Способ видовой идентификации рыб семейства тресковых методом пцр в режиме реального времени
Владельцы патента RU 2748058:
Общество с ограниченной ответственностью "ГенБит" (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к молекулярной диагностике, и может быть использовано в пищевой промышленности для видовой идентификации рыб семейства тресковых (Gadidae) в пищевых продуктах и продовольственном сырье. Выделяют ДНК из проб тканей рыб или из образца пищевого продукта (продовольственного сырья). Проводят анализ методом полимерной цепной реакции в режиме реального времени для выявления специфических последовательностей ДНК рыб с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов, установленных для каждого вида рыб. Готовят смесь для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР. Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной пороговой линией Threshold и значением порогового цикла, рассчитываемого программным обеспечением амплификатора. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора значение порогового цикла не превышает 30. ДНК пикши (Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если одновременно для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) значение порогового цикла не превышает 30. Для определения путассу (Micromesisteus poutassou) и сайды (Pollachius virens) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значения порогового цикла превышают 30 в пробирках/реакторах с тест-системами. Предлагаемый способ позволяет провести идентификацию всех видов тресковых рыб в рамках одного анализа и получить результат анализа быстрее по сравнению с существующими методами. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к молекулярной диагностике, и может быть использовано в пищевой промышленности для видовой идентификации рыб семейства тресковых (Gadidae) в пищевых продуктах и продовольственном сырье.
Cуществуют стандарты, регламентирующие видовую идентификацию рыб, в том числе семейства тресковых способами электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях [ГОСТ Р 54414-2011 Видовая идентификация рыбы методом электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле. Москва, Стандартинформ, 2013.], изоэлектрофокусировки [ГОСТ Р 52840-2007 Видовая идентификация рыбы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле. Москва, Стандартинформ, 2008.] и секвенирования [ГОСТ 34106-2017 Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции. Москва, Стандартинформ, 2017.].
Однако, эти способы по сравнению с ПЦР в режиме реального времени более трудоемки и времязатратны, требуют наличия у персонала специальных навыков, более сложного оборудования и наличия стандартных образцов для каждого вида рыб.
Известен подход к видовой идентификации тресковых рыб [Namikoshi, A., Takashima, Y., Iguchi, J., Yanagimoto, T., &Yamashita, M. (2011). Species identification of Alaska pollock, Gadus spp., and Micromesistius spp. in cod roe products using a PCR-based method.FisheriesScience, 77(4), 671-678.], основанный на детекции видоспецифической ДНК методом ПЦР. Тест-системы, описанные в этой научной работе, в качестве метода регистрации результата используют гель-электрофорез, что существенно усложняет анализ и увеличивает время, необходимое для его проведения.
Технической задачей настоящего изобретения является идентификация рыб семейства тресковых с помощью обнаружения специфических ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме «реального времени».
Способ основан на выявлении специфических участков генапантофизина, NADH-дегидрогеназы, АТФазы 6 и родопсина с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов. Разработанные олигонуклеотиды имеют следующие последовательности:
Последовательность (5'-3') | Размер ампликона, п.н. | Ген-мишень | №№ в базе данных GenBank |
Треска тихоокеанская (Gadus macrocephalus) F: ATGTGTCAGATTATACCAGTTAATTC R: GTTGGTTAAATTGTATAACAAGGA Pr: FAM-TCTGGGCGTGACCTCAACACTA-BHQ1 |
169 | NADH-дегидрогеназа | EU729423.1 |
Треска атлантическая (Gadus morhua) F: CAATGTTAATGTTTCTCCTACTTT R: TGACGAAGTGTAGTTGCCAA Pr: ROX-CAGCATCCTTACCAAGTCCCTACC-BHQ2 |
108 | пантофизин | AF288943.1 |
Минтай (Gadus chalcogrammus) F: GCAATGTTAATGTTTCTCCTACT R: AGTTAGTTGCCAATAAGGAAAG Pr: FAM-CAGCATTCTTACACAGTCCCTACCT-BHQ1 |
101 | пантофизин | AY292495.1 |
Пикша (Melanogrammus aeglefinus) F: AATTTAGGCTTAGCTGTTCC R: GAATTAGAGCTGTAGGGGTG Pr: ROX-TAGCAACTGTTCTTATTGGAATACGAA-BHQ2 |
115 | АТФаза 6 | DQ010963.1 |
Путассу (Micromesisteus poutassou) F: ACTCTCCTGGTTGATTGATATT R: CTATACAGGTGTTGGAAGCC Pr: FAM-CTTGTTTCTTAGATTGATGCAGCATT-BHQ1 |
240 | пантофизин | AY292496.1 |
Сайда (Pollachius virens) F: GTTTGTGCTATCATACCCATC R: GGACTTTGTAAGAATGCTGC Pr: ROX-CTCCTAAATCGTGGCTGGTTGA-BHQ2 |
138 | пантофизин | AY292491.1 |
Мерланг (Merlangius merlangus) F: TACACCCGCGCTGAGG R: GTAGATGGACGAGGACTTGG Pr: FAM-AGATGGGACCGAAGACGCTG-BHQ1 |
330 | родопсин | EU492056.1 |
Для проведения ПЦР используют геномную ДНК рыб. Для выделения ДНК используют готовые наборы реактивов, предназначенные для работы с пищевыми продуктами и продовольственным сырьем. Выделение ДНК осуществляют из кусочков филе рыб или образца продукта питания, не имевших контакта с внешней средой (с целью избежать возможной исходной контаминации чужеродной ДНК) в соответствии с протоколом (инструкцией по применению), рекомендованным производителем.
Оценку чистоты полученных препаратов ДНК производят спектрофотометрическим методом с помощью спектрофотометра, позволяющего измерять оптическую плотность при длинах волн 260 и 280 нм. Для анализа используют препараты ДНК с соотношением оптической плотности при длинах волн 260 нм и 280 нм (A260/A280) в пределах 1,8-2,0. Полученные препараты ДНК хранят в морозильной камере при −20°С до использования.
Для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме «реального времени» используют амплификатор нуклеиновых кислот, позволяющий осуществлять термоциклирование и одновременную регистрацию флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» в формате микропробирок, микрочипов или микропланшетов.
Разработанный состав смеси для ПЦР и концентрации отдельных компонентов представлены в таблице.
Компонент | Концентрация | Объем, мкл | Конечная концентрация в реакции (25 мкл) |
Смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) | 2,5 ммоль/ дм3 каждого дНТФ | 2,5 | 250 мкмоль/дм3 |
Прямой праймер | 5 пмоль/см3 | 2 | 0,4 пмоль/ см3 |
Обратный праймер | 5 пмоль/ см3 | 2 | 0,4 пмоль/ см3 |
ДНК-зонд | 2,5 пмоль/ см3 | 2 | 0,2 пмоль/ см3 |
ПЦР-буфер c MgCl2 | 10x | 2,5 | 1x |
Термостабильная ДНК-полимераза (Taq) с горячим стартом | 5 Е/мкл | 0,5 | 2,5 Е/реакция |
Вода деионизованная | - | 4,5 | - |
ДНК исследуемого образца | - | 9 | - (36% конечного объема реакции) |
Объем реакции может быть масштабирован в соответствии с типом используемого оборудования (амплификатора нуклеиновых кислот).
Для корректной работы тест-систем используется следующая программа термоциклирования:
Первичная денатурация - 120с при 94°С с последующим циклированием: денатурация - 5с при 94°С, отжиг праймеров и элонгация - 30с при 60°С (45 циклов). Регистрация сигнала осуществляется после прохождения этапа отжига праймеров и элонгации.
Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривойфлуоресценции с установленной пороговой линией (Threshold) и значения порогового цикла, рассчитываемого программным обеспечением амплификатора, следующим образом:
1. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора значение порогового цикла не превышает 30.
2. ДНК пикши (Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если одновременно выполняются следующие условия:
- для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) значение порогового цикла не превышают 30;
- в пробирках/реакторах с тест-системами для определения путассу (Micromesisteus poutassou) и сайды (Pollachius virens) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значения порогового цикла превышают 30.
3. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают не обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора флуоресцентный сигнал не регистрируется или значение порогового цикла превышает 30.
4. ДНК пикши (Melanogrammus aeglefinus) считают не обнаруженной, если выполняется хотя бы одно из следующих условий:
- для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значение порогового цикла превышают 30;
- одновременно регистрируется флуоресцентный сигнал со значением порогового цикла, не превышающим 30, в пробирках/реакторах с тест-системами для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) и сайды (Pollachius virens);
- одновременно регистрируется флуоресцентный сигнал со значением порогового цикла, не превышающим 30, в пробирках/реакторах с тест-системами для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) и путассу (Micromesisteus poutassou).
Разработанный способ видовой идентификации тресковых рыб по сравнению с существующими методами обладает следующими преимуществами:
- возможность идентификации основных промысловых видов тресковых рыб;
- идентификация всех заявленных видов тресковых рыб в рамках одного анализа за счет оптимизированных последовательностей специфических олигонуклеотидов и унифицированной программы термоциклирования;
- ускоренное по сравнению с существующими способами получение результата анализа.
--->
Перечень последовательностей
<110> Общество с ограниченной ответственностью "ГенБит"
<120> СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЫБ СЕМЕЙСТВА ТРЕСКОВЫХ МЕТОДОМ ПЦР
В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
<140> 2020133599
<141> 13.10.2020
<160> 21
<210> 1
<211> 26
<212>ДНК
<213>Gadus macrocephalus
<400> 1
atgtgtcagattataccagttaattc
<210>2
<211> 24
<212>ДНК
<213>Gadus macrocephalus
<400> 2
gttggttaaattgtataacaagga
<210>3
<211> 22
<212>ДНК
<213>Gadus macrocephalus
<400>3
tctgggcgtgacctcaacacta
<210> 4
<211> 24
<212>ДНК
<213>Gadus morhua
<400> 4
caatgttaatgtttctcctacttt
<210>5
<211> 20
<212>ДНК
<213>Gadus morhua
<400> 5
tgacgaagtgtagttgccaa
<210>6
<211> 24
<212>ДНК
<213>Gadus morhua
<400> 6
cagcatccttaccaagtccctacc
<210> 7
<211> 23
<212>ДНК
<213>Gadus chalcogrammus
<400> 7
gcaatgttaatgtttctcctact
<210>8
<211> 22
<212>ДНК
<213>Gadus chalcogrammus
<400> 8
agttagttgccaataaggaaag
<210> 9
<211> 25
<212>ДНК
<213>Gadus chalcogrammus
<400> 9
cagcattcttacacagtccctacct
<210> 10
<211> 20
<212>ДНК
<213>Melanogrammus aeglefinus
<400>10
aatttaggcttagctgttcc
<210>11
<211> 20
<212>ДНК
<213>Melanogrammus aeglefinus
<400>11
gaattagagctgtaggggtg
<210>12
<211> 27
<212>ДНК
<213>Melanogrammus aeglefinus
<400>12
tagcaactgttcttattggaatacgaa
<210>13
<211> 22
<212>ДНК
<213>Micromesisteus poutassou
<400>13
actctcctggttgattgatatt
<210>14
<211> 20
<212>ДНК
<213>Micromesisteus poutassou
<400>14
ctatacaggtgttggaagcc
<210>15
<211> 26
<212>ДНК
<213>Micromesisteus poutassou
<400> 15
cttgtttcttagattgatgcagcatt
<210>16
<211> 21
<212>ДНК
<213>Pollachius virens
<400> 16
gtttgtgctatcatacccatc
<210>17
<211> 20
<212>ДНК
<213>Pollachius virens
<400> 17
ggactttgtaagaatgctgc
<210>18
<211> 22
<212>ДНК
<213>Pollachius virens
<400> 18
ctcctaaatcgtggctggttga
<210>19
<211> 16
<212>ДНК
<213>Merlangius merlangus
<400>19
tacacccgcgctgagg
<210>20
<211> 20
<212>ДНК
<213>Merlangius merlangus
<400>20
gtagatggacgaggacttgg
<210>21
<211> 20
<212>ДНК
<213>Merlangius merlangus
<400>21
agatgggaccgaagacgctg
<---
1. Способ видовой идентификации рыб семейства тресковых, заключающийся в выделении ДНК из проб тканей рыб, образца продукта питания или продовольственного сырья, последующем анализе методом полимерной цепной реакции в режиме реального времени для выявления специфических последовательностей ДНК рыб, с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов, установленных для каждого вида рыб, так для трески атлантической прямой праймер CAATGTTAATGTTTCTCCTACTTT, обратный праймер TGACGAAGTGTAGTTGCCAA, зонд ROX-CAGCATCCTTACCAAGTCCCTACC-BHQ2, для трески тихоокеанской прямой праймер ATGTGTCAGATTATACCAGTTAATTC, обратный праймер GTTGGTTAAATTGTATAACAAGGA, зонд FAM-TCTGGGCGTGACCTCAACACTA-BHQ1, для пикши прямой праймер AATTTAGGCTTAGCTGTTC, обратный праймер GAATTAGAGCTGTAGGGGTG, зонд ROX-TAGCAACTGTTCTTATTGGAATACGAA-BHQ2, для минтая прямой праймер GCAATGTTAATGTTTCTCCTACT, обратный праймер AGTTAGTTGCCAATAAGGAAAG, зонд FAM-CAGCATTCTTACACAGTCCCTACCT-BHQ1, для сайды прямой праймер GTTTGTGCTATCATACCCATC, обратный праймер GGACTTTGTAAGAATGCTGC, зонд ROX-CTCCTAAATCGTGGCTGGTTGA-BHQ2, для путассу прямой праймер ACTCTCCTGGTTGATTGATATT, обратный праймер CTATACAGGTGTTGGAAGCC, зонд FAM-CTTGTTTCTTAGATTGATGCAGCATT-BHQ1, для мерланга прямой праймер TACACCCGCGCTGAGG, обратный праймер GTAGATGGACGAGGACTTGG, зонд FAM-AGATGGGACCGAAGACGCTG-BHQ1, готовят смесь для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР и осуществляют термоциклирование с первичной денатурацией – 120 с при 94°С с последующим циклированием: денатурация – 5 с при 94°С, отжиг праймеров и элонгация – 30 с при 60°С (45 циклов), регистрацию сигнала осуществляют после прохождения этапа отжига праймеров и элонгации, результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной пороговой линией Threshold и значением порогового цикла, рассчитываемого программным обеспечением амплификатора.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что смесь для проведения ПЦР содержит следующие компоненты в конечных концентрациях: смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) – 250 мкмоль/дм3 каждого дНТФ; прямой праймер – 0,4 пмоль/см3; обратный праймер – 0,4 пмоль/см3; ДНК-зонд – 0,2 пмоль/см3; ПЦР-буфер c MgCl2 – 1x; термостабильная ДНК-полимераза (Taq) с «горячим стартом» - 0,1 E/мкл и образец ДНК 36% от общего объема смеси.