((3β-ацетокси-урс-12-ен-28-оил-оксиацетокси)метил)-1h-1,2,3-триазол-1-ил) метил)-4-метил-1,2,5-оксадиазол-2-оксид, обладающий селективной противоопухолевой активностью в отношении клеток рака молочной железы mcf-7

Изобретение относится к соединению ((3β-ацетокси-урс-12-ен-28-оил-оксиацетокси)метил)-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)метил)-4-метил-1,2,5-оксадиазол-2-оксида. Технический результат - получено новое соединение формулы 1, обладающее селективной противоопухолевой активностью в отношении клеток рака молочной железы MCF-7, которое может найти свое применение в медицине. 1 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к новому химическому соединению, конкретно ((3β-ацетокси-урс-12-ен-28-оил-оксиацетокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)метил)-4-метил-1,2,5-оксадиазол 2-оксиду 1,

1

обладающему селективной противоопухолевой активностью в отношении клеток рака молочной железы MCF-7. Указанное свойство определяет возможность использования соединения в медицине в качестве фармацевтического препарата при терапии рака молочной железы. Изобретение выполнено в рамках финансирования РФФИ 18-53-76001.

Широкая распространенность онкологических заболеваний молочной железы, а также несовершенство известных средств химиотерапии, заключающееся либо в их недостаточной эффективности, либо в существовании негативных побочных эффектов при их применении, стали стимулом использования природных соединений для создания новых веществ, эффективных в отношении пролиферации опухолевых клеток и малотоксичных для здоровых человеческих клеток.

Доступное и малотоксичное природное соединение урсоловая кислота 2 (УК) привлекает большое внимание своей многофункциональной противораковой активностью [D. Kashyap, H. Singh, T. Anil, K.Sharma, Ursolic acid (UA): A metabolite with promising therapeutic potential, Life Sciences, Volume 146, 1 February 2016, 201-213; M.K. Shanmugam, X. Dai, A.P. Kumar, B.K. Tan, G. Sethi, A. Bishayee, Ursolic acid in cancer prevention and treatment: molecular targets, pharmacokinetics and clinical studies, Biochem. Pharmacol. 85 (2013) 1579-1587].

УК также используется в профилактике онкологических заболеваний в виде пищевых функциональных добавок [X. Ma, Y. Zhang, Z. Wang, Y. Shen, M. Zhang, Q. Nie, Y. Hou, G. Bai, Ursolic acid, a natural nutraceutical agent, targets caspase-3 and alleviates inflammation-associated downstream signal transduction, Mol Nutr Food Res, 61 (2017); Z. Ovesna, A. Vachalkova, K. Horvathova, D. Tothova, Pentacyclic triterpenoic acids: new chemoprotective compounds. Minireview, Neoplasma 51 (2004) 327-333].

Противоопухолевый эффект УК объясняется ее способностью индуцировать апоптоз раковых клеток, предотвращать онкогенез и ингибировать пролиферацию раковых клеток. УК вызывает аутофагию, остановку клеточного цикла и апоптоз в различных раковых клеточных линиях воздействием через ряд сигнальных путей [M.K. Shanmugam, X. Dai, A.P. Kumar, B.K. Tan, G. Sethi, A. Bishayee, Ursolic acid in cancer prevention and treatment: molecular targets, pharmacokinetics and clinical studies, Biochem. Pharmacol. 85 (2013) 1579-1587.], включая NF-kB [S. Shishodia, S. Majumdar, S. Banerjee, B.B. Aggarwal, Ursolic acid inhibits nuclear factor-kappaB activation induced by carcinogenic agents through suppression of I kappaB alpha kinase and p-65 phosphorylation: correlation with down-regulation of cyclooxygenase 2, matrix metalloproteinase 9, and cyclin D1, Cancer Res. 63 (2003) 4375-4383.], STAT3 [W. Wang, C. Zhao, D. Jou, J. Lu, C. Zhang, L. Lin, J. Lin, Ursolic acid inhibits the growth of colon cancer-initiating cells by targeting STAT3, Anticancer Res. 33 (2013) 4279-4284.] и TRAIL [S. Prasad, V.R. Yadav, R. Kannappan, B.B. Aggarwal, Ursolic acid, a pentacyclic triterpene, potentiates TRAIL-induced apoptosis through p53-independent up-regulation of death receptors: evidence for the role of reactive oxygen species and JNK, J. Biol. Chem. 286 (2011) 5546-5557.]. Недостатком урсоловой кислоты является ее относительно низкая активность в отношении ряда опухолевых клеток, в частности рака молочной железы.

Известно широкое применение в терапии опухолей полусинтетических препаратов, таких как доксорубицин 3.

Доксорубицин ((8S-цис)-10-(3-амино-2,3,6-тридезокси-альфа-L-ликсогексо-пиранозил)окси-7,8,9,10-тетра-гидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксилацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион является противоопухолевым антибиотиком антрациклинового ряда. Оказывает антимитотическое и антипролиферативное действие. Обладает способностью к блокированию матричной активности ДНК [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1993 с. 534-535]. Доксорубицин применяется в терапии ряда онкологических заболеваний, таких как лимфобластный лейкоз, саркома мягких тканей, остеогенная саркома, саркома Юинга, рак молочной железы, рак щитовидной железы, опухоль Вильмса, нейробластома, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак яичников и др. Доксорубицин обладает рядом побочных эффектов, основным недостатком его применения является низкая селективность в отношении опухолевых и здоровых клеток, что может приводить к токсическим эффектам при его терапевтическом использовании.

Задачей настоящего изобретения, является разработка новых противоопухолевых агентов, эффективных и селективных в отношении пролиферации опухолевых клеток молочной железы, на основе доступного растительного метаболита урсоловой кислоты.

Поставленная задача решается новым химическим соединением ((3β-ацетокси-урс-12-ен-28-оил-оксиацетокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)метил)-4-метил-1, 2,5-оксадиазол 2-оксидом 1, обладающим высокой активностью в отношении пролиферации клеток рака молочной железы и слаботоксичным для нераковых клеток человека.

В качестве исходного вещества использована урсоловая кислота 2, выделяемая из доступного сырья - отходов пищевой промышленности: шротов ягод, в частности черноплодной рябины [Л.П. Козлова, Е.В. Малыхин, С.М. Обут, С.А. Попов, О.П. Шеремет Способ получения урсоловой кислоты Заявка 2006138543/15, приоритет от 31.10.2006, Патент RU 2329048, Бюл. № 20, 20.07.2008].

Алкилированием урсоловой кислоты пропаргилбромидом в присутствии основания получают пропаргил урсолат 5 [U. V Mallavadhani, A. Mahapatra, B. Pattnaik, N. Vanga, N. Suri, A.K. Saxena, Synthesis and anti-cancer activity of some novel C-17 analogs of ursolic and oleanolic acids, Med. Chem. Res. 22 (2013) 1263-1269]. Обработкой известного соединения 3-(бромметил)-4-метил-1,2,5-оксадиазол 2-оксида [A. M. Gasco, D. Boschi, A. Gasco, Unsymmetrically Substituted Furoxan. Part 15. Bromination of dimethylfuroxan and related compounds with NBS, J. Heterocycl. Chem. 32 (1995) 811-813] получают 3-(азидометил)-4-метил-1,2,5-оксадиазол 2-оксид 4. Реакция 1,3-циклоприсоединения азида 4 к пропаргил урсолату 5 приводит к к фуроксановому производному 6, содержащему 1,2,3-триазольный линкер. Целевой продукт 1 получают в результате реакции ацилирования 6 действием уксусного ангидрида в присутствии органического основания.

Предложенный метод получения 1 является простым и эффективным. Выход соединения 1 в соответствии со схемой 1 в расчете на урсоловую кислоту 2 составляет 54%. Физико-химические данные новых, впервые полученных соединений 1, 4, 5, 6 приведены в примерах 1, 2, 3.

Сравнительную противоопухолевую активность изучали с использованием MTT теста [T. Mosmann, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, 65 (1983), 55-63.] (пример 5).

Результаты испытаний противоопухолевой активности представлены в таблице 1.

Таблица 1. Антипролиферативная активность соединений (GI_50, μM) в отношении исследуемых клеточных линий^[a]

Таблица 1

Соединение	hTERT	MCF-7	U-87 MG	A549	HepG2
Доксорубицин	3.33±0.67	4.51±1.12	2.05±0.22	6.17±1.17	10.02±1.67
Урсоловая кислота 2	90.89±5.5	25.05±3.17	43.82±3.88	41.02±3.77	37.28±5.02
6	25.85±3.04	22.9±10.02	29.71±6.52	>100	12.89±2.63
1	10.41±1.25	1.55±0.08	>100	>100	>100

[a] GI₅₀: концентрация вещества, при которой наблюдалось 50% ингибирование роста опухолевых клеток после 72 ч инкубирования; экспериментальные результаты получены как cреднее значение трех независимых экспериментов. Культуры клеток рака молочной железы MCF-7 (ATCC HTB-22), мультиформные клетки глиобластомы MG U-87 (ATCC HTB-14), легочной карциномы A549 (ATCC CRM-CCL-18) гепатокарциномы HepG2 (ATCC HB-8065), иммортализованные человеческие фибробласты hTERT (ИЦИГ СОРАН, ATCC CRL-4058).

Значения индекса селективности S определяли по формуле:

S = GI_{50 hTERT}/ GI₅₀

Где GI_{50 hTERT}, GI₅₀ - антипролиферативная активность соединений в отношении нераковых клеток и опухолевых клеток, соответственно.

Из данных таблицы 1 следует, что гибридное производное 1 проявило значительную эффективность и селективность. Активность 1 в отношении раковых клеток MCF-7 значительно превышала активность исходного соединения урсоловой кислоты 2 и активность доксорубицина. В отношении клеток MCF-7 соединение 1 обладает селективным действием по сравнению с урсоловой кислотой и доксорубицином.

Индекс селективности 1 для MCF-7 (6.7) существенно превышает значения, полученные для урсоловой кислоты (3.7) и доксорубицина (0.7).

Спектральные исследования выполнены в Химическом Сервисном Центре коллективного пользования СО РАН.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Получение 3-(азидометил)-4-метил-1,2,5-оксадиазол 2-оксида 4. 3- (бромметил) -4-метил-1,2,5-оксадиазол 2-оксид 3 (1 ммоль) и азид натрия (3 ммоль) в ДМФ (10 мл) перемешивали при 50-55° С в течение 5-7 часов (контроль ТСХ). Реакционную смесь выливали в ледяную воду, экстрагировали МТБЭ (3 × 30 мл). Органический слой промывали нас. раствором NaCl (30 мл), сушили (Na₂SO₄) и концентрировали в вакууме. После хроматографии на короткой колонке с силикагелем (CH₂Cl₂-MTБЭ) получали азид 4 (98%) в виде желтого масла.

ИК (см^-1): 500, 554, 594, 658, 704, 773, 849, 883, 941, 993, 1039, 1093, 1122, 1221, 1271, 1315, 1352, 1387, 1427, 1477, 1520, 1606, 1674, 2116, 2935. ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃, δ, ppm, J/Гц): 2.35 (3Н, с, Ме-1), 4.31 (2Н, с, 2Н-4), ЯМР ¹³C (125 МГц, CDCl₃, δ, ppm, J/Гц): 10.8 (C-1), 42.3 (C-4), 112.3 (C-2), 153.9 (C-3). Найдено, m/z: 155.0448 [M]+ . C₄H₅N₅O₂ Вычислено: m/z: 155.0443.

Пример 2. Синтез пропаргилурсолата 5.

Суспензию урсоловой кислоты 2 (10 ммоль), K₂CO₃ (100 ммоль), KI (0.1 ммоль) в ацетоне (50 мл) и пропаргилбромид (12 ммоль) перемешивали в течение 20-24 часов при комнатной температуре (контроль ТСХ). Растворитель удаляли в вакууме, остаток суспендировали в воде. Осадок отделяли на фильтре, промывали водной HCl (3%, 30 мл), водой (2 × 50 мл) и сушили на воздухе, получали эфир 5 (84%). Спектры ЯМР ¹Н, ¹³С соединения 5 были идентичны опубликованным [U. V Mallavadhani, A. Mahapatra, B. Pattnaik, N. Vanga, N. Suri, A.K. Saxena, Synthesis and anti-cancer activity of some novel C-17 analogs of ursolic and oleanolic acids, Med. Chem. Res. 22 (2013) 1263-1269].

Пример 3. Синтез ((3β-гидрокси-урс-12-ен-28-оил-оксиацетокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил) метил)-4-метил-1,2,5-оксадиазол 2-оксида

Смесь пропаргил урсолата 5 (1 ммоль), 3-(азидометил)-4-метил-1,2,5-оксадиазол 2-оксида 4 (1 ммоль), CuSO₄×5H₂O (0.2 ммоль) в ДМФА (15 мл) смешивали при комнатной температуре в течение 30 минут с последующим добавлением аскорбата натрия (0.2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 13-15 часов (контроль ТСХ). Смесь выливали в воду (100 мл), экстрагировали CH₂Cl₂ (2×50 мл), органический экстракт концентрировали в вакууме. Продукт очищали с помощью колоночной хроматографии (SiO₂, CH₂Cl₂-MTBE) получали целевой продукт (72%) в виде белого порошка.

ИК (KBr, см^-1): 602, 652, 660, 700, 733, 756, 791, 829, 849, 906, 916, 953, 987, 1028, 1043, 1078, 1113, 1138, 1167, 1178, 1194, 1248, 1308, 1371, 1390, 1456, 1520, 1610, 1659, 1732, 1765, 2874, 2929, 2949, 2968, 3145, 3435. ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.69 (3H, с, Me-26), 0.82 (3H, с, Me-25), 0.84 (6H, с, Me-29, Me-24), 0.91 (3H, с, Me-30), 0.93 (3H, с, Me-23), 1.05 (3H, с, Me-27), 2.01 (4H, с, Me-2”), 2.20 (1H, д, J=11.2 Гц, H-18), 2.42 (3H, с, Me-9’), 4.43-4.57 (3H, m, H-3 + 2H-1’), 5.19-5.22 (1H, ддд, J₁=J₂ = 3.4 Гц, H-12), 5.24 (2H, с), 5.37 (2H, с, 2H-4’), 7.77 (1H, с, H-6’). ЯМР ¹³C (125 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 10.9 (C-7', к), 15.4 (C-25, к), 16.7 (C-24, к), 16.7 (C-26, к), 16.9 (C-29, к), 18.1 (C-6, т), 21.1 (C-30, к), 21.2 (C-2", к), 23.2 (C-11, т), 23.4 (C-27, к), 23.5 (C-16, т), 24.1 (C-2, т), 27.9 (C-15, т), 28 (C-23, к), 30.5 (C-21, т), 32.8 (C-7, т), 36.5 (C-22, т), 36.8 (C-10, с), 37.6 (C-1, т), 38.2 (C-4, с), 38.7 (C-20, д), 39 (C-19, д), 39.4 (C-8, с), 41.2 (C-4', т), 42 (C-14, с), 47.3 (C-9, д), 48.1 (C-17, с), 52.7 (C-18, д), 55.2 (C-5, д), 57.1 (C-1', т), 80.8 (C-3, д), 111.8 (C-6', с), 124.5 (C-3', д), 125.5 (C-12, д), 137.9 (C-13, с), 144.2 (C-2', с), 153.9 (C-5', с), 170.9 (C-1'', с), 177.3 (C-28, с).

Найдено, m/z: 649.4186 [M]+ C₃₇H₅₅O₅N₅ Вычислено, m/z: 649.4198

Пример 4. Синтез ((3β-ацетокси-урс-12-ен-28-оил-оксиацетокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил) метил)-4-метил-1,2,5-оксадиазол 2-оксида 1.

К перемешиваемой смеси эфира 6 (1 ммоль), Et₃N (2 г, 20 ммоль) в CH₂Cl₂ (20 мл) при комнатной температуре добавляли уксусный ангидрид (1.0 г, 10 ммоль). Смесь перемешивали в течение 12-14 ч (контроль ТСХ), после чего добавляли MeOH (1.0 г, 30 ммоль). Полученную смесь промывали HCl_водн. (3%, 2×20 мл), NaHCO_{3 водн} (5%, 20 мл), сушили (Na₂SO₄) и концентрировали в вакууме. Остаток хроматографировали (SiO₂, CH₂Cl₂, MTБЭ), получали целевой продукт 1 (90%) в виде белого порошка.

ИК (KBr, см^-1): 602, 652, 660, 700, 733, 756, 791, 829, 849, 906, 916, 953, 987, 1028, 1043, 1078, 1113, 1138, 1167, 1178, 1194, 1248, 1308, 1371, 1390, 1456, 1520, 1610, 1659, 1732, 1765, 2874, 2929, 2949, 2968, 3145, 3435. ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.69 (3H, с, Me-26), 0.82 (3H, с, Me-25), 0.84 (6H, с, Me-29, Me-24), 0.91 (3H, с, Me-30), 0.93 (3H, с, Me-23), 1.05 (3H, с, Me-27), 2.01 (4H, с, Me-2”), 2.20 (1H, д, J=11.2 Гц, H-18), 2.42 (3H, с, Me-9’), 4.43-4.57 (3H, m, H-3 + 2H-1’), 5.19-5.22 (1H, ддд, J₁=J₂ = 3.4 Гц, H-12), 5.24 (2H, с), 5.37 (2H, с, 2H-4’), 7.77 (1H, с, H-6’). ЯМР ¹³C (125 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 10.9 (C-7', к), 15.4 (C-25, к), 16.7 (C-24, к), 16.7 (C-26, к), 16.9 (C-29, к), 18.1 (C-6, т), 21.1 (C-30, к), 21.2 (C-2", к), 23.2 (C-11, т), 23.4 (C-27, к), 23.5 (C-16, т), 24.1 (C-2, т), 27.9 (C-15, т), 28 (C-23, к), 30.5 (C-21, т), 32.8 (C-7, т), 36.5 (C-22, т), 36.8 (C-10, с), 37.6 (C-1, т), 38.2 (C-4, с), 38.7 (C-20, д), 39 (C-19, д), 39.4 (C-8, с), 41.2 (C-4', т), 42 (C-14, с), 47.3 (C-9, д), 48.1 (C-17, с), 52.7 (C-18, д), 55.2 (C-5, д), 57.1 (C-1', т), 80.8 (C-3, д), 111.8 (C-6', с), 124.5 (C-3', д), 125.5 (C-12, д), 137.9 (C-13, с), 144.2 (C-2', с), 153.9 (C-5', с), 170.9 (C-1'', с), 177.3 (C-28, с). Найдено, m/z: 691.4311 [M]+ C₃₉H₅₇O₆N₅ Вычислено, m/z: 691.4302

Пример 5 Сравнительное изучение противоопухолевой (антипролиферативной) активности.

Культуры клеток рака молочной железы MCF-7 (ATCC HTB-22), мультиформные клетки глиобластомы MG U-87 (ATCC HTB-14), легочной карциномы A549 (ATCC CRM-CCL-18) гепатокарциномы HepG2 (ATCC HB-8065) были получены из ATCC, США. Иммортализованные человеческие фибробласты hTERT (ИЦИГ СОРАН, ATCC CRL-4058) использованы в качестве неракового клеточного контроля. Антипролиферативную активность тестируемых соединений оценивали с использованием анализа МТТ и стандартной процедуры [T. Mosmann, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, 65 (1983), 55-63]. Клетки инокулировали в 96-луночные планшеты (5000 клеток на лунку) и инкубировали при 37° C в атмосфере 5% CO₂. Среду в лунках заменяли через 24 часа свежей средой, содержащей испытуемые соединения в ДМСО (1 об.%), после чего продолжали инкубирование в течение 72 часов. Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически. Все соединения были испытаны в концентрациях 10, 25, 50 и 100 мкМ с использованием необходимых контролей, то есть отрицательного, ДМСО (растворитель) и положительного доксорубицина (стандартный цитостатик). Каждый эксперимент проводился в трех независимых сериях по три теста в каждой серии. Результаты представлены в таблице 1 в виде средней ингибирующей концентрации IC₅₀ ± SEM.

((3β-ацетокси-урс-12-ен-28-оил-оксиацетокси)метил)-1Н-1,2,3-триазол-1-ил) метил)-4-метил-1, 2,5-оксадиазол 2-оксид, обладающий селективной противоопухолевой активностью в отношении клеток рака молочной железы mcf-7.

Синтез ((3β-ацетокси-урс-12-ен-28-оил-оксиацетокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил) метил)-4-метил-1, 2,5-оксадиазол 2-оксида 1.

Схема 1.

((3β-ацетокси-урс-12-ен-28-оил-оксиацетокси)метил)-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)метил)-4-метил-1,2,5-оксадиазол-2-оксид формулы 1

,

1

обладающий селективной противоопухолевой активностью в отношении клеток рака молочной железы MCF-7.