Способ идентификации бактерий из положительных гемокультур методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (maldi-tof ms), у больных с инфекцией кровотока

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии. Раскрыт способ идентификации бактерий из положительных гемокультур методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии у больных с инфекцией кровотока, включающий пробоподготовку положительной гемокультуры путем ее переноса из флакона, предназначенного для культивирования микроорганизмов, в пробирку с разделительным гелем, далее центрифугируют при 3000 оборотах в течение 10 минут, полученную надосадочную жидкость перемешивают и проводят последовательные этапы центрифугирования, добавления к осадку деионизированной воды, 96%-ного этилового спирта, экстракции белкового экстракта муравьиной кислотой и ацетонитрилом, перемешивая смесь на вортексе и центрифугируя при 13000 оборотах в течение 2 минут, полученную надосадочную жидкость наносят на мишень масс-спектрометра, после высыхания покрывают матрицей и проводят идентификацию микроорганизмов методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии у больных с инфекцией кровотока. Изобретение обеспечивает снижение трудоемкости за счет внесения меньшего количества реагентов и сокращение времени подготовки положительных гемокультур, обеспечивающей высокую точность идентификации микроорганизмов из кровотока, содержащего бактерии. 3 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии, с возможностью применения у больных в гематологии, и может быть использовано для идентификации бактерий из положительной гемокультуры методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) у больных с инфекцией кровотока.

Инфекции кровотока являются одной из самых распространенных форм внутрибольничной инфекции в различных странах мира Основная доля инфекций кровотока возникает у пациентов, находящихся в специализированных отделениях, таких как отделения реанимации и интенсивной терапии, гематологии, кардиохирургии, трансплантологии, ожоговые отделения и т.п. Современная высокотехнологичная медицина позволяет достичь высоких результатов лечения данных больных, но наряду с успехами в лечении больных увеличивается риск возникновения тяжелых инфекционных осложнений. Инфекции кровотока являются одним из частых и тяжелых осложнений у иммунокомпрометированных больных.

Развитие инфекций кровотока у иммунокомпрометированных больных происходит как при эндогенном, так и при экзогенном варианте инфицирования микроорганизмами. Эндогенная транслокация бактерий в кровоток происходит, как правило, через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, повреждаемую цитостатическими препаратами или опухолью. Экзогенный вариант развития инфекции включает проникновение микроорганизмов из окружающей среды, их передачу от одного больного другому или через руки медперсонала. Место установки центрального венозного катетера может быть «входными воротами» для микроорганизмов, колонизирующих кожные покровы больного. Возбудители могут мигрировать с кожи больного или с рук медицинского персонала на поверхность катетера по его наружной или внутренней стенке.

Одна из ведущих причин высокой летальности при инфекциях кровотока - это несвоевременная или неадекватная терапия противомикробными препаратами. В этой связи крайне важным является предоставление результатов идентификации микроорганизмов в клинические отделения в максимально короткий срок.

В литературе представлено несколько методов по прямой идентификации микроорганизмов из гемокультур. Известен способ идентификации микроорганизмов из тестируемого образца гемокультуры. Способ предусматривает получение тестируемого образца, селективный лизис и растворение клеток, не являющихся микроорганизмами тестируемого образца, наслаивание полученного лизата на плотностной буфер в герметичном контейнере и дальнейшее центрифугирование. Плотностный буфер имеет однородную плотность приблизительно от 1,025 г/мл до 1,120 г/мл. При этом микроорганизмы, проходя через указанный буфер, формируют осадок на дне контейнера. Осадок исследуют с использованием рамановской спектроскопии, что позволяет идентифицировать микроорганизм на уровне рода или вида. Изобретение позволяет идентифицировать микроорганизмы из клинических образцов за 120 мин и менее (RU 2541775, 20.02.2015).

Известен способ подготовки первичных монокомпонентных положительных гемокультур для прямой идентификации микроорганизмов методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии, при этом для подготовки к анализу образца из флаконов, содержащих в качестве сорбента полимерные гранулы, к 1 мл его содержимого, помещенного в микропробирку, добавляли 200 мкл 5% водного раствора сапонина для лизиса эритроцитов. Смесь инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре, лизат центрифугировали (12000 об/мин, 1 мин), после чего удаляли супернатант. Далее осадок промывали 1 мл фосфатно-солевого буфера, затем повторно центрифугировали (12000 об/мин, 1 мин) и удаляли супернатант. К осадку добавляли сначала 300 мкл бидистилированной воды, перемешивали, затем 900 мкл этанола, далее центрифугировали (12000 об/мин, 2 мин), удаляли супернатант, осадок подсушивали при комнатной температуре в течение нескольких минут, после чего к нему последовательно добавляли сначала 20 мкл муравьиной кислоты, затем равное количество ацетонитрила. Полученную суспензию перемешивали, после чего вновь центрифугировали (12000 об/мин, 2 мин), 1 мкл белкового экстракта наносили на мишень масс-спектрометра в двух повторностях, подсушивали, после чего добавляли раствор матрикса (α-циано-4- гидроксикоричная кислота) в соотношении 1:1 и оставляли до полного высыхания. Пробоподготовка образца из флаконов, содержащих в качестве сорбента активный уголь, включала предварительный этап его осаждения путем центрифугирования (400 об/мин, 0,5 мин), не приводящего к седиментации микроорганизмов. Масс-спектры регистрировали в автоматическом режиме в диапазоне 2-20 кД. Исследуемые образцы помещали в вакуумную камеру прибора, где они под воздействием лазерного излучения подвергались мягкой ионизации. Образующиеся при этом заряженные частицы двигались в электрическом поле к аноду-детектору со скоростью, пропорциональной их массе, формируя соответствующий масс-спектр. При сканировании каждого образца снимали по 100 спектров. Идентификацию микроорганизмов осуществляли путем автоматического сравнения полученных масс-спектров с референсной базой данных, содержащей информацию более чем о 950 клинически значимых видах микроорганизмов (Попов Д.А., Овсеенко С.Г. и др. и др. Экспресс-идентификация положительных гемокультур с помощью метода прямой MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Анестезиология и реаниматология, 2015, №5, с. 71-75).

Однако данные способы трудоемки, так как требуют внесения большого количества реагентов. Необходимы простые и надежные способы выделения микроорганизмов из клинических образцов (например, гемокультуры), которые свободны от материалов, способных изменить результат идентификации, и совместимы с технологиями быстрой идентификации.

Технический результат заключается в снижении трудоемкости за счет внесения меньшего количества реагентов и сокращения времени подготовки положительных гемокультур, обеспечивающих высокую точность идентификации микроорганизмов из кровотока, содержащего бактерии.

Технический результат достигается тем, что подготовку положительных гемокультур для идентификации микроорганизмов методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии у больных с инфекцией кровотока проводят путем ее переноса из флакона с жидкой питательной средой и сорбентом для антибиотиков, предназначенного для культивирования микроорганизмов, в пробирку с разделительным гелем и центрифугируют при 3000 оборотах в течение 10 минут, полученную надосадочную жидкость перемешивают, переносят в микроцентрифужную пробирку и центрифугируют при 3000 оборотах в течение 2 минут, после чего надосадочную жидкость переносят во вторую микроцентрифужную пробирку и центрифугируют при 13000 оборотах в течение 2 минут, удаляют надосадочную жидкость, в осадок добавляют деионизированную воду и перемешивают на вортексе, далее добавляют 96% этиловый спирт и еще раз перемешивают на вортексе, после чего центрифугируют при 13000 оборотах в течение 2 минут, затем удаляют спирт и центрифугируют при 13000 оборотах в течение 2 минут, а остатки спирта удаляют, оставляя микроцентрифужную пробирку с открытой крышкой до полного испарения спирта, далее проводят экстракцию белкового экстракта муравьиной кислотой и ацетонитрилом перемешивая смесь на вортексе и центрифугируя при 13000 оборотах в течение 2 минут, полученную надосадочную жидкость наносят на мишень масс-спектрометра, после высыхания покрывают матрицей и проводят идентификацию микроорганизмов методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии у больных с инфекцией кровотока.

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь для микробиологического исследования берут у больных с инфекцией кровотока при температуре от 38° и более из периферической вены или из центрального венозного катетера. Вносят образцы крови в коммерческие флаконы с жидкой питательной средой, предназначенные для аэробного или анаэробного культивирования микроорганизмов (ВАСТЕС Plus Aerobic/F, ВАСТЕС Plus Anaerobic/F, Becton Dickinson). Флаконы с кровью инкубируют в автоматическом анализаторе для гемокультур (BD ВАСТЕС FX, Becton Dickinson). После сигнала прибора о наличии «положительной» гемокультуры (то есть, получен рост микроорганизма во флаконе с питательной средой) проводят пробоподготовку для идентификации микроорганизмов методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии. Для этого из флакона с «положительной» гемокультурой отбирают 5-6 мл крови в пробирку с разделительным гелем. Присутствие клеток крови и белков плазмы искажает интерпретацию белкового спектра бактерий при идентификации методом MALDI-TOF MS непосредственно из положительных флаконов с гемокультурой. Использование пробирок с гелем (например, пробирка Моноветта 7,5 мл сыворотка-гель, Sarstedt AG&Co., Германия), предназначенных для отделения клеточных элементов и белков от сыворотки, способствует увеличению числа удачных идентификаций. Пробирку с разделительным гелем и образцом положительной гемокультуры центрифугируют при 3000 оборотах в течение 10 минут. После центрифугирования бактерии находятся на поверхности геля. Затем аккуратно перемешивают полученную надосадочную жидкость в пробирке стерильной одноразовой пипеткой (примерно 15 сек). Далее 1 мл полученной надосадочной жидкости помещают в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 3000 оборотах в течение 2 минут. После центрифугирования белки и форменные элементы оседают на дно пробирки. Затем 1 мл надосадочной жидкости переносят во вторую микроцентрифужную пробирку и центрифугируют при 13000 оборотах в течение 2 минут. После центрифугирования бактерии оседают на дно второй микроцентрифужной пробирки. Надосадочную жидкость удаляют и далее работают с осадком, в котором находятся бактерии. В полученный осадок добавляют 300 мкл деионизированной воды и перемешивают на вортексе в течение 30 сек. Затем добавляют 900 мкл 96% этилового спирта и еще раз перемешивают на вортексе в течение 30 сек после чего центрифугируют при 13000 оборотах в течение 2 минут. Из пробирки удаляют большую часть спирта и еще раз центрифугируют при 13000 оборотах в течение 2 минут. Остатки спирта (примерно 100-200 мкл) удаляют, затем оставляют микроцентрифужную пробирку с открытой крышкой для полного испарения спирта на 5-7 мин. Далее осуществляют экстракцию белков, добавляя муравьиную кислоту пропорционально количеству осадка (10-30 мкл), перемешивают на вортексе, затем добавляют столько же ацетонитрила (10-30 мкл) и вновь перемешивают на вортексе, далее центрифугируют при 13000 оборотах в течение 2 минут. Полученную надосадочную жидкость наносят на мишень (слайд) масс-спектрометра и после полного высыхания (примерно в течение 5 мин) покрывают «матрицей», содержащей α-циано-4-гидроксикоричную кислоту и раствор 50% ацетонитрила в сочетании с 2,5% трифторуксусной кислоты. Образец полностью высушивают при комнатной температуре примерно в течение 5 мин. Затем мишень устанавливают в анализатор Microflex LT (Broker Daltonics, Германия) и проводят идентификацию микроорганизмов методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии.

В период с апреля 2018 года по март 2019 была исследована 131 положительная гемокультура от больных с инфекцией кровотока. Кровь для микробиологического исследования брали от больных с инфекцией кровотока при температуре от 38° и более из периферической вены или из центрального венозного катетера. Вносили образцы крови в коммерческие флаконы с жидкой питательной средой, предназначенные для аэробного или анаэробного культивирования микроорганизмов (ВАСТЕС Plus Aerobic/F, ВАСТЕС Plus Anaerobic/F, Becton Dickinson) и культивировали в автоматическом анализаторе гемокультур (BD ВАСТЕС FX, Becton Dickinson). После получения сигнала анализатора о наличии роста микроорганизмов во флаконе с гемокультурой проводили ускоренную идентификацию микроорганизмов с использованием предложенной методики (описано выше). Параллельно проводили исследование классическим методом: содержимое флакона переносили на плотные питательные среды, инкубировали чашки Петри в термостате и после получения культуры идентифицировали полученные микроорганизмы методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии.

Из всех флаконов для культивирования микроорганизмов с положительной гемокультурой был выделен 131 микроорганизм в монокультуре, из них 53 - грамотрицательных бактерий и 78 грамположительных бактерий. Спектр микроорганизмов, полученных из положительных гемокультур, представлен в таблице 1.

При использовании предложенной ускоренной методики успешная идентификация микроорганизмов до рода была получена в 79,4% (в 104 из 131) случаев, до вида - в 74% (97 из 131). Идентификация до рода грамотрицательных бактерий была в 96,2% (в 51 из 53) случаев, грамположительных бактерий - в 67,9% (в 53 из 78) (таблица 2). Результаты идентификации до рода микроорганизмов, полученные предложенным методом, полностью (100%) совпадали с результатами идентификации после культивирования микроорганизмов классическим методом. Расхождения в идентификации до вида были только в 4,1% (в 4 из 97) случаях, но эти бактерии были правильно определены до рода (Streptococcus oralis вместо Streptococcus mitis, Enterobacter kobei вместо Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae вместо Enterobacter cloacae, Enterobacter cloacae вместо Enterobacter asburiae). Следует отметить, что S. oralis и S. mitis относятся к одной группе Streptococcus группы viridans, а Е. cloacae, Е. asburiae, Е. kobei относятся к Enterobacter cloacae complex, и для этих групп бактерий существуют одни и те же антибиотики для лечения. В таблице 2 используются следующие сокращения: 1 - грам+ - грамположительные микроорганизмы; 2 - грам- - грамотрицательные микроорганизмы; м/о - микроорганизм. Если при идентификации предложенным методом не было результатов, то в столбце «Идентификация рода и вида м/о» проставлено значение «Нет идентификации», а в столбцах «Коэффициент идентификации в усл. ед. (Score)», «Разница во времени идентификации м/о между двумя методами, часы», «1 - совпадение, 0 - несовпадение» нет значений.

Медиана длительности инкубации флаконов с гемокультурой до получения положительного сигнала составила 16 ч 13 мин (разброс от 3 ч 50 мин до 73 ч 17 мин), причем, медиана инкубации грамотрицательных бактерий была меньше, чем грамположительных бактерий и составила 13 ч 36 мин (разброс от 3 ч 50 мин до 45 ч 25 мин) против 18 ч 56 мин (разброс от 9 ч 5 мин до 73 ч 17 мин), р=0,0002. Медиана времени, затраченного на пробоподготовку и идентификацию микроорганизмов предложенным методом, составила 52 мин (разброс от 40 мин до 60 мин). Предложенным методом суммарное время от начала инкубации гемокультур в анализаторе до идентификации микроорганизмов и передачи результатов исследования в клинические отделения составило 17 ч 8 мин, для грамотрицательных бактерий - 14 ч 28 мин, для грамположительных бактерий - 18 ч 54 мин, таблица 3. Классическим методом (получение роста бактерий на плотных питательных средах и проведение их идентификации) период от начала инкубации флаконов в автоматическом анализаторе до идентификации микроорганизмов составил 41 ч 5 мин. Таким образом, предложенный метод позволяет идентифицировать микроорганизмы на 23 ч 41 мин раньше и существенно сократить время представления результатов в клинику, чем при использовании классического метода идентификации, различия во времени статистически значимы (р<0,001). Время от начала инкубации до идентификации микроорганизмов предложенным методом и классическим методом для разных видов бактерий представлено в таблице 3.

Примеры реализации предлагаемого способа ускоренной идентификации бактерий.

Пример 1

Больной К., 27 лет, с диагнозом острый миелобластный лейкоз поступил в стационар для проведения трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТКМ) от неродственного HLA-идентичного донора. Больному было проведено предтрансплантационное кондиционирование в миелоаблативном режиме, включавшее бусульфан, циклофосфамид и антитимоцитарный глобулин. Алло-ТКМ была выполнена 05.02.2019. На фоне миелотоксического агранулоцитоза (08.02.2019) у больного появилась диарея, а через несколько дней (12.08.2019) - мукозит. Повышение температуры до 39,2°С было констатировано 13.02.2019. После выполнения микробиологического исследования крови из перефирической вены и центрального венозного катетера был назначен цефоперазон/сульбактам. Через 10 часов 30 минут (14.02.2019) после начала инкубации крови во флаконах, предназначенных для культивирования микроорганизмов, был зарегистрирован рост микроорганизмов. Сразу после сигнала автоматического анализатора гемокультур был использован предложенный метод подготовки положительной гемокультуры для идентификации микроорганизмов методом MALDI-TOF MS, и параллельно был проведен посев содержимого флакона с положительной гемокультурой на плотные питательные среды (классический метод). Через 50 минут была получена идентификация микроорганизмов предложенным методом, были идентифицированы два микроорганизма - Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae. В этот же день (14.02.2019) у больного было отмечено ухудшение состояния в виде повышения температуры до 39°С с ознобом и повышением содержания лактата в крови до 6,7 ммоль/л (допустимые значения 0,5-1,6 ммоль/л). Таким образом, у больного был диагностирован сепсис, вызванный двумя грамотрицательными микроорганизмами. Сразу после получения результатов идентификации микроорганизмов предложенным методом была проведена эскалация антибактериальной терапии, включавшая отмену цефоперазона/сульбактама и назначение меропенема и колистина. Результат идентификации микроорганизмов классическим методом был получен только на следующий день (15.02.2019) и подтвердил полностью видовую принадлежность микроорганизмов. Время от начала инкубации флакона с гемокультурой до идентификации микроорганизмов предложенным методом составило 11 ч 20 мин, классическим методом - 37 ч 15 мин. На фоне антибактериальной терапии было достигнуто клиническое улучшение в виде снижения температуры с 39,2°С до 37°С, регрессировали симптомы сепсиса. Целевая противомикробная терапия была реализована через 11 ч 20 мин от момента возникновения температуры. Колистин был отменен через 12 дней, меропенем - через 18 дней. Перевода больного в отделение реанимации не было.

Пример 2

Больная Н., 64 года, с диагнозом острый миелоидный лейкоз поступила в стационар для проведения четвертого курса химиотерапии по программе децитабин-цитабарин-идарубицин. На фоне миелотоксического агранулоцитоза 04.03.2019 у больной было отмечено повышение температуры до 39,6°С. После выполнения микробиологического исследования крови из перефирической вены и центрального венозного катетера был назначен цефоперазон/сульбактам. Через 10 часов 13 минут (05.03.2019) после начала инкубации крови во флаконах, предназначенных для культивирования микроорганизмов, был зарегистрирован рост микроорганизмов. Сразу после сигнала автоматического анализатора гемокультур была проведена идентификация микроорганизмов предложенным методом, и параллельно был проведен посев содержимого флакона с положительной гемокультурой на плотные питательные среды (классический метод). Через 51 минут была получена идентификация микроорганизмов предложенным методом, были идентифицированы Klebsiella pneumoniae. Сразу после получения результатов идентификации микроорганизмов предложенным методом была проведена эскалация антибактериальной терапии, включавшая отмену цефоперазона/сульбактама и назначение меропенема и амикацина. Результат идентификации микроорганизмов классическим методом из гемокультуры был получен только на следующий день и подтвердил полностью видовую принадлежность микроорганизмов. Время от начала инкубации флакона с гемокультурой до идентификации микроорганизмов предложенным методом составило 11 ч 4 мин, классическим методом - 34 ч 10 мин. На момент идентификации классическим методом (06.03.2019) на фоне антибактериальной терапии было достигнуто клиническое улучшение в виде снижения температуры с 39,6°С до 37°С. Целевая противомикробная терапия была реализована через 11 ч 4 мин от момента возникновения температуры. В результате лечения было отмечено улучшение состояния больного. Амикацин был отменен через 8 суток, а меропенем - через 10 суток применения.

Таким образом, предложенный способ продемонстрировал высокую точность идентификации микроорганизмов у больных с инфекцией кровотока сравнимую с классическим методом, при статистически значимом временном сокращении исследования (17 ч 2 мин против 41 ч 5 мин, р<0,001). Метод не трудоемкий и требует внесения меньшего количества реагентов, чем в других методиках, так как отделение форменных элементов крови от плазмы и бактерий происходит за счет разделительного геля, находящегося в пробирке. На основании полученных результатов данный метод подготовки гемокультур для идентификации бактерий может быть рекомендован для использования в рутинной практике лабораторий микробиологии с целью сокращения времени представления результата по идентификации микроорганизмов в клинические отделения у больных с инфекцией кровотока.

Способ идентификации бактерий из положительных гемокультур методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии у больных с инфекцией кровотока, включающий пробоподготовку положительной гемокультуры к анализу методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии, отличающийся тем, что пробоподготовку положительной гемокультуры осуществляют путем ее переноса из флакона, предназначенного для культивирования микроорганизмов, в пробирку с разделительным гелем и центрифугируют при 3000 оборотах в течение 10 минут, полученную надосадочную жидкость перемешивают, переносят в микроцентрифужную пробирку и центрифугируют при 3000 оборотах в течение 2 минут, после чего надосадочную жидкость переносят во вторую микроцентрифужную пробирку и центрифугируют при 13000 оборотах в течение 2 минут, удаляют надосадочную жидкость, в осадок добавляют деионизированную воду и перемешивают на вортексе, а далее добавляют 96%-ный этиловый спирт и еще раз перемешивают на вортексе, после чего центрифугируют при 13000 оборотах в течение 2 минут, затем удаляют спирт и центрифугируют при 13000 оборотах в течение 2 минут, а остатки спирта удаляют, оставляя микроцентрифужную пробирку с открытой крышкой до полного испарения спирта, далее проводят экстракцию белкового экстракта муравьиной кислотой и ацетонитрилом, перемешивая смесь на вортексе и центрифугируя при 13000 оборотах в течение 2 минут, полученную надосадочную жидкость наносят на мишень масс-спектрометра, после высыхания покрывают матрицей и проводят идентификацию микроорганизмов методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии у больных с инфекцией кровотока.