Универсальная биосенсорная система для детекции аналита

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая биосенсорную систему детекции (варианты). В одном из вариантов реализации биосенсорная система детекции содержит живую биологическую клетку заданного типа, генерирующий сигнал репортер, связанный с живой клеткой, путь передачи сигнала, связанный с генерирующим сигнал репортером, универсальный детекторный элемент, связанный с указанным путем передачи сигнала, и элемент, связывающий аналит, связанный с универсальным детекторным элементом, где элемент, связывающий аналит, представляет собой аффитело, аптамер или растворимый рецептор, одноцепочечное антитело или одноцепочечное диатело. Изобретение расширяет арсенал биосенсорных средств для детекции. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 3 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая патентная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной патентной заявки США №62/438,068, поданной 22 декабря 2016 г.и названной "Systems and Devices for the Rapid Detection of Analytes" ("Системы и устройства для быстрой аналитов"), а также является частичным продолжением патентной заявки США №15/642,800 (патент США №9,850,546), поданной 06 июля 2017 г.и названной «Biosensor System for the Rapid Detection of Analytes» ("Биосенсорная система для детекции аналитов"), раскрытие которых включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки и является частью настоящей заявки на патент США на изобретение для любых целей.

Уровень техники

[0002] Описанное изобретение относится в целом к системам, устройствам, реагентам и способам для детекции различных представляющих интерес аналитов в биологических образцах или других типах образцов, а более конкретно, к системе на основе биосенсора для детекции и идентификации представляющих интерес аналитов в реальном времени на основе испускания детектируемого сигнала, когда биосенсор реагирует с представляющим интерес аналитом в тестируемом образце. Следующие патенты предоставляют дополнительную справочную информацию по технологии настоящего изобретения и включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки для любых целей: Патент США №9,023,640; 9,752,199; 9,850,546; 9,850,547; и 9,850,548.

[0003] В общем виде биосенсор представляет собой систему или устройство для детекции аналита, который сочетает в себе чувствительный биологический компонент с физико-химическим детекторным компонентом (детектором). Компоненты типичной биосенсорной системы включают биологический элемент, преобразователь или детекторный элемент и соответствующую электронную аппаратуру или процессоры для обработки сигналов, которые отображают результаты теста значимым и полезным образом. Биологический элемент обычно включает биологический материал, такой, как ткань, микроорганизмы, органеллы, клеточные рецепторы, ферменты, антитела, нуклеиновые кислоты и тому подобное, которые могут быть созданы с помощью известных процессов биологической инженерии. Преобразователь или детекторный элемент работает по физико-химическому механизму (например, оптическому, пьезоэлектрическому и/или электрохимическому), преобразуя сигнал, полученный в результате взаимодействия аналита с биологическим элементом, в другой сигнал, который можно легче измерять и количественно характеризовать. Биосенсоры были созданы в результате интеграции молекулярной биологии и информационных технологий (например, микросхем, оптических волокон и т.д.) для осуществления качественной или количественной оценки взаимодействий биомолекулы и аналита, например, таких, как антитела с антигеном. Учитывая, что существует большой спрос на быстрые, чувствительные, простые в обращении и экономически эффективные средства детекции для выявления инфекционных агентов, патогенов и/или токсинов в пищевых продуктах (см., например, Mead et al., Food Related Illness and Death in the United States, Emerging Infectious Diseases, V. 5, №5, сентябрь-октябрь 1999 года (607-625), который включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме), существует постоянная потребность в применении биосенсоров в режиме реального времени, полевых портативных устройствах и инструментах для детекции и идентификации инфекционных агентов, патогенных микроорганизмов, токсинов и других загрязняющих веществ в пищевых продуктах.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Далее представлено краткое изложение нескольких примерных вариантов реализации данного изобретения. Данное изложение сущности изобретения не представляет собой расширенного обзора и не предназначено для идентификации ключевых критических элементов или для определения объема формулы изобретения. Однако следует понимать, что использование неопределенных артиклей на языке, используемом для описания и утверждения настоящего изобретения, никоим образом не предназначено для ограничения описанной системы отдельными компонентами или элементами. Скорее использование «а» или «an» в данном документе должно интерпретироваться «по меньшей мере, как один» или «один или несколько».

[0005] Согласно одному аспекту настоящего изобретения предусмотрена первая биосенсорная система для детекции целевых аналитов. Эта система включает живую биологическую клетку заданного (заранее определенного) типа; генерирующий сигнал репортер, связанный с живой биологической клеткой; путь передачи сигнала или активаторный механизм, связанный с репортером генерации сигнала; универсальный детекторный элемент, связанный с активаторным механизмом; и элемент, связывающий аналит, связанный с универсальным детекторным элементом, причем элемент, связывающий аналит, специфичен как в отношении универсального детекторного элемента, так и в отношении целевого аналита.

[0006] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрена первая биосенсорная система для детекции целевых аналитов. Эта система включает живую биологическую клетку заданного типа; генерирующий сигнал репортер, связанный с живой биологической клеткой, причем генерирующий сигнал репортер реагирует на определенные изменения, происходящие внутри живых биологических клеток; путь передачи сигнала или активаторный механизм, связанный с генерирующим сигнал репортером, причем активаторный механизм является оперативным для того, чтобы вызывать определенные изменения в живой биологической клетке; универсальный детекторный элемент, связанный с активаторным механизмом, причем универсальный детекторный элемент может запускать активаторный механизм; элемент, связывающий аналит, связанный с универсальным детекторным элементом, причем элемент, связывающий аналит, специфичен как в отношении универсального детекторного элемента, так и в отношении целевого аналита; и в котором при связывании элемента, связывающего аналит, с которым целевой аналит также связан с универсальным детекторным элементом, универсальный детекторный элемент запускает активаторный механизм, вызывая определенные изменения в живой биологической клетке, в результате чего генерирующий сигнал репортер генерирует детектируемый сигнал.

[0007] В еще одном аспекте настоящего изобретения предусмотрена третья биосенсорная система для детекции целевых аналитов. Эта система включает живую биологическую клетку заданного типа; генерирующий сигнал репортер в живой биологической клетке, причем генерирующий сигнал репортер реагирует на определенные изменения, происходящие в живой биологической клетке; путь передачи сигнала или активаторный механизм, связанный с генерирующим сигнал репортером, причем активаторный механизм может вызывать определенные изменения в живой биологической клетке; универсальный детекторный элемент, связанный с активаторным механизмом, причем универсальный детекторный элемент может запускать активаторный механизм; элемент, связывающий аналит, связанный с универсальным детекторным элементом, причем элемент, связывающий аналит, является специфическим как в отношении универсального детекторного элемента, так и в отношении целевого аналита; причем при связывании элемента, связывающего аналит, с которым целевой аналит также связан, с универсальным детекторным элементом, универсальный детектор ингибирует активаторный механизм, вызывая снижение определенных изменений в живой биологической клетке, в результате чего генерирующий сигнал репортер генерирует ослабленный сигнал или не генерирует сигнал.

[0008] Дополнительные признаки и аспекты настоящего изобретения станут очевидны обычным специалистам в данной области техники после прочтения и осмысления нижеследующего подробного описания примерных вариантов реализации. Специалист в данной области поймет, что возможны дополнительные варианты реализации изобретения, не выходящие за пределы объема и сущности изобретения. Соответственно, чертежи и подробное описание должны рассматриваться как иллюстративные и неограничительные.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0009] Прилагаемые чертежи, которые включены в описание и составляют его часть, схематически иллюстрируют один или более примерных вариантов реализации изобретения и вместе с общим описанием, приведенным выше, и подробным описанием, приведенным ниже, служат для объяснения принципов изобретения, и при этом:

[0010] ФИГ. 1a-b являются иллюстрациями первого биосенсора в соответствии с одним примерным вариантом реализации, в котором Т-клетки Jurkat были сконструированы (модифицированы) для продуцирования экворина и для экспрессии не являющегося антителом трансмембранного передающего сигнал элемента IgGbp-CD3ζ;

[0011] ФИГ. 2a-b являются иллюстрациями второго биосенсора биосенсора в соответствии с примерным вариантом реализации, в котором тучные клетки МС/9 были сконструированы для продуцирования экворина, и где клетки МС/9 экспрессируют нативный рецептор FcεRI, который связывается с не являющимся антителом растворимым передающим сигнал элементом IgGbp-IgE;

[0012] ФИГ. 3a-b являются иллюстрациями третьего биосенсора соответствии с примерным вариантом реализации, в котором тучные клетки МС/9 были сконструированы для продуцирования экворина, и где клетки МС/9 экспрессируют нативный рецептор FcεRI, который связывается с не являющимся антителом растворимым передающим сигнал элементом IgGbp-IgE, который экскретируется тучными клетками МС/9;

[0013] ФИГ. 4 является иллюстрацией четвертого биосенсора в соответствии с примерным вариантом реализации, в котором биосенсорные клетки были сконструированы для продуцирования экворина и для экспрессии не являющегося антителом трансмембранного передающего сигнал элемента mSA-CD3, который связывается с биотинилированным детекторным; и

[0014] ФИГ. 5 является иллюстрацией пятого биосенсора в соответствии с примерным вариантом реализации, в котором биосенсорные клетки были сконструированы для продуцирования экворина и для экспрессии не являющегося антителом трансмембранного передающего сигнал элемента mSA-CD3ζ, который связывается с биотинилированным детекторным элементом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0015] Примерные варианты реализации настоящего изобретения будут теперь описаны со ссылкой на чертежи. Хотя нижеследующее подробное описание содержит множество конкретных признаков для целей иллюстрации, обычный специалист в данной области техники поймет, что могут быть сделаны различные модификации и изменения без выхода за рамки объема настоящего изобретения. Соответственно, следующие варианты реализации изобретения изложены без какой-либо потери общности и без наложения ограничений на заявленное изобретение.

[0016] Настоящее изобретение относится в целом к системам, устройствам, реагентам и способам для детекции различных аналитов или других мишеней, представляющих интерес, в биологических образцах или образцах других типов, а более конкретно, к биосенсорной системе для детекции и идентификации представляющих интерес аналитов в режиме реального времени на основе испускания детектируемого сигнала, когда биосенсор реагирует с интересующим аналитом в анализируемом образце. Сконструированные клетки по настоящему изобретению являются очень чувствительными и эффективными биосенсорами, и поскольку этим биосенсорным клеткам присуща способность к детекции, они образуют универсальную систему, которая может быть легко адаптирована для детекции широкого спектра различных инфекционных агентов или других мишеней, простого за счет выбора альтернативных растворимых детекторных молекул (например, антител), обладающих специфичностью в отношении конкретного патогена или другой представляющей интерес мишени. Кроме того, система по настоящему изобретению может быть легко сконфигурирована для мультиплексной детекции нескольких инфекционных агентов или других аналитов за один анализ, обеспечивая большую гибкость и полезность. Универсальность настоящего изобретения обусловлена уникальной комбинацией элементов и, в частности, комбинацией универсальной биосенсорной клетки со специфическим растворимым детектором (например, антителом). Универсальная биосенсорная клетка обладает способностью реагировать на присутствие практически любой целевой молекулы (мишени), которая может быть распознана детекторной молекулой. Поскольку в некоторых вариантах осуществления детектор или детекторное антитело добавляется в систему в качестве растворимого фактора, система может быть сконфигурирована для детекции альтернативной мишени просто за счет выбора соответствующего альтернативного детектора или детекторного антитела. Специфичность раскрытой системы определяется детекторной молекулой, которая выбирается на основании ее специфичности и сродства к молекуле-мишени, которая характерна для инфекционного агента или другого целевого аналита (аналита-мишени). Комбинация этой универсальной биосенсорной клетки и растворимого детектора также позволяет конструировать мультиплексные анализы просто путем включения множества детекторных молекул (например, антител) в тест-систему, где молекулы-мишени выбираются на основе их специфичности к альтернативным инфекционным агентам или другим аналитам.

[0017] Генетические манипуляции и модификация типов биосенсорных клеток, применяемых в данном изобретении, обычно включают применение надлежащим образом отобранных средств доставки генов, которые содержат генетические элементы, эффективно функционирующие в выбранном типе клеток. Например, целесообразно использовать промоторный элемент, который обеспечивает высокий уровень экспрессии введенных трансгенов в конкретной выбранной биосенсорной клетке. В примерном варианте реализации данного изобретения такой промоторный элемент может быть получен непосредственно из самой биосенсорной клетки и затем использован для экспрессии представляющего интерес трансгена. В другом варианте реализации данного изобретения соответствующий элемент может быть определен эмпирически путем сравнения функции альтернативных промоторных элементов в контексте альтернативных носителей доставки генов с целью выявления эффективных промоторных, трансгенных, векторных комбинаций для выбранного типа клеток. Трансгены, такие как ген, кодирующий люминесцентный репортерный белок, могут быть введены в биосенсорную клетку с использованием стандартных методов, таких как электропорация или с помощью химических реагентов для трансфекции, таких как, например, липофектамин. Другие методы генной инженерии, известные специалистам в данной области, также совместимы с настоящим изобретением.

[0018] Пример реализации настоящего изобретения включает живую сконструированную биосенсорную клетку, причем живая сконструированная биосенсорная клетка обычно является компонентом иммунной системы млекопитающего; репортерный белок, причем репортерный белок экспрессируется живой сконструированной клеткой и присутствует в живой сконструированной клетке, а также репортерный белок испускает детектируемый сигнал в ответ на определенные изменения в цитозоле живой сконструированной клетки; путь передачи сигнала, демонстрируемый живой сконструированной клеткой, причем этот путь передачи сигнала контролирует биологический или биохимический процесс в цитозоле живой сконструированной клетки и при этом по меньшей мере один биологический или биохимический процесс, когда он происходит, заставляет репортерный белок испускать детектируемый сигнал; по меньшей мере один тип детекторной молекулы (молекулы-детектора), причем каждая детекторная молекула приспособлена для связывания с конкретным аналитом; по меньшей мере, один аналит, причем, по меньшей мере, один аналит связывается с детекторной молекулой, которая специфична для этого аналита; и множество не являющихся антителами передающих сигнал трансмембранных элементов, экспрессируемых живой сконструированной клеткой, причем каждый передающий сигнал элемент способен принимать детекторную молекулу, которая, в свою очередь, способна принимать аналит. После связывания достаточного количества аналитов с достаточным количеством детекторных молекул, которые сами связаны с не являющимися антителами передающими сигнал трансмембранными элементами, происходит агрегация передающих сигнал элементов на поверхность клетки, активируется путь передачи сигнала, происходит биологический или биохимический процесс, и репортерный белок испускает детектируемый сигнал. Эта система может также включать устройство для смешивания живых клеток с растворимыми компонентами и образцом, содержащим интересующий аналит или инфекционный агент при сохранении жизнеспособности и функциональности биосенсорной клетки, и детектор для детекции сигнала, испускаемого биосенсорной клеткой.

[0019] Другой пример осуществления этого изобретения включает в себя: живую сконструированную клетку, причем живая сконструированная клетка является компонентом иммунной системы млекопитающих, где живая сконструированная клетка представляет собой тучную клетку и где тучная клетка экспрессирует по меньшей мере один предопределенный рецептор; репортерный белок, причем репортерный белок представляет собой экворин, который экспрессируется живой, сконструированной клеткой, и где экворин испускает детектируемый сигнал света в ответ на некоторые определенные изменения в цитозоле живой сконструированной клетки; путь передачи сигнала, экспрессируемый живой сконструированной клеткой, причем путь передачи сигнала управляет биохимическим процессом в цитозоле живой сконструированной клетки и где биохимический процесс, контролируемый путем передачи сигнала, дополнительно включает увеличение внутриклеточного кальция, причем увеличение внутриклеточного кальция, когда оно происходит, побуждает экворин испускать детектируемый свет; по меньшей мере один тип детекторной молекулы, где каждая детекторная молекула приспособлена для связывания с конкретным аналитом; по меньшей мере, один аналит, где, по меньшей мере, один аналит связывается с детекторной молекулой, которая специфична для этого аналита; и множество растворимых не являющихся антителами передающих сигнал элементов. Каждый передающий сигнал элемент, способен к связыванию, по меньшей мере, с одним предопределенным рецептором и для приема детекторной молекулы. При связывании достаточного количества аналитов с достаточным количеством детекторных молекул с достаточным количеством элементов, не передающих трансмембранный сигнал антитела, которые сами связаны по меньшей мере с одним типом предопределенного рецептора, происходит агрегация рецепторов на поверхности клетки, активируется путь передачи сигнала, происходит увеличение внутриклеточного кальция, и экворин испускает детектируемый свет. Эта система может также включать устройство для смешивания живых клеток вместе с растворимыми компонентами и образцом, содержащим интересующий аналит или инфекционный агент при сохранении жизнеспособности и функциональности живой биосенсорной клетки, и детектор для детекции сигнала, испускаемого биосенсорной клеткой.

[0020] Еще один пример реализации настоящего изобретения включает: биосенсор для быстрой детекции, где биосенсор дополнительно включает живую сконструированную клетку, причем живая сконструированная клетка получена из клеточного компонента иммунной системы млекопитающего (то есть иммуноцита); репортерный белок, причем репортерный белок встроен в живую сконструированную клетку и экспрессируется ей, и при этом репортерный белок испускает детектируемый сигнал в ответ на некоторые определенные изменения в цитозоле живой сконструированной клетки; путь передачи сигнала, встроенный в живую сконструированную клетку или присутствующий в ней от природы, при этом путь передачи сигнала контролирует биологический процесс в цитозоле живой сконструированной биосенсорной клетки, и при этом биологический процесс, когда он происходит, побуждает (заставляет) репортерный белок испускать детектируемый сигнал; и множество не являющихся антителами передающих сигнал элементов, которые прямо или опосредованно связываются с аналитом в анализируемом образце, причем связанные не являющиеся антителами передающие сигнал элементы, затем взаимодействуют с биосенсорной клеткой для прямой или непрямой активации пути передачи сигнала.

Живая биологическая клетка

[0021] Примеры реализации настоящего изобретения включают живую, сконструированную биосенсорную клетку, которая обычно является компонентом иммунной системы млекопитающего, например иммуноцит. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения биосенсорная клетка представляет собой В-клетку человека или мыши. В-клетки или В-лимфоциты представляют собой тип лейкоцитов подтипа лимфоцитов, которые функционируют в гуморальном компоненте иммунитета адаптивной иммунной системы, вырабатывая антитела. В некоторых примерах реализации настоящего изобретения биосенсорная клетка представляет собой Т-клетку человека или мыши. Т-клетки или Т-лимфоциты являются другим типом лимфоцитов, которые играют центральную роль в клеточном иммунитете как части адаптивной иммунной системы. Т-клетки отличаются от других лимфоцитов наличием Т-клеточного рецептора на поверхности клеток. В других вариантах реализации настоящего изобретения биосенсорная клетка представляет собой тучную клетку. Тучная клетка также представляет собой тип лейкоцитов, известный как гранулоцит, который получают из миелоидных стволовых клеток, которые являются частью иммунной и нейроиммунной систем. Другие типы клеток совместимы с настоящим изобретением, включая базофилы, которые являются другим типом лейкоцитов, однако похожи по внешнему виду и имеют схожие функции с тучными клетками.

[0022] В других примерах реализации настоящего изобретения живая биологическая клетка может быть прокариотической или эукариотической клеткой, такой как эукариотическая клетка, которая включает сигнальную систему Са2+. Живой клеткой может быть дрожжевая клетка или клетка насекомого, например клетка Drosophila Schneider 2 (S2), клетка sf9 или клетка насекомого, которая была сконструрирована для применения экворина в качестве репортера. Живой биологической клеткой может быть клетка млекопитающего, например клетка HEK, клетка СНО, клетка COS или клетка 3T3. Живая биологическая клетка может быть сконструированной клеткой. Сконструированная клетка может быть получена из нативной, пассируемой или культивируемой клетки млекопитающего. Сконструированная клетка может быть получена из невоспроизводящейся клетки, фиксированной клетки, клетки, обработанной лекарственным средством или химическим реагентом, осмотически обработанной клетки, облученной клетки, искусственно или синтетически полученной клетки или неживой клетки, при условии, что сконструированная клетка содержит функциональный лиганд, путь передачи сигнала и репортер. Клетка может быть искусственной или синтетической. Сконструированная клетка может быть получена из растительной клетки, клетки животного, клетки насекомого или клетки другого животного, не являющегося млекопитающим, компонента иммунной системы млекопитающего, фолликулярной дендритной клетки, естественной клетки-киллера, макрофага, моноцита, мононуклеарного фагоцита, нейтрофила, эозинофила или базофила. Сконструированная клетка также может представлять собой клетку, которая экспрессирует рецепторы типа Fc, такие как В-лимфоциты, фолликулярные дендритные клетки, природные клетки-киллеры, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и тучные клетки. В определенных вариантах реализации клетка может представлять собой любую прокариотическую или эукариотическую клетку, которая имеет подходящий рецептор, путь передачи сигнала и механизм вывода сигнала, полученная естественным путем, посредством генной инженерии, либо посредством химического добавления. Клетка может быть искусственной или неживой единицей при условии, что она имеет функциональный рецептор, сигнальный путь и механизм вывода сигнала. Примером клетки, которая может применяться в данной системе, является клетка макрофага, такая как линия клеток человека U937, которая экспрессирует Fc-рецептор на поверхности клетки. Антиген может быть связан с антителом путем добавления антитела к мишени, и этот комплекс антиген-антитело будет связываться с Fc-рецептором на клетке, стимулируя передачу сигналов, что приводит к увеличению внутриклеточного кальция. Клетки можно зафиксировать, заморозить, высушить или сублимировать.

Генерирующий сигнал репортер

[0023] Примерные варианты реализации настоящего изобретения включают репортерный элемент, такой как репортерный белок или фермент, который продуцируется или экспрессируется живой сконструированной биосенсорной клеткой. Репортерный белок испускает детектируемый сигнал в ответ на некоторые определенные изменения в цитозоле живой, сконструированной биосенсорной клетки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения репортерный белок представляет собой биолюминесцентный фотопротеин, такой как экворин, который получают из гидрозоя Aequorea Victoria. Экворин ранее использовался для конструирования живых биосенсорных клеток с целью получения световых сигналов в ответ на активацию широкого спектра путей передачи сигнала; таким образом, специалистам в данной области известны различные способы манипулирования продукцией экворина в живых клетках. В частности, квалифицированный специалист может выбрать и использовать любое подходящее средство доставки генов, такое как, например бактериальные плазмидные векторы или вирусные векторы, для введения соответствующего генетического материала в биосенсорные клетки. Продукция репортерного белка в биосенсорной клетке далее контролируется за счет экспрессии введенного генетического материала. Специалист в данной области поймет, что другие фотопротеины, репортерные белки других типов, ферменты и молекулы могут быть включены и использованы в различных альтернативных вариантах реализации настоящего изобретения.

[0024] В различных вариантах реализации настоящего изобретения репортер может представлять собой белок, обладающий флуоресцентными характеристиками, которые подвергаются заметному изменению в ответ на активацию по меньшей мере одного биохимического пути и результирующего изменения в живой биологической клетке. Репортер, или репортерный белок может представлять собой другие чувствительные к кальцию люминесцентные или флуоресцентные молекулы, такие как обелин, талассиколин, митрокомин (галистаурин), клитин (фиалидин), мнемопсин, беровин, индо-1, фура-2, квин-2, флуо-белок. 3, Rhod-2, кальциевый зеленый, ВАРТА, камелины (А. Miyawaki et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 213540), или похожие молекулы. Репортерный белок может быть химерным. Он включает Са²⁺-связывающий домен и связанный флуоресцентный белок. Связанный флуоресцентный белок имеет зеленую флуоресценцию (GFP). Белок может связывать другие компоненты фосфатидилинозитного пути (т.е пути, используемого в вариантах реализации, описанного в настоящем документе) и изменять его флуоресценцию. Примером является флуоресцентный белок, который был разработан для связывания диацилглицерина. Репортер может быть ферментом, способным (выполненным с возможностью) давать люминесцентноый или флуоресцентный сигнал. Репортерный белок может быть ферментом, типа люциферазы или щелочной фосфатазы, который генерирует люминесцентный или флуоресцентный сигнал соответственно. Он также может быть флуоресцентным белком или включать флуоресцентные, заряженные или магнитные наночастицы, наноточки или квантовые точки. Репортер может быть красителем с флуоресцентными, ультрафиолетовыми или видимыми свойствами, причем флуоресцентные, ультрафиолетовые или видимые характеристики подвергаются заметному изменению в ответ на активацию, по меньшей мере, одного биохимического пути и результирующего изменения в живой биологической клетке.

Активаторный механизм

[0025] Примерные варианты реализации настоящего изобретения включают активаторный механизм в форме пути передачи сигнала, демонстрируемого живой, сконструированной биосенсорной клеткой. Путь передачи сигнала контролирует, по меньшей мере, один биологический процесс в цитозоле живой, сконструированной клетки, и, по меньшей мере, один биологический процесс, когда он происходит, то побуждает репортерный белок испускать детектируемый сигнал. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения путь передачи сигнала (сигнальной трансдукции) представляет собой любой биохимический путь, в котором увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ индуцируется в ответ на активацию молекулы, типа рецепторного белка, которая передает сигнал с клеточной поверхности. Биосенсорные клетки, применяемые в настоящем изобретении, могут быть выбраны из множества живых клеток, способных вызывать увеличение цитоплазматического Са2+ в ответ на активацию передающей сигнал молекулы с клеточной поверхности. Например, В-клетки, Т-клетки и тучные клетки способны вызывать увеличение концентрации Са2+ в ответ на активацию передающих сигнал молекул клеточной поверхности (таких как В-клеточный рецептор, Т-клеточный рецептор и Fc эпсилон-рецептор (тучные клетки)).

[0026] Поскольку клетки млекопитающих, растущие в культуре обычно дают популяции клеток, в которых конкретные отдельные клетки имеют различную способность вызывать увеличение концентрации Са2+, целесообразно выбирать или отбирать те субпопуляции клеток или клональных клеточных линий, которые обладают устойчивой способностью генерировать сигнал Са2+. Достичь этого можно, например путем анализа индукции индуцированной вспышки, вызванной экворином. В частности, трансфектанты, созданные путем введения трансгенов в клетку, представляют собой смешанную популяцию клеток, полученную в результате большого числа независимых событий встраивания генов. Таким образом, при конструировании биосенсорной клетки лучше проводить скрининг или выбирать конкретные субпопуляции клеток или клональных клеточных линий, обладающих эффективными возможностями передачи сигнала вместе с достаточной экспрессией введенных трансгенов. Особенно полезно использовать метод анализа сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) для отбора субпопуляций с высокой экспрессией или для получения клональных клеточных линий для этой цели.

[0027] Как указывалось ранее, экворин ранее использовался для конструирования живых биосенсорных клеток с целью получения световых сигналов в ответ на активацию широкого спектра путей передачи сигнала, в частности, когда такие пути передачи сигнала приводят к повышению цитоплазматических уровней ионов Са2+ в живой клетке. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения биосенсорные клетки, продуцирующие экворин в качестве репортерного белка, перед их использованием в анализе на детектирование наргужают коэлентеразином (CTZ). Этот этап нагрузки ковалентно связывает экворин с гидрофобной простетической группой (например, CTZ), после связывания кальция (Са2+) CTZ подвергается необратимой реакции, в результате которой происходит изменение конформации и испускание синего света (при 469 нм).

[0028] Как описано выше, путь передачи сигнала может передавать первичный сигнал путем высвобождения ионов кальция из эндоплазматического ретикулума в цитозоль, а второй сигнал может высвобождаться репортером в ответ на ионы кальция. Данный сигнальный путь является каскадом передачи сигнала, детектируемого в В-клетках, Т-клетках, тучных клетках, макрофагах и других иммунных клетках, где поперечное сшивание рецепторов клеточной поверхности активирует тирозинкиназу, которая затем фосфорилирует фосфолипазу С, которая в свою очередь расщепляет фосфатидилинозитол 4 5-бисфосфат (PIP2) до инозитол 1,4,5-трифосфата (IP3) и диацилглицерина; затем IP3 открывает кальциевые каналы для высвобождения кальция из внутриклеточных пулов, например, эндоплазматического ретикулума, или для впуска внеклеточного кальция, тем самым повышая концентрацию кальция в цитозоле клетки. В зависимости от типа рецептора, типа клеток и желаемого способа передачи сигнала могут применяться альтернативные каскады передачи сигнала (сигнальной трансдукции), такие как каскад G-белок-аденилат-циклический-цАМФ-протеинкиназа А. Путь передачи сигнала также может передавать сигнал путем высвобождения диацилглицерина, керамида или другой вторичной сигнальной липофильной молекулы (вторичного мессенджера), при этом репортер испускает второй сигнал в ответ на высвобождение диацилглицерина, керамида или другой липофильной молекулы вторичного мессенджера. Путь передачи сигнала также может передавать сигнал путем высвобождения или образования оксида азота («NO»), цАМФ, цГМФ или другого циклического нуклеотида, где репортер испускает второй сигнал в ответ на данное высвобождение или образование. Путь передачи сигнала также может передавать сигнал путем высвобождения или образования супероксида, пероксида водорода, оксида углерода, сероводорода или другого вторичного редокс мессенджера (сигнальной молекулы), причем репортер испускает второй сигнал в ответ на высвобождение или выработку супероксида, пероксида водорода, оксида углерода, сероводорода или другой молекулы вторичного окислительно-восстановительного мессенджера. В некторых вариантах реализации активаторный механизм включает изменение рН или температуры клетки или изменение электрических или магнитных свойств клетки.

Универсальный детекторный элемент

[0029] Примерные варианты осуществления настоящего изобретения включают различные не являющиеся антителами передающие сигнал элементы, которые функционируют как универсальные детекторные элементы для распознавания целевых аналитов. Каждый передающий сигнал элемент обычно способен к приему, т.е. связыванию, элемента, связывающего аналит (также называемого здесь "детекторной молекулой"), который в свою очередь способен к приему, т.е. связыванию конкретного интересующего аналита. В одном варианте реализации передающий сигнал элемент, представляет собой трансмембранный химерный слитый белок, который встроен и экспрессируется на поверхности биосенсорной клетки и который способен активировать путь передачи сигнала, что в конечном итоге приводит к тому, что репортерный белок испускает детектируемый сигнал. В другом варианте реализации передающий сигнал элемент представляет собой растворимый химерный слитый белок, который способен связываться с элементом, передающим сигнал, на клеточной поверхности, таким как нативный рецептор или рецепторный белок, который способен активировать путь передачи сигнала, что в конечном итоге приводит к тому, что репортерный белок испускает детектируемый сигнал. В еще одном варианте реализации путь передачи сигнала представляет собой растворимый химерный слитый белок, который встроен в биосенсорную клетку и экспрессируется биосенсорной клеток. Растворимый химерный слитый белок затем секретируется, выделяется во внеклеточное пространство, где он связывается с элементом, передающим сигнал, на клеточной поверхности, таким как нативный рецептор или рецепторный белок, который способен активировать путь передачи сигнала, что в конечном итоге приводит к тому, что репортерный белок испускает детектируемый сигнал.

[0030] Химерные слитые белки настоящего изобретения могут включать: (i) компонент белка, который способен связываться, по меньшей мере, с одним типом детекторной молекулы (например, растворимое антитело); и (ii) компонент рецепторного комплекса, обычно экспрессируемого живой, сконструированной биосенсорной клеткой. В некоторых вариантах реализации компонент белка, который способен к связыванию, по меньшей мере, с одним типом детекторной молекулы, может быть получен из бактериального связывающего белка (то есть антитело-связывающего белка, полученного из бактерий), такого как, например IgG-связывающий домен G-белка стрептококка (обозначается в настоящем документе как IgGbp или Igbp на чертежах). Тандемные повторы этого IgG-связывающего домена могут быть включены для увеличения сродства (аффиности) связывающего белка к растворимому антителу. В альтернативном варианте реализации компонент химерного слитого белка, который способен к связыванию, по меньшей мере, с одним типом детекторной молекулы, представляет собой домен, связывающий антитело, полученный из рецепторного белка, такого как, например мышиный рецептор Fc-гамма RI (FcγRI). В различных примерных вариантах реализации компонент рецепторного комплекса, в норме экспрессируемый живой сконструированной биосенсорной клеткой, представляет собой IgM (для биосенсоров на осове В-клеток); Igα/β (для биосенсоров на основе В-клеток); IgE (для биосенсоров на основе тучных клеток); CD19 (для биосенсоров на основе В-клеток), CD3zeta (для биосенсоров на основе Т-клеток) или FcεRI (для биосенсоров на основе тучных клеток).

[0031] Не являющиеся антителами передающие сигнал элементы согласно настоящему изобретению могут включать либо полные белковые последовательности, либо сконструированные белковые фрагменты, такие как отобранные белковые домены, полученные из более крупных белковых молекул. Специалист в данной области поймет, что фрагменты более крупных молекул могут быть созданы с использованием стандартных методов генной инженерии, таких как технология синтетических генов. При использовании фрагментов более крупных белков для конструирования мотивов связывания антител в качестве аспектов химерных слитых белков важно проектировать сконструированные белки таким образом, чтобы обеспечить надлежащее конформационное сворачивание выбранных фрагментов белка. Следовательно, целесообразно включать (в слитые белки) короткие спейсерные или линкерные элементы, которые плохо образуют белковые вторичные структуры. Короткие комбинации аминокислот, такие, как глицин, серин и аланин, могут быть использованы для данных спейсерных или линкерных элементов. В примерном варианте реализации аминокислотная последовательность глицин (G), серин (S), аланин (А), серин (S), глицин (G), серин (S), глицин (G) применяется для отделения связывающего домена от компонента рецепторного комплекса в сконструированной белковой молекуле (см. SEQ ID №:19). Что касается пептидного линкера или спейсера, применяемого для соединения детекторного элемента с передающим сигнал элементом или для соединения различных сегментов элемента передачи сигнала: линкер обычно соединяет карбоксильный конец одного элемента с амино-концом другого. Пептидные линкеры могут иметь длину от 0 до 25 аминокислот или любое промежуточное целочисленное значение и обычно, но не всегда, включают гидрофильные аминокислоты, такие как глицин (G) и серин (S).

[0032] Как указывалось ранее, каждый передающий сигнал элемент связывается с детекторной молекулой, которая связывается с конкретным представляющим интерес аналитом. Детекторная молекула, которая связана с аналитом, будет либо (i) связываться с трансмембранным элементом, передающим сигнал; или (ii) с элементом передачи сигнала, который сам будет связываться с элементом передачи сигнала на клеточной поверхности, (например нативным рецептором). В первой ситуации при связывании достаточного количества аналитов с достаточным количеством детекторных молекул, которые сами связаны с элементами, не передающими трансмембранные сигналы антител, происходит агрегация элементов, передающих сигналы, на поверхности биосенсорные клетки, активируется путь передачи сигнала, происходит биологический процесс, и детектируемый сигнал испускается репортерным белком. Во втором случае при связывания достаточного количества аналитов с достаточным количеством детекторных молекул с достаточным количеством не являющихся антителами передающих сигнал элементов, которые сами связаны с соответствующим нативным рецептором, происходит агрегация рецепторов на поверхности клетки, активируется путь передачи сигнала, происходит повышение внутриклеточного кальция, и репортерный белок испускает детектируемый свет.

[0033] Первый не являющийся антителом передающий сигнал элемент в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения включает бактериальный связывающий белок (IgGbp), слитый с константным доменом тяжелой цепи IgM (В-клетка) с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 1 представлена последовательность ДНК для передающего сигнал элемента IgGbp-IgM, и в SEQ ID NO: 2 представлена последовательность белка для передающего сигнал элемента IgGbp-IgM.

[0034] Второй не являющийся антителом передающий сигнал элемент в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения включает бактериальный связывающий белок (IgGbp), слитый с Igα/β компонентом В-клеточного рецептора с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 3 представлена последовательность ДНК для передающего сигнал элемента IgGbp-Igα/β, и в SEQ ID NO: 4 представлена последовательность белка для передающего сигнал элемента IgGbp-Igα/β.

[0035] Третий не являющийся антителом передающий сигнал элемент, в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения, включает бактериальный связывающий белок (IgGbp), слитый с дзета-цепью CD3 рецептора Т-клеток с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 5 представлена последовательность ДНК для передающего сигнал элемента IgGbp-CD3ζ, и в SEQ ID NO: 6 представлена последовательность белка для передающего сигнал элемента IgGbp-CD3ζ.

[0036] Четвертый не являющийся антителом передающий сигнал элемент, в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения включает домен, связывающий антитела FcγRI, слитый с константным доменом тяжелой цепи IgM (В-клетка) с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 7 представлена последовательность ДНК для передающего сигнал элемента FcγRI-IgM, и в SEQ ID NO: 8 представлена последовательность белка для передающего сигнал элемента FcγRI-IgM.

[0037] Пятый не являющийся антителом передающий сигнал элемент, в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения включает домен, связывающий антитела FcγRI, слитый с Igα/β компонентом В-клеточного рецептора с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 9 представлена последовательность ДНК для передающего сигнал элемента FcγRI-Igα/β, и в SEQ ID NO: 10 представлена последовательность белка для передающего сигнал элемента FcγRI-Igα/β.

[0038] Шестой не являющийся антителом передающий сигнал элемент, в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения включает домен, связывающий антитело FcγRI, слитый с CD3 дзета-цепью рецептора Т-клеток с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 11 представлена последовательность ДНК для передающего сигнал элемента FcγRI-CD3ζ and SEQ ID NO: На фиг 12 представлена последовательность белка для передающего сигнал элемента FcγRI-CD3ζ..

[0039] Седьмой не являющийся антителом передающий сигнал элемент, в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения включает бактериальный связывающий белок (IgGbp), слитый с константным доменом IgE (В-клетка) с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 13 представлена последовательность ДНК для передающего сигнал элемента IgGbp-IgE, и в SEQ ID NO: 14 представлена последовательность белка для передающего сигнал элемента IgGbp-IgE..

[0040] Восьмой не являющийся антителом передающий сигнал элемент, в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения включает домен, связывающий антитело FcγRI, слитый с константным доменом IgE (В-клетка) с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 15 представлена последовательность ДНК для передающего сигнал элемента FcγRI-IgE, и в SEQ ID NO: 16 представлена последовательность белка для передающего сигнал элемента FcγRI-IgE.

[0041] Девятый не являющийся антителом передающий сигнал элемент, в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения, включает мономерный стрептавидин, слитый с CD3 дзета-цепью рецептора Т-клеток с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 17 представлена последовательность ДНК для передающего сигнал элемента mSA-CD3ζ, и в SEQ ID NO: 8 представлена последовательность белка для передающего сигнал элемента mSA-CD3ζ. Мономерный стрептавидин представляет собой рекомбинантную форму стрептавидина, которая включает мутации, расщепляющие тетрамер стрептавидина на мономер и повышающие растворимость полученной изолированной субъединицы.

[0042] В различных вариантах реализации универсальный детекторный элемент включает VDJ-область антитела, Fab-фрагмент или другую детерминанту антитела. Универсальный детекторный элемент может включать в себя область VJ область Т-клеток, VDJ область или другую детерминанту рецептора Т-клеток. Универсальный детекторный элемент может включать синтетический пептид; небольшую органическую детерминанту, которая не является пептидом; белок или пептидную детерминанту; детерминанту лектина, углевод-связывающий модуль или другую углевод-связывающую детерминанту; липидсвязывающую детерминанту; или детерминанту металлотиона, которая связывает металл, или другую металлсвязывающую детерминанту.

[0043] Универсальный детекторный элемент может быть ковалентно связан с путем передачи сигнала, экспрессируемым живой биологической клеткой. Примером является заякоренное в мембране антитело, где заякоренная часть является частью пути передачи сигнала, т.е передает сигнал снаружи клетки в клетку. В некоторых вариантах реализации универсальный детекторный элемент не является модульным, однако, является неотъемлемой частью пути передачи сигнала, например, частью химерного белка, образующего этот путь. Универсальный детекторный элемент может быть нековалентно связан с путем передачи сигнала. Связь между универсальным детекторным элементом и путем передачи сигнала может быть нековалентной. В других вариантах реализации универсальный детекторный элемент является модульным, а клетка, содержащая путь передачи сигнала, может быть нагружена выбранным универсальным детекторным элементом. Универсальный детекторный элемент может включать детерминанту, которая нековалентно связывается с компонентом пути передачи сигнала, или универсальный детекторный элемент может включать в себя Fc детерминанту, которая нековалентно связывает его с Fc-связывающим компонентом пути передачи сигнала. Универсальный детекторный элемент может включать детерминанту биотина или (стрепт)авидина, который нековалентно связывает его с биотин- или (стрепт)авидин-связывающим компонентом пути передачи сигнала.

Элемент, связывающий аналит, / детекторная молекула

[0044] Примерные варианты реализации настоящего изобретения включают по меньшей мере один тип элемента, связывающего аналит, также называемый здесь «детекторная молекула», где каждый элемент, связывающий аналит, способен к связыванию с конкретным целевым аналитом. Элемент, связывающий аналит, может быть растворимым антителом, которое никоим образом не экспрессируется биосенсорными клетками. Конкретный элемент, связывающий аналит, применяемый в настоящем изобретении, выбирается на основе его способности однозначно идентифицировать целевой аналит, представляющий интерес. В примерном варианте реализации элемент, связывающий аналит, представляет собой растворимое антитело, например, имеющееся на рынке IgG, которое специфично к конкретному аналиту, такогому как инфекционный агент. В другом примерном варианте реализации элемент, связывающий аналит, представляет собой биотинилированную молекулу (или молекулу на основе стрептавидина), которая специфична к предопределенному аналиту, такому, как, например, биотинилированная молекула аутоантигена, которая специфична к антитело против аутоантигена. Детекторная молекула или молекула-мишен, согласно настоящему изобретению может включать аутоантиген или аутоантитело, связанное с аутоиммунным заболеванием. Типичные аутоиммунные заболевания или нарушения включают ревматоидный артрит (РА), ювенильный РА (ЮРА), сахарный диабет типа 1, системную красную волчанку, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, склеродермию, целиакию, болезнь Крона, язвенный колит, синдром Шегрена, множественный склероз, синдром Шегрена, Синдром Гудпастуры, болезнь Аддисона, гранулематоз Вегенера, первичный билиарный цирроз, склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, ревматическая полимиалгия, височный артериит/гигантоклеточный артериит и синдром Гийена-Барре. Молекулы детектора или мишени также могут содержать опухолеспецифичные или опухолеассоциированные антигены или антитела к таким антигенам; или биологически активные молекулы, такие как эпидермальный фактор роста, пептидные гормоны, включая инсулин и гормон роста, цитокины, интерлейкины, интерфероны, ФНО и т.д. или антитела к таким биологически активным молекулам.

[0045] Система согласно настоящему изобретению может дополнительно включать элемент связывания аналита, который включает фрагмент IgG, а фрагмент IgG может быть одноцепочечным антителом или одноцепочечным диателом. Детектор также может быть аффителом, (то есть сконструированным связывающим белком), аптамером, (например молекулой ДНК или РНК, которая была сконструирована для связывания лигандов) или растворимым рецептором, таким как растворимый рецептор для инфекционного вируса.

Целевые аналиты и исследуемый образец

[0046] Предполагаемое использование настоящего изобретения заключается в детекции различных аналитов, которые присутствуют или могут присутствовать в исследуемых образцах. В примерном варианте реализации настоящего изобретения детектируемый аналит будет связываться с такой детекторной молекулой, как растворимое антитело, являющейся специфичным для этого аналита. Исследуемый образец может быть взят из большого числа источников пищи, включая: (i) мясо, такое как говядина, свинина, баранина, бизоны, птица и морепродукты; и (ii) растения и овощи. Исследуемый образец может также быть взят из многих других источников, таких как вода, потребляемые жидкости, консервирующие жидкости и жидкости организма, такие как кровь. Аналиты, которые могут детектироваться, включают в себя практически все, что будет специфично связываться с детектором или детекторной молекулой, т.е., например, химические вещества, токсины и инфекционные агенты, а также вирусы, бактерии и другие биологические материалы или агенты. В примерном варианте реализации настоящего изобретения конкретным инфекционным агентом является Escherichia coli, хотя и другие инфекционные агенты (такие как Salmonella, Listeria и Campylobacter) и загрязняющие вещества могут детектироваться с помощью настоящего изобретения. Escherichia coli O157 Н7, O26, O45, О103, O111, O121 и O145, как в отдельных, так и в мультиплексных анализах, потенциально могут детектироваться с помощью данного изобретения.

[0047] С помощью данного изобретения можно детектировать множество различных аналитов, включая патогены мяса и те, которые присутствуют в шпинате, салате и других овощах, и продуктах питания. Аналит может содержать один или несколько антигенных или аллергеных эпитопов, включая как линейные, так и конформационные эпитопы; он также может содержать один или несколько лигандов или рецепторов, распознаваемых реципрокными рецепторами или лигандами. Типичные аналиты включают бактерии, такие как Bacillus, (например В. anthracis), Enterobacteriaceae, (например Salmonella, Escherichia coli, Yersinia pestis, Klebsiella и Shigella), Yersinia, (например Y. pestis или Y. enterocolitcus), Staphylococ. например S. aureus), Streptococcus, Gonorrheae, Enterococcus, (например E. faecalis), Listeria (например, L. monocytogenes), Brucella (например В. abortus, В. melitensis или В. suis), Vibrio (например V. cholerae), Corynebacterium diphtheria, Pseudomonas, (например P. pseudomallei или P. aeruginosa), Burkholderia, (например В. mallei или В. pseudomallei), шигеллы, (например S. dysenteriae), риккетсии, (например R. риккетсии, R. prowazekii или R. typhi), Francisella tularensis, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, Mycoplasma, (например M. mycoides) и т.д.; аллергены, такие как арахисовая пыль, микотоксины, споры плесени или бактериальные споры, такие как Clostridium botulinum и С. perfringens; токсины, такие как рицин, микотоксин, тетродотоксин, токсин сибирской язвы, ботулинический токсин, стафилококковый энтертоксин В или сакситоксин; вирус, такой как Adenoviridae, (например аденовирус), Arenaviridae, (например вирус Мачупо), Bunyaviridae, (например вирус лихорадки Hantavirus или Rift Valley), Coronaviridae, Orthomyxoviridae, (например вирусы гриппа), Filoviridae, (например вирус Эбола и вирус Марбург), Flaviviridae, (например вирус японского энцефалита и вирус желтой лихорадки), Hepadnaviridae, (например вирус гепатита В), Herpesviridae, (например вирусы простого герпеса), Papovaviridae, (например вирусы папилломы), Paramyxoviridae, (например респираторно-синцитиальный вирус, вирус кори, вирус эпидемического паротита или вирус парагриппа), Parvoviridae, Picornaviridae, (например полиовирусы), Poxviridae, (например вирусы натуральной оспы), Reoviridae, (например ротавирусы), ретровирусы, (например лимфотропные вирусы Т-клеток человека (HTLV) и иммунодефицит человека) вирусы (ВИЧ)), Rhabdoviridae, (например вирус бешенства) и Togaviridae, (например вирусы энцефалита, вирус желтой лихорадки и вирус краснухи)); простейшие, такие как Cryptosporidium parvum, Encephalitozoa, Plasmodium, Toxoplasma gondii, Acanthamoeba, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis, Leishmania или Trypanosoma, (например Т. brucei; гельминтов, таких как цестоды (ленточные черви), трематоды или нематоды (круглые черви, например Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus или Ancylostoma duodenale); паразитов, (например любые простейшие или гельминты, описанные здесь); грибы, такие как Aspergilli, Candidae, Coccidioides immitis и Cryptococci; загрязнители окружающей среды; водная добавку; сельскохозяйственный маркер; нуклеиновую кислоту, (например олигонуклеотиды, полинуклеотиды, нуклеотиды, нуклеозиды, молекулы ДНК или молекулы РНК, включая хромосому, плазмиду, вирусный геном, праймер или ген); белок, (например гликопротеин, металлопротеин, фермент, прион или иммуноглобулин); метаболит; сахар; липид; липополисахарид; соль; или ион. Мишени также включают пищевые патогены, такие как сальмонелла, (например Salmonella Typhimurium), патогенная кишечная палочка, (например O157: Н7), Bacillus, (например В. cereus), Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes, Yersinia, (например Y. enterocolitica), норовирус, (например вирус Норуолк), шигеллы, золотистый стафилококк, Toxoplasma gondii, Vibrio, (например V. vulnificus, V. cholera, V. parahaemolyticus), Campylobacter jejuni и Clostridium perfringens; и вооруженные патогены, такие как Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis, Brucella (например, В. suis), Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Shigella, Clostridium botulinum, Variola, (например вирус V. major), Filii, Filovi и Марбургский вирус), Arenaviridae, (например вирус Ласса и вирус Мачупо), Clostridium perfringens, любой пищевой патоген, (например виды сальмонеллы, Escherichia coli O157: Н7 или Shigella), Chlamydia psittaci, Coxiella burnetiia, Staphylococcal aus, (например R. prowazekii или R. rickettsii), альфа-вирус, (например вирус венесуэльского лошадиного энцефалита, вирус восточного лошадиного энцефалита или вирус западного лошадиного энцефалита), Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum, генипавирус, (например вирус Nipah, Buny), Hantavirus или вирус лихорадки Рифт-Валли), Flaviviridae, (например вирус японского энцефалита и вирус желтой лихорадки) и Coccidioides spp.

[0048] Эпитопы, которые могут детектироваться как аналиты или части аналита обычно представляют собой антигенные детерминантные участки на антигене, с которыми может специфически связываться иммуноголублин (или его антигенсвязывающий фрагмент). Эпитопы могут состоять как из последовательных, так и из не последовательных аминокислот, сближенных в третичной структуре белка. Эпитопы могут присутствовать на Fab (вариабельной) области иммуноглобулинов (называемых «идиотипическими детерминантами») и включают «идиотип» иммуноглобулина. Эпитоп и антиген могут быть получены естественным путем или искусственно. В зависимости от природы эпитоп или антиген могут быть выделены или очищены, например, из матрицы или исходного вещества, синтезированы или получены рекомбинантным путем. Эпитопы и антигены, используемые в качестве аналитов, могут быть происходить из человека или животного, не являющегося человеком, растений, бактерий, простейших, паразитов, вирусов и т.д. В некоторых вариантах реализации аналитом является полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, углевод, гликопротеин, липид, липопротеин, гликолипид или малая молекула. В некоторых вариантах реализации аналит выбран из ракового антигена, аутоантигена, аллергена, эндогенного антигена, антигена инфекционного агента, лекарственного (низкомолекулярного) антигена, токсина, яда, биологического антигена, антигена окружающей среды, антигена трансплантата и антигена имплантата.

[0049] Аналит может содержать эпитоп ракового антигена. В некоторых вариантах реализации аналит представляет собой опухолеассоциированный антиген. В некоторых вариантах реализации аналит представляет собой опухолеспецифический антиген. В некоторых вариантах реализации изобретения аналит представляет собой опухолеассоциированный антиген (ОАА), а ОАА представляет собой углеводный антиген, имеющий одну или несколько посттрансляционных модификаций, которые отличаются от белка микроорганизма дикого типа, содержит область слияния белка в результате слияния генов, которые присутствуют в злокачественных клетках, но не присутствуют в незлокачественных клетках, или где ОАА содержит рецепторную тирозинкиназу (RTK), которая разрегулирована или нефункциональная в опухолевых клетках вследствие аутокринной активации, хромосомной транслокации, гиперэкспресии RTK или мутациии приобретения функции в гене RTK или в белке. В некоторых вариантах реализации изобретения аналит представляет собой иммуноглобулин, экспрессируемый В-клеточной лимфомой. Примеры злокачественных новообразований В-клеток включают, но не ограничиваются ими, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, хронический лимфолейкоз, мантийно-клеточную лимфому и множественную миелому. К дополнительным в-клеточным злокачественным новообразованиям относятся, например, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмоцитарный лейкоз, лимфома маргинальной зоны селезенки, лимфома маргинальной зоны (внеузловая и узловая), новообразования из плазматических клеток, (например плазмоклеточная миелома, плазмоцитома, заболевания с отложением моноклонального иммуноглобулина, болезни тяжелой цепи) и фолликулярная лимфома, (например I, II, III или IV степени).

[0050] В некоторых вариантах аналит представляет собой опухолеассоциированный антиген, происходящий из опухолевых клеток, полученных от субъекта. В некоторых вариантах реализации опухолеассоциированный антиген представляет собой один или несколько антигенов, выбранных из следующих: 17-1A, 707-АР, AFP, аннексин II, ART-4, BAGE, BAGE-1, β-катенин, BCG, гибридное соединение bcr/abl, Bcr/abl е14а2, bcr-abl (b3a2), bcr-abl (b3a2), bcr-abl р190 (e1a2), bcr-abl р210 (b2a2), bcr-abl р210 (b3a2), bc-abl р210 (b3a2), буллезный пемфигоидный антиген-1, СА19-9, СА125, СА215, CAG-3, CAMEL, антиген рака яичка, каспаза-8, CCL3, CCL4, CD16, CD20, CD3, CD30, CD55, CD63, CDC27, CDK-4, CDR3, CEA, кластер 5, кластер-5А, цикликиназа-4, Сур-В, DAM-10, DAM-6, Dek-cain Е7, EGFR (РЭФР), EGFRvIII, EGP40, ELF2 М, EpCAM, FucGM1, G250, GA733, GAGE, GAGE-1-8, опухолеассоциированный антиген желудка, GD2, GD3, globoH, гликофорин, GM1, GM2, GM3, GnTV, Gn-TV, gp100, Her-2/neu, HERV-K-ME, высокомолекулярный связанный антиген, высокомолекулярный протеогликан (HMPG), HPV-16 Е6, HPV-16 Е7, HPVE6, HSP70-2M, HST-2, hTERT, хорионический гонадотропин человека (HCG)), Жирная глобула грудного молока (HMFG), iCE, KIAA0205, KK-LC-1, KM-HN-1, L6, LAGE-1, Lcose4Cer, LDLR/FUT, Lewis A, Lewis v/b, белок M, MAGE-1, MVC, MAGE-A1-12, MAGE-C2, MAHGE-3, MART-1/Melan-A, MC1R, ME491, MUC1, MUC2, муцин, MUM-1, MUM-2, MUM-3, мутированный p53, миозин, MZ2-E, N9 нейраминидаза, NA88, NA88-A, антиген назофарингеальной карциномы, NGA, NK1/с-3, новые bcr/ablk слитые BCR-экзоны 1, 13, 14 с ABL-экзонами 4, NY-ESO-1/LAGE-2, NY-ESO-1b, ОС125, ассоциированный с остеосаркомой антиген-1, Р15, р190, мимор bcr-abl (e1a2), р53, Pm1/RARa, полисиаловая кислота, PRAME, PSA, PSM, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, Сиалил LeA, Sp17, SSX-2, SSX-4, поверхностный иммуноглобулин, TAG-1, TAG-2, TEL/AML1, TPI, TRAG-3, TRP-1 (gp75), TRP-2, TRP2-INT2, hTRT, связанный с опухолью гликопротеин-72 (TAG-72), тирозиназа, u-PA, WT1 и XAGE-1b или иммуногенный фрагмент любого из вышеуказанных антигенов. В некоторых вариантах реализации опухолеассоциированный антиген идентифицируют с помощью SEREX (серологический анализ библиотеки экспрессии рекомбинантной кДНК) или на основе серологического скрининга библиотеки экспрессии кДНК, созданной из опухолевых тканей различного происхождения или линий раковых клеток, и идентификации иммуногенных опухолевых белков на основе их реактивности с аутологичными сыворотками пациентов. В некоторых вариантах реализации аналит представляет собой опухолеассоциированный антиген, который представляет собой акарбогидратный антиген, имеющий одну или несколько посттрансляционных модификаций, которые отличаются от белка животного дикого типа. В некоторых вариантах реализации опухолеассоциированный антиген содержит область слияния белка, полученную в результате слияния генов, которая повторно присутствует в злокачественных клетках, но отсутствует в незлокачественных клетках. В некоторых вариантах реализации опухолеассоциированный антиген содержит рецепторную тирозинкиназу, которая является дерегулированной и/или дисфункциональной в опухолевых клетках из-за аутокринной активации, хромосомных транслокаций, геперкспрессии RTK или мутации приобретения функции в гене или белке RTK.

[0051] Аналит может содержать эпитоп антигена инфекционного или неинфекционного агента, который может быть патогенным или непатогенным для субъекта. Аналит может быть получен из мутуалистического, паразитического или комменсального микроорганизма, включая любой микроорганизм в биоме животных или растений, такой как пробиотические или комменсальные микроорганизмы в пищеварительном тракте человека, поверхности слизистой оболочки или эпителий. В некоторых вариантах реализации бактериальный патоген выбран из следующих: Acinetobacter baumannii (ранее Acinetobacter calcoaceticus), Actinobacillus, Actinomyces pyogenes (ранее Corynebacterium pyogenes), Actinomyces israelii, nocardia asteroides, N. brasilienausaaisteriumterium et al., Aeromobacterium et al. Et al. haemolyticum), Arizona hinshawii - все серотипы, Bacillus anthracis, Bacteroides fragilis, Bartonella henselae, B. quintana, B. vinsonii, Bordetella, включая В. pertussis, Borrelia recurrentis, B. burgdorferi, Burkholderia (ранее принадлежавших к псевдошдомам) кроме перечисленных BSL III), Campylobacter coli, С. fetus, С. jejuni, Chlamydia psittaci, C. trachomatis, C. pneumonia, Clostridium botulinum (виды, продуцирующие нейротоксин), нейротоксины Clostridium botulinum, Cl. chauvoei, Cl. haemolyticum, Cl. histolyticum, Cl. novyi, Cl. septicum, Cl. Tetani, Cl. Perfirngens эпсилон-токсин, дифтерийная палочка, С. pseudotuberculosis, С. renale, Dermatophilus congolensis, Edwardsiella Tarda, эризипелоид, кишечная палочка - все энтеропатогенные, энтеротоксигенные, энтероинвазивные и штаммы, несущие антиген K1, в том числе кишечной палочки O157: Н7, Haemophilus ducreyi, Н. influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella - все виды, кроме K. oxytoca (RG1), Legionella, включая L. pneumophila, Leptospira interrogans - все серотипы, Listeria, Moraxella, Mycobacterium (кроме перечисленных в BSL III), включая M. avium complex, M. asiaticum, вакцинный штамм M. bovis BCG, M. chelonei, M. fortuitum, M. kansasii, M. leprae, M. malmoense, M. marinum, M. paratuberculosis, M. scrofulaceum, M. simiae, M. szulgai, M. ulcerans, M. xenopi, Mycoplasma, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitides, Nocardia asteroides, N. brasiliensis, N. otitidiscaviarum, N. transvalensis, Proteus mirabilis, P. vulgaris, включая Rhodococcus equi S. Salmon, S. arizonae. S. cholerasuis, S. enteritidis, S. gallinarum-pullorum, S. meleagridis, S. paratyphi, А, В, C, S. typhi, S. typhimurium, Shigella, включая S. boydii, S. dysenteriae, тип 1, S. flexneri, S. sonnei, Sphaerophorus necrophorus, Staphylococcus aureus, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus, в том числе S. pneumoniae, S. pyogenes, Treponema pallidum, T. carateum, Vibrio cholerae, V. parahemolyticus, Vulninalus, Vulnificus, V vulnificus, V. abortus, B. canis, B. suis, B. melitensis, Burkholderia (Pseudomonas) mallei, B. pseudomallei, Coxiella burnetii, Francisella tularensis, Mycobacterium bovis (кроме штамма BCG, BSL II - бактериальные агенты, включая хламидии), М. tuberculosis, микобактерии, отличные от туберкулеза (МОТТ), Pasteurella multocida типа В - «буйвол» и другие вирулентные штаммы. Rickettsia akari, R. australis, R. canada, R. conorii, R. prowazekii, R. rickettsii, R, siberica, R. tsutsugamushi, R. typhi (R. mooseri), Yersinia pestis.

[0052] Аналит может происходить из вирусного патогена. Например, в некоторых вариантах реализации аналит происходит из вирусного патогена, выбранного из следующих: аденовирусы, человека - всех типов, альфавирусов (тогавирусов), вируса восточного лошадиного энцефалита, вируса восточного лошадиного энцефаломиелита, вакцинного штамма венесуэльского лошадиного энцефаломиелита ТС-83, вируса Западного конского энцефаломиелита, Аренавируса, вируса лимфоцитарного хориоменингита (не нейротропные штаммы), комплекса вирусов Такарибе, Буниавируса, вируса Буньямвера, вакцинного штамма вируса лихорадки Рифт-Валли MP-12, Кальцивируса, коронавируса. Флавивирусы (тогавирусы) - арбовирусы группы В, серотипы вируса Денге типа 1, типа 2, типа 3 и типа 4, вакцинный штамм вируса желтой лихорадки 17D, вирусы гепатита А, В, С, D и Е, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, герпес симплекс типов 1 и 2, герпес зостер, герпесвирус человека 6 и 7, вирусы гриппа типов А, В и С, паповавирусы, вирусы папилломы, вирус ньюкаслской болезни, вирус кори, паротита, вирусы парагриппа типов 1, 2, 3, и 4, полиомавирусы (вирус JC, вирус BK), респираторно-синцитиальный вирус, человеческий парвовирус (В19), вирусы Коксаки типов А и В, эховирусы, полиовирусы, риновирусы, аластрим (минорный вирус Variola), оспа (крупный вирус Variola), Реовирусы белой оспы, Колтивирус, ротавирус человека и орбивирус (вирус клещевой лихорадки Колорадо), вирус бешенства, вирус везикулярного стоматита, рубивирус (краснуха), вирус леса Семлики, вирус энцефалита Сент-Луиса, вирус венесуэльского конского энцефалита, вирус венесуэльского конского энцефаломиелита (он же вирус южно-американской геморрагической лихорадки), Флексал, вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCM) (нейротропные штаммы), хантавирусы, включая вирус Хантаан, вирус лихорадки Рифт-Валли, вирус японского энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирус оспы обезьян, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1 и 2, Т-клеточный лимфотропный вирус человека (HTLV) типов 1 и 2, вирус иммунодефицита обезьян (SIV), вирус везикулярного стоматита, вирус гуанарито, вирус лихорадки Ласса, вирус Хунина, вирус Мачупо, Сабиа, вирус геморрагической лихорадки Крым-Конго, вирусы Эбола, Марбургский вирус, комплекс вируса клещевого энцефалита (флави), включающий в себя среднеевропейский клещевой энцефалит, дальневосточный клещевой энцефалит, Ханзалова, Гипр, Кумлинге, Кясанурская лесная болезнь, омская геморрагическая лихорадка, вирусы энцефалита русской весны и лета, герпесвирус simiae (вирус герпеса В или обезьян В), вирус герпеса 1 Cercopithecine (вирус герпеса В), морбилливирус лошадей (вирусы Hendra и Hendra-подобные), вирус Nipah, вирус Variola major (Smal) вирус оспы), вирус Variola minor (Alastrim), вирус африканской чумы свиней, вирус африканской чумы лошадей, вирус Акабане, вирус птичьего гриппа (высокопатогенный), вирус синего языка, вирус оспы верблюда, вирус классической чумы свиней, Cowdria ruminantium (гидроперикардит), вирус ящура, вирус оспы коз, вирус японского энцефалита, вирус узелковой кожной сыпи, вирус злокачественной катаральной лихорадки, вирус Menangle, вирус ньюкаслской болезни (VVND), вирус жвачных животных Peste Des Petits, вирус чумы крупного рогатого скота, вирус оспы овец, везикулярная свинья вирус болезни, вирус везикулярного стоматита (экзотический).

[0053] Аналит может происходить из паразита. Например, в некоторых вариантах реализации аналит происходит из паразита, выбранного из: анкилостоматид, включая А. duodenale, A. ceylanicum, аскарид, включая Ascaris lumbricoides suum, бабезии, включая В. divergens, В. microti, нитчатые черви, включая В. malayi, В. timori, кокцидий, криптоспоридий, включая С. parvum, Cysticercus cellulosae (гидатидная киста, личинка Т. solium), эхинококков, включая Е. granulosis, Е. multilocularis, Е. vogeli, дизентерийных амеб, возбудителей энтерибиоза, Фасциолеза, включая F gigantica, F. hepatica, Giardia, включая G. lamblia, возбудителей гетерофиеса, карликового цепня, включая Н. diminuta, Н. nana, Isospora, лейшмании, включая L. braziliensis, L. donovani, L. ethiopia, L. major, L. mexicana, L Peruvania, L. tropica, червей Loa loa filaria, микроспоридий, Naegleria fowlery, анкилостомы Некатора, включая N. americanus, червей Onchocerca filaria, включая О. volvulus, Plasmodium cynomologi, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, саркоцист, включая S. sui hominis, шистосом, включая S. haematobium, S. intercalatum, S. japonicum, S. mansoni, S. mekongi, Strongiloies, включая S. stercoralis, свиного цепня, токскокары, включая Т. canis, токсоплазм, включая Т. gondii, Trichinella spiralis, трипаносом, включая Т. Brucei Brucei, Т. Brucei Gambiense, Т. Brucei Rhodesiense, Т. Cruzi или черви филярии Wuchereria Bancrofti.

[0054] Аналит может происходить из вирусного патогена. Например, в некоторых вариантах реализации аналит происходит из грибкового патогена, выбранного из следующих: Aspergillus fumigates, Blastomyces dermatitidis, Cladosporium bantianum, Candida albicans, C. (Xylohypha) trichoides, Cryptococcus neoformans, Dactylaria galopava (Epopmumpumophophone), Ophropumophophon). (Wangiella) dermatitidis, Fonsecaea pedrosoi, Microsporum, Paracoccidioides braziliensis, Penicillium marneffei, Pneumocystis carinii, Sporothrix schenckii, Trichophyton, Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii. duboisii.

[0055] Аналит может происходить из вирусного патогена. В некоторых вариантах реализации аналит представляет собой токсин, выбранный из следующих: абрин, ботулинические нейротоксины, эпсилон-токсин Clostridium perfringens, конотоксины, диацетоксисцирпенол, рицин, сакситоксин, шигаподобные рибосомные инактивирующие белки, шигатоксин, стафилококковый энтеротоксин, токсин Т2 и тетродотоксин.

[0056] В некоторых вариантах осуществления аналит выбран из следующих: поверхностный антиген гепатита В (HBsAg), В. burgdorferi OspA, HPV L1, белок F RSV, гаммаглутанин гриппа, область ствол-петля гриппа, белок поверхности мерозоитов М2, Р. falciparum. 10, GLURP, SERA, S-антиген, семейство 6-цис, АМА1, ЕВА175, 140, 181, MTRAP, PTRAMP, ASP, Rh1, 2а, 2b, 4, 5, RAP1, 2, 3, RAMA, RHOPH1, 2 3, оксиспорозоитный белок P. vivax, спорозоитный поверхностный белок 2, SSP2/TRAP, CSP-N, CSP-R, CSP-C, MSP-1, MSP-9, DBPRIII, AMA-1, Pvs25, Pvs28, полисахарид оболочки S. aureus, поли-N-ацетилглюкозамин, ВИЧ gp120, gp41 и консервативная область вируса Денге.

[0057] В другом варианте реализации аналит содержит по меньшей мере один эпитоп аллергена. Аллергены могут быть естественными или искусственными, такими как аллергены, содержащиеся в аллерговакцинах. Примеры аллергенов включают следующие, но не ограничиваются ими: продукты животного происхождения (например, Fel d1, перхоть меха, чешуйки (calyx) таракана, шерсть, экскременты пылевого клеща), лекарственные средства, (например пенициллин, сульфонамиды, салицилаты, местный анестетик), продукты питания, (например стебель сельдерея и корень сельдерея, кукуруза, яйца, (например альбумин), фрукты, бобовые, (например бобы, горох, арахис, соя), молоко, морепродукты, (например моллюски), кунжут, соя, лесные орехи, (например орехи пекан, миндаль), пшеница, яд насекомых, (например огненные муравьи, яд пчелиного укуса, яд осы), латекс, металл, пыльца растений, (например трава райграс, тимофеевка), сорняки, (например амброзия, подорожник, крапива, полынь обыкновенная, марь белая, щавель) и деревья, (например береза, ольха, лещина, граб, конский каштан, ива, тополь, платан, липа, олива, можжевельник (Ashe juniper)).

[0058] В некоторых вариантах реализации аналит представляет собой аллерген, полученный из латексного белка, например необработанного латексного сока, необработанного латекса, содержащего аммиак, или готового латексного продукта, в котором белки были подвергнуты воздействию химических веществ и высоких температур. В некоторых вариантах реализации аллергеном является аллерген клеща, например Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus, Acarus siro, Blomia tropicalis, Chortoglyphus arcuatas, Euroglyphus cannei, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae, или Glyphagus demesticus. В некоторых вариантах реализации аллерген происходит из яда, например Bombus spp., Vespa crabro, Apis mellifera, Dolichovespula spp., Polistes spp., Vespula spp., Dolichovespula maculata или Dolichovespula arenaria. В некоторых вариантах осуществления аналит представляет собой аллерген насекомого, например Camponotus pennsylvanicus, Solenopsis invicta, Solenopsis richteri, Periplaneta americana, Blattella germanica, Blatta orientails, Tebanus spp., Musca domestica, Ephemeroptera spp., Culicidae sp., Или Culicidae sp., Culicidae. Heterocera spp.

[0059] В некоторых вариантах реализации аналитом аллергена является эпителий, перхоть или волосы из организма, например Serinus canaria, Felis catus (domesticus), Bos taurus, Gallus gallus (domesticus), Canis acquis, Arias platyrhynchos, Meriones unguiculatus, Capra hircus, Anser domesticus, Cavia porcellus (cobaya), Mesocrietus auratus, Sus scrofa, Equus caballus, Mus musculus, Psittacidae, Columba flaviata, Oryctolagus cuniculus, Rattus norvegicus или Ovis aries.

[0060] В некоторых вариантах реализации аналит аллергена получают из грибов, например Cephalosporium acremonium, Alternaria tenuis, Aspergillus glaucus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus versicolor, Aureobasidium pullulan (Pullularia pullulans), Drechslera sorokiniana, Helminthosporium sativum, Botrytis cinerea, Candida albicans, Chaetomium globosum, Cladosporium herbarum, Cladosporium sphaerospennum (Homodendrum hordei), Drechslera spicifera (Curvularia spicifera), Epicoccum nigrum (Epicoccum purpurascens), Epidermophyton floccosum, Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Geotrichum candidum, Gliocladium viride, Helminthosporium solani, Microsporum canis, Mucor circinelloidesf circinelloides, Mucor circinelloidesf lusitanicus, Mucor plumbous, Mycogone perniciosa, Neurospora intermedia, Nigrospora oryzae, Paecilomyces variotii, Penicillum brevicompactum, Penicillum camembertii, Penicillum chrysogenum, Penicillum digitatum, Penicillum expansum, Penicillum notatum, Penicillum roquefortii, Phoma betae, Phoma herbarum, Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer, Rhodotorula mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, Scopulariopsis brevicaulis, Serpula lacrymans, Setosphaeria rostrata, Stemphylium botryosum, Stemphylium solani, Trichoderma harzianum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, или Trichothecium roseum. В некоторых вариантах реализации аллерген происходит из головни, например Ustilago nuda, Ustilago cynodontis, Ustilago candis, Sporisorium cruentum, Ustilago avenae или Ustilago tritici.

[0061] В некоторых вариантах реализации аналит аллергена получают из травы, например Paspalum notatum, Cynodon dactylon, Poapressa, Bromus inennis, Phalaris arundinacea, банки Zea, Elytrigia repens (Agropyron repens), сорго haelpense, Poa pratensis, Festutior (Festuca)), Avena sativa, Dactylis glomerata, Agrostis gigantea (alba), Secale cereale, Leymus (Elymus) конденсатный, Lolium perenne ssp.multiflorum, Lolium perenne, Anthoxanthum odoratum, Phleum pratense, Holcus lanatus, Triticum aestivum или Elymus (Agropyron) smithii.

[0062] В некоторых вариантах реализации аналит аллергена происходит от сорняков, например Atriplex polycarpa, Baccharis halimifolia, Baccharis sarothroides, Hymenoclea salsola, Amaranthus hybridus, Xanthium strumarium (commune), Rumex crispus, Eupathium capillifolium, Solidago spp., Amaranthus tuberculatus (Acnida tamariscina), Allenrolfea occidentalis, Chenopodium botrys, Kochia scoparia, Chenopodium album, Iva xanthifolia, Iva angustifolia, Chenopodium ambrosioides, Artemisia vulgaris, Artemisia ludoviciana, Urtica dioica, Amaranthus spinosus, Plantago lanceolata, Iva axillaris, Atriplex lentiformis, Ambrosia dumosa, Ambrosia acanthicarpa, Ambrosia trifida, Ambrosia artemisiifolia, Ambrosia confertiflora, Ambrosia bidentata, Ambrosia psilostachya, Salsola kali (pestifer), Artemisia californica, Artemisiafrigida, Artemisia tridentata, Atriplex wrightii, Atriplex confertifolia, or Artemisia annua.

[0063] В некоторых вариантах осуществления аналит аллергена получают из дерева, например Acasia spp., Alnus glutinosa, Alnus rubra, Alnus incana ssp.rugosa, Alnus rhombifolia, Fraxinus velutina, Fraxinus pennsylvanica, Fraxinus latifolia, Fraxinus americana, Populus tremuloides, Myrica cerifera, Fagus grandifolia (americana), Casuarina equisetifolia, Betula lenta, Betula pendula, Betula nigra, Betula occudentalis (fontinalis), Betula populifolia, Acer negundo, Cryptomeria japonica, Juniperus ashei (sabinoides), Juniperus virginiana, Tamarix gallica, Populus balsamifera ssp.trichocarpa, Populus deltoides, Populusfremontii, Populus wislizeni, Populus monilifera (sargentii), Cupressus arizonoca, Taxodium distichum, Cupressus sempervirens, Ulmus americana, Ulmus crassifolia, Ulmus pumila, Eucalyptus globulus, Celtis occidentalis, Corylus americana, Corylus avellana, Carya ovata, Carya laciniosa, Carya alba, Juniferus monosperma, Juniperus princhotii, Juniperus scopulorum, Juniperus occidentalis, Robinia pseudoacacia, Mangifera indica, Acer macrophyllum, Acer rubrum, Acer saccharum, Melaleuca quinquenervia (leucadendron), Prosopis glandulosa (juliflora), Broussonetia papyrifera, Morus rubra, Morums alba, Quercus gambelii, Quercus velutina, Quercus macrocarpa, Quercus kelloggii, Quercus agrifolia, Quercus lobata, Quercus ilex, Quercus stellata, Quercus rubra, Quercus dumosa, Quercus virginiana, Quercus nigra, Quercus garryana, Quercus alba, Olea europaea, Elaegnus angustifolia, Citrus sinensis, Arecastrum romanzoffianum (Cocos plumosa), Carya illnoensis, Schinus molle, Schinus terebinthifolius, Pinus taeda, Pinus strobus, Pinus palustris, Pinus ponderosa, Pinus elliottii, Pinus virginiana, Pinus monticola, Pinus echinata, Populus nigra, Populus alba, Ligustrum vulgare, Liquidambar styraciflua, Platanus occidentalis, Platanus orientalis, Platanus racemosa, Platanus acerifolia, Juglans nigra, Juglans californica, Juglans regia, Salix lasiolepsis, Salix nigra, or Salix discolor. В некоторых вариантах реализации аллерген получают из цветка, например Chrysanthemum leucanthemum, Taraxacum officinale или Helianthus annuus. В некоторых вариантах реализации аллерген получают из сельскохозяйственного растения, например Medicago sativa, Ricinus communis, Trifolium pratense, Brassica spp., или Beta vulgaris.

[0064] В некоторых вариантах реализации аналит аллергена получают из растительной пищи (пищевого растения), например Prunus dulcis, Malus pumila, Prunus armeniaca, Musa paradisiaca (sapientum), Hordeum vulgare, Phaseolus lanatus, Phaseolus vulgaris, Phaseolus sp., Phaseolus sp., Phaseolus vulgaris, Rubus allegheniensis, Vaccinium sp., Brassica oleracea var. botrytis, Fagopyrum esculentum, Brassica oleracea var. capitata, Theobroma cacao, Cucumis melo, Daucus carota, Brassica oleracea var. botrytis, Apium graveolens var. dulce, Prunus sp., Cinnamomum verum, Coffea arabic, Zea cans, Vaccinium macrocarpon, Cucumis sativus, Allium sativum, Zingiber officinale, Vitis sp., Citrus paradisi, Humulus lupulus, Citrus limon, Lactuca sativa, Agaricus campestris, Brassica sp., Myristica fragrans, Avena sativa, Olea europaea, Allium сера var. сера, Citrus sinensis, Vigna unguiculata, Pisum sativum, Prunus persica, Pyrus communis, Piper nigrum, Capsicum annuum var. annuum, Ananas comosus, Ipomoea batatas, Solanum tuberosum, Rubus idaeus var. idaeus, Oryza sativa, Secale cereale, Sesamum orientale (indicum), Glycine max, Spinacia oleracea, Cucurbita pepo var. melopepo, Fragaria chiloensis, Lycopersicon esculentum (lycopersicum), Brassica rapa var. rapa, Vanilla planifolia, Citrullus lanatus var. lanatus, или Triticun aestivum.

[0065] В некоторых вариантах реализации аналит аллергена получают из рыбы или моллюсков, например Micropterus sp., Ictalurus punctatus, Mercenaria mercenaria, Gadus morhua, Callinectes sapidus, Platichthys sp., Hippoglossus sp., Homarus americanus, Scomber scombrus, Crassostrea virginica, Sebastes marinus, Salmo salar, Clupeiformes, Pecten magellanicus, Penaeus sp., Salvelinus sp., or Thunnus sp.В некоторых вариантах реализации аллерген представляет собой пищевой продукт для животных, например, полученный из Bos taurus, Ovis aries или Sus scrofa. В некоторых вариантах реализации аллерген представляет собой птицепродукт, например продукты из курицы (Gallus gallus) или продукты из индейки (Meleagris gallopavo). В некоторых вариантах реализации аллерген получают из молочного продукта, например бычьего казеина или бычьего молока. В некоторых вариантах реализации аллергеном является орех, например Bertholletia excelsa, Anacardium oceidentale, Cocos nucifera, Corylus americana, Arachis hypogaea, Carya illinoensis, Juglans nigra или Juglans regia. В некоторых вариантах аллергеном является пыль, например пыль зерна ячменя, пыль зерна кукурузы, домашняя пыль, пыль матраса, пыль зерна овса, пыль зерна пшеницы, пыль обивки или латексная пыль.

[0066] В некоторых вариантах реализации антиген аналита представляет собой аутоантиген, связанный с аутоиммунным нарушением. В некоторых вариантах реализации аутоиммунное нарушение представляет собой клеточное или органоспецифическое аутоиммунное нарушение, а аутологичный антиген аналита выбирают из следующих: ацетилхолиновый рецептор (миастения), актин (хронический активный гепатит, первичный билиарный цирроз), транслокатор адениннуклеотидных антител (ANT) (дилатационная кардиомиаптиия, миокардит), бета-адренорецептор (дилатационная кардиомиопатия), декарбоксилаза ароматических L-аминокислот (аутоиммунный полиэндокринный синдром типа I (APS-1)), рецептор асиалогликопротеина (аутоиммунный гепатит), бактериальный белок/белок, повышающий проницаемость (Bpi) (муковисцидоз васкулитов), кальций-чувствительный рецептор (приобретенный гипопаратиреоз), фермент расщепления боковой цепи холестерина (CYPIIa) (APS-1), альфа3-цепь коллагена типа IV (синдром Гудпасчера), цитохром Р450 2D6 (CYP2D6) (аутоиммунный гепатит)), десмин (болезнь Крона, болезнь коронарной артерии), десмоглеин 1 (пузырчатка фолиевая), десмоглейн 3 (пузырчатка обыкновенная), F-актин (аутоиммунный гепатит), ганглиозид ГМ (Гийен-Барре) синдром), глутаматдекарбоксилаза (GAD65) (диабет 1 типа, синдром ригидности), рецептор глутамата (GLUR) (энцефалит Расмуссена), Н/K-АТФаза (аутоиммунный гастрит), 17-альфа-гидроксилаза (CYP17) (APS-1) 21-гидроксилаза (CYP21) (болезнь Аддисона), IA-2 (ICA512) (диабет типа 1), инсулин (диабет типа 1, гипогликемический синдром инсулина (болезнь Хирата), резистентность к инсулину типа В, акантоз, системная красная волчанка (SLE))), внутренний фактор типа 1 (пернициозная анемия), антиген, ассоциированный с функцией лейкоцитов (LFA-1) (резистентный к лечению лимфатический артрит), гликопротеин, ассоциированный с миелином (MAG) (полиневропатия), основной белок миелина (рассеянный склероз, демиелинизирующее заболевание)), миелиновый олигодендроцитный гликопротеин (MOG) (рассеянный склероз), миозин (ревматическая лихорадка), р-80-Coilin (атопический дерматит), пируватдегидрогеназнвй комплекс Е2 (PDC Е2) (первичный билиарный цирроз), Натрий-йодидный симпортер (NIS) (Болезнь Грейвса, аутоиммунный гипотиреоз), SOX-10 (витилиго), общий белок щитовидной железы и глазной мышцы белок (аутоиммунный тиреоидит), пероксидаза щитовидной железы (аутоиммунный тиреоидит Хашимото), рецептор тиреотропина (болезнь Грейвса), тканевая трансглутаминаза (целиакия), транскрипционный коактиватор р75 (атопический дерматит), гидроксилаза триптофана (APS-1), тирозилана, метастазолазит (тиопластиногруппа, тироизиназа, витроциланаз, тирозилана)) и тирозин-гидроксилаза (APS-1), где аутоиммунное заболевание(я) перечислены в скобках сразу после каждого связанного с аутологичным антигеном аналита.

[0067] В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой системное аутоиммунное нарушение, а аутологичный антиген аналита выбран из следующих: АКТГ (дефицит АКТГ), аминоацил-тРНК-гистидилсинтетаза (миозит, дерматомиозит), аминоацил-тРНК-синтетаза (полимиозит, дерматомиозит), кардиолипин (СКВ), карбоангидраза II (СКВ, синдром Шегрена, системный склероз (коллагеновидный скелет), коллаген (системный склероз, коллаген), коллаген RA), SLE, прогрессирующий системный склероз), ассоциированный с центромерой белок (системный склероз), ДНК-зависимая нуклеосомо-стимулированная АТФаза (дерматомиозит), фибрилларин (склеродермия), фибронектин (SLE, RA, морфея), глюкозо-6-фосфат-изомераза (RA), Beta2-гликопротеин I (Beta2-GPI) (первичный антифосфолипидный синдром), голгин (golgin, 95, 97, 160 и/или 180) (синдром Шегрена, SLE, RA), белок теплового шока (различные нарушения, связанные с иммунитетом), белок гемидесмосомы 180 (буллезный пемфигоид, герпес гестационный, рубцовый пемфигоид, гистон Н2А-Н2 В-ДНК (SLE), рецептор IgE (хроническая идиопатическая крапивница), кератин (RA), Ku-ДНК-протеинкиназа (SLE), Ku-нуклеопротеин (синдромы соединительной ткани), La phosphoprotein (La 55-В) (синдром Шьорена ome), миелопероксидаза (некротический и цесцентный гломерулонефрит (NCGN), системный васкулит), протеиназа 3 (PR3) (гранулематоз Вегенера, синдром Шурга-Штрауса), РНК-полимераза I-III (RNP) (системный склероз, SLE), сигнальный белок распознавания (SRP54) (полимиозит), топоизомераза-1 (Scl-70) (склеродермия, синдром Рейно), тубулин (хроническое заболевание печени, висцеральный лейшманиоз) и виментин (системное аутоиммунное заболевание), в котором аутоиммунные заболевания перечислены в скобках сразу после каждого аутологичного антигена.

[0068] В некоторых вариантах реализации аутоиммунное заболевание представляет собой аутоиммунное нарушение белка плазмы или аутоиммунное нарушение цитокинов, а аутологичный антиген аналита выбирается из следующих: ингибитор С1 (аутоиммунный дефицит C1), C1q (SLE, мембрано-пролиферативный гломерулонефрит (MPGN)), цитокин (например, IL-1 альфа, IL-1бета, IL-, IL-10, LIF) (РА, системный склероз), фактор II (увеличенное время коагуляции), фактор V (увеличенное время коагуляции), фактор VII (увеличенное время коагуляции), фактор VIII (увеличенное время коагуляции), фактор IX (увеличенное время коагуляции), фактор X (увеличенное время коагуляции), фактор XI (увеличенное время коагуляции), фактор XII (увеличенное время коагуляции), тромбин (увеличенное время коагуляции), vWF (увеличенное время коагуляции), гликопротеин IIb/IIIg и Ib/IX (аутоиммунная тромбоцитопения пурпура), IgA (иммунодефицит) и окисленный ЛПНП (OxLDL) (атеросклероз), где ассоциированное аутоиммунное заболевание(я) перечислены в скобках сразу после каждого связанного с аутологичным антигеном аналита.

[0069] В некоторых вариантах реализации аутоиммунное нарушение представляет собой рак или паранеопластическое аутоиммунное нарушение, а связанного с аутологичным антигеном аналита выбирают из следующих: амфифизин (невропатия, мелкоклеточный рак легких), циклин В1 (гепатоцеллюлярная карцинома), ДНК-топоизомераза II (рак печени), десмоплакин (паранеопластическая пузырчатка), гефирин (синдром паранеопластического ригидного синдрома), белок Hu (паранеопластический энцефаломиелит), нейрональный никотиновый ацетилхолиновый рецептор (подострая вегетативная невропатия, рак), р53 (рак, SLE), р62 (mG-IG-белок), связывание р62 (IGF) (гепатоцеллюлярная карцинома), рековерин (связанная с раком ретинопатия), белок R1 (паранеопластическая опсоклонусная атаксия), бета-IV спектрин (синдром нижних двигательных нейронов), синаптотагмин (миастенический синдром Ламберта-Итона), потенциал-управляемые кальциевые каналы (миастенический синдром Ламберта-Итона) и белок Йо (паранеопластическая мозжечковая дегенерация).

[0070] В некоторых вариантах реализации антигенного аналита представляет собой эндогенный антиген, который является аберрантно экспрессируемым полипептидом. Примеры таких эндогенных антигенов включают следующие, но не ограничиваются ими: амилоид бета (А-бета), альфа-синуклеин, цистатин С, Тау, ARri, ADan, супероксиддисмутаза (СОД), мутантный хантингтин, PrP^sc или фрагмент любого из перечисленных.

[0071] В некоторых вариантах реализации изобретения аналит содержит по меньшей мере один эпитоп имплантата (импланта) для введения субъекту, продукты метаболизма или разложения материала имплантата или вещества, которые специфически связываются с эпитопом материала имплантата, такие как антитела, разработанные к материалу имплантата или продуктам его разрушения. Такие имплантаты могут включать, например, имплантаты с электрическим приводом, (например искусственные водители ритма), биоимплантаты (биоматериал, хирургически имплантируемый в тело субъекта для замены поврежденной ткани, (например ортопедический реконструктивный протез), протезы сердца (искусственные клапаны), кожи и роговицы), противозачаточные имплантаты, зубные имплантаты, ортопедические имплантаты и устройства для предотвращения адгезии. Примеры материалов имплантатов, которые могут нести эпитопы, включают латекс; силикон; металлы, такие как сплавы кобальт-хром (Co-Cr), титан и титановые сплавы; полимеры, такие как полиэтилен сверхвысокой молекулярной массы (СВМПЭ) и полиметилметакрилатный цемент (ПММА); и биокерамика, такая как гидроксиапатит и биостекло.

[0072] В некоторых вариантах реализации не являющийся антителом связывающий элемент может представлять собой бактериальный связывающий белок или связывающий домен антитела. Предопределенный аналит может быть выбран из следующих: полезных бактерий кишечника, патогенных бактерий, белковых токсинов, белковых биомаркеров, низкомолекулярных токсинов, метаболитов или боевых химических агентов. Для таких аналитов в некоторых вариантах реализации анализ модифицируется в конкурентный формат, в котором низкомолекулярный аналит связан с белком или другим макромолекулярным носителем таким образом, что антитела к свободному аналиту также распознают иммобилизованный аналит (если нет доступных антител, их можно получить путем иммунизации животных иммобилизованным аналитом). Иммобилизованный аналит агрегирует клеточные рецепторы, связанные с антителом против аналита, и дает люминесцентный сигнал. Если иммобилизованный аналит смешать с измеряемым свободным аналитом, который не приводит к агрегации, люминесцентный сигнал будет ослаблен. Активатором может быть рецептор, а не являющийся антителом связывающий элемент может представлять собой лиганд, который специфичен для рецептора и вызывает конформационное изменение, (а не агрегацию) в рецепторе при связывании с ним, где лиганд способен к связыванию с рецептором только после того, как он связался с предопределенным аналитом. Лиганд может быть присоединен к детектору, при этом детектор может предотвращать связывание лиганда с рецептором, если лиганд сначала не связался с предопределенным аналитом. Активатором также может быть рецептор, который был сконструирован для связывания определенного (заранее определенного) аналита, причем рецептор претерпевает конформационное изменение при связывании этого определенного аналита. Опять же, этот вариант не основан на эффекте агрегации. Однако в других вариантах реализации событие агрегации может быть опосредовано молекулой-носителем, такой как сывороточный альбумин, который связывает множество копий мишени, таких как физиологические или лекарственные метаболиты.

Пример биосенсора I

[0073] Со ссылкой на фиг. 1а-b, первый биосенсор 100 в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения включает Т-клетки Jurkat 102, которые были сконструированы для продуцирования экворина 104 и были нагружены CTZ 106 для образования комплекса экворин/CTZ, как было описано ранее. Этот конкретный биосенсор также был сконструирован для экспрессии трансмембранного элемента 108, не передающего сигнал антитела, который представляет собой IgGbp-CD3ζ (SEQ ID NOS: 5-6), хотя трансмембранный не являющийся антителом передающий сигнал элемент, FcγRI-CD3ζ (SEQ ID NO: 11-12) можно тоже использовать с биосенсором 100. Биосенсорная клетка 102 также включает, по меньшей мере, один путь передачи сигнала 110, активация которого приводит к повышению внутриклеточного Са2+112. Как показано на фиг. 1b, когда достаточное количество детекторных молекул 114, (например растворимых антител), с которыми связан целевой аналит 116, (например E.coli 0157), связывается с не являющимися антителами передающими сигналы трансмембранными элементами 108, активируется путь передачи сигнала 110, увеличивается содержание внутриклеточного Са2+112, комплекс экворин/CTZ претерпевает конформационное изменение и испускает сигнал (фотон) света 118, который детектируется фотоумножителем 120, и пиковое отклонение 122 графически отображается на аналитическом устройстве (см. описание ниже), указывая на присутствие целевого аналита 116 в анализируемом образце. Отображаемая информация может иметь как качественный, таки и количественный характер в отношении целевого аналита 116.

Пример биосенсора II

[0074] Со ссылкой на фиг. 2а-b второй биосенсор 200 в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения включает тучные клетки 202 МС/9 (АТСС^® CRL-8306™), которые были сконструированы для продуцирования экворина 204 и были нагружены CTZ 206 для образования комплекса экворин/CTZ, как было описано ранее. Данный биосенсор экспрессирует нативный рецептор Fc эпсилон (то есть, Fc RI) 207, который связывается с растворимым не являющимся антителом передающим сигнал растворимым элементом 208, который представляет собой IgGbp-IgE (SEQ ID NO: 13-14), хотя не являющийся антителом передающий сигнал элемент FcγRI-IgE. (SEQ ID NO: 15-15), также можно использовать с биосенсором 200. Как показано на фиг. 2b, когда достаточное количество детекторных молекул 214, (например растворимых антител), с которыми связан целевой аналит 216, (например E.coli 0157), связывается с не являющимися антителами передающими сигнал элементами 208, которые ранее связались с нативными рецепторами Fc эпсилон 207, активируется путь передачи сигнала 210, повышается содержание внутриклеточного Са2+212, комплекс экворин/CTZ претерпевает конформационное изменение и испускает сигнал (фотон) света 218, который детектируется фотоумножителем 220, и пиковое отклонение 222 графически отображается на аналитическом устройстве (см. описание ниже), указывающее на присутствие целевого аналита 216 в тестируемом образце. Отображаемая информация может иметь как качественный, таки и количественный характер в отношении целевого аналита 216.

Пример биосенсора III

[0075] Со ссылкой на фиг. 3а-b, третий биосенсор 300 в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения включает тучные клетки 302 МС/9 (АТСС^® CRL-8306™), которые были сконструированы для продуцирования экворина 304 и были нагружены CTZ 306 для образования комплекса экворин/CTZ, как было описано ранее. Данный биосенсор экспрессирует нативный рецептор Fc эпсилон (то есть, Fc RI) 307, который связывается с не являющимся антителом передающим сигнал элементом 308, который представляет собой IgGbp-IgE (SEQ ID NO: 13-14), хотя не являющийся антителом передающий сигнал элемент FcγRI-IgE (SEQ ID NO: 15-15) также можно тоже использовать с биосенсором 300. В этом конкретном варианте реализации биосенсорные клетки 302 были дополнительно сконструированы для экспрессии IgGbp-IgE и экспреции этого не являющегося антителом передающего сигнал элемента, во внеклеточное пространство, где он связывается с нативным FcεRI, экспрессируемым на поверхности клетки. Как показано на фиг. 3b, когда достаточное количество детекторных молекул 314, (например растворимые антитела), с которыми связан целевой аналит 316, (например E.coli 0157), связывается с не являющимися антителами передающими сигнал элементами 308, которые ранее связались с нативными рецепторами 307 эпсилона Fc, активируется путь передачи сигнала 310, повышается содержание внутриклеточного Са2+312, комплекс экворин/CTZ претерпевает конформационное изменение и испускает сигнал (фотон) света 318, который детектируется фотоумножителем 320, и пиковое отклонение 322 графически отображается на аналитическом устройстве (см. описание ниже), указывая на присутствие целевого аналита 316 в тестируемом образце. Отображаемая информация может иметь как качественный, таки и количественный характер в отношении целевого аналита 316.

Пример биосенсора IV

[0076] Со ссылкой на фиг. 4, четвертый биосенсор 400 в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения включает биосенсорные клетки 402, которые были сконструированы для продуцирования экворина и для экспрессии трансмембранного не являющегося антителом передающего сигнал элемента 408, который представляет собой mSA-CD3ζ (SEQ ID NO: 17-18). Не являющийся антителом передающий сигнал элемент mSA-CD3ζ (мономерный стрептавидин-CD3ζ), связывается с биотинилированной детекторной молекулой 414, которая специфически связывается с молекулой-мишенью 416, такой как, например, эпидермальный фактор роста (EGF). Антитело 417 к молекуле-мишени, такое как, например анти-EGF, создает мультимеры мишени, которые кластеризуют множество элементов, передающих сигнал, и индуцируют передачу сигнала, как описано ранее. В других вариантах реализации мономерный стрептавидиновый компонент заменяется биотинилированным компонентом, и можно применять альтернативные связи.

Пример биосенсора V

[0077] Со ссылкой на фиг. 5, пятый биосенсор 500 в соответствии с примерным вариантом реализации настоящего изобретения включает в биосенсорные клетки 502, которые были сконструированы для продуцирования экворина и для экспрессии не являющегося антителом передающего сигнал трансмембранного элемента 508, который представляет собой mSA-CD3ζ (SEQ ID NO: 17-18). He являющийся антителом передающий сигнал элемент mSA-CD3ζ (мономерный стрептавидин-CD3ζ) связывается с биотинилированной детекторной молекулой 514, которая в некоторых вариантах реализации является молекулой аутологичного антигена. Биотинилированная детекторная молекула 514 специфически связывается с молекулой-мишенью 516, которая в некоторых вариантах является молекулой антиаутологичного антигена. Аутоиммунные антитела в образце сыворотки создают мультимеры мишени, которые кластеризуют несколько передающих сигнал элементов и индуцируют передачу сигнала, как описано ранее. В других вариантах реализации мономерный стрептавидиновый компонент заменяется биотинилированным компонентом, и можно применять альтернативные связи.

[0078] Аминокислотные последовательности передающего сигнал полипептида, используемого для получения химерных белков согласно изобретению, могут иметь по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 87.5%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 92.5%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97.5%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% идентичность последовательности или сходство с белками или доменами, идентифицируемых по или в следующих регистрационных номерах: IgM с тяжелыми цепями (База генетических данных: САС20458.1), Ig-альфа (Р11912.2, GI: 547896), Ig-бета (Р40259.1 GI: 728994), CD19 (ААА69966.1 GI: 901823), CD3zeta (Р20963.2, GI: 23830999), IgE альфа (1F2Q_A, GI: 9257150) и Fc-эпсилон-R1 субъединица альфа (Р12319.1, GI: 119865).

[0079] Белок A Staphylococcus aureus (Р02976.3, GI: 110283003) кодируется геном spa Staphylococcus aureus, его структура, включая его Ig-связывающие сегменты и иммуноглобулин-связывающие свойства хорошо известны и включены со ссылкой на Graille et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2000 9 мая; 97(10): 5399-404; и Roben et al. J Immunol. 1995 15 июня; 154 (12): 6437-45. Варианты белка А или его иммуноглобулинсвязывающих сегментов, имеющие по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 87.5%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 92.5%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97.5%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% идентичность последовательности или сходство с известными аминокислотными последовательностями белка А и способность связываться с иммуноглобулином или другим аналитом, такими как описанные Graille et al. и Roben, et al., могут быть получены молекулярно-биологическими методами, хорошо известными в данной области, включая прямой синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулинсвязывающую аминокислотную последовательность.

[0080] Другие бактериальные иммуноглобулин-связывающие белки, такие как Streptococcus Protein G и инженерные варианты таких белков, известны и включены посредством ссылки на Bailey, et al., J. Immunol Methods. 2014 дек 15; 415: 24-30 (doi: 10.1016/j.jim.2014.10.003) (Epub 2014, 22 октября); и Watanabe и др. J Biol Chem. 2009 год, 1 мая; 284(18): 12373-8 (doi: 10.1074/jbc.M809236200) (Epub 2009, 6 марта). Варианты белка G или его иммуноглобулинсвязывающих сегментов, имеющие по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 87.5%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 92.5%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97.5%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% идентичность последовательности или сходство с известными аминокислотными последовательностями белка G и способность связываться с иммуноглобулином или другим аналитом, такими как описанные Bailey et al. и Watanabe, et al., могут быть получены молекулярно-биологическими методами, хорошо известными в данной области, включая прямой синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулинсвязывающую аминокислотную последовательность.

[0081] Fc-рецепторы (FcR) связываются с Fc-частью иммуноглобулина, известно много типов таких Fc-рецепторов, включая FcyRI и FceRI.. Структурные и функциональные характеристики связывания этих FcR включены посредством ссылки на Fridman, FASEB J. 1991 Сентябрь; 5(12): 2684-90. Варианты рецепторов FcR или их иммуноглобулин-связывающие сегменты, имеющие по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 87.5%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 92.5%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97.5%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% идентичность последовательности или сходство с известной аминокислотной последовательностью FcR, такие как последовательности, которые опивал Fridman, могут быть получены молекулярно-биологическими методами, хорошо известными в технике, в том числе путем прямого синтеза нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноглобулин-связывающие аминокислотные последовательности.

[0082] Передающий сигнал белок согласно изобретению может иметь по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 87.5%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 92.5%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97.5%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% идентичность последовательности или сходство с раскрытыми передающими сигнал химерными белками, описанными SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 18, а также обладает способностью связывать аналит, такой как иммуноглобулин, и затем передавать сигнал в сконструированную биосенсорную клетку. Такие варианты могут быть сконструированы хорошо известными в области молекулярной биологии методами или химическим синтезом полинуклеотидов, кодирующих вариабельные химерные репортерные белки, вставкой кодирующих последовательностей в вектор и трансформацией или трансфекцией компетентной клетки с помощью вектора.

Сортировка и клонирование клеток

[0083] Проектирование и конструирование биосенсоров по настоящему изобретению дает смешанную популяцию биосенсорных клеток при культивировании. Некоторые клетки не экспрессировали встроенные (рекомбинантные) факторы, тогда как другие экспрессировали факторы на разных уровнях. После успешной электропорации и встраивания генов биосенсорные клетки культивировали и тестировали на биологический ответ (флэш-сигнал) в виде смешанных популяций. Сортировку отдельных клеток выполняли с применением проточного цитометра. Клетки выделяли и затем размножали для анализа, чтобы отобрать те, которые экспрессировали наиболее высокий уровень целевых белков. Для этого процесса флуоресцентно меченные антитела использовали для нацеливания на разные рецепторы на биосенсорных клетках, тем самым обеспечивая процесс сортировки. Отдельные клоны подвергали скринингу на передачу сигналов, отбирали лучшие клоны. В этом процессе были идентифицированы и выделены наиболее подходящие клоны. Флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS) и окрашивание живых клеток на внеклеточный белок проводили, как описано ниже.

[0084] Сконструированные биосенсорные клетки подсчитывали, осторожно центрифугировали и повторно суспендировали в промывочном буфере (HBSS + 2% БСА) до конечной концентрации 1×10⁷-1×10⁸ клеток/мл. В каждом эксперименте использовали либо полное антитело с областью Fc, либо F(ab)₂. При использовании полного антитела 1-0,5 мкг антитела, блокирующего Fc рецептор, добавляли в каждую пустую пробирку размером 12×15 мм, предназначенную для приема клеток. В каждую из этих пробирок поверх Fc-блокирующего антитела добавляли 100 мкл клеток (от 1×10⁶ до 1×10⁷ клеток). Клетки осторожно перемешивали и инкубировали в течение 15 минут при 4°С или комнатной температуре. При использовании F(ab)₂ предыдущий этап блокировки Fc пропускали. Добавляли в общей сложности 1 мкг первичного антитела (на выбранный рецептор), и затем, перед инкубацией, клетки осторожно перемешивали в течение 20-40 минут на льду (или при 4°С). Эта температура препятствовала интернализации рецепторов. Для стимуляции маркировки, клетки осторожно с перерывами перемешивали (вращали). Добавляли 2 мл холодного промывочного буфера, затем клетки центрифугировали при 4°С, супернатант отбрасывали. Этап промывки повторяли перед повторным суспендированием клеток в 100 мкл промывочного/сортировочного буфера. К клеткам добавляли вторичное FITC-меченое антитело (0,5-1 мкг) и перемешивали перед инкубацией на льду (или при 4°С) в течение 20-40 минут. Клетки защищали от света в течение всего процесса. Добавляли 2 мл холодного промывочного буфера, затем клетки центрифугировали, супернатант отбрасывали. Стадию промывки повторяли, а клетки ресуспендировали в 0,5-1 мл промывочного буфера. Клетки инкубировали на льду до момента сортировки. Сортировка проводилась в кратчайшие сроки (по крайней мере, в тот же день). Клонирование и культивирование клеток после одноклеточной сортировки проводили, как описано ниже.

[0085] Биосенсорные клетки сортировали в 96-луночных планшетах, каждая лунка которых содержала по одной клетке и 100-200 мкл среды для роста клеток. Планшеты сканировали/мониторировали в течение следующих 10-14 дней, чтобы определить скорость роста и определить время переноса в 24-луночный планшет. Во время сканирования для различных условий использовались различные маркировки. Некоторые лунки, если они содержали живые клетки, но не были готовы к переносу, маркировались. Загрязненные лунки также маркировались. Клетки переносили в 24-луночный планшет, содержащий 1,0 мл соответствующей среды в каждой лунке. В случаях загрязнения клеток проводили промывку путем добавления всей клеточной суспензии из лунки в 5 мл стерильного 1х ФСБ в 15 мл конической пробирке. Затем клетки центрифугировали при значении RCF 170 в течение 10 минут, супернатант отбрасывали. Гранулу для культивирования повторно суспендировали в 1,0 мл свежей среды в 24-луночном планшете. После продолжительного роста клетки переносили в 12-луночный планшет с 1,5 мл свежей среды на лунку.

[0086] Для проведения скрининга клонов, после выращивания в 12-луночном планшете, клетки подсчитывали, чтобы определить, готовы ли они к зарядке и флэш-тестированию. Во время флеш-тестирования в одной итерации участвовало 25000 клеток. Было выращено достаточно клеток, чтобы провести тестирование, а также оставить несколько для продолжения роста. Этот шаг ознаменовал первый раунд скрининга клонов. Отобранные клоны выращивали далее и, в зависимости от желаемых свойств, подвергали последующим испытаниям. Для биологического ответа, например клоны Jurkat-FcγRI-CD3ζ, подвергали скринингу с использованием антител на CD3ε (положительный контроль) и моноклональных антител на бактерии с соответствующими бактериями, а для теста на химический ответ использовали время как дигитонин. Клоны МС/9-Aeq подвергали скринингу с использованием антител к Fc RI (биологический ответ) и дигитонин (химический ответ).

[0087] Таким образом, метод анализа сортировки клеток с активированной флоуресценсией (FACS), проводили с использованием меток флуоресцентных антител для отбора и выделения клеток, высокоэкспрессируюших желаемые белки, которые в этом случае были сконструированными рецепторами. Данный процесс привел к образованию популяции биосенсорных клеток с высоким уровнем экспрессии, что было дополнительно подтверждено флэш-тестированием с использованием ФЭУ в аналитическом устройстве. На протяжении всего процесса клетки были подсчитывали с использованием автоматическиго счетчика клеток, для того чтобы исключить человеческую ошибку и увеличить стабильность и эффективность. Различные клоны Jurkat-FcγRI-CD3ζ давали разные уровни биологического ответа при тестировании с использованием MAT к Е. Coli O111 и бактерий Е. coli O111. Многие клоны исследовали таким же образом. Клоны с самым высоким уровнем ответов сохраняли в банке клонов. Аналогичным образом результаты химического ответа, полученные при тестировании различных клонов МС/9-Aeq с использованием химического дигитонина, показали, что разные клоны давали разные уровни химического ответа в зависимости от уровня экспрессии экворина. Клоны с самым высоким сигналом сохраняли в банке клонов.

Культивирование биосенсорных клеток

[0088] Чтобы обеспечить оптимальные условия роста для различных клеточных линий использовались различные составы питательных сред. Тучные клетки МС/9 культивировали в полной среде для тучных клеток (DMEM - Sigma, №в каталоге D5796; 1x Pen/Strep; 10% ФБС; Добавка T-Stim 10%; 50 мкМ β-меркаптоэтанол). Т-клетки Jurkat культивировали в полной среде RPMI (Rpmi-ThermoFisher; 10% ФБС; 1x Pen/Strep). В зависимости от характеристик электропорированных конструкций для селекции в культуре клеток использовались разные антибиотики. Подходящие антибиотики добавляли в питательную среду через 2-3 дня после электропорации для отбора клеток, которые успешно интегрировали линеаризованные ДНК-конструкции. Для оптимального роста клеток их концентрацию поддерживали между 4,0×10⁵ и 1,0×10⁶ клеток/мл. Различные клеточные линии и клоны обрабатывали для длительного хранения, а запасы замораживали в жидком азоте следующим образом: (i) клетки центрифугировали при значении RCF 150 в течение 10 минут, супернатант отбрасывали; (ii) клеточный осадок ресуспендировали в среде для замораживания (RPMI; 50% ФБС; 10% ДМСО) в концентрации 5,0×10⁵ клеток/мл; и (iii) объемы 1 мл разделяли на аликвоты в 2 мл криосклянках Nunc и замораживали при -80°С в течение 24 часов, а затем перенесены в жидкий азот для длительного хранения.

Зарядка биосенсорных клеток

[0089] Биосенсорные клетки согласно настоящему изобретению центрифугировали в конических пробирках по 50 мл при значении RCF 150 в течение 10 минут. Супернатант отбрасывали и гранулы повторно суспендировали в нагрузочной среде (RPMI; 10% ФБС, обедненный антителами; 1X пенициллин/стрептомицин; 0,1% Pluronic F68 и 1,5 мм целентеразина) в концентрации 25000 клеток/180 мкл. Кроме того, клетки также заряжались в различных концентрациях, таких как, например, 100000 клеток/180 мкл и 400000 клеток/180 мкл. Клетки нагружали при комнатной температуре с мягким встряхиванием/покачиванием в течение 24-26 часов. Перед использованием коммерчески доступной ФБС, истощенной по антителам, может быть дополнительно очищен с использованием других систем истощения антител.

Концентрирование клеток

[0090] Было показано, что биосенсорные клетки согласно настоящему изобретению лучше нагружаются при более низких концентрациях, чем при более высоких концентрациях. Например, было показано, что нагрузка элементов с плотностью 25000 элементов/180 мкл против 400000 элементов/180 мкл приводит к двукратному усилению детектируемого сигнала. Клетки клона p5g7 Jurkat-FcyRI-CD3z нагружали при 400000 клеток/180 мкл и 25000 клеток/180 мкл, затем тестировали при 400000 клеток/180 МКЛ в каждой реакции. Культуру бактерий Е. coli O111 с 23 нм анти-Е. coli O111 mAb. использовали в течение ночи. Биосенсорные клетки, нагруженные при более низкой концентрации, давали более высокий сигнал для такого же количества тестируемых клеток бактерий. Плотность биосенсорных клеток в основном изменяется путем концентрирования клеток после нагрузки для обеспечения оптимальной детекции патогенных микроорганизмов. Различные концентрации были использованы для детекции патогена в зависимости от целевого патогена и качества антитела, когда детекторная молекула представляет собой растворимое антитело. Биосенсорные клетки концентрируют центрифугированием при значении RCF 150 в течение 10 минут, клеточный осадок повторно суспендируют в желаемом объеме среды для анализа. Среда для нагрузки может также служить в качестве испытательной среды. В некоторых случаях добавление нормального ФБС к среде вызывало биологический ответ, что приводило к сигналу биосенсора (вспышке) из-за высокой концентрации антител в нормальном ФБС. Следовательно, поставляемый на рынок, истощенный антителами ФБС был использован в процессе зарядки, который ослаблял сигнал, испускаемый антителами, без его полного устранения. Дополнительные методы были использованы для дальнейшего истощения следов антител у поставляемых на рынок истощенных антителами ФБС.

Биоанализ

[0091] В типичных вариантах реализации настоящего изобретения биоанализ аналита форматируется с применением биосенсорной клетки и растворимого моноклонального антитела (МАТ), которое специфично к данному аналиту, (например патогену). В данных вариантах реализации специфичность биоанализа напрямую связана с селективным связыванием растворимого антитела с целевым аналитом, а специфичность и чувствительность биосенсора определяют путем детекции и измерения биолюминесценции. В этом процессе биосенсорные клетки изначально нагружаются с использованием светоизлучающих молекул коэлентеразина (КТЗ). Затем добавляют выбранное растворимое антитело и анализируемый образец. Если патоген-мишень (целевой патоген) присутствует в образце, он взаимодействует с растворимым антителом, которое связывается с белком слияния, экспрессируемым биосенсорной клеткой, в конечном счете запуская сигнальный каскад, что приводит к излучению света биосенсорной клеткой. Испускаемый свет детектируется фотоумножителем (ФЭУ) в аналитическом устройстве, а сигнал, испускаемый биосенсорной клеткой, отображается в виде числа фотонов в секунду. Как описано ниже, на основе растворимого антитела и целевого патогена были разработаны различные способы детекции патогенов. Три таких способа, подробно описанные ниже, включают: (i) немедленное добавление детекторных молекул, (например антител); (ii) покрытие биосенсорных клеток детекторными молекулами (например антителами); и (iii) покрытие аналитов (например бактерий) антителами.

Аналитический блок (установке)

[0092] Относящийся к биоанализу аспект описанного здесь изобретения может быть осуществлен в аналитическом блоке или аналитическом картридже, предназначенном для применения с настольной или переносной аналитической системой и устройством, таким как раскрытое в патенте США №9,023,640), который включен в качестве ссылки в полном объеме. Аналитический картридж, который может быть изделием одноразового использования, принимает как образец, так и биосенсор, а введение биосенсора в аналитический картридж обеспечивает предсказуемое и контролируемое смешивание образца и биосенсора. Аналитический картридж дополнительно включает реакционную камеру для приема исследуемого образца и биосенсора, причем реакционная камера имеет заданную внутреннюю геометрию и дополнительно приспособлена (выполнена с возможностью) для минимизации или устранения фонового шума с целью улучшения общего отношения сигнал/шум. По меньшей мере один стабилизатор может быть расположен в реакционной камере для сведения к минимуму сдвигового повреждения анализируемого образца и биосенсора в процессе перемешивания.

[0093] В примерном варианте реализации реакционная камера и каналы для текучей среды, которые ведут к реакционной камере внутри аналитического картриджа, выполнены с возможностью решения нескольких задач. Входной канал для текучей среды, поступающей в реакционную камеру, имеет форму трубки, причем диаметр трубки относительно мал и сужается, становясь меньше на входе в реакционную камеру. Это увеличивает скорость текучей среды, поступающей в реакционную камеру, и способствует более энергичному и однородному перемешиванию за счет объемного движения реагентов внутри реакционной камеры. Желательно смешивать реагенты и образец таким образом, чтобы стимулировать перемешивание в дополнение молекулярной диффузии для уменьшения продолжительности анализа за счет обеспечения того, что любой инфекционный агент, присутствующий в образце, быстро достигает биосенсора. Входной канал может быть смещен от центральной оси реакционной камеры, чтобы способствовать вращательному движению реагентов по часовой или против часовой стрелки вокруг центральной оси аналитической камеры, по мере перемешивания текучих сред с повышением однородности смеси. Входной канал также приблизительно выполнен заподлицо (tangent) с внутренней поверхностью реакционной камеры, что позволяет поступающей жидкости проходить из входного канала в реакционную камеру, оставаясь в контакте с боковой поверхностью реакционной камеры, обеспечивая минимальный турбулентный поток и минимальное попадание пузырьков воздуха в смешиваемые текучие среды. Из-за непредсказуемого преломления света, которое они вызывают, когда свет, излучаемый реагентами, проходит через пузырьки внутри смешанных реагентов или на поверхности смешанных реагентов, нежелательно наличие пузырьков. Ось входного канала может быть расположена под углом к горизонтали, (например, около 30 градусов), чтобы обеспечить частично нисходящее направление для входящего потока жидкости, чтобы обеспечить, что реагент смешается с жидкостью, находящейся в нижней части реакционной камеры. В качестве альтернативы реагенты могут вводиться в аналитическую камеру с использованием альтернативных средств доставки жидкости, таких как вертикальный канал для доставки реагентов в нижнюю часть реакционной камеры, или подачи жидкости непосредственно на центральную ось аналитической камеры, чтобы создать столб реагента, втекающий в аналитическую камеру, тем самым способствуя перемешиванию через унос.

[0094] Форма, (то есть заданная геометрия) реакционной камеры, может представлять собой сечение вращения, облегчающее движение перемешивающихся текучих сред по часовой или против часовой стрелки вокруг центральной оси реакционной камеры. В качестве альтернативы, если необходимо, можно использовать форму реакционной камеры, отличную от сечения вращения, такую как прямоугольная или неправильная форма. В одном варианте реализации сечение вращения, используемое для формирования реакционной камеры, представляет собой часть эллипса, для облегчения сбора рассеянного света, испускаемого реагентами, и отражения этого света к поверхности детектора, который может быть фотоумножителем (photomultiplier tube? ФЭУ) (Hamamatsu). Поверхность реакционной камеры может быть отражающей, чтобы улучшить характеристики сбора света эллиптической формы. В некоторых вариантах реализации для достижения максимального отношения сигнал/шум на выходе системы максимальный диаметр поверхности ФЭУ ограничен. Диаметр реакционной камеры может быть выполнен так, чтобы приблизительно соответствовать диаметру ФЭУ, что влияет на эллиптическую форму, которая может быть достигнута в реакционной камере, предназначенной для вмещения определенного объема текучих сред. Из-за ограниченной эллиптической формы цвет поверхности реакционной камеры может быть частично рассеивающим белым из-за дополнительного сбора света, который происходит, когда свет, который в противном случае не отражался бы непосредственно от поверхности ФЭУ, частично рассеивался, и часть его направлялась к поверхности ФЭУ. В качестве альтернативы, при желании можно использовать другие виды покрытия поверхности и материалов, такие как алюминий с почти зеркальным покрытием или прозрачный материал. Кроме того, желательно, чтобы материал реакционной камеры был минимально фосфоресцентным, чтобы свет, излучаемый самой реакционной камерой не затмевал испускаемый свет от реагентов, тем самым мешая детекции. Несмотря на то, что белые полимерные материалы, такие как акрилонитрилбутадиенстирол или другие подобные полимерные материалы, проявляют низкий уровень фосфоресценции, дополнительный сбор света, обеспечиваемый комбинацией отражения и диффузии света, является преимуществом отношения сигнал/шум выходного сигнала светочувствительной схемы.

[0095] В примерном варианте аналитический подблок обеспечивает систему для применения в анализе образцов. Система содержит биосенсорный реагент, причем биосенсорный реагент содержит живые биологические клетки; карту резервуара с длинной петлевой частью и короткой петлей, в которой карта резервуара хранит биосенсорный реагент; и основание аналитического картриджа, и при этом основание аналитического картриджа сконфигурировано для приема карты резервуара. Основание аналитического картриджа дополнительно содержит: (i) реакционную камеру, имеющую центральную ось, причем реакционная камера имеет форму полуэллиптического тела вращения; и (ii) входной канал, соединенный с реакционной камерой, причем входной канал расположен над реакционной камерой под углом 15-60 градусов выше горизонтали, и при этом входной канал смещен от центральной оси реакционной камеры, причем после введения анализируемого образца в основание аналитического картриджа через входной канал образец гомогенно смешивается с биосенсорным реагентом, сводя к минимуму повреждение живых биологических клеток

[0096] В другом типичном варианте реализации изобретения аналитический блок обеспечивает систему для быстрой детекции присутствия аналита в биологическом образце. Эта система содержит биосенсорный реагент, содержащий по меньшей мере одно антитело, специфичное в отношении заданного аналита, и биолюминесцентный агент, причем указанное по меньшей мере одно антитело экспрессируется на поверхности живых сконструированных лимфоцитов, и при этом биолюминесцентный агент экспрессируется живыми сконструированными лимфоцитами, и, при этом биосенсорный реагент осуществляет: (i) детектирование присутствия конкретного аналита в исследуемом образце и (ii) испускание детектируемого светового сигнала, когда биосенсорный реагент реагирует с образцом и детектирует присутствие конкретного аналита в образце. Дополнительно включен аналитический картридж. Аналитический картридж дополнительно содержит: (i) карту резервуара, причем карта резервуара дополнительно содержит биосенсорный реагент; и (ii) основание аналитического картриджа, и при этом основание аналитического картриджа выполнено с возможность приема карты резервуара. Основание аналитического картриджа дополнительно содержит: а) реакционную камеру, имеющую центральную ось, причем реакционная камера имеет полуэллиптическую форму вращения; b) входной канал, соединенный с реакционной камерой, причем входной канал расположен над реакционной камерой под углом 15-60 градусов выше горизонтали, и при этом входной канал смещен от центральной оси реакционной камеры; и с) при введении образца в основание аналитического картриджа через входной канал образец гомогенно смешивается с биосенсорным реагентом, одновременно минимизируя повреждение живых сконструированных лимфоцитов и минимизируя любое барботирование смешанного биосенсорного реагента и образца в реакционной камере. Дополнительно включен аналитический блок, предназначенный для приема аналитического картриджа. Аналитический блок содержит детектор для обнаружения детектируемого светового сигнала, испускаемого биосенсорным реагентом при взаимодействии с образцом, причем детектирование испускаемого обнаруживаемого светового сигнала указывает на присутствие аналита в образце, и при этом детектирование конкретного аналита в образце происходит в реальном времени.

Пример биоанализа 1: Мгновенное добавление антител

[0097] В примерном варианте реализации биоанализа по настоящему изобретению, в котором детекторная молекула представляет собой растворимое антитело, растворимое антитело и исследуемый образец смешивают вместе непосредственно перед осуществлением контакта биосенсорных клеток с тестируемым образцом. В этом варианте реализации нагруженные биосенсорные клетки центрифугируют и концентрируют до приблизительно 400000 клеток/180 мкл (целесообразно для одной реакции) в нагрузочной среде. Аликвоты по 180 мкл (около 400000 клеток) нагруженных биосенсорных клеток затем загружают в длинную петлевую часть карты резервуара. Для проведения положительного контроля 30 мкл анти-CD3ε-антитела в среде RPMI загружают в короткую петлевую часть карты резервуара. Карта резервуара затем фиксируется в основании аналитического картриджа. 2 мкл антител (0,5 мг/мл) на целевой патоген, такого как анти-Е. coli O111 (где целевым патогеном является E.coli O111), смешивают с 28 мкл исследуемого образца в смесительной камере картриджа. Основа аналитического картриджа вставляется в тестирующее устройство, а заряженные биосенсорные клетки вводятся в реакционную камеру для инициирования реакции. Полученный сигнал записывают в течение 4-8 минут, и в конце периода испытания 30 мкл анти-CD3ε-антитела вводят из короткой петли резервуара в реакционную камеру в качестве положительной контрольной реакции, которая регистрируется в течение 2 минут. В качестве альтернативного положительного контроля можно использовать 30 мкл 0,61 мМ дигитонина вместо антитела к CD3ε. Тест отрицательного контроля может быть выполнен с использованием предопределенного патогена, который не специфичен для используемого антитела.

Пример биоанализа 2: Покрытие клеток биосенсора антителами

[0098] В другом примерном варианте реализации биоанализа по настоящему изобретению, где детекторная молекула представляет собой растворимое антитело, биосенсорные клетки покрывают растворимым антителом в течение определенного времени до смешивания исследуемого образца с биосенсорными клеткам. В этом варианте реализации нагруженные биосенсорные клетки центрифугируют и концентрируют примерно до 400000 клеток/180 мкл (достаточно для одной реакции) в нагрузочной среде. Аликвоту 180 мкл (около 400000 клеток) биосенсорных клеток затем смешивают с объемом 2 мкл антител (при 0,5 мг/мл) целевому патогену, такого как анти-Е. coli O111 (где целевым патогеном является E. coli O111) в пробирке Эппендорфа. Биосенсорные клетки, смешанные с антителом, инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут и затем загружают в длинную петлевую часть карты резервуара. Для проведения положительного контроля 30 мкл анти-CD3ε-антитела в среде RPMI загружают в короткую петлевую часть карты резервуара. Карта резервуара затем фиксируется в основании аналитического картриджа. В реакционную камеру добавляют 30 мкл тестируемого образца. Основа аналитического картриджа вставляется в тестирующее устройство, а биосенсорные клетки вводятся в смесительную камеру для инициирования реакции. Полученный сигнал записывают в течение 4-8 минут, и в конце периода испытания 30 мкл анти-CD3ε-антитела вводят из короткой петли резервуара в реакционную камеру в качестве положительной контрольной реакции, которая регистрируется в течение 2 минут. В качестве альтернативного положительного контроля можно использовать 30 мкл 0,61 мМ дигитонина вместо антитела против CD3ε. Тест отрицательного контроля может быть выполнен с использованием предопределенного патогена, который не специфичен для используемого антитела.

Пример биоанализа 3: Покрытие аналита антителами

[0099] В другом примерном варианте реализации биоанализа по настоящему изобретению, в котором детекторная молекула представляет собой растворимое антитело, аналит (например, патогенные бактерии) покрывают растворимым антителом в течение определенного времени до смешивания исследуемого образца с биосенсором. В этом варианте реализации нагруженные биосенсорные клетки центрифугируют и концентрируют примерно до 400000 клеток/180 мкл (достаточно для одной реакции) в нагрузочной среде. 180 мкл (около 400000 клеток) аликвоты биосенсорных клеток загружают в длинную петлевую часть карты резервуара. Для проведения положительного контроля 30 мкл анти-CD3ε-антитела в среде RPMI загружают в короткую петлевую часть карты резервуара. Карта резервуара затем фиксируется в основании картриджа. 2 мкл антител (0,5 мг/мл) на целевой патоген, такого как анти-Е. coli O111 (где целевым патогеном является E.coli O111), смешивают с 28 мкл исследуемого образца в пробирке Эппендорфа. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут, затем добавляют в смесительную камеру картриджа. Картридж вставляется в ФЭУ, и биосенсорные клетки вводят в смесительную камеру для инициирования реакции. Полученный сигнал записывают в течение 4-8 минут, и в конце периода анализа 30 мкл анти-CD3ε-антитела вводят из короткой петли резервуара в реакционную камеру в качестве положительной контрольной реакции, которая регистрируется в течение 2 минут. В качестве альтернативного положительного контроля можно использовать 30 мкл 0,61 мМ дигитонина вместо антитела против CD3ε. Тест отрицательного контроля может быть выполнен с использованием предопределенного патогена, который не специфичен для используемого антитела.

[0100] Описанные здесь примеры биоанализов могут включать другие добавки, снижающие фоновый шум и усиливающие сигнал. Используя антитело CD3ε в качестве положительного контроля, было продемонстрировано, что система детектирует менее 10 нагруженных биосенсорных клеток в смеси из 50000 незаряженных биосенсорных клеток. Было продемонстрировано, что сам биосенсор детектирует 230 КОЕ бактерий в образце 30 мкл. В биоанализах, описанных выше, проприетарное моноклональное антитело (1F11) на бактерии Е. coli O111 использовалось для быстрой детекции бактерий Е. coli O111 с использованием Е. coli O157 в качестве отрицательного контроля. Было продемонстрировано, что Е. coli O157 дает отрицательные результаты, тем самым подтверждая специфичность системы. Многочисленные коммерчески доступные антитела также могут быть использованы в описанном биоанализе. Что касается проприетарного моноклонального антитела (1F11), анализ антител и отбор моноклонального антитела были выполнены, как описано ниже.

[0101] Продукцию антител определяли методом ИФА, выполненного в 96-луночных многолуночных планшетах. Каждая лунка была покрыта различными LPS (E.coli O157, E.coli O127, E.coli O111, E.coli O26, Klebsiella pnuemoniae, Salmonella enterioa и naive na sera) или бактериальными клетками (E.coli O157, E.coli O111 E.coli 26 и E.coli DH5α). В лунки добавляли супернатант гибридомы из различных клонов mAb O157 или mAb O111. Для быстрой детекции использовали козьи антитела к IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (Приложение III.A.3). Два гибридомных клона (1В10 и 6G1) Е. coli O157 распознают исключительно LPS Е. coli O157 и Е. coli O157. Девять гибридомных клонов Е. coli O111 специфически распознают LPS Е. coli O111 и Е. coli O111. Клоны с самой высокой оптической плотностью (OD) были выбраны для валидации, которая была выполнена, как описано ниже.

[0102] Осадок гибридомных клеток собирали и хранили при -80°С до извлечения РНК. Извлеченную РНК использовали в качестве матрицы для обратной транскрипции кДНК с последующей амплификацией с помощью вложенной ПЦР. Все положительные продукты ПЦР были клонированы в векторы клонирования ТА и отправлены для секвенирования. Вариабельные области легкой и тяжелой цепи определяли после анализа последовательностей. Четыре одноцепочечных антитела (scFv) O157 (1 В10) (индивидуальные mAb, продуцируемые FSC) и АТСС НВ 10452, а также два одноцепочечных антитела O111, продуцируемых FSC (1F11 и 1F2), были рекомбинантно экспрессированы и очищены методом афинной хроматографии на иммобилизованных ионах металла (IMAC). Последовательность scFv конструировали в следующем порядке: сигнал секреции pel В + аминокислота аланин + гистидиновая метка + аминокислоты глицин-серин-серин-глицин + участок расщепления TEV + аминокислоты глицин-серин-серин-глицин + вариабельная область тяжелой цепи + серин-аланин-аспарагиновая кислота-аспарагиновая кислота-аланин-лизин-лизин-аспарагиновая кислота-аланин-аланин-лизин-лизин-аспарагиновая кислота-аспарагиновая кислота-аланин-лизин-лизин-аспарагиновая кислота-аспарагиновая кислота линкерная область + вариабельная область легкой цепи. Очищенные scFv были протестированы с использованием многолуночных планшетов, покрытых LPS O157 или O111.

[0103] Целью данного исследования было изучение взаимодействия моноклонального антитела (mAb, MAT) с цельными бактериальными клетками (Е. coli O157 или Е. coli O111) и оценка кинетической константы (KD) взаимодействия антитело-бактерия. В этих анализах использовали козье анти-Е. Coli O157 поликлональное антитело, козье анти-E. coli O111 поликлональное антитело, три моноклональных антитела (1022, 1024 и 1061) на Е. coli O157 и одно моноклональное антитело на Е. coli O111. Чип датчика СМ5 и набор для соединения амина также использовались. Все анализы проводили на приборе Biacore X100. В рамках Протокола одно поликлональное антитело (против выбранных бактерий) иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5. Затем отобранные бактерии связывали с последующей инъекцией моноклонального антитела на те же бактерии в непрерывном буферном потоке. Взаимодействие контролировалось в режиме реального времени. Относительное связывание антитела с каждой бактерией регистрировали в резонансных единицах (RUs). Результаты анализа BIAcore по связыванию специфического антитела Е. coli O157 (mAb FF754) с Е. coli O157 и Е. coli O111 показали, что m15b O157 специфичен для своего антигена-мишени.

Fc-рецепторы

[0104] Рецепторы, используемые в настоящем изобретении, например, в качестве лигандов или детекторов, могут включать альтернативные Fc-несущие химерные рецепторы. Описанные здесь химерные рецепторы содержат внеклеточный домен с аффинностью и специфичностью связывания для Fc-части иммуноглобулина («Fc-связывающее вещество»), трансмембранный домен, по меньшей мере, один костимулирующий сигнальный домен и цитоплазматический сигнальный домен, содержащий иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM). Химерные рецепторы сконфигурированы так, что при экспрессии на клетке-хозяине внеклеточный лиганд-связывающий домен локализуется внеклеточно для связывания с молекулой-мишенью, (например, антителом или Fc-связанным белком) и костимулирующим сигнальным доменом, a ITAM-содержащий цитоплазматический сигнальный домен локализован в цитоплазме для запуска активации или эффекторной передачи сигналов. В некоторых вариантах реализации конструкция химерного рецептора, как описано в настоящем документе, содержит от N-конца до С-конца Fc-связующее вещество, трансмембранный домен, по меньшей мере, один костимулирующий сигнальный домен и ITAM-содержащий цитоплазматический сигнальный домен. В других вариантах реализации конструкция химерного рецептора, как описано в настоящем документе, содержит от N-конца до С-конца Fc-связующее вещество, трансмембранный домен, ITAM-содержащие цитоплазматические сигнальные домены, и, по меньшей мере, один костимуляторный сигнальный домен.

[0105] Любой из химерных рецепторов, описанных в настоящем документе, может дополнительно содержать шарнирный домен, который может быть расположен на С-конце Fc-связующего вещества и N-конце трансмембранного домена. В качестве альтернативы или в дополнение к этому химерные рецепторные конструкции, описанные в данном документе, могут содержать два или более костимулирующих сигнальных домена, которые могут связываться друг с другом или разделяться ITAM-содержащим цитоплазматическим сигнальным доменом. Внеклеточный Fc-связующий элемент, трансмембранный домен, костимулирующий сигнальный домен(ы) и ITAM-содержащий цитоплазматический сигнальный домен в конструкции химерного рецептора могут быть связаны друг с другом напрямую или через пептидный линкер.

[0106] Описанные здесь конструкции химерных рецепторов содержат внеклеточный домен, который является Fc-связующим элементом, то есть способен связываться с Fc-частью иммуноглобулина (например, IgG, IgA, IgM или IgE) подходящего млекопитающего (например, человека, мыши, крысы, козы, овцы или обезьяны). Подходящие Fc-связующее элементы могут происходить из встречающихся в природе белков, таких как Fc-рецепторы млекопитающих или определенных бактериальных белков (например, белка А, белка G). Кроме того, Fc-связующие вещества могут быть синтетическими полипептидами, сконструированными специально для связывания Fc-части любой из молекул Ig, описанных здесь, с высокой аффинностью и специфичностью. Например, такое Fc-связующее вещество может представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывает Fc-часть иммуноглобулина. Примеры включают, но не ограничиваются одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), доменным антителом или нанотелом. В качестве альтернативы, Fc-связывающий элемент может представлять собой синтетический пептид, который специфически связывает Fc-часть, такой как домен Kunitz, иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера (SMIP), аднектин, авимер, аффибод, DARPin или антикалин, который может быть идентифицирован путем скрининга пептидной комбинаторной библиотеки на активность связывания с Fc.

[0107] В некоторых вариантах реализации Fc-связывающий элемент представляет собой внеклеточный лиганд-связывающий домен рецептора Fc млекопитающего. Используемый здесь термин «Fc-рецептор» представляет собой рецептор, связанный с клеточной поверхностью, который экспрессируется на поверхности многих иммунных клеток (включая В-клетки, дендритные клетки, природные клетки-киллеры (NK), макрофаги, нейтофилы, тучные клетки и эозинофилы) и проявляет специфичность связывания с Fc-доменом антитела. Fc-рецепторы обычно состоят по меньшей мере из 2 иммуноглобулин(Ig)-подобных доменов со специфичностью связывания с Fc (кристаллизующийся фрагмент) частью антитела. В некоторых случаях связывание Fc-рецептора с Fc-частью антитела может вызывать эффекты антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ). Fc-рецептор, используемый для конструирования химерного рецептора, как описано здесь, может представлять собой природный вариант полиморфизма (например, вариант CD16 V158), который может иметь повышенную или пониженную аффинность к Fc по сравнению с аналогом дикого типа. В качестве альтернативы, рецептор Fc может представлять собой функциональный вариант аналога дикого типа, который несет одну или несколько мутаций (например, до 10 замен аминокислотных остатков), изменяющих аффинность связывания с частью Fc молекулы Ig. В некоторых случаях мутация может изменить характер гликозилирования Fc-рецептора и, следовательно, аффинность связывания с Fc.

[0108] В таблице ниже приведен ряд примеров полиморфизмов во внеклеточных доменах Fc-рецепторов (см., Например, Kim et al., J. Mol. Evol. 53: 1-9, 2001):

[0109] Рецепторы Fc классифицируются на основе изотипа антитела, с которым оно способно связываться. Например, Fc-гамма-рецепторы (FcγR) обычно связываются с антителами IgG, такими как один или несколько их подтипов (то есть IgG1, IgG2, IgG3, IgG4); Рецепторы Fc-альфа (FcαR) обычно связываются с антителами IgA; и рецепторы Fc-эпсилон (FccR) обычно связываются с антителами IgE. В некоторых вариантах реализации Fc-рецептор представляет собой Fc-гамма-рецептор, Fc-альфа-рецептор или Fc-эпсилон-рецептор. Примеры Fc-гамма-рецепторов включают, без ограничения: CD64A, CD64B, CD64C, CD32A, CD32B, CD16A и CD16 В. Примером Fc-альфа-рецептора является FcaR1/CD89. Примеры рецепторов Fc-эпсилона включают без ограничения: FcεRI и Fc.epsilon.RII/CD23. В приведенной ниже таблице перечислены типичные рецепторы Fc, использующиеся при конструировании химерных рецепторов, описанных здесь, и их связывающая активность с соответствующими доменами Fc:

[0110] Выбор лиганд-связывающего домена Fc-рецептора для применения в химерных рецепторах, описанных в настоящем документе, будет очевиден для специалиста в данной области. Например, он может зависеть от таких факторов, как изотип антитела, к которому требуется связывание Fc-рецептора и предпочтительное сродство связывающего взаимодействия. В некоторых примерах (а) представляет собой внеклеточный лиганд-связывающий домен CD16, который включает встречающийся в природе полиморфизм, который может модулировать сродство к Fc. В некоторых примерах (а) представляет собой внеклеточный лиганд-связывающий домен CD16, включающий полиморфизм в положении 158, (например, валин или фенилаланин). В некоторых вариантах реализации (а) получают в условиях, которые изменяют его состояние гликозилирования и его сродство к Fc. В некоторых вариантах реализации (а) представляет собой внеклеточный лиганд-связывающий домен CD16, включающий модификации, которые делают химерный рецептор, включающий его, специфичным для подтипа антител IgG. Например, могут быть включены мутации, которые увеличивают или уменьшают сродство к подтипу IgG (например, IgG1).

[0111] В других вариантах реализации Fc-связывающий элемент происходит из встречающегося в природе бактериального белка, который способен связываться с частью Fc молекулы IgG. Fc-связывающий элемент, применяющийся при конструировании химерного рецептора, как описано здесь, может представлять собой полноразмерный белок или его функциональный фрагмент. Белок А представляет собой поверхностный белок 42 кДа, первоначально найденный в клеточной стенке бактерии Staphylococcus aureus. Он состоит из пяти доменов, каждый из которых складывается в трехспиральный пучок и способен связывать IgG посредством взаимодействий с областью Fc большинства антител, а также с областью Fab антител семейства VH3 человека. G-белок представляет собой белок массой приблизительно 60 кДа, экспрессируемый в стрептококковых бактериях группы С и G, который связывается как с Fab, так и с Fc-областью IgG млекопитающих. Хотя нативный белок G также связывает альбумин, были разработаны рекомбинантные варианты без связывания альбумина.

[0112] Fc-связывающий элемент, применяемый в химерных рецепторах, также могут быть вновь созданы с использованием комбинаторной биологии или методов направленного развития. Начиная с белкового каркаса, (например scFv, полученного из IgG, домена Kunitz, полученного из ингибитора протеазы типа Kunitz, анкиринового повтора, домена Z из белка А, липокалина, домена фибронектина типа III, домена SH3 из Fyn или другие) боковые цепи аминокислот для набора остатков на поверхности могут быть произвольно замещены для создания большой библиотеки вариантов каркасов. Из больших библиотек можно выделить редкие варианты со сродством к мишени, такой как домен Fc, сначала выбрав для связывания с последующей амплификацией с помощью фагового, рибосомного или клеточного дисплея. Повторные циклы отбора и амплификации могут быть использованы для выделения белков с наибольшим сродством к мишени.

[0113] Любое из Fc-связующих веществ, описанных здесь, может иметь подходящую аффинность связывания с Fc-частью терапевтического антитела. Используемый здесь термин «аффинность связывания» относится к кажущейся константе ассоциации или К_А. K_A является обратной величиной константы диссоциации, K_D. Внеклеточный лиганд-связывающий домен Fc-рецепторного домена химерных рецепторов, описанных здесь, может иметь аффинность связывания K_D, по меньшей мере, 10-⁵, по меньшей мере, 10-⁶, по меньшей мере, 10-⁷, по меньшей мере, 10-⁸, по меньшей мере, 10^-9, по меньшей мере, 10^-10М или ниже для Fc-части антитела. В некоторых вариантах реализации Fc-связующее имеет высокое сродство связывания с антителом, изотипом или подтипом(ами) антител по сравнению со сродством связывания элемента, связывающего Fc, с другим антителом, изотипом или подтипами антител. В некоторых вариантах реализации внеклеточный лиганд-связывающий домен Fc-рецептора обладает специфичностью к антителу, изотипу антител или его подтипу(ам) по сравнению со связыванием внеклеточного лиганд-связывающего домена Fc-рецептора с другим антителом, изотип антител или их подтипов. Fc-гамма-рецепторы с высокой аффинностью связывания включают CD64A, CD64B и CD64C. Fc-гамма-рецепторы с низкой аффинностью связывания включают CD32A, CD32B, CD16A и CD16B. Рецептор Fc-эпсилон с высокой аффинностью связывания представляет собой Fc.epsilon.RI, а рецептор Fc-эпсилон с низкой аффинностью связывания представляет собой Fc.epsilon.RII/CD23.

[0114] Аффинность (сродство) связывания или специфичность связывания Fc-рецептора или химерного рецептора, содержащего Fc-связывающий элемент, (например внеклеточный лиганд-связывающий домен Fc-рецептора), могут быть определены различными методами, включая равновесный диализ, равновесное связывание, гель-фильтрацию, ИФА, поверхностный плазменный резонанс или спектроскопия.

[0115] В некоторых вариантах реализации внеклеточный лиганд-связывающий домен Fc-рецептора содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% (например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%) идентична аминокислотной последовательности внеклеточного лиганд-связывающего домена встречающегося в природе Fc-гамма-рецептора, Fc-альфа-рецептора или Fc-эпсилон-рецептора. «Процент идентичности» двух аминокислотных последовательностей можно определить с помощью алгоритма Karlin и Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, 1990, модифицированный как в Karlin и Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77, 1993. Такой алгоритм включен в программы Nblast и XBLAST (версия 2.0) Altschul и др. J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990. Поиск белка BLAST может быть выполнен с помощью программы XBLAST, оценка = 50, длина слова = 3, чтобы получить аминокислотные последовательности, гомологичные молекулам белка по изобретению. Там, где существуют разрывы между двумя последовательностями, можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402, 1997. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST могут использоваться параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).

[0116] Еще один вариант реализации данного изобретения предусматривает систему, которая включает пространство или отсек для контакта сконструированной клетки с аналитом; сконструированная клетка, которая содержит лиганд, путь передачи сигнала и репортер; при этом универсальный детекторный элемент связывается с предопределенным аналитом, путь передачи сигнала принимает первый сигнал, вызванный связыванием аналита с лигандом, передает первый сигнал репортеру, и репортер испускает второй детектируемый сигнал при получении первого сигнала от пути передачи сигнала; и детектор.

[0117] Еще один вариант реализации данного изобретения предусматривает систему, которая включает пространство или отсек для контакта сконструированной клетки с предопределенным аналитом; сконструированная клетка, содержащая совокупность лигандов и элементов передачи сигнала, которые непрерывно передают сигнал на детектор, испускают свет или другой детектируемый сигнал; и детектор; причем связывание предопределенного аналита с агрегацией лигандов и элементов передачи сигнала ослабляет передачу сигнала и ослабляет испускание света или другого детектируемого сигнала репортером. Агрегация лигандов и элементов передачи сигнала поддерживается с помощью связующего адаптера, и когда когезивный адаптер связан с предопределенным аналитом, его способность поддерживать агрегацию лигандов и элементов передачи сигнала ослабляется.

[0118] Еще один вариант реализации данного изобретения предусматривает систему, которая включает пространство или отсек для контакта сконструированной клетки с предопределенным аналитом; сконструированная клетка, содержащая лиганд, передающий сигнал элемент, который передает ингибирующий сигнал при привязке к предопределенному аналиту, и репортер, который постоянно испускает свет или другой детектируемый сигнал; детектор (датчик); причем связывание предопределенного аналита с универсальным детекторным элементом вызывает подавляющий сигнал, который ослабляет испускание света или другого детектируемого сигнала репортером. В этом варианте реализации универсальный элемент детектора может включать иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM). ITIM дополнительно описан и включен со ссылкой на Staub Е, Rosenthal A, Hinzmann В. (2004). «Систематическая идентификация иммунорецепторного тирозинового ингибирующего мотива в протеоме человека». Клеточный сигнал Сигнал 16(4): 435-456.

[0119] Хотя настоящее изобретение было проиллюстрировано с помощью описания его примерных вариантов реализации и хотя варианты реализации были описаны с определенными подробностями, заявитель не имел намерения сужать или каким-либо образом ограничивать объем прилагаемой формулы изобретения такими подробностями. Дополнительные преимущества и модификации очевидны для специалистов в данной области техники. Поэтому изобретение в его широких аспектах не ограничено конкретными элементами и описанными вариантами осуществления, показанными и описанными здесь. Следовательно, могут быть выполнены различные изменения, не выходящие за рамки сущности или объема главной инновационной концепции.

1. Биосенсорная система детекции, содержащая:

а) живую биологическую клетку заданного типа, где указанная живая клетка выбрана из прокариотической клетки, эукариотической клетки, дрожжевой клетки, клетки насекомого, клетки млекопитающего, клетки животного, растительной клетки, невоспроизводящейся клетки, фиксированной клетки, обработанной лекарством клетки, химически обработанной клетки, осмотически обработанной клетки, облученной клетки, искусственной клетки, синтетической клетки, фолликулярной дендритной клетки, клетки-природного киллера, макрофага, моноцита, мононуклеарного фагоцита, нейтрофила, эозинофила или базофила;

(b) генерирующий сигнал репортер, связанный с живой биологической клеткой, где указанный генерирующий сигнал репортер представляет собой краситель, имеющий флуоресцентные, ультрафиолетовые или видимые характеристики; фермент, способный давать люминесцентный или флуоресцентный сигнал; флуоресцентные, заряженные или магнитные наночастицы, наноточки или квантовые точки; флуоресцентный белок или другую чувствительную к кальцию люминесцентную или флуоресцентную молекулу;

(c) путь передачи сигнала, связанный с генерирующим сигнал репортером, где указанный путь передачи сигнала активируется в результате: изменения рН или температуры живой биологической клетки; изменения электрических или магнитных свойств живой биологической клетки; активации сигнального пути сопряженного с G-белком рецептора в живой биологической клетке; активации пути фосфатидилинозитола в живой биологической клетке; активации пути передачи сигнала в живой биологической клетке, который высвобождает диацилглицерин, керамид или другую липофильную сигнальную молекулу; активации пути передачи сигнала в живой биологической клетке, который высвобождает или образует оксид азота, цАМФ, цГМФ или другой циклический нуклеотид; активации пути передачи сигнала в живой биологической клетке, который выделяет или образует супероксид, пероксид водорода, монооксид углерода, сероводород или другую вторичную редокс-сигнальную молекулу; или конформационного изменения рецептора, экспрессируемого живой биологической клеткой, где конформационное изменение происходит только после того, как универсальный детекторный элемент связывается с целевым аналитом;

d) универсальный детекторный элемент, связанный с указанным путем передачи сигнала, где указанный универсальный детекторный элемент содержит: область V(variable, вариабельный)-, D(diversity, разнообразие)-, J(joining, соединение) сегментов (VDJ) антитела, Fab-фрагмент или другую детерминанту антитела; V-J сегменты (VJ) Т-клеток, V-D-J сегменты (VDJ) или другую детерминанту рецептора Т-клеток; синтетический пептид; непептидную органическую детерминанту известного размера; детерминанту лектина, углеводсвязывающий модуль или другую углеводсвязывающую детерминанту; липидсвязывающую детерминанту; детерминанту металлотиона, которая связывает металл, или другую металлсвязывающую детерминанту; иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM); детерминанту Fc, которая нековалентно связывается с Fc-связывающим компонентом пути передачи сигнала в живой биологической клетке; или детерминанту биотина или (стрепт)авидина, которая нековалентно связывается с биотин- или (стрепт)авидинсвязывающим компонентом пути передачи сигнала; в живой биологической клетке; и

е) элемент, связывающий аналит, связанный с универсальным детекторным элементом, причем элемент, связывающий аналит, специфичен как в отношении универсального детекторного элемента, так и в отношении целевого аналита, где элемент, связывающий аналит, представляет собой аффитело, аптамер или растворимый рецептор, или где элемент, связывающий аналит, включает фрагмент IgG, который представляет собой одноцепочечное антитело или одноцепочечное диатело.

2. Биосенсорная система по п. 1, где клетка насекомого представляет собой клетку Drosophila Schneider 2 или клетку sf9.

3. Биосенсорная система по п. 1, характеризующаяся тем, что клетка млекопитающего представляет собой клетку HEK; клетку СНО; клетку COS; клетку 3Т3 или другую культивируемую, иммортализованную или пассируемую клетку млекопитающего.

4. Биосенсорная система по п. 1, где флуоресцентный белок представляет собой зеленый флуоресцентный белок.

5. Биосенсорная система по п. 1, где репортер, генерирующий сигнал, представляет собой обелин, талассиколин, митрокомин (галиставрин), клитин (фиалидин), мнемопсин, беровин, Indo-1, Fura-2, Quin-2, Fluo-3, Rhod-2, кальциевый зеленый, BAPTA, cameleons или другую кальций-чувствительную люминесцентную или флуоресцентную молекулу.

6. Биосенсорная система по п.1, характеризующаяся тем, что целевой аналит представляет собой мутуалистический, комменсальный или паразитический микроб, патогенный микроб, микроорганизм для биологической борьбы или другой микроорганизм; или фармацевтическое средство, лекарственное средство, яд, токсин, химическое боевое вещество, гормон, метаболит или небольшую молекулу, связанную с макромолекулярным носителем.

7. Биосенсорная система детекции, содержащая:

а) живую биологическую клетку заданного типа, где указанная живая клетка выбрана из прокариотической клетки, эукариотической клетки, дрожжевой клетки, клетки насекомого, клетки млекопитающего, клетки животного, растительной клетки, невоспроизводящейся клетки, фиксированной клетки, обработанной лекарством клетки, химически обработанной клетки, осмотически обработанной клетки, облученной клетки, искусственной клетки, синтетической клетки, фолликулярной дендритной клетки, клетки-природного киллера, макрофага, моноцита, мононуклеарного фагоцита, нейтрофила, эозинофила или базофила;

(b) генерирующий сигнал репортер в живой биологической клетке, где указанный генерирующий сигнал репортер представляет собой краситель, имеющий флуоресцентные, ультрафиолетовые или видимые характеристики; фермент, способный давать люминесцентный или флуоресцентный сигнал; флуоресцентные, заряженные или магнитные наночастицы, наноточки или квантовые точки; флуоресцентный белок или другую чувствительную к кальцию люминесцентную или флуоресцентную молекулу, причем генерирующий сигнал репортер реагирует на определенные изменения, происходящие в живой биологической клетке;

(c) путь передачи сигнала, связанный с генерирующим сигнал репортером, где указанный путь передачи сигнала активируется в результате: изменения рН или температуры живой биологической клетки; изменения электрических или магнитных свойств живой биологической клетки; активации сигнального пути сопряженного с G-белком рецептора в живой биологической клетке; активации пути фосфатидилинозитола в живой биологической клетке; активации пути передачи сигнала в живой биологической клетке, который высвобождает диацилглицерин, керамид, или другую липофильную сигнальную молекулу; активации пути передачи сигнала в живой биологической клетке, который высвобождает или образует оксид азота, цАМФ, цГМФ или другой циклический нуклеотид; активации пути передачи сигнала в живой биологической клетке, который выделяет или образует супероксид, пероксид водорода, монооксид углерода, сероводород или другую вторичную редокс-сигнальную молекулу; или конформационного изменения рецептора, экспрессируемого живой биологической клеткой, где конформационное изменение происходит только после того, как универсальный детекторный элемент связывается с целевым аналитом;

(d) универсальный детекторный элемент, связанный с указанным путем передачи сигнала, причем указанный универсальный детекторный элемент содержит: область V(variable, вариабельный)-, D(diversity, разнообразие)-, J(joining, соединение) сегментов (VDJ) антитела, Fab-фрагмент или другую детерминанту антитела; V-J сегменты (VJ) Т-клеток, V-D-J сегменты (VDJ) или другую детерминанту рецептора Т-клеток; синтетический пептид; непептидную органическую детерминанту известного размера; детерминанту лектина, углеводсвязывающий модуль или другую углеводсвязывающую детерминанту; липидсвязывающую детерминанту; детерминанту металлотиона, которая связывает металл, или другую металлсвязывающую детерминанту; иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM); детерминанту Fc, которая нековалентно связывается с Fc-связывающим компонентом пути передачи сигнала в живой биологической клетке; или детерминанту биотина или (стрепт)авидина, которая нековалентно связывается с биотин- или (стрепт)авидинсвязывающим компонентом пути передачи сигнала; в живой биологической клетке, и где указанный универсальный детекторный элемент может запускать указанный путь передачи сигнала;

е) элемент, связывающий аналит, связанный с универсальным детекторным элементом, причем элемент, связывающий аналит, специфичен как в отношении универсального детекторного элемента, так и в отношении целевого аналита, где элемент, связывающий аналит, представляет собой аффитело, аптамер или растворимый рецептор или где элемент, связывающий аналит, включает фрагмент IgG, который представляет собой одноцепочечное антитело или одноцепочечное диатело; и

(f) где при связывании элемента, связывающего аналит, с которым целевой аналит также связан, с универсальным детекторным элементом универсальный детекторный элемент запускает путь передачи сигнала, вызывая определенные изменения в живой биологической клетке, тем самым заставляя генерирующий сигнал репортер генерировать детектируемый сигнал.

8. Биосенсорная система по п. 7, где клетка насекомого представляет собой клетку Drosophila Schneider 2 или клетку sf9.

9. Биосенсорная система по п. 7, где клетка млекопитающего представляет собой клетку HEK; клетку СНО; клетку COS; клетку 3Т3 или другую культивируемую, иммортализованную или пассируемую клетку млекопитающего.

10. Биосенсорная система по п. 7, где флуоресцентный белок представляет собой зеленый флуоресцентный белок.

11. Биосенсорная система по п. 7, где репортер, генерирующий сигнал, представляет собой обелин, талассиколин, митрокомин (галиставрин), клитин (фиалидин), мнемопсин, беровин, Indo-1, Fura-2, Quin-2, Fluo-3, Rhod-2, кальциевый зеленый, BAPTA, cameleons, или другую кальций-чувствительную люминесцентную или флуоресцентную молекулу.

12. Биосенсорная система по п.7, в которой целевой аналит представляет собой полезную кишечную бактерию; патогенную бактерию; белковый биомаркер; низкомолекулярный токсин, метаболит или средство химической борьбы; или небольшую молекулу, связанную с макромолекулярным носителем.

13. Биосенсорная система детекции, содержащая:

а) живую биологическую клетку заданного типа, где указанная живая клетка выбрана из прокариотической клетки, эукариотической клетки, дрожжевой клетки, клетки насекомого, клетки млекопитающего, клетки животного, растительной клетки, невоспроизводящейся клетки, фиксированной клетки, обработанной лекарством клетки, химически обработанной клетки, осмотически обработанной клетки, облученной клетки, искусственной клетки, синтетической клетки, фолликулярной дендритной клетки, клетки-природного киллера, макрофага, моноцита, мононуклеарного фагоцита, нейтрофила, эозинофила или базофила;

(b) генерирующий сигнал репортер в живой биологической клетке, где указанный генерирующий сигнал репортер представляет собой краситель, имеющий флуоресцентные, ультрафиолетовые или видимые характеристики; фермент, способный давать люминесцентный или флуоресцентный сигнал; флуоресцентные, заряженные или магнитные наночастицы, наноточки или квантовые точки; флуоресцентный белок или другую чувствительную к кальцию люминесцентную или флуоресцентную молекулу, и при этом генерирующий сигнал репортер реагирует на определенные изменения, происходящие в живой биологической клетке;

(c) путь передачи сигнала, связанный с генерирующим сигнал репортером, где указанный путь передачи сигнала активируется в результате: изменения рН или температуры живой биологической клетки; изменения электрических или магнитных свойств живой биологической клетки; активации сигнального пути сопряженного с G-белком рецептора в живой биологической клетке; активации пути фосфатидилинозитола в живой биологической клетке; активации пути передачи сигнала в живой биологической клетке, который высвобождает диацилглицерин, керамид или другую липофильную сигнальную молекулу; активации пути передачи сигнала в живой биологической клетке, который высвобождает или образует оксид азота, цАМФ, цГМФ или другой циклический нуклеотид; активации пути передачи сигнала в живой биологической клетке, который выделяет или образует супероксид, пероксид водорода, монооксид углерода, сероводород или другую вторичную редокс-сигнальную молекулу; или конформационного изменения рецептора, экспрессируемого живой биологической клеткой, где конформационное изменение происходит только после того, как универсальный детекторный элемент связывается с целевым аналитом;

(d) универсальный детекторный элемент, связанный с указанным путем передачи сигнала, причем универсальный детекторный элемент содержит: область V(variable, вариабельный)-, D(diversity, разнообразие)-, J(joining, соединение) сегментов (VDJ) антитела, Fab-фрагмент или другую детерминанту антитела; V-J сегменты (VJ) Т-клеток, V-D-J сегменты (VDJ) или другую детерминанту рецептора Т-клеток; синтетический пептид; непептидную органическую детерминанту известного размера; детерминанту лектина, углеводсвязывающий модуль или другую углеводсвязывающую детерминанту; липидсвязывающую детерминанту; детерминанту металлотиона, которая связывает металл или другую металлсвязывающую детерминанту; иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM); детерминанту Fc, которая нековалентно связывается с Fc-связывающим компонентом пути передачи сигнала в живой биологической клетке; или детерминанту биотина или (стрепт)авидина, которая нековалентно связывается с биотин- или (стрепт)авидинсвязывающим компонентом пути передачи сигнала; в живой биологической клетке, и где указанный универсальный детекторный элемент может запускать указанный путь передачи сигнала;

е) элемент, связывающий аналит, связанный с универсальным детекторным элементом, причем элемент, связывающий аналит, специфичен как в отношении универсального детекторного элемента, так и в отношении целевого аналита, где элемент, связывающий аналит, представляет собой аффитело, аптамер или растворимый рецептор или где элемент, связывающий аналит, включает фрагмент IgG, который представляет собой одноцепочечное антитело или одноцепочечное диатело; и

(f) при этом при связывании элемента, связывающего аналит, с которым целевой аналит также связан, с универсальным детекторным элементом универсальный детектор ингибирует указанный путь передачи сигнала, вызывая уменьшение указанных определенных изменений в живой биологической клетке, в результате чего генерирующий сигнал репортер генерирует ослабленный сигнал или не генерирует сигнал.

14. Биосенсорная система по п.13, в которой целевой аналит представляет собой полезную кишечную бактерию, патогенную бактерию, белковый биомаркер, низкомолекулярный токсин, метаболит или средство химической борьбы или небольшую молекулу, связанную с макромолекулярным носителем.