Композиция для предупреждения или лечения злокачественной опухоли, содержащая средство, разрушающее сосуды, и ингибитор иммунной точки контроля
Изобретение относится к комбинации для предупреждения или лечения злокачественной опухоли, содержащей (S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-(3,4,5-триметоксибензоил)фенил)тиазол-2-ил)-2-амино-3-метилбутанамид или его фармацевтически приемлемые соли и ингибитор иммунной точки контроля. Композиция по настоящему изобретению достигает превосходного эффекта лечения злокачественной опухоли. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 пр., 7 ил.
Область техники
Настоящее изобретение относится к композиции для предупреждения или лечения злокачественной опухоли, содержащей средство, разрушающее сосуды (VDA), и ингибитор иммунной точки контроля.
Уровень техники
Поскольку последние достижения в области иммунологии обеспечивают большее понимание иммунной системы организма человека, была разработана иммунотерапия в качестве новой терапии, направленной против опухолей, где она имеет преимущество, состоящее в том, что может использоваться собственная иммунная система пациентов, и, таким образом, они могут приобретать противоопухолевый иммунитет на длительный период времени с меньшими побочными эффектами.
Целью иммунотерапии является продукция опухолеспецифических цитотоксических T-лимфоцитов (CTL), способных распознавать опухолевых клетки или опухолевые антигены, и, таким образом, устранение опухолевых клеток. Иными словами, антигенными пептидами опухоли нагружается основной комплекс гистосовместимости (MHC), а затем они презентируются T-лимфоцитам самими опухолевыми клетками или антигенпредставляющими клетками, таким образом, активируя T-лимфоциты и индуцируя их дифференцировку в CTL и увеличение уровня CTL.
Однако большинство опухолей в организме человека имеют тенденцию к ускользанию от иммунного надзора индивидуума, поэтому их трудно лечить. Причинами такой затрудненности являются следующие: 1) опухолевые антигены являются частью аутоантигенов, большинство из которых экспрессируются в ходе эмбрионального периода или экспрессируются в нормальных клетках и не распознаются в качестве антигена вследствие очень низкой степени индукции иммунитета, 2) экспрессия MHC опухолевыми клетками является низкой или опухолевые антигены не полностью процессируются в опухолевых клетках, и, таким образом, не презентируются вовсе, 3) большинство опухолевых клеток могут не экспрессировать костимулирующие молекулы, необходимые для презентации антигена, и 4) такие опухолевые клетки могут избегать иммунного надзора посредством ингибиторных цитокинов, секретируемых опухолями.
Между тем разрушающее сосуды средство (VDA) служит для селективного разрушения микротрубочек цитоскелета сосудисто-эндотелиальных клеток и, таким образом, быстрого и селективного разрушения кровеносных сосудов опухоли, образовавшихся в ней, где VDA также может индуцировать ишемический некроз клеток, расположенных в центре опухолей. Однако при лечении VDA в качестве единственного средства существует проблема, состоящая в том, что опухоли могут быстро вновь расти из жизнеспособных краев, таким образом, снижая терапевтическую полезность таких лекарственных средств.
Ссылки уровня техники
Патентные документы
WO2009/119980
WO2016/130839
WO2016/197204
Непатентный документ
Cancer immunology immunotherapy 2014; 63:925-938.
Описание изобретения
Техническая проблема
Авторы настоящего изобретения провели различные исследования для предоставления новой композиции для предупреждения или лечения злокачественной опухоли и способа ее лечения, в которых используется большинство преимуществ иммунотерапевтических средств, используемых в иммунотерапии, при одновременном решении проблем, связанных с применением только VDA.
Решение проблемы
Задачей настоящего изобретения является предоставление композиции для предупреждения или лечения злокачественной опухоли, содержащей разрушающее сосуды средство (VDA) и ингибитор иммунной точки контроля.
Задачей настоящего изобретения является предоставление способа лечения злокачественной опухоли, включающего введение VDA и ингибитора иммунной точки контроля индивидууму, нуждающемуся в этом.
Задачей настоящего изобретения является обеспечение применения VDA и ингибитора иммунной точки контроля для получения лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли.
Задачей настоящего изобретения является предоставление композиции, содержащей VDA и ингибитор иммунной точки контроля, для применения для лечения злокачественной опухоли.
Преимущественные эффекты изобретения
Композиция по настоящему изобретению достигает превосходной активности предупреждения или лечения злокачественной опухоли и имеет преимущество более низкой вероятности рецидива опухоли. Таким образом, композицию по настоящему изобретению можно применять для предупреждения, снижения или лечения злокачественной опухоли.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлено увеличение экспрессии CD80, маркера зрелых дендритных клеток, в соответствии с лечением соединением формулы 2.
На фиг.2 представлено увеличение экспрессии CD86, маркера зрелых дендритных клеток, в соответствии с лечением соединением формулы 2.
На фиг.3 представлено увеличение экспрессии MHCII, маркера зрелых дендритных клеток, в соответствии с лечением соединением формулы 2.
На фиг.4 представлено увеличение секретируемого количества IL-1b, IL-6 и IL-12, в соответствии с лечением соединением формулы 2.
На фиг.5 представлено повышение фагоцитоза дендритных клеток в соответствии с лечением соединением формулы 2.
На фиг.6 представлен эффект лечения злокачественной опухоли в соответствии с введением разрушающего сосуды средства отдельно или комбинированным введением разрушающего сосуды средства и ингибитора иммунной точки контроля (PD-1, CTLA-4 или оба из них) в модели злокачественной опухоли на животных.
На фиг.7 представлен эффект лечения злокачественной опухоли в соответствии с введением VDA отдельно или комбинированным введением VDA и ингибитора иммунной точки контроля (PD-L1) в модели злокачественной опухоли на животных.
Наилучшие способы осуществления изобретения
В результате усилий по достижению указанных выше задач авторы настоящего изобретения получили фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения злокачественной опухоли, содержащей разрушающее сосуды средство (VDA) и ингибитор иммунной точки контроля.
VDA нацелено на селективное разрушение микротрубочек цитоскелета сосудисто-эндотелиальных клеток и, таким образом, быстрое и селективное разрушение кровеносных сосудов опухоли, образовавшихся в ней. Также VDA может индуцировать ишемический некроз клеток, расположенных в центре опухолей.
В рамках настоящего изобретения соединение, используемое в качестве указанного VDA, представляет собой (S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-(3,4,5-триметоксибензоил)фенил)тиазол-2-ил)-2-амино-3-метилбутанамид, соответствующий приведенной ниже формуле 1, или его фармацевтически приемлемые соли.
[Формула 1]
В рамках настоящего изобретения соединение формулы 1 выше можно получать, например, способом получения, описанным в международной публикации патента WO 2009-119980, но не ограничиваясь этим.
В рамках настоящего изобретения фармацевтически приемлемые соли означают соли, обычно используемые в фармацевтической промышленности, где они представляют собой, например, соли неорганических ионов, образованные из кальция, калия, натрия, магния и т.п.; соли неорганических кислот, образованные из хлористоводородной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты, бромноватой кислоты, йодноватой кислоты, перхлорной кислоты, серной кислоты и т.п.; соли органических кислот, образованные из уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, лимонной кислоты, малеиновой кислоты, янтарной кислоты, щавелевой кислоты, бензойной кислоты, виннокаменной кислоты, фумаровой кислоты, миндальной кислоты, пропионовой кислоты, молочной кислоты, гликолевой кислоты, глюконовой кислоты, галактуроновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутаровой кислоты, глюкуроновой кислоты, аспарагиновой кислоты, аскорбиновой кислоты, угольной кислоты, ванилиновой кислоты и т.п.; соли сульфоновых кислот, образованные из метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, нафталинсульфоновой кислоты и т.п.; соли аминокислот, образованные из глицина, аргинина, лизина и т.д.; соли аминов, образованные из триметиламина, триэтиламина, аммиака, пиридина, пиколина и т.д. и т.п., однако типы солей, подразумеваемые в рамках настоящего изобретения, не ограничиваются приведенными выше солями.
В частности, соль (S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-(3,4,5-триметоксибензоил)фенил)тиазол-2-ил)-2-амино-3-метилбутанамида может представлять собой гидрохлорид.
В рамках настоящего изобретения активный метаболит соединения формулы 1 выше может представлять собой (4-(2-аминотиазол-4-ил)-2-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)фенил)(3,4,5-триметоксифенил)метанон, соответствующий приведенной ниже формуле 2. Термин "активный метаболит", упоминаемый выше, представляет собой вещество, фактически демонстрирующее фармакологическую активность у подвергаемого лечению индивидуума среди веществ, продуцируемых в ходе метаболического процесса ассимиляции или катаболизма в организме.
[Формула 2]
В рамках настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы 1, для предупреждения или лечения злокачественной опухоли, присутствует в качестве соединения формулы 2 выше в соответствии с метаболическим процессом у индивидуума, таким образом, достигая эффекта предупреждения, уменьшения или лечения злокачественной опухоли.
Соединение формулы 1 по настоящему изобретению быстро и селективно разрушает кровеносные сосуды опухоли, таким образом, не только вызывая ишемический некроз клеток, расположенных в центре опухолей, но также активируя дендритные клетки.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения соединение формулы 2 способствует созреванию дендритных клеток (DC), увеличивает фагоцитоз и повышает способность презентировать чужеродные антигены (фиг.1-5).
Дендритные клетки представляют собой клетки, способные индуцировать противоопухолевый иммунитет, где они получают антигены через фагоцитоз и т.д., и экспрессируют антигены путем загрузки антигенных пептидов на MHC, таким образом, интенсивно индуцируя активность T-лимфоцитов, имеющих антигенспецифический T-клеточный рецептор. Также при активации дендритные клетки экспрессируют IL-12, предупреждая апоптоз T-лимфоцитов, индуцируют дифференцировку T-лимфоцитов и активность CTL, и повышают активность натуральных киллеров, так что такие клетки достигают характеристик увеличения противоопухолевого иммунитета.
Таким образом, в фармацевтической композиции по изобретению для предупреждения или лечения злокачественной опухоли соединение формулы 1 и соединение формулы 2, которое является его активным метаболитом, достигают не только эффекта разрушающего сосуды средства, но также эффектов активации дендритных клеток и повышения фагоцитоза и способности презентировать чужеродный антиген.
В рамках настоящего изобретения ингибитор иммунной точки контроля ингибирует ускользание злокачественной опухоли от иммунитета путем нарушения иммунной точки контроля, что препятствует прогрессированию иммунных ответов в злокачественной опухоли с высокой иммуносупрессивной активностью, так что это может лечить злокачественную опухоль.
Ингибитор иммунной точки контроля представляет собой новое терапевтическое средство против опухоли, разработанное в результате большего понимания иммунной системы организма человека вследствие достижения в области иммунологии, где такой ингибитор широко используется в стратегии борьбы со злокачественной опухолью. В качестве иллюстративного механизма использования ингибитора и, таким образом, достижения противоракового эффекта, существует механизм ингибирования T-лимфоцитов посредством CTLA-4 и механизм PD-1/PD-L1 для ингибирования T-лимфоцитов, которые уже активированы. Однако согласно сообщенной информации, лечение только ингибитором иммунной точки контроля имеет ограничения, такие как низкая терапевтическая эффективность, незначительный эффект и т.п.
Однако композиция по изобретению для предупреждения или лечения злокачественной опухоли помогает предупреждать и лечить злокачественную опухоль посредством иммунотерапии вследствие синергического и взаимодополняющего эффекта, посредством введения соединения формулы 1 (VDA) и ингибитора иммунной точки контроля, которые представляют собой лекарственные средства против злокачественной опухоли с различными терапевтическим механизмами, в комбинации друг с другом.
Ингибитор иммунной точки контроля может представлять собой антитело, слитый белок, аптамер или его фрагмент, связывающий белок иммунной точки контроля. Например, ингибитор иммунной точки контроля представляет собой антитело против белка иммунной точки контроля или его антигенсвязывающий фрагмент.
В определенном примере ингибитор иммунной точки контроля выбран из антитела против CTLA4, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PD-L1, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; антитела против LAG-3, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; антитела против OX40, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; антитела против TIM3, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; и антитела против PD-1, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента.
Например, ингибитор иммунной точки контроля может быть выбран из ипилимумаба, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; тремелимумаба, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; ниволумаба, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; пембролизумаба, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; пидилизумаба, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; атезолизумаба, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; дурвалумаба, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; авелумаба, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; BMS-936559, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; BMS-986016, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; GSK3174998, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; TSR-022, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; MBG453, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; LY3321367, его производного или их антигенсвязывающего фрагмента; и рекомбинантного слитого белка IMP321. Можно использовать любой ингибитор иммунной точки контроля без ограничений при условии, что он представляет собой антитело или другие его формы, пригодные в качестве ингибитора иммунной точки контроля.
В частности, предпочтительно он представляет собой по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, состоящей из антитела против CTLA4, антитела против PD-1, антитела против LAG-3, антитела против OX40, антитела против TIM3 и антитела против PD-L1. Антитело можно использовать, например, в форме, приобретенной от типичного производителя антител и т.д., или получать известным способом получения антител.
Ингибитор иммунной точки контроля может представлять собой низкомолекулярное соединение, имеющее эффект ингибитора иммунной точки контроля, описанного выше, или вовлеченное в его ингибиторный механизм. Например, эти низкомолекулярные соединения могут представлять собой низкомолекулярные соединения, которые связывают белок иммунной точки контроля или вовлечены в механизм, связанный с ингибированием иммунной точки контроля.
В частности, низкомолекулярные соединения могут представлять собой BMS-202 (Resource: BMS), BMS-8 (Resource: BMS), CA170 (Resource: Curis/Aurigene), CA327 (Resource: Curis/Aurigene), Epacadostat, GDC-0919, BMS-986205 и т.п.
Можно использовать любой ингибитор иммунной точки контроля без ограничений при условии, что он представляет собой низкомолекулярное соединение, пригодное в качестве ингибитора иммунной точки контроля или имеющее сходный эффект.
Композицию по настоящему изобретению вводят в комбинации с соединением формулы 1 (VDA) и ингибитором иммунной точки контроля, таким образом, достигая выраженной активности предупреждения и лечения злокачественной опухоли вследствие синергического и взаимодополняющего эффекта такого комбинированного применения.
В качестве одного примера терапевтического механизма композиция по настоящему изобретению может иметь выраженный эффект предупреждения и лечения злокачественной опухоли следующим образом, но не ограничиваясь этим. Соединение формулы 1 активирует дендритные клетки, и, таким образом, затем может происходить активация T-лимфоцитов. В фазу активации T-лимфоцитов или в фазу распознавания активированными T-лимфоцитами злокачественных клеток для уничтожения их, иммунная точка контроля может нарушать эти фазы, ингибируя активацию T-лимфоцитов. Однако ингибитор иммунной точки контроля, который вводят в комбинации с соединением формулы 1, может нарушать фазу ингибирования активации T-лимфоцитов, сохраняя активность T-лимфоцитов. Таким образом, является возможным достижение синергического эффекта в отношении активности предупреждения или лечения злокачественной опухоли посредством комбинирования различных механизмов: одним является активация T-лимфоцитов соединением формулы 1, а другим является нарушение ингибитором иммунной точки контроля ингибирования активации T-лимфоцитов злокачественными клетками.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения было выявлено, что комбинированное введение соединения формулы 1 и антитела против PD-1, антитела против CTLA-4 или обоих из них достигало увеличенного эффекта лечения злокачественной опухоли по сравнению с однократным введением (фиг.6).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения было идентифицировано, что комбинированное введение соединения формулы 1 и антитела против PD-L1 достигало повышенного эффекта лечения злокачественной опухоли по сравнению с введением единственного средства (фиг.7).
Таким образом, композиция содержит соединение формулы 1 и по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, состоящей из антитела против CTLA4, антитела против PD-1 и антитела против PD-L1. В частности, композиция содержит соединение формулы 1 и антитело против CTLA4. В частности, композиция содержит соединение формулы 1 и антитело против PD-1. В частности, композиция содержит соединение формулы 1 и антитело против PDL1. В частности, композиция содержит соединение формулы 1, антитело против CTLA4 и антитело против PD-1.
В рамках настоящего изобретения может быть полезным использование композиции по настоящему изобретению для предупреждения или лечения злокачественной опухоли. Злокачественная опухоль может представлять собой злокачественную опухоль различных типов в организме человека, гинекологическую опухоль, злокачественную опухоль эндокринной системы, опухоль центральной нервной системы, злокачественную опухоль мочеточник и т.д., в том числе включая рак легкого, рак желудка, рак печени, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, меланому кожи, рак тела матки, рак яичника, рак ободочной и прямой кишки, рак молочной железы, саркому матки, карциному фаллопиевых труб, карциному внутреннего эндометрия, карциному шейки матки, карциному вульвы, рак пищевода, рак гортани, новообразование тонкого кишечника, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, саркому мягких тканей, рак уретры, рак полового члена, рак предстательной железы, множественную миелому, хронический или острый лейкоз, солидную опухоль детского возраста, лимфому (такую как дифференцированная лимфома, первичная лимфома центральной нервной системы), рак мочевого пузыря, рак почки, почечноклеточный рак, карциному почечной лоханки, опухоль оси позвоночника, глиому ствола головного мозга, карциному из клеток Меркеля, новообразование мочевыводящих путей или аденому гипофиза, но не ограничиваясь ими. Более конкретно, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для предупреждения или лечения злокачественной опухоли, выбранной из группы, состоящей из рака ободочной и прямой кишки, меланомы кожи, рака легкого, рака желудка, лимфомы, карциномы из клеток Меркеля, новообразования из мочевыводящих путей и множественной миеломы.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть составлена в препарат с использованием фармацевтически приемлемого носителя в соответствии со способом, который может быть без труда выполнен специалистами в области, к которой относится настоящее изобретение, так что такую композицию можно получать в форме единичной дозы или можно получать путем помещения в многодозовый контейнер.
Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой носитель, обычно используемый для составления препарата, где такой носитель включает, но не ограничиваясь ими, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и т.п. Помимо этих компонентов фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, кроме того, может содержать смазывающее вещество, увлажнитель, подсластитель, вкусовую добавку, эмульгатор, суспендирующее вещество, консервант и т.д. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и препараты подробно описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
Композиция по настоящему изобретению может содержать отдельные препараты двух типов и также она может состоять из одного препарата.
Композицию по настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально (например, применять внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или местным путем), в соответствии с заданным способом.
В рамках настоящего изобретения (S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-(3,4,5-триметоксибензоил)фенил)тиазол-2-ил)-2-амино-3-метилбутанамид или его фармацевтически приемлемые соли можно вводить перорально или парентерально, и предпочтительно вводят перорально.
Также ингибитор иммунной точки контроля можно вводить перорально или парентерально.
Например, антитело, слитый белок, аптамер или его фрагмент, связывающий иммунный белок точки контроля, в качестве ингибитора иммунной точки контроля можно вводить парентерально.
Например, низкомолекулярные соединения в качестве ингибитора иммунной точки контроля можно вводить перорально или парентерально.
В композиции по настоящему изобретению подходящий диапазон дозировок эффективных компонентов, описанных выше, варьируется в зависимости от массы тела пациента, возраста, пола, состояния здоровья, диеты, времени введения, способа введения, скорости экскреции, тяжести заболевания и т.п. Суточная доза (S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-(3,4,5-триметоксибензоил)фенил)тиазол-2-ил)-2-амино-3-метилбутанамида или его фармацевтически приемлемых солей составляет приблизительно от 1 до 20 мг/м2, предпочтительно от 5 до 15 мг/м2. Также суточная доза антитела, слитого белка, аптамера или его фрагмента, связывающего белок иммунной точки контроля, по настоящему изобретению, составляет приблизительно от 0,1 до 50 мг/кг, предпочтительно от 1 до 30 мг/кг. Суточная доза низкомолекулярных соединений в качестве ингибитора иммунной точки контроля по настоящему изобретению составляет приблизительно от 1 до 1500 мг, предпочтительно от 200 до 800 мг.
Более того, в композиции по настоящему изобретению подходящий интервал между введением эффективных компонентов, описанных выше, может зависеть от указанной дозы.
(S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-(3,4,5-триметоксибензоил)фенил)тиазол-2-ил)-2-амино-3-метилбутанамид или его фармацевтически приемлемые соли можно вводить один раз в сутки или один раз в три недели, в частности, два раза в неделю, но не ограничиваясь этим. Кроме того, ингибитор иммунной точки контроля по настоящему изобретению можно вводить один раз в сутки или один раз в три недели, но не ограничиваясь этим.
Настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, включающему введение VDA по изобретению и ингибитора иммунной точки контроля индивидууму, нуждающемуся в этом. В рамках настоящего изобретения термин "индивидуум" включает млекопитающих, в частности, людей. Способ лечения включает введение терапевтически эффективного количества, где термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству VDA по изобретению и ингибитора иммунной точки контроля, которое является эффективным для лечения злокачественной опухоли. VDA и ингибитор иммунной точки контроля, описанные выше, можно вводить последовательно в любом порядке или одновременно.
Настоящее изобретение относится к предоставлению VDA и ингибитора иммунной точки контроля для получения лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли. Композицию, содержащую VDA по изобретению и ингибитор иммунной точки контроля, для получения лекарственного средства можно смешивать с приемлемым носителем и т.д., и она может дополнительно содержать другие средства.
Настоящее изобретение относится к предоставлению композиции, содержащей VDA и ингибитор иммунной точки контроля, для применения для лечения злокачественной опухоли.
Материалы, упомянутые в отношении применения, композиции, способа лечения по настоящему изобретению применимы в равной степени, если только они не противоречат друг другу.
Способ осуществления изобретения
Далее конфигурации и эффекты настоящего изобретения более подробно описаны с помощью примеров. Однако приведенные ниже предоставлены только для иллюстрации настоящего изобретения и, таким образом, объем настоящего изобретения не ограничивается ими.
<Пример 1> Эффект соединения формулы 2 на повышение активности дендритных клеток
1. Экспериментальный способ
Получение дендритных клеток, происходящих из костного мозга мыши (BM-DC)
Дендритные клетки, происходящие из костного мозга (BM-DC), получали из бедра мыши BALB/c или C57BL/6. Клетки держали в модифицированной способом Дульбекко среде Игла (DMEM), содержавшей 40 нг/мл rmGM-CSF (JW Creagene, Sungnam, Корея) и 20 нг/мл rmIL-4 (JW CreaGene), и содержавшей 10% инактивированную нагреванием FBS (Hyclone), 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Hyclone) и 50 мкм 2-меркаптоэтанола (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, США).
Получение активного соединения
Соединение формулы 2 (соединение 2), которое представляло собой активный метаболит соединения формулы 1, растворяли в DMSO и разбавляли средой происходящих из костного мозга мыши дендритных клеток с получением активного соединения.
Идентификация фенотипа дендритных клеток
Для идентификации фенотипа дендритных клеток происходящие из костного мозга мыши дендритные клетки обрабатывали соединением формулы 2 в течение 24 часов, а затем окрашивали антителом (антитело против CD80 мыши, против CD86 мыши или против MHC II мыши) к маркеру клеточной поверхности происходящих из костного мозга мыши дендритных клеток, а также изотипическим контрольным антителом. Проточную цитометрию проводили с использованием проточного цитометра FACS Canto II (Becton Dickinson).
Количественное определение цитокинов, продуцированных дендритными клетками
Для идентификации изменения секреции цитокинов происходящие из костного мозга мыши дендритные клетки обрабатывали соединением формулы 2 в течение 24 часов, а затем количественно определяли цитокины с использованием клеточной культуральной среды. Для количественного определения цитокинов использовали набор для иммуноанализа (R&D system), и, таким образом, проводили количественное определение IL-1β, IL-6 и IL-12.
Определение фагоцитоза дендритных клеток
Для идентификации фагоцитоза дендритных клеток происходящие из костного мозга мыши дендритные клетки (2×106/лунка) обрабатывали 100 нМ соединения формулы 2 в течение 18 часов, а затем добавляли микросферы с OVA, содержавшие овальбумин, меченный флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), для культивирования в течение 2 часов. Полностью культивированные клетки промывали PBS, а затем клетки собирали, фиксировали параформальдегидом и анализировали с использованием проточного цитометра.
Статистический анализ
Статистическую значимость между контрольной группой и группой лечения подтверждали с использованием t-критерия Стьюдента.
2. Результаты эксперимента
Созревание дендритных клеток
Результаты обработки происходящих из костного мозга мыши дендритных клеток соединением формулы 2 представлены на фиг.1-3. На фиг.1, 2 и 3 представлены результаты идентификации фенотипа с использованием CD80, CD86 и MHC II в качестве клеточного маркера, соответственно. Как видно на фиг.1 и 2 выше, было идентифицировано, что уровни CD80 и CD86 увеличивались во всех группах, в которых проводилась обработка в концентрации 0,01, 0,1 и 1 мкМ. На фиг.3 представлены результаты в концентрации 100 нМ, где было идентифицировано, что уровень MHCII возрастал в качестве фенотипа зрелых клеток. Из приведенных выше результатов было идентифицировано, что соединение формулы 2 обеспечивало созревание дендритных клеток.
Увеличение продукции цитокинов
Результаты для уровней цитокинов, измененных в соответствии с лечением соединением формулы 2, представлены на фиг.4. В результате обработки происходящих из костного мозга мыши дендритных клеток соединением формулы 2, было идентифицировано, что уровни IL-1β, IL-6 и IL-12 возрастали во всех группах, в которых проводили обработку соединением формулы 2. Из приведенных выше результатов было идентифицировано, что соединение формулы 2 обеспечивало созревание дендритных клеток.
Повышение фагоцитоза дендритных клеток
Результаты количественного определения фагоцитоза дендритных клеток представлены на фиг.5. В результате анализа интенсивности флуоресценции с использованием проточного цитометра было идентифицировано, что соединение формулы 2 повышало фагоцитоз дендритных клеток, и, таким образом, было идентифицировано, что фагоцитоз дендритных клеток в отношении чужеродных антигенов возрастал.
<Пример 2> Синергический эффект при лечении соединением формулы 1 и ингибитором иммунной точки контроля (1)
1. Способ эксперимента
MC38 (8×104 клеток), клеточную линию рака ободочной и прямой кишки, подкожно трансплантировали мыши C57BL/6. Когда размер злокачественной опухоли достигал 40-60 мм3, мыши внутрибрюшинно инъецировали носитель или 5 мг/кг соединения формулы два раза в неделю. Также 1 мкг/мкл (200 мкг/200 мкл/мышь) антитела против PD-1, антитела против CTLA-4 или обоих из них (приобретенных от BioXCell) внутрибрюшинно инъецировали мыши два раза в неделю через один день после введения носителя или соединения формулы 1. Размер злокачественной опухоли и массу определяли два раза в неделю.
2. Результаты эксперимента
Результаты эксперимента, описанного выше, представлены на фиг.6.
В модели злокачественной опухоли на животных соединение формулы 1, и антитело против PD-1, и антитело против CTLA-4 в значительной степени ингибировали рост злокачественной опухоли. В частности, соединение формулы 1 достигало очень высокого терапевтического потенциала с синергическим эффектом при введении в комбинации с антителом против PD-1 или антителом против CTLA-4, соответственно. Более того, эффект, направленный против злокачественной опухоли, в наибольшей степени возрастал в экспериментальной группе, в которой соединение формулы 1 вводили в третей комбинации с антителом против PD-1 и антителом против CTLA-4, и, таким образом, было идентифицировано, что злокачественная опухоль полностью устранялась у двух из десяти экспериментальных животных. Из приведенных выше результатов было идентифицировано, что комбинированное введение соединения формулы 1 и ингибитора иммунной точки контроля достигло в значительной степени превосходного противоракового эффекта, одновременно имея синергический эффект на лечение злокачественной опухоли.
<Пример 3> Синергический эффект при лечении злокачественной опухоли соединением формулы 1 и ингибитором иммунной точки контроля (2)
1. Экспериментальный способ
MC38 (8×104 клеток), клеточную линию рака ободочной и прямой кишки мыши, подкожно трансплантировали мыши C57BL/6. Когда размер опухоли достигал 40-60 мм3, носитель или 5 мг/кг соединения формулы 1 внутрибрюшинно инъецировали мыши два раза в неделю. Также, 1 мкг/мкл (200 мкг/200 мкл/мышь) антитела против PD-L1 внутрибрюшинно инъецировали мыши два раза в неделю через одни сутки после введения носителя или соединения формулы. Размер и массу злокачественной опухоли определяли два раза в неделю.
2. Результаты эксперимента
Результаты эксперимента, описанного выше, представлены на фиг.7.
В модели злокачественной опухоли на животных, описанной выше, соединение формулы и антитело против PD-L1 в значительной степени ингибировали рост злокачественной опухоли. В частности, соединение формулы 1 достигало очень высокого терапевтического потенциала с синергическим эффектом при введении в комбинации с антителом против PD-L1. Из приведенных выше результатов было идентифицировано, что комбинированное введение соединения формулы 1 и ингибитора иммунной точки контроля достигало в значительной степени превосходного противоракового эффекта, одновременно оказывая синергическое действие на лечение злокачественной опухоли.
1. Комбинация для лечения злокачественной опухоли, содержащая терапевтически эффективное количество (S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-(3,4,5-триметоксибензоил)фенил)тиазол-2-ил)-2-амино-3-метилбутанамида, соответствующего следующей формуле 1, или его фармацевтически приемлемой соли, и терапевтически эффективное количество ингибитора иммунной точки контроля, выбранного из антитела против CTLA4 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента; и антитела против PD-1 или его антигенсвязывающего фрагмента.
[Формула 1]
2. Комбинация по п. 1, где фармацевтически приемлемая соль (S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-(3,4,5-триметоксибензоил)фенил)тиазол-2-ил)-2-амино-3-метилбутанамида представляет собой гидрохлорид.
3. Комбинация по п. 1, где активный метаболит соединения, соответствующего формуле 1 выше, представляет собой (4-(2-аминотиазол-4-ил)-2-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)фенил)(3,4,5-триметоксифенил)метанон, соответствующий следующей формуле 2:
[Формула 2]
4. Комбинация по п .1, где злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, выбранную из группы, состоящей из рака ободочной и прямой кишки, меланомы кожи, рака легкого, рака желудка, рака предстательной железы, лимфомы, карциномы из клеток Меркеля, новообразования мочевыводящих путей и множественной миеломы.
5. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение терапевтически эффективного количества комбинации по п. 1 нуждающемуся в этом индивидууму.
6. Способ по п. 5, где (S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-(3,4,5-триметоксибензоил)фенил)тиазол-2-ил)-2-амино-3-метилбутанамид или его фармацевтически приемлемую соль вводят перорально.
7. Способ по п. 5, где ингибитор иммунной точки контроля вводят парентерально.
8. Способ по п. 5, где фармацевтически приемлемая соль (S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-(3,4,5-триметоксибензоил)фенил)тиазол-2-ил)-2-амино-3-метилбутанамида представляет собой гидрохлорид.
9. Применение комбинации по п. 1 для получения лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли.
10. Применение по п. 9, где фармацевтически приемлемая соль (S)-N-(4-(3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-(3,4,5-триметоксибензоил)фенил)тиазол-2-ил)-2-амино-3-метилбутанамида представляет собой гидрохлорид.
