Лечение рака с помощью химерного антигенного рецептора к cd33

Авторы патента:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR) для связывания с CD33, связывающему CD33 домену, а также к полипептиду химерного антигенного рецептора (CAR) для связывания с CD33. Также раскрыт вектор, иммунная эффекторная клетка и популяция иммунных эффекторных клеток, содержащие вышеуказанную молекулу, а также способ получения вышеуказанной клетки и популяции. Изобретение также относится к способу обеспечения иммунитета против CD33-экспрессирующей опухоли у млекопитающего, к способу кондиционирования субъекта, имеющего CD33-экспрессирующую клетку перед клеточной трансплантацией, предусматривающим использование вышеуказанных веществ. Изобретение позволяет эффективно осуществлять лечение млекопитающего, имеющего заболевание, ассоциированное с экспрессией CD33. 12 н. и 47 з.п. ф-лы, 58 ил., 13 табл., 10 пр.

По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки PCT № PCT/CN2014/082589, поданной 21 июля 21 2014 года, и заявки PCT № PCT/CN2014/090504, поданной 6 ноября 2014 года. Полное содержание этих заявок включено в настоящее описание посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Рассматриваемая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей полноте. Упомянутая копия в формате ASCII, созданная 15 июля 2015 года, называется N2067-7047WO3_SL.txt и имеет размер 323686 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится в целом к использованию иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), сконструированных для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), для лечения заболевания, ассоциированного с экспрессией белка кластер дифференцировки 33 (CD33).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Большинство пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) неизлечимы с помощью стандартной терапии (Mrozek et al, 2012, J Clin Oncol, 30:4515-23), и пациенты с рецидивирующим или рефрактерным (RR-) имеют особенно плохой прогноз (Kern et al, 2003, Blood 2003, 101:64-70; Wheatley et al, 1999, Br J Haematol, 107:69-79).

Генная инженерия может придавать T-клеткам специфичность к выбранной мишени. T-клетки могут быть трансдуцированы генетическим материалом, кодирующим одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) антитела, в сочетании с сигнальной молекулой, благодаря чему определяющая комплементарность область (CDR) используется для распознавания антигена клеточной поверхности не ограниченным ГКГС образом. Эти клетки называются T-клетками с химерным антигенным рецептором (CAR). Предклинические и клинические попытки нацеливания на по меньшей мере 20 различных поверхностных молекул во множестве злокачественных опухолей продемонстрировали некоторую активность, но эти попытки часто были ограничены плохой жизнестойкостью вводимого продукта в виде T-клеток с CAR (Sadelain et al, 2009, Curr Opin Immunol 2009, 21:215-23). Недавний успех в отношении перенаправленных анти-CD19 T-клеток у пациентов с хроническим лимфоидным лейкозом (ХЛЛ) в поздней стадии и острым лимфоидным лейкозом (ОЛЛ) (Porter et al, 2011, N Engl J Med, 365:725-33; Kalos et al, 2011, Science Transl Med, 3:95ra73; Grupp and Kalos, 2013, N Engl J Med, 368:1509-18) продемонстрировал, что эти клетки могут уничтожать массивную опухолевую нагрузку после одного введения с ремиссией продолжительностью вплоть до 3 лет на данный момент, что подчеркивает исключительный потенциал терапии T-клетками с CAR. Было несколько предклинических попыток нацеливания на ОМЛ в моделях на животных (Marin et al, 2010, Haematologica, 95:2144-52; Tettamanti et al, 2013, Br J Haematol, 161:389-401). Недавно опубликованное небольшое клиническое исследование продемонстрировало, что можно получать T-клетки и вводить их пациентам с агрессивной злокачественной опухолью (Ritchie et al, 2013, Mol Ther, 2013 Nov;21(11):2122-9). Помимо способности химерного антигенного рецептора на генетически модифицированных T-клетках распознавать и разрушать клетки-мишени, успешная терапия терапевтическими T-клетками должна обладать способностью пролиферировать и сохраняться в течение времени и в дальнейшем отслеживать уклонившиеся лейкозные клетки. Переменное качество T-клеток, является ли оно результатом анергии, супрессии или истощения, может оказывать воздействие на активность трансформированных CAR T-клеток. Специалисты в настоящее время имеют ограниченные возможности по контролю за изменчивостью качества T-клеток. Для того чтобы быть эффективными, трансформированные CAR T-клетки пациента должны поддерживать и сохранять способность к пролиферации в ответ на антиген для CAR. Было продемонстрировано, что T-клетки пациента с ОЛЛ могут осуществлять это с помощью CART19, содержащей мышиный scFv (смотри, например, Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение предлагает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR), причем CAR содержит антитело или фрагмент антитела, который включает в себя CD33-связывающий домен (например, человеческий или гуманизированный связывающий CD33 домен), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен). В одном варианте осуществления CAR содержит антитело или фрагмент антитела, который включает в себя CD33-связывающий домен, описанный в настоящем документе (например, человеческий или гуманизированный связывающий CD33 домен, описанный в настоящем документе), трансмембранный домен, описанный в настоящем документе, и внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем документе (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен).

В одном варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен содержит одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющей комплементарность области 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющей комплементарность области 3 легкой цепи (LC CDR3) CD33-связывающего домена, описанного в настоящем документе, и/или одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (HC CDR3) CD33-связывающего домена, описанного в настоящем документе, например, CD33-связывающего домена, содержащего одну или несколько, например, все три, LC CDR и одну или несколько, например, все три, HC CDR. В одном варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен (например, человеческий или гуманизированный связывающий CD33 домен) содержит вариабельную область легкой цепи, описанную в настоящем документе (например, в таблице 8 или 9), и/или вариабельную область тяжелой цепи, описанную в настоящем документе (например, в таблице 8 или 9). В одном варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен представляет собой scFv, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности из таблицы 8 или 9. В варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен (например, scFv) содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, приведенной в таблице 8 или 9, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности из таблицы 8 или 9; и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в таблице 8 или 9, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности из таблицы 8 или 9.

В других вариантах осуществления кодируемый CD33-связывающий домен содержит HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 в соответствии с любой аминокислотной последовательностью связывающего домена тяжелой цепи для CD33, приведенной в таблице 8 или 9. В вариантах осуществления CD33-связывающий домен дополнительно содержит LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3. В вариантах осуществления CD33-связывающий домен содержит LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 в соответствии с любой аминокислотной последовательностью связывающего домена легкой цепи для CD33, приведенной в таблице 8 или 9.

В некоторых вариантах осуществления кодируемый CD33-связывающий домен содержит одну, две или все из LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 в соответствии с любой аминокислотной последовательностью связывающего домена легкой цепи для CD33, приведенной в таблице 8 или 9, и одну, две или все из HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 в соответствии с любой аминокислотной последовательностью связывающего домена тяжелой цепи для CD33, приведенной в таблице 8 или 9.

В одном варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39-47, 57-65, 66-74 или 262-268. В варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен (например, scFv) содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 39-47, 57-65, 66-74 или 262-268, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 39-47, 57-65, 66-74 или 262-268. В другом варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-65, или последовательность, идентичную ей на 95-99%. В другом варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 66-74, или последовательность, идентичную ей на 95-99%. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 255-261, или последовательность, идентичную ей на 95-99%.

В одном варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен включает в себя линкер (Gly4-Ser)n, причем n представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В одном варианте осуществления кодируемый CAR включает в себя трансмембранный домен, который содержит трансмембранный домен белка, например, белка, описанного в настоящем документе, например, выбранного из группы, состоящей из альфа-, бета- или дзета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В одном варианте осуществления кодируемый трансмембранный домен содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 6. В одном варианте осуществления кодируемый трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 6, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 6. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая трансмембранный домен, содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 17 или последовательность, идентичную ей на 95-99%.

В одном варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен соединен с трансмембранным доменом шарнирной областью, например, шарнирной областью, описанной в настоящем документе. В одном варианте осуществления кодируемая шарнирная область содержит SEQ ID NO: 2 или последовательность, идентичную ей на 95-99%. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая шарнирную область, содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 13 или последовательность, идентичную ей на 95-99%.

В одном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность, кодирующую костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем документе. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит костимулирующий домен. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит первичный сигнальный домен. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит костимулирующий домен и первичный сигнальный домен.

В одном варианте осуществления кодируемый костимулирующий домен представляет собой функциональный сигнальный домен, полученный из белка, например, описанного в настоящем документе, например, выбранного из группы, состоящей из молекулы ГКГС класса I, белков-рецепторов ФНО, иммуноглобулин-подобных белков, цитокиновых рецепторов, интегринов, сигнальных лимфоцит-активирующих молекул (SLAM-белков), активирующих рецепторов NK-клеток, BTLA, рецептора толл-лиганда, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганда, который специфически связывается с CD83. В вариантах осуществления кодируемый костимулирующий домен содержит 4-1BB, CD27, CD28 или ICOS.

В одном варианте осуществления кодируемый костимулирующий домен из 4-1BB содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления кодируемый костимулирующий домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 7, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая костимулирующий домен, содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 18 или последовательность, идентичную ей на 95-99%. В другом варианте осуществления кодируемый костимулирующий домен из CD28 содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 379. В одном варианте осуществления кодируемый костимулирующий домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 379, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 379. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая костимулирующий домен из CD28 содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 380 или последовательность, идентичную ей на 95-99%. В другом варианте осуществления кодируемый костимулирующий домен из CD27 содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 8. В одном варианте осуществления кодируемый костимулирующий домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 8, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 8. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая костимулирующий домен из CD27, содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 19 или последовательность, идентичную ей на 95-99%. В другом варианте осуществления кодируемый костимулирующий домен из ICOS содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 381. В одном варианте осуществления кодируемый костимулирующий домен из ICOS содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 381, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 381. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая костимулирующий домен из ICOS, содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 382 или последовательность, идентичную ей на 95-99%.

В вариантах осуществления кодируемый первичный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен из CD3-дзета. В вариантах осуществления функциональный сигнальный домен из CD3-дзета содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 (мутантная CD3-дзета) или SEQ ID NO: 10 (человеческая CD3-дзета дикого типа) или последовательность, идентичную ей на 95-99%.

В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен из 4-1BB и/или функциональный сигнальный домен из CD3-дзета. В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотную последовательность CD3-дзета в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 7 и последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, причем последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной рамке и в виде одной полипептидной цепи. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB, содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 18 или последовательность, идентичную ей на 95-99%, и/или нуклеотидную последовательность CD3-дзета в соответствии с SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21 или последовательность, идентичную ей на 95-99%.

В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен из CD27 и/или функциональный сигнальный домен из CD3-дзета. В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен из CD27 содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотную последовательность CD3-дзета в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 8 и последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, причем последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной рамке и в виде одной полипептидной цепи. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен из CD27, содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 19 или последовательность, идентичную ей на 95-99%, и/или нуклеотидную последовательность CD3-дзета в соответствии с SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21 или последовательность, идентичную ей на 95-99%.

В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен из CD28 и/или функциональный сигнальный домен из CD3-дзета. В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен из CD28 содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 379 и/или аминокислотную последовательность CD3-дзета в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 379 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 379 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 379 и последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, причем последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной рамке и в виде одной полипептидной цепи. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен из CD28, содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 380 или последовательность, идентичную ей на 95-99%, и/или нуклеотидную последовательность CD3-дзета в соответствии с SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21 или последовательность, идентичную ей на 95-99%.

В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен из ICOS и/или функциональный сигнальный домен из CD3-дзета. В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен из ICOS содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 381 и/или аминокислотную последовательность CD3-дзета в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 381 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 381 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 381 и последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, причем последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной рамке и в виде одной полипептидной цепи. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен из ICOS, содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 382 или последовательность, идентичную ей на 95-99%, и/или нуклеотидную последовательность CD3-дзета в соответствии с SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21 или последовательность, идентичную ей на 95-99%.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей конструкт CAR, содержащий лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, описанную в настоящем документе, например, аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1; CD33-связывающий домен, описанный в настоящем документе, например, CD33-связывающий домен, содержащий LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3, описанный в настоящем документе (например, человеческий или гуманизированный связывающий CD33 домен, описанный в таблице 8 или 9), или последовательность, идентичную ему на 95-99%; шарнирную область, описанную в настоящем документе, например, аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2; трансмембранный домен, описанный в настоящем документе, например, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 6; и внутриклеточный сигнальный домен, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем документе. В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем документе (например, костимулирующий домен из 4-1BB, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 7, или костимулирующий домен из CD27, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 8), и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, описанный в настоящем документе (например, стимулирующий домен из CD3-дзета, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конструкт CAR, включает в себя лидерную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 1 или последовательностью, идентичной ей на 95-99%.

В одном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит (например, состоит из нее) нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность CAR в соответствии с SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 или SEQ ID NO: 56; или аминокислоту, имеющую одну, две или три модификации (например, замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 или SEQ ID NO: 56; или аминокислотную последовательность, идентичную на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 или SEQ ID NO: 56.

В одном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит (например, состоит из нее) последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82 или SEQ ID NO: 83 или последовательность нуклеиновой кислоты, идентичную на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82 или SEQ ID NO: 83.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CD33-связывающий домен, причем CD33-связывающий домен содержит одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющей комплементарность области 2 легкой цепи (LC CDR2) и/или определяющей комплементарность области 3 легкой цепи (LC CDR3) CD33-связывающего домена, описанного в настоящем документе, и одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (HC CDR3) CD33-связывающего домена, описанного в настоящем документе, например, человеческого или гуманизированного связывающего CD33 домена, содержащего одну или несколько, например, все три, LC CDR и одну или несколько, например, все три, HC CDR.

В одном варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи, описанную в настоящем документе (например, в SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74), и/или вариабельную область тяжелой цепи, описанную в настоящем документе (например, в SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 или 65). В одном варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен представляет собой scFv, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 или 47. В варианте осуществления CD33-связывающий домен (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74; и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 или 65, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 или 65. В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47, или последовательность, идентичную ей на 95-99%. В одном варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, например, в таблице 8, прикреплена к вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, например, в таблице 8, с помощью линкера, например, линкера, описанного в настоящем документе. В одном варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен включает в себя линкер (Gly4-Ser)n, причем n представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле CD33-связывающего домена (например, полипептиду, антителу или его фрагменту), кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления выделенный CD33-связывающий домен содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56, или последовательность, идентичную ей на 95-99%.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле химерного антигенного рецептора (CAR) (например, полипептиду), содержащей CD33-связывающий домен (например, человеческое или гуманизированное антитело или фрагмент антитела, которые специфически связываются с CD33), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен). В одном варианте осуществления CAR содержит антитело или фрагмент антитела, которые включают в себя CD33-связывающий домен, описанный в настоящем документе (например, человеческое или гуманизированное антитело или фрагмент антитела, которые специфически связываются с CD33, как описано в настоящем документе), трансмембранный домен, описанный в настоящем документе, и внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем документе (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен, описанный в настоящем документе).

В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен содержит одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющей комплементарность области 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющей комплементарность области 3 легкой цепи (LC CDR3) CD33-связывающего домена, описанного в настоящем документе, и одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и/или определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (HC CDR3) CD33-связывающего домена, описанного в настоящем документе, например, CD33-связывающего домена, содержащего одну или несколько, например, все три, LC CDR и одну или несколько, например, все три, HC CDR. В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи, описанную в настоящем документе (например, в таблице 8), и/или вариабельную область тяжелой цепи, описанную в настоящем документе (например, в таблице 8 или 9). В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен представляет собой scFv, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности, приведенной в таблице 8 или 9. В варианте осуществления CD33-связывающий домен (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, приведенной в таблице 8 или 9, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности, приведенной в таблице 8 или 9; и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в таблице 8 или 9, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности, приведенной в таблице 8 или 9.

В других вариантах осуществления CD33-связывающий домен содержит HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 в соответствии с любой аминокислотной последовательностью связывающего домена тяжелой цепи для CD33, приведенной в таблице 8 или 9. В вариантах осуществления CD33-связывающий домен дополнительно содержит LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3. В вариантах осуществления CD33-связывающий домен содержит LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 в соответствии с любой аминокислотной последовательностью связывающего домена легкой цепи для CD33, приведенной в таблице 8 или 9.

В некоторых вариантах осуществления CD33-связывающий домен содержит одну, две или все из LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 в соответствии с любой аминокислотной последовательностью связывающего домена легкой цепи для CD33, приведенной в таблице 8 или 9, и одну, две или все из HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 в соответствии с любой аминокислотной последовательностью связывающего домена тяжелой цепи для CD33, приведенной в таблице 8 или 9.

В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57-74 или SEQ ID NO: 262-268; или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) в любой из вышеупомянутых последовательностей; или последовательность, идентичную на 95-99% любой из вышеупомянутых последовательностей. В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, например, в таблице 8 или 9, прикреплена к вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, например, в таблице 8 или 9, с помощью линкера, например, линкера, описанного в настоящем документе. В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен включает в себя линкер (Gly4-Ser)n, причем n представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В одном варианте осуществления выделенная молекула CAR содержит трансмембранный домен белка, например, белка, описанного в настоящем документе, например, выбранного из группы, состоящей из альфа-, бета- или дзета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В одном варианте осуществления трансмембранный домен содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 6. В одном варианте осуществления трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 20, 10 или 5 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 6, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 6.

В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен соединен с трансмембранным доменом шарнирной областью, например, шарнирной областью, описанной в настоящем документе. В одном варианте осуществления кодируемая шарнирная область содержит SEQ ID NO: 2 или последовательность, идентичную ей на 95-99%.

В одном варианте осуществления выделенная молекула CAR дополнительно содержит последовательность, кодирующую костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем документе.

В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен выделенной молекулы CAR содержит костимулирующий домен. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен выделенной молекулы CAR содержит первичный сигнальный домен. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен выделенной молекулы CAR содержит костимулирующий домен и первичный сигнальный домен.

В одном варианте осуществления костимулирующий домен содержит функциональный сигнальный домен белка, выбранного из группы, состоящей из молекулы ГКГС класса I, белков-рецепторов ФНО, иммуноглобулин-подобных белков, цитокиновых рецепторов, интегринов, сигнальных лимфоцит-активирующих молекул (SLAM-белков), активирующих рецепторов NK-клеток, BTLA, рецептора толл-лиганда, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганда, который специфически связывается с CD83.

В одном варианте осуществления костимулирующий домен из 4-1BB содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления костимулирующий домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 20, 10 или 5 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 7, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления костимулирующий домен из CD28 содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 379. В одном варианте осуществления костимулирующий домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 379, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 379. В другом варианте осуществления костимулирующий домен из CD27 содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 8. В одном варианте осуществления костимулирующий домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 8, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 8. В другом варианте осуществления костимулирующий домен из ICOS содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 381. В одном варианте осуществления костимулирующий домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 381, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 381.

В вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен из CD3-дзета. В вариантах осуществления функциональный сигнальный домен из CD3-дзета содержит SEQ ID NO: 9 (мутантная CD3-дзета), или SEQ ID NO: 10 (человеческая CD3-дзета дикого типа), или последовательность, идентичную им на 95-99%.

В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен из 4-1BB и/или функциональный сигнальный домен из CD3-дзета. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 20, 10 или 5 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 7 и/или последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 7 и/или последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 7 и/или последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, причем последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной рамке и в виде одной полипептидной цепи.

В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен из CD27 и/или функциональный сигнальный домен из CD3-дзета. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен из CD27 содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотную последовательность CD3-дзета в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 8 и последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, причем последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной рамке и в виде одной полипептидной цепи.

В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен из CD28 и/или функциональный сигнальный домен из CD3-дзета. В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен из CD28 содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 379 и/или аминокислотную последовательность CD3-дзета в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 379 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 379 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 379 и последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, причем последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной рамке и в виде одной полипептидной цепи.

В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен из ICOS и/или функциональный сигнальный домен из CD3-дзета. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен из ICOS содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 381 и/или аминокислотную последовательность CD3-дзета в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более чем 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 381 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 381 и/или аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 381 и последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, причем последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной рамке и в виде одной полипептидной цепи.

В одном варианте осуществления выделенная молекула CAR дополнительно содержит лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, описанную в настоящем документе. В одном варианте осуществления лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1 или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле CAR, содержащей лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, описанную в настоящем документе, например, лидерную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1 или идентичную ей на 95-99%, CD33-связывающий домен, описанный в настоящем документе, например, CD33-связывающий домен, содержащий LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3, описанный в настоящем документе, например, CD33-связывающий домен, описанный в таблице 8, или последовательность, идентичную ему на 95-99%, шарнирную область, например, шарнирную область, описанную в настоящем документе, например, шарнирную область в соответствии с SEQ ID NO: 2 или идентичную ей на 95-99%, трансмембранный домен, например, трансмембранный домен, описанный в настоящем документе, например, трансмембранный домен, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 6 или последовательность, идентичную ей на 95-99%, внутриклеточный сигнальный домен, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем документе (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен). В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем документе, например, костимулирующий домен из 4-1BB, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 7 или идентичную ей на 95-99%, и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, описанный в настоящем документе, например, стимулирующий домен из CD3-дзета, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 или идентичную ей на 95-99%. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем документе, например, костимулирующий домен из 4-1BB, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 7, и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, описанный в настоящем документе, например, стимулирующий домен из CD3-дзета, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.

В одном варианте осуществления выделенная молекула CAR содержит (например, состоит из нее) аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 или SEQ ID NO: 56, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, 10, 15, 20 или 30 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), но не более чем 60, 50 или 40 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 или SEQ ID NO: 56, или аминокислотную последовательность, идентичную на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 или SEQ ID NO: 56.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к CD33-связывающему домену, содержащему одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющей комплементарность области 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющей комплементарность области 3 легкой цепи (LC CDR3) CD33-связывающего домена, описанного в настоящем документе, и/или одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (HC CDR3) CD33-связывающего домена, описанного в настоящем документе, например, CD33-связывающего домена, содержащего одну или несколько, например, все три, LC CDR и одну или несколько, например, все три, HC CDR.

В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи, описанную в настоящем документе (например, в SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74) и/или вариабельную область тяжелой цепи, описанную в настоящем документе (например, в SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 или 65). В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен представляет собой scFv, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 или 47. В варианте осуществления CD33-связывающий домен (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74; и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 или 65, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 или 65. В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47, или последовательность, идентичную ей на 95-99%. В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, например, в таблице 8 или 9, прикреплена к вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, например, в таблице 8 или 9, с помощью линкера, например, линкера, описанного в настоящем документе. В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен включает в себя линкер (Gly4-Ser)n, причем n представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем документе, например, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, описанный в настоящем документе. В одном варианте осуществления вектор выбирают из группы, состоящей из ДНК, РНК, плазмиды, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора.

В одном варианте осуществления вектор представляет собой лентивирусный вектор. В одном варианте осуществления вектор дополнительно содержит промотор. В одном варианте осуществления промотор представляет собой промотор EF-1. В одном варианте осуществления промотор EF-1 содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 11. В другом варианте осуществления промотор представляет собой промотор PGK, например, усеченный промотор PGK, как описано в настоящем документе.

В одном варианте осуществления вектор представляет собой in vitro транскрибируемый вектор, например, вектор, который транскрибирует РНК молекулы нуклеиновой кислоты, описанной в настоящем документе. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты в векторе дополнительно содержит поли(A)-хвост, например, поли-A-хвост, описанный в настоящем документе, например, содержащий приблизительно 150 аденозиновых оснований (SEQ ID NO: 377). В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты в векторе дополнительно содержит 3'-НТО, например, 3'-НТО, описанную в настоящем документе, например, содержащую по меньшей мере один повтор 3'-НТО, происходящей от человеческого бета-глобулина. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты в векторе дополнительно содержит промотор, например, промотор T2A.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей вектор, описанный в настоящем документе. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку, описанную в настоящем документе, например, иммунную эффекторную клетку, например, человеческую T-клетку, например, человеческую T-клетку, описанную в настоящем документе, или человеческую NK-клетку, например, человеческую NK-клетку, описанную в настоящем документе. В одном варианте осуществления человеческая T-клетка представляет собой CD8+ T-клетку.

В одном варианте осуществления экспрессирующая CAR клетка, описанная в настоящем документе, может дополнительно экспрессировать другое средство, например, средство, которое усиливает активность экспрессирующей CAR клетки. Например, в одном варианте осуществления средство может представлять собой средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета, например, как описано в настоящем документе. В одном варианте осуществления средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу, содержит первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который передает положительный сигнал в клетку, например, внутриклеточным сигнальным доменом, описанным в настоящем документе. В одном варианте осуществления средство содержит первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, такую как PD1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), CTLA4, VISTA, CD160, BTLA, LAIR1, TIM3, 2B4, TGFR-бета, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TIGIT или фрагмент любой из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любой из них), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем документе (например, содержит костимулирующий домен (например, 41BB, CD27 или CD28, например, как описано в настоящем документе) и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен из CD3-дзета, описанный в настоящем документе)). В одном варианте осуществления средство содержит первый полипептид PD1 или его фрагмент (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид внутриклеточного сигнального домена, описанного в настоящем документе (например, сигнального домена из CD28, описанного в настоящем документе, и/или сигнального домена из CD3-дзета, описанного в настоящем документе).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу производства клеток, содержащему трансдукцию клетки, описанной в настоящем документе, например, иммунной эффекторной клетки, описанной в настоящем документе, например, T-клетки, описанной в настоящем документе, или NK-клетки, вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, например, CAR, описанный в настоящем документе.

Настоящее изобретение предлагает также способ генерирования популяции сконструированных клеток с измененной РНК, например, клеток, описанных в настоящем документе, например, иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, временно экспрессирующих экзогенную РНК. Способ содержит введение транскрибированной in vitro РНК или синтетической РНК в клетку, причем РНК содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу CAR, описанную в настоящем документе.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу обеспечения противоопухолевого иммунитета у млекопитающего, содержащему введение млекопитающему эффективного количества клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, клеток, экспрессирующих молекулу CAR, описанную в настоящем документе. В одном варианте осуществления клетка представляет собой аутологичную иммунную эффекторную клетку, например, T-клетку или NK-клетку. В одном варианте осуществления клетка представляет собой аллогенную иммунную эффекторную клетку, например, T-клетку или NK-клетку. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека, например, пациента с гематологическим раком.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающего, имеющего заболевание, ассоциированное с экспрессией CD33 (например, пролиферативное заболевание, предраковое состояние и не связанный с раком симптом, ассоциированный с экспрессией CD33), содержащему введение млекопитающему эффективного количества клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем документе. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека, например, пациента с гематологическим раком.

В одном варианте осуществления заболевание представляет собой заболевание, описанное в настоящем документе. В одном варианте осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией CD33, выбирают из пролиферативного заболевания, такого как рак или злокачественная опухоль, или предракового состояния, такого как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз, или оно представляет собой не связанный с раком симптом, ассоциированный с экспрессией CD33. В одном варианте осуществления заболевание представляет собой гематологический рак, выбранный из группы, состоящей из одного или нескольких острых лейкозов, включая, но без ограничения, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ); миелодиспластический синдром; миелопролиферативные новообразования; хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ); новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток; и заболевание, ассоциированное с экспрессией CD33, включая, но без ограничения, атипичные и/или неклассические раки, злокачественные опухоли, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, экспрессирующие CD33; и их комбинации.

В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем документе, вводят в комбинации со средством, которое повышает эффективность клетки, экспрессирующей молекулу CAR, например, средством, описанным в настоящем документе.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу кондиционирования субъекта перед клеточной трансплантацией, содержащему введение субъекту эффективного количества клеток, содержащих молекулу CAR, раскрытую в настоящем документе. В одном варианте осуществления клеточная трансплантация представляет собой трансплантацию стволовых клеток. Трансплантация стволовых клеток представляет собой трансплантацию гематопоэтических стволовых клеток или трансплантацию костного мозга. В одном варианте осуществления клеточная трансплантация является аллогенной или аутологичной.

В одном варианте осуществления кондиционирование субъекта перед клеточной трансплантацией содержит уменьшение количества CD33-экспрессирующих клеток у субъекта. CD33-экспрессирующие клетки у субъекта представляют собой CD33-экспрессирующие нормальные клетки или CD33-экспрессирующие раковые клетки, и, в некоторых случаях, кондиционирование субъекта будет уменьшать количество как CD33-экспрессирующих нормальных, так и раковых клеток перед клеточной трансплантацией.

В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем документе, вводят в комбинации с низкой иммуностимулирующей дозой ингибитора mTOR. Не желая быть связанными теорией, авторы полагают, что лечение с помощью низкой иммуностимулирующей дозы (например, дозы, недостаточной для полного подавления иммунной системы, но достаточной для улучшения иммунной функции) сопровождается уменьшением количества PD-1-положительных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, или увеличением количества PD-1-отрицательных клеток. PD-1-положительные иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки или NK-клетки), но не PD-1-отрицательные иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки или NK-клетки) могут быть истощены посредством контакта с клетками, которые экспрессируют лиганд PD-1, например, PD-L1 или PD-L2.

В варианте осуществления этот подход можно использовать для оптимизации активности клеток с CAR, описанных в настоящем документе, у субъекта. Не желая быть связанными теорией, авторы полагают, что в варианте осуществления активность эндогенных немодифицированных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, улучшается. Не желая быть связанными теорией, авторы полагают, что в варианте осуществления активность экспрессирующей CAR к CD33 клетки улучшается. В других вариантах осуществления клетки, например, иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки или NK-клетки), которые должны экспрессировать или будут сконструированы для экспрессии CAR, могут быть обработаны ex vivo посредством контакта с некоторым количеством ингибитора mTOR, которое увеличивает количество PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток, NK-клеток, или повышает отношение PD1-отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки или NK-клетки/PD1-положительные иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки или NK-клетки.

В варианте осуществления введение низкой иммуностимулирующей дозы ингибитора mTOR, например, аллостерического ингибитора, например, RAD001, или каталитического ингибитора, начинают перед введением экспрессирующей CAR клетки, описанной в настоящем документе, например, иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток). В варианте осуществления клетки с CAR вводят по прошествии достаточного времени или достаточного дозирования ингибитора mTOR, так что уровень PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, или отношение PD1-отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки или NK-клетки/PD1-положительные иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки или NK-клетки, по меньшей мере временно повышается. В варианте осуществления клетку, например, иммунную эффекторную клетку (например, T-клетку или NK-клетку), которая должна быть сконструирована для экспрессии CAR, отбирают по прошествии достаточного времени или после достаточного дозирования низкой иммуностимулирующей дозы ингибитора mTOR, так что уровень PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток, или отношение PD1-отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки или NK-клетки/PD1-положительные иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки или NK-клетки, у субъекта или после отбора у субъекта по меньшей мере временно повышается.

В варианте осуществления настоящее изобретение предлагает ингибитор mTOR для использования в лечении субъекта, причем упомянутый ингибитор mTOR усиливает иммунный ответ упомянутого субъекта, и причем упомянутый субъект получил, получает или скоро будет получать иммунную эффекторную клетку, которая экспрессирует CAR к CD33, как описано в настоящем документе.

В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем документе, вводят в комбинации со средством, которое ослабляет один или несколько побочных эффектов, ассоциированных с введением клетки, экспрессирующей молекулу CAR, например, средством, описанным в настоящем документе.

В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем документе, вводят в комбинации со средством, которое лечит заболевание, ассоциированное с CD33, например, средством, описанным в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с CD33, представляет собой пролиферативное заболевание, такое как рак или злокачественная опухоль, или предраковое состояние, такое как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз, или представляет собой не связанный с раком симптом, ассоциированный с экспрессией CD33.

В определенных вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с CD33, представляет собой гематологический рак, выбранный из группы, состоящей из одного или нескольких острых лейкозов, включая, но без ограничения, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ); миелодиспластический синдром; миелопролиферативные новообразования; хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ); новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток; и заболевание, ассоциированное с экспрессией CD33, включая, но без ограничения, атипичные и/или неклассические раки, злокачественные опухоли, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, экспрессирующие CD33; и их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления CAR к CD33, описанный в настоящем документе, воздействует на CD33-экспрессирующую клетку. В вариантах осуществления CAR к CD33, описанный в настоящем документе, воздействует на МДС-бласт. В некоторых вариантах осуществления МДС-бласт содержит делецию 5q (del(5q)). В вариантах осуществления экспрессирующую CAR к CD33 клетку, описанную в настоящем документе, используют для лечения субъекта, имеющего МДС. В вариантах осуществления экспрессирующую CAR к CD33 клетку, описанную в настоящем документе, используют для лечения субъекта, имеющего МДС, ассоциированный с выделенной del(5q).

В вариантах осуществления CAR к CD33, описанный в настоящем документе, воздействует на MDSC, например, MDSC у субъекта, имеющего рак (например, множественную миелому, хронический лимфоцитарный лейкоз или солидные злокачественные опухоли, такие как рак яичников, рак толстой кишки или рак молочной железы). В вариантах осуществления MDSC является отрицательной по линии дифференцировки (LIN-), HLA-DR-отрицательной и CD33-положительной. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующая CAR к CD33 клетка, описанная в настоящем документе, воздействует на МДС-бласт и MDSC. В вариантах осуществления экспрессирующую CAR к CD33 клетку, описанную в настоящем документе, используют для лечения множественной миеломы, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) или солидных злокачественных опухолей, таких как рак яичников, рак толстой кишки или рак молочной железы.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR настоящего изобретения, выделенной полипептидной молекуле CAR настоящего изобретения, вектору, содержащему CAR настоящего изобретения, и клетке, содержащей CAR настоящего изобретения, для использования в качестве лекарственного средства, например, как описано в настоящем документе.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR настоящего изобретения, выделенной полипептидной молекуле CAR настоящего изобретения, вектору, содержащему CAR настоящего изобретения, и клетке, содержащей CAR настоящего изобретения, для использования в лечении заболевания, экспрессирующего CD33, например, заболевания, экспрессирующего CD33, как описано в настоящем документе.

Дополнительные признаки и варианты осуществления вышеупомянутых композиций и способов включают в себя один или несколько из следующих:

В определенных вариантах осуществления молекула CAR к CD33 (например, нуклеиновая кислота CAR к CD33 или полипептид CAR к CD33, как описано в настоящем документе) или CD33-связывающий домен, как описано в настоящем документе, включает в себя одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, HC CDR1, HC CDR2 и/или HC CDR3), приведенные в таблице 1; и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, LC CDR1, LC CDR2 и/или LC CDR3) из CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, приведенные в таблице 2; или последовательность, по существу идентичную (например, идентичную на 95-99% или вплоть до 5, 4, 3, 2 или 1 изменения в аминокислотах, например, замены (например, консервативной замены)) любой из вышеупомянутых последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR к CD33 (например, нуклеиновая кислота CAR к CD33 или полипептид CAR к CD33, как описано в настоящем документе) или анти-CD33 антигенсвязывающий домен, как описано в настоящем документе, включают в себя одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, HC CDR1, HC CDR2 и/или HC CDR3), приведенные в таблице 3; и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, LC CDR1, LC CDR2 и/или LC CDR3) из CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, приведенные в таблице 4; или последовательность, по существу идентичную (например, идентичную на 95-99% или вплоть до 5, 4, 3, 2 или 1 изменения в аминокислотах, например, замены (например, консервативной замены)) любой из вышеупомянутых последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR к CD33 или анти-CD33 антигенсвязывающий домен включают в себя одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3), приведенные в таблице 5; и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, LC CDR1, LC CDR2 и/или LC CDR3) из CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, приведенные в таблице 6; или последовательность, по существу идентичную (например, идентичную на 95-99% или вплоть до 5, 4, 3, 2 или 1 изменения в аминокислотах, например, замены (например, консервативной замены)) любой из вышеупомянутых последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR к CD33 или анти-CD33 антигенсвязывающий домен включают в себя

(i) LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 в соответствии с любой аминокислотной последовательностью связывающего домена легкой цепи для CD33, приведенной в таблице 8 или 9, или LC CDR в таблице 2, 9, 4 или 6; и/или.

(ii) HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 в соответствии с любой аминокислотной последовательностью связывающего домена тяжелой цепи для CD33, приведенной в таблице 8 или 9, или HC CDR в таблице 1, 9, 3 или 5.

(1) три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одной из следующих:

(i) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 111, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 120 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 129 из CAR33-1;

(ii) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 112, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 121 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 130 из CAR33-2;

(iii) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 113, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 122 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 131 из CAR33-3;

(iv) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 114, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 123 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 132 из CAR33-4;

(iv) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 115, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 124 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 133 из CAR33-5;

(vi) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 116, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 125 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 134 из CAR33-6;

(vii) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 117, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 126 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 135 из CAR33-7;

(viii) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 118, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 127 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 136 из CAR33-8; или

(ix) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 119, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 128 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 137 из CAR33-9; и/или

(2) три CDR тяжелой цепи (HC), выбранные из одной из следующих:

(i) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 84, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 93 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 102 из CAR33-1;

(ii) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 85, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 94 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 103 из CAR33-2;

(iii) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 86, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 95 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 104 из CAR33-3;

(iv) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 87, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 96 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 105 из CAR33-4;

(iv) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 88, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 97 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 106 из CAR33-5;

(vi) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 89, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 98 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 107 из CAR33-6;

(vii) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 90, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 99 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 108 из CAR33-7;

(viii) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 91, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 100 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 109 из CAR33-8; или

(ix) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 92, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 101 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 110 из CAR33-9.

(1) три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одной из следующих:

(i) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 296, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 305 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 314 из CAR33-1;

(ii) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 297, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 306 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 315 из CAR33-2;

(iii) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 298, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 307 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 316 из CAR33-3;

(iv) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 299, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 308 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 317 из CAR33-4;

(iv) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 300, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 309 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 318 из CAR33-5;

(vi) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 301, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 310 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 319 из CAR33-6;

(vii) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 302, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 311 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 320 из CAR33-7;

(viii) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 303, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 312 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 321 из CAR33-8; или

(ix) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 304, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 313 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 322 из CAR33-9; и/или

(2) три CDR тяжелой цепи (HC), выбранные из одной из следующих:

(i) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 269, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 278 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 287 из CAR33-1;

(ii) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 270, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 279 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 288 из CAR33-2;

(iii) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 271, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 280 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 289 из CAR33-3;

(iv) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 272, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 281 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 290 из CAR33-4;

(iv) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 273, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 282 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 291 из CAR33-5;

(vi) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 274, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 283 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 292 из CAR33-6;

(vii) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 275, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 284 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 293 из CAR33-7;

(viii) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 276, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 285 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 294 из CAR33-8; или

(ix) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 277, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 286 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 295 из CAR33-9.

(1) три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одной из следующих:

(i) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 350, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 359 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 368 из CAR33-1;

(ii) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 351, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 360 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 369 из CAR33-2;

(iii) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 352, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 361 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 370 из CAR33-3;

(iv) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 353, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 362 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 371 из CAR33-4;

(iv) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 354, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 363 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 372 из CAR33-5;

(vi) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 355, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 364 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 373 из CAR33-6;

(vii) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 356, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 365 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 374 из CAR33-7;

(viii) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 357, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 366 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 375 из CAR33-8; или

(ix) LC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 358, LC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 367 и LC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 376 из CAR33-9; и/или

(2) три CDR тяжелой цепи (HC), выбранные из одной из следующих:

(i) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 323, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 332 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 341 из CAR33-1;

(ii) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 324, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 333 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 342 из CAR33-2;

(iii) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 325, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 334 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 343 из CAR33-3;

(iv) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 326, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 335 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 344 из CAR33-4;

(iv) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 327, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 336 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 345 из CAR33-5;

(vi) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 328, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 337 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 346 из CAR33-6;

(vii) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 329, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 338 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 347 из CAR33-7;

(viii) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 330, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 339 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 348 из CAR33-8; или

(ix) HC CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 331, HC CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 340 и HC CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 349 из CAR33-9.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значение, обычно понимаемое средним специалистом в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя при реализации на практике или тестировании настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем документе, включены посредством ссылки во всей полноте. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Заголовки, подзаголовки или элементы, обозначенные цифрами или буквами, например, (a), (b), (i) и так далее, представлены только для удобства чтения. Использование в данном документе заголовков или элементов, обозначенных цифрами или буквами, не требует, чтобы этапы или элементы были выполнены в алфавитном порядке, или чтобы этапы или элементы были обязательно отделены друг от друга. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и чертежей и из формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Нижеследующее подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения будет более понятным при чтении совместно с прилагаемыми чертежами. С целью иллюстрации настоящего изобретения на чертежах показаны варианты осуществления, которые в настоящее время являются предпочтительными. Следует, тем не менее, понимать, что настоящее изобретение не ограничено точными конфигурациями и инструментальными средствами вариантов осуществления, показанных на чертежах.

Фигура 1 представляет собой изображение, демонстрирующее, что CD33 экспрессируется на большинстве бластов во многих первичных образцах пациентов с ОМЛ (ОМЛ-бласты гейтировали с использованием стандартных характеристик боковое светорассеяние^low CD45^dim); n=35-46 на группу.

Фигуры 2A, 2B, и 2C представляют собой графики и профиль проточной цитометрии, демонстрирующие экспрессию CD33 в костном мозге пациентов с миелодиспластическим синдромом. Фигура 2A показывает процентную долю CD33-экспрессирующих клеток в камере CD34+ CD38- гематопоэтических стволовых клеток у пациентов с МДС. Фигура 2B показывает процентную долю CD33-экспрессирующих клеток в камере CD34+ CD38+, содержащей миелоидные предшественники, у пациентов с МДС. Фигура 2C представляет собой гистограмму, показывающую среднюю интенсивность флуоресценции у пациентов с МДС в камере CD34+ CD38-.

Фигура 3 показывает схематическое представление конструктов CAR, используемых в примере 1. Все они представляют собой CAR второго поколения, использующие сигнализацию 41BB и CD3-дзета. scFv CART33 получали из клона MY9-6.

Фигура 4 представляет собой изображение, демонстрирующее in vitro активность CART33. CART33-опосредованная дегрануляция T-клеток: трансдуцированные CAR33 и нетрансдуцированные T-клетки инкубировали с линией CD33+ клеток MOLM14 и контрольной линией клеток ОЛЛ NALM6 в течение 4 часов в присутствии CD28, CD49d и монензина. Дегрануляцию по CD107a измеряли с помощью проточной цитометрии. Экспрессия как мышиных, так и гуманизированных конструктов CART33 выявляет специфическую дегрануляцию в присутствии MOLM14 (P<0,001).

Фигура 5 представляет собой изображение, демонстрирующее in vitro активность CART33. Производство цитокинов: экспрессирующие как гуманизированные, так и мышиные CAR33 T-клетки производят цитокин после инкубации с MOLM14. T-клетки инкубировали с линией CD33+ клеток MOLM14 и контрольной линией клеток NALM6 в течение 4 часов. Затем клетки фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали на внутриклеточные некроз опухоли-альфа и интерферон-гамма. Затем образцы анализировали посредством использования проточной цитометрии.

Фигура 6 представляет собой изображение, демонстрирующее in vitro активность CART33. Пролиферация экспрессирующих CAR123 и CAR33 T-клеток: пролиферация гуманизированных CART33 и мышиных CART33 в ответ на MOLM14. T-клетки помечали CFSE и инкубировали в контрольных условиях или с MOLM14 в течение 120 часов, и измеряли с помощью проточной цитометрии разбавление CFSE в качестве маркера пролиферации.

Фигуры 7A и 7B представляют собой два графика, демонстрирующих in vitro активность CART33. Специфический киллинг экспрессирующих CAR123, гуманизированный CAR33 и мышиный CAR33 T-клеток: T-клетки инкубировали с MOLM14 или T-клеточной линией клеток ОЛЛ Jurkat (контроль) в течение 24 часов. huCART33 приводили к значительно большему специфическому киллингу по сравнению с мышиными CART33 при низких отношениях E:T. На фигуре 7B CART33-Jurkat представлены с помощью треугольников, CART33-MOLM14 представлены с помощью перевернутых треугольников и CART123-MOLM14 представлены с помощью квадратов.

Фигура 8 представляет собой изображение, демонстрирующее, что CART33 (шарнир IgG4) и CART33 (шарнир CD8) обладают эквивалентной in vitro активностью. Анализ дегрануляции: CART33 (шарнир IgG4), CART33 (шарнир CD8), CART123 и нетрансдуцированные T-клетки инкубировали с линией CD33+ клеток MOLM14, и измеряли дегрануляцию по CD107a с помощью проточной цитометрии. Оба конструкта CART33 подвергались специфической дегрануляции в присутствии MOLM14.

Фигура 9 представляет собой изображение, демонстрирующее, что CART33 (шарнир IgG4) и CART33 (шарнир CD8) обладают эквивалентной in vitro активностью. Производство цитокинов: оба конструкта CAR33 и CAR123 специфически индуцируют производство цитокинов после инкубации с линией клеток MOLM14. T-клетки инкубировали с MOLM14 в течение 4 часов в присутствии CD28, CD49d и монензина. Затем клетки отбирали, фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали на некроз опухоли-альфа, MIP1a и интерферон-гамма. Затем процентную долю клеток, производящих цитокины, измеряли с помощью проточной цитометрии.

Фигура 10 представляет собой изображение, демонстрирующее, что CART33 (шарнир IgG4) и CART33 (шарнир CD8) обладают эквивалентной in vitro активностью. Пролиферация контрольных нетрансдуцированных, экспрессирующих CAR33 (шарнир IgG4) (то есть, CAR33-IgG4H), CAR33 (шарнир CD8) (то есть, CAR33-CD8H) или CAR123 T-клеток в ответ на MOLM14. T-клетки помечали с помощью CFSE и инкубировали с MOLM14 в течение 120 часов.

Фигура 11 представляет собой схематическую диаграмму, демонстрирующую сравнение in vivo противоопухолевого эффекта CART33-CD8H, CART33-IgG4H и CART123. NOD-SCID- мышей с нокаутом общей гамма-цепи (NSG) инъецировали линией клеток ОМЛ MOLM14 1×10⁶ в/в и визуализировали в отношении приживления через 6 дней. На день 7 мышей обрабатывали T-клетками, экспрессирующими CAR33 (шарнир IgG4), CAR33 (шарнир CD8), CAR123, или контрольным носителем (нетрансдуцированными клетками). Общее количество инъецированных T-клеток составляло 2×10⁶ в/в. Затем мышей подвергали серии еженедельных визуализаций для оценки опухолевой нагрузки.

Фигура 12 представляет собой изображение, демонстрирующее эквивалентный in vivo противоопухолевый эффект T-клеток CART33-CD8H, CART33-IgG4H и CART123. Опухолевая нагрузка с течением времени по биолюминесцентной визуализации (BLI); данные из одного эксперимента (n=5 на группу), отражающего 4 независимых эксперимента для мышей, показанных на фигуре 11.

Фигура 13 представляет собой схематическую диаграмму, демонстрирующую сравнение CART33 и CART123 при эрадикации первичного ОМЛ in vivo. Мышей NSG, трансгенных по человеческим цитокинам IL3/GM-CSF/SCF (мышей NSGS), инъецировали образцом первичного ОМЛ 5×10⁶ в/в. Приживление подтверждали с помощью ретроорбитального кровопускания через 2-4 недели, и затем мышей обрабатывали с помощью CART33, CART123 или контрольным носителем (нетрансдуцированными клетками). Общее количество инъецированных T-клеток составляло 1×10⁵ в/в. Затем мышей подвергали серии ретроорбитальных кровопусканий для оценки нагрузки ОМЛ.

Фигура 14 представляет собой изображение, демонстрирующее, что CART33 и CART123 производят эквивалентную эрадикацию первичного ОМЛ in vivo. Анализ периферической крови мышей, обработанных нетрансдуцированными (UTD), CART33 или CART123, на исходном уровне, на день 14 и день +70. В соответствии со схемой эксперимента, описанной на фигуре 13, у мышей, обработанных CART33 или CART123, не детектировали ОМЛ.

Фигура 15 представляет собой изображение, демонстрирующее, что CART33 и CART123 производят эквивалентную эрадикацию первичного ОМЛ in vivo. Сводная информация по нагрузке заболевания, измеренной в бластах на мкл в ретроорбитальных кровопусканиях в различных временных точках, как указано, у мышей в схеме эксперимента, описанной на фигуре 13.

Фигура 16 представляет собой изображение, демонстрирующее, что CART33 и CART123 производят эквивалентную эрадикацию первичного ОМЛ in vivo. Выживаемость мышей, обработанных CART33, CART123 или UTD (p<0,001, когда обработку с помощью или CART33, или CART123 сравнивают с UTD), в соответствии со схемой эксперимента, описанной на фигуре 13.

Фигура 17 представляет собой схематическую диаграмму, демонстрирующую схему тестирования токсичности клеток CART33 для гематопоэтических стволовых клеток. Схема эксперимента: мышам с гуманизированной иммунной системой (HIS) делали ретроорбитальное кровопускание через 6-8 недель после инъекции человеческих CD34+ клеток, полученных из фетальной печени, для подтверждения приживления человеческих клеток. Затем мышей обрабатывали с помощью или CART33, или UTD (по 1×10⁶ клеток) и затем подвергали серии еженедельных ретроорбитальных кровопусканий. Затем мышей умерщвляли на день 28, и органы отбирали и анализировали.

Фигура 18 представляет собой изображение, демонстрирующее токсичность клеток CART33 для гематопоэтических стволовых клеток клеток. Анализ с помощью проточной цитометрии периферической крови (из ретроорбитального кровопускания) с 28 дня при завершении эксперимента, показанного на фигуре 17. Обработка с помощью CART33 приводит к значительному уменьшению количества миелоидных клеток и моноцитов периферической крови по сравнению с обработкой с помощью нетрансдуцированных T-клеток.

Фигура 19 представляет собой изображение, демонстрирующее токсичность клеток CART33 для гематопоэтических стволовых клеток. Сводная статистика на день 28 анализа периферической крови мышей, обработанных CART33, UTD или не обработанных (n=5), из эксперимента, показанного на фигуре 17. CART33 приводили к значительной токсичности на моноцитах и клетках CD33+ миелоидной линии дифференцировки при относительном щажении B-клеток и тромбоцитов.

Фигура 20 представляет собой изображение, демонстрирующее токсичность клеток CART33 для гематопоэтических стволовых клеток. Графики из анализа костного мозга с помощью проточной цитометрии на день 28 мышей из эксперимента, показанного на фигуре 17. Обработка с помощью CART33 приводила к значительному уменьшению количества миелоидных предшественников (CD34+CD38+) и гематопоэтических стволовых клеток (CD34+CD38-), гейтированных по синглетам, huCD45dim, отрицательных по линии дифференцировки.

Фигура 21 представляет собой изображение, демонстрирующее токсичность клеток CART33 для гематопоэтических стволовых клеток. Срезы бедра мышей из эксперимента, показанного на фигуре 17, получали от мышей на день 28 после обработки UTD T-клетками или клетками CART33. Проводили окрашивание huCD45 и CD34 с помощью IHC. Нет различий в huCD45 между контрольными T-клетками и CART33, хотя обе эти группы продемонстрировали меньшее окрашивание huCD45, вероятно в связи с эффектом взаимодействия аллогенных человеческих и античеловеческих белков. Имело место специфическое уменьшение количества CD34+ клеток у мышей, обработанных CART33. Результаты отражают два эксперимента.

Фигура 22 представляет собой схематическую диаграмму, демонстрирующую схему тестирования гематопоэтической токсичности CART33 и CART123 in vivo. Схема эксперимента: мыши NSGS получали бусульфан и/п и затем на следующий день 2×10⁶ клеток без-T-клеточного костного мозга от нормального донора. Приживление подтверждали по анализу периферической крови с помощью проточной цитометрии через 4 недели, и затем мышей обрабатывали с помощью 1×10⁶ аутологичных T-клеток, трансдуцированных CART33, CART123 или UTD. Затем мышей подвергали ретроорбитальному кровопусканию на день 7 и день 14 и умерщвляли для некропсии на день 14.

Фигура 23 представляет собой изображение, демонстрирующее, что CART33 и CART123 производят эквивалентную гематопоэтическую токсичность in vivo. Показан типичный график анализа костного мозга мышей из эксперимента, показанного на фигуре 22, с помощью проточной цитометрии на день 28. Обработка с помощью CART33 и CART123 приводила к значительному уменьшению количества миелоидных предшественников (CD34+CD38+) и гематопоэтических стволовых клеток (CD34+CD38-), гейтированных по huCD45dim, Lin-. Результаты отражают два эксперимента.

Фигура 24 представляет собой изображение, демонстрирующее, что CART33 и CART123 являются цитотоксическими для клеток костного мозга при миелодиспластическом синдроме (МДС). Обогащенный CD34 КМ пациентов с МДС инкубировали с UTD, CART33 (шарнир IgG4), CART33 (шарнир CD8) или CART123. Имело место уменьшение количества клеток CD45dimCD34+ в образцах, обработанных с помощью CART33 или CART123.

Фигура 25 представляет собой схематическую диаграмму вектора для экспрессии мышиных CART33.

Фигура 26 представляет собой схематическую диаграмму вектора для экспрессии гуманизированных CART33.

Фигура 27 представляет собой изображение, показывающее экспрессию scFv на клеточной поверхности на линии T-клеток Jurkat, которые содержат репортер люциферазы, управляемый NFAT-регулируемым промотором (называемых клетками JNL). Клетки JNL трансдуцировали лентивирусным вектором, экспрессирующим кДНК, кодирующую GFP, scFv, который связывается с CD19, или кДНК, которые кодируют scFv, который был сгенерирован к hsCD33. Экспрессию на клеточной поверхности отдельных scFv на JNL детектировали посредством инкубирования клеток с рекомбинантным Fc-меченым hsCD33 с последующей инкубацией с Fc-специфическим вторичным антителом, конъюгированным с фикоэритрином.

Фигуры 28A, 28B, 28C и 28D представляют собой изображения, показывающие способность отдельных scFv, воздействующих на hsCD33, выявлять активность NFAT в клетках JNL. Клетки JNL, экспрессирующие scFv против hsCD33, совместно культивировали с линиями клеток MOLM13 или MOLP8, которые, соответственно, экспрессируют hsCD33 или не имеют экспрессии hsCD33 на клеточной поверхности (фигура 28A; hsCD33, сплошная зеленая линия; изотипический контроль, серая пунктирная линия и заштрихованный участок). Фигура 28B изображает активацию клеток JNL, экспрессирующих scFv, воздействующий на hsCD33, в присутствии клеток MOLM13 (сплошные линии) или MOLP8 (пунктирные линии). Клетки JNL, экспрессирующие отдельные scFv, высеивали при различных отношениях эффектора (то есть клеток JNL) к мишени (то есть MOLM13 или MOLP8) и анализировали в отношении экспрессии в относительных единицах люциферазы (RLU) с использованием Bright-Glo™ Luciferase Assay на приборе EnVision через 24 часа после инкубации. Фигура 28C представляет собой вариант фигуры 28B, изображающий активацию клеток JNL в присутствии MOLM13. Фигура 28D представляет собой вариант фигуры 28B, изображающий активацию клеток JNL в присутствии MOLP8.

Фигуры 29A и 29B представляют собой панели изображений, показывающих активность scFv, воздействующих на hsCD33, в полученных от донора первичных T-клетках. Изображена экспрессия scFv на клеточной поверхности первичных человеческих T-клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором, который экспрессирует scFv, который воздействует на hsCD33. Экспрессию scFv детектировали посредством инкубирования клеток с рекомбинантным Fc-меченым hsCD33 и Fc-специфическим вторичным антителом, конъюгированным с фикоэритрином, как описано на фигуре 27.

Фигуры 30A и 30B представляют собой изображения, показывающие пролиферативную активность T-клеток, экспрессирующих scFv, воздействующие на CD33. T-клетки помечали CFSE и совместно культивировали в присутствии MOLM13 (фигура 30A, сплошной черный столбец), MOLP8 (фигура 30A, незаштрихованный белый столбец) или культивировали отдельно (фигура 30A, заштрихованный столбец) для оценки пролиферативной способности первичных UTD T-клеток или клеток, экспрессирующих scFv, воздействующие на hsCD33. Кроме того, оценивали антигензависимое деление клеток в первичных T-клетках посредством измерения медианной интенсивности флуоресценции (MFI) CFSE-меченых T-клеток, экспрессирующих клоны scFv CD33-2, -3, -4, -5, -6 и -9, культивированные совместно с клетками MOLM13, MOLP8 или отдельно (фигура 30B).

Фигура 31 представляет собой изображение, показывающее цитолитическю активность T-клеток, экспрессирующих scFv, воздействующие на CD33. Для оценки цитолитической активности 25000 клеток MOLM13 высеивали с первичными T-клетками, экспрессирующими отдельные scFv, при различных отношениях эффектора (то есть T-клеток) к мишени (то есть MOLM13) и анализировали в отношении величины киллинга MOLM13 посредством подсчета абсолютного количества CFSE-меченых клеток MOLM13 после 4 дней культивирования.

Фигура 32 представляет собой изображение, показывающее перекрестную реактивность T-клеток, экспрессирующих scFv, воздействующие на CD33, к CD33 яванского макака (cyCD33) с помощью проточной цитометрии. Клетки JNL, трансдуцированные лентивирусным вектором, экспрессирующим scFv, сгенерированные против hsCD33, инкубировали или с рекомбинантным Fc-меченым hsCD33 (пунктирная линия), или с cyCD33 (сплошная линия), за чем следовала инкубация с Fc-специфическим вторичным антителом, конъюгированным с фикоэритрином.

Фигуры 33A и 33B изображают экспрессию мРНК CAR33 в T-клетках от нормальных доноров после электропорации. Фигура 33A представляет собой ряд профилей проточной цитометрии, показывающих экспрессию CAR33 в T-клеточной популяции в указанных временных точках. Процентная доля экспрессирующих CAR33 клеток (обведено рамкой) количественно определена и показана на профиле. Фигура 33B представляет собой графическое представление процентной доли экспрессии CAR33.

Фигуры 34A и 34B сравнивают экспрессию трансдуцированного с помощью лентивируса CAR33 с электропорированного мРНК CAR33. Фигура 34A показывает стабильную экспрессию трансдуцированного с помощью лентивируса CAR33 (CART33LV) в указанные моменты времени в течение 4 дней. Фигура 34B показывает временную экспрессию электропорированного мРНК CAR33 (РНК-CART33) в указанные моменты времени в течение 4 дней. Экспрессия CAR33 представлена средней интенсивностью флуоресценции (MFI) по оси x, и общее количество клеток представлено по оси y.

Фигуры 35A, 35B, 35C и 35D представляют собой графические представления, сравнивающие цитолитическую активность T-клеток, экспрессирующих CD33 после лентивирусной трансдукции или электропорации мРНК. Эксперимент повторяли через 1 день (фигура 35A), 2 дня (фигура 35B), 3 дня (фигура 35C) и 4 дня (фигура 35D) после электропорации T-клеток. Клетки CART33 инкубировали с линией CD33-положительных клеток MOLM14 и контрольной линией клеток мантийноклеточной лимфомы JEKO при отношениях E:T (эффектор к мишени), указанных по оси x. Киллинг в процентах при каждом отношении указан по оси y.

Фигуры 36A и 36B представляют собой графические представления, сравнивающие цитолитическую активность T-клеток, экспрессирующих CD33 после лентивирусной трансдукции или электропорации мРНК с течением времени. Фигура 36A показывает специфический киллинг трансдуцированных с помощью лентивируса клеток с CAR33 по сравнению с клетками РНК-CAR33 при инкубации с клетками MOLM14 при отношении E:T (эффектор:мишень), составляющем 2:1, в течение 4 дней. Фигура 36B показывает специфический киллинг трансдуцированных с помощью лентивируса клеток с CAR33 по сравнению с клетками РНК-CAR33 при инкубации с клетками MOLM14 при отношении E:T (эффектор:мишень), составляющем 1:1, в течение 4 дней.

Фигуры 37A, 37B, 37C и 37D показывают, что клетки CART33 проявляют устойчивые in vitro эффекторные функции в ответ на линию CD33+ клеток MOLM14 или на образцы первичного ОМЛ. Графики отражают четыре независимых эксперимента. Фигура 37A показывает дегрануляцию по CD107a. CART33, CART123 и нетрансдуцированные T-клетки (UTD) инкубировали с линией CD33+/CD123+ клеток MOLM14, PMA/иономицином в качестве положительного неспецифического T-клеточного стимулятора и контрольной T-клеточной линией клеток ОЛЛ Jurkat в присутствии костимулирующих молекул CD49d, CD28 и монензина. Дегрануляцию по CD107a измеряли с помощью проточной цитометрии после 4 часов инкубации. Фигура 37B показывает специфический киллинг CD33-экспрессирующих клеток. CART33, CART123 и UTD инкубировали с MOLM14-luc или Jurkat-luc в течение 24 часов при различных отношениях E:T, как указано, и затем осуществляли биолюминесцентную визуализацию в качестве измерения оставшихся живых клеток. Черная/сплошная линия (квадраты) представляет CART123, инкубированные с MOLM14; синяя/пунктирная линия (треугольники, направленные вниз/закрашенные треугольники) представляет CART33, инкубированные с MOLM14; и красная/пунктирная линия (треугольники, направленные вверх/незакрашенные треугольники) представляет CART33, инкубированные с Jurkat. Фигуры 37C и 37D показывают пролиферацию клеток CART33 в ответ на CD33-экспрессирующие клетки. T-клетки помечали CFSE и инкубировали с MOLM14, PMA/IONO в качестве положительного специфического T-клеточного стимулятора, Jurkat в качестве отрицательного контроля или образцами ОМЛ в течение 120 часов. Количество пролиферирующих T-клеток оказалось значительно выше в ответ на MOLM14 по сравнению с Jurkat и оказалось сравнимым с CART123.

Фигуры 38A, 38B и 38C показывают производство цитокинов клетками CART33 в ответ на CD33-экспрессирующие клетки MOLM14. Клетки CART33, CART123 и UTD инкубировали с MOLM14, PMA/иономицином и Jukat в течение 4 часов. Затем клетки фиксировали и пермеабилизировали, окрашивали на 5 различных цитокинов (фактор некроза опухоли-альфа, интерферон-гамма, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, макрофагальный белок воспаления 1b и интерлейкин-2), и выполняли анализы с помощью проточной цитометрии. Большинство клеток CART33 производят более чем один цитокин в ответ на MOLM14 (фигура 38A), аналогично их ответу на PMA/иономицин (положительный контроль, фигура 38B). Фигура 38C показывает, что производство IL-2, IFN-γ, GM-CSF и ФНО-α в ответ на MOLM14 оказалось значительно выше в клетках CART33, чем в CART123. Клетки CART33, CART123 и UTD инкубировали с MOLM14, Jurkat и PMA/иономицином в течение 24 часов. Затем отбирали супернатант и выполняли 30-плексный анализ Luminex. Уровни остатка цитокинов представлены на фигуре 39.

Фигура 39 представляет собой ряд графиков, показывающих сравнение производства цитокинов клетками CART33 и CART123 в ответ на MOLM14. Клетки CART33, CART123 и UTD инкубировали с MOLM14, Jurkat и PMA/иономицином в течение 24 часов. Затем отбирали супернатант и выполняли 30-плексный анализ Luminex для указанных цитокинов.

Фигура 40 показывает специфический киллинг CD33-экспрессирующих клеток MOLM14 in vitro. CART123, CART33 (шарнир CD8) и CART33 (шарнир IgG4) инкубировали с MOLM14 при указанных отношениях E:T, и оценивали киллинг с помощью биолюминесцентной визуализации. CART33 (шарнир IgG4) приводили к более специфическому киллингу, чем CART33 (шарнир CD8) при более низком отношении E:T.

Фигуры 41A, 41B и 41C показывают противоопухолевую активность в отношении миелодиспластических синдромов (МДС). Фигура 41A представляет собой график, показывающий специфическую дегрануляцию по CD107a в ответ на клетки костного мозга пациентов с МДС. Фигура 41B представляет собой набор изображений, показывающих специфический киллинг клона МДС, имеющего делецию 5q. Фигура 41C представляет собой график, показывающий количественное описание клонов с делецией 5q, оставшихся после обработки, определенное с помощью FISH. Имело место значительное уменьшение процентной доли 5q-клона в группе, обработанной CART33, по сравнению с группами с обработкой UTD и без обработки.

Фигуры 42A, 42B, 42C показывают, что обработка CART33 приводит к выживаемости для привитых ксенотрансплантатов MOLM14. Схема эксперимента представлена на фигуре 11. На фигуре 42A количественно определяли опухолевую нагрузку с течением времени с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI); данные из одного эксперимента (n=5 на группу), каждая мышь представлена линией. Фигура 42B показывает сводную выживаемость по трем независимым экспериментам. Обработка с помощью CART33 приводила к значительному преимуществу по выживаемости по сравнению с обработкой UTD. Фигура 42C представляет собой типичные биолюминесцентные изображения из одного эксперимента.

Фигуры 43A и 43B показывают, что обработка с помощью CART33 приводит к дозозависимому уменьшению лейкозной нагрузки для привитых ксенотрансплантатов MOLM14. Фигура 43A схематически показывает схему эксперимента, описанного в примере 6. Фигура 43B показывает количественное описание опухолевой нагрузки с течением времени, измеренной с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI) в различных группах.

Фигура 44 представляет собой график, показывающий опухолевую нагрузку с течением времени, измеренную с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI) в различных группах при схеме эксперимента, показанной на фигуре 11.

Фигура 45 показывает, что комбинация РНК-CART33 и химиотерапии приводит к дальнейшему уменьшению лейкозной нагрузки для привитых ксенотрансплантатов MOLM14.

Фигуры 46A и 46B показывают антителосвязывающую способность для CD33 и CD123 на MOLM14 и образцах первичного ОМЛ, использованных для in vivo экспериментов. Анализ осуществляли с использованием набора QUANTUM SIMPLY CELLULAR (Bangs Laboratories, Inc). Образцы промывали в проточном буфере и затем окрашивали указанным антителом (CD33 или CD123), конъюгированным с PE. Пять различных микросфер, предложенных в наборе, также окрашивали тем же антителом. Среднюю интенсивность флуоресценции мишени сравнивали с интенсивностью флуоресценции пяти микросфер, и затем вычисляли значение антителосвязывающей способности в соответствии с протоколом производителя. Фигура 46A показывает антителосвязывающую способность MOLM14 для CD33 и CD123, тогда как фигура 46B показывает антителосвязывающую способность для CD33 и CD123 первичных образцов, использованных в этих экспериментах.

Фигура 47 представляет собой график, показывающий пролиферацию по числу клеток различных T-клеток - T-клеток CART-33 (от CD33-1 до CD33-9, или Upenn), T-клеток CART-CD19 (CD19) или нетрансдуцированных T-клеток (Клетки) под воздействием PL21, HL-60 или клеток-мишеней MOLP8.

Фигура 48A представляет собой график, показывающий долю в процентах лизиса клеток-мишеней HL-60-Luc под воздействием различных T-клеток CART-33 (от CD33-1 до CD33-9, или Upenn), T-клеток CART-CD19 (CD19) или нетрансдуцированных T-клеток (Клетки) при различных отношениях эффектора к T-клетке. Фигура 48B представляет собой график, показывающий долю в процентах лизиса клеток-мишеней PL21/Luc под воздействием различных T-клеток CART-33 (от CD33-1 до CD33-9, или Upenn), T-клеток CART-CD19 (CD19) или нетрансдуцированных T-клеток (Клетки) при различных отношениях эффектора к T-клетке. Фигура 48C представляет собой график, показывающий долю в процентах лизиса клеток-мишеней U87/Luc под воздействием различных T-клеток CART-33 (от CD33-1 до CD33-9, или Upenn), T-клеток CART-CD19 (CD19) или нетрансдуцированных T-клеток (Клетки) при различных отношениях эффектора к T-клетке.

Фигура 49 представляет собой график, показывающий концентрацию цитокинов (человеческого интерферона-гамма (IFN-γ), человеческого интерлейкина-2 (IL-2) и человеческого фактора некроза опухоли (ФНО)), производимых различными T-клетками CART-33 (от CD33-1 до CD33-9, или Upenn), T-клетками CART-CD19 (CD19) или нетрансдуцированными T-клетками (клетки) под воздействием PL21, HL60 или клеток-мишеней MOLP8.

Фигура 50A представляет собой график проточной цитометрии, показывающий стратегию гейтирования для MDSC. Фигура 50B представляет собой график, показывающий долю в процентах отрицательных по линии дифференцировки, HLA-DR-отрицательных, CD33+ (LIN-HLDR-CD33+) клеток в костном мозге нормальных доноров (КМ НД) или пациентов с миелодиспластическим синдромом (МДС) (КМ МДС). Фигура 5°C представляет собой график, показывающий уровень CD33, измеренный по средней интенсивности флуоресценции (MFI) в популяции MDSC (MDSC) по сравнению с популяцией злокачественного МДС (МДС) и популяцией от нормальных доноров (НД-КМ).

Фигура 51A представляет собой панель графиков проточной цитометрии, показывающих степень дегрануляции (уровень CD107a) и производство цитокинов (GM-CSF, IL-2, ФНО-a) из CART33. Дегрануляция по CD107a и производство цитокинов показаны по оси y, а CAR против CD33 по оси x. Отрицательный контроль показан слева (Jurkat), а MDSC справа. Фигура 51B представляет собой график, показывающий количественное описание дегрануляции и производства цитокинов CART33 против различных мишеней - Jurkat, PMA/иономицина (PMA/IONO), МДС (не MDSC) и MDSC.

Фигуры 52A-52D показывают различные конфигурации на одном векторе, например, в которых U6-регулируемая кшРНК расположена в обратном направлении или в прямом направлении от EF1-альфа-регулируемых кодирующих CAR элементов. В примерах конструктов, изображенных на фиг. 52A и 52B, транскрипция происходит через промоторы U6 и EF1-альфа в одном и том же направлении. В примерах конструктов, изображенных на фиг. 52C и 52D, транскрипция происходит через промоторы U6 и EF1-альфа в различных направлениях. На фигуре 52E кшРНК (и соответствующий промотор U6) расположен на первом векторе, а CAR (и соответствующий промотор EF1-альфа) расположен на втором векторе.

Фигура 53 изображает структуры двух примеров конфигураций RCAR. Антигенсвязывающие элементы содержат антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен-переключатель. Внутриклеточные связывающие элементы содержат домен-переключатель, костимулирующий сигнальный домен и первичный сигнальный домен. Эти две конфигурации демонстрируют, что первый и второй домены-переключатели, описанные в настоящем документе, могут находиться в различной ориентации по отношению к антигенсвязывающему элементу и внутриклеточному связывающему элементу. Другие конфигурации RCAR описаны далее в настоящем документе.

Фигура 54 показывает, что пролиферация экспрессирующих CAR, трансдуцированных T-клеток увеличивается низкими дозами RAD001 в системе клеточной культуры. CART совместно культивировали с клетками Nalm-6 в присутствии различных концентраций RAD001. Количество CAR-положительных CD3-положительных T-клеток (черный цвет) и всех T-клеток (серый цвет) оценивали после 4 дней совместного культивирования.

Фигура 55 изображает измерения роста опухоли клеток NALM6-luc при ежедневном дозировании RAD001 по 0,3, 1, 3 и 10 мг/кг (mpk) или дозировании носителя. Кружки обозначают носитель; квадраты обозначают дозу RAD001 10 мг/кг; треугольники обозначают дозу RAD001 3 мг/кг, перевернутые треугольники обозначают дозу RAD001 1 мг/кг; и ромбы обозначают дозу RAD001 0,3 мг/кг.

Фигуры 56A и 56B показывают фармакокинетические кривые, показывающие количество RAD001 в крови мышей NSG с опухолями NALM6. Фиг. 56A показывает ФК на день 0 после первой дозы RAD001. Фиг. 56B показывает ФК на день 14 после последней дозы RAD001. Ромбы обозначают дозу RAD001 10 мг/кг; квадраты обозначают дозу RAD001 1 мг/кг; треугольники обозначают дозу RAD001 3 мг/кг; и x обозначают дозу RAD001 10 мг/кг.

Фигуры 57A и 57B показывают in vivo пролиферацию гуманизированных CD19-CART-клеток с дозированием RAD001 и без него. Низкие дозы RAD001 (0,003 мг/кг) ежедневно приводят к увеличению пролиферации T-клеток с CAR выше нормального уровня пролиферации huCAR19. Фигура 57A показывает CD4⁺ T-клетки с CAR; фиг. 57B показывает CD8⁺ T-клетки с CAR. Кружки обозначают ФСБ; квадраты обозначают huCTL019; треугольники обозначают huCTL019 с 3 мг/кг RAD001; перевернутые треугольники обозначают huCTL019 с 0,3 мг/кг RAD001; ромбы обозначают huCTL019 с 0,03 мг/кг RAD001; и кружки обозначают huCTL019 с 0,003 мг/кг RAD001.

Фигура 58 представляет собой график, показывающий прогрессирование заболевания ОМЛ, вызванного ксенотрансплантатом HL-60-luc. Синие кружки: мыши, обработанные 100 мкл ФСБ через хвостовую вену; красные квадраты: мыши, обработанные T-клетками с CD19-CAR; зеленые треугольники: мыши, обработанные трансдуцированными CAR CD33-1 T-клетками; перевернутые пурпурные треугольники: мыши, обработанные трансдуцированными CAR CD33-2 T-клетками; оранжевые ромбы: мыши, обработанные трансдуцированными CAR CD33-4 T-клетками; черные квадраты: мыши, обработанные трансдуцированными CAR CD33-5 T-клетками; коричневые треугольники: мыши, обработанные трансдуцированными CAR CD33-6 T-клетками; темно-синие кружки: мыши, обработанные трансдуцированными CAR CD33-7 T-клетками; и перевернутые темно-пурпурные треугольники: мыши, обработанные трансдуцированными CAR CD33-9 T-клетками.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

Единственное число относится к одному или более чем одному (то есть по меньшей мере к одному)объекту. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или более чем один элемент.

Термин "приблизительно" при ссылке на измеряемое значение, такое как количество, продолжительность времени и тому подобное, предназначен для того, чтобы охватить изменения, составляющие ±20%, или в некоторых случаях ±10%, или в некоторых случаях ±5%, или в некоторых случаях ±1%, или в некоторых случаях ±0,1%, от указанного значения, если такие изменения являются подходящими для выполнения раскрытых способов.

Термин "химерный антигенный рецептор" или, альтернативно, "CAR" относится к рекомбинантной полипептидной конструкции, содержащей по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен (также обозначаемый в настоящем документе как "внутриклеточный сигнальный домен"), содержащий функциональный сигнальный домен, происходящий от стимулирующей молекулы, как определено ниже. В некоторых вариантах осуществления домены в полипептидной конструкции CAR расположены в одной и той же полипептидной цепи, например, содержат химерный белок слияния. В некоторых вариантах осуществления домены в полипептидной конструкции CAR не соприкасаются друг с другом, например, расположены в различных полипептидных цепях, например, как предложено в RCAR, описанном в настоящем документе.

В одном аспекте стимулирующая молекула CAR представляет собой дзета-цепь, ассоциированную с T-клеточным рецепторным комплексом. В одном аспекте цитоплазматический сигнальный домен содержит первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен из CD3-дзета). В одном аспекте цитоплазматический сигнальный домен дополнительно содержит один или несколько функциональных сигнальных доменов, происходящих от по меньшей мере одной костимулирующей молекулы, как определено ниже. В одном аспекте костимулирующую молекулу выбирают из 4 1BB (то есть CD137), CD27, ICOS и/или CD28. В одном аспекте CAR содержит химерный белок слияния, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, происходящий от стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит химерный белок слияния, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, происходящий от костимулирующей молекулы, и функциональный сигнальный домен, происходящий от стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит химерный белок слияния, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий два функциональных сигнальных домена, происходящих от одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домен, происходящий от стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит химерный белок слияния, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий по меньшей мере два функциональных сигнальных домена, происходящих от одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домен, происходящий от стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит необязательную лидерную последовательность на N-конце (N-ter) белка слияния CAR. В одном аспекте CAR дополнительно содержит лидерную последовательность на N-конце внеклеточного антигенраспознающего домена, причем лидерная последовательность, необязательно, отщепляется от антигенраспознающего домена (например, aa scFv) во время клеточного процессинга и локализации CAR в клеточной мембране.

CAR, который содержит антигенсвязывающий домен (например, scFv, однодоменное антитело или TCR (например, связывающий домен TCR-альфа или связывающий домен TCR-бета)), который воздействует на специфический опухолевый маркер X, причем X может представлять собой опухолевый маркер, как описано в настоящем документе, также называется XCAR. Например, CAR, который содержит антигенсвязывающий домен, который воздействует на CD33, называется CD33CAR. CAR может экспрессироваться в любой клетке, например, иммунной эффекторной клетке, как описано в настоящем документе (например, T-клетке или NK-клетке).

Термин "сигнальный домен" относится к функциональной части белка, которая действует посредством передачи информация внутри клетки для регуляции клеточной активности через определенные сигнальные пути, генерируя вторичные мессенджеры или функционируя в качестве эффекторов, отвечая на такие мессенджеры.

Как используется в настоящем документе, термин "CD33" относится к белку кластер дифференцировки 33, который представляет собой антигенную детерминанту, детектируемую на лейкозных клетках, а также на нормальных клетках-предшественниках миелоидной линии дифференцировки. Человеческие и мышиные аминокислотные и нуклеиновокислотные последовательности могут быть найдены в публичной базе данных, такой как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, аминокислотная последовательность человеческого CD33 может быть найдена под № доступа P20138 UniProt/Swiss-Prot, а нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий CD33, может быть найдена под № доступа NM_001772.3. В одном аспекте антигенсвязывающая часть CAR распознает и связывает эпитоп внутри внеклеточного домена белка CD33 или его фрагментов. В одном аспекте белок CD33 экспрессируется на раковой клетке. Как используется в настоящем документе, "CD33" включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки, делеции и варианты сплайсинга полноразмерного CD33 дикого типа.

Термин "антитело", как используется в настоящем документе, относится к белковой или полипептидной последовательности, происходящей от иммуноглобулиновой молекулы, которая специфически связывается с антигеном. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными, много- или одноцепочечными или представлять собой интактные иммуноглобулины и могут происходить из природных источников или из рекомбинантных источников. Антитела могут представлять собой тетрамеры иммуноглобулиновых молекул.

Термин "фрагмент антитела" относится к по меньшей мере одной части интактного антитела или ее рекомбинантным вариантам и относится к антигенсвязывающему домену, например, определяющей антиген вариабельной области интактного антитела, которого достаточно для придания фрагменту антитела распознавания и специфического связывания с мишенью, такой как антиген. Примеры фрагментов антител включают, но без ограничения, фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv, фрагменты антител scFv, линейные антитела, однодоменные антитела, такие как sdAb (или VL, или VH), верблюжьи домены VHH и мультиспецифические молекулы, образованные из фрагментов антител, такие как двухвалентный фрагмент, содержащий два или более, например, два, фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области, или две или более, например, две, выделенные CDR, или другие связанные связывающие эпитоп фрагменты антитела. Фрагмент антитела может также быть введен в однодоменные антитела, макситела, минитела, нанотела, интратела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и бис-scFv (смотри, например, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Фрагменты антител можно также прививать на каркасы, основанные на полипептидах, такие как фибронектин типа III (Fn3) (смотри патент США № 6703199, который описывает минитела с фибронектиновым полипептидом).

Термин "scFv" относится к белку слияния, содержащему по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область легкой цепи, и по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, причем вариабельные области легкой и тяжелой цепи связаны рядом посредством короткого гибкого полипептидного линкера и способны экспрессироваться как одноцепочечный полипептид, и причем scFv сохраняет специфичность интактного антитела, от которого он происходит. Если не указано, как используется в настоящем документе, scFv может содержать вариабельные области VL и VH в любом порядке, например, по отношению к N-концевой и C-концевой областям полипептида scFv может содержать VL-линкер-VH или может содержать VH-линкер-VL.

Термины "определяющая комплементарность область" или "CDR", как используется в настоящем документе, относятся к последовательностям аминокислот в вариабельных областях антитела, которые придают антигенную специфичность и аффинность связывания. Например, в общем случае, есть три CDR в каждой вариабельной области тяжелой цепи (например, HCDR1, HCDR2 и HCDR3) и три CDR в каждой вариабельной области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3). Точные границы аминокислотной последовательности заданной CDR могут быть определены с использованием любой из ряда хорошо известных схем, включая описанные Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации Кэбота), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273927-948 (схема нумерации Чотиа), или их комбинации. В соответствии со схемой нумерации Кэбота в некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене (VH) тяжелой цепи нумеруют как 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); а аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене (VL) легкой цепи нумеруют 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3). В соответствии со схемой нумерации Чотиа в некоторых вариантах осуществления аминокислоты CDR в VH нумеруют 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); а аминокислотные остатки CDR в VL нумеруют 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3). В объединенной схеме нумерации Кэбота и Чотиа в некоторых вариантах осуществления CDR соответствуют аминокислотным остаткам, которые являются частью CDR Кэбота, CDR Чотиа или обеих. Например, в некоторых вариантах осуществления CDR соответствуют аминокислотным остаткам 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в VH, например, VH млекопитающего, например, человеческом VH; и аминокислотным остаткам 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в VL, например, VL млекопитающего, например, человеческом VL.

Часть композиции CAR настоящего изобретения, содержащая антитело или его фрагмент антитела, может существовать во множестве форм, например, в которых антигенсвязывающий домен экспрессируется как часть полипептидной цепи, включая, например, фрагмент однодоменного антитела (sdAb), одноцепочечное антитело (scFv) или, например, гуманизированное или человеческое антитело (Harlow et al., 1999, в Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, в Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). В одном аспекте антигенсвязывающий домен композиции CAR настоящего изобретения содержит фрагмент антитела. В другом аспекте CAR содержит фрагмент антитела, который содержит scFv.

Как используется в настоящем документе, термин "связывающий домен" или "молекула антитела" относится к белку, например, иммуноглобулиновой цепи или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере одну последовательность иммуноглобулинового вариабельного домена. Термин "связывающий домен" или "молекула антитела" охватывает антитела и фрагменты антител. В варианте осуществления молекула антитела представляет собой мультиспецифическую молекулу антитела, например, она содержит множество последовательностей иммуноглобулиновых вариабельных доменов, причем первая последовательность иммуноглобулинового вариабельного домена из множества имеет специфичность связывания к первому эпитопу, и вторая последовательность иммуноглобулинового вариабельного домена из множества имеет специфичность связывания ко второму эпитопу. В варианте осуществления мультиспецифическая молекула антитела представляет собой биспецифическую молекулу антитела. Биспецифическое антитело имеет специфичность не более чем к двум антигенам. Биспецифическая молекула антитела характеризуется первой последовательностью иммуноглобулинового вариабельного домена, которая имеет специфичность связывания к первому эпитопу, и второй последовательностью иммуноглобулинового вариабельного домена, которая имеет специфичность связывания ко второму эпитопу.

Термин "тяжелая цепь антитела" относится к большей из полипептидных цепей двух типов, присутствующих в молекулах антител в их природных конформациях, которая обычно определяет класс, к которому принадлежит антитело.

Термин "легкая цепь антитела" относится к меньшей из полипептидных цепей двух типов, присутствующих в молекулах антител в их природных конформациях. Легкие цепи каппа (κ) и лямбда (λ) соотносятся с двумя главными изотипами легкой цепи антитела.

Термин "рекомбинантное антитело" относится к антителу, которое создано с использованием технологии рекомбинантной ДНК, такому как, например, антитело, экспрессируемое системой экспрессии бактериофагов или дрожжей. Данный термин также следует интерпретировать как означающий антитело, которое было создано посредством синтеза молекулы ДНК, кодирующей антитело, причем молекула ДНК экспрессирует белок антитела или аминокислотную последовательность, определяющую антитело, причем ДНК или аминокислотная последовательность были получены с использованием технология рекомбинантной ДНК или аминокислотной последовательности, которая доступна и хорошо известна в данной области техники.

Термин "антиген" или "Ag" относится к молекуле, которая вызывает иммунный ответ. Данный иммунный ответ может включать в себя или производство антител, или активацию специфических иммунологически компетентных клеток, или и то, и другое. Специалисту будет понятно, что любая макромолекула, включая практически все белки или пептиды, может служить антигеном. Кроме того, антигены могут быть получены из рекомбинантной или геномной ДНК. Специалисту будет понятно, что любая ДНК, которая содержит нуклеотидные последовательности или частичную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который вызывает иммунный ответ, тем самым кодирует "антиген", как этот термин используют в настоящем документе. Кроме того, специалисту в данной области техники будет понятно, что антиген не обязательно кодируется исключительно полноразмерной нуклеотидной последовательностью гена. Совершенно очевидно, что настоящее изобретение включает в себя, но без ограничения, использование частичных нуклеотидных последовательностей из более чем одного гена, и что эти нуклеотидные последовательности расположены в различных комбинациях для кодирования полипептидов, которые вызывают желаемый иммунный ответ. Кроме того, специалисту будет понятно, что антиген вообще не обязательно закодирован "геном". Совершенно очевидно, что антиген может быть создан синтезом или может быть получен из биологического образца, или может представлять собой макромолекулу, отличную от полипептида. Такой биологический образец может включать, но без ограничения, образец ткани, образец опухоли, клетку или жидкость с другими биологическими компонентами.

Термин "противоопухолевый эффект" относится к биологическому эффекту, который может проявляться различными способами, включая, но без ограничения, например, уменьшение объема опухоли, уменьшение количества опухолевых клеток, уменьшение количества метастазов, увеличение продолжительности жизни, снижение пролиферации опухолевых клеток, уменьшение выживаемости опухолевых клеток или ослабление различных физиологических симптомов, ассоциированных с раковым состоянием. "Противоопухолевый эффект" также может проявляться в первую очередь в способности пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител настоящего изобретения предупреждать возникновение опухоли.

Термин "противораковый эффект" относится к биологическому эффекту, который может проявляться различными способами, включая, но без ограничения, например, уменьшение объема опухоли, уменьшение количества раковых клеток, уменьшение количества метастазов, увеличение продолжительности жизни, снижение пролиферации раковых клеток, уменьшение выживаемости раковых клеток или ослабление различных физиологических симптомов, ассоциированных с раковым состоянием. "Противораковый эффект" также может проявляться в первую очередь в способности пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител предупреждать возникновение рака. Термин "противоопухолевый эффект" относится к биологическому эффекту, который может проявляться различными способами, включая, но без ограничения, например, уменьшение объема опухоли, уменьшение количества опухолевых клеток, снижение пролиферации опухолевых клеток или уменьшение выживаемости опухолевых клеток.

Термин "аутологичный" относится к любому материалу, происходящему от того же индивидуума, которому он должен быть позже повторно введен.

Термин "аллогенный" относится к любому материалу, происходящему от другого животного того же вида, что и индивидуум, которому вводят данный материал. Двух или более индивидуумов называют аллогенными друг другу, когда гены в одном или нескольких локусах не идентичны. В некоторых аспектах аллогенный материал от индивидуумов того же вида может достаточно отличаться генетически для антигенного взаимодействия.

Термин "ксеногенный" относится к трансплантату, полученному от животного другого вида.

Термин "аферез", как используется в настоящем документе, относится к принятому в данной области техники экстракорпоральному процессу, посредством которого кровь донора или пациента удаляют из донора или пациента и пропускают через приспособление, которое отделяет выбранный конкретный компонент(ы) и возвращает остальное в циркуляцию донора или пациента, например, посредством повторной трансфузии. Таким образом, в данном контексте "образец афереза" относится к образцу, полученному с использованием афереза.

Термин "комбинация" относится или к фиксированной комбинации в одной стандартной лекарственной форме, или к комбинированному введению, когда соединение настоящего изобретения и компонент комбинации (например, другой препарат, как рассмотрено ниже, также называемый "терапевтическим средством" или "дополнительным средством") могут быть введены независимо в одно и то же время или по-отдельности в пределах временных интервалов, особенно, когда эти временные интервалы позволяют компонентам комбинации демонстрировать совместный, например, синергистический, эффект. Одиночные компоненты могут быть упакованы в набор или по-отдельности. Один или оба из компонентов (например, порошки или жидкости) могут быть перед введением разведены или разбавлены до желаемой дозы. Предполагается, что термины "совместное введение" или "комбинированное введение" или тому подобное, как используются в настоящем документе, охватывают введение выбранного компонента комбинации одному субъекту, нуждающемуся в этом (например, пациенту), и предполагается, что они включают в себя схемы лечения, в которых средства необязательно вводят посредством одного и того же пути введения или в одно и то же время. Термин "фармацевтическая комбинация", как используется в настоящем документе, обозначает продукт, который получается из смешивания или объединения более чем одного активного ингредиента и включает в себя как фиксированные, так и нефиксированные комбинации активных ингредиентов. Термин "фиксированная комбинация" означает, что оба активных ингредиента, например, соединение настоящего изобретения и компонент комбинации, вводят пациенту одновременно в форме одной единицы или дозировки. Термин "нефиксированная комбинация" означает, что оба активных ингредиента, например, соединение настоящего изобретения и компонент комбинации, вводят пациенту в виде отдельных единиц или одновременно, в одно время, или последовательно без конкретных временных ограничений, причем такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни этих двух соединений в теле пациента. Последнее также применимо к коктейльной терапии, например, введению трех или более активных ингредиентов.

Термин "рак" относится к заболеванию, отличающемуся быстрым и неконтролируемым ростом аберрантных клеток. Раковые клетки могут распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части тела. Примеры различных раков описаны в настоящем документе и включают, но без ограничения, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак кожи, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак почек, рак печени, рак головного мозга, лимфому, лейкоз, рак легкого и тому подобное. Термины "опухоль" и "рак" используются в настоящем документе взаимозаменяемо, например, оба термна охватывают твердые и жидкие, например, диффузные или циркулирующие, опухоли. Как используется в настоящем документе, термин "рак" или "опухоль" включает предзлокачественные, а также злокачественные раки и опухоли.

"Происходящий от", как этот термин используют в настоящем документе, указывает на взаимосвязь между первой и второй молекулой. Он в общем относится к структурному сходству между первой молекулой и второй молекулой и не определяет или включает в себя ограничение в отношении процесса или источника для первой молекулы, которая происходит от второй молекулы. Например, в случае внутриклеточного сигнального домена, который происходит от молекулы CD3-дзета, внутриклеточный сигнальный домен сохраняет достаточную структуру CD3-дзета, так что обладает требуемой функцией, а именно способностью генерировать сигнал в соответствующих условиях. Он не определяет или включает в себя ограничение в отношении конкретного процесса производства внутриклеточного сигнального домена, например, он не означает, что для получения внутриклеточного сигнального домена следует начинать с последовательности CD3-дзета и удалять нежелательную последовательность или вводить мутации, чтобы прийти к внутриклеточному сигнальному домену.

Фраза "заболевание, ассоциированное с экспрессией CD33", как используется в настоящем документе, включает в себя, но без ограничения, заболевание, ассоциированное с клеткой, которая экспрессирует CD33 (например, дикого типа или мутантный CD33), или состояние, ассоциированное с клеткой, которая экспрессирует CD33 (например, дикого типа или мутантный CD33), включая, например, пролиферативное заболевание, такое как рак или злокачественная опухоль, или предраковое состояние, такое как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз; или не связанный с раком симптом, ассоциированный с клеткой, которая экспрессирует CD33 (например, дикого типа или мутантный CD33). Во избежание сомнений, заболевание, ассоциированное с экспрессией CD33, может включать состояние, ассоциированное с клеткой, которая в настоящий момент не экспрессирует CD33, например, потому, что экспрессия CD33 подверглась понижающей регуляции, например, благодаря лечению с помощью молекулы, воздействующей на CD33, например, ингибитора CD33, описанного в настоящем документе, но которая в свое время экспрессировала CD33. В одном аспекте рак, ассоциированный с экспрессией CD33 (например, дикого типа или мутантного CD33), представляет собой гематологический рак. В одном аспекте гематологический рак включает, но без ограничения, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), миелодисплазию и миелодиспластический синдром, миелофиброз и миелопролиферативные новообразования, острый лимфоидный лейкоз (ОЛЛ), волосистоклеточный лейкоз, пролимфоцитарный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток и тому подобное. Другие заболевания, ассоциированные с экспрессией CD33 (например, дикого типа или мутантного CD33), включают, но без ограничения, например, атипичные и/или неклассические раки, злокачественные опухоли, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, ассоциированные с экспрессией CD33 (например, дикого типа или мутантного CD33). Также могут быть включены не связанные с раком симптомы, ассоциированные с экспрессией CD33 (например, дикого типа или мутантного CD33). В вариантах осуществления не связанный с раком симптом, ассоциированный с экспрессией CD33, включает, но без ограничения, например, аутоиммунное заболевание, (например, волчанку), воспалительные нарушения (аллергию и астму) и трансплантацию. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующая опухолевый антиген клетка экспрессирует, или в любой момент времени экспрессировала, мРНК, кодирующую опухолевый антиген. В варианте осуществления экспрессирующая опухолевый антиген клетка производит белок опухолевого антигена (например, дикого типа или мутантный), и белок опухолевого антигена может присутствовать на нормальном уровне или на пониженном уровне. В варианте осуществления экспрессирующая опухолевый антиген клетка производила детектируемые уровни белка опухолевого антигена в один момент, и впоследствии по существу не производила детектируемого белка опухолевого антигена.

Термин "консервативные модификации последовательности" относится к модификациям аминокислот, которые не воздействуют или не изменяют значительно характеристики связывания антитела или фрагмента антитела, содержащего данную аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, присоединения и делеции. Модификации могут быть введены в антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения посредством стандартных методов, известных в данной области техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативными являются замены, в которых аминокислотный остаток заменяется на аминокислотный остаток, имеющий схожую боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в CAR настоящего изобретения могут быть заменены другими аминокислотными остатками из того же семейства боковых цепей, и измененный CAR может быть подвергнут тестированию с использованием функциональных анализов, описанных в настоящем документе.

Термин "стимуляция" относится к первичному ответу, индуцируемому связыванием стимулирующей молекулы (например, комплекса TCR/CD3) с ее когнатным лигандом, что опосредует событие трансдукции сигнала, такое как, но без ограничения, трансдукция сигнала посредством комплекса TCR/CD3. Стимуляция может опосредовать изменение экспрессии некоторых молекул, такое как понижающая регуляция TGF-β и/или реорганизация структур цитоскелета, и тому подобное.

Термин "стимулирующая молекула" относится к молекуле, экспрессируемой T-клеткой, которая обеспечивает первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность(и), которая регулирует первичную активацию комплекса TCR стимулирующим образом для по меньшей мере некоторых аспектов T-клеточного сигнального пути. В одном аспекте первичный сигнал инициируется, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, нагруженной пептидом, что ведет к опосредованию T-клеточного ответа, включая, но без ограничения, пролиферацию, активацию, дифференцировку и тому подобное. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность (также называемая "первичным сигнальным доменом"), которая действует стимулирующим образом, может содержать сигнальный мотив, который известен как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM. Примеры содержащих ITAM первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей, которые особенно полезны в настоящем изобретении, включают, но без ограничения, происходящие от TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как "ICOS"), FcεRI и CD66d, DAP10 и DAP12. В конкретных CAR настоящего изобретения внутриклеточный сигнальный домен в любом одном или нескольких CAR настоящего изобретения содержит внутриклеточную сигнальную последовательность, например, первичную сигнальную последовательность CD3-дзета. В конкретном CAR настоящего изобретения первичная сигнальная последовательность CD3-дзета представляет собой последовательность, определенную как SEQ ID NO: 9, или эквивалентные остатки из отличного от человека вида, например, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и тому подобных. В конкретном CAR настоящего изобретения первичная сигнальная последовательность CD3-дзета представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10, или эквивалентные остатки из отличного от человека вида, например, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и тому подобных.

Термин "антигенпрезентирующая клетка" или "APC" относится к клетке иммунной системы, такой как вспомогательная клетка (например, B-клетка, дендритная клетка и тому подобные), которая демонстриует чужеродный антиген в комплексе с главными комплексами гистосовместимости (ГКГС) на своей поверхности. T-клетки могут распознавать эти комплексы с использованием своих T-клеточных рецепторов (TCR). APC процессируют антигены и презентируют их T-клеткам.

"Внутриклеточный сигнальный домен", как этот термин используют в настоящем документе, относится к внутриклеточной части молекулы. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен трансдуцирует сигнал эффекторной функции и направляет клетку к выполнению специализированной функции. Хотя может использоваться весь внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях нет необходимости в использовании всей цепи. Если используют усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, такая усеченная часть может быть использована вместо интактной цепи в том случае, если она трансдуцирует сигнал эффекторной функции. Таким образом, предполагается, что термин внутриклеточный сигнальный домен включают в себя любую усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, достаточную для трансдукции сигнала эффекторной функции. Внутриклеточный сигнальный домен может генерировать сигнал, который стимулирует иммунную эффекторную функцию содержащей CAR клетки, например, CART-клетки или экспрессирующей CAR NK-клетки. Примеры иммунной эффекторной функции, например, в CART-клетке или экспрессирующей CAR NK-клетке, включают цитолитическую активность и хелперную активность, включая секрецию цитокинов.

В варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать первичный внутриклеточный сигнальный домен. Примеры первичных внутриклеточных сигнальных доменов включают происходящие от молекул, отвечающих за первичную стимуляцию или антиген-зависимую стимуляцию. В варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать костимулирующий внутриклеточный домен. Примеры костимулирующих внутриклеточных сигнальных доменов включают происходящие от молекул, отвечающих за костимулирующие сигналы или антиген-независимую стимуляцию. Например, в случае экспрессирующей CAR иммунной эффекторной клетки, например, CART-клетки или экспрессирующей CAR NK-клетки, первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность T-клеточного рецептора, и костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность от корецептора или костимулирующей молекулы.

Первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать сигнальный мотив, который известен как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM. Примеры содержащих ITAM первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают, но без ограничения, происходящие от CD3-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как "ICOS"), FcεRI и CD66d, DAP10 и DAP12.

Термин "дзета" или, альтернативно, "дзета-цепь", "CD3-дзета" или "TCR-дзета" определяют как белок, предлагаемый под № доступа в GenBank BAG36664.1, или эквивалентные остатки из отличного от человека вида, например, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и тому подобных, и "стимулирующий домен дзета" или, альтернативно, "стимулирующий домен из CD3-дзета" или "стимулирующий домен TCR-дзета" определяют как аминокислотные остатки из цитоплазматического домена дзета-цепи, которых достаточно для функциональной передачи начального сигнала, необходимого для активации T-клеток. В одном аспекте цитоплазматический домен дзета содержит остатки 52-164 в соответствии с № доступа в GenBank BAG36664.1 или эквивалентные остатки из отличного от человека вида, например, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и тому подобных, которые являются их функциональными ортологами. В одном аспекте "стимулирующий домен дзета" или "стимулирующий домен из CD3-дзета" представляет собой последовательность, определенную как SEQ ID NO: 9. В одном аспекте "стимулирующий домен дзета" или "стимулирующий домен из CD3-дзета" представляет собой последовательность, определенную как SEQ ID NO: 10.

Термин "костимулирующая молекула" относится к партнеру по когнатному связыванию на T-клетке, который специфически связывается с костимулирующим лигандом, тем самым опосредуя костимулирующий ответ T-клетки, такой как, но без ограничения, пролиферация. Костимулирующие молекулы являются молекулами клеточной поверхности, отличными от рецепторов антигенов или их лигандов, которые нужны для эффективного иммунного ответа. Костимулирующие молекулы включают, но без ограничения, молекулу ГКГС класса I, белки-рецепторы ФНО, иммуноглобулин-подобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные лимфоцит-активирующие молекулы (SLAM-белки), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, рецептор толл-лиганда, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается с CD83.

Костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен относится к внутриклеточной части костимулирующей молекулы.

Внутриклеточный сигнальный домен может содержать всю внутриклеточную часть или весь нативный внутриклеточный сигнальный домен молекулы, от которой он происходит, или его функциональный фрагмент.

Термин "4-1BB" относится к члену суперсемейства TNFR с аминокислотной последовательностью, предлагаемой под № доступа в GenBank AAA62478.2, или эквивалентным остаткам из отличного от человека вида, например, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и тому подобных; и "костимулирующий домен из 4-1BB" определяют как аминокислотные остатки 214-255 в № доступа в GenBank AAA62478.2 или эквивалентные остатки из отличного от человека вида, например, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и тому подобных. В одном аспекте "костимулирующий домен из 4-1BB" представляет собой последовательность, определенную как SEQ ID NO: 7, или эквивалентные остатки из отличного от человека вида, например, мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и тому подобных.

"Иммунная эффекторная клетка", как этот термин используют в настоящем документе, относится к клетке, которая участвует в иммунном ответе, например, в активации иммунного эффекторного ответа. Примеры иммунных эффекторных клеток включают в себя T-клетки, например, альфа/бета-T-клетки и гамма/дельта-T-клетки, B-клетки, клетки-естественные киллеры (NK), T-клетки-естественные киллеры (NKT), тучные клетки и фагоциты миелоидного происхождения.

"Иммунная эффекторная функция или иммунный эффекторный ответ", как этот термин используют в настоящем документе, относится к функции или ответу, например, иммунной эффекторной клетки, которые усиливают или стимулируют иммунную атаку клетки-мишени. Например, иммунные эффекторные функция или ответ относятся к свойству T или NK-клеток, которое стимулирует киллинг или ингибирование роста или пролиферации клетки-мишени. В случае T-клетки первичная стимуляция и костимуляция представляют собой примеры иммунной эффекторной функции или ответа.

Термин "эффекторная функция" относится к специальной функции клетки. Эффекторная функция T-клетки, например, может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов.

Термин "кодирующий" относится к свойству, присущему специфическим последовательностям нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, служить в качестве матриц для синтеза в биологических процессах других полимеров и макромолекул, имеющих или определенную последовательность нуклеотидов (например, рРНК, тРНК и мРНК), или определенную последовательность аминокислот и биологические свойства, проистекающие из них. Таким образом, ген, кДНК или РНК кодируют белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей этому гену, производит белок в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая нить, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно приводится в перечнях последовательностей, так и некодирующая нить, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут называться кодирующей белок или другой продукт этих гена или кДНК.

Если не указано иное, "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает в себя все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга, и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Фраза "нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК" может также включать в себя интроны, если нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может в некоторых вариантах содержать интрон(ы).

Термины "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" используются взаимозаменяемо в настоящем документе и относятся к количеству соединения, состава, материала или композиции, как описано в настоящем документе, эффективному для достижения определенного биологического результата.

Термин "эндогенный" относится к любому материалу из организма, клетки, ткани или системы, или производимому внутри них.

Термин "экзогенный" относится к любому материалу, введенному в организм, клетку, ткань или систему, или производимому снаружи от них.

Термин "экспрессия" относится к транскрипции и/или трансляции конкретной нуклеотидной последовательности, управляемой промотором.

Термин "вектор переноса" относится к композиции веществ, которая содержит выделенную нуклеиновую кислоту, и которую можно использовать для доставки выделенной нуклеиновой кислоты внутрь клетки. В данной области техники известны многочисленные векторы, включая, но без ограничения, линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, ассоциированные с ионными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы. Таким образом, термин "вектор переноса" включает в себя автономно реплицирующиеся плазмиду или вирус. Термин также следует интерпретировать как дополнительно включающий в себя неплазмидные и невирусные соединения, которые облегчают перенос нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, полилизиновое соединение, липосома и тому подобное. Примеры вирусных векторов переноса включают, но без ограничения, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы и тому подобное.

Термин "вектор экспрессии" относится к вектору, содержащему рекомбинантный полинуклеотид, содержащий контрольные последовательности экспрессии, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, подлежащей экспрессии. Вектор экспрессии содержит достаточно действующих в цис-положении элементов для экспрессии; другие элементы для экспрессии могут поставляться клеткой-хозяином или в системе in vitro экспрессии. Векторы экспрессии включают в себя все известные в данной области техники, включая космиды, плазмиды (например, оголенные или содержащиеся в липосомах) и вирусы (например, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые включают в себя рекомбинантный полинуклеотид.

Термин "лентивирус" относится к роду семейства Retroviridae. Лентивирусы являются уникальными среди ретровирусов в том, что они способны инфицировать неделящиеся клетки; они могут доставлять значительное количество генетической информации в ДНК клетки-хозяина, так что они являются одним наиболее эффективных способов вектора доставки генов. ВИЧ, SIV и FIV являются примерами лентивирусов.

Термин "лентивирусный вектор" относится к вектору, происходящему по меньшей мере частично от лентивирусного генома, в частности включая самоинактивирующийся лентивирусный вектор, как предложено в документе Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Другие примеры лентивирусных векторов, которые могут быть использованы в клинике, включают, но без ограничения, например, технологию доставки генов LENTIVECTOR® от Oxford BioMedica, векторную систему LENTIMAX™ от Lentigen и тому подобные. Неклинические типы лентивирусных векторов также доступны и должны быть известны специалисту в данной области техники.

Термин "гомологичный" или "идентичность" относятся к идентичности последовательностей субъединиц между двумя полимерными молекулами, например, между двумя молекулами нуклеиновой кислоты, такими как две молекулы ДНК или две молекулы РНК, или между двумя полипептидными молекулами. Когда положение субъединицы в обеих из двух молекул занято одной и той же мономерной субъединицей; например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то они гомологичны или идентичны в этом положении. Гомология между двумя последовательностями является непосредственной функцией количества совпадающих или гомологичных положений; например, если половина (например, пять положений в полимере длиной десять субъединиц) положений в двух последовательностях гомологичны, две последовательности гомологичны на 50%; если 90% положений (например, 9 из 10) совпадают или гомологичны, две последовательности гомологичны на 90%.

"Гуманизированные" формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую от нечеловеческого иммуноглобулина. По большей части гуманизированные антитела и их фрагменты антител представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело или фрагмент антитела), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменены на остатки из CDR отличного от человека вида (донорное антитело), такого как мышь, крыса или кролик, имеющие желаемую специфичность, аффинность и способность. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированное антитело/фрагмент антитела может содержать остатки которые, не обнаруживаются ни в реципиентном антителе, ни в импортированной CDR или каркасных последовательностях. Эти модификации могут дополнительно уточнять и оптимизировать активность антитела или фрагмента антитела. В общем случае, гуманизированное антитело или его фрагмент антитела будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из областей CDR соответствуют нечеловеческому иммуноглобулину и все или значительная часть областей FR имеют последовательность от человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело или фрагмент антитела могут также содержать по меньшей мере часть иммуноглобулиновой константной области (Fc), обычно от человеческого иммуноглобулина. Для дальнейших подробностей смотри Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

"Полностью человеческий" относится к иммуноглобулину, такому как антитело или фрагмент антитела, если вся молекула имеет человеческое происхождение или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной человеческой форме антитела или иммуноглобулин.

Термин "выделенный" означает измененный или удаленный из естественного состояния. например, нуклеиновая кислота или пептид естественно присутствующие в живом животном, не являются "выделенными", но те же самые нуклеиновая кислота или пептид частично или полностью отделенные от сопутствующих материалов их естественного состояния, являются "выделенными". Выделенные нуклеиновая кислота или белок могут существовать в по существу очищенной форме или могут существовать в ненативном окружении, таком как, например, клетка-хозяин.

В контексте настоящего изобретения используются следующие сокращения для часто встречающихся оснований нуклеиновой кислоты. "A" относится к аденозину, "C" относится к цитозину, "G" относится к гуанозину, "T" относится к тимидину, и "U" относится к уридину.

Термины "функционально связанный" или "транскрипционный контроль" относятся к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, приводящей к экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, если первая последовательность нуклеиновой кислоты помещена в функциональную взаимосвязь со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор воздействует на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Функционально связанные последовательности ДНК могут соприкасаться друг с другом и, например, если необходимо соединить две кодирующие белок области, находятся в одной и той же рамке считывания.

Термин "парентеральное" введение иммуногенной композиции включает, например, методы подкожной (п/к), внутривенной (в/в), внутримышечной (в/м) или интрастернальной инъекции, внутриопухолевый или инфузии.

Термины "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" относятся к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновым кислотам (РНК) и их полимерам или в одно- или в двухцепочечной форме. Если специально не оговорено, термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют связывающие свойства, аналогичные эталонной нуклеиновой кислоте, и метаболизируются аналогичным природным нуклеотидам образом. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также неявно охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также явно указанную последовательность. Если говорить конкретнее, замены вырожденных кодонов могут быть получены посредством создания последовательностей, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов заменено на остатки смешанного основания и/или дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Термины "пептид", "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо и относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и не налагается никаких ограничений на максимальное количество аминокислот, которое может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислоты, соединенные друг с другом пептидными связями. Как используется в настоящем документе, термин относится как к более коротким цепям, которые также обычно называют в данной области техники, например, пептидами, олигопептидми и олигомерами, так и к более длинным цепям, которые обычно называют в данной области техники белками, которых существует много типов. "Полипептиды" включают, например, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, белки слияния и другие. Полипептид включает природный пептид, рекомбинантный пептид или их комбинацию.

Термин "промотор" относится к последовательности ДНК, распознаваемой клетками аппарата синтеза или введенным аппаратом синтеза, необходимой для начала специфической транскрипции полинуклеотидной последовательности.

Термин "промотор/регуляторная последовательность" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая требуется для экспрессии продукта гена, функционально связанного с данными промотором/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях данная последовательность может представлять собой последовательность корового промотора, а в других случаях данная последовательность может также включать в себя последовательность энхансера и другие регуляторные элементы, который требуются для экспрессии продукта гена. Промотор/регуляторная последовательность может, например, представлять собой последовательность, экспрессирующую продукт гена ткань-специфическим образом.

Термин "конститутивный" промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая, когда функционально связана с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, вызывает производство продукта гена в клетке в большинстве или всех физиологических условиях клетки.

Термин "индуцируемый" промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая, когда функционально связана с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, вызывает производство продукта гена в клетке по существу только тогда, когда в клетке присутствует индуктор, который соответствует промотору.

Термин "ткань-специфический" промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая, когда функционально связана с полинуклеотидом, который кодирует или определяется геном, вызывает производство продукта гена в клетке по существу только тогда, когда клетка представляет собой клетку типа ткани, соответствующего промотору.

Термины "ассоциированный с раком антиген" или "опухолевый антиген" взаимозаменяемо относятся к молекуле (обычно белку, углеводу или липиду), которая экспрессируется на поверхности раковой клетки, или полностью, или в виде фрагмента (например, ГКГС/пептида), и которая полезна для преимущественного направления фармакологического средства на раковую клетку. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой маркер, экспрессируемый как нормальными клетками, так и раковыми клетками, например, маркер линии дифференцировки, например, CD19 на B-клетках. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая сверхэкспрессируется в раковых клетках по сравнению с нормальной клеткой, например, 1-кратно сверхэкспрессируется, 2-кратно сверхэкспрессируется, 3-кратно или более сверхэкспрессируется по сравнению с нормальной клеткой. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая неадекватно синтезируется в раковой клетке, например, молекулу, которая содержит делеции, присоединения или мутации по сравнению с молекулой, экспрессируемой на нормальной клетке. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген будет экспрессироваться исключительно на клеточной поверхности раковой клетки, полностью или в виде фрагмента (например, ГКГС/пептида), и не синтезироваться или экспрессироваться на поверхности нормальной клетки. В некоторых вариантах осуществления CAR настоящего изобретения включают в себя CAR, содержащие антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела), который связывается с презентируемым ГКГС пептидом. Обычно пептиды, происходящие от эндогенных белков, заполняют все карманы молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса I и распознаются T-клеточными рецепторами (TCR) на CD8+T-лимфоцитах. Комплексы ГКГС класса I конститутивно экспрессируются всеми ядросодержащими клетками. При раке вирус-специфические и/или опухоль-специфические комплексы пептид/ГКГС представляют уникальный класс мишеней клеточной поверхности для иммунотерапии. Были описаны TCR-подобные антитела, воздействующие на пептиды, происходящие от вирусных или опухолевых антигенов, в контексте человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)-A1 или HLA-A2 (смотри, например, Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608 ; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33 ; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). Например, TCR-подобное антитело может быть идентифицировано скринингом библиотеки, такой как библиотека фагового отображения человеческого scFv.

Термины "поддерживающий опухоль антиген" или "поддерживающий рак антиген" взаимозаменяемо относятся к молекуле (обычно белку, углеводу или липиду), который экспрессируется на поверхности клетки, который сам по себе не является раковым, но поддерживает раковые клетки, например, посредством стимуляции их роста или выживаемости, например, резистентности к иммунным клеткам. Примеры клеток данного типа включают стромальные клетки и супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC). Сам поддерживающий опухоль антиген не должен играть роль в поддержании опухолевых клеток до тех пор, пока антиген присутствует на клетке, которая поддерживает раковые клетки.

Термин "гибкий полипептидный линкер" или "линкер", как используется в контексте scFv, относится к пептидному линкеру, который состоит из аминокислот, таких как остатки глицина и/или серина, используемые по-отдельности или в комбинации, для связывания вместе вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи. В одном варианте осуществления гибкий полипептидный линкер представляет собой линкер Gly/Ser и содержит аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)_n (SEQ ID NO: 38), где n представляет собой положительное целое число, равное или большее чем 1. Например, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 и n=6, n=7, n=8, n=9 и n=10. В одном варианте осуществления гибкие полипептидные линкеры включают, но без ограничения, (Gly₄ Ser)₄ (SEQ ID NO: 27) или (Gly₄ Ser)₃ (SEQ ID NO: 28). В другом варианте осуществления линкеры включают множественные повторы (Gly₂Ser), (GlySer) или (Gly₃Ser) (SEQ ID NO: 29). Также в пределы объема настоящего изобретения включены линкеры, описанные в WO2012/138475, включенной в настоящий документ посредством ссылки.

Как используется в настоящем документе, 5'-кэп (также называемый кэп РНК, 7-метилгуанозиновый кэп РНК или кэп m⁷G РНК) представляет собой модифицированный нуклеотид гуанин, который присоединен к "переднему" или 5'-концу эукариотической информационной РНК вскоре после начала транскрипции. 5'-кэп состоит из концевой группы, которая связана с первым транскрибируемым нуклеотидом. Ее присутствие является критическим для распознавания рибосомой и защиты от РНКаз. Присоединение кэпа связано с транскрипцией и происходит котранскрипционно, так что они воздействуют друг на друга. Вскоре после начала транскрипции 5'-конец синтезируемой мРНК связывается синтезирующим кэп комплексом, ассоциированным с РНК-полимеразой. Этот ферментный комплекс катализирует химические реакции, которые необходимы для кэпирования мРНК. Синтез продолжается в виде многостадийной биохимической реакции. Кэпирующая группа может быть модифицирована для модулирования функциональных свойств мРНК, таких как ее стабильность или эффективность трансляции.

Как используется в настоящем документе, "транскрибируемая in vitro РНК" относится к РНК, предпочтительно мРНК, которая была синтезирована in vitro. Обычно транскрибируемая in vitro РНК генерируется из вектора in vitro транскрипции. Вектор in vitro транскрипции содержит матрицу, которая используется для генерирования транскрибируемой in vitro РНК.

Как используется в настоящем документе, "поли(A)" представляет собой ряд аденозинов, прикрепленных посредством полиаденилирования к мРНК. В предпочтительном варианте осуществления конструкта для временной экспрессии поли-A составляет между 50 и 5000 (SEQ ID NO: 30), предпочтительно, больше чем 64, более предпочтительно, больше чем 100, наиболее предпочтительно, больше чем 300 или 400. Поли(A)-последовательности могут быть модифицированы химически или ферментативно для модулирования функциональных свойств мРНК, таких как локализация, стабильность или эффективность трансляции.

Как используется в настоящем документе, "полиаденилирование" относится к ковалентной связи полиаденильного участка или его модифицированного варианта с молекулой информационной РНК. В эукариотических организмах большая часть молекул информационной РНК (мРНК) полиаденилированы с 3'-конца. 3'-поли(A)-хвост представляет собой длинную последовательность адениновых нуклеотидов (часто несколько сотен), присоединенных к пре-мРНК посредством действия фермента полиаденилатполимеразы. В высших эукариотах поли(A)-хвост присоединяется к транскриптам, которые содержат специфическую последовательность, сигнал полиаденилирования. Поли(A)-хвост и белковая связь с ним помогает защитить мРНК от деградации экзонуклеазами. Полиаденилирование также важно для терминации транскрипции, экспорта мРНК из ядра и трансляции. Полиаденилирование происходит в ядре непосредственно после транскрипции ДНК в РНК, но дополнительно может также происходить позже в цитоплазме. После терминации транскрипции цепь мРНК расщепляется действием эндонуклеазного комплекса, ассоциированного с РНК-полимеразой. Сайт расщепления обычно характеризуется присутствием последовательности оснований AAUAAA около сайта расщепления. После расщепления мРНК аденозиновые остатки присоединяются к свободному 3'-концу в сайте расщепления.

Как используется в настоящем документе, "временный" относится к экспрессии неинтегрированного трансгена в течение периода, составляющего часы, дни или недели, причем период времени экспрессии меньше, чем период времени экспрессии данного гена в случае интеграции в геном или содержания в стабильном плазмидном репликоне в клетке-хозяине.

Как используется в настоящем документе, термины "лечить" и "лечение" относятся к уменьшению или ослаблению прогрессирования, тяжести и/или продолжительности пролиферативного нарушения или ослаблению одного или нескольких симптомов (предпочтительно, одного или нескольких выраженных симптомов) пролиферативного нарушения, происходящих от введения одной или нескольких терапий (например, одного или нескольких терапевтических средств, таких как CAR настоящего изобретения). В конкретных вариантах осуществления термины "лечить" и "лечение" относятся к ослаблению по меньшей мере одного измеряемого физического параметра пролиферативного нарушения, такого как рост опухоли, не обязательно воспринимаемого пациентом. В других вариантах осуществления термины "лечить" и "лечение" относятся к ингибированию прогрессирования пролиферативного нарушения физически посредством, например, стабилизации выраженного симптома, физиологически посредством, например, стабилизации физического параметра, или и тем, и другим образом. В других вариантах осуществления термины "лечить" и "лечение" относятся к уменьшению или стабилизации размера опухоли или числа раковых клеток.

Термин "путь трансдукции сигнала" относится к биохимической взаимосвязи между множеством молекул трансдукции сигнала, которые играют роль в передаче сигнала из одной части клетки в другую часть клетки. Фраза "рецептор клеточной поверхности" включает в себя молекулы и комплексы молекул, способные к приему сигнала и передаче сигнала через мембрану клетки.

Предполагается, что термин "субъект" включает в себя живые организмы, у которых может быть вызван иммунный ответ (например, млекопитающие, люди).

Термин "по существу очищенная" клетка относится к клетке, которая по существу свободна от других типов клеток. По существу, очищенная клетка также относится к клетке, которая была отделена от клеток других типов, с которыми она обычно связана в своем естественном состоянии. В некоторых случаях популяция по существу очищенных клеток относится к однородной популяции клеток. В других случаях данный термин относится просто к клеткам, которые были отделены от клеток, с которыми они естественным образом связаны в своем естественном состоянии. В некоторых аспектах клетки культивируют in vitro. В других аспектах клетки не культивируют in vitro.

Термин "терапевтический", как используется в настоящем документе, означает лечение. Терапевтический эффект получают посредством уменьшения, супрессии, ремиссии или эрадикации болезненного заболевания.

Термин "профилактика", как используется в настоящем документе, означает предупреждение или защитное лечение заболевания или болезненного состояния.

В контексте настоящего изобретения "опухолевый антиген", или "антиген гиперпролиферативных нарушений", или "антиген, ассоциированный с гиперпролиферативным нарушением" относятся к антигенам, которые являются общими для конкретных гиперпролиферативных нарушений. В определенных аспектах антигены гиперпролиферативных нарушений настоящего изобретения происходят от раков, включая, но без ограничения, первичную или метастатическую меланому, тимому, лимфому, саркому, рак легкого, рак печени, неходжкинскую лимфому, ходжкинскую лимфому, лейкозы, рак матки, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак почек и аденокарциномы, такие как рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак поджелудочной железы и тому подобное.

Термин "трансфицированный", или "трансформированный", или "трансдуцированный" относится к процессу, посредством которого экзогенную нуклеиновую кислоту переносят или вводят в клетку-хозяина. "Трансфицированная", или "трансформированная", или "трансдуцированная" клетка представляет собой клетку, которая была трансфицирована, трансформирована или трансдуцирована экзогенной нуклеиновой кислотой. Клетка включает первичную клетку субъекта и ее потомство.

Термин "специфически связывает" относится к антителу или лиганду, который распознает белок-когнатный партнер по связыванию (например, стимулирующую и/или костимулирующую молекулу, презентированную на T-клетке), присутствующий в образце, и связывается с ним, причем эти антитело или лиганд по существу не распознают другие молекулы в образце или не связываются с ними.

"Регулируемый химерный антигенный рецептор (RCAR)", как используется в настоящем документе, относится к набору полипептидов, обычно двум в простейших вариантах осуществления, которые, находясь в иммунной эффекторной клетке, придают клетке специфичность к клетке-мишени, обычно раковой клетке, и генерацию внутриклеточных сигналов. В некоторых вариантах осуществления RCAR содержит по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен (также обозначаемый в настоящем документе как "внутриклеточный сигнальный домен"), содержащий функциональный сигнальный домен, происходящий от стимулирующей молекулы и/или костимулирующей молекулы, как определено в настоящем документе в контексте молекулы CAR. В некоторых вариантах осуществления набор полипептидов в RCAR не соприкасаются друг с другом, например, находятся в различных полипептидных цепях. В некоторых вариантах осуществления RCAR включает в себя переключатель димеризации, который в присутствии молекулы димеризации, может связывать полипептиды друг с другом, например, может связывать антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых вариантах осуществления RCAR экспрессируется в клетке (например, иммунной эффекторной клетке), как описано в настоящем документе, например, RCAR-экспрессирующей клетке (также обозначаемой в настоящем документе как "RCARX-клетка"). В варианте осуществления RCARX-клетка представляет собой T-клетку и называется RCART-клеткой. В варианте осуществления RCARX-клетка представляет собой NK-клетку и называется RCARN-клеткой. RCAR может придавать RCAR-экспрессирующей клетке специфичность к клетке-мишени, обычно раковой клетке, и регулируемую генерацию внутриклеточных сигналов или пролиферацию, что может оптимизировать иммунное эффекторное свойство RCAR-экспрессирующей клетки. В вариантах осуществления RCAR-клетка по меньшей мере частично опирается на антигенсвязывающий домен при придании специфичности к клетке-мишени, которая содержит антиген, связываемый антигенсвязывающим доменом.

"Мембранный якорь" или "связывающий с мембраной домен", как этот термин используют в настоящем документе, относится к полипептиду или фрагменту, например, миристоильной группе, достаточным для заякоревания внеклеточного или внутриклеточного домена к плазматической мембране.

"Домен-переключатель", как этот термин используют в настоящем документе, например, при ссылке на RCAR, относится к объекту, обычно полипептидному объекту, который в присутствии молекулы димеризации связывается с другим доменом-переключателем. Эта связь приводит к функциональному связыванию первого объекта, связанного, например, слитого, с первым доменом-переключателем, и второго объекта, связанного, например, слитого, со вторым доменом-переключателем. Первый и второй домены-переключатели вместе называются переключателем димеризации. В вариантах осуществления первый и второй домены-переключатели являются одинаковыми друг с другом, например, они представляют собой полипептиды, имеющие одинаковую первичную аминокислотную последовательность, и вместе называются переключателем гомодимеризации. В вариантах осуществления первый и второй домены-переключатели отличаются друг от друга, например, они представляют собой полипептиды, имеющие различные первичные аминокислотные последовательности, и вместе называются переключателем гетеродимеризации. В вариантах осуществления переключатель является внутриклеточным. В вариантах осуществления переключатель является внеклеточным. В вариантах осуществления домен-переключатель представляет собой полипептидный объект, например, на основе FKBP или FRB, и молекула димеризации представляет собой небольшую молекулу, например, рапалог. В вариантах осуществления домен-переключатель представляет собой полипептидный объект, например, scFv, который связывает пептид myc, и молекула димеризации представляет собой полипептид, его фрагмент или мультимер полипептида, например, лиганд myc или мультимеры лиганда myc, который связывается с одним или несколькими scFv к myc. В вариантах осуществления домен-переключатель представляет собой полипептидный объект, например, рецептор myc, и молекула димеризации представляет собой антитело или его фрагменты, например, антитело к myc.

"Молекула димеризации", как этот термин используют в настоящем документе, например, при ссылке на RCAR, относится к молекуле, которая стимулирует связь первого домена-переключателя со вторым доменом-переключателем. В вариантах осуществления молекула димеризации не встречается естественным образом у субъекта, или не встречается в концентрации, которая приводила бы к значительной димеризации. В вариантах осуществления молекула димеризации представляет собой небольшую молекулу, например, рапамицин или рапалог, например, RAD001.

Термин "биоэквивалентный" относится к количеству средства, отличного от эталонного соединения (например, RAD001), требуемому для произведения эффекта, эквивалентного эффекту, производимому эталонной дозой или эталонным количеством эталонного соединения (например, RAD001). В варианте осуществления эффект представляет собой уровень ингибирования mTOR, например, измеренный по ингибированию киназы P70 S6, например, оцененный в in vivo или in vitro анализе, например, измеренный с помощью анализа, описанного в настоящем документе, например, анализа Boulay или измерения уровней фосфорилированного S6 с помощью вестерн-блоттинга. В варианте осуществления эффект представляет собой изменение отношения PD-1-положительные/PD-1-отрицательные между иммунными эффекторными клетками, например, между T-клетками или NK-клетками, измеренное с помощью клеточной сортировки. В варианте осуществления биоэквивалентное количество или доза ингибитора mTOR представляют собой количество или дозу, которые дают такой же уровень ингибирования киназы P70 S6, как и эталонная доза или эталонное количество эталонного соединения. В варианте осуществления биоэквивалентное количество или доза ингибитора mTOR представляют собой количество или дозу, которые дают такой же уровень изменения отношения PD-1-положительные/PD-1-отрицательные между иммунными эффекторными клетками, например, между T-клетками или NK-клетками, как и эталонная доза или эталонное количество эталонного соединения.

Термин "низкая иммуностимулирующая доза" при использовании в сочетании с ингибитором mTOR, например, аллостерическим ингибитором mTOR, например, RAD001 или рапамицином, или каталитическим ингибитором mTOR, относится к дозе ингибитора mTOR, которая частично, но не полностью ингибирует активность mTOR, например, измеренную по ингибированию активности киназы P70 S6. Способы оценки активности mTOR, например, по ингибированию киназы P70 S6, рассмотрены в настоящем документе. Данная доза недостаточна для того, чтобы приводить к полной иммуносупрессии, но достаточна для усиления иммунного ответа. В варианте осуществления низкая иммуностимулирующая доза ингибитора mTOR приводит к уменьшению количества PD-1-положительных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, и/или увеличению количества PD-1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, или увеличению отношения PD-1-отрицательные иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки или NK-клетки)/PD-1-положительные иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки или NK-клетки).

В варианте осуществления низкая иммуностимулирующая доза ингибитора mTOR приводит к увеличению количества наивных T-клеток. В варианте осуществления низкая иммуностимулирующая доза ингибитора mTOR приводит к одному или нескольким из следующего:

увеличение экспрессии одного или нескольких из следующих маркеров: CD62L^high, CD127^high, CD27⁺ и BCL2, например, на T-клетках памяти, например, на предшественниках T-клеток памяти;

уменьшение экспрессии KLRG1, например, на T-клетках памяти, например, на предшественниках T-клеток памяти; и

увеличение количества предшественников T-клеток памяти, например, клеток с любой одной из следующих характеристик или их комбинацией: повышенный уровень CD62L^high, повышенный уровень CD127^high, повышенный уровень CD27⁺, пониженный уровень KLRG1 и повышенный уровень BCL2;

причем любое из изменений, описанных выше, происходит, например, по меньшей мере временно, например, по сравнению с не подвергавшимся лечению субъектом.

"Рефрактерный", как используется в настоящем документе, относится к заболеванию, например, раку, которое не отвечает на лечение. В вариантах осуществления рефрактерный рак может быть резистентным к лечению до или в начале лечения. В других вариантах осуществления рефрактерный рак может становиться резистентным во время лечения. Рефрактерный рак также называют резистентным раком.

"Рецидивирующий" или "рецидив", как используется в настоящем документе, относится к повторному появлению заболевания (например, рака) или признаков и симптомов заболевания, такого как рак, после периода улучшения или реагирования, например, после предшествующего лечения с помощью терапии, например, терапии рака. Например, в период реагирования уровень раковых клеток может падать ниже определенного порога, например, ниже 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. При повторном появлении уровень раковых клеток может подниматься выше определенного порога, например, выше 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%.

Диапазоны: на протяжении настоящего раскрытия различные аспекты настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазонов. Следует понимать, что описание в формате диапазонов дано только для удобства и краткости и не должно рассматриваться в качестве негибкого ограничения объема настоящего изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как конкретно раскрывающее все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в пределах этого диапазона. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, следует рассматривать как конкретно раскрывающее такие поддиапазоны, как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и так далее, а также отдельные числовые значения в пределах этого диапазона, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. В качестве другого примера, диапазон, такой как идентичность на 95-99%, включает в себя что-либо с идентичностью на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, и включает в себя такие поддиапазоны как идентичность на 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% и 98-99%. Это применяется независимо от ширины диапазона.

Описание

В настоящем описании предлагаются композиции веществ и способы применения для лечения или предупреждения заболеваний, таких как рак, с использованием химерных антигенных рецепторов (CAR) к CD33.

В одном аспекте настоящее изобретение предлагает ряд химерных антигенных рецепторов (CAR), содержащих антитело или фрагмент антитела, сконструированные для специфического связывания с белком CD33 или его фрагментами. В одном аспекте настоящее изобретение предлагает клетку (например, иммунную эффекторную клетку, например, T-клетку или NK-клетку), сконструированную для экспрессии CAR, причем данная клетка (например, "CART") проявляет противоопухолевое свойство. В одном аспекте клетку трансформируют с помощью CAR, и по меньшей мере часть CAR экспрессируется на клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления клетку (например, иммунную эффекторную клетку, например, T-клетку или NK-клетку) трансдуцируют с помощью вирусного вектора, кодирующего CAR. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. В некоторых таких вариантах осуществления клетка может стабильно экспрессировать CAR. В другом варианте осуществления клетку (например, иммунную эффекторную клетку, например, T-клетку или NK-клетку) трансфицируют нуклеиновой кислотой, например, мРНК, кДНК, ДНК, кодирующей CAR. В некоторых таких вариантах осуществления клетка может временно экспрессировать CAR.

В одном аспекте CD33-связывающий домен, например, человеческий или гуманизированный связывающий CD33 домен, в CAR представляет собой фрагмент антитела scFv. В одном аспекте такие фрагменты антител функциональны в том, что они сохраняют эквивалентную аффинность связывания, например, они связывают один и тот же антиген с эффективностью, сравнимой с антителом IgG, имеющим такие же вариабельные области тяжелой и легкой цепи. В одном аспекте такие фрагменты антител функциональны в том, что они обеспечивают биологический ответ, который может включать в себя, но без ограничения, активацию иммунного ответа, ингибирование возникновения трансдукции сигнала от их антигенов-мишеней, ингибирование киназной активности и тому подобное, как будет понятно специалисту.

В некоторых аспектах антитела настоящего изобретения включены в химерный антигенный рецептор (CAR). В одном аспекте CAR содержит полипептидную последовательность, приведенную в настоящем документе как SEQ ID NO: 48-56.

В одном аспекте часть CD33-связывающего домена, например, гуманизированного или человеческого связывающего CD33 домена, в CAR настоящего изобретения кодируется трансгеном, последовательность которого была кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке млекопитающего. В одном аспекте весь конструкт CAR настоящего изобретения кодируется трансгеном, вся последовательность которого была кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке млекопитающего. Оптимизация кодонов относится к тому открытию, что частота встречаемости синонимичных кодонов (то есть, кодонов, которые кодируют одну и ту же аминокислоту) в кодирующей ДНК в различных видах смещена. Такое вырождение кодонов делает возможным кодирование идентичного полипептида с помощью множества нуклеотидных последовательностей. Множество способов оптимизации кодонов известны в данной области техники и включают, например, способы, раскрытые по меньшей мере в патентах США №№ 5786464 и 6114148.

В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен содержит часть scFv, приведенную в SEQ ID NO: 39-47. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен содержит часть scFv, приведенную в SEQ ID NO: 39. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен содержит часть scFv, приведенную в SEQ ID NO: 40. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен содержит часть scFv, приведенную в SEQ ID NO: 41. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен содержит часть scFv, приведенную в SEQ ID NO: 42. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен содержит часть scFv, приведенную в SEQ ID NO: 43. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен содержит часть scFv, приведенную в SEQ ID NO: 44. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен содержит часть scFv, приведенную в SEQ ID NO: 45. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен содержит часть scFv, приведенную в SEQ ID NO: 46. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен содержит часть scFv, приведенную в SEQ ID NO: 47. В одном аспекте CAR настоящего изобретения объединяют антигенсвязывающий домен специфического антитела с внутриклеточной сигнальной молекулой. Например, в некоторых аспектах внутриклеточная сигнальная молекула включает, но без ограничения, сигнальные модули CD3-дзета-цепь, 4-1BB и CD28 и их комбинации. В одном аспекте антигенсвязывающий домен связывается с CD33. В одном аспекте CAR к CD33 содержит CAR, выбранный из последовательности, приведенной в одной или нескольких из SEQ ID NO: 48-56. В одном аспекте CAR к CD33 содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48. В одном аспекте CAR к CD33 содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49. В одном аспекте CAR к CD33 содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 50. В одном аспекте CAR к CD33 содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 51. В одном аспекте CAR к CD33 содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 52. В одном аспекте CAR к CD33 содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 53. В одном аспекте CAR к CD33 содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 54. В одном аспекте CAR к CD33 содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 55. В одном аспекте CAR к CD33 содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 56.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает композиции CAR к CD33 и их применение в лекарственных средствах или способах лечения, помимо других заболеваний, рака или любой злокачественной опухоли или аутоиммунных заболеваний с участием клеток или тканей, которые экспрессируют CD33.

В одном аспекте CAR настоящего изобретения можно использовать для эрадикации CD33-экспрессирующих нормальных клеток, и тем самым он применим для использования в качестве клеточной кондиционирующей терапии перед клеточной трансплантацией или другой подходящей терапией. Клеточная трансплантация включает в себя трансплантацию стволовых клеток, например, трансплантацию гематопоэтических стволовых клеток, и трансплантацию костного мозга. Клеточная трансплантация является аллогенной или аутологичной. В вариантах осуществления CAR настоящего изобретения уничтожает CD33-экспрессирующие нормальные клетки, или CD33-экспрессирующие раковые клетки, или и те, и другие, перед клеточной трансплантацией или другой подходящей терапией. В одном аспекте CD33-экспрессирующая нормальная клетка представляет собой CD33-экспрессирующую миелоидную клетку-предшественник, и клеточная трансплантация представляет собой трансплантацию стволовых клеток.

В одном аспекте настоящее изобретение предлагает клетку (например, иммунную эффекторную клетку, например, T-клетку или NK-клетку), сконструированную для экспрессии химерного антигенного рецептора (например, иммунную эффекторную клетку, например, T-клетку или NK-клетку, например, CART) настоящего изобретения, причем клетка (например, иммунная эффекторная клетка, например, T-клетка или NK-клетка, например, "CART") проявляет противоопухолевое свойство. Соответственно, настоящее изобретение предлагает CD33-CAR, который содержит CD33-связывающий домен и введен методами генной инженерии в клетку (например, иммунную эффекторную клетку, например, T-клетку или NK-клетку), и способы их использования для адоптивной терапии.

В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR содержит человеческое антитело или фрагмент антитела к CD33. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR содержит гуманизированное антитело или фрагмент антитела к CD33. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR содержит фрагмент человеческого антитела к CD33, содержащий scFv. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR представляет собой человеческий scFv к CD33. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR содержит фрагмент гуманизированного антитела к CD33, содержащий scFv. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR представляет собой гуманизированный scFv к CD33.

В одном аспекте CD33-CAR содержит по меньшей мере один внутриклеточный домен, например, описанный в настоящем документе, например, выбранный из группы из сигнального домена из CD137 (4-1BB), сигнального домена из CD28, сигнального домена из CD3-дзета и любой их комбинации. В одном аспекте CD33-CAR содержит по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен от одной или нескольких костимулирующих молекул, отличных от CD137 (4-1BB) или CD28.

Химерный антигенный рецептор (CAR)

Настоящее изобретение предлагает также CAR (например, полипептид CAR), который содержит анти-CD33-связывающий домен (например, CD33-связывающий домен, как описано в настоящем документе), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, причем упомянутый CD33-связывающий домен содержит определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (HC CDR3) в соответствии с любыми аминокислотными последовательностями связывающего домена тяжелой цепи, приведенными в таблице 8 или 9. CD33-связывающий домен CAR может дополнительно содержать определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (LC CDR3) в соответствии с любыми аминокислотными последовательностями связывающего домена тяжелой цепи, приведенными в таблице 8 или 9.

Настоящее изобретение предлагает также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR, описанный в настоящем документе, например, кодирующий CAR, который содержит CD33-связывающий домен (например, как описано в настоящем документе), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, причем упомянутый CD33-связывающий домен содержит определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (HC CDR3) в соответствии с любыми аминокислотными последовательностями связывающего домена тяжелой цепи, приведенными в таблице 8 или 9. В одном варианте осуществления кодируемый CD33-связывающий домен CAR может дополнительно содержать определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (LC CDR3) в соответствии с любыми аминокислотными последовательностями анти-BMCA связывающего домена тяжелой цепи, приведенными в таблице 8 или 9.

В конкретных аспектах конструкт CAR настоящего изобретения содержит домен человеческого scFv, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:39-47, причем перед scFv может находиться необязательная лидерная последовательность, такая как приведенная в SEQ ID NO: 1, а после него может следовать необязательная шарнирная последовательность, такая как приведенная в SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 5, трансмембранная область, такая как приведенная в SEQ ID NO: 6, внутриклеточный сигнальный домен, который включает в себя SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, и последовательность CD3-дзета, которая включает в себя SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, например, причем домены соприкасаются и находятся в одной и той же рамке считывания, образуя один белок слияния. Также в настоящее изобретение включена нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид каждого из человеческих фрагментов scFv, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39-47. Также в настоящее изобретение включена нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид каждого из человеческих фрагментов scFv, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39-47, и каждый из доменов в соответствии с SEQ ID NO: 12 и 6-9 и кодируемый CAR к CD33 настоящего изобретения.

В одном аспекте пример конструкта CD33CAR содержит необязательную лидерную последовательность, внеклеточный антигенсвязывающий домен, шарнир, трансмембранный домен и внутриклеточный стимулирующий домен. В одном аспекте пример конструкта CD33CAR содержит необязательную лидерную последовательность, внеклеточный антигенсвязывающий домен, шарнир, трансмембранный домен, внутриклеточный костимулирующий домен и внутриклеточный стимулирующий домен. Конкретные конструкты CAR к CD33, содержащие гуманизированные домены scFv настоящего изобретения, определены как SEQ ID NO: 138.

В некоторых вариантах осуществления полноразмерные последовательности CAR к CD33 также приведены в настоящем документе как SEQ ID NO: 48-56, как показано в таблице 8.

Типичная лидерная последовательность определена как SEQ ID NO: 1. Типичная последовательности шарнира/спейсера определена как SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 5. Типичная последовательность трансмембранного домена определена как SEQ ID NO: 6. Типичная последовательность внутриклеточного сигнального домена белка 4-1BB определена как SEQ ID NO: 7. Типичная последовательность внутриклеточного сигнального домена из CD27 определена как SEQ ID NO: 8. Типичная последовательность домена из CD3-дзета определена как SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.

В одном аспекте настоящее изобретение охватывает рекомбинантный нуклеиновокислотный конструкт, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, причем данная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CD33-связывающий домен, например, описанный в настоящем документе, например, который соприкасается и находится в одной рамке считывания с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей внутриклеточный сигнальный домен. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен выбирают из одной или нескольких из SEQ ID NO:39-47. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен представляет собой SEQ ID NO: 39. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен представляет собой SEQ ID NO: 40. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен представляет собой SEQ ID NO: 41. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен представляет собой SEQ ID NO: 42. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен представляет собой SEQ ID NO: 43. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен представляет собой SEQ ID NO: 44. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен представляет собой SEQ ID NO: 45. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен представляет собой SEQ ID NO: 46. В одном аспекте человеческий связывающий CD33 домен представляет собой SEQ ID NO: 47.

В одном аспекте последовательность нуклеиновой кислоты конструкта CAR настоящего изобретения выбирают из одной или нескольких из SEQ ID NO: 75-83. В одном аспекте последовательность нуклеиновой кислоты конструкта CAR содержит (например, состоит из нее) SEQ ID NO: 75. В одном аспекте последовательность нуклеиновой кислоты конструкта CAR содержит (например, состоит из нее) SEQ ID NO: 76. В одном аспекте последовательность нуклеиновой кислоты конструкта CAR содержит (например, состоит из нее) SEQ ID NO: 77. В одном аспекте последовательность нуклеиновой кислоты конструкта CAR содержит (например, состоит из нее) SEQ ID NO: 78. В одном аспекте последовательность нуклеиновой кислоты конструкта CAR содержит (например, состоит из нее) SEQ ID NO: 79. В одном аспекте последовательность нуклеиновой кислоты конструкта CAR содержит (например, состоит из нее) SEQ ID NO: 80. В одном аспекте последовательность нуклеиновой кислоты конструкта CAR содержит (например, состоит из нее) SEQ ID NO: 81. В одном аспекте последовательность нуклеиновой кислоты конструкта CAR содержит (например, состоит из нее) SEQ ID NO: 82. В одном аспекте последовательность нуклеиновой кислоты конструкта CAR содержит (например, состоит из нее) SEQ ID NO: 83.

Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие желаемые молекулы, могут быть получены с использованием рекомбинантных способов, известных в данной области техники, таких как, например, с помощью скрининга библиотек клеток, экспрессирующих данный ген, с помощью получения гена из вектора, о котором известно, что он включает его в себя, или с помощью выделения непосредственно из содержащих его клеток и тканей с использованием стандартных методов. В качестве альтернативы, представляющая интерес нуклеиновая кислота может быть произведена синтетически, а не клонирована.

Настоящее изобретение включает в себя ретровирусные и лентивирусные векторные конструкты, экспрессирующие CAR, которые могут быть непосредственно трансдуцированы в клетку.

Настоящее изобретение также включает в себя РНК-конструкт, который может быть непосредственно трансфицирован в клетку. Способ генерирования мРНК для использования в трансфекции включает в себя in vitro транскрипцию (IVT) матрицы со специально сконструированными праймерами, после чего следует присоединение поли-A для получения конструкта, содержащего 3'- и 5'-нетранслируемую последовательность ("НТО"), 5'-кэп и/или участок внутренней посадки рибосомы (IRES), подлежащую экспрессии нуклеиновую кислоту и поли-A хвост, обычно длиной 50-2000 оснований (SEQ ID NO: 35). Получаемая таким образом РНК может эффективно трансфицировать различные типы клеток. В одном варианте осуществления матрица включает в себя последовательности для CAR. В варианте осуществления вектор с РНК CAR трансдуцируют в клетку посредством электропорации.

Антигенсвязывающий домен

CAR настоящего изобретения содержат мишень-специфический связывающий элемент. Выбор фрагмента зависит от типа и количества лигандов, которые определяют поверхность клетки-мишени. Например, антигенсвязывающий домен может быть выбран для распознавания антигена, который действует как маркер клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированный с конкретным болезненным состоянием.

В одном аспекте CAR-опосредованный T-клеточный ответ может быть направлен на представляющий интерес антиген посредством конструирования антигенсвязывающего домена, который специфически связывает желаемый антиген в CAR.

В одном аспекте CAR настоящего изобретения содержит связывающий домен, который специфически связывается с CD33. В одном аспекте CAR настоящего изобретения содержит антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с человеческим CD33.

Антигенсвязывающий домен может представлять собой любой белок, который связывается с антигеном, включая, но без ограничения, моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело и их функциональный фрагмент, включая, но без ограничения, однодоменное антитело, такое как вариабельный домен (VH) тяжелой цепи, вариабельный домен (VL) легкой цепи и вариабельный домен (VHH) нанотела верблюжьего происхождения, и альтернативный каркас, о котором известно в данной области техники, что он функционирует в качестве антигенсвязывающего домена, такой как рекомбинантный фибронектиновый домен и тому подобные. В некоторых случаях полезно, чтобы антигенсвязывающий домен происходил от того вида, в котором CAR будет в конце концов использован. Например, для использования на людях может быть полезным, чтобы антигенсвязывающий домен CAR содержал человеческие или гуманизированные остатки для антигенсвязывающего домена антитела или фрагмента антитела.

В некоторых случаях полезно, чтобы антигенсвязывающий домен происходил от того вида, в котором CAR будет в конце концов использован. Например, для использования на людях может быть полезным, чтобы антигенсвязывающий домен CAR содержал человеческие или гуманизированные остатки для антигенсвязывающего домена антитела или фрагмента антитела. Таким образом, в одном аспекте антигенсвязывающий домен содержит человеческое антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления человеческий связывающий CD33 домен содержит одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющей комплементарность области 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющей комплементарность области 3 легкой цепи (LC CDR3) человеческого связывающего CD33 домена, описанного в настоящем документе, и/или одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (HC CDR3) человеческого связывающего CD33 домена, описанного в настоящем документе, например, человеческого связывающего CD33 домена, содержащего одну или несколько, например, все три, LC CDR и одну или несколько, например, все три, HC CDR. В одном варианте осуществления человеческий связывающий CD33 домен содержит одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (HC CDR3) человеческого связывающего CD33 домена, описанного в настоящем документе, например, человеческий связывающий CD33 домен содержит две вариабельные области тяжелой цепи, причем каждая содержит HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3, описанные в настоящем документе. В одном варианте осуществления человеческий связывающий CD33 домен содержит человеческую вариабельную область легкой цепи, описанную в настоящем документе (например, в таблице 2), и/или человеческую вариабельную область тяжелой цепи, описанную в настоящем документе (например, в таблице 1). В одном варианте осуществления человеческий связывающий CD33 домен содержит человеческую вариабельную область тяжелой цепи, описанную в настоящем документе (например, в таблице 1), например, по меньшей мере две человеческие вариабельные области тяжелой цепи, описанные в настоящем документе (например, в таблице 1). В одном варианте осуществления CD33-связывающий домен представляет собой scFv, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью в соответствии с таблицами 1-2. В варианте осуществления CD33-связывающий домен (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, приведенной в таблице 2, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности из таблицы 13; и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в таблице 2, или последовательность, идентичную на 95-99% аминокислотной последовательности из таблицы 1. В одном варианте осуществления человеческий связывающий CD33 домен содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39-47, или последовательность, идентичную ей на 95-99%. В одном варианте осуществления человеческий связывающий CD33 домен представляет собой scFv, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, например, в таблице 2, прикреплена к вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, например, в таблице 1, с помощью линкера, например, линкера, описанного в настоящем документе. В одном варианте осуществления человеческий связывающий CD33 домен включает в себя линкер (Gly4-Ser)n, причем n представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В одном аспекте антигенсвязывающий домен содержит гуманизированное антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления гуманизированный связывающий CD33 домен содержит одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющей комплементарность области 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющей комплементарность области 3 легкой цепи (LC CDR3) CD33-связывающего домена, описанного в настоящем документе, и/или одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (HC CDR3) CD33-связывающего домена, описанного в настоящем документе, например, гуманизированного связывающего CD33 домена, содержащего одну или несколько, например, все три, LC CDR и одну или несколько, например, все три, HC CDR. В одном варианте осуществления гуманизированный связывающий CD33 домен включает в себя линкер (Gly4-Ser)n, причем n представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В одном аспекте CAR к CD33, который включает в себя гуманизированный связывающий CD33 домен, содержит SEQ ID NO: 143. В некоторых аспектах нечеловеческое антитело является гуманизированным, причем конкретные последовательности или области антитела модифицированы для повышения сходства с антителом, естественно производимым в человеке, или его фрагментом. В одном аспекте антигенсвязывающий домен является гуманизированным. Примеры гуманизированных антител к CD33 для использования с CART, описанной в настоящем документе, включают hp67.6 или гемтузумаб, как описано в WO2012123755.

Гуманизированное антитело может быть получено с использованием множества способов, известных в данной области техники, включая, но без ограничения, трансплантацию CDR (смотри, например, европейский патент № EP 239400; международную публикацию № WO 91/09967; и патенты США №№ 5225539, 5530101 и 5585089, каждый из которых включен в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки), венирование или перекладку (смотри, например, европейские патенты №№ EP 592106 и EP 519596; документы Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; и Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973, каждый из которых включен в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки), перетасовку цепей (смотри, например, патент США № 5565332, который включен в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки) и способы, раскрытые, например, в публикации патентной заявки США № US2005/0042664, публикации патентной заявки США № US2005/0048617, патенте США № 6407213, патенте США № 5766886, международной публикации № WO 9317105, документах Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994) и Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994), каждый из которых включен в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки. Часто каркасные остатки в каркасных областях заменяют соответствующим остатком из антитела-донора CDR для изменения, например, улучшения, связывания антигена. Эти каркасные замены идентифицируют посредством способов, хорошо известных в данной области техники, например, посредством моделирования взаимодействий CDR и каркасных остатков для идентификации каркасных остатков, важных для связывания антигена, и сравнения последовательностей для идентификации необычных каркасных остатков в конкретных положениях. (Смотри, например, документы Queen et al., патент США № 5585089; и Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323, которые включены в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте.)

Гуманизированное антитело или фрагмент антитела содержит один или несколько аминокислотных остатков, оставшихся в нем от источника, который является нечеловеческим. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто называют "импортными" остатками, который обычно берут из "импортного" вариабельного домена. Как предусмотрено в настоящем документе, гуманизированные антитела или фрагменты антител содержат одну или несколько CDR из нечеловеческих иммуноглобулиновых молекул и каркасных областей, причем аминокислотные остатки, содержащие каркас, происходят полностью или по большей части из человеческой зародышевой линии. Множество способов гуманизации антител или фрагментов антител хорошо известны в данной области техники и могут в основном быть выполнены в соответствии со способом Winter и сотр. (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)) посредством замены CDR грызуна или последовательностей CDR на соответствующие последовательности человеческого антитела, то есть трансплантации CDR (EP 239400; публикация PCT № WO 91/09967; и патенты США №№ 4816567; 6331415; 5225539; 5530101; 5585089; 6548640, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки в настоящем документе во всей полноте). В таких гуманизированных антителах и фрагментах антител по существу меньшая, чем интактный человеческий вариабельный домен, часть заменена соответствующей последовательностью из отличного от человека вида. Гуманизированные антитела часто представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые каркасные (FR) остатки заменены остатками из аналогичных участков антител грызунов. Гуманизация антител и фрагментов антител также может быть получена посредством венирования или перекладки (EP 592106; EP 519596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); и Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) или перетасовки цепей (патент США № 5565332), содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки в настоящем документе во всей полноте.

Выбор человеческих вариабельных доменов, как легких, так и тяжелых, для использования в получении гуманизированных антител заключается в уменьшении антигенности. В соответствии с так называемым способом "наилучшего соответствия" последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу по всей библиотеке известных человеческих последовательностей вариабельных доменов. Затем человеческую последовательность, которая является наиболее близкой к последовательности грызуна, принимают в качестве человеческого каркаса (FR) для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987), содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки в настоящем документе во всей полноте). Другой способ использует конкретный каркас, происходящий от консенсусной последовательности всех человеческих антител определенной подгруппы легких или тяжелых цепей. Тот же самый каркас может быть использован для нескольких различных гуманизированных антител (смотри, например, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993), содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки в настоящем документе во всей полноте). В некоторых вариантах осуществления каркасная область, например, все четыре каркасные области, вариабельной области тяжелой цепи происходит от последовательности зародышевой линии VH4_4-59. В одном варианте осуществления каркасная область может содержать одну, две, три, четыре или пять модификаций, например, замен, например, от аминокислоты в соответствующей мышиной последовательности (например, SEQ ID NO: 138). В одном варианте осуществления каркасная область, например, все четыре каркасные области, вариабельной области легкой цепи происходит от последовательности зародышевой линии VK3_1.25. В одном варианте осуществления каркасная область может содержать одну, две, три, четыре или пять модификаций, например, замен, например, от аминокислоты в соответствующей мышиной последовательности (например, SEQ ID NO: 138).

В некоторых аспектах часть композиции CAR настоящего изобретения, которая содержит фрагмент антитела, гуманизирована с сохранением высокой аффинности к антигену-мишени и других полезных биологических свойств. В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения гуманизированные антитела и фрагменты антител получают посредством способа анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов широко доступны и хорошо известны специалистам в данной области техники. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатных иммуноглобулиновых последовательностей. Исследование этих отображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании кандидатной иммуноглобулиновой последовательности, например, проанализировать остатки, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связываться с антигеном-мишенью. Таким образом, FR остатки могут быть выбраны и объединены из реципиентной и импортной последовательностей таким образом, что достигается желаемая характеристика антитела или фрагмента антитела, такая как повышение аффинности к антигену-мишени. В общем случае, остатки CDR непосредственно и наиболее существенно участвуют в воздействии на связывание антигена.

Гуманизированное антитело или фрагмент антитела могут сохранять такую же антигенную специфичность, что и исходное антитело, например, в настоящем изобретении способность связывать человеческий CD33 или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела могут иметь улучшенные аффинность и/или специфичность связывания с человеческим CD33 или его фрагментом.

В одном аспекте часть антигенсвязывающего домена содержит одну или несколько последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 39-47. В одном аспекте CAR к CD33, который включает в себя человеческий связывающий CD33 домен, выбирают из одной или нескольких последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 48-56.

В одном аспекте CD33-связывающий домен характеризуется определенными функциональными признаками или свойствами антитела или фрагмента антитела. Например, в одном аспекте часть композиции CAR настоящего изобретения, которая содержит антигенсвязывающий домен, специфически связывает человеческий CD33 или его фрагмент. В одном аспекте настоящее изобретение относится к антигенсвязывающему домену, содержащему антитело или фрагмент антитела, причем связывающий домен антитела специфически связывается с белком CD33 или его фрагментом, причем антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь, которые включают в себя аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 48-56. В одном аспекте антигенсвязывающий домен содержит аминокислотную последовательность scFv, выбранную из SEQ ID NO: 39-47. В определенных аспектах scFv соприкасается и находится в одной рамке считывания с лидерной последовательностью. В одном аспекте лидерная последовательность представляет собой полипептидную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 1.

В одном аспекте CD33-связывающий домен представляет собой фрагмент, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В одном аспекте CD33-связывающий домен представляет собой Fv, Fab, (Fab')2 или бифункциональное (например, биспецифическое) гибридное антитело (например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). В одном аспекте антитела и его фрагменты настоящего изобретения связывают белок CD33 или его фрагмент с аффинностью как у дикого типа или более высокой.

В некоторых случаях человеческий scFv может быть получен из библиотеки отображения. Библиотека отображения представляет собой собрание объектов; каждый объект включает в себя доступный полипептидный компонент и многоразовый компонент, который кодирует или идентифицирует полипептидный компонент. Полипептидный компонент варьируют таким образом, чтобы были представлены различные аминокислотные последовательности. Полипептидный компонент может иметь любую длину, например, от трех аминокислот до более чем 300 аминокислот. Объект библиотеки отображения может включать в себя более чем один полипептидный компонент, например, две полипептидные цепи в Fab. В одном типичном варианте осуществления библиотеку отображения можно использовать для идентификации человеческого связывающего CD33 домена. При выборе полипептидный компонент каждого элемента библиотеки исследуют с помощью CD33 или его фрагмента, и если полипептидный компонент связывается с CD33, элемент библиотеки отображения идентифицируют, обычно по связыванию на подложке.

Связавшиеся элементы библиотеки отображения восстанавливают с подложки и анализируют. Анализ может включать в себя амплификацию и последующую селекцию в схожих или отличающихся условиях. Например, можно чередовать положительную и отрицательную селекцию. Анализ может также включать в себя определение аминокислотной последовательности полипептидного компонента, то есть анти-CD33-связывающего домена, и очистку полипептидного компонента для подробной характеризации.

Для библиотек отображения можно использовать множество форматов. Примеры включают фаговое отображение. При фаговом отображении белковый компонент обычно ковалентно связан с белком оболочки бактериофага. Связь возникает благодаря трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей белковый компонент, слитый с белком оболочки. Связь может включать в себя гибкий пептидный линкер, сайт протеазы или аминокислоту, введенную в результате супрессии стоп-кодона. Фаговое отображение описано, например, в документах US 5223409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8 и Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3)344-8. Бактериофаг, отображающий белковый компонент, может быть выращен и собран с использованием стандартных способов получения фагов, например, ПЭГ-преципитации из среды для роста. После выбора отдельных отображающих фагов нуклеиновая кислота, кодирующая выбранные белковые компоненты, может быть выделена из клеток, инфицированных выбранными фагами, или из самих фагов после амплификации. Отдельные колонии или бляшки могут быть выбраны, нуклеиновая кислота выделена и секвенирована.

Другие форматы отображения включают отображение на основе клеток (смотри, например, WO 03/029456), слияния белок-нуклеиновая кислота (смотри, например, US 6207446), рибосомное отображение (Смотри, например, Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 и Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; и Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-35) и периплазматическое отображение в E. coli (2005 Nov 22;PMID: 16337958).

В некоторых случаях могут быть получены scFv в соответствии со способом, известным в данной области техники (смотри, например, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 и Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Молекулы ScFv могут быть получены посредством связывания областей VH и VL вместе с использованием гибких полипептидных линкеров. Молекулы scFv содержат линкер (например, линкер Ser-Gly) с оптимизированными длиной и/или аминокислотным составом. Длина линкера может сильно влиять на то, как вариабельные области scFv складываются и взаимодействуют. Фактически, если используется короткий полипептидный линкер (например, 5-10 аминокислот), предотвращается внутрицепочечный фолдинг. Межцепочечный фолдинг также требует соединения двух вариабельных областей вместе для образования функционального участка связывания эпитопа. Для примеров ориентаций и размеров линкеров смотри, например, Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, публикации патентной заявки США №№ 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 и публикации PCT №№ WO2006/020258 и WO2007/024715, включенные в настоящий документ посредством ссылки.

scFv может содержать линкер из по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более аминокислотных остатков между своими областями VL и VH. Последовательность линкера может содержать любую природную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления последовательность линкера содержит аминокислоты глицин и серин. В другом варианте осуществления последовательность линкера содержит набор повторов глицина и серина, такой как (Gly₄Ser)n, где n представляет собой положительный целое число, равное или большее 1 (SEQ ID NO: 25). В одном варианте осуществления линкер может представлять собой (Gly₄Ser)₄ (SEQ ID NO: 27) или (Gly₄Ser)₃ (SEQ ID NO: 28). Изменения длины линкера могут сохранять или увеличивать активность, что приводит к более высокой эффективности при исследованиях активности.

Типичные конструкты человеческого CAR к CD33 и антигенсвязывающие домены

Типичные конструкты CAR к CD33, раскрытые в настоящем документе, содержат scFv (например, человеческий scFv, как раскрыто в таблицах 8 и 9 в настоящем документе), которому необязательно предшествует необязательная лидерная последовательность (например, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 12 в качестве типичных лидерных аминокислотной и нуклеотидной последовательностей, соответственно). Последовательности человеческих фрагментов scFv (SEQ ID NO: 39-83, включают в себя необязательную лидерную последовательность) приведены в настоящем документе в таблице 8. Последовательности человеческих фрагментов scFv без лидерной последовательности приведены в настоящем документе в таблице 9 (SEQ ID NO: 255-261 для нуклеотидных последовательностей и SEQ ID NO: 262-268 для аминокислотных последовательностей). Конструкт CAR к CD33 может дополнительно включать в себя необязательный шарнирный домен, например, шарнирный домен CD8 (например, включающий в себя аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 или кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 13); трансмембранный домен, например, трансмембранный домен CD8 (например, включающий в себя аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 6 или кодируемый нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 17); внутриклеточный домен, например, внутриклеточный домен 4-1BB (например, включающий в себя аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 7 или кодируемый нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 18); и функциональный сигнальный домен, например, домен CD3-дзета (например, включающий в себя аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 или 10 или кодируемый нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 20 или 21). В определенных вариантах осуществления домены соприкасаются и находятся в одной и той же рамке считывания, образуя один белок слияния. В других вариантах осуществления домены находятся в отдельных полипептидах, например, как в молекуле RCAR, как описано в настоящем документе.

В определенных вариантах осуществления полноразмерная молекула CAR к CD33 включает в себя аминокислотную последовательность, или кодируется соответствующей нуклеотидной последовательностью, в соответствии с CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, приведенную в таблице 8, или последовательность, по существу (например, на 95-99%) идентичную ей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR к CD33, или анти-CD33 антигенсвязывающий домен, включает в себя аминокислотную последовательность scFv в соответствии с CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, приведенную в таблице 8 (с лидерной последовательностью или без нее); или включает в себя аминокислотную последовательность scFv, или кодируется соответствующей нуклеотидной последовательностью, в соответствии с CAR33-1, CAR33-2, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-9, приведенную в таблице 9, или последовательность, по существу идентичную (например, идентичную на 95-99% или вплоть до 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 изменения в аминокислотах, например, замены (например, консервативной замены)) любой из вышеупомянутых последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR к CD33, или анти-CD33 антигенсвязывающий домен, включает в себя вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи из CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, приведенные в таблице 8, или последовательность, по существу идентичную (например, идентичную на 95-99% или вплоть до 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 изменения в аминокислотах, например, замены (например, консервативной замены)) любой из вышеупомянутых последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR к CD33, или анти-CD33 антигенсвязывающий домен, включает в себя одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, HC CDR1, HC CDR2 и/или HC CDR3), приведенные в таблице 1; и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, LC CDR1, LC CDR2 и/или LC CDR3) из CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, приведенные в таблице 2; или последовательность, по существу идентичную (например, идентичную на 95-99% или вплоть до 5, 4, 3, 2 или 1 изменения в аминокислотах, например, замены (например, консервативной замены)) любой из вышеупомянутых последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR к CD33, или анти-CD33 антигенсвязывающий домен, включает в себя одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, HC CDR1, HC CDR2 и/или HC CDR3), приведенные в таблице 3; и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, LC CDR1, LC CDR2 и/или LC CDR3) из CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, приведенные в таблице 4; или последовательность, по существу идентичную (например, идентичную на 95-99% или вплоть до 5, 4, 3, 2 или 1 изменения в аминокислотах, например, замены (например, консервативной замены)) любой из вышеупомянутых последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR к CD33, или анти-CD33 антигенсвязывающий домен, включает в себя одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, HC CDR1, HC CDR2 и/или HC CDR3), приведенные в таблице 5; и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3) из CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, приведенные в таблице 6; или последовательность, по существу идентичную (например, идентичную на 95-99% или вплоть до 5, 4, 3, 2 или 1 изменения в аминокислотах, например, замены (например, консервативной замены)) любой из вышеупомянутых последовательностей.

Последовательности человеческих последовательностей CDR доменов scFv показаны в таблице 1 для вариабельных доменов тяжелой цепи и в таблице 2 для вариабельных доменов легкой цепи. "ID" обозначает для соответствующий SEQ ID NO для каждой CDR. CDR, приведенные в таблицах 1 и 2, соответствуют комбинации схем нумерации Кэбота и Чотиа.

Таблица 1. CDR вариабельных доменов тяжелой цепи

Кандидат	HCDR1	ID	HCDR2	ID	HCDR3	ID
CAR33-1	GYSFTSYWIG	84	IIYPGDSDTRYSPSFQG	93	LGGSLPDYGMDV	102
CAR33-2	GYIFTNYYVH	85	IISPSGGSPTYAQRLQG	94	ESRLRGNRLGLQSSIFDH	103
CAR33-3	GFTFSSYAMS	86	AISGSGGSTYYADSVKG	95	EDTIRGPNYYYYGMDV	104
CAR33-4	GYSFTSYWIG	87	IIYPGDSDTRYSPSFQG	96	GGYSDYDYYFDF	105
CAR33-5	GFTFDDYAMH	88	VIWPDGGQKYYGDSVKG	97	HFNAWDY	106
CAR33-6	GFTFSIFAMH	89	TISYDGSNAFYADSVEG	98	AGDGGYDVFDS	107
CAR33-7	GFTFSSYAMS	90	AISGSGGSTYYADSVKG	99	ETDYYGSGTFDY	108
CAR33-8	GYMFTDFFIH	91	WINPNSGVTKYAQKFQG	100	WYSSGWYGIANI	109
CAR33-9	GYSFTNYWIG	92	IIYPGDSDTRYSPSFQG	101	HGPSSWGEFDY	110

Таблица 2. CDR вариабельных доменов легкой цепи

Кандидат	LCDR1	ID	LCDR2	ID	LCDR3	ID
CAR33-1	RSSQSLLHSNGYNYLD	111	LGSNRAS	120	MQALQTLIT	129
CAR33-2	QASQDINNHLN	112	DTSNLEI	121	QQYENLPLT	130
CAR33-3	RASQDIDTWLA	113	AASNLQG	122	QQASIFPPT	131
CAR33-4	RSSQSLLHSNGYNYLD	114	LGSNRAS	123	MQALQTPFT	132
CAR33-5	QASQGISQFLN	115	DASNLEP	124	QQYDDLPLT	133
CAR33-6	RSSQSLLHSNGYNYLD	116	LGSNRAS	125	MQALQTPT	134
CAR33-7	RASQGIGIYLA	117	GASTLQS	126	QQSNNFPPT	135
CAR33-8	QASHDISNYLH	118	DASNLET	127	QQSDDLPHT	136
CAR33-9	RASQSISSYLN	119	AASSLQS	128	QQSYSTPLT	137

Таблица 3: CDR вариабельных доменов тяжелой цепи в соответствии со схемой нумерации Кэбота (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)

Кандидат	HCDR1	ID	HCDR2	ID	HCDR3	ID
141643-CAR33-1	SYWIG	269	IIYPGDSDTRYSPSFQG	278	LGGSLPDYGMDV	287
141644-CAR33-2	NYYVH	270	IISPSGGSPTYAQRLQG	279	ESRLRGNRLGLQSSIFDH	288
141645-CAR33-3	SYAMS	271	AISGSGGSTYYADSVKG	280	EDTIRGPNYYYYGMDV	289
141646-CAR33-4	SYWIG	272	IIYPGDSDTRYSPSFQG	281	GGYSDYDYYFDF	290
141647-CAR33-5	DYAMH	273	VIWPDGGQKYYGDSVKG	282	HFNAWDY	291
141648-CAR33-6	IFAMH	274	TISYDGSNAFYADSVEG	283	AGDGGYDVFDS	292
141649-CAR33-7	SYAMS	275	AISGSGGSTYYADSVKG	284	ETDYYGSGTFDY	293
141650-CAR33-8	DFFIH	276	WINPNSGVTKYAQKFQG	285	WYSSGWYGIANI	294
141651-CAR33-9	NYWIG	277	IIYPGDSDTRYSPSFQG	286	HGPSSWGEFDY	295

Таблица 4: CDR вариабельных доменов легкой цепи в соответствии со схемой нумерации Кэбота (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)

Кандидат	LCDR1	ID	LCDR2	ID	LCDR3	ID
141643-CAR33-1	RSSQSLLHSNGYNYLD	296	LGSNRAS	305	MQALQTLIT	314
141644-CAR33-2	QASQDINNHLN	297	DTSNLEI	306	QQYENLPLT	315
141645-CAR33-3	RASQDIDTWLA	298	AASNLQG	307	QQASIFPPT	316
141646-CAR33-4	RSSQSLLHSNGYNYLD	299	LGSNRAS	308	MQALQTPFT	317
141647-CAR33-5	QASQGISQFLN	300	DASNLEP	309	QQYDDLPLT	318
141648-CAR33-6	RSSQSLLHSNGYNYLD	301	LGSNRAS	310	MQALQTPT	319
141649-CAR33-7	RASQGIGIYLA	302	GASTLQS	311	QQSNNFPPT	320
141650-CAR33-8	QASHDISNYLH	303	DASNLET	312	QQSDDLPHT	321
141651-CAR33-9	RASQSISSYLN	304	AASSLQS	313	QQSYSTPLT	322

Таблица 5: CDR вариабельных доменов тяжелой цепи в соответствии со схемой нумерации Чотиа (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273927-948)

Кандидат	HCDR1	ID	HCDR2	ID	HCDR3	ID
141643-CAR33-1	GYSFTSY	323	YPGDSD	332	LGGSLPDYGMDV	341
141644-CAR33-2	GYIFTNY	324	SPSGGS	333	ESRLRGNRLGLQSSIFDH	342
141645-CAR33-3	GFTFSSY	325	SGSGGS	334	EDTIRGPNYYYYGMDV	343
141646-CAR33-4	GYSFTSY	326	YPGDSD	335	GGYSDYDYYFDF	344
141647-CAR33-5	GFTFDDY	327	WPDGGQ	336	HFNAWDY	345
141648-CAR33-6	GFTFSIF	328	SYDGSN	337	AGDGGYDVFDS	346
141649-CAR33-7	GFTFSSY	329	SGSGGS	338	ETDYYGSGTFDY	347
141650-CAR33-8	GYMFTDF	330	NPNSGV	339	WYSSGWYGIANI	348
141651-CAR33-9	GYSFTNY	331	YPGDSD	340	HGPSSWGEFDY	349

Таблица 6: CDR вариабельных доменов легкой цепи в соответствии со схемой нумерации Чотиа (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273927-948)

Кандидат	LCDR1	ID	LCDR2	ID	LCDR3	ID
141643-CAR33-1	SQSLLHSNGYNY	350	LGS	359	ALQTLI	368
141644-CAR33-2	SQDINNH	351	DTS	360	YENLPL	369
141645-CAR33-3	SQDIDTW	352	AAS	361	ASIFPP	370
141646-CAR33-4	SQSLLHSNGYNY	353	LGS	362	ALQTPF	371
141647-CAR33-5	SQGISQF	354	DAS	363	YDDLPL	372
141648-CAR33-6	SQSLLHSNGYNY	355	LGS	364	ALQTP	373
141649-CAR33-7	SQGIGIY	356	GAS	365	SNNFPP	374
141650-CAR33-8	SHDISNY	357	DAS	366	SDDLPH	375
141651-CAR33-9	SQSISSY	358	AAS	367	SYSTPL	376

В определенных вариантах осуществления молекула CAR, описанная в настоящем документе (например, нуклеиновая кислота CAR или полипептид CAR), или CD33-связывающий домен включают в себя:

(1) одну, две или три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одной из следующих: