательностью, комплементарной целинацеливающего олигонуклеотида. Таким образом, если целевой фрагмент в образце еще не является одноцепочечным, должны быть созданы условия для разделения одноцепочечной целевой последовательности от ее комплементарной цепи нуклеиновой кислоты.

Денатурирующие условия могут иметь достаточно высокую температуру для разделения целевого фрагмента от его комплементарной последовательности. Денатурирующими условиями может быть инкубация при 95°С в течение подходящего времени, например, 10 минут. В качестве альтернативы может быть выполнена химическая денатурация.

Комплементарностъ

Способ анализа образца на присутствие целевого фрагмента может содержать контактирование образца с зондом нуклеиновой кислоты, в котором зонд содержит

нацеливающий олигонуклеотид, содержащий последовательность, комплементарную цели, которая является комплементарной к целевому фрагменту и фланкирующую последовательность, примыкающую к последовательности, комплементарной цели, и

последовательность олигонуклеотида, имеющего свободный 5'- или 3'-конец, причем последовательность олигонуклеотида является комплементарной к фланкирующей последовательности.

Подходящие концентрации зондов могут быть определены на основании концентрации (или ожидаемой концентрации) целевого фрагмента или целевых фрагментов в образце. Как проиллюстрировано в Примерах, зонды могут быть добавлены к образцу в концентрации 10 пМ на зонд. В случае, если образец контактирует с несколькими зондами (например, набором зондов), концентрации отдельных зондов могут составлять 10 пМ. В предпочтительном варианте, для детекции или количественного определения используются зонды в концентрации, превышающей ожидаемую концентрацию представляющих интерес типов нуклеиновой кислоты. Использование зонда в превышающей концентрации должно обеспечить распознавание всех копий целевых последовательностей, присутствующих в образце. Это увеличивает чувствительность детекции. Также, когда способы включают количественное определение, это гарантирует, что детектирование лигированных продуктов или кумулятивный сигнал из набора зондов являются пропорциональными количеству целевых последовательностей в образце.

В условиях отжига, целевой фрагмент (если он присутствует) гибридизируется с последовательностью, комплементарной цели нацеливающей цепи, а последовательность олигонуклеотида гибридизируется к фланкирующей последовательности, таким образом, что свободный 5'- или 3'-конец последовательности олигонуклеотида находится в соприкасании с 5'- или 3'-концом целевого фрагмента, соответственно. Таким образом, нацеливающий олигонуклеотид делает целевой фрагмент основой для лигирования к последовательности олигонуклеотида. В случае двойного лигирования, 3'-конец целевого фрагмента может быть лигирован с 5'-концом последовательности, расположенной в начале, и 5'-конец целевого фрагмента может быть лигирован с 3'-концом последовательности, расположенной в конце.

В зондах, в соответствии с настоящим изобретением, максимальная специфичность по отношению к целевому фрагменту достигается в том случае, если последовательность, комплементарная комплементарная цели является точно комплементарной к целевой последовательности, таким образом, что существует идеальная гибридизация между ними. Тем не менее, это не является обязательным во всех случаях, и малая степень несовпадения может быть приемлемой, например, с целью обнаружения фрагментов, которые демонстрируют аллельную вариацию там, где это желательно для обнаружения фрагмента, независимо от присутствия точного аллеля в образце. В альтернативном варианте, для различных последовательностей могут быть разработаны многочисленные зонды. Это может сделать возможным как обнаружение так и распознавание различных аллелей или мутаций. Зонды, в соответствии с настоящим изобретением, наиболее предпочтительно использовать в мультиплексных способах, где в реакцию включается большое количество различных зондов. В пределах такого множества зондов, предполагается, что большинство зондов будут иметь идеальную комплементарность для их целевых фрагментов, но некоторые зонды могут связывать цели с незначительными несовпадениями.

Предпочтительно, последовательность, комплементарная цели имеет несовпадение с целевым фрагментом меньше чем 5 пар оснований. Там необязательно может быть одна, две, три или четыре пары оснований несовпадения между целевым фрагментом и последовательностью, комплементарной цели. Несовпадение может быть точкой, в которой из одной последовательности отсутствует соответствующее основание, таким образом, что комплементарная последовательность образует петлю в точке несовпадения, или может возникать там, где некомплементарный нуклеотид присутствует в одной последовательности и таким образом не соединяется с основанием в соответствующем положении другой последовательности. Там, где существует неправильное спаривание оснований, то есть, спаривание А или Т с С или G, между основаниями двух цепей не возникают водородные связи, хотя гибридизация будет по-прежнему происходить между целевым фрагментом и последовательностью, комплементарной цели нацеливающего олигонуклеотида вследствие спаривания оснований между соседними с несовпадением нуклеотидами. Несовпадения могут быть между неоднозначными основаниями. Неоднозначное основание, как правило, соответствует положению в последовательности, комплементарной цели, которая соединяется с положением известной генетической вариации в целевом фрагменте. Зонд может быть синтезирован путем добавления одного или более дидезоксинуклеотидов в течение конкретного цикла синтеза для положения неоднозначного основания. Это, как правило, имеет место для традиционного синтеза олигонуклеотидов. В альтернативном варианте, может быть произведено множество отдельных зондов, по одному для каждого генетического варианта. Это, как правило, происходит если зонды синтезированы с использованием синтеза на основе микрочипов. Неоднозначное основание может соответствовать однонуклеотидным различиям между кодонами, где различные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту.

В общем, более длинные последовательности, комплементарные цели для гибридизации более длинных целевых фрагментов могут допускать большее количество несовпадений, по сравнению с более короткими целевыми комплементарными последовательностями. Последовательность, комплементарная цели, может, например, иметь не более 1 из 8, 1 из 9 или 1 из 10 пары оснований с несоответствием целевого фрагмента. Любые такие несоответствия должны быть ограничены внутренней областью последовательности, комплементарной цели, и целевого фрагмента, таким образом, чтобы они не ингибировали лигирование или сайт - специфическую целевую фрагментацию, например расщепление ферментами рестрикции. Соответственно, предпочтительно существует совершенная комплементарность между целевым фрагментом и последовательностью, комплементарной цели в концевых 6-8 нуклеотидах, предпочтительно 10 концевых нуклеотидов на каждом конце целевого фрагмента.

В общем, целевой фрагмент и последовательность, комплементарная цели имеют одинаковую длину. Полная длина целевого фрагмента, таким образом ограничена последовательностью, комплементарной цели. Гибридизация целевого фрагмента с нацеливающим олигонуклеотидом является одиночным событием связывания между двумя молекулами нуклеиновых кислот, контрастирующими с зондами, которые связывают два конца целевой молекулы или две непримыкающие области цели.

Последовательность, комплементарная цели, может иметь длину по меньшей мере 10 нуклеотидов, например, по меньшей мере 15 нуклеотидов. Она может быть длиной до 20, 25, 30, 35 или 40 нуклеотидов. Предпочтительные диапазоны включают 10-20 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов и 10-40 нуклеотидов. Такие относительно короткие последовательности, комплементарные цели являются подходящими для связывания соответственно коротких фрагментов. Короткая последовательность способствует специфичности реакции двойного лигирования, поскольку ДНК-лигазы чувствительны к несовпадению пар оснований и преимущественно лигируют идеально подходящие последовательности. Там, где несовпадения присутствуют в зоне действия ДНК-лигазы, связанной с двухцепочечной последовательностью, последовательности могут не быть лигированы, что обеспечивает дополнительный этап проверочного считывания, гарантирующий высокую специфичность выявления целевой последовательности в предпочтении последовательностям с различными, но похожими последовательностями. ДНК-лигаза, как правило, имеет зону действия 6-8 оснований на каждой стороне разрыва. Таким образом, если целевой фрагмент имеет 20 оснований, 12-16 оснований будут покрываться за счет специфичности лигазы.

Гибридизация зонда будет дискриминационной в отношении несовпадений, в особенности в центральной части гибридизированной последовательности, в то время как лигирование дискриминирует несовпадения на концах целевого фрагмента. Вместе это создает высокоспецифическое детектирование фрагмента.

Нацеливающий олигонуклеотид является более длинным, чем целевой фрагмент, поскольку он включает в себя фланкирующие последовательности, а также последовательность, комплементарную цели, и он может дополнительно включать одну или более заданных последовательностей. Заданная последовательность не является комплементарной к другим местам зонда или к целевому фрагменту - другими словами, она не гибридизируются с другими местами зонда (за пределами заданной последовательности) или с целевым фрагментом в условиях отжига. Вышележащая фланкирующая область является вышележащей или 5'-концом последовательности, комплементарной цели в нацеливающем олигонуклеотиде. Нижележащая фланкирующая область является нижележащей или 3'-концом последовательности, комплементарной цели в нацеливающем олигонуклеотиде. Соответственно, последовательность, комплементарная цели является внутренней по отношению к нацеливающему олигонуклеотиду и не включает в себя конец нацеливающего олигонуклеотида, так как он фланкирован вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями.

Двухцепочечная последовательность производится путем гибридизации целевого фрагмента и последовательность, комплементарная цели, может рассматриваться как гибрид двухцепочечной последовательности, так как она является гибридом цели и зонда. Как правило, двухцепочечная последовательность принимает двойную спиральную конформацию, в которой целевой фрагмент является одной цепью, а нацеливающий олигонуклеотид является второй цепью двойной спирали. Гибридная двухцепочечная последовательность фланкирована вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида, который, в свою очередь гибридизируется с последовательностями, находящимися в начале и конце, создавая таким образом двухцепочечную последовательность. Опять же, эти, как правило, принимают нормальную двойную спиральную конформацию двухцепочечной нуклеиновой кислоты.

Вышележащие и нижележащие фланкирующие последовательности предпочтительно отличаются друг от друга, то есть, предпочтительно имеют различные последовательности. Предпочтительно, чтобы последовательность, находящаяся в начале, являлась комплементарной к вышележащей фланкирующей последовательности, но не к нижележащей фланкирующей последовательности, и чтобы последовательность находящаяся в конце являлась комплементарной к нижележащей фланкирующей последовательности, но не к вышележащей фланкирующей последовательности. Это гарантирует, что последовательности, лежащие в начале и в конце, гибридизируются только к вышележащей и, соответственно, нижележащей фланкирующим последовательностям.

Последовательность, расположенная в начале, как правило, такой же длины как вышележащая фланкирующая последовательность. Последовательность, расположенная в конце, как правило, такой же длины как нижележащая фланкирующая последовательность.

Обычная длина для фланкирующих последовательностей составляет от 10 до 40 нуклеотидов, например, 10-20 или 10-30 нуклеотидов. Фланкирующие последовательности могут быть одинаковой длины. Одна или обе фланкирующие последовательности могут быть одинаковой длины как и последовательность, комплементарная цели. Таким образом, вышележащая и/или нижележащая фланкирующая последовательность может иметь длину по меньшей мере 10 нуклеотидов, например, по меньшей мере 15 нуклеотидов. Она может быть длиной до 20, 25, 30, 35 или 40 нуклеотидов.

Предпочтительно, чтобы последовательность, расположенная в начале, являлась комплементарной вышележащей последовательности. Предпочтительно, чтобы последовательность, расположенная в конце, являлась комплементарной нижележащей последовательности. Идеальное совпадение последовательностей является желательным для оптимального связывания зонда, таким образом последовательности, лежащие в начале и в конце, являются правильно расположенными для лигирования целевого фрагмента. При необходимости, однако, может быть несовпадение в одну, две, три или четыре пары оснований между последовательностью, расположенной в начале и вышележащей фланкирующей последовательностью, и/или между последовательностью, расположенной в конце и нижележащей фланкирующей последовательностью. Предпочтительно, имеется менее 5 несовпадений пар оснований.

Иначе чем последовательность, комплементарная цели, зонд должен, как правило, не быть комплементарным к целевому фрагменту или к другим нуклеиновым кислотам, которые могут присутствовать в образце. Это позволяет избежать нежелательной гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой, отличающейся от цели. Таким образом, если зонд используется для связывания фрагмента геномной ДНК человека, зонд может быть разработан таким образом, чтобы последовательности, отличающиеся от последовательности, комплементарной цели являлись не комплементарными геномной ДНК человека, таким образом, зонд гибридизируется только с целевым фрагментом, а не с другой нуклеиновой кислотой в образце.

Отжиг и лигирование

Целевой фрагмент дотируется через высокоспецифическую реакцию на обоих концах. Поскольку целевой фрагмент, как правило, является продуктом специфической фрагментации нуклеиновой кислоты, эти концы обычно имеют специфическую, заранее определенную последовательность. На стадии лигирования, эти концы конкретно детектируются с помощью зависимого от последовательности лигирования с последовательностями, лежащими в начале и в конце, соответственно. Предпочтительно, связывание целевого фрагмента с зондом создает два идеально пригнанных стыка лигирования, один между 3'-концом целевого фрагмента и 5'-концом последовательности, находящейся в начале, и один между 5'-концом целевого фрагмента и 3'-концом последовательности, находящейся в конце.

Лигирование 5'-конца нуклеиновой кислоты с 3'-концом нуклеиновой кислоты может произойти, когда основания обеих концов спарены с примыкающими нуклеотидами комплементарной последовательности. Спариванием оснований соответствующих концевых нуклеотидов с прилегающими нуклеотидами образует цепь нуклеиновой кислоты, содержащую разрыв между двумя концами. Лигирование двух концов может катализироваться ДНК-лигазой. Обеспечение условий для лигирования поэтому, как правило, включает фермент ДНК-лигазы и условия реакции, при которых ДНК-лигаза лигирует два конца с образованием непрерывной цепи нуклеиновой кислоты, закрывая разрыв. Некоторые ферменты лигаз являются коммерчески доступными, такие как Ampligase (фирма "Epicentre"), для которой подходящими условиями является добавление 1 U фермента и инкубирование при 55°С в течение 1 часа в лигазном буфере.

Из-за расположения последовательности, комплементарной цели, между фланкирующими последовательностями, нацеливающий олигонуклеотид делает целевой фрагмент основой для лигирования последовательностей, расположенных в начале и в конце. В условиях отжига, при наличии целевого фрагмента, последовательности, находящиеся в начале и в конце, гибридизируются с фланкирующими последовательностями, задавая пробел между 5'-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательности, находящейся в конце. Целевой фрагмент гибридизуется с последовательностью, комплементарной цели, в пробеле. Таким образом, гибридизация последовательностей, находящихся в начале и в конце, и целевого фрагмента с нацеливающим олигонуклеотидом позиционирует 3'-конец целевого фрагмента в соприкасании с 5'-концом последовательности, находящейся в начале, и позиционирует 5'-конец целевого фрагмента в соприкасании с 3'-концом последовательности, находящейся в конце.

Позиционирование двух концов в соприкасании обеспечивает субстрат для ДНК-лигазы для лигирования концов вместе. Предпочтительно, чтобы 5'-конец последовательности, расположенной в начале и 3'-конец целевого фрагмента гибридизировался с примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду нуклеотидами, и 3'-конец последовательности, расположенной в конце, и 5'-конец целевого фрагмента гибридизировался с примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду нуклеотидами. Соответственно, вышележащая фланкирующая последовательность может быть непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели, без промежуточных нуклеотидов. Аналогичным образом, нижележащая фланкирующая последовательность может быть непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели, без промежуточных нуклеотидов. Прилегающие 3'- и 5'-концы могут быть непосредственно лигированы с помощью ДНК-лигазы, запечатывающей разрыв между ними с образованием непрерывной цепи нуклеиновой кислоты.

Продукт двойного лигирования, то есть, продукт лигирования как последовательности, находящейся в начале, так и последовательности, находящейся в конце, с целевым фрагментом, представляет собой непрерывную цепь нуклеиновой кислоты. Она непрерывна в том смысле, что она не содержит никаких разрывов или пробелов, таким образом все нуклеотиды в цепи ковалентно связаны.

Зонд может быть разработан таким образом, что непрерывная цепь нуклеиновой кислоты, содержащая последовательности, лежащие в начале и в конце, и целевой фрагмент является кольцом нуклеиновой кислоты. Термин кольцо здесь относится к топологии замкнутой в петлю цепи, без свободного конца.

В условиях отжига, при наличии целевого фрагмента, последовательности, находящиеся в начале и в конце, гибридизируются с фланкирующими последовательностями, задавая пробел между 5'-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательности, находящейся в конце. Целевой фрагмент, гибридизуется с последовательностью, комплементарной цели, в пробеле, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5'-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательностей, находящихся в конце, и завершает кольцо нуклеиновой кислоты, которое содержит целевой фрагмент и последовательности, расположенные в начале и в конце.

Молекулы нуклеиновых кислот, которые образуют кольцо имеют свои концы в соприкасании. Лигирование концов производит непрерывную кольцевую цепь нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере последовательности, лежащие в начале и в конце, и целевой фрагмент.

Зонды, которые образуют кольцо нуклеиновой кислоты включают зонды, в которых последовательности, расположенные в начале и в конце, предоставляются на одной молекуле нуклеиновой кислоты. Например, в дополнение к нацеливающему олигонуклеотиду, зонд может содержать каркасный олигонуклеотид, имеющий последовательности, расположенные в начале и в конце на его 5'- и 3'-концах соответственно, причем последовательности, расположенные в начале и в конце каркасного олигонуклеотида связываются in trans с фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида в условиях отжига. Каркасный олигонуклеотид может включать заданную последовательность между последовательностями, расположенными в начале и в конце. Фигура 3 иллюстрирует варианты реализации таких зондов. В альтернативном варианте, последовательности, находящиеся в начале и в конце, каркасного олигонуклеотида могут быть примыкающими, без заданной нуклеотидной последовательности между ними.

В другом примере, последовательности, находящиеся в начале и в конце, могут находиться на концах нацеливающего олигонуклеотида и связываться in cis с фланкирующими последовательностями в условиях отжига. Нацеливающий олигонуклеотид может включать заданную последовательность между нацеливающим олигонуклеотидом и последовательностями, расположенными в начале и/или в конце. Фигура 4 иллюстрирует вариант реализации такого зонда.

Зонды, которые образуют кольцо нуклеиновой кислоты также включают зонды, в которых последовательности, расположенные в начале и в конце, предоставляются на разных молекулах нуклеиновой кислоты. В таких случаях, кольцо нуклеиновой кислоты, которое образуется в условиях отжита будет содержать, по меньшей мере, три молекулы нуклеиновой кислоты - целевой фрагмент, последовательность, находящуюся в начале и последовательность, находящуюся в конце. Как было указано ранее, все концы молекул нуклеиновых кислот будут соприкасаться. В таких случаях, для формирования непрерывной кольцевой цепи нуклеиновой кислоты необходимо более двух реакций лигирования. Примером может являться, когда последовательность, находящаяся в конце, является 3'-концом нацеливающего нуклеотида, и зонд содержит каркасный олигонуклеотид, имеющий последовательность, находящуюся в начале, на его 5'-конце. В условиях отжига, последовательность, находящаяся в конце, связывается in cis с нижележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида, и последовательность, находящаяся в начале, каркасного олигонуклеотида связывается in trans с вышележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида. Связывание in cis означает, что связывание происходит на той же молекуле нуклеиновой кислоты, то есть, одна цепь нуклеиновой кислоты образует трехмерную структуру, в которой различные участки сведены вместе и гибридизируются. Связывание in trans означает, что связывание происходит между различными молекулами нуклеиновых кислот. В некоторых случаях, каркасный олигонуклеотид содержит пару последовательностей обращенных повторов, которые формируют шпилькообразную структуру в условиях отжига, тем самым позиционируя 3'-конец каркасного олигонуклеотида в соприкасании с 5'-концом нацеливающего олигонуклеотида. Существует разрыв между двумя концами. Зонд такого типа проиллюстрирован на фигуре 5. Когда обеспечены условия лигирования, 5'-конец нацеливающего олигонуклеотида является лигированным с 3'-концом каркасного олигонуклеотида. Продукт двойного лигирования представляет собой кольцо нуклеиновой кислоты, содержащее нацеливающий олигонуклеотид, целевой фрагмент и каркасный олигонуклеотид. В альтернативном варианте, когда между 5'-концом нацеливающего олигонуклеотида и 3'-концом каркасного олигонуклеотида существует разрыв, зонд, показанный на фигуре 5, не будет округляться лигированием - вместо этого непрерывная цепь нуклеиновой кислоты, содержащая последовательности, расположенные в начале и в конце, и целевой фрагмент, является линейной цепью нуклеиновой кислоты.

Зонд, в альтернативном варианте, может быть расположен в противоположной ориентации таким образом, что последовательность, находящаяся в начале расположена на 5'-конце нацеливающего нуклеотида, и зонд содержит каркасный олигонуклеотид, имеющий последовательность, находящуюся в конце, на его 3'-конце. В этом случае, в условиях отжига, последовательность, находящаяся в начале, связывается in cis с вышележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида, и последовательность, находящаяся в конце, каркасного олигонуклеотида связывается in trans с нижележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида. И вновь, каркасный олигонуклеотид может содержать пару последовательностей обращенных повторов, которые формируют шпилькообразную структуру в условиях отжига в положении 5'-конца каркасного олигонуклеотида в соприкасании с 3'-концом нацеливающего олигонуклеотида. 3'-конец нацеливающего олигонуклеотида затем лигирован с 5'-концом каркасного олигонуклеотида, таким образом, что продукт двойного лигирования представляет собой кольцо нуклеиновой кислоты, содержащее нацеливающий олигонуклеотид, целевой фрагмент и каркасный олигонуклеотид. В альтернативном варианте, как было отмечено выше, отжиг может помещать 5'-конец каркасного олигонуклеотида возле 3'-конца нацеливающего олигонуклеотида 5, но разделенными пробелом из одного или более нуклеотидов. Продукт лигирования будет представлять собой непрерывную линейную цепь нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности, расположенные в начале и в конце, и целевой фрагмент.

Каркасный олигонуклеотид может содержать заданную последовательность между последовательностью обращенного повтора, таким образом, что в условиях отжига каркасный олигонуклеотид образует шпилькообразную петлю, как проиллюстрировано на фиг. 5.

Как было отмечено, зонды могут быть разработаны таким образом, что непрерывная цепь нуклеиновой кислоты, содержащая последовательности, лежащие в начале и в конце, и целевой фрагмент является линейной цепью нуклеиновой кислоты. В условиях отжига, при наличии целевого фрагмента, последовательности, находящиеся в начале и в конце, гибридизируются с фланкирующими последовательностями, задавая пробел между 5'-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательности, находящейся в конце. Целевой фрагмент, гибридизуется с последовательностью, комплементарной цели, в пробеле, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5'-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательностей, находящихся в конце, и завершает цепь нуклеиновой кислоты, которая содержит целевой фрагмент и последовательности, расположенные в начале и в конце. Молекулы нуклеиновых кислот, которые образуют цепь имеют свои концы в соприкасании. Термин соприкасание был обсужден в другом месте. Существует разрыв между двумя концами, которые будут лигированы. Лигирование концов производит непрерывную цепь нуклеиновой кислоты, содержащую, по меньшей мере, последовательности, лежащие в начале и в конце, и целевой фрагмент.

Зонд может содержать нацеливающий олигонуклеотид, имеющий последовательность, расположенную в конце, на своем 3'-конце и линейный каркасный олигонуклеотид, имеющий последовательность, расположенную в начале, на своем 5'-конце. В условиях отжига, последовательность, находящаяся в конце, связывается in cis с нижележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида, и последовательность, находящаяся в начале, каркасного олигонуклеотида связывается in trans с вышележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида. Нацеливающий олигонуклеотид может содержать заданную последовательность между нижележащей фланкирующей последовательностью и последовательностью, расположенной в конце, таким образом, что в условиях отжига, нацеливающий олигонуклеотид образует шпилькообразную петлю. Линейная цепь нуклеиновой кислоты, образовавшаяся в условиях отжига, содержит каркасный олигонуклеотид, целевой фрагмент и нацеливающий олигонуклеотид. Фиг. 6 иллюстрирует это расположение.

Зонд может быть в равной степени расположен в обратной ориентации, где последовательность, находящаяся в начале, расположена на 5'-конце нацеливающего нуклеотида, и зонд содержит каркасный олигонуклеотид, имеющий последовательность, находящуюся в конце, на его 3'-конце. В этом случае, последовательность, находящаяся в начале, связывается in cis с вышележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида, и последовательность, находящаяся в конце, каркасного олигонуклеотида связывается in trans с нижележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида.

Другой формой зонда, которая образует линейную цепь нуклеиновой кислоты в качестве продукта лигирования, является зонд, содержащий последовательности, лежащие в начале и в конце, на отдельных каркасных олигонуклеотид ах. Такой зонд может содержать каркасный олигонуклеотид, содержащий последовательность, расположенную в начале, имеющую свободный 5'-конец, и каркасный олигонуклеотид, содержащий последовательность, расположенную в конце, имеющую свободный 3'-конец, причем, в условиях отжига, последовательности, расположенные в начале и в конце связываются in trans с фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида. Один или оба каркасных олигонуклеотида могут дополнительно содержать заданную последовательность. Фиг. 7 иллюстрирует зонды этого типа.

Предпочтительно, олигонуклеотиды зонда в его нелигированной форме являются линейными. Таким образом, предпочтительно, нацеливающий олигонуклеотид является линейной молекулой нуклеиновой кислоты. Зонды, включающие один или более каркасные олигонуклеотиды, также предпочтительно являются линейными. Это обеспечивает удобную дифференциацию между лигированными и нелигированными зондами, где кольцо ДНК образуется только в результате успешного лигирования кольцевых вариантов реализации зонда. Линейные молекулы нуклеиновых кислот, не амплифицируются репликацией по типу катящегося кольца.

Обнаружение

После создания условий в которых целевой фрагмент, если он присутствует, лигируется с зондом, выполняется этап детектирования с целью определения действительно ли произошло такое лигирование. Это свидетельствует о том, присутствовал ли или нет целевой фрагмент в образце. Таким образом, обнаружение продукта зависит от успешного лигирования целевого фрагмента с последовательностями, расположенными в начале и в конце, для формирования непрерывной цепи нуклеиновой кислоты. Этап обнаружения, поэтому, в общем включает детектирование сигнала, что требует присутствия обоих стыков лигирования. Например, детектирование может включать в себя амплификацию по обеим стыкам лигирования (например, с помощью ПЦР или для кольцевых вариантов реализации зонда, репликации по типу катящегося кольца) или захват непрерывной нити нуклеиновой кислоты в одном ее конце и детектирование ее другого конца.

В некоторых случаях, способ может включать приумножение продукта двойного лигирования до обнаружения. Продукты могут быть приумножены посредством амплификации и/или с помощью твердофазной химии. Кольцевые продукты нуклеиновых кислот могут быть выборочно приумножены путем обработки образца экзонуклеазой (например, Лямбда экзонуклеазой) для расщепления линейных продуктов нуклеиновой кислоты. В общем, если продукты лигирования защищены от экзонуклеазной деградации, экзонуклеазная деградация может быть использована для приумножения продуктов лигирования. Экзонуклеаза затем должна быть дезактивирована (например, воздействием высокой температуры) до любой последующей стадии с участием полимеризации, например, до амплификации по типу катящегося кольца. Как иллюстрируется в Примере 1, 1U экзонуклеазы может быть добавлен для удаления непрореагировавпшх зондов и фрагментов. Подходящими условиями является инкубация при 37°С в течение 1 часа в соответствующем экзонуклеазном буфере, с последующей инактивацией фермента при 80°С в течение 20 минут. Там, где использованы способы захвата/детектирования, продукты лигирования могут быть приумножены путем захвата продуктов на твердой фазе с помощью фрагмента захвата. Как иллюстрируется в Примере 2, раствор, содержащий линейные продукты лигирования может быть смешан с 10 мл М-280 магнитных шариков, покрытых стрептавидином (Инвитроджен) в Трис-HCl (рН 7,5), 3,5 мМ ЭДТА и 0,07% Tween-20 в конечном объеме 200 мл, и инкубирован при комнатной температуре в течение 15 мин. После инкубации шарики собираются с помощью кольцевого магнита и супернатант удаляется. Другие способы приумножения для продуктов лигирования включают специфический отбор продуктов лигирования по размеру.

Удобный способ детектирования продукта двойного лигирования заключается в обеспечении амплификации и определении наличия продуктов амплификации. Существует несколько возможных подходов амплификации, например, NASPA, LAMP, Т7 амплификация, ПЦР или, где непрерывная цепь является кольцом, репликация по типу катящегося кольца. Этап выявления продукта двойного лигирования может включать создание условий для амплификации по первому и второму стыках лигирования непрерывной цепи нуклеиновой кислоты, и детектирование с целью определить присутствует ли продукт амплификации. Продукты лигирования могут быть амплифицированы с помощью клональной амплификации. Подходящие способы амплификации включают амплификацию по типу катящегося кольца (см. ниже), твердофазную ПЦР (Addessi С, с соавт., Nucleic Acids Res. 15 октября 2000 года; 28 (20): Е87), эмульсионную ПЦР (цифровая ПЦР в эмульсиях была описана Dressman с соавт., Proc Natl Acad Sci США. 22 июля 2003 года; 100(15): 8817-22. Epub 11 июля 2003 года) и цифровая ПЦР (Vogelstein и Kinzler, Proc Natl Acad Sci США. 3 августа 1999 года; 96 (16): 9236-41). Клонально локализованная амплификация в гелях была описана Mitra и Church, Nucleic Acids Res. 15 декабря 1999 года; 27 (24): е34.

Там, где продукт двойного лигирования является кольцом нуклеиновой кислоты, удобный способ для обнаружения продукта заключается в обеспечении условий для репликации по типу катящегося кольца и для детектирования, присутствует ли продукт репликации по типу катящегося кольца. Продукт репликации по типу катящегося кольца зависит от двойного лигирования, с целью обеспечения кольца нуклеиновой кислоты для амплификации. Репликация по типу катящегося кольца была описана в патенте США 5,854,033 (Lizardi) и Fire и Xu, Proc Natl Acad Sci США. 9 мая 1995 года; 92(10): 4641-5. Репликация по типу катящегося кольца является амплификацией кольцевой молекулы нуклеиновой кислоты с использованием ДНК-полимеразы, которая замещает цепь, что приводит к образованию больших молекул ДНК, содержащих тандемные повторы амплифицированной последовательности. ДНК-полимераза катализирует удлинение праймера и смещение цепи в процессивной реакции полимеризации по типу катящегося кольца, которая продолжается столько, сколько является необходимым. Это приводит к амплификации округленной последовательности зонда в больших порядках, чем за один цикл ПЦР репликации и в других методах амплификации, в которых каждый цикл ограничен удвоению числа копий целевой последовательности. Дополнительная амплификация может быть получена с помощью каскада реакций замещения цепи. Репликация по типу катящегося кольца может быть сверхразветвленной репликацией по типу катящегося кольца. Сверхразветвленная RCA была описана Lizardi с соавт., Nat Genet, июль 1998 года; 19 (3): 225-32. Условия для полимеризации по типу катящегося кольца проиллюстрированы в Примерах, например, инкубация с полимеразой phi29 (фирма "Нью Инглэнд Биолабс") 1U которой может быть добавлен в соответствующий буфер phi29 с олигонуклеотидами (дНТФ) при 37°С в течение 1 часа.

После репликации по типу катящегося кольца, амплифицированные последовательности зонда могут быть обнаружены и количественно определены с использованием любой из обычных систем обнаружения для нуклеиновых кислот, таких как обнаружение флуоресцентных меток, систем обнаружения, связанных с ферментами, обнаружение метки посредством антител и обнаружение радиоактивных меток. Предпочтительно, продукт амплификации по типу катящегося кольца обнаруживается посредством гибридизации меченного олигонуклеотида обнаружения с мотивом в продукте RCA, например, мотив в заданной последовательности зонда. Поскольку амплифицированный продукт является прямо пропорциональным количеству целевой последовательности, присутствующей в образце, количественные измерения достоверно представляют количество целевой последовательности в образце. Основными преимуществами этого способа является то, что стадией лигирования можно манипулировать для получения аллельной дискриминации, стадия репликации ДНК является изотермической, а сигналы строго количественными, так как реакция амплификации является линейной и катализируется чрезвычайно последовательным ферментом. В мультиплексных анализах, олигонуклеотид праймера, используемый для реакции ДНК-полимеразы, может быть одинаковым для всех зондов.

Для зондов, в которых последовательности, расположенные в начале и в конце, расположены на разных молекулах нуклеиновой кислоты, может оказаться удобным использовать способы захвата/ детектирования. Продукт двойного лигирования содержит последовательности, расположенные в начале и в конце, в одной молекуле нуклеиновой кислоты (непрерывной цепи), в то время, как нелигированные зонды не содержат этого. Таким образом, продукт двойного лигирования может быть специфически детектирован путем захвата молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, расположенную в начале, промывания для удаления нелигированной нуклеиновой кислоты зонда, а затем детектирования наличия последовательности, расположенной в конце, в захваченной фракции. В альтернативном варианте, продукт двойного лигирования может быть детектирован путем захвата молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, расположенную в конце, промывания для удаления нелигированной нуклеиновой кислоты зонда, а затем детектирования наличия последовательности, расположенной в начале, в захваченной фракции. Детектирование является специфическим для лигированных зондов, так как последовательности, расположенные в начале и в конце, в нелигированных зондах соединены только путем гибридизации между нуклеиновыми кислотами и отделены друг от друга промыванием, в то время как лигированные зонды содержат последовательности, расположенные в начале и в конце, в непрерывной нити нуклеиновой кислоты, то есть, связанные ковалентно.

Зонды могут быть модифицированы, чтобы нести фрагменты захвата. Фрагмент захвата может позволять присоединение к такой твердой подложке, как шарик (микроноситель). Подходящим фрагментом захвата является биотин, который соединяется со стрептавидином, позволяя модифицированной нуклеиновой кислоте зонда быть изолированной на твердой подложке, покрытой стрептавидином. В случае, если зонд содержит каркасный олигонуклеотид, содержащий либо последовательность, расположенную в начале или в конце, и отдельную нуклеиновую кислоту (нацеливающий олигонуклеотид или второй каркасный олигонуклеотид), содержащую либо последовательность, расположенную в начале или в конце соответственно, либо эти молекулы нуклеиновых кислот могут нести фрагмент захвата, например, могут быть биотинилированными. Это может быть удобно для обеспечения зонда фрагментом захвата перед объединением зонда с образцом. В альтернативном варианте фрагмент захвата может быть введен после стадии лигирования.

Если одна молекула нуклеиновой кислоты в зонде содержит фрагмент захвата, то другая может нести метку. Существует возможность использования самой последовательности нуклеиновой кислоты в качестве метки, например, для специфического детектирования присутствия последовательности, расположенной в начале (где конец последовательности захвачен) или последовательности, расположенной в конце (где начало последовательности захвачено) или для детектирования заданной последовательности, которая является уникальной для детектируемой молекулы нуклеиновой кислоты. Комплементарный олигонуклеотид может быть использован для детектирования. В качестве альтернативы нуклеиновая кислота может нести гетерогенную метку, такую как флуорофор. Гетерогенный метка не является частью самой нуклеиновой кислоты. Могут быть использованы другие метки, такие как квантовые точки, биолюминесценция, генерация сигналов ферментными каскадами, например, тирамидиновое усиление сигнала и радиоактивные фрагменты. Затем способ может включать обнаружение присутствия метки, например, обнаружение флуоресценции, обнаружение квантовых точек, обнаружения биолюминесценции, обнаружение сигнала, генерируемого с помощью фермента или обнаружение радиоактивности, соответственно.

В качестве примера, этап детектирования присутствия продукта двойного лигирования может включать захватывание каркасного олигонуклеотида зонда на подложке с помощью фрагмента захвата, промывание подложки для удаления нелигированных зондов и удержание захваченной фракции, включающей подложку и захваченный каркасный олигонуклеотид, а также тестирование на наличие продукта двойного лигирования в захваченной фракции. Если продукт двойного лигирования несет метку, это может включать в себя проверку на наличие метки в захваченной фракции.

Фрагмент захвата может быть биотиновой молекулой с аффинностью к стрептавидиновой подложке. Другие подходящие метки аффинности включают полигистидиновые теги с аффиностью к иммобилизованным ионам металлов, таким как кобальт, никель, медь, которые могут быть использованы для очистки последовательностей, содержащих гистидин, например, каркасных олигонуклеотидов. Таким образом, фрагмент захвата может быть частью последовательности для захвата, например, последовательностью Гис-тег, или он может представлять собой гетерогенную часть молекулы, которая не является частью самой нуклеиновой кислоты.

Подходящий твердый субстрат представляет собой шарик, например, магнитный шарик, для облегчения приумножения захваченных продуктов с помощью магнита. Подложка может быть покрыта связующим элементом для фрагмента захвата, например, стрептавидиновые магнитные шарики (микроносители) могут быть использованы с биотинилированными зондами.

Преимуществом некоторых вариантов реализации настоящего способа является то, что он не полагается ни на секвенирование нуклеиновых кислот, ни на ПЦР, которые вызывают необъективные результаты, поскольку некоторые последовательности амплифицируются более эффективно, чем другие. В некоторых случаях, однако, детектирование может включать этап проверки идентичности лигированного фрагмента путем секвенирования продукта. Одним из преимуществ настоящего изобретения является то, что путем включения фактического целевого фрагмента в продукт двойного лигирования, продукт может быть секвенирован для подтверждения того факта, что зонды реагирует с правильной целью. Это является преимуществом по сравнению с другими подходами, основанными на двойном лигировании, таких как США 20130172212 (Ariosa).

Мультиплексирование

Многочисленные различные фрагменты целевой нуклеиновой кислоты могут быть обнаружены с параллельным использованием множества зондов. Например, образец фрагментированных хромосом может контактировать с набором зондов для связывания нескольких фрагментов хромосомы, причем каждый зонд в наборе используется для связывания другого целевого фрагмента специфичного для этой хромосомы. Зонды могут иметь общую заданную последовательность, которая может быть использована в качестве штрих-кода для идентификации зондов, которые специфически связывают эту хромосому. Мультиплексирование может включать в себя мультиплексные нацеливающие олигонуклеотиды и один общий каркасный олигонуклеотид, но и несколько наборов нацеливающих олигонуклеотидов, где каждое подмножество гибридизируется для разделения каркасных олигонуклеотидов.

Множественные зонды могут быть использованы для обеспечения обнаруживаемого сигнала, где величина сигнала является пропорциональной количеству зондов, распознающих их целевые фрагменты. Индивидуальные сигналы от множества датчиков преобразуются в один кумулятивный детектируемый сигнал, усиливающий отдельные сигналы с помощью мультиплексного зондирования. Десять или более зондов производят усиление сигнала в десять или более раз. Генерируемые сигналы зависят от правильного реагирования зондов при распознавании целей, с использованием специфической к последовательности гибридизации и лигирования для генерации специфических продуктов двойного лигирования, из которых получается сигнал.

Каждый зонд, который распознает свой целевой фрагмент, генерирует продукт лигирования, и продукты лигирования, производимые в результате гибридизации каждого зонда, могут детектироваться индивидуально, так что отдельный сигнал может быть получен от каждого зонда. Тем не менее, элегантная особенность данного изобретения заключается в том, что эти отдельные сигналы не нуждаются в индивидуальном обнаружении, но вместо этого они сливаются в кумулятивный сигнал и детектируется уже сам кумулятивный сигнал. Кумулятивный сигнал является комбинацией отдельных сигналов и, таким образом, может быть использован для детектирования и/или количественного определения продуктов лигирования, отображая присутствие или количество типов исследуемых нуклеиновых кислот. Некоторые варианты реализации данного способа допускают более раннее слияние сигналов зондов по сравнению со способами, включающими секвенирование и микрочипы, в которых отдельные сигналы генерируются для нескольких зондов по всему региону, а затем сигнал сливается и анализируется для представления региона. Сигнал может быть объединен перед детектированием, так что отдельные сигналы не будут отдельно отображаться или запрашиваться. Это дает возможность более простому формату считывания.

Отдельные сигналы могут быть получены от каждого продукта двойного лигирования, который образован в результате гибридизации с каждым целевым фрагментом. Так, например, если набор зондов включает 10 различных зондов, которые распознают 10 целевых фрагментов типов интереса в образце, то образуется 10 продуктов лигирования, включая стыки лигирования, и кумулятивный сигнал может быть обнаружен, представляя собой комбинацию отдельных сигналов от 10 продуктов лигирования. Конечно, в этом примере фактическое число молекул зондов, целевых фрагментов и продуктов лигирования может быть выше 10, поскольку, как правило, имеется множество копий каждого целевого фрагмента в образце, и образец будет контактировать с множеством копий каждого зонда.

Способ усиления сигнала посредством мультиплексирования может быть использован для обнаружения в образце представляющих интерес типов нуклеиновых кислот, например, когда тип нуклеиновой кислоты является небольшим или микроскопическим компонентом в сложном образце нуклеиновой кислоты. Усиление мультиплексированием обеспечивает надежное детектирование. Это может использоваться, например, для обнаружения микробной нуклеиновой кислоты в образцах, таких как образцы пациентов, для диагностических целей. Образцы могут быть зондированы с помощью зондов, специфичных до микробных нуклеиновых кислот множества типов, для обнаружения и идентификации тех, которые присутствуют. Это полезно для обнаружения таких возбудителей инфекционных заболеваний, как бактерии, вирусы и грибы. Могут быть обнаружены конкретные транскрипты нуклеиновых кислот. Усиление посредством мультиплексирования также может быть использовано для количественного определения типов нуклеиновых кислот. При зондировании двух или более типов нуклеиновой кислоты - один или более тип, представляющий интерес, и один или более тип эталонной нуклеиновой кислоты - способ обеспечивает количественное определение относительного количества двух типов в образце. Способ особенно полезен, когда применяется в детектировании и определении количества хромосом или хромосомных локусов, например, для обнаружения числа хромосомных копий. Применение конкретного значения представляет использование таких способов для выявления хромосомных дефектов, в том числе для диагностики раковых заболеваний и врожденных анеуплоидий. Конкретно описано использование для неинвазивной пренатальной диагностики (НПД).

Типы нуклеиновой кислоты в образце могут быть обнаружены путем контактирования образца с набором зондов согласно настоящему изобретению, причем каждый зонд специфически распознает отдельную целевую последовательность в типах детектируемой нуклеиновой кислоты. Целевые последовательности соответствуют целевым фрагментам типов нуклеиновой кислоты. Как описано в настоящем документе, распознавание каждой целевой последовательности с помощью каждого зонда формирует продукт двойного лигирования. Кумулятивный сигнал, являющийся комбинацией сигналов от продуктов, может быть обнаружен. Детектирование сигнала указывает на присутствие типов нуклеиновой кислоты в образце. Типы нуклеиновых кислот могут быть количественно определены путем количественного определения кумулятивного сигнала для определения уровня сигнала, причем уровень сигнала является пропорциональным количеству типов нуклеиновой кислоты в образце, и, таким образом, определяет количество типов нуклеиновой кислоты в образце. Первый тип нуклеиновой кислоты может быть количественно определен по отношению ко второму или эталонному типу нуклеиновой кислоты путем контактирования образца с первым набором зондов и вторым набором зондов, причем зонды первого набора каждый специфически распознает отдельную целевую последовательность в пределах первого типа нуклеиновой кислоты и, в котором зонды второго набора каждый специфически распознает отдельную целевую последовательность в пределах второго или эталонного типа нуклеиновой кислоты. Детектируются первый и второй кумулятивные сигналы, первый кумулятивный сигнал является сочетанием отдельных сигналов от продуктов, полученных с помощью зондов первого набора, распознающих их целевые последовательности, а второй кумулятивный сигнал является сочетанием отдельных сигналов от продуктов, полученных с помощью зондов второго набора, распознающих их целевые последовательности. Первый и второй сигналы определяются количественно для определения первого и второго уровней сигналов, соответственно, что является пропорциональным к количеству первого и второго типа нуклеиновой кислоты в образце. Относительные количества первого и второго типа нуклеиновых кислот в образце, могут быть таким образом определены путем сравнения первого и второго уровней сигналов.

Например, кумулятивный сигнал может быть суммированным перечислением клонально амплифицированных и/или меченых продуктов зондов, которые распознают свои целевые последовательности, например, продукты амплификации по типу катящегося кольца или флуоресцентного сигнала, излучаемого из всех продуктов, где каждый продукт излучает флуоресцентный сигнал. Для количественного определения относительных количеств нескольких типов нуклеиновых кислот для каждого типа используются разные сигналы, например, продукты из одного набора зондов могут излучать различные длины волн или спектр флуоресценции по сравнению с продуктами другого набора зондов.

Типы нуклеиновой кислоте в образце могут быть детектированы в способе, включающем

контактирование образца с набором зондов, причем каждый зонд специфически распознает отдельную целевую последовательность в пределах типов детектируемой нуклеиновой кислоты,

обеспечение денатурирующих условий, при которых целевые последовательности в типах нуклеиновой кислоты, являются одноцепочечными,

обеспечение условий для отжига и лигирования, при таких условиях зонды гибридизируются с целевыми последовательностями и генерируют продукты лигирования, и

обнаружение кумулятивного сигнала, который является комбинацией отдельных сигналов от всех продуктов лигирования,

причем обнаружение сигнала указывает на присутствие типов нуклеиновой кислоты в образце.

Подробная информация об образце, целевой нуклеиновой кислоте, этапах способа (например, денатурировании, отжиге, лигировании) и зондах описана другом месте настоящего описания. Способ может включать:

(i) получение образца, в котором тип нуклеиновой кислоты фрагментируется на целевые фрагменты,

(ii) обеспечение денатурирующих условий, при которых целевые фрагменты являются одноцепочечными

(iii) контактирование образца с набором зондов, причем каждый зонд специфически распознает отдельную целевую последовательность в пределах типов детектируемой нуклеиновой кислоты, причем целевые последовательности являются последовательностями целевых фрагментов, и в котором каждый зонд содержит

нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент и содержит внутреннюю последовательность, комплементарную цели, таким образом, что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида, и

последовательности, расположенные в начале и в конце, имеющие свободные 5'- и 3'-концы, соответственно, причем последовательности, находящиеся в начале и в конце, являются комплементарными к вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно,

(iv) обеспечение условий отжига при которых последовательности начала и конца гибридизируются с фланкирующими последовательностями, а целевые фрагменты, если они присутствуют, гибридизуются с последовательностями, комплементарными цели, зондов, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5'-концом последовательности начала и 3'-концом последовательности конца

(v) обеспечение условий для лигирования при которых, если целевой фрагмент присутствует, 3'-конец целевого фрагмента лигирует с 5'-концом последовательности начала с образованием первого стыка лигирования, и 5'-конец целевого фрагмента лигирует с 3'-концом последовательности конца с образованием второго стыка лигирования, продуцируя продукт двойного лигирования, который включает в себя непрерывную цепь нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности начала и конца и целевой фрагмент, и

(vi) обнаружение кумулятивного сигнала, который является комбинацией отдельных сигналов от всех продуктов,

причем обнаружение сигнала указывает на присутствие типов нуклеиновой кислоты в образце.

Типы нуклеиновой кислоте могут быть количественно определены с помощью способа, включающего

(i) получение образца, в котором тип нуклеиновой кислоты фрагментируется на целевые фрагменты

(ii) обеспечение денатурирующих условий, при которых целевые фрагменты являются одноцепочечными

(iii) контактирование образца с набором зондов, причем каждый зонд специфически распознает отдельный целевой фрагмент типов определяемой количественно нуклеиновой кислоты, причем каждый зонд содержит

нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент и содержит внутреннюю последовательность, комплементарную цели, таким образом, что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида, и

последовательности, расположенные в начале и в конце, имеющие свободные 5'- и 3'-концы, соответственно, причем последовательности, находящиеся в начале и в конце, являются комплементарными к вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно,

(iv) обеспечение условий отжига при которых последовательности начала и конца гибридизируются с фланкирующими последовательностями, а целевые фрагменты, если они присутствуют, гибридизуются с последовательностями, комплементарными цели, зондов, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 3'-концом последовательности начала и 3'-концом последовательности конца

(v) обеспечение условий для лигирования при которых, если целевой фрагмент присутствует, 3'-конец целевого фрагмента лигирует с 5'-концом последовательности начала с образованием первого стыка лигирования, и 5'-конец целевого фрагмента лигирует с 3'-концом последовательности конца с образованием второго стыка лигирования, продуцируя продукт двойного лигирования, который включает в себя непрерывную цепь нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности начала и конца и целевой фрагмент,

(vi) обнаружение кумулятивного сигнала, который является комбинацией отдельных сигналов от всех продуктов лигирования, и

(vii) количественное определение кумулятивного сигнала для определения уровня сигнала, причем уровень сигнала является пропорциональным количеству типов нуклеиновой кислоты в образце, и

таким образом определяет количество типов нуклеиновой кислоты в образце.

Способ может быть использован для количественной оценки первого типа нуклеиновой кислоты по отношению ко второму типу нуклеиновой кислоты в образце. Способ может включать:

(i) получение образца, в котором первый и второй тип нуклеиновой кислоты фрагментирован на целевые фрагменты

(ii) обеспечение денатурирующих условий, при которых целевые фрагменты являются одноцепочечными

(iii) контактирование образца с первым набором зондов и вторым набором зондов, причем зонды первого набора специфически распознают отдельные целевые фрагменты первого типа нуклеиновой кислоты и, в котором зонды второго набора специфически распознают отдельные целевые фрагменты второго типа нуклеиновой кислоты, причем каждый зонд содержит

нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент и содержит внутреннюю последовательность, комплементарную цели, таким образом, что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида, и

последовательности, расположенные в начале и в конце, имеющие свободные 5'- и 3'-концы, соответственно, причем последовательности, находящиеся в начале и в конце, являются комплементарными к вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно,

(iv) обеспечение условий отжига при которых последовательности начала и конца габридизируются с фланкирующими последовательностями, а целевые фрагменты, если они присутствуют, гибридизуются с последовательностями, комплементарными цели, зондов, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 3'-концом последовательности начала и 3'-концом последовательности конца

(v) обеспечение условий для лигирования при которых, если целевой фрагмент присутствует, 3'-конец целевого фрагмента лигирует с 5'-концом последовательности начала с образованием первого стыка лигирования, и 5'-конец целевого фрагмента лигирует с 3'-концом последовательности конца с образованием второго стыка лигирования, продуцируя продукт двойного лигирования, который включает в себя непрерывную цепь нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности начала и конца и целевой фрагмент,

(vi) обнаружение первого кумулятивного сигнала, который является комбинацией отдельных сигналов от продуктов лигирования, полученных с помощью зондов первого набора, и их количественное определение для определения уровня первого сигнала, причем уровень первого сигнала является пропорциональным количеству первого типа нуклеиновой кислоты в образце,

(vii) обнаружение второго кумулятивного сигнала, который является комбинацией отдельных сигналов от продуктов лигирования, полученных с помощью зондов второго набора, и их количественное определение для определения уровня второго сигнала, причем уровень второго сигнала является пропорциональным количеству второго типа нуклеиновой кислоты в образце, и

(viii) сравнение уровней первого и второго сигналов, таким образом определяя относительные количества первого и второго типа нуклеиновых кислот в образце.

Как правило, для обнаружения или количественного определения каждого типа нуклеиновой кислоты необходимо по меньшей мере десять зондов. Количество, естественно, относится к количеству различных зондов, а не к абсолютному количеству молекул зонда. Соответственно, нуклеиновая кислота будет содержать, по меньшей мере, десять различных конкретных целевых последовательностей, а кумулятивный сигнал является комбинацией отдельных сигналов, по меньшей мере, десяти уникальных зондов, этот кумулятивный сигнал представляет один тип нуклеиновой кислоты. Высокие уровни мультиплексирования могут быть использованы для получения соответственно высоких уровней усиления сигнала. Например, по меньшей мере 100, по меньшей мере 1000, по меньшей мере, 10000 или даже большее число зондов может быть использовано для обнаружения или количественного определения каждого типа нуклеиновой кислоты.

Способ включает контактирование образца фрагментированных хромосом с несколькими наборами зондов для связывания нескольких фрагментов двух или более хромосом, содержащий:

первый набор зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для первой хромосомы, и

второй набор зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для второй хромосомы, и, в некоторых случаях,

один или более дополнительных наборов зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для одной или более дополнительных хромосом.

Зонды в пределах набора могут иметь заданную последовательность, которая является общей для этого набора, и отличатся от заданных последовательностей зондов в других наборах, что позволяет легко идентифицировать зонды из каждого набора. Каждый набор зондов может содержать, по меньшей мере, 500, 600, 700, 800, 900 или, по меньшей мере 1000 различных зондов для связывания с множеством целевых фрагментов, специфических к хромосоме. Например, способ может использовать 1000 различных нацеливающих олигонуклеотидов к каждой из 21, 13 и 18 хромосоме соответственно, и три различных каркасных олигонуклеотида, по одному для каждого подмножества хромосомы.

Существует возможность определения относительных количеств двух или более хромосом в образце путем детектирования продуктов двойного лигирования для каждого набора зондов и детектирования относительных количеств заданных последовательностей в указанных продуктах.

С помощью зондов, где нацеливающий олигонуклеотид и вышележащие и нижележащие олигонуклеотиды образуют кольцо, мотивы, кодирующие специфические аллели и или локусы, могут быть включены в заданную последовательность в высоком множестве копий.

Цифровое кариотипирование и неинвазивная пренатальная диагностика

Некоторые варианты реализации данного способа могут обеспечить определенные преимущества в областях, в которых необходимо точное определение количества целевой ДНК. Это включает в себя ряд диагностических методов, основанных на использовании нуклеиновой кислоты. Одной из таких областей является анализ ДНК злокачественных опухолей из биологических образцов пациента (например, крови). Другой такой областью является неинвазивная пренатальная диагностика (НПД) путем анализа внеклеточной ДНК.

Проблемой, возникающей при проведении НПД, является то, что большое количество специфических фрагментов генома должно учитываться для того, чтобы достичь статистической достоверности, необходимой для диагностики аномалий хромосомных анеуплоидий (различия числа копий хромосом). Поскольку ДНК плода смешивается с материнской ДНК и составляет 4-30% генетического материала в крови беременной женщины, наблюдение за хромосомной анеуплоидией в ДНК плода требует очень точного измерения.

Зонды, описанные в данном документе, могут быть использованы для анализа свободно циркулирующей ДНК плода в образцах материнской крови. При использовании множества зондов, предназначенных для различных фрагментов одной хромосомы, и множества зондов, предназначенных для различных фрагментов другой хромосомы, зонды с высокой степенью достоверности определяют дисбаланс в относительных количествах двух хромосом в образце. Это позволяет диагностировать в фетальной ДНК такие виды хромосомной анеуплоидий, как трисомия, даже при высоком фоне материнской ДНК.

Зонды, описанные в данном документе, могут быть использованы для тестирования образцов материнской крови беременных женщин для выявления фетальной нуклеиновой кислоты для диагностики хромосомных аномалий, таких как трисомия, и для тестирования образцов пациентов на наличие опухолевой ДНК для диагностики или мониторинга наличия опухоли у пациента. Другие области применения включают анализ образцов материала на наличие микробной нуклеиновой кислоты, где обнаружение микробной нуклеиновой кислоты указывает на инфицирование материала микроорганизмом, который может быть таким инфекционным агентом, как бактерия, вирус или грибок. Образцом может быть ткань или кровь пациента.

В более общем смысле, используя сотни или тысячи различных зондов, данный способ может обеспечивать высокую точность путем обнаружения сотен или тысяч специфических фрагментов нуклеиновых кислот, обеспечивая преимущества по целому ряду диагностических применений. Обнаружение большого количества фрагментов ДНК из хромосомы или хромосомного локуса, связанного с конкретным заболеванием, позволяет сравнить эту хромосому или локус с контрольной хромосомой или локусом, таким образом, что даже небольшие различия в образцах могут быть обнаружены точно.

Большая часть сильно фрагментированной внеклеточной ДНК, которая находится в материнской крови, может быть эффективно проанализирована путем исследования небольших целевых фрагментов. Это имеет важное значение, поскольку очень малые количества внеклеточной ДНК доступны в материнской крови.

Способ количественного определения первой хромосомы или хромосомного локуса относительно второй хромосомы или хромосомного локуса в образце нуклеиновой кислоты, полученном из индивидуума, может включать в себя

(i) получение образца, в котором первая и вторая хромосомы или хромосомные локусы фрагментированы на целевые фрагменты

(ii) обеспечение денатурирующих условий, при которых целевые фрагменты являются одноцепочечными

(iii) контактирование образца с первым набором зондов и вторым набором зондов, в которых зонды первого набора специфически распознают отдельные целевые фрагменты первой хромосомы и зонды второго набора специфически распознают отдельные целевые фрагменты второй хромосомы, причем каждый зонд содержит

нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент и содержит внутреннюю последовательность, комплементарную цели, таким образом, что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида, и

последовательности, расположенные в начале и в конце, имеющие свободные 5'- и 3'-концы, соответственно, причем последовательности, находящиеся в начале и в конце, являются комплементарными к вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно,

(iv) обеспечение условий отжига при которых последовательности начала и конца гибридизируются с фланкирующими последовательностями, а целевые фрагменты, если они присутствуют, гибридизуются с последовательностями, комплементарными цели, зондов, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 3'-концом последовательности начала и 3'-концом последовательности конца

(v) обеспечение условий для лигирования при которых, если целевой фрагмент присутствует, 3'-конец целевого фрагмента лигирует с 5'-концом последовательности начала с образованием первого стыка лигирования, и 5'-конец целевого фрагмента лигирует с 3'-концом последовательности конца с образованием второго стыка лигирования, продуцируя продукт двойного лигирования, который включает в себя непрерывную цепь нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности начала и конца и целевой фрагмент,

(vi) обнаружение первого кумулятивного сигнала, который является комбинацией отдельных сигналов от продуктов лигирования, полученных с помощью зондов первого набора, и их количественное определение для определения уровня первого сигнала, причем уровень первого сигнала является пропорциональным количеству первой хромосомы или хромосомного локуса в образце,

(vii) определение второго кумулятивного сигнала, который является комбинацией отдельных сигналов от продуктов лигирования, полученных с помощью зондов второго набора, и их количественное определение для определения уровня второго сигнала, причем уровень второго сигнала является пропорциональным количеству второй хромосомы или хромосомного локуса в образце, и

(viii) сравнение уровней первого и второго сигналов, таким образом определяя относительные количества первой и второй хромосом в образце.

Данный способ может быть использован для диагностики анеуплоидий у плода (например, трисомии), где образец нуклеиновой кислоты представляет собой образец, полученный из материнской крови и содержащий внеклеточную ДНК плода смешанную с материнской ДНК, и в котором неравное соотношение первого и второго уровней сигналов свидетельствует об анеуплоидий (например, трисомии).

Зонды

Другие аспекты включают зонды, пригодные для использования в настоящем способе. Примеры зондов и их особенности уже были описаны выше. Некоторые дополнительные особенности и примеры описаны здесь.

Нуклеиновая кислота зонда предпочтительно является ДНК. Тем не менее, это может быть другая нуклеиновая кислота, естественного происхождения или нет. Стандартными основами ДНК являются А, Т, С и G, но нуклеиновая кислота зонда может при необходимости включать нестандартные нуклеотиды.

В общем, зонд в соответствии с настоящим изобретением содержит нацеливающий олигонуклеотид и последовательности, расположенные в начале и в конце. Последовательности, расположенные в начале и в конце, могут быть частью нацеливающего олигонуклеотида, либо одна либо обе из них могут быть на разной молекуле нуклеиновой кислоты. При необходимости, зонд содержит нацеливающий олигонуклеотид, каркасный олигонуклеотид, содержащий последовательность, находящуюся в начале, и каркасный олигонуклеотид, содержащий последовательность, находящуюся в конце. Поэтому зонд может содержать одну, две или три молекулы нуклеиновой кислоты в ее нелигированной форме.

Нацеливающий олигонуклеотид является длиннее, чем целевой фрагмент, и содержит внутреннюю последовательность, комплементарную цели, таким образом, что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида. Последовательности, находящиеся в начале и в конце, имеют свободные 5'- и 3'-концы соответственно, и являются комплементарными вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно. В условиях отжига, при наличии целевого фрагмента, последовательности, расположенные в начале и в конце, гибридизируются с фланкирующими последовательностями, задавая пробел между 5'-концом последовательности, расположенной в начале, и 3'-концом последовательности, расположенной в конце, причем целевой фрагмент гибридизируется с последовательностью, комплементарной цели, в пробеле, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5'-концом последовательности, расположенной в начале, и 3'-концом последовательности, расположенной в конце.

Зонды могут быть разработаны таким образом, чтобы гибридизация целевого фрагмента в пробеле завершала кольцо нуклеиновой кислоты, кольцо, содержащее целевой фрагмент и последовательности, расположенные в начале и в конце.

Последовательность зонда, расположенная в начале и/или в конце, является предпочтительно присоединенной к заданной последовательности, которая не является комплементарной к другим областями зонда или целевого фрагмента.

В некоторых вариантах реализации изобретения зонда, одна молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательности, расположенные в начале и в конце.

Последовательности, расположенные в начале и в конце, могут быть отделены от нацеливающего олигонуклеотида таким образом, что они связываются in trans с фланкирующими последовательностями. Например, последовательности, расположенные в начале и в конце, могут быть, соответственно, на 5'- и 3'-концах каркасного олигонуклеотида. Заданная последовательность может быть включена между последовательностями каркасного олигонуклеотида, расположенными в начале и в конце. Пример такого зонда проиллюстрирован на фиг. 1 и фиг. 3. В альтернативном варианте, последовательности, находящиеся в начале и в конце каркасного олигонуклеотида, могут быть примыкающими, без промежуточной нуклеотидной последовательности. В таком случае, фланкирующие последовательности нацеливающего олигонуклеотида гибридизируются по всей длине каркасного олигонуклеотида и могут замкнуть его в кольцо.

Зонды могут быть разработаны таким образом, чтобы последовательность, находящаяся в начале, являлась 5'-концом нацеливающего олигонуклеотида и/или последовательность, находящаяся в конце, являлась 3'-концом нацеливающего олигонуклеотида, таким образом, чтобы гибридизация целевого фрагмента в пробеле завершала цепь нуклеиновой кислоты, содержащей целевой фрагмент, последовательности, расположенные в начале и в конце, последовательность, комплементарную цели, и фланкирующие последовательности. Последовательности, лежащие в начале и в конце могут находиться на концах нацеливающего олигонуклеотида и связываться in cis с фланкирующими последовательностями. Пример такого зонда проиллюстрирован на фиг. 4. В этой версии зонда, последовательности, расположенные в начале и в конце, и последовательность, комплементарная цели, все становятся округленными с целевым фрагментом. Заданные последовательности могут быть расположены в петлях олигонуклеотида. Нуклеиновая кислота зонда является относительно длинной, но имеет преимуществом соединение структуры олигонуклеотида в одну молекулу, которая является предварительно собранной и не требует гибридизации различных молекул нуклеиновой кислоты зонда.

Зонды могут также быть разработаны с каркасным олигонуклеотидом, который является отдельной молекулой нуклеиновой кислоты из нацеливающего олигонуклеотида. Последовательность, расположенная в конце, может быть 3'-концом нацеливающего олигонуклеотида, а последовательность, расположенная в начале 5'-концом каркасного олигонуклеотида. В альтернативном варианте, последовательность, расположенная в начале, может быть 5'-концом нацеливающего олигонуклеотида, а последовательность, расположенная в конце 3'-концом каркасного олигонуклеотида. Заданная последовательность может быть введена в нацеливающий олигонуклеотид, например, для обеспечения петли между последовательностями, расположенными в начале и в конце, и фланкирующей последовательностью. Преимуществом использования данного подхода зонда состоит в том, что последовательность детектирования может быть введена в петлю и ассоциирована с последовательностью, комплементарной цели, что может быть полезно для способов усиления, особенно усилений высших порядков со схемами обнаружения "high-plex". Каркасный олигонуклеотид может дополнительно включать заданную последовательность. При обеспечении зонда двумя олигонуклеотидами, молекулы нуклеиновой кислоты зонда являются более короткими, чем однонуклеотидная версия, но сохраняют ту же самую функцию.

Другая конструкция зонда обеспечивает последовательности, расположенные в начале и в конце, на двух каркасных олигонуклеотидах. Таким образом, зонд содержит

нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент и содержит внутреннюю последовательность, комплементарную цели, таким образом что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида,

каркасный олигонуклеотид, содержащий последовательность, расположенную в начале, имеющую свободный 5'-конец, и

каркасный олигонуклеотид, содержащий последовательность, расположенную в конце, имеющую свободный 3'-конец,

причем, последовательности, расположенные в начале и конце, являются комплементарными вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно.

Один каркасный олигонуклеотид может нести фрагмент захвата, и в этом случае другой каркасный олигонуклеотид используется для обнаружения и может нести гетерогенную метку. Один или оба каркасных олигонуклеотида могут дополнительно содержать заданную последовательность. В альтернативном или дополнительном варианте, нацеливающий олигонуклеотид может включать заданную последовательность.

В условиях отжига, при наличии целевого фрагмента, последовательности, расположенные в начале и в конце, гибридизируются с фланкирующими последовательностями, задавая пробел между 5'-концом последовательности, расположенной в начале, и 3'-концом последовательности, расположенной в конце, причем целевой фрагмент гибридизируется последовательностью, комплементарной цели, в пробеле, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5'-концом последовательности, расположенной в начале, и 3'-концом последовательности, расположенной в конце. Гибридизация целевого фрагмента в пробеле завершает цепь нуклеиновой кислоты, содержащую целевой фрагмент и последовательности, расположенные в начале и в конце. Цепь несет фрагмент захвата и метку, позволяющие детектирование с помощью способов захвата/детектирования, описанных других местах настоящего описания.

Комплекты и наборы зондов

Дальнейшим аспектом настоящего изобретения является набор зондов для связывания одноцепочечных целевых фрагментов нуклеиновой кислоты, содержащий множество зондов, зондов, имеющих множество различных последовательностей, комплементарных цели, для связывания множества различных целевых фрагментов.

Набор зондов может быть предназначен для связывания нескольких фрагментов хромосомы человека, причем каждый зонд в наборе используется для связывания другого целевого фрагмента специфичного для этой хромосомы. Все такие зонды могут включать общую заданную последовательность, как часть нацеливающего олигонуклеотида или как часть каркасного олигонуклеотида.

Может быть предоставлено несколько наборов зондов для связывания различных фрагментов двух или более хромосом человека, содержащих:

первый набор зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для первой хромосомы, и

второй набор зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для второй хромосомы, и, в некоторых случаях,

один или более дополнительных наборов зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для одной или более дополнительных хромосом. Зонды в пределах набора могут иметь заданную последовательность, которая является общей для этого набора, и отличается от заданных последовательностей зондов в других наборах.

Также могут быть предоставлены комплекты, содержащие наборы зондов в виде раствора в одном или более контейнерах.

Применение

Зонды, наборы зондов и комплекты, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для тестирования образцов на наличие целевых фрагментов нуклеиновых кислот. Они могут быть использованы для идентификации наличия определенного целевого фрагмента в образце фрагментированной нуклеиновой кислоты in vitro.

Один аспект включает применение зонда для анализа образца на наличие целевого фрагмента одноцепочечной нуклеиновой кислоты,

в котором зонд содержит нацеливающий олигонуклеотид, содержащий последовательность, которая является точно комплементарной к целевому фрагменту, а также расположенные в начале и в конце последовательности олигонуклеотида, которые гибридизируются смежно с целевым фрагментом на нацеливающем олигонуклеотиде,

причем гибридизация между целевым фрагментом и зондом делает целевой фрагмент основой для лигирования с последовательностями, расположенными в начале и в конце.

Примеры таких зондов и их использования в способах анализа образцов описаны более подробно в других местах настоящего описания. Применение включает тестирование образцов крови беременных женщин для выявления фетальной ДНК для диагностики таких хромосомных аномалий, как трисомия, и тестирование образцов пациентов на наличие опухолевой ДНК для диагностики или мониторинга наличия опухоли у пациента. Другие области применения включают анализ образцов материала на наличие микробной нуклеиновой кислоты, где обнаружение микробной нуклеиновой кислоты указывает на инфицирование материала микроорганизмом, который может быть таким инфекционным агентом, как бактерия, вирус или грибок. Образцом может быть ткань или кровь пациента.

Примеры

Следующий пример приведен для того, чтобы продемонстрировать и в дальнейшем проиллюстрировать некоторые варианты реализации и аспекты данного изобретения и не должен быть истолкован как ограничивающий его объем.

Пример 1

Протокол подходит для осуществления способа, иллюстрированного на фиг. 1, следующим образом:

1) 10 нг ДНК расщепляется с помощью 1 единицы рестриктазы в соответствующем буфере, совместимом с данным ферментом. Реакция инкубируется при 37°С в течение 1 ч, с последующей ферментативной дезактивацией при 80°С в течение 20 мин. 2) Фрагменты ДНК денатурируют до одноцепочечных фрагментов при 95°С в течение 10 мин и смешиваются с зондами и лигазой для образования кольцевых продуктов. Набор зондов в концентрации по 10 пМ каждый вместе с 1 ед. Амфилигазы (Эпицентр) добавляется в лигазный буфер и инкубируется при 55°С в течение 1 ч. 3) 1 ед. экзонуклеазы добавляется для удаления непрореагировавших зондов и их фрагментов. 1 ед экзонуклеазы Лямбда (Эпицентр) добавляется при 37°С в течение 1 ч в соответствующий экзонуклеазных буфер с последующей инактивацией фермента при 80°С в течение 20 мин. 4) Оставшиеся кольцевые продукты амплифицируются с помощью RCA. 1 ед. phi29 полимеразы (фирма "Нью Ингланд Биолоабс") и нуклеотиды (дНТФ) добавляются в соответствующих буфер при 37°С в течение 1 ч.

Пример 2

Протокол подходит для осуществления способа, иллюстрированного на фиг. 2, следующим образом:

1) 10 нг ДНК расщепляется с помощью 1 единицы рестриктазы в соответствующем буфере, совместимом с данным ферментом. Реакция инкубируется при 37°С в течение 1 ч, с последующей ферментативной дезактивацией при 80°С в течение 20 мин. 2) Фрагменты ДНК денатурируют до одноцепочечных фрагментов при 95°С в течение 10 мин и смешиваются с зондами и лигазой для образования линейных продуктов лигирования. Набор зондов в концентрации по 10 пМ каждый вместе с 1 ед. Амфилигазы (Эпицентр) добавляется в лигазный буфер и инкубируется при 55°С в течение 1 ч. 3) продукт лигирования улавливается с помощью магнитных микроносителей, покрытых стрептавидином. Для удаления непрореагировавших зондов и фрагментов раствор смешивается с 10 мл М-280 магнитных микроносителей, покрытых стрептавидином (фирма "Инвитроджен") в Трис-HCl (рН 7,5), 3,5 мМ ЭДТА и 0,07% Tween-20 в конечном объеме 200 мл, и инкубируется при комнатной температуре в течение 15 мин. После инкубации шарики собираются с помощью кольцевого магнита и супернатант удаляется.

Пример 3

Материалы и методы

Пробоподготовка У каждого субъекта отбирается по 10 мл крови в пробирку для внеклеточной ДНК (Стрек, Омаха, штат Небраска). Плазма выделяется из крови с помощью двойного центрифугирования (1600 г в течение 10 мин, а затем 16000 г в течение 10 мин, после перемещения пробирки после первого центрифугирования). Внеклеточная ДНК выделяется с помощью набора Квайджен для выделения циркулирующей внеклеточной нуклеиновой кислоты (Квайджен, Хильден, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Полученная ДНК элюируется в 50 мкл буфера (часть набора Квайджен).

Разработка зонда и каркаса Технология мультиплексной амплификации зонда, описанная в данном документе, осуществляет специфическую и одновременную амплификацию тысяч хромосомных фрагментов. Зонды предназначаются для захвата 2500-5000 фрагментов (мишеней) на любой из 21, 18, и 13 хромосом. Мишени размером 18-35 п.н. выбираются таким образом, чтобы они являлись уникальной последовательностью в геноме, имели унифицированный AT/ГС состав, не включали в себя ни известный полиморфизм ни вариации числа копий. Зонды, нацеленные на 2500 фрагментов любой из 13 и 18 хромосом, объединяются вместе с 5000 зондами, нацеленными на фрагменты 21 хромосомы, чтобы создать единый пул олиго зондов.

Пример последовательности зондов, "N" представляет собой последовательность, комплементарную цели: ATGTGACCCTTCCGTCTGTTGAGTTAGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCGTGCCTTGTCATTCGGGAGCACTAACTGCTG (SEQ ID NO: 1)

Каркасы, с последовательностями, которые расположены в начале и в конце и комплементарными к концевым последовательностям зонда, были разработаны для того, чтобы включать в себя мотивы последовательностей как для секвенирования, так и для цифрового подсчета. Два каркаса использовались в экспериментах, которые описаны в разделе результаты; один комплементарный к зондам, которые нацелены на 13 и 18 хромосомы:

(/5Phos/CGCACACGATTAAGGTCCAGTCACAGGCAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGT AGGGAAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATTTCA TGCTGCTAACGGTCGAGTCGGACAGGTGGCTCCACTAAATAGACGCA); SEQ ID NO: 2, и второй нацелен на 21 хромосому: (/5Phos/GGCCTAACTCAACAGACGGAAGGGTCACATAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGG AAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATTTCATGCTGCTAACGGTCGAGCAGTTAGTGCTCCCGAATGACAAGGCACGA; SEQ ID NO: 3).

Биохимический протокол зонда: 50 мкл очищенной внеклеточной ДНК расщепляется с помощью 5 ед. MseI (Нью Ингланд Биолоабс) и 1х БСА буфера (Нью Ингланд Биолоабс) в общем объеме 55 мкл при 37°С в течение 30 мин с последующей тепловой инактивацией при 65°С в течение 20 мин. Затем расщепленная ДНК смешиваются с литерующим миксом вместе с зондами и каркасами. 55 мкл расщепленной ДНК смешивается с зондами (1 пМ/зонд), каркасами (60 нМ каждый), 1х буфером для лигирования (Эпицентр), 100 ед. Амфилигазы (Эпицентр), 1 мМ НАД, и 5 мМ магния²⁺ в общем объеме 70 мкл. Расщепленные фрагменты сначала денатурируют до одноцепочечной ДНК при 95°С в течение 5 мин с последующей гибридизацией и лигированием при 55°С в течение 16 ч. Затем литерованный микс обрабатывается экзонуклеазами для удаления оставшихся линейных молекул ДНК. Реакция лигирования смешивается с 20 ед. ExoI (НЕБ) и 5 ед. ЕхоIII (НЕБ) и 1х БСА в общем объеме 75 мкл при 37°С в течение 60 мин с последующей тепловой инактивацией при 65°С в течение 10 мин.

Анализ: Для проведения секвенирования, кольцевые продукты, которые подверглись воздействию Ехо, амплифицируются с подходящими для Illumina праймерами для секвенирования, а затем загружаются в Illumina Miseq в соответствии с рекомендованным производителем протоколом.

Для цифрового анализа, реакции, связанные с воздействием Ехо, подвергают амплификации по типу катящегося кольца (RCA) для генерации дискретных ДНК копий конкатемерных кольцевых продуктов. 37,5 мкл кольцевых структур, подданных воздействию Ехо, смешиваются с 4 мМ DTT, 3 ед. phi29 полимеразы (НЕБ), 0,1 мМ праймера, 1 мМ миксом дНТФ (НЕБ) и 1х БСА, в общем объеме 50 мкл, и инкубируются при 37°С в течение 1 ч с последующей термоинактивацией при 65°С в течение 10 мин. Затем реакция RCA метится комплементарными к последовательности каркаса флуоресцентными олигонуклеотидами. 50 мкл продуктов RCA смешиваются с 0,1% Tween 20 (Сигма), 5 нМ меченных олигонуклеотидов и 2х SSC (Сигма), в общем объеме 100 мкл. Наконец, меченые RCA-продукты осаждаются на предметное стекло микроскопа, покрытое полилизином (Сигма), и подсчитываются с помощью флуоресцентного микроскопа.

Результаты

Зондовый метод, описанный в данном документе, демонстрируется на Illumina секвенировании и цифровой системой подсчета. Чтобы продемонстрировать эффективность зондового метода, образец ДНК с трисомией по 21 хромосоме смешивается с ДНК, выделенной из нормальных образцов плазмы (3-5 мл плазмы) в различных концентрациях. Затем образцы исследуются с помощью зондового метода и оцениваются посредством секвенирования.

Для результатов, показанных на фиг. 8, 100 нг ДНК клеточной линии анализируется согласно протоколу, описанному выше. 10000 зондов смешиваются, чтобы специфически объединиться в кольцевые структуры с соответствующими 10000 хромосомными фрагментами 13, 18, и 21 хромосом. Затем, 10000 полученных кольцевых структур амплифицируются с соответствующими ПЦР-праймерами Illumina и анализируются в геле перед секвенированием. Линия 1 соответствует маркеру длины ДНК, линия 2 образцу ДНК после расщепления, и линия 3 продукту ПНР с 10000 амплифицированных фрагментов.

Для результатов, показанных на фиг. 9, 12 нормальных образцов плазмы анализировались параллельно с образцами ДНК с трисомией по 21 хромосоме в различных концентрациях. ДНК выделялась и обрабатывалась по протоколу для зонда 10K-plex и, потом секвенировалась на секвенаторе Illumina. Используя доверительный интервал, обеспечивающий 99% специфичности, положительные образцы детектируются с 90% чувствительностью на основании предполагаемого нормального распределения.

Чтобы продемонстрировать принцип преобразования целевых фрагментов в меченые ДНК-объекты, 10% ДНК с трисомией по 21 хромосоме добавляется к 20 нг ДНК нормальной клеточной линии и осуществляется с помощью зондового метода. Образующиеся меченые RCA-продукты были случайным образом нанесены на предметное стекло микроскопа и подсчитаны. Зонды, нацеленные на фрагменты, полученные из хромосомы 21 метили одним цветом, а фрагменты, полученные из Хр. 13 и 18 контрольным цветом. Эти результаты приведены на фиг. 10. Панель (А) фиг. 10 изображает изображение с микроскопа, показывая меченные и детектированные продукты RCA. Помечая все фрагменты из хромосомы 13 одним флуорофором и фрагменты из эталонной хромосомы вторым флуорофором, можно достичь измерения соотношения. Панель (В): 20 нг ДНК обрабатывается по протоколу для зонда 10K-Plex и преобразуется в меченные продукты RCA. Продукты RCA анализируются параллельно с образцами, несущими дополнительно 10% ДНК с трисомией по 21 хромосоме. 12 нормальных образцов ДНК (образец №1-12) анализируются параллельно с тремя положительными образцами (образец №13-15).

Дальнейшее описание

Следующие пункты являются частью описания.

1. Способ анализа образца на наличие целевого фрагмента нуклеиновой кислоты, содержащий

(i) получение образца фрагментированной нуклеиновой кислоты

(ii) обеспечение денатурирующих условий, при которых целевые фрагменты являются одноцепочечными

(iii) контактирование образца с зондом нуклеиновой кислоты, содержащий нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент и содержит внутреннюю последовательность, комплементарную цели, таким образом, что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида, и

последовательности, расположенные в начале и в конце, имеющие свободные 5'- и 3'-концы соответственно, причем последовательности, расположенные в начале и в конце, являются комплементарными вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно,

(iv) обеспечение условий отжига при которых последовательности начала и конца гибридизируются с фланкирующими последовательностями, а целевые фрагменты, если они присутствуют, гибридизуются с последовательностями, комплементарными цели, зондов, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5'-концом последовательности начала и 3'-концом последовательности конца

(v) обеспечение условий для лигирования при которых, если целевой фрагмент присутствует, 3'-конец целевого фрагмента лигирует с 5'-концом последовательности, расположенной в начале, с образованием первого стыка лигирования, и 5'-конец целевого фрагмента лигирует с 3'-концом последовательности, расположенной в конце, с образованием второго стыка лигирования, продуцируя продукт двойного лигирования, который включает в себя непрерывную цепь нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности, расположенные в начале и в конце и целевой фрагмент,

(vi) детектирование наличия продукта двойного лигирования,

причем детектирование продукта двойного лигирования указывает на присутствие целевого фрагмента в образце.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образец фрагментированной нуклеиновой кислоты расщеплен ферментом рестрикции, а целевой фрагмент является фрагментом рестрикции.

3. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что 5'-конец последовательности, расположенной в начале, и 3'-конец целевого фрагмента гибридизируется с примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду нуклеотидами, и 3'-конец последовательности, расположенной в конце, и 5'-конец целевого фрагмента гибридизируется с примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду нуклеотидами.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что этап выявления продукта двойного лигирования содержит создание условий для амплификации через первый и второй стык лигирования непрерывной цепи нуклеиновой кислоты, и детектирование с целью определить присутствует ли продукт амплификации.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что непрерывная цепь нуклеиновой кислоты, содержащая последовательности, лежащие в начале и в конце, и целевой фрагмент являются кольцом нуклеиновой кислоты.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что этап детектирование продукта двойного лигирования включает создание условий для репликации по типу катящегося кольца, и детектирование с целью определить присутствует ли продукт репликации по типу катящегося кольца.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что репликация по типу катящегося кольца является сверхразветвленной репликацией по типу катящегося кольца.

8. Способ по любому из п.п. 5-7, отличающийся тем, что зонд содержит последовательности, находящиеся в начале и в конце на одной молекуле нуклеиновой кислоты.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что зонд содержит каркасный олигонуклеотид, имеющий последовательности, расположенные в начале и в конце на его 5'- и 3'-концах соответственно, причем последовательности, расположенные в начале и в конце каркасного олигонуклеотида связываются in trans с фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида в условиях отжига.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что каркасный олигонуклеотид содержит заданную последовательность между последовательностями, расположенными в начале и в конце, причем заданная последовательность не является комплементарной с другими местами зонда или с целевым фрагментом.

11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и в конце каркасного олигонуклеотида являются примыкающими.

12. Способ по любому из пл. 5-8, отличающийся тем, что последовательности, находящиеся в начале и в конце, расположены на концах нацеливающего олигонуклеотида и связываются in cis с фланкирующими последовательностями в условиях отжига.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что нацеливающий олигонуклеотид содержит заданную последовательность между нацеливающим олигонуклеотидом и последовательностями, расположенными в начале и/или в конце, причем заданная последовательность не является комплементарной с другими местами зонда или с целевым фрагментом.

14. Способ по любому из п.п. 1-7, отличаюпшйся тем, последовательность, находящаяся в конце расположена на 3'-конце нацеливающего нуклеотида, и зонд содержит каркасный олигонуклеотид, имеющий последовательность, находящуюся в начале на его 5'-конце,

причем, в условиях отжига, последовательность, расположенная в конце связывается in cis с нижележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида, и последовательность, расположенная в начале, каркасного олигонуклеотида связывается in trans с вышележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что каркасный олигонуклеотид содержит пару последовательностей обращенных повторов, причем

в условиях отжига последовательности обращенных повторов образуют шпилькообразную структуру, тем самым позиционируя 3'-конец каркасного олигонуклеотида в соприкасании с 5'-концом нацеливающего олигонуклеотида, и отличающийся тем, что

в условиях лигирования, 5'-конец нацеливающего олигонуклеотида лигирован с 3'-концом каркасного олигонуклеотида, таким образом, что продукт двойного лигирования представляет собой кольцо нуклеиновой кислоты, содержащее нацеливающий олигонуклеотид, целевой фрагмент и каркасный олигонуклеотид.

16. Способ по любому из п.п. 1-7, отличающийся тем, последовательность, находящаяся в начале расположена на 5'-конце нацеливающего нуклеотида, и зонд содержит каркасный олигонуклеотид, имеющий последовательность, находящуюся в конце на его 3'-конце,

причем, в условиях отжига, последовательность, находящаяся в начале связывается in cis с вышележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида, и последовательность, находящаяся в конце, каркасного олигонуклеотида связывается in trans с нижележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что каркасный олигонуклеотид содержит пару последовательностей обращенных повторов, причем

в условиях отжига последовательности обращенных повторов образуют шпилькообразную структуру, тем самым позиционируя 5'-конец каркасного олигонуклеотида в соприкасании с 3'-концом нацеливающего олигонуклеотида, и отличающийся тем, что

в условиях лигирования, 3'-конец нацеливающего олигонуклеотида лигирован с 5'-концом каркасного олигонуклеотида, таким образом, что продукт двойного лигирования представляет собой кольцо нуклеиновой кислоты, содержащее нацеливающий олигонуклеотид, целевой фрагмент и каркасный олигонуклеотид.

18. Способ по любому из п.п. 14-17, отличающийся тем, что каркасный олигонуклеотид содержит заданную последовательность между последовательностью обращенного повтора, таким образом, что в условиях отжига каркасный олигонуклеотид образует шпилькообразную петлю.

19. Способ по любому из п.п. 1-4, отличающийся тем, что непрерывная цепь нуклеиновой кислоты, содержащая последовательности, лежащие в начале и в конце, и целевой фрагмент являются линейной цепью нуклеиновой кислоты.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, последовательность, находящаяся в конце расположена на 3'-конце нацеливающего нуклеотида, и зонд содержит каркасный олигонуклеотид, имеющий последовательность, находящуюся в начале, на его 5'-конце,

причем, в условиях отжига, последовательность, расположенная в конце связывается in cis с нижележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида, и последовательность, расположенная в начале, каркасного олигонуклеотида связывается in trans с вышележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида.

21. Способ по любому из п.п. 14, 15 или 20, отличающийся тем, что нацеливающий олигонуклеотид содержит заданную последовательность между нижележащей фланкирующей последовательностью и последовательностью, расположенной в конце, таким образом, что в условиях отжига, нацеливающий олигонуклеотид образует шпилькообразную петлю.

22. Способ по п. 19, отличающийся тем, последовательность, находящаяся в начале расположена на 5'-конце нацеливающего нуклеотида, и зонд содержит каркасный олигонуклеотид, имеющий последовательность, находящуюся в конце, на его 3'-конце,

причем, в условиях отжига, последовательность, находящаяся в начале связывается in cis с вышележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида, и последовательность, находящаяся в конце, каркасного олигонуклеотида связывается in trans с нижележащей фланкирующей последовательностью нацеливающего олигонуклеотида.

23. Способ по любому из п.п. 16, 17 или 22, отличающийся тем, что нацеливающий олигонуклеотид содержит заданную последовательность между последовательностью, расположенной в начале и вышележащей фланкирующей последовательностью, таким образом, что в условиях отжига, нацеливающий олигонуклеотид образует шпилькообразную петлю.

24. Способ по любому из п.п. 14-18 или 20-23, отличающийся тем, что каркасный олигонуклеотид несет фрагмент захвата.

25. Способ по п. 19, отличающийся тем, что зонд содержит каркасный олигонуклеотид, содержащий последовательность, расположенную в начале, имеющую свободный 5'-конец, и каркасный олигонуклеотид, содержащий последовательность, расположенную в конце, имеющую свободный 3'-конец, причем, в условиях отжига, последовательности, расположенные в начале и в конце связываются in trans с фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что один или оба каркасных олигонуклеотида дополнительно содержат заданную последовательность, причем заданная последовательность не является комплементарной с другими местами зонда или с целевым фрагментом.

27. Способ по п. 25 или п. 26, отличающийся тем, что один из каркасных олигонуклеотидов несет фрагмент захвата.

28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что другой каркасный олигонуклеотид несет гетерогенную метку.

29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что метка является флуорофором.

30. Способ по п. 24 или по любому из п.п. 27-29, отличающийся тем, что этап детектирования присутствия продукта двойного лигирования включает захватывание каркасного олигонуклеотида на подложке с помощью фрагмента захвата, промывание подложки для удаления нелигированных зондов и удержание захваченной фракции, включающей подложку и захваченный каркасный олигонуклеотид, а также тестирование на наличие продукта двойного лигирования в захваченной фракции.

31. Способ по п. 28 или по п. 29, отличающийся тем, что этап детектирования присутствия продукта двойного лигирования включает захватывание каркасного олигонуклеотида на подложке с помощью фрагмента захвата, промывание подложки для удаления нелигированных зондов и удержание захваченной фракции, включающей подложку и захваченный каркасный олигонуклеотид, а также тестирование на наличие метки в захваченной фракции.

32. Способ по п. 24 или по любому из п.п. 27-31, отличающийся тем, что фрагмент захвата является биотином.

33. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что последовательность, комплементарная цели, имеет длину от 10 до 30 нуклеотидов.

34. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что последовательность, комплементарная цели, имеет несовпадение с целевым фрагментом меньше чем 5 пар оснований.

35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что последовательность, комплементарная цели, является точно комплементарной с целевым фрагментом.

36. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что фланкирующие последовательности каждая имеет длину от 10 до 30 нуклеотидов.

37. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что вышележащие и нижележащие фланкирующие последовательности отличаются друг от друга.

38. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что последовательность, расположенная в начале, имеет несовпадение с вышележащей фланкирующей последовательностью менее чем 5 пар оснований и последовательность, расположенная в конце, имеет несовпадение с нижележащей фланкирующей последовательностью менее чем 5 пар оснований.

39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что последовательность, находящаяся в начале является точно комплементарной к вышележащей фланкирующей последовательности и последовательность, находящаяся в конце является точно комплементарной к нижележащей фланкирующей последовательности.

40. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что нацеливающий олигонуклеотид является линейным.

41. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что образец представляет собой образец фрагментированных хромосом человека, а целевой фрагмент является фрагментом генома человека специфичным для одной хромосомы.

42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что целевой фрагмент является специфичным для одного локуса генома человека.

43. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота зонда является ДНК.

44. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем что, способ содержит мультиплексное тестирование для многочисленных различных фрагментов целевой нуклеиновой кислоты с параллельным использованием множества зондов.

45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что способ включает контактирование образца фрагментированных хромосом с набором зондов для связывания нескольких фрагментов хромосомы, причем каждый зонд в наборе используется для связывания другого целевого фрагмента специфичного для этой хромосомы.

46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что зонды имеют общую заданную последовательность.

47. Способ по п. 44, отличающийся тем, что способ включает контактирование образца фрагментированных хромосом с наборами зондов для связывания нескольких фрагментов двух или более хромосом, причем наборы зондов содержат:

первый набор зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для первой хромосомы, и

второй набор зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для второй хромосомы, и, в некоторых случаях,

один или более дополнительных наборов зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для одной или более дополнительных хромосом.

48. Способ по п. 47, отличающийся тем, что каждый набор зондов включает по меньшей мере 500 различных зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для хромосомы.

49. Способ по п. 47 или п. 48, отличающийся тем, что зонды в пределах набора имеют заданную последовательность, которая является общей для этого подмножества, и отличается от заданных последовательностей зондов в других наборах.

50. Способ по п. 49, включающий определение относительных количеств двух или более хромосом в образце путем детектирования продуктов двойного лигирования для каждого набора зондов и детектирования относительных количеств заданных последовательностей в указанных продуктах.

51. Способ по любому из п.п. 45-50, отличающийся тем, что хромосома или хромосомы являются человеческими.

52. Зонд нуклеиновой кислоты для связывания фрагмента одноцепочечной целевой нуклеиновой кислоты, отличающийся тем, что зонд содержит

нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент и содержит внутреннюю последовательность, комплементарную цели, таким образом, что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида, и

последовательности, находящиеся в начале и в конце, имеющие свободные 5'- и 3'-концы соответственно, причем последовательности, находящиеся в начале и в конце, являются комплементарными вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно,

таким образом, что в условиях отжига, при наличии целевого фрагмента, последовательности, находящиеся в начале и в конце, гибридизируются с фланкирующими последовательностями, задавая пробел между 5'-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательности, находящейся в конце, причем целевой фрагмент гибридизируется с последовательностью, комплементарной цели, в пробеле, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5'-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательности, находящейся в конце, и причем

гибридизация целевого фрагмента в пробеле завершает кольцо нуклеиновой кислоты, кольцо содержит целевой фрагмент и последовательности, расположенные в начале и в конце.

53. Зонд нуклеиновой кислоты по п. 52, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и/или в конце, являются присоединенными к заданной последовательности, причем заданная последовательность не является комплементарной с другими местами зонда или с целевым фрагментом.

54. Зонд нуклеиновой кислоты по п. 52 или п. 53, отличающийся тем, что одна молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательности, расположенные в начале и в конце.

55. Зонд по п. 52 или п. 53, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и в конце, отделены от нацеливающего олигонуклеотида и связываются in trans с фланкирующими последовательностями.

56. Зонд по п. 55, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и в конце, находятся на 5'- и 3'-концах, соответственно, каркасного олигонуклеотида.

57. Зонд по п. 56, отличающийся тем, что каркасный олигонуклеотид содержит заданную последовательность между последовательностями, расположенными в начале и в конце, причем заданная последовательность не является комплементарной с другими местами зонда или с целевым фрагментом.

58. Зонд по п. 56, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и в конце, каркасного олигонуклеотида являются примыкающими.

59. Зонд нуклеиновой кислоты для связывания фрагмента одноцепочечной целевой нуклеиновой кислоты, отличающийся тем, что зонд содержит

нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент и содержит внутреннюю последовательность, комплементарную цели, таким образом, что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими. и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида, и

последовательности, находящиеся в начале и в конце, имеющие свободные 5'- и 3'-концы соответственно, причем последовательности олигонуклеотида, находящиеся в начале и в конце, являются комплементарными вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно,

таким образом, что в условиях отжига, при наличии целевого фрагмента, последовательности, находящиеся в начале и в конце, гибридизируются с фланкирующими последовательностями, задавая пробел между 5'-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательности, находящейся в конце, причем целевой фрагмент гибридизируется с последовательностью, комплементарной цели, в пробеле, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5'-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательности, находящейся в конце, и причем

последовательность, находящаяся в начале, является 5'-концом нацеливающего олигонуклеотида и/или последовательность находящаяся в конце, является 3'-концом нацеливающего олигонуклеотида, таким образом, чтобы гибридизация целевого фрагмента в пробеле завершала цепь нуклеиновой кислоты, содержащей целевой фрагмент, последовательности, лежащие в начале и в конце, последовательность, комплементарную цели, и фланкирующие последовательности.

60. Зонд по п. 52 или п. 59, отличающийся тем, что последовательности, лежащие в начале и в конце, находятся на концах нацеливающего олигонуклеотида и связываются in cis с фланкирующими последовательностями.

61. Зонд по п. 52 или п. 59, отличающийся тем, что последовательность, находящаяся в конце, является 3'-концом нацеливающего нуклеотида, а последовательность, находящаяся в начале, является 5'-концом каркасного нуклеотида отдельно от нацеливающего нуклеотида.

62. Зонд по п. 52 или п. 59, отличающийся тем, что последовательность, находящаяся в начале, является 5'-концом нацеливающего нуклеотида, а последовательность, находящаяся в конце, является 3'-концом каркасного нуклеотида отдельно от нацеливающего нуклеотида.

63. Зонд по п. 61 или п. 62, отличающийся тем, что каркасный олигонуклеотид дополнительно содержит заданную последовательность, причем заданная последовательность не является комплементарной с другими местами зонда или с целевым фрагментом.

64. Зонд нуклеиновой кислоты для связывания фрагмента одноцепочечной целевой нуклеиновой кислоты, отличающийся тем, что зонд содержит

нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент и содержит внутреннюю последовательность, комплементарную цели, таким образом что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида,

каркасный олигонуклеотид, содержащий последовательность, расположенную в начале, имеющую свободный 5'-конец, и

каркасный олигонуклеотид, содержащий последовательность, расположенную в конце, имеющую свободный 3'-конец,

причем, последовательности, находящиеся в начале и в конце, являются комплементарными вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно, и причем

один каркасный олигонуклеотид несет фрагмент захвата, а другой каркасный олигонуклеотид несет гетерогенную метку,

таким образом, что в условиях отжига, при наличии целевого фрагмента, последовательности, находящиеся в начале и в конце, гибридизируются с фланкирующими последовательностями, задавая пробел между 5'-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательности, находящейся в конце, причем целевой фрагмент гибридизуется с последовательностью, комплементарной цели, в пробеле, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5'-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательности, находящейся в конце, и причем

гибридизация целевого фрагмента в пробеле завершает цепь нуклеиновой кислоты, содержащую целевой фрагмент и последовательности, расположенные в начале и в конце, причем цепь несет фрагмент захвата и метку.

65. Зонд по п. 64, отличающийся тем, что фрагмент захвата является биотином.

66. Зонд по п. 64 или п. 65, отличающийся тем, что метка является флуорофором.

67. Зонд по любому из п.п. 64-66, отличающийся тем, что один или оба каркасных олигонуклеотида дополнительно содержат заданную последовательность, причем заданная последовательность не является комплементарной с другими местами зонда или с целевым фрагментом.

68. Зонд по любому из п.п. 52-67, отличающийся тем, что нацеливающий олигонуклеотид дополнительно содержит заданную последовательность, которая не является комплементарной с другими местами зонда или с целевым фрагментом.

69. Зонд по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что последовательность, комплементарная цели, имеет длину от 10 до 30 нуклеотидов.

70. Зонд по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что последовательность, комплементарная цели, имеет несовпадение с целевым фрагментом меньше чем 5 пар оснований.

71. Зонд по п. 70, отличающийся тем, что последовательность, комплементарная цели, является точно комплементарной с целевым фрагментом.

72. Зонд по любому из п.п. 52-71, отличающийся тем, что фланкирующие последовательности каждая имеет длину от 10 до 30 нуклеотидов.

73. Зонд по любому из п.п. 52-72, отличающийся тем, что вышележащие и нижележащие фланкирующие последовательности нацеливающего олигонуклеотида отличаются друг от друга.

74. Зонд по любому из п.п. 52-73, отличающийся тем, что последовательность, расположенная в начале, имеет несовпадение с вышележащей фланкирующей последовательностью менее чем 5 пар оснований и последовательность, расположенная в конце, имеет несовпадение с нижележащей фланкирующей последовательностью менее чем 5 пар оснований.

75. Зонд по п. 74, отличающийся тем, что последовательности, лежащие в начале и в конце, являются полностью комплементарными с фланкирующими последовательностями.

76. Зонд по любому из п.п. 52-75, отличающийся тем, что нацеливающий олигонуклеотид является линейным.

77. Зонд по любому из п.п. 52-76, отличающийся тем, что целевой фрагмент является фрагментом эндонуклеазы рестрикции.

78. Зонд по любому из п.п. 52-77, отличающийся тем, что целевой фрагмент является фрагментом генома человека.

79. Зонд по п. 78, отличающийся тем, что целевой фрагмент является фрагментом генома человека специфичным для одной хромосомы.

80. Зонд п. 79, отличающийся тем, что целевой фрагмент является специфичным для одного локуса генома человека.

81. Зонд по любому из п.п. 52-80, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота зонда является ДНК.

82. Набор зондов для связывания одноцепочечных целевых фрагментов нуклеиновой кислоты, содержащий множество зондов по любому из п.п. 52-81, зондов, имеющих множество различных последовательностей, комплементарных цели, для связывания множества различных целевых фрагментов.

83. Набор зондов по п. 82, который предназначен для связывания нескольких фрагментов хромосомы человека, причем каждый зонд в наборе используется для связывания другого целевого фрагмента специфичного для этой хромосомы.

84. Набор зондов по п. 83, отличающийся тем, что зонды имеют общую заданную последовательность.

85. Наборы зондов для связывания различных фрагментов двух или более хромосом человека, содержащие:

первый набор зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для первой хромосомы, и

второй набор зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для второй хромосомы, и, в некоторых случаях,

один или более дополнительных наборов зондов для связывания множества целевых фрагментов, специфичных для одной или более дополнительных хромосом.

86. Набор зондов по п. 85, отличающийся тем, что зонды в пределах набора имеют заданную последовательность, которая является общей для этого набора, и отличается от заданных последовательностей зондов в других наборах.

87. Комплект, содержащий набор или наборы зондов по любому из п.п. 82-86 в растворе в одном или более контейнерах.

88. Использование зонда по любому из п.п. 52-81, набор зондов по любому из п.п. 82-86, или комплект по п. 87, для проверки пробы на наличие целевого фрагмента нуклеиновой кислоты.

89. Применение зонда для анализа образца на наличие целевого фрагмента одноцепочечной нуклеиновой кислоты,

в котором зонд содержит нацеливающий олигонуклеотид, содержащий последовательность, которая является точно комплементарной к целевому фрагменту, а также расположенные в начале и в конце последовательности олигонуклеотида, которые гибридизируются смежно с целевым фрагментом на нацеливающем олигонуклеотиде,

причем гибридизация между целевым фрагментом и зондом делает целевой фрагмент основой для лигирования с последовательностями, расположенными в начале и в конце.

90. Применение по п. 89, отличающиеся тем, что зонд является таким, как определено по любому из п.п. 52-81.

Вариант реализации изобретения обеспечивает способ обработки образца нуклеиновой кислоты, включающий: а) гибридизацию образца, содержащего целевой фрагмент к зонду нуклеиновой кислоты, включающему: i. последовательность, расположенную в начале и последовательность, расположенную в конце, где последовательности, расположенные в начале и в конце, находятся на концах первой олигонуклеотидной молекулы; и ii. последовательность шунта, которая содержит, в следующем порядке: вышележащую фланкирующую последовательность, которая является комплементарной к последовательности, расположенной в начале; последовательность, комплементарную цели, которая является комплементарной к целевому фрагменту; и нижележащую фланкирующую последовательность, которая является комплементарной к последовательности, расположенной в конце; в результате чего получается гибридизационный продукт, в котором концы целевого фрагмента являются смежными для лигирования к концам последовательностей, расположенных в начале и в конце, в первой молекуле олигонуклеотида; и б) лигирование концов целевого фрагмента к концам последовательностей, расположенных в начале и в конце, первой молекулы олигонуклеотида, в результате чего получается кольцевой продукт, содержащий целевой фрагмент и последовательности, расположенные в начале и в конце.

В любом варианте реализации способ может дополнительно включать амплификацию кольцевого продукта путем амплификации по типу катящегося кольца с использованием праймера, который гибридизуется с первой молекулой олигонуклеотида или с последовательностью шунта. В этих вариантах реализации способ может дополнительно включать количественное определение числа продуктов, полученных в результате амплификации по типу катящегося кольца, таким образом обеспечивая оценку количества указанного целевого фрагмента в образце.

В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность шунта может находиться в первой олигонуклеотидной молекуле.

В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность шунта может находиться во второй олигонуклеотидной молекуле.

В любых вариантах реализации изобретения последовательность, комплементарная цели, может иметь длину от 10 до 30 нуклеотидов.

В любых вариантах реализации изобретения последовательность, комплементарная цели, может иметь одно или более несовпадение с целевым фрагментом.

В любых вариантах реализации изобретения фланкирующие последовательности могут иметь длину от 10 до 40 нуклеотидов.

В любом варианте реализации изобретения образец может быть расщеплен ферментом рестрикции.

В любом варианте реализации изобретения образец может содержать геномную ДНК, например, геномную ДНК человека. В этих вариантах реализации изобретения образец может содержать внеклеточную ДНК, выделенную из крови. Например, в любом варианте реализации изобретения образец может содержать внеклеточную ДНК, выделенную из крови беременного человека.

В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность шунта может находиться во второй олигонуклеотидной молекуле, которая содержит фрагмент захвата, например, фрагмент биотина. В данных вариантах реализации изобретения способ может включать: в) иммобилизацию кольцевого продукта путем связывания фрагмента захвата с твердой фазой; а также

г) промывание твердой фазы для удаления нелигированных нуклеиновых кислот и других компонентов реакции, тем самым приумножая для циклического продукта.

В любом варианте реализации изобретения целевой фрагмент может быть из 21, 13 или 18 хромосомы.

В некоторых вариантах реализации изобретения способ может включать гибридизацию образца с набором, по меньшей мере, 50 указанных зондов, в котором указанные зонды метят различные фрагменты на той же самой хромосоме, и в котором способ приводит к множеству циклических продуктов, которые содержат целевые фрагменты.

В этих вариантах реализации способ может включать в себя гибридизацию образца с первым набором и со вторым набором из указанных наборов зондов, причем первый и второй наборы нацелены на первую хромосому и на вторую хромосому, соответственно, амплифицируя циклические продукты путем амплификации по типу катящегося кольца (RCA) и сравнивая количество продуктов RCA, соответствующих первой хромосоме с количеством продуктов RCA, соответствующих первой хромосоме.

В этих вариантах реализации способ может включать в себя гибридизацию образца с первым набором и со вторым набором из указанных наборов зондов, причем первый и второй наборы нацелены на первый и второй регионы на хромосоме, соответственно, амплифицируя циклические продукты путем амплификации по типу катящегося кольца (RCA) и сравнивая количество продуктов RCA, соответствующих первому региону с количеством продуктов RCA, соответствующих второму региону.

Также, данный документ предусматривает композицию, содержащую зонд нуклеиновой кислоты, как было описано выше. В некоторых вариантах реализации изобретения зонд нуклеиновой кислоты может содержать: i. последовательность, расположенную в начале и последовательность, расположенную в конце, где последовательности, расположенные в начале и в конце, находятся на противоположных концах первой олигонуклеотидной молекулы; и ii. последовательность шунта, которая содержит, в следующем порядке: вышележащую фланкирующую последовательность, которая является комплементарной к последовательности, расположенной в начале; последовательность, комплементарную цели, которая является комплементарной к целевому фрагменту в геноме человека; и нижележащую фланкирующую последовательность, которая является комплементарной к последовательности, расположенной в конце; причем зонд разработан таким образом, что, когда первый олигонуклеотид, последовательность шунта, и целевой фрагмент гибридизуются друг с другом, то концы целевого фрагмента являются смежными для лигирования с концами последовательностей, расположенных в начале и в конце, в первой молекуле олигонуклеотида.

В любой композиции варианта реализации изобретения композиция может содержать первый набор из, по меньшей мере, 50 зондов нуклеиновых кислот, в которых последовательности, комплементарные цели, указанных зондов являются комплементарными к различным целевым фрагментам первой хромосомы человека, например, хромосомы человека 21, 13 или 18. В этих вариантах реализации изобретения композиция может опционально содержать второй набор из, по меньшей мере, 50 указанных зондов нуклеиновых кислот, в которых последовательности, комплементарные цели, указанных зондов второго набора являются комплементарными к различным целевым фрагментам второй хромосомы человека, например, хромосом 13 или 18 (если первая хромосома является хромосомой 21).

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>Dahl, Carl OF

Ericsson, John O

<120>Nucleic Acid Probe and Method of Detecting Genomic Fragments

<130>VANA-001WO

<150>GB 1321191.7

<151>2013-12-02

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>93

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic oligonucleotide

<220>

<221>misc_feature

<222>(31)..(60)

<223>positions 31 to 60 represent a target complementary sequence on

human chromosome 21.

<400>1

atgtgaccct tccgtctgtt gagttaggcc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

tcgtgccttg tcattcggga gcactaactg ctg 93

<210>2

<211>152

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic oligonucleotide

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>c has 5' phosphate

<220>

<221>misc_feature

<222>(64)..(73)

<223>n is a, c, g, or t

<400>2

cgcacacgat taaggtccag tcacaggcag agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag 60

tgtnnnnnnn nnngtgtaga tctcggtggt cgccgtatca tttcatgctg ctaacggtcg 120

agtcggacag gtggctccac taaatagacg ca 152

<210>3

<211>152

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic oligonucleotide

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>g has a 5' phosphate

<220>

<221>misc_feature

<222>(64)..(73)

<223>n is a, c, g, or t

<400>3

ggcctaactc aacagacgga agggtcacat agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag 60

tgtnnnnnnn nnngtgtaga tctcggtggt cgccgtatca tttcatgctg ctaacggtcg 120

agcagttagt gctcccgaat gacaaggcac ga 152

<---

1. Зонд нуклеиновой кислоты для связывания одноцепочечного целевого фрагмента нуклеиновой кислоты, причем зонд содержит

нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент, и содержит внутреннюю комплементарную цели последовательность, таким образом, что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида, и

последовательности, находящиеся в начале и в конце, имеющие свободные 5'- и 3'-концы соответственно, причем последовательности, находящиеся в начале и в конце, являются комплементарными вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно, так, что в условиях отжига, при наличии целевого фрагмента, последовательности, находящиеся в начале и в конце, гибридизируются с фланкирующими последовательностями, задавая пробел между 5'-концом последовательности, находящейся в начале, и 3'-концом последовательности, находящейся в конце, причем целевой фрагмент гибридизируется с последовательностью, комплементарной цели, в пробеле, таким образом позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5-концом последовательности, находящейся в начале, и 3'-концом последовательности, находящейся в конце, и при этом

гибридизация целевого фрагмента в пробеле завершает кольцо нуклеиновой кислоты, причем кольцо содержит целевой фрагмент и последовательности, расположенные в начале и в конце.

2. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и/или в конце, являются присоединенными к заданной последовательности, причем заданная последовательность не является комплементарной другим местам зонда или целевому фрагменту.

3. Зонд по п. 1 или 2, отличающийся тем, что одна молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательности, расположенные в начале и в конце.

4. Зонд по п. 1 или 2, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и в конце, отделены от нацеливающего олигонуклеотида и связываются in trans с фланкирующими последовательностями.

5. Зонд по п. 4, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и в конце, находятся на 5'- и 3'-концах, соответственно, каркасного олигонуклеотида.

6. Зонд по п. 5, отличающийся тем, что каркасный олигонуклеотид содержит заданную последовательность между последовательностями, расположенными в начале и в конце, причем заданная последовательность не является комплементарной другим местам зонда или целевому фрагменту.

7. Зонд по п. 5, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и в конце каркасного олигонуклеотида, являются примыкающими.

8. Зонд по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что целевой фрагмент является фрагментом генома человека.

9. Зонд по п. 8, отличающийся тем, что целевой фрагмент является фрагментом генома человека, специфичным для одной хромосомы.

10. Зонд по п. 9, отличающийся тем, что целевой фрагмент является специфичным для одного локуса генома человека.

11. Набор зондов для связывания одноцепочечных целевых фрагментов нуклеиновой кислоты, содержащий множество зондов по любому из пп. 1-10, при этом зонды имеют множество различных последовательностей, комплементарных цели, для связывания множества различных целевых фрагментов.

12. Набор зондов по п. 11, предназначенный для связывания нескольких фрагментов хромосомы человека, причем каждый зонд в наборе используется для связывания отдельного целевого фрагмента, специфичного для этой хромосомы.

13. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что 5'-конец последовательности, расположенной в начале, и 3'-конец целевого фрагмента гибридизируется с примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду нуклеотидами, и 3'-конец последовательности, расположенной в конце, и 5'- конец целевого фрагмента гибридизируется с примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду нуклеотидами.

14. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что вышележащая фланкирующая последовательность непосредственно примыкает к последовательности, комплементарной цели, без промежуточных нуклеотидов, и нижележащая фланкирующая последовательность непосредственно примыкает к последовательности, комплементарной цели, без промежуточных нуклеотидов.

15. Применение зонда по любому из пп. 1-12, для проверки образца на наличие целевого фрагмента нуклеиновой кислоты.

16. Способ анализа образца на наличие целевого фрагмента нуклеиновой кислоты, включающий:

(i) гибридизацию зонда по любому из пп. 1-10 с образцом денатурированной нуклеиновой кислоты, содержащей целевой фрагмент;

(ii) обеспечение условий для лигирования, так что 3'-конец целевого фрагмента лигирует с 5'-концом последовательности начала и 5-конец целевого фрагмента лигирует с 3'-концом последовательности конца с образованием продукта лигирования в виде кольца, и

(iii) детектирование наличия продукта лигирования в виде кольца,

где выявление продукта лигирования в виде кольца указывает на присутствие целевого фрагмента в образце.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что этап детектирования наличия продукта лигирования включает создание условий для репликации по типу катящегося кольца и детектирование с целью определения присутствия продукта репликации по типу катящегося кольца.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что продукт репликации по типу катящегося кольца детектируют с помощью гибридизации с мечеными олигонуклеотидами.

19. Способ по п. 16, отличающийся тем, что последовательность, комплементарная цели, является последовательностью генома человека, а образец денатурированной нуклеиновой кислоты представляет собой образец денатурированной ДНК человека.

20. Способ по п. 16, отличающийся тем, что последовательность, комплементарная цели, является последовательностью генома человека, а образец денатурированной нуклеиновой кислоты представляет собой образец денатурированной бесклеточной ДНК, которая расщеплена эндонуклеазами рестрикции.

21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что бесклеточная ДНК получена из кровотока беременной женщины.

22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что последовательность, комплементарная цели, является последовательностью из хромосомы 21 человека.

23. Способ по п. 16, отличающийся тем, что в продукте стадии (i) по меньшей мере один из:

5'-конец последовательности, находящейся в начале, и 3'-конец последовательности целевого фрагмента не гибридизуются с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду; или

3'-конец последовательности, находящейся в конце, и 5'-конец последовательности целевого фрагмента не гибридизуются с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду.

24. Способ по п. 16, отличающийся тем, что в продукте стадии (i) по меньшей мере один из:

5'-конец последовательности, находящейся в начале, и 3'-конец последовательности целевого фрагмента гибридизуются с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду; или

3'-конец последовательности, находящейся в конце, и 5'-конец последовательности целевого фрагмента гибридизуются с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду.

25. Способ по п. 16, отличающийся тем, что в продукте стадии (i) по меньшей мере одна из:

вышележащей фланкирующей последовательности не является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели; или

нижележащей фланкирующей последовательности не является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели.

26. Способ по п. 16, отличающийся тем, что в продукте стадии (i) по меньшей мере одна из:

вышележащей фланкирующей последовательности является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели; или

нижележащей фланкирующей последовательности является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели.

27. Способ детектирования хромосомной аномалии, включающий:

(i) гибридизацию набора зондов по любому из пп. 11, 12 с денатурированным образцом, содержащим геномную ДНК, полученную от человеческого субъекта, где зонды из набора содержат различные внутренние последовательности, комплементарные цели, которые гибридизуются с различными целевыми фрагментами одной и той же хромосомы;

(ii) обеспечение условий для лигирования, так что 3'-конец целевого фрагмента лигирует с 5'-концом последовательности начала и 5'-конец целевого фрагмента лигирует с 3'-концом последовательности конца с образованием продукта лигирования в виде кольца;

(iii) подсчет количества продуктов лигирования в виде кольца, полученных на этапе (ii);

(iv) сравнение результатов, полученных на стадии (iii), с результатами, полученными с использованием зондов, которые гибридизуются с контрольной хромосомой;

(v) определение, основанное на сравнении стадии (iv), имеется ли у человеческого субъекта хромосомная аномалия или является ли он беременным плодом, у которого имеется хромосомная аномалия.

28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что образец является денатурированной бесклеточной ДНК, которая расщеплена эндонуклеазой рестрикции.

29. Способ по п. 27, отличающийся тем, что бесклеточная ДНК получена из кровотока беременной женщины.

30. Способ по п. 27, отличающийся тем, что стадия подсчета (iii) включает амплификацию продуктов лигирования в виде кольца с помощью амплификации по типу катящегося кольца и подсчет количества продуктов амплификации по типу катящегося кольца.

31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что продукт амплификации по типу катящегося кольца детектируют с помощью гибридизации меченых олигонуклеотидов с продуктами амплификации по типу катящегося кольца и детектирования полученных комплексов.

32. Способ по п. 27, отличающийся тем, что хромосомная аномалия является анеуплоидией.

33. Способ по п. 32, где анеуплоидия является трисомией 21.

34. Способ по п. 27, отличающийся тем, что в продукте стадии (i) по меньшей мере один из:

5'-конец последовательности, находящейся в начале, и 3'-конец последовательности целевого фрагмента гибридизуются с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду; или

3'-конец последовательности, находящейся в конце, и 5'-конец последовательности целевого фрагмента гибридизуются с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду.

35. Способ по п. 27, отличающийся тем, что в продукте стадии (i) по меньшей мере один из:

5'-конец последовательности, находящейся в начале, и 3'-конец последовательности целевого фрагмента не гибридизуются с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду; или

3'-конец последовательности, находящейся в конце, и 5'-конец последовательности целевого фрагмента не гибридизуются с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду.

36. Способ по п. 27, отличающийся тем, что в продукте стадии (i) по меньшей мере одна из:

вышележащей фланкирующей последовательности является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели, без промежуточных нуклеотидов; или

нижележащей фланкирующей последовательности является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели, без промежуточных нуклеотидов.

37. Способ по п. 27, отличающийся тем, что в продукте стадии (i) по меньшей мере одна из:

вышележащей фланкирующей последовательности не является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели; или

нижележащей фланкирующей последовательности не является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели.