Противо-sars-cov-2 вирусное средство антипровир

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики. Раскрыто применение фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного компонента апротинин и вспомогательные вещества, в качестве противовирусного средства для лечения и профилактики COVID-19. Изобретение обеспечивает высокую противовирусную активность при лечении и профилактике COVID-19. 3 з.п. ф-лы, 4 пр.

 

Данное изобретение относится к новому противо-SARS-CoV-2 вирусному средству Антипровир предназначенному для профилактики и лечения короновирусного заболевания COVID-19, Внезапная вспышка нового коронавируса в 2019 году, позже названного SARS-CoV-2, в Ухань, Китай, которая быстро превратилась в глобальную пандемию, ознаменовала третье внедрение вирулентного Коронавируса в человеческое общество, влияющий не только на систему здравоохранения, но и на мировую экономику. Эффективные подходы к вакцинации, профилактике и лечению SARS-CoV-2 (COVID-19) и эпидемиологическому контролю все еще отсутствуют,

В этой связи во всем мире ведутся интенсивный поиск вакцин и терапевтических агентов для профилактики и лечения SARS-CoV-2 (COVID-19). Одним из практических подходов в качестве меры быстрого реагирования на возникающую пандемию является перепрофилированием существующих терапевтических агентов, ранее предназначенных для других вирусных инфекций так как большинство из этих агентов уже были проверены на их безопасность. Эти агенты могут быть разделены на две широкие категории, те, которые могут непосредственно ориентироваться на цикл репликации вируса, и те, которые основаны на иммунотерапевтическом подходе, направленные либо на усиление врожденных противовирусных иммунных реакций, либо на уменьшение ущерба вызвано дисрегуляцией воспалительных реакций.

Первоначальные клинические исследования выявили многообещающий терапевтический потенциал нескольких таких препаратов, включая фавипиравир, противовирусный препарат широкого спектра действия который мешает репликации вируса, гидроксихлорохин, перепрофилированный противомалярийный препарат, который вмешивается в эндосомальный путь проникновения вируса и ремдисивир с широким спектром противовирусной активностью. Ремдисивир экспериментальное лекарство, которое не имеет доказанной безопасности или эффективности для лечения каких-либо состояний. Ремдесивир продемонстрировал активность in vitro и in vivo на животных моделях против вирусных патогенов MERS и SARS, которые также являются коронавирусами и структурно сходны с COVID-19. Ограниченные доклинические данные по ремдесивиру в MERS и SARS указывают на то, что ремдесивир может обладать потенциальной активностью в отношении COVID-19.

По состоянию на 26 апреля 2020 года коронавирус COVID-19 поразил 210 стран и территорий, всего было зарегистрировано 3 055 308 случаев инфичированных COVID-19 человек, выздоровело 917432 человек и умерло 211032 человека.

Учитывая, что SARS-CoV-2 представляет собой серьезную угрозу для общественного здравоохранения и экономики во всем мире представляется целесообразным поиск новых эффективных противокоронавирусных препаратов,

Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании этого изобретения.

Термин «лекарственный препарат» означает вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции) в виде таблеток, капсул, инъекций, мазей и др. готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего.

Термин «фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя соединение формулы 1 и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ.

Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного компонента, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, альгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного компонента, одного или в комбинации с другим активным компонентом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения, в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения.

Термин «инертный наполнитель», используемый в данном описании, относится к соединению, которое используют для получения фармацевтической композиции, и, как правило, безопасному, нетоксичному и ни биологически, ни иным образом нежелательному, и включает в себя вспомогательные вещества, которые являются приемлемыми для применения в ветеринарии, а также фармакологически приемлемыми для человеческого использования. Соединения по данному изобретению могут быть введены отдельно, но обычно их будут вводить в смеси с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями, выбранными с учетом предполагаемого пути введения и стандартной фармацевтической практики.

Термин «терапевтически эффективное количество», используемый здесь, означает количество субстанции, пролекарства или лекарства, необходимое для уменьшения симптомов заболевания у субъекта. Доза субстанции, пролекарства или лекарства будет соответствовать индивидуальным требованиям в каждом конкретном случае. Эта доза может варьироваться в широких пределах в зависимости от многочисленных факторов, таких как тяжесть заболевания, подлежащего лечению, возраста и общего состояния здоровья пациента, других лекарственных средств, с помощью которых пациент проходит лечение, способа и формы введения и опыта лечащего врача. Для перорального введения суточная доза составляет приблизительно от 0,01 до 10 г, включая все значения между ними, в день в монотерапии и/или в комбинированной терапии. Предпочтительная суточная доза составляет примерно от 0,1 до 7 г в день. Как правило, лечение начинают с большой начальной нагрузочной дозы, чтобы быстро уменьшить или устранить вирус, сопровождающей: убывающую дозу до уровня, достаточного для предотвращения всплеска инфекции.

Термин «субъект» означает млекопитающее, которое включает, но не ограничивается ими, крупный рогатый скот, свиней, овец, куриц, индеек, буйволов, лам, страусов, собак, кошек и человека, предпочтительно субъектом является человек. Предполагается, что в способе лечения субъекта может быть любое из пролекарств общей формулы 1, его стереоизомер, изотопно-обогащенный аналог, его фармацевтически приемлемая соль, гидрат, сольват, кристаллическая и полиморфная форма, либо в сочетании их с другим соединением, в том числе с ингибитором РНК-зависимой РНК -полимеразы (RdRp) различных РНК вирусов.

Известен полипептид апротинин, получаемый из органов крупного рогатого скота. Апротинин обладает антипротеолитическим, гемостатическим и антифибринолитическим действием. На его основе выпускается ряд препаратов для терапии различных заболеваний, в том числе Апротекс^®, Гордокс», Аэрус^® и др.

Апротекс^® (Aprotex^®) - представляет собой фармацевтическую композицию, включающую в качестве активного компонента лиофилизат апротинина и вспомогательные вещества (лактоза; натрия гидроксид), для приготовления раствора для внутривенного введения [https://www.rlsnetru/tn_index_id_26457.htm] и обладающий антипротеолитическим, гемостатическим и антифибринолитическим действием. Апротекс применяется для лечения острого или обостренного хронического панкреатита и панкреонекроза; кровотечения на фоне гиперфибринолиза: посттравматическое, послеоперационное (особенно при операциях на предстательной железе, легких), до, после и во время родов (в т.ч. при эмболии околоплодными водами); полименореи; ангионевротического отека; шока (токсического, травматического, ожогового, геморрагического); обширные и глубоких травматических повреждений тканей, а также для профилактики острого неспецифического послеоперационного паротита и выполнение диагностических исследований и операций на поджелудочной железе (профилактика ферментативного аутолиза поджелудочной железы при операциях на ней и рядом расположенных органах брюшной полости) [https://www.vidal.ru/drugs/aprotex_30966].

Гордокс^® (Gordox^®) - инъекционный препарат, представляет собой фармацевтическую композицию, включающую в качестве активного компонента апротинин, вспомогательные вещества (натрия хлорид и бензиловый спирт и воду для инъекций) и обладающий антифибринолитическим действием [https://yandex.ru/health/pills/product/gordoks-203]. Гордокс^® применяется для профилактики интраоперационной кровопотери и уменьшения объема гемотрансфузии при проведении операций аортокоронарного шунтирования с использованием АИК у взрослых пациентов, находящихся в группе повышенного риска развития кровотечения или необходимости проведения гемотрансфузии [https://yandex.ru/health/pills/product/gordoks-203]. Препарат рекомендован также в качестве профилактического лечения для пациентов, у которых можно ожидать повышенного риска кровотечения или потребности в трансфузии https://www.vidalby/poisk_preparatov/gordox.html].

Аэрус^® (Aerus^®) - аэрозольный ингаляционный препарат [WО 2012008869, RU 2425691, ЕР 2594283] для лечения вирусных респираторных инфекций и инфекционно-воспалительных заболеваний вирусной этиологии, представляет собой фармацевтическую композицию, включающую в качестве активного компонента апротинин и вспомогательные вещества (вытеснитель -1,1,1,2-тетрафторзтана, растворители - этанол, глицерин и воду и стабилизатора - масло перечной мяты). [https://wvvw.vidal.ru/drugs/aerus_23575; https://vww.rlsnet.ru/tn_index_id_44141.htm].

Авторы неожиданно обнаружили известные фармацевтические композиции, в том числе Апротекс^®, Гордокс^® и Аэрус^®, включающие в качестве активного компонента апротинин и вспомогательные вещества могут применяться по новому назначению, а именно в качестве пртиво-SARS-CoV-2 вирусного лекарственного средства Антипровир для профилактики и лечения короновирусного заболевания COVID-19.

Предметом данного изобретения является также лекарственное средство Антипровир для профилактики и лечения короновирусного заболевания COVID-19 представляющее собой фармацевтическую композицию содержащую 0,1% вес. ÷ 0,2% вес. апротинина, необязательно 0,2 вес. 1,0% вес. вспомогательных веществ и остальное вода для инъекций. В качестве вспомогательных веществ могут использоваться натрия хлорид, натрия гидроксид, бензиловый спирт, лактоза, 1,1,1,2-тетрафторэтан, мяты перечной листьев масло, этанол, глицерол и др.

Преимущественным лекарственным средством Антипровира является препарат Гордокс^®.

Преимущественным лекарственным средством Антипровира является препарат Аэрус^®.

Преимущественным лекарственным средством Антипровира является препарат Апротекс^®.

Предметом данного изобретения является лиофилизат для приготовления лекарственного средства Антипровир по настоящему изобретению включающий в свой состав 1÷2 весовых части апротинина и необязательно 2÷10 весовых части вспомогательных веществ. В качестве вспомогательных веществ могут использоваться натрия хлорид, натрия гидроксид, бензиловый спирт, лактоза, 1,1,1,2-тетрафторэтан, мяты перечной листьев масло, этанол, глицерол и др.

Предметом данного изобретения является способ получения лекарственного средства Антипровир по настоящему изобретению растворением лиофилизата по данному изобретению в воде для инъекций.

Изучение противовирусной эффективности Covid-014 лекарственного средства Антипровир по настоящему изобретению в культуре клеток Vero Е6 против вируса SARS-CoV-2. Антипровир исследовался в виде лиофилизата препаратов Апротекса, Гордокс и Аэрус в концентрации ~53 000 КИЕ/мл.(или ~10 000 КИЕ/лунку) в отношении вируса SARS-CoV-2 методом анализа вирусной продукции по цитопатическому действию в культуре клеток Vero Е6 с подтверждением ПЦР в реальном времени. Было установлено, что Антипровир по настоящему изобретению в концентрации ~53 000 КИЕ/мл (или ~10 000 КИЕ/лунку) оказал полное подавление цитопатического действия вируса в дозе 100 ТЦИД₅₀/лунку, и частичное подавление в дозе 1 000 ТЦИД₅₀/лунку.

Противо-SARS-CoV-2 вирусную эффективность действия Антипровира по настоящему изобретению проверяли с помощью методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В реальном времени определяли SARS-CoV-2 вирусу в исследуемых лунках. Из трех лунок разведения препарата для 0 ТЦИД₅₀, 100 ТЦИД₅₀ и 1000 ТЦИД₅₀ вируса, отбирали надосадочную жидкость. Отобранную жидкость использовали для выделения РНК параллельно с положительным и отрицательным контролем этапа выделения. Выделенную РНК использовали для проведения ПЦР в реальном времени. Наличие вирусной РНК оценивали по величине порогового цикла (Ct). Полученные с помощью ПЦР данные показали полное ингибирование SARS-CoV-2 вируса Антипровиром в концентрации ~53 000 КИЕ/мл при вирусной нагрузке 100 ТЦД₅₀.

Предметом данного изобретения является также способ профилактики и лечения SARS-CoV-2 (COVID-19) инфекций у пациентов заключается во введении пациенту лекарственного средства Антипровира по настоящему изобретению.

Лекарственные средства могут вводиться парентерально, в том числе внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или через спрей. Клиническая дозировка лекарственного средства по данному изобретению у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективности в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени (предпочтительно - от одного до шести раз).

Для профилактики SARS-CoV-2 (COVID-19) у лиц близко-контактировавших с инфицированными и медицинского персонала используют Антипровир по данному изобретению дважды в день по 300 КИЕ (ЕД) в виде ингаляций или в виде спрея в каждый носовой вход в течении 14 дней. Для экстренной профилактики Антипровир используют 4 раза в день по 300 КИЕ в виде ингаляций или в виде спрея в каждый носовой вход в течении 14 дней.

Для лечения легких форм коронавирусной инфекции COVID-19 используют Антипровир ингаляции 4 раза в день по 300 КИЕ в течении 7 дней: При среднетяжелых формах возможно увеличение дозировки Антипровира до 5,0 КИЕ/пациент/день - ингаляции каждые 2 часа по 600 КИЕ (до 5000 КИЕ) в течении 7 дней.

Для лечения тяжелых форм коронавирусной инфекции COVID-19 используется дозировка Антипровира 30000 КИЕ/пациент/день. Возможно увеличение до 50000 КИЕ/пациент/день. Эта дозировка будет поддерживать достаточную терапевтическую концентрацию препарата в легких и других важных органах для подавления репродукции вируса и снижения системного воспаления. Антипровир дозируют медленно струйно или капельно по 100000 КИЕ 2-3 раза в сутки в течение 5-7 дней или по 150000 КИЕ 3 раза в сутки в течение 5-7 дней.

Данное изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Лиофилизат для приготовления лекарственного средства Антипровир для внутривенной и спрей-терапии COVID-19. Растворяют 1,5 г апротинина, 85 г хлорида натрия и 100 г бензилового спирта в 1,0 л воды для инъекций. Полученный раствор разливают в соответствующие флаконы по 10 мл во флакон с помощью машины розлива Rota FLR 50. Заполненные флаконы стерилизуются при температуре 120°-122° под давлением 120 кПа в течение 8 минут, лиофилизируют в сублиматоре Zirbus под вакуумом менее 0,3 бар, закупориваются пробками, обжимаются алюминиевыми колпачками и раскладываются в упаковочные коробки по 10 шт. Получают лиофилизат для приготовления лекарственного средства Антипровир 100000 КИЕ в 10 мл.

Пример 2. Противо-SARS-CoV-2 вирусное средство Антипровир для внутривенной терапии COVID-19. Растворяют 1,5 г апротинина, 85 г хлорида натрия и 100 г бензилового спирта в 1,0 л воды для инъекций. Половину полученного раствора разливают в соответствующие ампулы из нейтрального стекла по 1 мл ампулу, а вторую половину - по 10 мл в ампулу с помощью машины розлива Roto FLR 50. Заполненные ампулы стерилизуются при температуре 120°-122° под давлением 120 кПа в течение 8 минут и запаиваются с помощью газовой горелки и раскладываются в упаковочные коробки по 10 шт. Получают наборы препаратов Антипровир 10000 КИЕ в 1 мл и Антипровир 100000 КИЕ в 10 мл для внутривенной терапии СОVID-19.

Пример 3. Противо-SARS-CoV-2 вирусное средство Антипровир для спрей-терапии COVID-19. Растворяют 1,5 г апротинина, 57 г хлорида натрия и 67 г бензилового спирта в 1,0 л воды для инъекций. Полученный раствор стерилизуют при температуре 120°-122° подавлением 120 кПа в течение 8 минут и разливают по 100 мл в соответствующие балончики для спрея (для носа и/или горла). Получают противо-SARS-CoV-2 вирусное средство Антипровир для спрей-терапии COVID-19.

Пример 4. Изучение противовирусной эффективности Covid-014 Антипровира в культуре клеток Vero Е6 против вируса SARS-CoV-2. Антипровир исследовался в виде лиофилизата Апротекса и Гордокса в концентрации ~53 000 КИЕ/мл в отношении вируса SARS-CoV-2 методом анализа вирусной продукции по цитопатическому действию в культуре клеток Vero Е6 с подтверждением ПЦР в реальном времени в Испытательном центре контроля качества иммунобиологических лекарственных средств ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

В 96-луночные культуральные плоскодонные планшеты помещали клетки Vero Е6 по 12000 кл./лунку в объеме 100,0 мкл свежеприготовленной полной культуральной среды (ПС). Клетки культивировали 24 ч при температуре 37°С в атмосфере 5% СО₂. Для приготовления двукратного раствора исследуемого препарата с концентрацией 106 400 Ед/мл содержимое 8 ми флаконов последовательно растворили в 1 мл среды реакционной среды (PC). Приготовленный раствор тестируемого препарата в концентрации 106400 КИЕ/мл выдерживают при температуре 2-8°С в течение 2 часов для контроля растворимости препарата. Из тест-планшетов удалили ПС, промыли клетки средой PC и перенесли по 100 мкл подготовленного разведения тестируемой субстанции. Каждую точку тестировали в 3х лунках. Также препарат вносили в лунки контроля без вируса для оценки потенциального цитотоксического действия и дальнейшего учета результатов исследования. В лунки контроля клеток вносят чистую PC. Для инфицирования клеток использовали суспензию вируса SARS-CoV-2, пассаж 4 с инфекционной активностью 10⁶ ТЦИД₅₀/1 мл для клеток Vero Е6. Готовили серию 10-кратных разведений вируса: 10^-1 и до 10^-6. Суспензию разводили путем последовательного переноса в пробирках с нужным количеством соответствующей PC: в пробирки вносят по 900 мкл PC и добавляют по 100 мкл вирусной суспензии. Для приготовления суспензии вируса с концентрацией 1000 ТЦИД₅₀/мл, из стоковой суспензии вируса с концентрацией 1×10⁶ ТЦИД₅₀/мл: отбирали 10 мкл суспензии и помещали в 10,0 мл PC. Для приготовления суспензии вируса с концентрацией 10000 ТЦИД₅₀/мл, из стоковой суспензии вируса с концентрацией 1×10⁶ ТЦИД₅₀/мл отбирали 100 мкл суспензии и помещали в 9,9 мл PC. Разведения вирусной суспензии добавляли к клеткам через 2 часа инкубации клеток с разведением тестируемого препарата и инкубировали совместно в течение 96 часов. В лунки 100 ТЦИД₅₀ и 1000 ТЦИД₅₀ вносили по 100 мкл вируса с концентрацией 1000 и 10000 ТЦИД₅₀/мл (100 и 1000 ТЦИД₅₀ на лунку, соответственно) в среде PC. В лунки «Контроль клеток» добавляют по 100 мкл PC. Планшеты с клетками инкубировали в атмосфере, 5% СО₂ при 37°С в течение 96 часов до полного проявления цитопатического действия вируса в вирусном контроле, в ожидаемом диапазоне. Противовирусную активность образцов оценивали визуально под микроскопом через 96 часов после инфицирования по ингибированию цитопатического действия (ЦПД) вируса в культуре клеток Vero Е6. Результатом исследования являлось заключение об ингибировании цитопатического действия вируса в культуре клеток Vero Е6 при воздействии препарата: полное ингибирование (отсутствие ЦПД в 3 лунках из 3), неполное ингибирование(наличие ЦПД в 1-2 лунках из 3), отсутствие ингибирования (наличие ЦПД в 3 лунках из 3). Результат: Препарат Антипровир в концентрации ~53 000 КИЕ/мл (или ~10 000 КИЕ/лунку) оказали полное подавление цитопатического действия вируса в дозе 100 ТЦИД₅₀/лунку, и частичное подавление в дозе 1000 ТЦИД₅₀/лунку.

Эффективность противо-SARS-CoV-2 вирусного действия препарата с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяли в реальном времени в исследуемых лунках. Из трех лунок разведения препарата для 0 ТЦИД₅₀, 100 ТЦИД₅₀ и 1000 ТЦИД₅₀ вируса, отбирали надосадочную жидкость. Отобранную жидкость использовали для выделения РНК параллельно с положительными отрицательным контролем этапа выделения. Выделенную РНК использовали для проведения ПЦР в реальном времени. Наличие вирусной РНК оценивали по величине порогового цикла (Ct). Результат: Полученные с помощью ПЦР данные показали полное ингибирование размножения вируса SARS-CoV-2 при концентрации Антипровира ~53 000 КИЕ/мл и подтвердили высокую противо-SARS-CoV-2 вирусную активность Антипровира.

1. Применение фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного компонента апротинин и вспомогательные вещества в качестве противовирусного средства для лечения и профилактики COVID-19.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что апротинин вводится ингаляционно или внутривенно.

3. Применение по п. 1, где вспомогательные вещества представляют собой воду, натрия хлорид, натрия гидроксид, бензиловый спирт, лактозу, 1.1.1.2-тетрафтороэтан, масло листьев перечной мяты, этанол, глицерол.

4. Применение по п. 1, отличающееся тем, что фармацевтическая композиция содержит апротинин в количестве 0,1-0,2 % вес.