Предотвращение и лечение воспалительных состояний

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к способам облегчения или предотвращения воспалительного состояния и поражения тканей у субъекта. Способ облегчения или предотвращения по меньшей мере одного воспалительного состояния у субъекта, включающий введение количества активатора Т-клеток - натуральных киллеров II типа (NKT-2), которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта, где указанный активатор NKT-2 представляет собой милтефозин, и где указанное воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, аутоиммунного гепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного склероза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита A, B и C, воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки и бокового амиотрофического склероза. Способ подавления повреждения ткани, опосредованного NKT-клетками I типа, у субъекта, включающий введение эффективного количества активатора NKT-2 субъекту, причем понижается активация NKT-клеток I типа, где указанный активатор NKT-2 представляет собой милтефозин, и где указанное повреждение ткани выбрано из группы, состоящей из жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, аутоиммунного гепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного склероза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита A, B и C, воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки и бокового амиотрофического склероза. Способ облегчения или предотвращения по меньшей мере одного воспалительного состояния у субъекта, включающий введение выделенных CD8αα+, TCRαβ+ T-клеток субъекту и введение количества активатора NKT-2, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта, где указанный активатор NKT-2 представляет собой милтефозин, и где указанное воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, аутоиммунного гепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного склероза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита A, B и C, воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки и бокового амиотрофического склероза. Вышеописанные способы позволяют облегчать или предотвращать воспалительные состояния и поражения тканей у субъекта при описанных поражениях печени. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 16 ил., 4 табл., 9 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/089690, озаглавленной «PREVENTION AND TREATMENT OF INFLAMMATORY CONDITIONS» («ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ И ЛЕЧЕНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СОСТОЯНИЙ»), поданной 9 декабря 2014 года, содержание которой включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область

[0002] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения относятся к композициям и способам для модуляции клеток NKT II типа и/или I типа для предотвращения и лечения воспалительных состояний печени.

Описание родственной области техники

[0003] Избыточное употребление алкоголя является основной причиной заболеваний печени в западных странах. Свидетельства повреждения печени наблюдают у индивидуумов, которые употребляют четыре или более стандартных порций спиртных напитков в день (четыре порции по 12 (~355 мл) унций пива, четыре бокала вина или четыре унции (120 мл) крепких спиртных напитков для мужчин и половина от указанного количества для женщин). Несмотря на то, что механизм повреждения печени алкоголем до конца не выяснен, хроническое употребление алкоголя приводит к секреции провоспалительных цитокинов (ФНО-альфа, IL6 и IL8), окислительному стрессу, переокислению липидов и токсическому действию ацетальдегида, что вызывает воспаление, апоптоз и в конечном итоге фиброз клеток печени.

[0004] Алкогольная болезнь печени (АБП) имеет три основные фазы: алкогольную жировую болезнь печени, алкогольный гепатит и цирроз. Алкогольная жировая болезнь печени, которая характеризуется накоплением жирных кислот в печени, как правило, протекает без симптомов и обращается вспять, если индивидуум отказывается от приема алкоголя на несколько недель. В тяжелых случаях могут ощущаться слабость, тошнота, боль в брюшной полости, потеря аппетита и общее недомогание. Несмотря на то, что жировая болезнь печени в некоторой степени присутствует у большинства лиц, злоупотребляющих алкоголем, в некоторых случаях сильная потребность в употреблении спиртных напитков присутствует ежедневно только в течение периода продолжительностью менее недели, только у одного из пяти лиц, злоупотребляющих алкоголем, развивается алкогольный гепатит, и у одного из четырех развивается цирроз. Алкогольный гепатит характеризуется воспалением гепатоцитов и в общем случае обратимым при отказе от употребления алкоголя. Цирроз, который характеризуется воспалением, фиброзом (отвердением клеток) и повреждением мембран, препятствующим детоксикации организма от различных химических веществ, и в конечном итоге рубцеванием и некрозом, в общем случае является необратимым.

[0005] Клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе различных фаз повреждения ткани печени при алкогольной болезни печени, плохо изучены. Несмотря на то, что в некоторых областях удалось добиться успеха, эффективный терапевтический подход для устранения указанного заболевания на момент подачи заявки отсутствовал. Это отчасти объясняется тем фактом, что печень является уникальным органом с точки зрения иммунологии, а также анатомии. Например, в то время, как паренхиматозные клетки печени имеют метаболические функции, непаренхиматозные клетки осуществляют иммунологические функции. Помимо паренхиматозных гепатоцитов печень содержит несколько видов непаренхиматозных клеток, таких как LSEC, клетки Купфера, дендритные клетки, NK-клетки и NKT-клетки, все из которых могут участвовать в иммунитете. Каким образом регуляция иммунного ответа обуславливает толерантность или иммунитет к алкогольному поражению, неизвестно.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

[0006] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ облегчения или предотвращения по меньшей мере одного воспалительного состояния у субъекта. Способ может включать введение количества активатора NKT-2, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта.

[0007] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ облегчения или предотвращения по меньшей мере одного воспалительного состояния у субъекта. Способ может включать введение некоторого количества активатора NKT-2 и некоторого количества сульфатида субъекту, где, взятые вместе, количество активатора NKT-2 и количество сульфатида являются достаточными для активации NKT-клеток II типа у субъекта.

[0008] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ подавления повреждения ткани, опосредованного NKT-клетками I типа, у субъекта. Способ может включать введение эффективного количества активатора NKT-2 субъекту, в результате чего снижается активация NKT-клеток I типа.

[0009] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция для применения в облегчении или предотвращении по меньшей мере одного воспалительного состояния. Композиция может содержать количество активатора NKT-2, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта.

[0010] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция для применения в облегчении или предотвращении по меньшей мере одного воспалительного состояния. Композиция может содержать некоторое количество активатора NKT-2 и некоторое количество сульфатида, причем, взятые вместе, количество активатора NKT-2 и количество сульфатида являются достаточными для активации NKT-клеток II типа у субъекта.

[0011] В настоящем изобретении также предложено несколько альтернативных вариантов:

[0012] Альтернативный вариант 1 включает способ облегчения или предотвращения по меньшей мере одного воспалительного состояния у субъекта. Способ может включать введение количества активатора NKT-2, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта.

[0013] Альтернативный вариант 2 включает способ согласно альтернативному варианту 1, в котором воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из: жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, ишемического и реперфузионного повреждения, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, бокового амиотрофического склероза и воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и колита).

[0014] Альтернативный вариант 3 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 1-2, где способ дополнительно включает введение субъекту количества агониста RAR, которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа у субъекта.

[0015] Альтернативный вариант 4 включает способ согласно альтернативному варианту 3, где активатор NKT-2 и агонист RAR вводят одновременно.

[0016] Альтернативный вариант 5 включает способ согласно альтернативному варианту 3, где активатор NKT-2 и агонист RAR вводят раздельно.

[0017] Альтернативный вариант 6 включает способ согласно альтернативному варианту 3, где активатор NKT-2 и агонист RAR вводят последовательно.

[0018] Альтернативный вариант 7 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 1-6, где активатор NKT-2 вводят перорально.

[0019] Альтернативный вариант 8 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 1-7, где активатор NKT-2 включает по меньшей одно из милтефозина, аналога милтефозина или фосфолипида.

[0020] Альтернативный вариант 9 включает способ согласно альтернативному варианту 8, где фосфолипид включает лизофосфатидилхолин (LPC), аналог LPC, лизо-фактор активации тромбоцитов (LPAF), лизосфингомиелин (LSM) или аналог LSM.

[0021] Альтернативный вариант 10 включает способ согласно альтернативному варианту 9, где LPC включает одно из LPC (С18:0), LPC (С16:0), LPC (C18:1(9Z)), LPC(С18:1(1-олеил)) или LignA(LPC)(C24:0).

[0022] Альтернативный вариант 11 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 1-7, где активатор NKT-2 включает по меньшей одно из милтефозина или аналога милтефозина.

[0023] Альтернативный вариант 12 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 8-11, где аналог милтефозина включает соединение, приведенное в таблице 2.1 или в таблице 2.2.

[0024] Альтернативный вариант 13 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 8-11, где аналог милтефозина включает соединение, приведенное в таблице 2.1.

[0025] Альтернативный вариант 14 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 1-7, где активатор NKT-2 включает милтефозин.

[0026] Альтернативный вариант 15 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 3-14, где агонист RAR включает ATRA или изотретиноин.

[0027] Альтернативный вариант 16 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 3-14, где агонист RAR включает тазаротен.

[0028] Альтернативный вариант 17 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 3-14, где агонист RAR включает ретинол или сложный эфир ретинола

[0029] Альтернативный вариант 18 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 1-17, где активация NKT-клеток II типа включает по меньшей мере один процесс, выбранный из: выработки IL-2 NKT-клетками II типа, пролиферацию NKT-клеток II типа или экспрессию CD69 на поверхности NKT-клеток II типа.

[0030] Альтернативный вариант 19 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 3-18, где подавление активации NKT-клеток I типа включает подавление накопления клеток альфа-GalGer/CD1d-тетрамер⁺ТСК-бета⁺.

[0031] Альтернативный вариант 20 включает способ облегчения или предотвращения по меньшей мере одного воспалительного состояния у субъекта, включающий введение некоторого количества активатора NKT-2 и некоторого количества сульфатида субъекту, где, взятые вместе, количество активатора NKT-2 и количество сульфатида являются достаточными для активации NKT-клеток II типа у субъекта.

[0032] Альтернативный вариант 21 включает способ согласно альтернативному варианту 20, где воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из: жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, ишемического и реперфузионного повреждения, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, бокового амиотрофического склероза и воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и колита).

[0033] Альтернативный вариант 22 включает способ согласно альтернативному варианту 20 или альтернативному варианту 21, где сульфатид и активатор NKT-2 вводят одновременно.

[0034] Альтернативный вариант 23 включает способ согласно альтернативному варианту 20 или альтернативному варианту 21, где сульфатид и активатор NKT-2 вводят раздельно.

[0035] Альтернативный вариант 24 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 20-23, где активатор NKT-2 вводят перорально.

[0036] Альтернативный вариант 25 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 20-24, где количество активатора NKT-2 является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта, и количество сульфатида является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта.

[0037] Альтернативный вариант 26 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 20-25, где способ дополнительно включает введение субъекту количества агониста RAR, которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа у субъекта.

[0038] Альтернативный вариант 27 включает способ согласно альтернативному варианту 26, где активатор NKT-2 и агонист RAR вводят одновременно.

[0039] Альтернативный вариант 28 включает способ согласно альтернативному варианту 26, где сульфатид и активатор NKT-2 вводят раздельно.

[0040] Альтернативный вариант 29 включает способ согласно альтернативному варианту 26, где активатор NKT-2 и агонист RAR вводят последовательно.

[0041] Альтернативный вариант 30 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 20-29, где активатор NKT-2 включает по меньшей одно из милтефозина, аналога милтефозина или фосфолипида.

[0042] Альтернативный вариант 31 включает способ согласно альтернативному варианту 30, где фосфолипид включает лизофосфатидилхолин (LPC), аналог LPC, лизо-фактор активации тромбоцитов (LPAF), лизосфингомиелин (LSM) или аналог LSM.

[0043] Альтернативный вариант 32 включает способ согласно альтернативному варианту 31, где LPC включает одно из LPC (С18:0), LPC (С16:0), LPC (C18:1(9Z)), LPC(С18:1(1-олеил)) или LignA(LPC)(C24:0).

[0044] Альтернативный вариант 33 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 20-29, где активатор NKT-2 включает по меньшей одно из милтефозина или аналога милтефозина.

[0045] Альтернативный вариант 34 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 30-32, где аналог милтефозина включает соединение, приведенное в таблице 2.1 или в таблице 2.2.

[0046] Альтернативный вариант 35 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 30-32, где аналог милтефозина включает соединение, приведенное в таблице 2.1.

[0047] Альтернативный вариант 36 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 20-29, где активатор NKT-2 включает милтефозин.

[0048] Альтернативный вариант 37 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 20-36, где сульфатид имеет следующую химическую структуру:

где R1 выбран из группы, состоящей из связи, водорода, C₁-C₃₀ алкила, C₁-C₃₀ замещенного алкила, C₁-C₃₀ алкенила, C₁-C₃₀ замещенного алкенила и С₅-С₁₂ сахара; R₂ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы и алкоксигруппы; R₃ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы, этоксигруппы и алкоксигруппы; R₄ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы и алкоксигруппы; R₅ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксила, карбонила, алкокси и связи; R₆ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀ алкила, С₁-С₄₀ замещенного алкила, С₁-С₄₀ алкенила, С₁-С₄₀ замещенного алкенила и С₁-С₄₀ алкинила; R₇ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀ алкила, С₁-С₄₀ замещенного алкила, С₁-С₄₀ алкенила, С₁-С₄₀ замещенного алкенила и C₁-С₄₀ алкинила; и R₈ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксильной группы, карбонила, алкоксигруппы и связи.

[0049] Альтернативный вариант 38 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 20-36, где сульфатид имеет следующую химическую структуру:

[0050] Альтернативный вариант 39 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 20-35, где агонист RAR включает ATRA или изотретиноин.

[0051] Альтернативный вариант 40 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 20-38, где агонист RAR включает тазаротен.

[0052] Альтернативный вариант 41 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 20-38, где агонист RAR включает ретинол или сложный эфир ретинола.

[0053] Альтернативный вариант 42 включает способ подавления повреждения ткани, опосредованного NKT-клетками I типа, у субъекта, включающий введение эффективного количества фосфолипида субъекту, в результате чего происходит понижение активации NKT-клеток I типа.

[0054] Альтернативный вариант 43 включает способ согласно альтернативному варианту 42, где воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из: жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, ишемического и реперфузионного повреждения, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, бокового амиотрофического склероза и воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и колита).

[0055] Альтернативный вариант 44 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 42-43, где фосфолипид включает по меньшей одно из милтефозина, аналога милтефозина или фосфолипида.

[0056] Альтернативный вариант 45 включает способ согласно альтернативному варианту 44, где фосфолипид включает лизофосфатидилхолин (LPC), аналог LPC, лизо-фактор активации тромбоцитов (LPAF), лизосфингомиелин (LSM) или аналог LSM.

[0057] Альтернативный вариант 46 включает способ согласно альтернативному варианту 45, где LPC включает одно из LPC (С18:0), LPC (С16:0), LPC (C18:1(9Z)), LPC(С18:1(1-олеил)) или LignA(LPC)(C24:0).

[0058] Альтернативный вариант 47 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 42-43, где фосфолипид включает по меньшей одно из милтефозина или аналога милтефозина.

[0059] Альтернативный вариант 48 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 44-47, где аналог милтефозина включает соединение, приведенное в таблице 2.1 или в таблице 2.2.

[0060] Альтернативный вариант 49 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 44-47, где аналог милтефозина включает соединение, приведенное в таблице 2.1.

[0061] Альтернативный вариант 50 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 42-43, где активатор NKT-2 включает милтефозин.

[0062] Альтернативный вариант 51 включает композицию для применения для облегчения или предотвращения по меньшей мере одного воспалительного состояния у субъекта, содержащую количество активатора NKT-2, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта.

[0063] Альтернативный вариант 52 включает композицию согласно альтернативному варианту 51, дополнительно содержащую количество агониста RAR, которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа у субъекта.

[0064] Альтернативный вариант 53 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 48-49, где воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из: жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, аутоиммунного гепатита, рассеянного склероза, диабета 1 типа, ишемического и реперфузионного повреждения, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, бокового амиотрофического склероза и воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и колита).

[0065] Альтернативный вариант 54 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 51-53, где активатор NKT-2 включает по меньшей одно из милтефозина, аналога милтефозина или фосфолипида.

[0066] Альтернативный вариант 55 включает композицию согласно альтернативному варианту 54, где фосфолипид включает лизофосфатидилхолин (LPC), аналог LPC, лизо-фактор активации тромбоцитов (LPAF), лизосфингомиелин (LSM) или аналог LSM.

[0067] Альтернативный вариант 56 включает композицию согласно альтернативному варианту 55, где LPC включает одно из LPC (С18:0), LPC (С16:0), LPC (C18:1(9Z)), LPC(С18:1(1-олеил)) или LignA(LPC)(C24:0).

[0068] Альтернативный вариант 57 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 51-53, где фосфолипид включает по меньшей одно из милтефозина или аналога милтефозина.

[0069] Альтернативный вариант 58 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 54-57, где аналог милтефозина включает соединение, приведенное в таблице 2.1 или в таблице 2.2.

[0070] Альтернативный вариант 59 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 51-57, где аналог милтефозина включает соединение, приведенное в таблице 2.1.

[0071] Альтернативный вариант 60 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 51-53, где активатор NKT-2 включает милтефозин.

[0072] Альтернативный вариант 61 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 52-60, где агонист RAR включает ATRA или изотретиноин.

[0073] Альтернативный вариант 62 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 52-60, где агонист RAR включает тазаротен.

[0074] Альтернативный вариант 63 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 52-60, где агонист RAR включает ретинол или сложный эфир ретинола.

[0075] Альтернативный вариант 64 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 51-63, где композиция предназначена для перорального введения.

[0076] Альтернативный вариант 65 включает композицию для применения для облегчения или предотвращения по меньшей мере одного воспалительного состояния у субъекта, содержащую количество активатора NKT-2 и количество сульфатида, где, взятые вместе, количество активатора NKT-2 и количество сульфатида являются достаточными для активации NKT-клеток II типа у субъекта.

[0077] Альтернативный вариант 66 включает композицию согласно альтернативному варианту 61, где воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из: жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, аутоиммунного гепатита, рассеянного склероза, диабета 1 типа, ишемического и реперфузионного повреждения, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, бокового амиотрофического склероза и воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и колита).

[0078] Альтернативный вариант 67 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 65-66, где количество активатора NKT-2 является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта, и количество сульфатида является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта.

[0079] Альтернативный вариант 68 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 65-67, где активатор NKT-2 включает по меньшей одно из милтефозина, аналога милтефозина или фосфолипида.

[0080] Альтернативный вариант 69 включает композицию согласно альтернативному варианту 68, где фосфолипид включает лизофосфатидилхолин (LPC), аналог LPC, лизо-фактор активации тромбоцитов (LPAF), лизосфингомиелин (LSM) или аналог LSM.

[0081] Альтернативный вариант 70 включает композицию согласно альтернативному варианту 69, где LPC включает одно из LPC (С18:0), LPC (С16:0), LPC (C18:1(9Z)), LPC(С18:1(1-олеил)) или LignA(LPC)(C24:0).

[0082] Альтернативный вариант 71 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 65-67, где активатор NKT-2 включает по меньшей одно из милтефозина или аналога милтефозина.

[0083] Альтернативный вариант 72 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 68-71, где аналог милтефозина включает соединение, приведенное в таблице 2.1 или в таблице 2.2.

[0084] Альтернативный вариант 73 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 68-71, где аналог милтефозина включает соединение, приведенное в таблице 2.1.

[0085] Альтернативный вариант 74 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 65-67, где активатор NKT-2 включает милтефозин.

[0086] Альтернативный вариант 75 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 65-74, где сульфатид имеет следующую химическую структуру:

где R1 выбран из группы, состоящей из связи, водорода, C₁-C₃₀ алкила, C₁-C₃₀ замещенного алкила, C₁-C₃₀ алкенила, C₁-C₃₀ замещенного алкенила и С₅-С₁₂ сахара; R₂ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы и алкоксигруппы; R₃ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы, этоксигруппы и алкоксигруппы; R₄ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы и алкоксигруппы; R₅ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксила, карбонила, алкокси и связи; R₆ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀ алкила, С₁-С₄₀ замещенного алкила, С₁-С₄₀ алкенила, С₁-С₄₀ замещенного алкенила и С₁-С₄₀ алкинила; R₇ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀ алкила, С₁-С₄₀ замещенного алкила, С₁-С₄₀ алкенила, С₁-С₄₀ замещенного алкенила и C₁-С₄₀ алкинила; и R₈ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксильной группы, карбонила, алкоксигруппы и связи.

[0087] Альтернативный вариант 76 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 65-74, где сульфатид имеет следующую химическую структуру:

[0088] Альтернативный вариант 77 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 65-76, где композиция дополнительно содержит количество агониста RAR, которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа у субъекта.

[0089] Альтернативный вариант 78 включает композицию согласно альтернативному варианту 77, где агонист RAR включает ATRA или изотретиноин.

[0090] Альтернативный вариант 79 включает композицию согласно альтернативному варианту 77, где агонист RAR включает тазаротен.

[0091] Альтернативный вариант 80 включает композицию согласно альтернативному варианту 77, где агонист RAR включает ретинол или сложный эфир ретинола.

[0092] Альтернативный вариант 81 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 1-50, где воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из: жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, ишемического и реперфузионного повреждения, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, бокового амиотрофического склероза и воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и колита).

[0093] Альтернативный вариант 82 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 1-50 или 81, где количество активатора NKT-2 является достаточным для активации CD8αα⁺ Т-клеток в печени субъекта.

[0094] Альтернативный вариант 83 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 1-50 или 81-82, дополнительно включающий введение выделенных CD8αα⁺, TCRαβ⁺ Т-клеток субъекту.

Альтернативный вариант 84 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 82-83, где выделенные CD8αα⁺, TCRαβ⁺ Т-клетки вводят субъекту перед введением активатора NKT-2.

Альтернативный вариант 85 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 82-83, где выделенные CD8αα⁺, TCRαβ⁺ Т-клетки вводят субъекту одновременно с активатором NKT-2.

Альтернативный вариант 86 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 82-83, где выделенные CD8αα⁺, TCRαβ⁺ Т-клетки вводят субъекту после активатора NKT-2.

[0095] Альтернативный вариант 87 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 82-87, дополнительно включающий получение образца клеток у млекопитающего, выделение CD8αα⁺, TCRαβ⁺ Т-клеток из образца клеток и выращивание выделенных Т-клеток.

[0096] Альтернативный вариант 88 включает способ согласно альтернативному варианту 87, где млекопитающее представляет собой субъекта.

[0097] Альтернативный вариант 89 включает способ согласно альтернативному варианту 87, где млекопитающее представляет собой организм, отличный от субъекта.

[0098] Альтернативный вариант 90 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 82-89, где выделенные Т-клетки представляют собой CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺.

[0099] Альтернативный вариант 91 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 82-89, где выделенные Т-клетки представляют собой CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD122⁺.

[0100] Альтернативный вариант 92 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 82-89, где выделенные Т-клетки представляют собой CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺, CD122⁺.

[0101] Альтернативный вариант 93 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 82-92, где выделенные Т-клетки представляют собой смесь двух или более типов клеток, выбранных из CD8αα⁺ TCRαβ⁺ Т-клеток, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD200⁺ Т-клеток, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD122⁺ Т-клеток и CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺ CD122⁺ Т-клеток.

[0102] Альтернативный вариант 94 включает способ облегчения или предотвращения по меньшей мере одного воспалительного состояния у субъекта, включающий введение выделенных CD8αα+, TCRαβ+ Т-клеток субъекту и введение количества активатора NKT-2, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта.

[0103] Альтернативный вариант 95 включает способ согласно альтернативному варианту 94, где воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из: жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, аутоиммунного гепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, ишемического и реперфузионного повреждения, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, бокового амиотрофического склероза и воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и колита).

[0104] Альтернативный вариант 96 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 94-95, где активатор NKT-2 включает по меньшей одно из милтефозина или аналога милтефозина.

[0105] Альтернативный вариант 97 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 94-95, где активатор NKT-2 включает милтефозин.

[0106] Альтернативный вариант 98 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 94-97, где количество активатора NKT-2 является достаточным для активации CD8αα⁺ Т-клеток в печени субъекта.

[0107] Альтернативный вариант 99 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 94-98, где выделенные CD8αα⁺, TCRαβ⁺ Т-клетки вводят субъекту перед введением активатора NKT-2.

[0108] Альтернативный вариант 100 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 94-98, где выделенные CD8αα⁺, TCRαβ⁺ Т-клетки вводят субъекту одновременно с активатором NKT-2.

[0109] Альтернативный вариант 101 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 94-98, где выделенные CD8αα⁺, TCRαβ⁺ Т-клетки вводят субъекту после активатора NKT-2.

[0110] Альтернативный вариант 102 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 94-101, дополнительно включающий получение образца клеток у млекопитающего, выделение CD8αα⁺, TCRαβ⁺ Т-клеток из образца клеток и выращивание выделенных Т-клеток.

[0111] Альтернативный вариант 103 включает способ согласно альтернативному варианту 102, где млекопитающее представляет собой субъекта.

[0112] Альтернативный вариант 104 включает способ согласно альтернативному варианту 102, где млекопитающее представляет собой организм, отличный от субъекта.

[0113] Альтернативный вариант 105 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 94-104, где выделенные Т-клетки представляют собой CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺.

[0114] Альтернативный вариант 106 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 94-104, где выделенные Т-клетки представляют собой CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD122⁺.

[0115] Альтернативный вариант 107 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 94-104, где выделенные Т-клетки представляют собой CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺, CD122⁺.

[0116] Альтернативный вариант 108 включает способ согласно любому из альтернативных вариантов 94-104, где выделенные Т-клетки включают смесь двух или более типов клеток, выбранных из CD8αα⁺ TCRαβ⁺ Т-клеток, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD200⁺ Т-клеток, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD122⁺ Т-клеток и CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺ CD122⁺ T-клеток.

[0117] Альтернативный вариант 109 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 51-80, где воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из: жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, ишемического и реперфузионного повреждения, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, бокового амиотрофического склероза и воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и колита).

[0118] Альтернативный вариант 110 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 51-80 или 109, где количество активатора NKT-2 является достаточным для активации CD8αα+ Т-клеток в печени субъекта.

[0119] Альтернативный вариант 111 включает композицию согласно любому из альтернативных вариантов 51-80 или 109 или 110, дополнительно содержащую выделенные CD8αα+, TCRαβ+ Т-клетки, для применения для введения субъекту.

[0120] Альтернативный вариант 112 включает композицию согласно альтернативному варианту 111, где выделенные Т-клетки представляют собой CD8αα+, TCRαβ+, CD200+.

[0121] Альтернативный вариант 113 включает композицию согласно альтернативному варианту 111, где выделенные Т-клетки представляют собой CD8αα+, TCRαβ+, CD122+. Альтернативный вариант 114 включает композицию согласно альтернативному варианту 111, где выделенные Т-клетки представляют собой CD8αα+, TCRαβ+, CD200+, CD122+.

[0122] Альтернативный вариант 115 включает композицию согласно альтернативному варианту 111, где выделенные Т-клетки включают смесь двух или более типов клеток, выбранных из CD8αα⁺ TCRαβ⁺ Т-клеток, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD200⁺ Т-клеток, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD122⁺ Т-клеток и CD8αα⁺, TCRαβ⁺ CD200⁺ CD122⁺ T-клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0123] На фигуре 1 приведен график, на котором изображена стимуляция NKT-клеток II типа милтефозином согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.

[0124] На фигуре 2А приведен график, на котором изображено подавление роста NKT-клеток I типа после инъекции милтефозина согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.

[0125] На фигуре 2В приведена серия графиков, на которых изображены данные проточной цитометрии, где показано подавление роста NKT-клеток I типа после инъекции милтефозина согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.

[0126] На фигуре 3А приведен график, на котором изображено подавление гепатита, индуцированного ConA, после лечения с применением милтефозина согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.

[0127] На фигуре 3B приведена серия микроскопических изображений, на которых показано подавление гепатита, индуцированного ConA, после лечения с применением милтефозина согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения. Фигура 3С представляет собой черно-белую репродукцию фигуры 3B.

[0128] На фигуре 4А приведен график, на котором изображено подавление накопления NKT-клеток I типа при алкогольной болезни печени (АБП) у мышей, которым проводили лечение с применением милтефозина согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.

[0129] На фигуре 4B приведена серия графиков, на которых изображены данные проточной цитометрии, где показано подавление накопления NKT-клеток I типа при алкогольной болезни печени (АБП) у мышей, которым проводили лечение с применением милтефозина согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.

[0130] На фигуре 4С приведен график, на котором изображено подавление накопления активированных (CD69⁺) NKT-клеток I типа при алкогольной болезни печени (АБП) у мышей, которым проводили лечение с применением милтефозина согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.

[0131] На фигуре 4D приведен график, на котором изображено подавление накопления нейтрофилов при алкогольной болезни печени (АБП) у мышей, которым проводили лечение с применением милтефозина согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.

[0132] На фигуре 5 приведен график, на котором изображены результаты лечения хронического и рецидивирующего экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ), прототипа рассеянного склероза, с применением милтефозина согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.

[0133] На фигуре 6 приведен график, на котором изображены результаты лечения хронического экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ), прототипа рассеянного склероза, с применением сульфатида.

[0134] На фигуре 7 приведен график, на котором показано, что рост NKT-клеток I типа in vitro в МКПК человека подавляется после лечения с применением милтефозина согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.

[0135] На фигурах 8А и 8B приведена пара графиков, на которых изображены средние индексы заболевания у мышей, которым вводили различные количества выращенных популяций T_reg-клеток в зависимости от количества дней после индуцирования ЭАЭ путем инъекции МВРАс1-9 (основный белок миелина) согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения. На фигуре 8А изображены результаты у мышей, которым путем инъекции вводили клетки 2D11. На фигуре 8B изображены результаты у мышей, которым вводили путем инъекции р42-50-реакционную линию Т-клеток.

[0136] На фигурах 9А-9С приведена серия графиков, на которых показано, что лечение мышей с применением агонистичного mAb к Vβ6 in vivo приводит к активации CD8αα⁺ Vβ6⁺ Т-клеток и предотвращению ЭАЭ согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения. На фигуре 9А изображены характеристики клеток, определенные путем проточной цитометрии. На фигуре 9В изображены относительные количества Vβ6 и Vβ8.2, определенные на основании данных ПЦР в реальном времени. На фигуре 9С изображено относительное количество в процентах TL-тетрамеров/CD8+ Т-клеток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0137] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции, содержащие количество активатора NKT-2, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа, можно применять для облегчения или предотвращения каких-либо воспалительных состояний. Без конкретного теоретического обоснования, предполагается, что при активации NKT-клетки II типа могут подавлять активацию NKT-клеток I типа и, таким образом, могут облегчать или предотвращать повреждение, опосредованное NKT-клетками I типа, связанное с воспалением. Соответственно, в некоторых вариантах реализации способы облегчения или предотвращения воспалительных состояний включают введение композиции, содержащей количество активатора NKT-2, например, милтефозина или аналога милтефозина, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа. Композиция необязательно может содержать количество сульфатида, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа. Композиция необязательно может содержать количество агониста RAR, которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа.

NKT-клетки

[0138] В печени содержится ряд специализированных клеток врожденной иммунной системы, включая клетки Купфера, клетки-натуральные киллеры (NK), Т-клетки-натуральные киллеры (NKT) и дендритные клетки. NKT-клетки являются уникальными, поскольку они имеют такие же рецепторы клеточной поверхности, что и NK-клетки (например, NK1.1) и при этом экспрессируют Т-клеточные рецепторы (TCR), что позволяет им распознавать липидные антигены в контексте молекул CD1d и обеспечивать переход врожденных иммунных ответов в адаптивный иммунитет. NKT-клетки обладают способностью регулировать активность других клеток, которые ответственны за воспаление в тканях и связанное с ним повреждение клеток. При активации NKT-клетки быстро секретируют большие количества интерферона-гамма, интерлейкина 4 (IL-4), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, а также множества других цитокинов и хемокинов. Так как NKT-клетки могут секретировать Th1 и Th2 цитокины, последствия активации NKT-клеток in vivo могут быть трудно прогнозируемыми. В зависимости от условий активация NKT-клеток запускает каскады явлений, которые стимулируют или подавляют различные иммунные ответы. В некоторых условиях активация NKT-клеток приводит к активации NK-клеток, дендритных клеток (DC) и В-клеток. Аспекты NKT-клеток обсуждаются в Kumar, "NKT-cell subsets: Promoters and protectors in inflammatory liver disease" Journal of Hepatology, 2013, 59: 618-620, содержание которой включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.

[0139] NKT-клетки распознают липидные антигены, презентируемые в контексте мономорфных молекул, подобных ГКГС I класса, CD1d. CD1d-ограниченные NKT-клетки разделяют на клетки I типа (которые также называют «NKT-клетки I типа» или клетки «NKT-1») и клетки II типа (которые также называют «NKT-клетки II типа» или клетки «NKT-2»), которые распознают различные липидные антигены, презентируемые молекулами CD1d. Несмотря на то, что обе подгруппы NKT-клеток, главным образом, представляют собой NK1.1+ (у мышей) или CD161+/CD56+ (у человека), их относительное количество различается у мышей и человека: таким образом, в то время, как у мышей, главным образом содержатся NKT-клетки I типа, у человека преобладает подгруппа NKT-клеток II типа.

[0140] Клетки I типа, также известные как инвариантные NKT-клетки, экспрессируют полуинвариантный Т-клеточный рецептор (TCR), характеризующийся Vα14-Jα18 и Vβ8.2, Vβ7 или Vβ2 у мышей или Vα24-JαQ и Vβ11 у человека, имеют высокую реакционную активность в отношении гликолипида альфа-галактозилкерамида, выделенного из морских губок («альфа-GalCer» или «αGalCer»), и их выявляют в проточной цитометрии по альфа-GalCer/CD1d-тетрамерам. NKT-клетки I типа также распознают антигены на основе липидов, таких как бактериальные липиды и гликолипиды хозяина, изоглоботригексозил-керамид (iGb3). NKT-клетки I типа имеют маркеры памяти и обладают уникальной способностью хранения образованных ранее мРНК для цитокинов. У мышей, у которых отсутствует ген Jα18 (мыши Jα18), наблюдают дефицит только NKT-клеток I типа.

[0141] NKT-клетки II типа, которые отличаются от NKT-клеток I типа, представляют собой регуляторные клетки, которые могут модулировать активность нескольких других подгрупп клеток, включая NKT-клетки I типа. NKT-клетки II типа распознают гликолипид хозяина, сульфатид (3'-сульфогалактозил-керамид) у мышей и человека. Основная подгруппа NKT-клеток II типа, которые могут быть выявлены по тетрамерам сульфатид/CD1d в проточной цитометрии, главным образом используют сегменты генов Vβ8.1/Vβ3.1-Jβ2.7 и Vα1/Vα3-Jα7 и обладают реакционной активностью в отношении сульфатидов. Активацию NKT-клеток II типа можно оценивать путем определения пролиферативного ответа NKT-клеток II типа in vitro в отношении потенциального агента, а также путем определения экспрессии CD69 и профиля секреции цитокинов путем внутриклеточного окрашивания цитокинов или ПЦР в реальном времени в отношении IFN-гамма, IL-4 или IL-13. Кроме того, способность активированных NKT-клеток II типа подавлять NKT-клетки I типа можно оценивать путем определения пролиферативного ответа NKT-клеток I типа на альфа-GalCer (высокоактивный активатор NKT-клеток I типа) при помощи анализа разбавления CF8E и внутриклеточного окрашивания цитокинов в тетрамерных клетках альфа-GalCer/CO1d. Активацию NKT-клеток (I типа или II типа) согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно оценивать количественно при помощи коэффициента стимуляции, определяемого по встраиванию тимидина (см., например, фигуру 2А).

[0142] В настоящем тексте «активаторы NKT-2», включая вариации этого общего термина, относятся к соединениям, который при контакте с NKT-клетками II типа индуцируют по меньшей мере один процесс, выбранный из секреции IL-2 NKT-клетками II типа, пролиферации NKT-клеток II типа или повышенной экспрессии CD69 на поверхности NKT-клеток II типа. Типовые активаторы NKT-2, подходящие для применения в способах, наборах и композициях, предложенных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, милтефозин, аналоги милтефозина (например, соединения, перечисленные в таблице 2.1 и в таблице 2.2), фосфолипиды, такие как лизофосфатидилхолин (LPC) (например, LPC (С18:0), LPC (С16:0), LPC (C18:1(9Z)), LPC(С18:1(1-олеил)) и/или LignA(LPC)(C24:0)), аналог LPC, лизо-фактор активации тромбоцитов (LPAF), лизосфингомиелин (LSM) и/или аналог LSM. Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что активаторы NKT-2 согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения могут таким образом активировать NKT-клетки II типа, которые в свою очередь могут подавлять активацию NKT-клеток I типа.

[0143] В некоторых вариантах реализации активация NKT-клеток II типа включает секрецию IL-2 NKT-клетками II типа, пролиферацию NKT-клеток II типа, повышенную экспрессию CD69 на поверхности NKT-клеток II типа, любые два из указанных процессов, любые три из указанных процессов или все четыре указанных процесса.

[0144] В некоторых вариантах реализации подавление активации NKT-клеток I типа включает подавление пролиферации NKT-клеток I типа, снижение накопления NKT-клеток I типа, пониженную экспрессию CD69 на поверхности NKT-клеток I типа, любые два из указанных процессов или все три указанных процесса.

Активаторы NKT-2 и NKT-клетки I типа и II типа после ишемического и реперфузионного повреждения

[0145] Реперфузионное повреждение возникает при восстановлении кровоснабжения органа или ткани после ишемии. Реперфузионное повреждение печени обычно возникает в результате хирургического вмешательства или травмы и играет важную роль для качества и функции ткани трансплантата после трансплантации печени. Развитие ишемического и реперфузионного повреждения (ИРП) включает по меньшей мере две фазы: начальный период (от примерно 1 до примерно 6 часов после реперфузии), который определяется, главным образом активацией клеток Купфера, высвобождением активных форм кислорода, рекрутингом CD4⁺ клеток и секрецией провоспалительных цитокинов, и поздний период (после начальной фазы от примерно 6 до примерно 48 часов после реперфузии), который характеризуется накоплением нейтрофилов и индукцией некроза. Как правило, после ишемической реперфузии также происходит активация NKT-клеток I типа и секреция IFN-гамма. Было показано, что введение активаторов NKT-2, таких как милтефозин, может стимулировать NKT-клетки II типа (см. фигуру 1) и подавлять рост NKT-клеток I типа (см. фигуру 2А и фигуру 2В), таким образом, предполагается, что активаторы NKT-2, такие как милтефозин и аналоги милтефозина и фосфолипиды, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять для подавления активации NKT-клеток I типа, связанной с ишемической реперфузией.

[0146] Соответственно, в некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая количество активатора NKT-2, например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа, для применения в лечении, ослаблении, предотвращении или снижении риска развития ишемического и реперфузионного повреждения. Композиция необязательно дополнительно содержит количество агониста RAR, например, тазаротена, которое является достаточным для подавления NKT-клеток I типа. Композиция необязательно дополнительно содержит сульфатид в количестве, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа. В некоторых вариантах реализации композицию вводят субъекту, страдающему от или имеющему риск развития ишемического и реперфузионного повреждения.

[0147] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая некоторое количество активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида) и некоторое количество сульфатида, которые, взятые вместе, являются достаточными для активации NKT-клеток II типа, для применения в лечении, ослаблении, предотвращении или снижении риска развития ишемического и реперфузионного повреждения. Композиция необязательно дополнительно содержит количество агониста RAR (например, тазаротена), которое является достаточным для подавления NKT-клеток I типа. В некоторых вариантах реализации композицию вводят субъекту, страдающему от или имеющему риск развития ишемического и реперфузионного повреждения. Композиция необязательно предназначена для перорального введения.

[0148] В некоторых вариантах реализации количество активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида), которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа, вводят субъекту, страдающему от или имеющему риск ИРП. Необязательно субъекту вводят количество агониста RAR (например, тазаротена), которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа. Введение необязательно является пероральным. Необязательно субъекту дополнительно вводят количество сульфатида, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа. В некоторых вариантах реализации активатор NKT-2 и агонист RAR вводят одновременно. В некоторых вариантах реализации активатор NKT-2 и агонист RAR вводят раздельно. В некоторых вариантах реализации сначала вводят активатор NKT-2 и затем вводят агонист RAR. В некоторых вариантах реализации сначала вводят агонист RAR и затем вводят активатор NKT-2. В некоторых вариантах реализации проводят чередующееся введение агониста RAR и активатора NKT-2.

Активаторы NKT-2 и активированные NKT-клетки I типа и II типа при заболевании печени

[0149] Согласно описанию патента США №8044029 и опубликованной заявки на патент США №2011/0118197 и опубликованной заявки на патент США №2014/0187504, содержание каждой из которых включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, введение гликолипидного лиганда хозяина, сульфатида, а также синтетических аналогов сульфатида может модулировать активность NKT-клеток I типа и II типа. Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что CD1d-зависимое распознавание сульфатида активирует NKT-клетки II типа и, главным образом, плазмацитоидные дендритные клетки (pDC), но не популяции типичных дендритных клеток (cDC) (которые в обычных условиях активируются NKT-клетками I типа), что приводит к быстрому рекрутингу NKT-клеток I типа в печени, опосредуемому IL-12 и MIP2. Тем не менее, рекрутированные NKT-клетки I типа не активируются, не секретируют цитокины и бездействуют. Было показано, что введение сульфатида in vivo а) подавляет пролиферацию NKT-клеток I типа in vivo в ответ на стимуляцию альфа-GalCer, и b) повышает долю сульфатид/CD1d-тетрамер + клеток с внутрицитоплазматическим окрашиванием IFN-гамма.

[0150] Было обнаружено, что секреция IFN-гамма NKT-клетками I типа в печени в ранней фазе ишемического и реперфузионного повреждения значительно понижается у мышей, которым вводят сульфатид, по сравнению с животными, которым такое лечение не проводят. Кроме того, как и в случае мышей Jα18^-/-, у которых отсутствуют NKT-клетки I типа, повреждение печени после ишемии/реперфузии значительно понижено у мышей, которым проводят лечение с применением сульфатида. Данное наблюдение указывает на патогенную роль NKT-клеток I типа при опосредовании ишемического и реперфузионного повреждения печени. Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что влияние секреции IFN-гамма NKT-клетками I типа может быть общим отличительным признаком ишемического повреждения органа, так как ишемическое и реперфузионное повреждение почки также ослаблены у мышей Jα18^-/-, у которых отсутствуют NKT-клетки I типа.

[0151] Аналогично ИРП введение сульфатида или активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида) может обеспечивать защиту от гепатита, индуцированного конканавалином А (ConA), на что указывает пониженный некроз клеток печени и пониженные уровни аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке, которые являются маркерами повреждения клеток печени. Кроме того, введение милтефозина за 12 часов перед ConA понижало уровень ALT в сыворотке через 24 часа (фигура 3А) и понижало некроз клеток при определении по гемотоксин-эозиновому окрашиванию отделов печени (фигура 3B). Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что данные наблюдения указывают на патогенную роль NKT-клеток I типа при гепатите, индуцированном ConA, и защитную роль сульфатида и/или фосфолипида (например, милтефозина или аналога милтефозина).

[0152] Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что данные, полученные в двух моделях повреждения печени, ИРП и гепатита, индуцированного ConA, соответствуют иммунорегуляторному пути, при котором NKT-клетки I типа играют отрицательную роль, и NKT-клетки II типа, способные взаимодействовать с сульфатидом/активатором NKT-2, играют защитную роль при воспалении печени, возникающем по различным причинам. Указанное защитное действие связано с ингибированием секреции цитокинов NKT-клетками I типа (подавленный фенотип) и значительным снижением рекрутинга незрелых миелоидных клеток (CD11b+Gr-1+) CD11b+Gr-1- и NK-клеток. Подавление NKT-клеток I типа также связано с приобретением толерантности или модификацией типичных дендритных клеток (cDC), и они совместно с подавленными NKT-клетками I типа подавляют активацию/рост адаптивных Th1/Th17 CD4+/CD8+ Т-клеток. Это приводит к модели, в которой введение сульфатида и/или активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида) стимулирует активность NKT-клеток II типа, которые в свою очередь подавляют активность NKT-клеток I типа и повреждение печени, вызванное воспалением, опосредованным NKT-клетками I типа.

[0153] Соответственно, в некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая количество активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида), которое является достаточным для активации NKT-клеток I типа, для применения в лечении повреждения печени или заболевания печени. Композиция необязательно дополнительно содержит количество агониста RAR (например, тазаротена), которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа. Композиция необязательно дополнительно содержит количество сульфатида, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа. В некоторых вариантах реализации композицию вводят субъекту, страдающему от повреждения печени или имеющему риск развития повреждения печени или заболевания печени, например, жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой.

[0154] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая количество активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида) и количество сульфатида, которые, взятые вместе, являются достаточными для активации NKT-клеток II типа, для применения в лечении, ослаблении, предотвращении или снижении риска развития повреждения печени или заболевания печени. Композиция необязательно дополнительно содержит количество агониста RAR (например, тазаротена), которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа. В некоторых вариантах реализации композицию вводят субъекту, страдающему от или имеющему риск развития повреждения печени или заболевания печени, например, жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой.

[0155] В некоторых вариантах реализации количество активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида), которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа, вводят субъекту, страдающему от или имеющему риск повреждения печени или заболевания печени. Необязательно субъекту вводят количество агониста RAR (например, тазаротена), которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа. Введение необязательно является пероральным. Необязательно субъекту дополнительно вводят количество сульфатида, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа. В некоторых вариантах реализации активатор NKT-2 и агонист RAR вводят одновременно. В некоторых вариантах реализации активатор NKT-2 и агонист RAR вводят раздельно. В некоторых вариантах реализации сначала вводят активатор NKT-2 и затем вводят агонист RAR. В некоторых вариантах реализации сначала вводят агонист RAR и затем вводят активатор NKT-2. В некоторых вариантах реализации проводят чередующееся введение агониста RAR и активатора NKT-2. В некоторых вариантах реализации субъект страдает от или имеет риск развития повреждения печени или заболевания печени, например, жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой.

NKT-клетки при алкогольной болезни печени

[0156] Алкогольная болезнь печени (АБП) развивается в результате повреждения клеток печени, вызванного избыточным употреблением алкоголя. Для клинического проявления АБП могут требоваться несколько эпизодов повреждения. Тем не менее, было обнаружено, что при хроническом употреблении алкоголя в печени наблюдают значительно повышенное количество NKT-клеток I типа (альфа-GalCer/CD1d-тетрамер + клетки), CD4+ клеток и CD11b+Gr-1+ миелоидных клеток, но не NKT-клеток II типа или CD11b+Gr-1- клеток. Повышенная экспрессия маркера CD69 является дополнительным подтверждением того, что по меньшей мере часть NKT-клеток I типа являются активированными. Таким образом, даже в отсутствие каких-либо клинических признаков заболевания (предболезненная стадия) клетки, опосредующие воспалительный ответ, накапливаются в печени при избыточном употреблении алкоголя. В отсутствие NKT-клеток I типа (у мышей Jα18-/-) накопление CD11b+Gr-1+ миелоидных клеток в печени при хроническом употреблении алкоголя значительно понижается. Без ограничения какой-либо теорией, считают, что полученные данные позволяют предположить участие NKT-клеток I типа в опосредовании предболезненной фазы АБП.

[0157] В соответствии с данными, указывающими на роль NKT-клеток I типа в предболезненной фазе АБП, клинические проявления повреждения печени после избыточного употребления алкоголя у мышей с дефицитом NKT-клеток I типа (Jα18-/-) значительно понижены при измерении, например, гистологическими методами и при помощи анализа ферментов печени. Без ограничения какой-либо теорией, считают, что полученные данные позволяют предположить важную роль NKT-клеток I типа при алкогольном повреждении печени.

[0158] NKT-клетки экспрессируют Т-клеточные рецепторы, которые позволяют им распознавать липидные антигены в контексте молекул CD1d. Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что NKT-клетки I типа активируются в печени после употребления алкоголя за счет локального накопления окисленных липидов хозяина в результате активности антиген-презентирующих клеток (АРС), экспрессирующих CD1d. Затем активированные NKT-клетки I типа инициируют многостадийный процесс, который приводит к активации клеток Купфера, рекрутингу/активации гранулоцитов и последующему воспалительному повреждению гепатоцитов.

[0159] Как показано на фигуре 4А и фигуре 4B введение милтефозина совместно с этанолом в модели алкогольной болезни печени у мышей подавляло накопление NKT-клеток I типа по сравнению с введением только этанола. Кроме того, как показано на фигуре 4С, введение милтефозина совместно с этанолом также обеспечивало снижение уровня активированных (CD69⁺) NKT-клеток по сравнению с введением только этанола. Кроме того, как показано на фигуре 4D, введение милтефозина совместно с этанолом также понижало уровень нейтрофилов по сравнению с введением только этанола.

[0160] Взаимодействие подтипов NKT-клеток после употребления этанола создает условия для повреждения печени и в тяжелых случаях для алкогольной болезни печени (АБП). Несколько вариантов реализации, описанных в настоящем документе, относятся к способам и композициям для регулирования взаимно противоположного действия NKT-клеток I типа и NKT-клеток II типа и их взаимодействий с другими клетками печени для излечения, облегчения или предотвращения повреждения печени после употребления алкоголя.

[0161] Лечение с применением сульфатида обеспечивает практически полную защиту от повреждения печени в результате избыточного потребления алкоголя. Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что защитное действие сульфатида может быть опосредовано прямой активацией NKT-клеток II типа, которые обеспечивают ингибирующее действие в отношении NKT-клеток I типа и cDC.

[0162] Соответственно, некоторые варианты реализации настоящего изобретения относятся к модуляции активности подтипов NKT-клеток для лечения, ослабления и/или предотвращения алкогольного повреждения печени. Согласно настоящему описанию введение активаторов NKT-2 (например, милтефозина), сульфатидов или агонистов рецептора ретиноевой кислоты (RAR) подавляет алкогольное повреждение печени. Например, пероральное введение милтефозина снижает накопление и активацию NKT-клеток I типа и накопление нейтрофилов, индуцированное этанолом (см. фигуры 4А, 4B, С и 4D).

[0163] Несколько вариантов реализации относятся к защитному действию основной подгруппы NKT-клеток II типа при алкогольном повреждении печени, которые обладают реакционной активностью в отношении сульфатида. Активация указанной подгруппы NKT-клеток сульфатидом подавляет повреждение, опосредованное NKT-клетками I типа, после избыточного употребления алкоголя. Опосредованная сульфатидом защита связана с активацией NKT-клеток II типа и подавлением секреции IFN-гамма NKT-клетками I типа в печени и подавлением рекрутинга миелоидных клеток, опосредованного NKT-клетками I типа, например, подгрупп CD11b⁺Gr-1^int и Gr-1^-, и NK-клеток в печени.

[0164] Соответственно, в некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая количество активаторов NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина), которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа, для применения для лечения, облегчения или предотвращения алкогольной болезни печени. Композиция необязательно дополнительно содержит количество агониста RAR (например, тазаротена), которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа. Композиция необязательно предназначена для перорального введения.

[0165] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая количество активаторов NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина) и количество сульфатида, которые, взятые вместе, являются достаточными для активации NKT-клеток II типа, для применения в лечении, ослаблении, предотвращении или снижении риска алкогольной болезни печени. Композиция необязательно дополнительно содержит количество агониста RAR (например, тазаротена), которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа. Композиция необязательно предназначена для перорального введения.

[0166] В некоторых вариантах реализации количество активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина), которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа, вводят субъекту, страдающему от или имеющему риск развития алкогольной болезни печени. Необязательно субъекту вводят количество агониста RAR (например, тазаротена), которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа. Введение необязательно является пероральным. Необязательно субъекту дополнительно вводят количество сульфатида, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа. В некоторых вариантах реализации активатор NKT-2 и агонист RAR вводят одновременно. В некоторых вариантах реализации активатор NKT-2 и агонист RAR вводят раздельно. В некоторых вариантах реализации сначала вводят активатор NKT-2 и затем вводят агонист RAR. В некоторых вариантах реализации сначала вводят агонист RAR и затем вводят активатор NKT-2. В некоторых вариантах реализации проводят чередующееся введение агониста RAR и активатора NKT-2.

Сульфатиды

[0167] В некоторых вариантах реализации сульфатид содержит, например, сульфатид, выделенный из мозга быков, который представляет собой смесь примерно 20 различных соединений, полученный в Sigma Inc. (Chicago, IL, USA). В других вариантах реализации сульфатид является полусинтетическим и содержит отдельные соединения сульфатида, например, цис-тетракозеноил-сульфатид или лизосульфатид, полученный в Maitreya Inc, (Pleasant Gap, PA, USA). В других вариантах реализации сульфатид может представлять собой полностью синтетический сульфатид.

[0168] Сульфатид, выделенный из миелина мозга быков, состоит из смеси 2:1 насыщенных/ненасыщенных основных ацильных цепей (С₂₄), где ненасыщенный участок содержится при С₁₉. Несколько вариантов реализации относятся к применению синтетических аналогов сульфатида, таких как аналоги с насыщенной ацильной цепью (С₂₄) и ненасыщенными цепями (С₂₄: 1), а также аналоги, состоящие из ацильных цепей жирных кислот с различной длиной или фрагментов сфингозина (более коротких, а также более длинных, например, C₁₈, С₃₂), и позиционные изомеры, содержащие 3' и 4'-сульфатированную группу при фрагменте галактозы (3'-803 и 4'-803).

[0169] В некоторых вариантах реализации сульфатид имеет следующую химическую формулу I:

Формула I

[0170] где R₁ может представлять собой связь, водород, C₁-C₃₀ алкил, C₁-C₃₀ замещенный алкил, C₁-C₃₀ алкенил, C₁-C₃₀ замещенный алкенил или С₅-С₁₂ сахар; R₂ может представлять собой водород, гидроксигруппу, метоксигруппу или алкоксигруппу; R₃ может представлять собой водород, гидроксигруппу, метоксигруппу, этоксигруппу или алкоксигруппу; R₄ может представлять собой водород, гидроксигруппу или алкоксигруппу; R₅ может представлять собой водород, гидроксигруппу, карбонил, алкоксигруппу или связь; R₆ может представлять собой C₁-С₄₀ алкил, С₁-С₄₀ замещенный алкил, С₁-С₄₀ алкенил, С₁-С₄₀ замещенный алкенил или С₁-С₄₀ алкинил; R7 может представлять собой С₁-С₄₀ алкил, С₁-С₄₀ замещенный алкил, С₁-С₄₀ алкенил, С₁-С₄₀ замещенный алкенил или С₁-С₄₀ алкинил; и R₈ может представлять собой водород, гидроксигруппу, карбонил, алкоксигруппу или связь.

[0171] В других вариантах реализации сульфатид имеет следующую химическую формулу II:

Формула II

[0172] где R₁ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀ алкила, С₁-С₄₀ замещенного алкила, С₁-С₄₀ алкенила, С₁-С₄₀ замещенного алкенила и С₁-С₄₀ алкинила; и R₂ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксильной группы, карбонила, алкоксигруппы и связи.

[0173] В других вариантах реализации сульфатид имеет следующую химическую структуру:

Формула III

[0174] В настоящем тексте термин «алкил» обозначает любой неразветвленный или разветвленный насыщенный углеводород. Термин «замещенный алкил» обозначает любой неразветвленный или разветвленный замещенный насыщенный углеводород. Циклические соединения, включая циклические углеводороды и циклические соединения, содержащие гетероатомы, включены в понятие «алкил».

[0175] В настоящем тексте термин «замещенный» обозначает любое замещение атома водорода на функциональную группу.

[0176] В настоящем тексте термин «функциональная группа» имеет общепринятое определение и относится к химическим фрагментам, предпочтительно выбранным из группы, состоящей из атома галогена, C₁-С₂₀ алкила, замещенного С₁-С₂₀ алкила, пергалогенированного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, бензила, гетероарила, замещенного гетероарила, циано и нитро.

[0177] В настоящем тексте термины «галоген» и «атом галогена» относятся к любому из стабильных атомов 17-й группы периодической таблицы элементов, предпочтительно к фтору, хлору, брому или йоду, где атомы фтора и хлора являются особенно предпочтительными.

[0178] В настоящем тексте термин «алкенил» обозначает любой неразветвленный или разветвленный замещенный или незамещенный ненасыщенный углеводород. Термин «замещенный алкенил» обозначает любой неразветвленный или разветвленный замещенный ненасыщенный углеводород, который замещен одной или более функциональными группами, при этом в определение «замещенный алкил» включены неразветвленные C₂-C₆ алкенил-вторичные амины, замещенные С₂-С₆ вторичные алкениламины и неразветвленные C₂-C₆ алкенил-третичные амины. Циклические соединения, включая ненасыщенные циклические углеводорода и циклические соединения, содержащие гетероатомы, включены в понятие «алкенил».

[0179] В настоящем тексте термин «алкокси» относится к любому неразветвленному или разветвленному замещенному или незамещенному насыщенному или ненасыщенному простому эфиру.

[0180] В настоящем тексте термин «сульфатид» имеет общепринятое значение и относится к сложному эфиру серной кислоты и цереброзида, содержащему одну или более сульфатных групп во фрагменте сахара молекулы.

[0181] В настоящем тексте термин «цереброзид» относится к любому липидному соединению, содержащему сахар, и в общем случае имеющему тип, обычно содержащийся в мозге и нервной ткани.

[0182] Соединения формулы (I), (II) и (III) могут иметь форму фармацевтически приемлемых нетоксичных солей. Соли формулы (I), (II) и (III) включают соли присоединения кислоты, такие как соли неорганических кислот (например, хлороводородной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты и фосфорной кислоты) или органических кислот (например, уксусной кислоты, пропановой кислоты, малеиновой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, лимонной кислоты, янтарной кислоты, винной кислоты, фумаровой кислоты, глутаминовой кислоты, пантотеновой кислоты, лаурилсульфокислоты, метансульфокислоты и фталевой кислоты).

[0183] Соединения формулы (I), (II) и (III) могут иметь форму сольватов (например, гидратов).

[0184] Соединения формулы (I), (II) и (III) можно получать при помощи любого способа для целевого синтеза сульфатидов.

[0185] Соединения формулы (I), (II) и (III) также можно выделять из природных продуктов (например, из биологических организмов) и очищать путем колоночной хроматографии и т.д.

[0186] В одном из вариантов реализации сульфатид имеет химическую формулу: (2S,3R,4Е)-N-нервонат-1-[-D-(3-сульфат)галактопиранозил]-2-аминооктадецен-3-ол. Указанная химическая формула также относится к цис-тетракозеноил-сульфатиду.

[0187] В некоторых вариантах реализации конкретное количество сульфатида, который вводят пациенту, может быть различным в зависимости от заболевания или состояния, которое лечат, а также возраста, массы тела и пола пациента, которого лечат. В общем случае, для обеспечения указанной конечной концентрации, например, в кишечнике или крови, количество молекулы фосфатида в дозированной композиции согласно вариантам реализации настоящего изобретения в целом составляет от примерно 0,1 миллиграмма до примерно 100 миллиграммов, предпочтительно от примерно 2,0 миллиграмма до примерно 60 миллиграммов, более предпочтительно от примерно 20 миллиграммов до примерно 50 миллиграммов. Аналогично, количество вторичного терапевтического соединения в дозированной композиции для перорального введения согласно вариантам реализации настоящего изобретения в общем случае находится в диапазоне от примерно 0,01 миллиграмма до примерно 1000 миллиграммов, более предпочтительно от примерно 0,1 миллиграмма до примерно 100 миллиграммов. Очевидно, что точная дозировка может быть различной в зависимости от заболевания или нарушения, которое лечат, причем предпочтительные диапазоны могут быть легко определены. В некоторых вариантах реализации пациент представляет собой человека.

[0188] В некоторых вариантах реализации субъекту вводят 0,1-10 мг сульфатида/кг массы тела, например, примерно 0,1 мг/кг массы тела, 0,2 мг/кг массы тела, 0,3 мг/кг массы тела, 0,5 мг/кг массы тела, 1 мг/кг массы тела, 2 мг/кг массы тела, 3 мг/кг массы тела, 5 мг/кг массы тела, 9 мг/кг массы тела, или количество находится в диапазоне, таком как

[0189] 0,2-0,5 мг/кг массы тела, 0,2-1 мг/кг массы тела, 0,2-5 мг/кг массы тела, 0,2-10 мг/кг массы тела, 0,5-1 мг/кг массы тела, 0,5-5 мг/кг массы тела, 0,5-10 мг/кг массы тела, 1-5 мг/кг массы тела, 1-10 мг/кг массы тела, 2-5 мг/кг массы тела, 2-10 мг/кг массы тела или 5-10 мг/кг массы тела. Предпочтительно при необходимости указанную дозировку вводят повторно. Необязательно дозировку можно вводить повторно пять раз в день, четыре раза в день, три раза в день, два раза в день, один раз в день или реже, например, один раз каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней, включая диапазоны между любыми двумя из перечисленных значений, например, каждые 1-2 дня, каждые 1-3 дня, каждые 1-5 дней, каждые 1-10 дней, каждые 1-20 дней, каждые 2-3 дня, каждые 3-5 дней, каждые 3-10 дней, каждые 3-20 дней, каждые 5-10 дней или каждые 5-20 дней.

Агонисты рецептора ретиноевой кислоты (RAR)

[0190] Согласно настоящему описанию введение агониста рецептора ретиноевой кислоты, полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA), значительно подавляет повреждение печени, вызванное употреблением алкоголя. Употребление этанола истощает запасы сложных ретиниловых эфиров в печени и изменяет физиологический уровень полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA), биологически активной формы витамина А, которая поддерживает многие биологические функции и может увеличивать выработку, стабильность и усиливать функцию дифференцировки необученных («наивных») CD4+ Т-клеток в FoxP3+ Treg даже в присутствии IL-6. Несколько вариантов реализации, описанных в настоящем документе, относятся к тому факту, что ATRA подавляет функцию эффектора NKT-клеток I типа, включая подавление секреции цитокинов в указанных клетках. Кроме того, ATRA оказывает прямое ингибирующее действие на активность NKT-клеток I типа, которое проявляется в отсутствие антиген-презентирующих клеток. Помимо этого, ATRA не ингибирует напрямую активность типичных МНС-ограниченных CD4+ Т-клеток, которые распознают антигены белков, таких как основный белок миелина или МВРАс1-9. Не желая быть связанными с конкретной теорией, считают, что полученные данные указывают на защитное действие ATRA в отношении повреждения печени, вызываемого избыточным употреблением алкоголя, осуществляемое за счет подавления NKT-клеток I типа.

[0191] Согласно настоящему описанию агонисты RAR индуцируют подавление NKT-клеток I типа. Кроме того, повреждение печени, вызванное воспалением, опосредованным NKT-клетками I типа, при избыточном употреблении алкоголя можно предотвращать, снижать или ослаблять путем введения агониста RAR. Воспаление печени может усиливаться по нескольким различным причинам. Например, воспаление печени может быть вызвано бактериальной или вирусной инфекцией, повреждением или атакой собственной иммунной системы. Несмотря на то, что воспаление, как правило, представляет собой защитный ответ и является необходимой стадией процесса излечения, продолжительное или хроническое воспаление может вызывать повреждение. Несколько вариантов реализации, описанных в настоящем документе, относятся к опосредованной агонистом RAR модуляции врожденных иммунных механизмов, которые приводят к повреждению печени, возникающему после воспаления, связанному с воспалением или вызванному воспалением. Некоторые варианты реализации относятся к способам и композициям для опосредованного агонистом RAR подавления активности NKT-клеток I типа, которые модулируют взаимодействия между компонентами врожденной иммунной системы для обеспечения толерантности в отношении выделенных из кишечника или получаемых из метаболитов антигенов в отсутствие воздействия или при минимальном воздействии на врожденный иммунный ответ на выявляемые чужеродные патогены.

[0192] Так как агонисты RAR могут напрямую подавлять NKT-клетки I типа, агонисты RAR можно применять для лечения при любом показании, при котором NKT-клетки I типа исполняют роль патогена. Некоторые примеры заболеваний, которые можно излечивать согласно вариантам реализации настоящего изобретения, включают алкогольный гепатит, неалкогольный стеатогепатит, цирроз, неалкогольную жировую болезнь печени, фиброз, первичный склерозирующий холангит, первичный билиарный цирроз, фульминантный цирроз, идиопатический гепатит, вирусный гепатит (А, В, С и другие), воспалительный гепатит, связанный с гепатобилиарной карциномой, рассеянный склероз, диабет 1 типа, ишемическое и реперфузионное повреждение, трансплантацию солидных органов, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, боковой амиотрофический склероз и воспалительное заболевание кишечника (болезнь Крона и колит).

[0193] В некоторых вариантах реализации различные показания, включая аутоиммунные или связанные с иммунной системой заболевания или нарушения, излечивают, предотвращают или ослабляют путем опосредованного агонистом RAR подавления активности NKT-клеток I типа. В частности один из аспектов предложенного варианта реализации относится к способу лечения пациента, страдающего от симптомов аутоиммунного или связанного с иммунной системой заболевания или нарушения, такого как, например, рассеянный склероз, системная красная волчанка, СПИД, болезнь Альцгеймера, ревматоидный артрит, инсулинозависимый сахарный диабет, аутоиммунный гепатит, астма, целиакия, первичный склерозирующий холангит, первичный билиарный цирроз, с применением эффективного количества агониста RAR. В некоторых вариантах реализации опосредованное агонистом RAR подавление активности NKT-клеток I типа обеспечивает излечение, предотвращение или ослабление симптомов астмы. В некоторых вариантах реализации пациент представляет собой человека.

[0194] Некоторые варианты реализации относятся к способу подавления или предотвращения опосредованного NKT-клетками I типа воспаления после ишемической реперфузии путем введения агониста RAR. NKT-клетки I типа играют роль патогена при состояниях, таких как ишемическое и реперфузионное повреждение. Реперфузионное повреждение может возникать в различных тканях при восстановлении кровотока после ишемии. Примеры включают ткань скелетной мускулатуры при раздавленной ране, сердечную мышцу при инфаркте миокарда или хирургии сердца или ишемической болезни сердца, нервную ткань при инсульте или травме мозга и ткань печени и почек при хирургии или травме. Ишемическое и реперфузионное повреждение также оказывает ключевое действие на качество и функционирование привитой ткани при трансплантации органа. Ишемическое и реперфузионное повреждение являются основными причинами увеличения продолжительности госпитализации и снижения долгосрочной выживаемости трансплантата. В некоторых вариантах реализации опосредованное агонистом RAR подавление активности NKT-клеток I типа подавляет или предотвращает ишемическое и реперфузионное повреждение печени при хирургии или травме.

[0195] Варианты реализации, описанные в настоящей заявке, относятся к подавлению активности NKT-клеток I типа с применением одного или более агонистов рецептора ретиноевой кислоты (RAR). Рецепторы ретиноевой кислоты включают три основных подтипа: RARα, RARβ и RARγ. Некоторые варианты реализации относятся к подавлению активности NKT-клеток I типа с применением одного или более универсальных агонистов RAR, предшественников указанных универсальных агонистов RAR и их смесей. В настоящем тексте термин «универсальный агонист RAR» относится к агонисту RAR, который действует на, например, активирует, на RARα, RARβ и RARγ по существу в равной степени или неселективно. Некоторые варианты реализации относятся к подавлению активности NKT-клеток I типа с применением одного или более активных агонистов RAR, которые являются эффективными для селективного или даже специфического воздействия на, например, активации, по меньшей мере одного из RARβ и RARγ и предпочтительно обоих указанных рецепторов по сравнению с RARα, предшественников указанных активных агонистов RAR и их смесей. В этом контексте термин «селективно» означает, что агонист RAR, предшественники агониста RAR и их смеси являются более эффективными, предпочтительно по меньшей мере в 10 или примерно в 100 раз или примерно в 1000 раз или более, в отношении по меньшей мере одного из RARβ и RARγ или обоих указанных рецепторов по сравнению с RARα. Некоторые варианты реализации относятся к подавлению активности NKT-клеток I типа с применением одного или более агонистов RAR, имеющих селективность в отношении подтипов, предшественников указанных агонистов RAR, имеющих селективность в отношении подтипов, и их смесей. В настоящем тексте термин «агонист RAR, имеющий селективность в отношении подтипов» относится к агонисту RAR, который селективно действует на, например, активирует, один из подтипов RAR. Ретиноидные соединения, имеющие селективность в отношении RARα, RARβ и RARγ, известны в данной области техники и описаны, например, в патентах США №6534544 и 6025388, содержание которых включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылок.

[0196] Несколько вариантов реализации относятся к способу подавления провоспалительной активности NKT-клеток I типа путем введения одного или более агонистов рецептора ретиноевой кислоты (RAR). Примеры агонистов RAR включают, но не ограничиваются ими, агонисты RAR, перечисленные в таблице 1.

[0197] В некоторых вариантах реализации провоспалительную активность NKT-клеток I типа подавляют с применением одного или более агонистов RAR, выбранных из группы, состоящей из ATRA, ретинола, 9-цис-RA или 13-цис-RA, третиноина, АМ580, АС55649, CD1530 или тазаротена. В некоторых вариантах реализации провоспалительную активность NKT-клеток I типа подавляют с применением одного или более полиолефиновых ретиноидов, таких как изотретиноин и ацитретин. В некоторых вариантах реализации провоспалительную активность NKT-клеток I типа подавляют с применением одного или более агонистов RAR, выбранных из группы, состоящей из этретината, ацитретина и изотретиноина.

[0198] Несколько вариантов реализации относятся к подавлению провоспалительной активности NKT-клеток I типа с применением тазаротена, тазаротеновой кислоты или их смеси. Тазаротен представляет собой этиловое сложноэфирное пролекарство, которое метаболизируется в соответствующую свободную кислоту, тазаротеновую кислоту. Тазаротен имеет жесткую кольцевую структуру, которая имеет ограниченную конформационную гибкость по сравнению с полностью транс-ретиноевой кислотой, природным лигандом рецепторов ретиноевой кислоты (RAR). Указанное структурное изменение придает тазаротеновой кислоте специфичность в отношении RAR и селективность в отношении RARβ и RARγ.

[0199] Примеры агонистов RAR дополнительно включают сложные эфиры цис- и транс-ретиноевых кислот, например, сложные алкильные эфиры первичных, вторичных или третичных спиртов, включая, но не ограничиваясь ими: метиловый, этиловый, пропиловый, изопропиловый, бутиловый, изобутиловый, гексиловый, гептиловый, этилгексиловый, октиловый, нониловый, лауриловый, олеиловый, стеариловый, гидроксиэтиловый, гидроксипропиловый, бензиловый, альфа-метилбензиловый, альфа-пропилфениловый, амиловый, изоамиловый, анизиловый, цетиловый, ментиловый, коричный, пинаколовый, фуриловый или миристиловый.

[0200] Для подавления активности NKT-клеток I типа также можно применять фармацевтически приемлемые соли агонистов RAR. Соединения, описанные в настоящей заявке, которые содержат достаточно кислотные, достаточно основные группы или оба вида указанных функциональных групп, могут взаимодействовать с любыми из органических или неорганических оснований и неорганических и органических кислот с образованием соли.

[0201] Примеры кислот, которые можно применять для получения солей присоединения кислоты агонистов RAR, содержащих основные группы, включают неорганические кислоты, такие как хлороводородная кислота, бромоводородная кислота, йодоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и т.д., и органические кислоты, такие как п-толуолсульфокислота, метансульфокислота, щавелевая кислота, п-бромфенилсульфокислота, угольная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота и т.д. Примеры указанных солей включают сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, ацетат, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формиат, изобутират, капроат, гептаноат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себакат, фумарат, малеат, бутин-1,4-диоат, гексин-1,6-диоат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, фталат, сульфонат, ксилолсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, гамма-гидроксибутират, гликолят, тартрат, метансульфонат, пропансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, манделат и т.д.

[0202] Примеры оснований, которые можно применять для получения солей присоединения основания агонистов RAR, содержащих кислотные группы, включают, но не ограничиваются ими, гидроксиды щелочных металлов, таких как натрий, калий и литий; гидроксиды щелочно-земельных металлов, таких как кальций и магний; гидроксиды других металлов, таких как алюминий и цинк; аммоний и другие органические амины, такие как незамещенные или гидрокси-замещенные моно-, ди- или триалкиламины; дициклогексиламин; трибутиламин; пиридин; N-метил,N-этиламин; диэтиламин; триэтиламин; моно-, бис- или трис-(2-гидрокси-низший алкил-амины), такие как моно-, бис- или трис-(2-гидроксиэтил)амин, 2-гидрокси-трет-бутиламин или трис-(гидроксиметил)метиламин, N,N-ди-низший алкил-N-(гидрокси-низший алкил)-амины, такие как N,N-диметил-N-(2-гидроксиэтил)амин или три-(2-гидроксиэтил)амин; N-метил-D-глюкамин; и аминокислоты, такие как аргинин, лизин и т.д.

[0203] В настоящем тексте термин «пациент» или «субъект» относится к получателю терапевтического лечения и включает все организмы из царства животных. В предпочтительных вариантах реализации животное принадлежит к семейству млекопитающих, такому как человек, крупный рогатый скот, овечьи, свиньи, кошачьи, бизоны, собачьи, козы, лошади, ослы, олени и приматы. В некоторых вариантах реализации животное включает млекопитающее, отличное от человека. Наиболее предпочтительным животным является человек. Соответственно, в некоторых вариантах реализации пациент или субъект представляет собой человека.

[0204] В настоящем тексте термины «лечить», «лечение» и «способ лечения» включают «предотвращать», «предотвращение» и «способ предотвращения», соответственно.

[0205] В настоящем тексте термин «эффективное количество» агента представляет собой количество, которое является достаточным для излечения, подавления или предотвращения повреждения печени, вызванного провоспалительной активностью NKT-клеток I типа.

[0206] Некоторые варианты реализации относятся к предварительному лечению пациентов с применением сульфатида и/или агониста RAR перед возникновением клинических проявлений АБП. В нескольких вариантах реализации пациентам проводят лечение с применением эффективного количества сульфатида и/или агониста RAR перед злоупотреблением алкоголем. В некоторых других вариантах реализации пациентам проводят лечение с применением эффективного количества сульфатида и/или агониста RAR от примерно 0,5 часа до примерно 18 часов перед злоупотреблением алкоголем. В некоторых других вариантах реализации пациентам проводят лечение с применением эффективного количества сульфатида и/или агониста RAR в период хронического употребления алкоголя. В некоторых вариантах реализации пациент представляет собой человека.

[0207] В некоторых вариантах реализации конкретное количество агониста RAR, которое вводят пациенту, может быть различным в зависимости от заболевания или состояния, подвергающегося лечению, а также от возраста, массы и пола пациента, подвергающегося лечению. В общем случае, для обеспечения указанной конечной концентрации, например, в кишечнике или крови, количество агониста RAR в одной дозе композиции согласно предложенным вариантам реализации в целом составляет от примерно 0,1 миллиграмма до примерно 100 миллиграммов, предпочтительно от примерно 2,0 миллиграмма до примерно 60 миллиграммов, более предпочтительно от примерно 20 миллиграммов до примерно 50 миллиграммов. Примеры подходящих доз включают: от примерно 0,1 до примерно 10 мг/день; от примерно 0,5 до примерно 2 мг/день; примерно 0,01-100 мг/день; от примерно 1 до примерно 50 мг/день; от примерно 0,1 мг/день до примерно 1,0 мг/день; от примерно 1,0 мг/день до примерно 5,0 мг/день; от примерно 5,0 мг/день до примерно 10,0 мг/день; от примерно 10,0 мг/день до примерно 15 мг/день; от примерно 15,0 мг/день до примерно 20,0 мг/день; от примерно 20,0 мг/день до примерно 25,0 мг/день; от примерно 30,0 мг/день до примерно 35,0 мг/день; от примерно 35,0 мг/день до примерно 40,0 мг/день; от примерно 40,0 мг/день до примерно 45,0 мг/день; от примерно 45,0 мг/день до примерно 50,0 мг/день; от примерно 50,0 мг/день до примерно 55,0 мг/день; от примерно 55,0 до примерно 60,0 мг/день; от примерно 60,0 мг/день до примерно 65,0 мг/день; от примерно 65,0 мг/день до примерно 70,0 мг/день; от примерно 70,0 мг/день до примерно 75,0 мг/день; от примерно 75,0 мг/день до примерно 80,0 мг/день; от примерно 80,0 мг/день до примерно 85,0 мг/день; от примерно 85,0 до примерно 90,0 мг/день; от примерно 85,0 мг/день до примерно 90,0 мг/день; от примерно 90,0 мг/день до примерно 95,0 мг/день; и от примерно 95,0 мг/день до примерно 100,0 мг/день. Очевидно, что точная дозировка может быть различной в зависимости от заболевания или нарушения, подвергающегося лечению, и предпочтительные диапазоны могут быть легко определены. В некоторых вариантах реализации пациент представляет собой человека.

[0208] При пероральном введении тазаротена для снижения активности NKT-клеток I типа дневная дозировка тазаротена предпочтительно находится в диапазоне от примерно 0,3 мг/день до примерно 7 мг/день или примерно 8 мг/день, более предпочтительно в диапазоне от примерно 0,6 мг/день до примерно 6,5 мг/день или примерно 7 мг/день. В некоторых вариантах реализации тазаротен вводят перорально с дневными дозировками тазаротена, включая 0,4 мг/день, 0,75 мг/день, 1,5 мг/день, 2,8 мг/день, 3 мг/день, 4,5 мг/день, 6 мг/день и 6,3 мг/день.

[0209] Согласно некоторым вариантам реализации агонист RAR можно вводить для ослабления симптомов пациента или можно вводить для противодействия механизму нарушения, как такового. В определенных вариантах реализации агонист RAR можно вводить в качестве профилактической меры. В некоторых вариантах реализации вводят несколько доз агониста RAR. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что указанные задачи лечения часто являются взаимосвязанными, и способы лечения можно корректировать у конкретных пациентов в зависимости от различных факторов. Указанные факторы могут включать возраст, пол или состояние здоровья пациента и прогрессирование аутоиммунного или связанного с иммунной системой заболевания или нарушения. Соответственно, методику лечения пациента можно корректировать в отношении дозировки, времени введения, способа введения и одновременного или последовательного осуществления других способов терапии. В некоторых вариантах реализации пациент представляет собой человека.

[0210] В некоторых вариантах реализации одно или более соединений-агонистов RAR можно вводить по отдельности или в комбинации с другим терапевтическим соединением. Например, одно или более соединений-агонистов RAR можно вводить в комбинации с сульфатидом. Можно применять любые известные в настоящее время терапевтические соединения, применяемые для лечения алкогольной болезни печени, воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания или реперфузионного повреждения. В некоторых вариантах реализации агонист RAR можно вводить в комбинации с сероводородом (H2S). В некоторых вариантах реализации агонист RAR можно вводить в комбинации с антиоксидантами. В некоторых вариантах реализации агонист RAR можно вводить в комбинации, например, с кортикостероидами, биопрепаратами (например, с антителами к ФНО-альфа и к IL-6), иммуномодуляторами (например, RU-486), модифицирующими болезнь противоревматическими препаратами (DMARD, такими как лефлуномид), ингибиторами СОХ-2 (целекоксиб), нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП, такими как напроксен), пероральными средствами против диабета (OAD, такими как метформин или ситаглиптен), агонистами GLP-1, инсулином, агонистами/антагонистами PPAR, медиаторами EGF (противораковые агенты), другими агентами, которые являются эффективными при лечении раковых заболеваний печени, клеточными способами терапии раковых заболеваний печени; интерферонами (IFN) при гепатите С, рассеянном склерозе или системной волчанке; и антагонистами LFA-1.

[0211] Соединения-агонисты RAR и сульфатидные соединения, описанные в настоящей заявке, можно применять в качестве активного ингредиента, включенного в состав фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция может содержать один активный ингредиент. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция может содержать два, три, четыре, пять или более активных ингредиентов. Рассматривают все способы введения, например, пероральный, ректальный, парентеральный, местный, введение путем внутривенной, внутримышечной, внутригрудинной или подкожной инъекции или в форме, подходящей для ингаляции. Составы, если это возможно, можно эффективно включать в раздельные лекарственные формы и получать при помощи любых способов, хорошо известных в области фармацевтики. Активные ингредиенты обычно вводят в состав совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами в соответствии с известной и сложившейся практикой. Таким образом, фармацевтическая композиция может быть получена в виде жидкости, порошка, эликсира, инъецируемого раствора, суспензии, суппозитория и т.д.

[0212] В некоторых вариантах реализации провоспалительную активность NKT-клеток I типа подавляют с применением одного или более агонистов RAR, выбранных из группы, состоящей из ATRA, ретинола, 9-цис-RA или 13-цис-RA, третиноина, АМ580, АС55649, CD1530 или тазаротена. В некоторых вариантах реализации провоспалительную активность NKT-клеток I типа подавляют с применением одного или более полиолефиновых ретиноидов, таких как изотретиноин и ацитретин. В некоторых вариантах реализации провоспалительную активность NKT-клеток I типа подавляют с применением одного или более агонистов RAR, выбранных из группы, состоящей из этретината, ацитретина и изотретиноина.

[0213] Несколько вариантов реализации относятся к подавлению провоспалительной активности NKT-клеток I типа с применением тазаротена, тазаротеновой кислоты или их смеси. Тазаротен представляет собой этиловое сложноэфирное пролекарство, которое метаболизируется в соответствующую свободную кислоту, тазаротеновую кислоту. Тазаротен имеет жесткую кольцевую структуру, которая имеет ограниченную конформационную гибкость по сравнению с полностью транс-ретиноевой кислотой, природным лигандом рецепторов ретиноевой кислоты (RAR). Указанное структурное изменение придает тазаротеновой кислоте специфичность в отношении RAR и селективность в отношении RARβ и RARγ.

[0214] Примеры агонистов RAR дополнительно включают сложные эфиры цис- и транс-ретиноевых кислот, например, сложные алкильные эфиры первичных, вторичных или третичных спиртов, включая, но не ограничиваясь ими: метиловый, этиловый, пропиловый, изопропиловый, бутиловый, изобутиловый, гексиловый, гептиловый, этилгексиловый, октиловый, нониловый, лауриловый, олеиловый, стеариловый, гидроксиэтиловый, гидроксипропиловый, бензиловый, альфа-метилбензиловый, альфа-пропилфениловый, амиловый, изоамиловый, анизиловый, цетиловый, ментиловый, коричный, пинаколовый, фуриловый или миристиловый.

[0215] Для подавления активности NKT-клеток I типа также можно применять фармацевтически приемлемые соли агонистов RAR. Соединения, описанные в настоящей заявке, которые содержат достаточно кислотные, достаточно основные группы или оба вида указанных функциональных групп, могут взаимодействовать с любыми из органических или неорганических оснований и неорганических и органических кислот с образованием соли.

[0216] Примеры кислот, которые можно применять для получения солей присоединения кислоты агонистов RAR, содержащих основные группы, включают неорганические кислоты, такие как хлороводородная кислота, бромоводородная кислота, йодоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и т.д., и органические кислоты, такие как п-толуолсульфокислота, метансульфокислота, щавелевая кислота, п-бромфенилсульфокислота, угольная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота и т.д. Примеры указанных солей включают сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, ацетат, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формиат, изобутират, капроат, гептаноат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себакат, фумарат, малеат, бутин-1,4-диоат, гексин-1,6-диоат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, фталат, сульфонат, ксилолсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, гамма-гидроксибутират, гликолят, тартрат, метансульфонат, пропансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, манделат и т.д.

[0217] Примеры оснований, которые можно применять для получения солей присоединения основания агонистов RAR, содержащих кислотные группы, включают, но не ограничиваются ими, гидроксиды щелочных металлов, таких как натрий, калий и литий; гидроксиды щелочно-земельных металлов, таких как кальций и магний; гидроксиды других металлов, таких как алюминий и цинк; аммоний и другие органические амины, такие как незамещенные или гидрокси-замещенные моно-, ди- или триалкиламины; дициклогексиламин; трибутиламин; пиридин; N-метил,N-этиламин; диэтиламин; триэтиламин; моно-, бис- или трис-(2-гидрокси-низший алкил-амины), такие как моно-, бис- или трис-(2-гидроксиэтил)амин, 2-гидрокси-трет-бутиламин или трис-(гидроксиметил)метиламин, N,N-ди-низший алкил-N-(гидрокси-низший алкил)-амины, такие как N,N-диметил-N-(2-гидроксиэтил)амин или три-(2-гидроксиэтил)амин; N-метил-D-глюкамин; и аминокислоты, такие как аргинин, лизин и т.д.

[0218] В некоторых вариантах реализации конкретное количество агониста RAR, которое вводят пациенту, может быть различным в зависимости от заболевания или состояния, подвергающегося лечению, а также от возраста, массы и пола пациента, подвергающегося лечению. В общем случае, для обеспечения указанной конечной концентрации, например, в кишечнике или крови, количество агониста RAR в одной дозе композиции согласно предложенным вариантам реализации в целом составляет от примерно 0,1 миллиграмма до примерно 100 миллиграммов, предпочтительно от примерно 2,0 миллиграмма до примерно 60 миллиграммов, более предпочтительно от примерно 20 миллиграммов до примерно 50 миллиграммов. Примеры подходящих доз включают: от примерно 0,1 до примерно 10 мг/день; от примерно 0,5 до примерно 2 мг/день; примерно 0,01-100 мг/день; от примерно 1 до примерно 50 мг/день; от примерно 0,1 мг/день до примерно 1,0 мг/день; от примерно 1,0 мг/день до примерно 5,0 мг/день; от примерно 5,0 мг/день до примерно 10,0 мг/день; от примерно 10,0 мг/день до примерно 15 мг/день; от примерно 15,0 мг/день до примерно 20,0 мг/день; от примерно 20,0 мг/день до примерно 25,0 мг/день; от примерно 30,0 мг/день до примерно 35,0 мг/день; от примерно 35,0 мг/день до примерно 40,0 мг/день; от примерно 40,0 мг/день до примерно 45,0 мг/день; от примерно 45,0 мг/день до примерно 50,0 мг/день; от примерно 50,0 мг/день до примерно 55,0 мг/день; от примерно 55,0 до примерно 60,0 мг/день; от примерно 60,0 мг/день до примерно 65,0 мг/день; от примерно 65,0 мг/день до примерно 70,0 мг/день; от примерно 70,0 мг/день до примерно 75,0 мг/день; от примерно 75,0 мг/день до примерно 80,0 мг/день; от примерно 80,0 мг/день до примерно 85,0 мг/день; от примерно 85,0 до примерно 90,0 мг/день; от примерно 85,0 мг/день до примерно 90,0 мг/день; от примерно 90,0 мг/день до примерно 95,0 мг/день; и от примерно 95,0 мг/день до примерно 100,0 мг/день. Очевидно, что точная дозировка может быть различной в зависимости от заболевания или нарушения, подвергающегося лечению, и предпочтительные диапазоны могут быть легко определены. В некоторых вариантах реализации пациент представляет собой человека.

[0219] При пероральном введении тазаротена для снижения активности NKT-клеток I типа дневная дозировка тазаротена предпочтительно находится в диапазоне от примерно 0,3 мг/день до примерно 7 мг/день или примерно 8 мг/день, более предпочтительно в диапазоне от примерно 0,6 мг/день до примерно 6,5 мг/день или примерно 7 мг/день. В некоторых вариантах реализации тазаротен вводят перорально с дневными дозировками тазаротена, включая 0,4 мг/день, 0,75 мг/день, 1,5 мг/день, 2,8 мг/день, 3 мг/день, 4,5 мг/день, 6 мг/день и 6,3 мг/день.

[0220] Согласно некоторым вариантам реализации агонист RAR можно вводить для ослабления симптомов пациента или можно вводить для противодействия механизму нарушения, как такового. В определенных вариантах реализации агонист RAR можно вводить в качестве профилактической меры. В некоторых вариантах реализации вводят несколько доз агониста RAR. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что указанные задачи лечения часто являются взаимосвязанными, и способы лечения можно регулировать у конкретных пациентов в зависимости от различных факторов. Указанные факторы могут включать возраст, пол или состояние здоровья пациента и прогрессирование аутоиммунного или связанного с иммунной системой заболевания или нарушения. Соответственно, методику лечения пациента можно регулировать в контексте дозировки, времени введения, способа введения и одновременного или последовательного проведения других способов терапии. В некоторых вариантах реализации пациент представляет собой человека.

[0221] В некоторых вариантах реализации одно или более соединений-агонистов RAR можно вводить по отдельности или в комбинации с другим терапевтическим соединением. Например, одно или более соединений-агонистов RAR можно вводить в комбинации с активатором NKT-2 (например, с милтефозином или аналогом милтефозина или фосфолипидом), сульфатидом или с активатором NKT-2 (например, с милтефозином, аналогом милтефозина или фосфолипидом) и сульфатидом.

Активаторы NKT-2

[0222] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять ряд активаторов NKT-2. В некоторых вариантах реализации активатор NKT-2 содержит фосфолипид, например, лизофосфолипид, например, лизофосфатидилхолин (LPC), милтефозин или аналог милтефозина. Действие некоторых соединений LPC на NKT-клетки II типа описано в Maricic et al., "Recognition of Lysophosphatidylcholine by Type II NKT Cells and Protection from an Inflammatory Liver Disease" J. Immunology, опубликованной в сети Интернет 26 сентября 2014 года, 1400699, содержание которой включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.

[0223] В некоторых вариантах реализации активатор NKT-2 содержит LPC, имеющий формулу IV:

Формула IV

где R выбран из группы, состоящей из C₁-C₄₀ алкила, C₁-C₄₀ замещенного алкила, C₁-C₄₀ алкенила, C₁-C₄₀ замещенного алкенила и C₁-C₄₀ алкинила. Типовые LPC включают LPC (С18:0), структура которого изображена ниже:

LPC (С16:0), структура которого изображена ниже:

LPC (C18:1(9Z)), структура которого изображена ниже:

LPC (С18:1(1-олеил)), структура которого изображена ниже:

и Lign A (LPC (С24:0)), структура которого изображена ниже:

Дополнительные типовые фосфолипиды, которые рассматривают как подходящие активаторы NKT-2, включают, но не ограничиваются ими, лизо-фактор активации тромбоцитов (LPAF), такой как LPAF (С18:0), структура которого изображена ниже:

и лизосфингомиелин (LSM), структура которого изображена ниже:

[0224] В некоторых вариантах реализации активатор NKT-2 содержит милтефозин. Структура милтефозина показана ниже:

[0225] В некоторых вариантах реализации активатор NKT-2 содержит аналог милтефозина. В настоящем тексте «аналог милтефозина» относится в широком смысле к структурным аналогам милтефозина и функциональным аналогам милтефозина. Некоторые аналоги милтефозина согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения включают соединения формулы V:

Формула V

где R выбран из группы, состоящей из C₁-C₃₀ алкила, C₁-C₃₀ замещенного алкила, C₁-C₃₀ алкенила, C₁-C₃₀ замещенного алкенила и C₁-C₃₀ алкинила.

[0226] Типовые аналоги милтефозина, которые можно применять согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, соединения, перечисленные ниже в таблицах 2.1 и 2.2.

[0227] В некоторых вариантах реализации аналог милтефозина содержит, состоит из или состоит по существу из любого из соединений, показанных в таблице 2.1. В некоторых вариантах реализации аналог милтефозина содержит, состоит из или состоит по существу из соединения, выбранного из таблицы 2.1. В некоторых вариантах реализации аналог милтефозина содержит, состоит из или состоит по существу из любого из соединений, показанных в таблице 2.1 или в таблице 2.2. В некоторых вариантах реализации аналог милтефозина содержит, состоит из или состоит по существу из соединения, выбранного из таблицы 2.1 или таблицы 2.2. В некоторых вариантах реализации аналог милтефозина содержит, состоит из или состоит по существу из любого из соединений, показанных в таблице 2.2. В некоторых вариантах реализации аналог милтефозина содержит, состоит из или состоит по существу из соединения, выбранного из таблицы 2.2. В некоторых вариантах реализации аналог милтефозина содержит, состоит из или состоит по существу из соединения формулы V.

[0228] Предполагаются все способы введения милтефозина и аналогов милтефозина, например, пероральный, ректальный, парентеральный, местный или введение путем внутривенной, внутримышечной, внутригрудинной или подкожной инъекции или в форме, подходящей для ингаляции. Составы, если это возможно, можно эффективно включать в раздельные лекарственные формы и получать при помощи любых способов, хорошо известных в области фармацевтики. Активные ингредиенты обычно вводят в состав совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами в соответствии с известной и сложившейся практикой. Таким образом, фармацевтическая композиция может быть получена в виде жидкости, порошка, эликсира, инъецируемого раствора, суспензии, суппозитория и т.д.

[0229] Милтефозин может подходить для перорального или местного введения. Таким образом, в некоторых вариантах реализации милтефозин или аналог милтефозина вводят перорально. В некоторых вариантах реализации милтефозин или аналог милтефозина вводят местно. В некоторых вариантах реализации милтефозин или аналог милтефозина вводят путем внутривенной, внутримышечной, внутригрудинной или подкожной инъекции или в форме, подходящей для ингаляции.

[0230] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конкретное количество милтефозина или аналога милтефозина, которое вводят субъекту, может быть различным в зависимости от заболевания или состояния, подвергающегося лечению, а также возраста, массы и пола пациента, подвергающегося лечению. В некоторых вариантах реализации милтефозин или аналог милтефозина вводят в дозировке примерно 0,1-10 мг/кг массы тела. В некоторых вариантах реализации милтефозин или аналог милтефозина вводят в дозировке примерно 0,1 мг/кг массы тела, 0,2 мг/кг массы тела, 0,3 мг/кг массы тела, 0,5 мг/кг массы тела, 1 мг/кг массы тела, 2 мг/кг массы тела, 3 мг/кг массы тела, 4 мг/кг массы тела, 5 мг/кг массы тела, 6 мг/кг массы тела, 7 мг/кг массы тела, 8 мг/кг массы тела, 9 мг/кг массы тела, включая диапазоны между любыми двумя из перечисленных значений, например, примерно 0,2-0,5 мг/кг массы тела, 0,2-1 мг/кг массы тела, 0,2-5 мг/кг массы тела, 0,2-10 мг/кг массы тела, 0,5-1 мг/кг массы тела, 0,5-3 мг/кг массы тела, 0,5-5 мг/кг массы тела, 0,5-10 мг/кг массы тела, 1-3 мг/кг массы тела, 1-5 мг/кг массы тела, 1-10 мг/кг массы тела, 2-3 мг/кг массы тела, 2-5 мг/кг массы тела, 2-10 мг/кг массы тела или 5-10 мг/кг массы тела. Предпочтительно указанную дозировку при необходимости вводят повторно. Дозировку необязательно можно вводить повторно пять раз в день, четыре раза в день, три раза в день, два раза в день, один раз в день или реже, например, один раз каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней, включая диапазоны между любыми двумя из перечисленных значений, например, каждые 1-2 дня, каждые 1-3 дня, каждые 1-5 дней, каждые 1-10 дней, каждые 1-20 дней, каждые 2-3 дня, каждые 3-5 дней, каждые 3-10 дней, каждые 3-20 дней, каждые 5-10 дней или каждые 5-20 дней. В некоторых вариантах реализации вводят по меньшей мере 2 дозировки, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 доз, включая диапазоны между любыми двумя из перечисленных значений, например, 2-10, 2-20, 2-50, 2-100, 5-10, 5-50, 5-100, 10-20, 10-50, 10-100, 20-50 или 20-100 доз. В некоторых вариантах реализации пациент представляет собой человека.

[0231] В некоторых вариантах реализации субъект, которому вводят милтефозин или аналог милтефозина, имеет воспалительное состояние, например, жировую болезнь печени, алкогольный гепатит, неалкогольный стеатогепатит, цирроз, неалкогольную жировую болезнь печени, фиброз, первичный склерозирующий холангит, первичный билиарный цирроз, фульминантный цирроз, идиопатический гепатит, вирусный гепатит (А, В, С и другие), аутоиммунный гепатит, воспалительный гепатит, связанный с гепатобилиарной карциномой, рассеянный склероз, диабет 1 типа, ишемическое и реперфузионное повреждение, трансплантацию солидных органов, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, боковой амиотрофический склероз и воспалительное заболевание кишечника (болезнь Крона и колит).

Фармацевтические композиции

[0232] Активаторы NKT-2, такие как милтефозин или аналоги милтефозина или фосфолипиды, соединения-агонисты RAR и сульфатидные соединения, описанные в настоящей заявке, можно применять в качестве активного ингредиента, включенного в состав фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция может содержать один активный ингредиент. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция может содержать два, три, четыре, пять или более активных ингредиентов. Любые из приведенных далее композиций, содержащих активатор NKT-2, можно применять для лечения, облегчения или предотвращения воспалительного состояния, например, жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, аутоиммунного гепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, ишемического и реперфузионного повреждения, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, бокового амиотрофического склероза и воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и колита).

[0233] В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит количество активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида), которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа. Фармацевтическая композиция необязательно дополнительно содержит количество агониста RAR, такого как ретиноид, например, тазаротен, которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа.

[0234] В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит количество активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида) и количество сульфатида, которые, взятые вместе, являются достаточными для активации NKT-клеток II типа.

[0235] В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит количество активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида) и количество сульфатида, которые, взятые вместе, являются достаточными для активации NKT-клеток II типа, и дополнительно содержит количество агониста RAR, такого как ретиноид (например, тазаротен), которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа.

[0236] В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит количество активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида), которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа, и количество сульфатида, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа.

[0237] В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит количество активатора NKT-2 (например, милтефозина или аналога милтефозина или фосфолипида), которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа, количество сульфатида, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа, и количество агониста RAR, такого как ретиноид (например, тазаротен), которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа.

[0238] В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит количество милтефозина или аналога милтефозина, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа, и количество тазаротена, которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа.

[0239] Предполагаются все способы введения, например, пероральный, ректальный, парентеральный, местный или введение путем внутривенной, внутримышечной, внутригрудинной или подкожной инъекции или в форме, подходящей для ингаляции. Составы, если это возможно, можно эффективно включать в раздельные лекарственные формы и получать при помощи любых способов, хорошо известных в области фармацевтики. Активные ингредиенты обычно вводят в состав совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами в соответствии с известной и сложившейся практикой. Таким образом, фармацевтическая композиция может быть получена в виде жидкости, порошка, эликсира, инъецируемого раствора, суспензии, суппозитория и т.д. Подходы получения фармацевтических составов подробно описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^е издание, A.R. Gennaro, ред., Mack Publishing Company (1995), содержание которой включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.

[0240] Активные ингредиенты согласно некоторым вариантам реализации можно включать в состав, предназначенный для перорального введения в виде таблеток, твердых желатиновых капсул, мягких желатиновых капсул, содержащих активное вещество в виде порошка, смеси с вспомогательными веществами, жидкости или раствора, суспензии, твердого раствора. Активные ингредиенты согласно некоторым вариантам реализации можно включать в состав, предназначенный для введения внутрь полости рта (подъязычное или трансбуккальное) в виде твердой лекарственной формы, быстрорастворимых или шипучих таблеток, тонких пленок, трансбуккальных пластинок или в виде жидкой или полутвердой формы, такой как гель, раствор, эмульсия, суспензия. Активные ингредиенты согласно некоторым вариантам реализации можно включать в состав, предназначенный для введения путем инъекции в виде водного или неводного раствора, суспензии или эмульсии. Масляные растворы и суспензии содержат смеси природных и/или синтетических масел, таких как соевое масло, хлопковое масло, минеральное масло, кунжутное масло, касторовое масло, гидрированные растительные масла, пчелиный воск. Активные ингредиенты согласно некоторым вариантам реализации можно включать в состав, предназначенный для чрескожного введения в виде крема, геля, эмульсии, водного раствора, масляного раствора, суспензии, пленки, пластыря, пены. Активные ингредиенты согласно некоторым вариантам реализации можно включать в состав, предназначенный для интраназального введения, в виде порошка, суспензии, раствора, эмульсии. Активные ингредиенты согласно некоторым вариантам реализации можно включать в состав, предназначенный для введения путем внутрилегочной доставки, в виде измельченного порошка. Пероральное введение связано с эффектом первого прохождения, а также индуцированием ферментов, осуществляющих метаболизм. Таким образом, для обеспечения оптимального эффекта можно регулировать величину дозировку и режим дозирования при пероральном введении ретиноевых кислот. Альтернативные способы доставки, например, подъязычный, трансбуккальный, инъекция, внутрилегочный и чрескожный способы, могут быть предпочтительными по сравнению с пероральным введением. Альтернативные способы введения, такие как те, что описаны в настоящей заявке, позволяют предотвращать эффект первого прохождения и всасывание в ЖКТ, обеспечивают пониженное индуцирование ферментов и стабильную фармакокинетику при повторном введении.

[0241] Фармацевтические составы согласно вариантам реализации настоящего изобретения могут обеспечивать немедленное высвобождение или модифицированное высвобождение (например, замедленное высвобождение, пульсирующее высвобождение, контролируемое высвобождение, отсроченное высвобождение, медленное высвобождение). Вследствие мгновенного проявления активности фармакологические количества вводимых перорально изомеров ретиноидов могут иметь побочные эффекты. Указанные побочные эффекты накладывают серьезные ограничения на применение пероральных ретиноидов в терапии. Несмотря на то, что при местном введении ретиноиды имеют незначительную тератогенность, указанный способ введения связан с другими проявлениями токсичности, включая раздражение кожи. Основной причиной токсичности при пероральном и местном введении является то, что после введения полное количество ретиноидов становится немедленно доступным. Способ, при применении которого ретиноид становился бы доступным in vivo с меньшей скоростью и в течение более длительного периода времени, позволил бы избежать пиков и долин доступности ретиноида и тем самым обеспечил бы эффективный уровень соединения in vivo в течение более продолжительного периода времени, что также позволило бы предотвратить или по существу понизить токсичность, которая часть возникает в результате мгновенной доступности избыточных количеств вещества. Инъецируемый состав на масляной основе, содержащий ретинол, сложный эфир ретинола, в частности, сложный эфир жирной кислоты и ретинола, ретиноевую кислоту или сложный эфир ретиноевой кислоты, можно вводить внутримышечно раз в неделю для обеспечения системной доставки с медленным высвобождением согласно приведенным выше принципам.

[0242] Некоторые варианты реализации относятся к составу в виде пероральной лекарственной формы одного или более активных ингредиентов согласно вариантам реализации настоящего изобретения, таких как описано в настоящей заявке. 10 г ретиноевой кислоты растворяют в смеси пчелиного воска, бутилированного гидроксианизола, эдетата динатрия, хлопьев гидрированного соевого масла, гидрированных растительных масел и аддукта спирта и соевого масла при незначительно повышенной температуре при перемешивании с высоким сдвиговым усилием. Смесь заключают внутри мягких желатиновых капсул в дозировках 2 мг, 5 мг и 10 мг для перорального введения.

[0243] Некоторые варианты реализации относятся к составу в виде биоадгезивной трансбуккальной таблетки, содержащей один или более активных ингредиентов согласно вариантам реализации настоящего изобретения. Получают смесь вспомогательных веществ, содержащую 24% активного ингредиента, 21% ГПМЦ, 18% кукурузного крахмала, 24% лактозы, 1% оксида кремния, 2,5% поликарбофила (Noveon), 7,5% карбомера 974Р, 1,2% талька и 0,7% стеарата магния. Смесь прессовали в таблетки с диаметром примерно 1 см.

[0244] Некоторые варианты реализации относятся к составу в виде подъязычной пленки, содержащей один или более активных ингредиентов согласно вариантам реализации настоящего изобретения. Следующие ингредиенты смешивают в 50 г воды: 3 г Methocel Е5, 5 г Methocel Е50, 1 г Klucel, 1 г мальтодекстрина, 1 г лимонной кислоты, 3 г сукралозы, 5 г апельсиновой вкусовой добавки, 0,2 г парабена, 0,1 г эдетата натрия и 5 г сорбита. Добавляют 1 г ретиноевой кислоты и смесь дегазируют при перемешивании. Композицию наносят тонким слоем на подложку из сложной полиэфирной пленки и оставляют сушиться на воздухе в отсутствие света для предотвращения разрушения. Затем пленку нарезают для получения доз от 2 до 10 мг.

[0245] Некоторые варианты реализации относятся к набору, который может содержать один или более сульфатидов, агонистов RAR или любую их комбинацию предпочтительно в виде фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации цис-тетракозеноил обеспечен в фармацевтически приемлемом носителе. В некоторых вариантах реализации ATRA обеспечена в фармацевтически приемлемом носителе. В некоторых вариантах реализации тазаротен обеспечен в фармацевтически приемлемом носителе. В нескольких вариантах реализации необязательно может быть обеспечен сероводород (H₂S). В нескольких вариантах реализации необязательно могут быть обеспечены антиоксиданты. В нескольких вариантах реализации наборы могут дополнительно содержать подходящую упаковку и/или инструкции по применению. Наборы также могут содержать средства для доставки одного или более сульфатидов, агонистов RAR или любую их комбинацию, такие как ингалятор, распылитель (например, для интраназального распыления), шприц для инъекции, иглу, пакет для в.в. инъекции или герметичную упаковку для капсул, таблеток, суппозиториев. Один или более сульфатидов, агонистов RAR или любая их комбинация могут находиться в сухой или лиофилизированной форме или в растворе, в частности в стерильном растворе. В случае сухой формы набор может содержать фармацевтически приемлемый разбавитель для получения жидкого состава. Набор может содержать устройство для введения или распределения композиций, включая, но не ограничиваясь ими, шприц, пипетку, чрескожный пластырь или ингалятор. Некоторые варианты реализации относятся к наборам, содержащим дозировки соединений или композиции, которые являются достаточными для обеспечения эффективного лечения индивидуума в течение продолжительного периода времени, такого как неделя, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 6 недель или 8 недель или более.

CD8 регуляторные Т-клетки

[0246] Предполагается, что комбинация, включающая введение CD8 T_reg-клеток и введение активатора NKT-2 согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, может подходить для лечения или предотвращения воспалительного состояния, например, аутоиммунного заболевания. В некоторых вариантах реализации CD8 T_reg-клетки вводят субъекту, у которого развивается воспалительное состояние или имеется риск его развития. Субъекту также можно вводить ингибитор NKT-2. Ингибитор NKT-2 необязательно содержит милтефозин. Воспалительное состояние необязательно включает по меньшей мере одно состояние, выбранное из: жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, аутоиммунного гепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного цирроза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, ишемического и реперфузионного повреждения, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, бокового амиотрофического склероза и воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и колита), или комбинацию двух или более из указанных перечисленных состояний.

[0247] Иммунная система поддерживает состояние равновесия в ответ на чужеродные антигены, а также собственные антигены. Механизмы контроля для поддержания гомеостаза после иммунного ответа на чужеродный антиген или предотвращения или прерывания вредного ответа на собственные антигены включают опосредованное CTLA-4-подавление Т-клеток, индуцированную активацией гибель клеток (AICD), регуляцию, опосредованную IL-2, и регуляторные Т-клетки (T_reg) (¹Abbas, А.K., Lohr, J., Knoechel, В. & Nagabhushanam, V. T cell tolerance and autoimmunity. Autoimmun Rev 3,471-5 (2004)). Индукция CD8 T_reg-клеток также описана в публикации РСТ WO 2007/136518 и опубликованной заявке на патент США №2007/0286849, содержание каждой из которых включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылок.

[0248] В экспериментах с использованием истощающих антител или животных с нокаутом специфического гена была показана важная регуляторная роль CD8⁺ лимфоцитов при аутоиммунных заболеваниях (Koh, D.R. et al. Less mortality but more relapses in experimental allergic encephalomyelitis in CD8-/- mice. Science 256, 1210-3 (1992)), переносимости трансплантата (Seydel, K. et al. Anti-CD8 abrogates effect of anti-CD4-mediated islet allograft survival in rat model. Diabetes 40, 1430-4 (1991)), неонатальной толерантности (Field, A.C., Caccavelli, L., Bloch, M.F. & Bellon, B. Regulatory CD8⁺ T cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoimmunity. J Immunol 170, 2508-15 (2003)) и гомеостазе нормальных клеточных и гуморальных иммунных ответов (Nanda, N.K. & Sercarz, Е. A truncated Т cell receptor repertoire reveals underlying immunogenicity of an antigenic determinant. J Exp Med 184, 1037-43 (1996)).

[0249] При рассеянном склерозе, например, иммунная система патологически распознает некоторые собственные антигены миелиновых мембран как чужеродные и запускает иммунный ответ, направленный на них. Это приводит к демиелинизации, разрушительному удалению миелина, который представляет собой изолирующий и защитный жировой белок, который образует оболочку нервных клеток (нейронов). Демиелинизация при рассеянном склерозе опосредована иммунным ответом, определяемым Т-клетками, который запускается в результате антигенпрезентирующих явлений в ЦНС или индуцируется после периферической активации за счет системного ответа молекулярной мимикрии.

[0250] Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что CD8αα⁺, TCRαβ⁺ T_reg-клетки могут подходить для лечения и/или предотвращения показаний, включающих аутоиммунные и связанные с иммунной системой заболевания и нарушения. Ингибитор NKT-2, такой как милтефозин, может индуцировать CD8 T_reg-клетки в печени субъекта (см., например, фигуры 8А-В). Таким образом, в некоторых вариантах реализации CD8 T_reg-клетки вводят субъекту, имеющему воспалительное состояние или имеющему риск возникновения воспалительного состояния, такого как описано в настоящей заявке. Необязательно субъекту дополнительно вводят ингибитор NKT-2. В некоторых вариантах реализации ингибитор NKT-2 включает милтефозин. Вводимые CD8 T_reg-клетки необязательно выделяют у субъекта (т.е. они представляют собой «аутологичные» CD8 T_reg-клетки). Вводимые CD8 T_reg-клетки необязательно выделяют у другого индивидуума (т.е. они представляют собой «аллогенетические» CD8 T_reg-клетки). Вводимые CD8 T_reg-клетки необязательно выращивают перед введением субъекту, например, клетки можно выращивать in vitro. Предполагается, что можно проводить лечение и снижение или устранение патологических аутореактивных иммунных ответов, лежащих в основе воспалительных состояний, таких как аутоиммунные заболевания или нарушения.

[0251] В общем случае, для обеспечения эффективной конечной концентрации, например, в кишечнике или крови, количество выращенной популяции T_reg-клеток в одной дозе композиции согласно вариантам реализации настоящего изобретения, в целом, составляет от примерно 10000 до примерно 1 триллиона клеток, предпочтительно от примерно 100000 до примерно 100 миллионов клеток, более предпочтительно от примерно 1 миллиона до примерно 50 миллионов клеток, еще более предпочтительно от примерно 10 миллионов до примерно 30 миллионов клеток, еще более предпочтительно от примерно 15 миллионов до примерно 25 миллионов клеток и еще более предпочтительно примерно 20 миллионов клеток. Аналогично, количество вторичного терапевтического соединения в одной пероральной дозе композиции согласно вариантам реализации настоящего изобретения, в общем случае, находится в диапазоне от примерно 0,01 миллиграмма до примерно 1000 миллиграммов, более предпочтительно от примерно 0,1 миллиграмма до примерно 100 миллиграммов. Очевидно, что точная дозировка может быть различной в зависимости от заболевания или нарушения, подвергающегося лечению, предпочтительные диапазоны могут быть легко определены.

[0252] В некоторых вариантах реализации выращенную популяцию T_reg-клеток можно объединять с фармацевтически приемлемым наполнителем. Подходящие фармацевтически приемлемые наполнители включают, например, фосфатный буферный солевой раствор. В одном из вариантов реализации пациенту вводят T_reg-клетки в количестве от примерно 1000 до примерно 3000000 клеток/кг массы тела. Предпочтительно вводят T_reg-клетки в количестве от примерно 100000 до примерно 1 миллиона клеток/кг массы тела. Указанную дозировку можно вводить повторно при необходимости раз в час, раз в день, раз в неделю, раз в месяц или нерегулярно. Типовые дозировки и схемы введения обсуждают ниже.

[0253] В некоторых вариантах реализации вводимые T_reg-клетки включают CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺ клетки. В некоторых вариантах реализации вводимые T_reg-клетки включают CD8αα⁺, TCRαβ⁺, IL-2Rβ⁺(CD122⁺). В некоторых вариантах реализации вводимые T_reg-клетки включают CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺, CD122⁺. Без ограничения какой-либо теорией, предполагают, что каждые из CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺ T_reg-клеток, CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD122⁺ T_reg-клеток и CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺, CD122⁺ T_reg-клеток также контролируют популяцию активированных Vβ8.2⁺ CD4 Т-клеток in vivo, и их можно применять аналогично CD8αα⁺, TCRαβ⁺ T_reg-клетками, описанным в настоящей заявке.

[0254] В некоторых вариантах реализации регуляторные Т-клетки вводят тому же субъекту, у которого они были получены. В других вариантах реализации регуляторные Т-клетки можно вводить субъекту, отличному от субъекта, у которого они были получены. В других вариантах реализации регуляторные Т-клетки можно получать у млекопитающего, которое не является субъектом. В некоторых вариантах реализации вводимые регуляторные Т-клетки содержат смесь клеток, полученную по меньшей мере у двух субъектов, у субъекта, которому вводят регуляторные Т-клетки, у субъекта, отличного от субъекта, которому вводят регуляторные Т-клетки, и у млекопитающего, не являющегося субъектом.

[0255] В некоторых вариантах реализации для выращивания популяции Т-клеток применяют планшеты с покрытием антитела к CD3, содержащие факторы роста, такие как IL-2, IL-7 и IL-15. В некоторых вариантах реализации T_reg можно выращивать in vitro с применением рекомбинантных TCR белков или пептидов, например, р42-50, выделенных из цепи TCR Vβ 8.2. Необязательно можно определять TCR Vβ или Vα-цепочечный ген, задействованный болезнь-специфическими патогенными Т-клетками. Затем белки, соответствующие указанным TCR Vβ или Vα-цепочечным генам, можно вводить в организм для активации соответствующей популяции Treg-клеток.

[0256] Различные режимы и способы введения терапевтической популяции T_reg-клеток подходят для применения согласно вариантам реализации, описанным в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации способы доставки включают, например, внутривенное введение, ингаляцию, внутримышечное, подкожное, интраназальное и пероральное введение или любой другой способ доставки, доступный в данной области техники. В зависимости от конкретного способа введения лекарственная форма может представлять собой, например, твердые, полутвердый, жидкий, газообразный препарат или аэрозоль. Лекарственная форма может включать, например, добавки, смазывающие вещества, стабилизаторы, буферы, покрытия и вспомогательные вещества, доступные в области получения фармацевтических составов.

[0257] Согласно вариантам реализации, описанным в настоящей заявке, рассматривают различные фармацевтические составы. В некоторых вариантах реализации фармацевтический состав содержит CD8 T_reg-клетки и активатор NKT-2, такой как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации фармацевтический состав содержит CD8 T_reg-клетки и милтефозин. В некоторых вариантах реализации фармацевтический состав содержит по меньшей мере один из следующих типов CD8 T_reg-клеток: CD8αα⁺ TCRαβ⁺ Т-клетки, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD200⁺ Т-клетки, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD122⁺ Т-клетки и CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺ CD122⁺ T-клетки, и дополнительно содержит активатор NKT-2, такой как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации фармацевтический состав содержит по меньшей мере один из следующих типов CD8 T_reg-клеток: CD8αα⁺ TCRαβ⁺ Т-клетки, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD200⁺ Т-клетки, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD122⁺ Т-клетки и CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺ CD122⁺ Т-клетки, и дополнительно содержит милтефозин. В некоторых вариантах реализации первый фармацевтический состав содержит CD8 T_reg-клетки, и второй фармацевтический состав содержит активатор NKT-2, такой как описано в настоящей заявке.

[0258] В некоторых вариантах реализации первый фармацевтический состав содержит CD8 T_reg-клетки, и второй фармацевтический состав содержит милтефозин. В некоторых вариантах реализации первый фармацевтический состав содержит по меньшей мере один из следующих типов CD8 T_reg-клеток: CD8αα⁺ TCRαβ⁺ Т-клетки, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD200⁺ Т-клетки, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD122⁺ Т-клетки и CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺ CD122⁺ Т-клетки, и второй фармацевтический состав содержит активатор NKT-2. В некоторых вариантах реализации первый фармацевтический состав содержит по меньшей мере один из следующих типов CD8 T_reg-клеток: CD8αα⁺ TCRαβ⁺ Т-клетки, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD200⁺ Т-клетки, CD8αα⁺ TCRαβ⁺ CD122⁺ Т-клетки и CD8αα⁺, TCRαβ⁺, CD200⁺ CD122⁺ Т-клетки, и второй фармацевтический состав содержит милтефозин. В некоторых вариантах реализации первый и второй фармацевтические составы вводят одновременно. В некоторых вариантах реализации первый и второй фармацевтические составы вводят в различное время. В некоторых вариантах реализации первый фармацевтический состав вводят перед вторым фармацевтическим составом. В некоторых вариантах реализации второй фармацевтический состав вводят перед первым фармацевтическим составом. Необязательно любой из фармацевтических составов, описанных в настоящем документе, можно получать при помощи традиционных способов с применением следующих фармацевтически приемлемых наполнителей и т.д.: вспомогательных веществ, таких как растворители (например, вода, физиологический раствор), объемообразующие агенты и наполнители (например, лактоза, крахмал, кристаллическая целлюлоза, маннит, мальтоза, гидрофосфат кальция, мягкий ангидрид кремниевой кислоты и карбонат кальция); вспомогательных веществ, таких как агенты, повышающие растворимости (например, этанол и полисольваты), связывающие агенты (например, крахмал, поливинилпирролидин, гидроксипропилцеллюлоза, этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и аравийская камедь), разрыхлители (например, крахмал и карбоксиметилцеллюлоза кальция), смазывающие агенты (например, стеарат магния, тальк и гидрированное масло), стабилизаторы (например, лактоза, маннит, мальтоза, полисольваты, макрогол и полиоксиэтилен-гидрированное касторовое масло), изотонические агенты, увлажнители, смазывающие агенты, диспергирующие агенты, буферные агенты и агенты, увеличивающие растворимость; и добавок, таких как антиоксиданты, консерванты, вкусоароматические добавки и ароматизаторы, обезболивающие агенты, стабилизаторы, красители и подсластители.

[0259] Следующие примеры приведены исключительно для иллюстрации и не ограничивают никаким образом варианты реализации, описанные в настоящей заявке.

ПРИМЕР 1

[0260] В исследовании CD1d, фиксированного на планшете, милтефозин способен стимулировать гибридому NKT-клеток II типа, Ну19.3. 96-луночные планшеты с покрытием белка CD1d инкубировали совместно с указанными липидами в течение 6 часов, промывали и добавляли Ну 19.3 NKT-клеток II типа (50000 клеток/лунку) и измеряли уровень IL-2 через 16 часов в надосадочной жидкости. LSF, лизосульфатид; LPC, лизофосфатидилхолин.

[0261] Полученные данные показывают, что милтефозин, аналог лизофосфатидилхолина (LPC), может связываться с молекулами CD1d и стимулировать NKT-клетки II типа.

ПРИМЕР 2

[0262] Мышам В6, которым ранее не проводили лечение, вводили каждый день в течение 7 дней ДМСО (контроль) или 1 мг милтефозина (растворенного в ДМСО и разбавленного в ФБР) с применением перорального зонда. Выращивали спленоциты in vitro в течение 90 часов в присутствии альфа-GalCer или без него. Стимуляция (коэффициент стимуляции) и рост NKT-клеток I типа (окрашивание FACS альфа-GalCer/CD1d^-тетрамер⁺ клетками) при концентрации альфа-GalCer 10 нг/мл показаны на фигуре 2А и фигуре 2В.

[0263] Данные, приведенные на фигуре 2А и фигуре 2В, показывают, что у животных, которым вводили милтефозин, происходило значительное подавление пролиферации и роста NKT-клеток I типа в присутствии распознаваемого ими лиганда альфа-GalCer.

[0264] Полученные данные согласуются с тем наблюдением, что другие липиды, такие как сульфатид (гликолипид) или лизофосфатидилхолин (LPC, фосфолипид), активируют NKT-клетки II типа, что приводит к инактивации или подавлению NKT-клеток I типа.

ПРИМЕР 3

[0265] Разделенным на группы мышам BL/6 вводили ДМСО/ФБР или милтефозин за 12 часов до введения ConA и определяли повреждение печени путем окрашивания Н&Е срезов печени, уровень ферментов печени, таких как ALT, в сыворотке исследовали через 24 часа (фигура 3А и фигура 3В). Показанные данные соответствуют 2 независимым экспериментам.

[0266] Как показано на фигуре 3В, окрашивание, соответствующее некрозу (красное окрашивание Н&Е) 1, наблюдали в срезах печени, которые обрабатывали Con А, но окрашивание, соответствующее пониженному некрозу (пониженное красное окрашивание Н&Е) 2, наблюдали в срезах печени, которые обрабатывали ConA и милтефозином.

[0267] Соответственно, после лечения с применением милтефозина наблюдали подавление индуцированного ConA гепатита. Полученные данные показывают, что аналогично сульфатиду или LPC, лечение мышей с применением милтефозина приводит к значительному подавлению повреждения печени после инъекции Con А.

ПРИМЕР 4

[0268] Разделенным на группы мышам C57BL/6 давали жидкий рацион с алкоголем (EtOH) или изокалорийный контрольный корм (контроль) в течение 10 дней, который содержал милтефозин (~500 микрограммов в день) или ДМСО/ФБР. На 11 день через 9 часов после приема алкоголя (хронический и избыточный прием) исследовали накопление и активацию NKT-клеток I типа (альфа-GalCer/CD1d^-тетрамер⁺ клетки) или нейтрофилов (Ly^-6G⁺CD11b⁺) в печени. Как показано на фигуре 4А и фигуре 4В, по сравнению с группой, в которой вводили контрольный корм, NKT-клетки I типа накапливались в печени мышей, которым в течение длительного периода времени вводили корм с избыточным содержанием EtOH. Кроме того, как показано на фигуре 4С и фигуре 4D, NKT-клетки I типа активировались (что оценивали по экспрессии CD69 на клеточной поверхности альфа-GalCer/CD1d-тетрамер⁺ клеток), что сопровождалось накоплением нейтрофилов (Ly^-6G⁺CD11b⁺ клетки) в печени. Накопление активированных NKT-клеток I типа и нейтрофилов приводит к воспалительному каскаду, который вызывает повреждение гепатоцитов при АБП. Следует отметить, что у мышей, которым вводят милтефозин, оба указанных вида клеток не накапливаются, что обеспечивает защиту от повреждения печени.

[0269] Полученные данные указывают на подавление накопления активированных NKT-клеток I типа, а также нейтрофилов при алкогольной болезни печени (АБП) у мышей, которым вводили милтефозин. Таким образом, предполагается, что милтефозин можно применять для лечения воспалительных заболеваний печени, включая АБП, NASH, ПБЦ, ПСХ, вирусный гепатит и т.д.

ПРИМЕР 5

[0270] Было обнаружено, что лечение с применением сульфатида приводит к значительному подавлению хронического и рецидивирующего ЭАЭ у мышей SJL/J. Тем не менее, как показано на фигуре 6, лечение с применением перорального сульфатида хотя и подавляет заболевание первоначально при пероральном введении, но не очень эффективно. Без ограничения какой-либо теорией, предполагают, что сульфатид является не очень стабильным в кишечнике, что согласуется с наблюдаемой низкой эффективностью. Если рассматривать фигуру 6, то разделенным на группы мышам В6 перорально вводили сульфатид (200 микрограммов в 200 микролитрах ФБР) в течение 7 дней, введение начинали за один день перед индуцированием заболевания. Ежедневно отслеживали клинический паралич и присваивали индекс от 1 до 5. Несмотря на то, что в первые 4-5 дней защита была обеспечена, затем у мышей из обеих групп тяжесть заболевания выравнивалась. Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что наблюдаемая схожесть результатов в обеих группах согласуется с нестабильностью сульфатида в кишечнике.

[0271] Как показано на фигуре 5, проводили оценку возможного подавления хронического и рецидивирующего ЭАЭ, который является прототипом рассеянного склероза, при пероральном введении милтефозина, который предположительно является относительно стабильным. Разделенным на группы мышам SJL при помощи перорального зонда вводили милтефозин (1 мг в 200 микролитрах 10% ДМСО/ФБР) или контроль (ДМСО/ФБР) два раза в неделю, что указано стрелками. Клиническую тяжесть заболевания отслеживали ежедневно, оценивая паралич в обеих группах мышей по шкале от 1 до 5, что показано на фигуре.

[0272] В данных, приведенных на фигуре 5, обобщены результаты лечения хронического и рецидивирующего экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ), который является прототипом рассеянного склероза, с применением милтефозина. В указанных экспериментах показано, что опосредованные Т-клетками аутоиммунные заболевания, включая MS, T1DD, RA, волчанку и IBD и т.д., можно излечивать с применением милтефозина.

ПРИМЕР 6

[0273] МКПК (1×10⁶/лунку) стимулировали in vitro с применением 100 нг/мл αGalCer, 100 нг/мл αGalCer + 5 мкг/мл милтефозина, или не проводили стимуляцию. Через 12 дней собирали клетки и оценивали уровень NKT-клеток I типа в процентах путем проточной цитометрии. Собирали окрашенные клетки с использованием BD FACS Canto. Анализировали данные при помощи программного обеспечения FlowJo. NKT-клетки человека I типа, которые идентифицировали как CD3+/Vα24Jα18 TCR+клетки (CD1d-ограниченные NKT-клетки I типа), показаны как % NKT-клеток в выделенной рамками области на фигуре 7. Содержание NKT-клеток I типа в процентах в свежих МКПК (без культуры) и МКПК после выращивания in vitro показано для каждого графика. Данные, показанные на фигуре 7, соответствуют более чем 5 независимым экспериментам.

[0274] Соответственно, показано, что согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лечение с применением милтефозина может приводить к росту NKT-клеток человека I типа.

[0275] Использование форм единственного числа в настоящей заявке может включать ссылки на множество объектов, если конкретно не указано иное или если специалистам в данной области техники после изучения настоящего описания не станет понятно, что форма единственного числа является единственным функциональным вариантом реализации. Таким образом, например, форма единственного числа может означать более чем один, и «один вариант реализации» может означать, что описание относится к нескольким вариантам реализации.

[0276] В приведенном выше описании и примерах подробно описаны определенные варианты реализации. Следует понимать, тем не менее, что независимо от подробности описания, приведенного в тексте, изобретение может быть реализовано при помощи множества способов, и изобретение следует рассматривать в соответствии с прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

ПРИМЕР 7

[0277] Разделенным на группы самкам мышей SJL/J перорально вводили 1 мг милтефозина, как показано на фигуре 2, до и во время заболевания. Мышей умерщвляли на 59 день. Профили проточной цитометрии мононуклеарных клеток печени, окрашенных CD4, CD8α и CD8β mAb, показаны на фигурах 8А-В. Интересно, что в то время, как уровень регуляторных CD8αα+ Т-клеток значительно повышен в печени, уровень других CD4+ и CD8αβ+ Т-клеток значительно не различается в группах, в которых вводили контроль и проводили лечение.

[0278] Соответственно, введение ингибиторов NKT-2, таких как милтефозин, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения может повышать индуцирование CD8αα+ Т-клеток в печени.

ПРИМЕР 8

[0279] Для определения регуляторного потенциала in vivo CD8 Treg адоптивно переносили 2D11 клетки при помощи внутривенного способа сингенетическим мышам. Через 24 часа реципиентов иммунизировали MBPAc1-9/CFA/PT для индуцирования ЭАЭ, ежедневно отслеживали клинические симптомы и в течение 35-45 дней оценивали их количественно по шкале 1-5: где 1 соответствует параличу хвоста; 2 соответствует параличу задних конечностей; 3 соответствует параличу задней части тела; 4 соответствует параличу задних конечностей и частичному параличу тела; и 5 соответствует параличу всего тела или гибели. Как показано на фигуре 8А, мыши, которым вводили инъекцию 1 миллиона 2D11 клеток, быстрее восстанавливались от ослабленного заболевания по сравнению с контрольной группой. Для проверки той возможности, что способность борьбы с заболеванием определяется долгоживущими культурами конкретного клона, получали короткоживущие линии р42-50-реакционных Т-клеток и использовали в схожих экспериментах по адоптивному переносу. Как показано на фигуре 8В, мыши, которым вводили пять миллионов клеток р42-50-реакционной Т-клеточной линии, были полностью защищены от индуцированного МВР ЭАЭ, и перенос только одного миллиона клеток обеспечивает ускоренное восстановление от ослабленного паралича. Адоптивный перенос короткоживущих Т-клеточных линий в отношении двух малозначимых TCR пептидов не оказывал влияния на ЭАЭ (данные не показаны). См. фигуры 8А-В.

[0280] Соответственно, адоптивный перенос линий и клонов CD8 Treg согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обеспечивает быстрое восстановление и защиту при ЭАЭ. Соответственно, предполагается, что адоптивный перенос линий и клонов CD8 Treg согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения может ослаблять и/или предотвращать по меньшей мере одно воспалительное состояние.

ПРИМЕР 9

[0281] Преобладающее использование TCR Vβ6 цепи клетками CD8 T_reg показано путем оценки возможного влияния лечения мышей mAb к Vβ6 на репертуар CD8 T_reg и течение MBPAc1-9-индуцированного ЭАЭ. После одной внутривенной инъекции mAb к TCR Vβ6 (RR4-7, 300 мкг/мышь) проводили оценку спленоцитов в различные моменты времени для определения наличия Vβ6⁺ клеток in vivo. Как и ожидалось, инъекция mAb к TCR Vβ6 приводила к ранней активации TCR Vβ6⁺ Т-клеток in vivo, что определяли по экспрессии маркера ранней активации CD69 (фигура 9А, второй столбец), и последующей понижающей регуляции экспрессии Vβ6 на клеточной поверхности (фигура 9А, первый столбец). Эффект mAb к TCR Vβ6 был TCR-специфическим, так как действие на Vβ8⁺ Т-клетки в идентичных экспериментальных условиях отсутствовало (фигура 9А, третий и четвертый столбцы). Анализ ОТ-ПЦР в реальном времени экспрессии мРНК TCR Vβ6 в спленоцитах у мышей, которым проводили лечение с применением mAb к TCR Vβ6, показал, что TCR Vβ6⁺ Т-клетки в большинстве своем, но не все, истощались после долгосрочного лечения (фигура 9В и не указанные данные).

[0282] CD8αα Т-клетки, главным образом, присутствующие во внутриэпителиальных лимфоцитах (IEL) в кишечнике, являются относительно устойчивыми к уничтожению под действием собственных агонистов и могут отличаться от CD8αβ Т-клеток ответом на активацию посредством Т-клеточного рецептора. Проводили исследование, в котором изучали возможное уничтожение или активацию CD8αα Т-клеток в периферических органах при введении mAb к TCR Vβ6 с применением окрашивания TL-тетрамером. Данные, приведенные на фигуре 9С, указывают на то, что TL-тетрамер⁺ CD8⁺ клетки не истощались после введения антитела. Действительно, у мышей, которым вводили антитело, наблюдали незначительное увеличение вторичного ответа in vitro на р42-50 (данные не показаны). Для дополнительного исследования регуляторной функции после активации CD8αα⁺ Vβ6⁺ Т-клеток разделенных на группы мышей иммунизировали MBPAc1-9/CFA/PT для индуцирования ЭАЭ. Через один день и одну неделю вводили внутривенную инъекцию небольшой дозы mAb к TCR Vβ6 (100 мкг/мышь), контрольного изотипа mAb (100 мкг/мышь) или ФБР. Клинические симптомы отслеживали ежедневно после второй инъекции. Данные, приведенные на фигуре 9D и в таблице 4, показывают, что активация in vivo Vβ6⁺ Т-клеток с применением mAb к TCR Vβ6 приводила к защите от ЭАЭ у мышей B10.PL. В противоположность этому, животные в группе, в которой вводили инъекцию контрольного изотипа mAb или неспецифического mAb, не были защищены от заболевания данные не показаны).

[0283] Активация (экспрессия CD69) и последующая понижающая регуляция/истощение Vβ6⁺, но не Vβ8⁺ Т-клеток после одной внутривенной инъекции mAb к TCR Vβ6 (300 мкг/мышь). В дни 0, 1 и 3 спленоциты окрашивали с применением TCR Vβ6-FITC/CD8α-PE/CD69-PerCP (первый и второй столбцы) или TCR Vβ8-FITC/CD8α-PE/CD69-PerCP (третий и четвертый столбцы). Клетки разделяли на TCR Vβ6/CD8α⁺ Т-клетки (второй столбец) или TCR Vβ8/CD8α⁺ Т-клетки (четвертый столбец) для анализа экспрессии маркера ранней активации CD69. Данные соответствуют двум независимым экспериментам. (b) Значительное истощение Vβ6⁺ Т-клеток после инъекции антитела к Vβ6 при определении путем ПЦР в реальном времени. Экспрессия мРНК показана как относительное количество после нормирования по двумя генам внутреннего контроля (L32 и циклофилин). Данные соответствуют двум независимым экспериментам, (с) TL-тетрамер⁺ CD8 Т-клетки не истощаются после инъекции антитела к TCR Vβ6. Спленоциты окрашивали CD8α-FITC/TL-тетрамер-РЕ в указанные дни после инъекции антитела. Данные соответствуют двум независимым экспериментам, (d) Мыши, которым вводили инъекцию mAb к TCR Vβ6, имели защиту от ЭАЭ. Через один день и семь дней после индуцирования ЭАЭ с применением MBPAc1-9/CFA/PT разделенным на группы мышам вводили инъекцию mAb к TCR Vβ6 (100 мкг/мышь) или изотипного контроля IgG или ФБР. Парализующее заболевание отслеживали согласно описанию, приведенному в разделе Способы. Полученные данные объединены для трех независимых экспериментов.

1. Исследовали пролиферацию или секрецию цитокинов в клоне CD8αα T_reg 2D11 в ответ на р 42-50 в присутствии антиген-презентирующих клеток (АРС), выделенных из различных Н-2 гаплотипов. Показаны гаплотипы Н-2K, D, L, Qa-1 и Qa-2.

2. Н-2 гаплотипы.

3. "+" и "-" в последнем столбцы относятся к положительному ответу и отсутствию ответа на р 42-50, соответственно. Положительный ответ определен при коэффициентах стимуляции (SI) более 3 (от 7,25+/-1,93 до 58,06+/-18,69).

1. Антитела (100 мкг) инъецировали в.в. в 1 день и 8 день после иммунизации МВРАс1-9 (день 0).

[0284] Соответственно, активация TCR Vβ6+ Т-клеток in vivo согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обеспечивает защиту от ЭАЭ.

1. Способ облегчения или предотвращения по меньшей мере одного воспалительного состояния у субъекта, включающий введение количества активатора Т-клеток - натуральных киллеров II типа (NKT-2), которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта, где указанный активатор NKT-2 представляет собой милтефозин, и где указанное воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, аутоиммунного гепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного склероза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита A, B и C, воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки и бокового амиотрофического склероза.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение субъекту количества агониста RAR, которое является достаточным для подавления активации NKT-клеток I типа у субъекта.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, в котором указанный активатор NKT-2 вводят перорально.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором указанное воспалительное состояние представляет собой рассеянный склероз.

5. Способ по любому из пп. 1-3, в котором указанное воспалительное состояние представляет собой системную красную волчанку.

6. Способ по любому из пп. 1-3, в котором указанное воспалительное состояние представляет собой неалкогольный стеатогепатит.

7. Способ подавления повреждения ткани, опосредованного NKT-клетками I типа, у субъекта, включающий введение эффективного количества активатора NKT-2 субъекту, причем понижается активация NKT-клеток I типа, где указанный активатор NKT-2 представляет собой милтефозин, и где указанное повреждение ткани выбрано из группы, состоящей из жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, аутоиммунного гепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного склероза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита A, B и C, воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки и бокового амиотрофического склероза.

8. Способ по п. 7, в котором указанное воспалительное состояние представляет собой рассеянный склероз.

9. Способ по п. 7, в котором указанное воспалительное состояние представляет собой системную красную волчанку.

10. Способ по п. 7, в котором указанное воспалительное состояние представляет собой неалкогольный стеатогепатит.

11. Способ по любому из пп. 1-10, дополнительно включающий введение выделенных CD8αα+, TCRαβ+ T-клеток субъекту.

12. Способ облегчения или предотвращения по меньшей мере одного воспалительного состояния у субъекта, включающий:

введение выделенных CD8αα+, TCRαβ+ T-клеток субъекту; и

введение количества активатора NKT-2, которое является достаточным для активации NKT-клеток II типа у субъекта, где указанный активатор NKT-2 представляет собой милтефозин, и где указанное воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из жировой болезни печени, алкогольного гепатита, неалкогольного стеатогепатита, аутоиммунного гепатита, цирроза, неалкогольной жировой болезни печени, фиброза, первичного склерозирующего холангита, первичного билиарного склероза, фульминантного цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита A, B и C, воспалительного гепатита, связанного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, диабета 1 типа, трансплантации солидных органов, системной красной волчанки и бокового амиотрофического склероза.

13. Способ по п. 12, в котором выделенные CD8αα+, TCRαβ+ T-клетки вводят субъекту одновременно с активатором NKT-2.

14. Способ по любому из пп. 12, 13, дополнительно включающий:

получение образца клеток у млекопитающего;

выделение CD8αα+, TCRαβ+ T-клеток из образца клеток; и

выращивание выделенных T-клеток.

15. Способ по п.14, в котором указанное млекопитающее является субъектом.

16. Способ по любому из пп. 12-15, в котором выделенные T-клетки выбраны из группы, состоящей из CD8αα+, TCRαβ+, CD200+, CD8αα+, TCRαβ+, CD122+ и CD8αα+, TCRαβ+, CD200+, CD122+.

17. Способ по любому из пп. 12-16, в котором указанное воспалительное состояние представляет собой рассеянный склероз.

18. Способ по любому из пп. 12-16, в котором указанное воспалительное состояние представляет собой системную красную волчанку.

19. Способ по любому из пп. 12-16, в котором указанное воспалительное состояние представляет собой неалкогольный стеатогепатит.