Применение конъюгата анти-her2 антитело-лекарственное средство при лечении уротелиальной карциномы

Данное изобретение относится к применению анти-HER2 конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC) для получения лекарственного средства для лечения уротелиальной карциномы. Лекарственное средство является безопасным и эффективным для пациентов с уротелиальной карциномой, особенно местнорастпространенной или метастатической уротелиальной карциномой, и может эффективно продлевать время выживания пациентов. 7 з.п. ф-лы, 8 ил., 6 табл., 6 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к применению конъюгата анти-HER2 (человеческий рецептор фактора роста эпидермиса 2) антитело-лекарственное средство в лечении уротелиальной карциномы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Уротелиальная карцинома (УК; также известная как переходно-клеточная карцинома, ПКК) является типом карциномы, которую обычно находят в мочевыделительной системе, такой как почки, мочевой пузырь и придаточные органы. Она является наиболее частым типом рака из карциномы мочевого пузыря и карциномы мочеточника, мочеиспускательного канала или пупочного протока. Она также является вторым наиболее частым типом карциномы почек, составляющим 5-10% от всех первичных злокачественных опухолей почек.

Уротелий (также называемый переходным эпителием) представляет собой выстилку мочевого пузыря, мочеточника и почечной лоханки (части почки, где собирается моча). Он состоит из уротелиальных клеток или переходных клеток. Эти клетки могут развиваться в раковые клетки, известные как уротелиальная карцинома (или переходно-клеточная карцинома).

В зависимости от инвазивности раковых клеток, уротелиальная карцинома может быть неинвазивной (только в выстилке мочевого пузыря) или инвазивной (растущей в другие слои стенки мочевого пузыря). Среди них неинвазивная уротелиальная карцинома имеется только в эндометрии мочевого пузыря и не прорастает глубже в стенки мочевого пузыря. В момент диагностики, 50%-60% пациентов с уротелиальной карциномой являются неинвазивными. Типы неинвазивной уротелиальной карциномы включают: неинвазивную плоскую уротелиальную карциному (также известную как карцинома in situ); неинвазивную папиллярную уротелиальную карциному, высокозлокачественную; неинвазивную папиллярную уротелиальную карциному, высокодифференцированную опухоль; вероятность неинвазивных папиллярных уротелиальных опухолей с низким потенциалом злокачественности, развивающихся в агрессивный рак, мала.

Наоборот, инвазивная уротелиальная карцинома растет из выстилки мочевого пузыря в более глубокие слои стенки мочевого пузыря, такие как соединительная ткань (известная как собственный слой) и мышечный слой. Во время диагностики опухоли у 40%-50% пациентов с уротелиальной карциномой являются инвазивными.

В теории, уротелиальная карцинома может происходить из любой части мочевыводящих путей, включая, но не ограничиваясь ими, почечную лоханку, мочеточник, мочевой пузырь и мочеиспускательный канал.

До возникновения метастазов из релевантных опухолевых клеток, хирургическая резекция является предпочтительным способом лечения. Для пациентов с опухолями, которые имеют метастазы, обычно требуются противораковые лекарственные средства. Текущая терапия первой линии включает: комбинированную терапию из гемцитабина и цисплатина. Радиационная терапия не является идеальной для уротелиальной карциномы и обычно применяется в качестве адъювантной терапии. При лечении рака в эпителии почечной лоханки/мочеточника, вариантом может быть БЦЖ инъекционная терапия (инъекция Mycobacterium Bovis через катетер).

Уротелиальная карцинома является мультицентровой и склонной к рецидивам. Для пациентов с опухолями, вовлекающими мышечный слой, предпочтительна полная резекция, и после хирургии требуется строгое повторное исследование. Поэтому лечение является трудным, и количество рецидивов высоко. (Li Xuesong, Wang Gang, Zhang Ye, eds. Essence of Urology Cases, Peking University Medical Press, 2017). Введение митомицина (химиотерапевтического агента) в мочевой пузырь в виде одной дозы в ранний послеоперационный период (в течение 24 часов) или в виде шести доз в течение нескольких недель после хирургии также является вариантом для некоторых пациентов. Химиотерапия на основе цисплатина все еще является золотым стандартом для лечения пациентов с метастатической УК. Суммарная эффективность терапии (СЭТ) химиотерапии на основе цисплатина составляет 60-70%, общая выживаемость (ОВ) составляет 14-15 месяцев, и 5-летняя выживаемость составляет 13-15%. Химиотерапию на основе платины проводят у пациентов с рецидивом с СЭТ приблизительно 15% и средней ОВ приблизительно 7 месяцев.

Винфлунин был одобрен в Европе для лечения распространенной мочевой эпителиальной или метастатической ПКК (Bellmunt, J. et al., JClin.Oncol. 27 (27): 4454-4461 (2009)). Несколько агентов было тестировано для монотерапии и они показали среднюю активность, со средней выживаемостью 5-10 месяцев (Yafi, F.A. et al. Current Oncol. 18 (1): e25-e34 (2011)). В случае метастазов, доцетаксел вводят в качестве подменного варианта пациентам с переходно-клеточной карциномой (NCCN 2014), и медицинские сообщества в Соединенных Штатах и Канаде доказали лечение доцетакселом для распространенного заболевания на основе доказательств со 2 фазы исследований (WO2016/064649A1).

В последние годы новые лекарственные средства для лечения уротелиальной карциномы в основном включают: 1. Атезолизумаб от Roche (2016), одобренный как первая анти-PD-L1 раковая иммунотерапия на рынке. Результаты последней фазы III клинического испытания (IMvigor211) Атезолизумаба для локально распространенного или метастатического рака мочеточника и мочевого пузыря показали, что Атезолизумаб не смог достичь первичной клинической конечной точки фазы III испытания IMvigor211, которая заключается в улучшении общей выживаемости (ОВ) в лечении второй линии для пациентов в местно распространенной или метастатической уротелиальной карциномой (мУК). Среди всего 234 пациентов (116 в группе Атезолизумаба и 118 в группе химиотерапии) средняя общая выживаемость составляла 11,1 месяца в группе Атезолизумаба и 10,6 месяца в группе химиотерапии. Частота подтвержденных объективных ответов у этих оцениваемых пациентов составила 23% и 22%, а средняя продолжительность ответа составила 15,9 и 8,3 месяца, соответственно.

Средняя выживаемость без прогрессирования в этой группе составила 2,4 месяца, и 4,2 месяца в контрольной группе. В разведочном анализе популяции с назначенным лечением, 12-месячные данные общей выживаемости составляли: для Атезолизумаба 39,2% и для химиотерапии 32,4%; средняя общая выживаемость составляла 8,3 месяца для Атезолизумаба, 7,5 месяцев для таксана и 9,2 месяца для винфлунина. (The ASCO Post, IMvigor211 Trial: Atezolizumab vs Chemotherapy in Platinum-Treated Advanced Urothelial Carcinoma, Matthew Stenger, 9/17/2018)

Кроме того, Комиссия по контролю данных США установила снижение выживаемости пациентов с PD-L1 низко-экспрессирующими опухолями с применением монотерапии Атезолизумабом по сравнению с химиотерапией на основе платины. Поэтому в июне 2018 в США было принято ограничение по применению Атезолизумаба (Tecentriq) у пациентов с локально распространенным или метастатическим уротелиальным раком, который подходит для цисплатин-содержащей химиотерапии. Требуется определить экспрессию PD-L1 перед применением Атезолизумаба. Это также иллюстрирует ограничения Атезолизумаба при лечении уротелиального рака.

2. Ниволумаб от Bristol-Myers Squibb (2017) был одобрен FDA для пациентов с локально распространенной или метастатической уротелиальной карциномой. Ниволумаб является анти-PD-1 моноклональным антителом. Клинические данные показали, что эффективность терапии Ниволумабом (СЭТ) составляет 19,6% и средняя выживаемость составляет 8,7 месяца. Наиболее частые серьезные побочные эффекты включают: инфекцию мочевыводящих путей, сепсис, диарею, непроходимость тонкой кишки и ухудшение общего состояния здоровья. Лечение Ниволумабом было прекращено у 17% пациентов из-за побочных реакций, и введение Ниволумаба у 46% пациентов было отложено из-за побочных реакций. В клинической практике связанные с лечение смерти были зафиксированы у 3 пациентов из-за пневмонии или сердечнососудистой недостаточности.

На основе вышесказанного, основной проблемой PD-L1/PD-1 иммунотерапевтических лекарственных средств на текущей клинической стадии является плохая эффективность лечения, которая в основном отражена в данных лечения, таких как средняя эффективность терапии (СЭТ) и средняя общая выживаемость, и не является идеальной. Другой основной проблемой является относительно высокая доля серьезных побочных эффектов. Например, Ниволумаб вызвал 3 смерти в соответствующих клинических испытаниях.

3. Эрдафитиниб от Janssen (Johnson & Johnson company) был предоставленной прорывной квалификацией лекарственного средства от FDA в 2018 для лечения пациентов с местно распространенным или метастатическим уротеалиальным раком, который развился после химиотерапии, и где опухоль имеет специфические изменения в гене фактора роста фибробластов (FGFR). Лекарственное средство является ингибитором рецептора фактора роста фибробластов (FGFR) тирозинкиназы. Результаты второй фазы клинического исследования (BLC2001, NCT02365597) показали, что суммарная эффективность терапии эрдафитинибом составляет 40% (процент пациентов с полным ответом 3%, процент пациентов с частичным ответом 37%), средняя выживаемость без прогрессирования составляла 5,5 месяцев и общее время выживания составляло 13,8 месяца. Из всего 99 пациентов, 7 пациентов прервали лечения из-за связанных с лечение побочных эффектов. Данные из https://www.jnj.com/media-center/press-releases/erdafitinib-phase-2-study-results-show-promise-in-the-treatment-of-metastatic-urothelial-cancer. Так как терапевтической целью этого лекарственного средства является FGFR, оно подходит только для пациентов с уротелиальным раком, которые имеют определенные мутации гена FGFR, хотя FGFR сверхэкспрессируется только в 15%-20% случаев метастатического уротелиального рака, и 40%-70% не мышечного инвазивного рака мочевого пузыря (2018 ASCO Annual Meeting, Responses Found in Advanced Urothelial Carcinoma with FGFR Inhibitor).

Текущие результаты лечения показали, что распространенная уротелиальная карцинома имеет высокую степень злокачественности и плохой прогноз. Особенно после неудачной обычной химиотерапии, варианты лечения ограничены. Иммунотерапия может быть полезна только для некоторых пациентов. Более того, количество доступных иммунотерапевтических ингибиторов также очень ограничено, суммарная эффективность терапии не высока, побочные эффекты лечения значительны, или существуют специфические генетические требования. В настоящее время существует немного терапевтических лекарственных средств, которые могут быть выбраны пациентами. Поэтому все еще существует необходимость в разработке лекарственных средств с более значительными терапевтическими эффектами и более широким применением для удовлетворения неотложных клинических потребностей.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном описании представлен способ лечения уротелиальной карциномы. Способ включает инъекцию эффективного количества конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC) пациенту, где ADC является конъюгированная с анти-HER2 антителом цитотоксическая молекула. Цитотоксическая молекула включает, но не ограничена ими, тубулиновый ингибитор или ДНК повреждающий агент. Тубулиновый ингибитор включает, но не ограничен ими, доластатин и его производные, ауристатин и его производные, и майтанзин и его производные; ДНК повреждающие агенты включают, но не ограничены ими, калихеамицины, дуокармицины, антрамицин производный ПБД (пирролобензодиазепин) и производное камптотецина SN-38. Ауристатин и его производные включают, но не ограничены ими, монометилауристатин E (MMAE), монометилауристатин F (MMAF), ауристатин F (AF) или их производные; майтанзин и его производные включают, но не ограничены ими, DM1, DM3, DM4 и их производные (Research progress of bullet molecules of antibody-drug conjugates, Hu Xinyueet al., ChinMedBiotechnol, December 2017, Vol. 12, No. 6) (Research progress of maytansinoid antibody drug conjugates, Zhou Lei et al., Chinese Journal of New Drugs, Volume 25, Issue 22, 2521 -2530). Цитотоксическими молекулами также могут быть аманитины, антрациклины, баккатины, камптотецины, цемадотины, колхицины, колцимиды, комбретастатины, криптофицины, дискодермолиды, доцетаксел, доксорубицин, эхиномицины, элеутеробины, эпотилоны, эстрамустины, лекситропсины, майтанзины, метотрексат, нетропсины, пиромицины, ризоксины, таксаны, тубулизины или алкалоиды барвинка. Цитотоксические молекулы не ограничены указанными выше категориями и могут включать все лекарственные средства, которые могут применяться для ADC.

Другой аспект данного описания включает получение конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC) для применения в производстве медикамента для лечения рака мочевого пузыря. Конъюгат антитело-лекарственное средство содержит антитело или его функциональный фрагмент, способный связываться с HER2, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, и где (i) вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR, где CDR имеют последовательности аминокислот SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно; и (ii) вариабельная область легкой цепи содержит три CDR, где CDR имеют последовательности аминокислот SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно. Антителом также может быть антитело, способное конкурировать с определенным антителом против одинакового или подобного эпитопа, где определенное антитело содержит указанные выше CDR.

В данном описании термин "антитело" может включать полноразмерное антитело или фрагмент антитела, которое связывается с, реагирует с или объединяется с HER2. Антителом может быть любой белок, белкоподобная молекула или полипептид, который связывается, объединяется или взаимодействует с частью популяции клеток, ищущих терапевтической модификации. Антителом может быть химерное антитело или его функционально активный фрагмент, гуманизированное антитело или его функционально активный фрагмент, человеческое антитело или его функционально активный фрагмент. Им также может быть антитело или его функционально активный фрагмент производных из других видов, отличных от указанных выше видов, например: мышиное антитело или его функционально активный фрагмент, крысиное антитело или его функционально активный фрагмент, козье антитело или его функционально активный фрагмент, кроличье антитело или его функционально активный фрагмент. Антителом может быть поликлональное антитело или моноклональное антитело. В некоторых вариантах, антителом может быть биспецифическое антитело. Также антителом может быть функционально активный фрагмент, производное или аналог антитела."Функционально/функциональное" означает, что фрагменты, производные или аналоги могут распознавать одинаковый антиген, и антитела, которые могут распознавать фрагменты, производные или аналоги, полученные из антигена, такие как, но не ограниченные ими: F (ab')₂, Fab, Fab', Fv фрагменты и димеры тяжелых цепей и легких цепей антитела, или любые их минимальные фрагменты, такие как Fv или одноцепочнчные антитела (ОЦА). Кроме того, антителом может быть слитый белок антитела. Антитела также могут включать аналоги и производные, которые модифицированы или не модифицированы (т.е. ковалентно связаны с любой молекулой), пока такое ковалентное связывание позволяет антителу сохранять его антиген-связывающую иммуноспецифичность. Примеры включают, но не ограничены ими, аналоги и производные антител, включая дополнительные модификации, такие как: гликозилирование, ацетилирование, пэгилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию через известные защитные/блокирующие группы, отщепление протеазы, присоединение клеточным единицам антитела или другим белкам, и подобные. Любые объемные химические модификации могут быть достигнуты с применением известных методик, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое отщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез в присутствии туникамицина, и подобные. Кроме того, аналоги или производные могут включать одну или более из ненатуральных аминокислот. В некоторых вариантах, антитело может иметь модификации (например, замещения, делеции или добавления) в аминокислотных остатках, которые взаимодействуют с Fc рецептором. В другом аспекте, конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную формулой Ab-(L-U)n, где Ab является антителом или его функциональным фрагментом, L является линкером, U является сопряженной цитотоксической молекулой, n является целым числом от 1 до 8, представляющим количество молекул терапевтического агента, связанных с антителом.

В другом аспекте линкер связан с антителом или его функциональным фрагментом через тиольную группу и/или аминогруппу, и цитотоксическая молекула конъюгирована с антителом через сайт-направленное или ненаправленное конъюгирование. Линкер в соответствии с данным изобретением может быть выбран из следующей таблицы:

Аббревиатура	Полное наименование	Характеристика
mc	Малеимидокапроил	Не отщепляемый[12]
mc-vc-pAB	Малеимидокапроил валин цитруллин п-аминобензил	Отщепляемый [12]
3-MPA	3-малеимидопропионовая кислота	Не отщепляемый[12]
Mal-di-EG-OPFP	Перфторфенил 3-(2-(2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)этокси)этокси)пропаноат	Не отщепляемый[14]
Mal-di-EG-ОВu	2,5-диоксопирролидин-1-ил 3-(2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этокси)этокси)пропаноат	Не отщепляемый[14]
Mal-Tri-EG-ОВu	2,5-диоксопирролидин-1-ил 3-(2-(2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этокси)этокси)этокси)пропаноат	Не отщепляемый[14]
Mal-Tetra-EG-ОВu	2,5-диоксопирролидин-1-ил 1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-оксо-7,10,13,16-тетраокса-4-азанонадекан-19-оат	Не отщепляемый[14]
Br-di-EG-ОВu	2,5-диоксопирролидин-1-ил 3-(2-(2-(2-бромацетамидо)этокси)этокси)пропаноат	Не отщепляемый[14]
Py-ds-prp-ОВu	2,5-диоксопирролидин-1-ил 3-(пиридин-2-илдисульфанил)пропаноат	Сократимый [14]
Py-ds-Prp-OPFP	Перфторфенил 3-(пиридин-2-илдисульфанил)пропаноат	Сократимый [14]
Py-ds-dmBut-ОВu	2,5-диоксопирролидин-1-ил 4-метил-4-(пиридин-2-илдисульфанил)пентаноат	Сократимый [14]
Py-ds-dmBut-OPF	Перфторфенил 4-метил-4-(пиридин-2-илдисульфанил)пентаноат	Сократимый [14]
SMCC	N-сукцинимидил 4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилат	Не отщепляемый[13]
MBS	3-малеимидобензойной кислоты N-гидроксисукцинимидовый эфир	Не отщепляемый[13]
SATA	S-(N-сукцинимидил)тиоацетат	Не отщепляемый[13]
SPDP	N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат	Сократимый [13]
SMPT	(N-сукцинимидилкарбонил)-1-метил-1-(2-пиридилтио)толуол	Сократимый [13]

Линкером в соответствии с данным изобретением предпочтительно является Малеимидо-Капроил-Валин-Цитруллин-п-аминобензилокси (mc-vc-pAB) и Малеимидокапроил (mc).

Линкером в соответствии с данным изобретением также может быть риглицилпептидный линкер, который является новым линкером для ADC, разработанным недавно (Rajeeva Singh et al., A New Triglycyl Peptide Linker for Antibody-Drug Conjugates (ADCs) with Improved Targeted Killing of Cancer Cells, MCT-16-002, Published June 2016). Альтернативно, может применяться глюкуронид-тубулизиновый линкер (Patrick J. Burke et al., Glucuronide-linked antibody-tubulysin conjugates display activity in MDR⁺ and heterogeneous tumor models, Molecular Cancer Therapeutics, 2018).

В другом аспекте антитело или его функциональный фрагмент получают из антитела, секретированного гибридомой, внесенной в China General Microbiological Culture Collection Center of China Committee for Culture Collection of Microorganisms, с номером образца CGMCC № 8102, 22 августа 2013.

В другом аспекте, антителом является гуманизированное антитело, предпочтительно, антителом является антитело, секретированное клетками CHO, внесенными в China Center for Type Culture Collection, с номером образца CCTCC C2013170, 6 ноября 2013.

В одном варианте, применяемый конъюгат антитело-лекарственное средство назван RC48-mc-vc-pAB-MMAE, что соответствует структуре общей формулы Ab-(L-U)n, в которой RC48 (гуманизированное анти-HER2 моноклональное антитело) сопряжено с MMAE через линкер mc-vc-pAB, и количество сопряжений варьируется от 1 до 8, включая 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, или сочетанию конъюгатов антитело-лекарственное средство с варьирующимися количествами сопряжений с MMAE от 1 до 8.

В данном описании уротелиальной карциномой является распространенная уротелиальная карцинома, которая не может быть удалена хирургией, местно распространенная или метастатическая уротелиальная карцинома, HER2 (человеческого фактора роста эпидермиса рецептор 2, также называемый ErbB-2, C-erbB2 или HER2/neu) положительная уротелиальная карцинома, HER2 положительная местно распространенная или метастатическая уротелиальная карцинома.

Лекарственное средство, описанное в данном описании, может вводиться интраназально, подкожно, чрезкожно, внутримышечно или внутривенно. Лекарственное средство также включает фармацевтически приемлемый носитель; лекарственное средство предпочтительно является лиофилизированным составом или жидким составом; носитель включает один или более, выбранный из группы, состоящей из стабилизатора, защитного агента, буфера, лиопротектора, агента, защищающего активность, поверхностно-активного вещества и адсорбирующего носителя и промотора абсорбции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: SDS-PAGE очищенного человеческого рекомбинантного белка HER2-ECD, окрашенного кумасси бриллиантовым синим. Загрузка составляет 10 мкг на трек.

Фигура 2: SDS-PAGE анализ cRC48 (химерного антитела) и RC48 (гуманизированного антитела). Загрузка составляет 2 мкг на трек.

На фигуре 3 показано сродство связывания гуманизированного антитела RC48 с HER2-ECD, определенное ELISA, и рассчитана константа сродства связывания Kd. Герцептин и cRC48 применяют в качестве контроля в этом эксперименте.

На фигуре 4A показана способность к связыванию анти-HER2 гуманизированного антитела RC48 с HER2⁺ клетками SK-BR3, BT474 и HER2^- клетками MDA-MB468 проточной цитометрией.

На фигуре 4B показана способность к связыванию анти-HER2 антител с антигенами поверхности клеток BT474 при различной концентрации антитела проточной цитометрией. Анти-HER2 антителами являются Герцептин, cRC48 и RC48. Всего анализировали 5 Ч 10⁴ клеток.

На фигуре 5 показано, что только RC48 показывает специфическое сродство связывания с HER2, но не с EGFR, HER3 и HER4.

На фигуре 6 представлена схематическая диаграмма эффективности субъекта № 01001. Профиль пациента: женщина, возраст 57 лет, с множественными метастазами в легкие после хирургической резекции правой лоханки. Патологический диагноз уротелиальная карцинома, HER2 ИГХ 3+.

На фигуре 7 представлена схематическая диаграмма эффективности субъекта № 01003. Профиль пациента: женщина, возраст 45 лет, метастазы в абдоминальный лимфатический узел после хирургической резекции правой почечной лоханки. Патологический диагноз уротелиальная карцинома, HER2 ИГХ 3+.

На фигуре 8 представлена схематическая диаграмма эффективности субъекта № 01007. Профиль пациента: мужчина, возраст 63 года, после раза мочевого пузыря и хирургической резекции правой лоханки, метастазы в легких, метастазы в печени, метастазы в цервикальный лимфатический узел, метастазы в средостение, множественные метастазы в кости. Патологический диагноз уротелиальная карцинома, HER2 ИГХ 3+.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Пример 1. Получение и анализ последовательности мышиного моноклонального антитела mRC48

1. Экспрессия и очистка HER2 антигена

Фрагмент кДНК, кодирующий HER2-ECD (от Thr23 до Thr652, GenBank № образца M11730) клонируют в вектор экспрессии пкДНК3 (Invitrogen) с помощью ПЦР.

Подробный способ: кДНК кодирующей области HER2-ECD получают из HER2⁺ колонии клеток SKBR3 (ATCC No. HTB-30) с помощью ОТ-ПЦР (применяя систему обратной транскрипции ImProm-IITM от Promega).

Праймерами являются P1: 5'CGGGATCCTGCCACCAGCTGTGCGCC (SEQ ID NO: 7), P2: 5 'GCTCTAGA TCAGTTGATGGGGCAAGGCT (SEQ ID NO: 8), подчеркнутыми последовательностями являются введенные BamHI и XbaI сайты разрезания рестриктазы, соответственно. HER2-ECD кДНК, полученную обратной транскрипцией, применяют в качестве шаблона для ПЦР амплификации с применением указанных выше праймеров. Условия амплификации: денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 60°C в течение 30 с, расширение при 72°C в течение 1 минуты, всего 30 циклов, и затем расширение при 72°C в течение 10 минут. ПЦР фрагмент затем восстанавливают, переваривают с BamHI и XbaI (от NEB) и лигируют с пкДНК3 вектором. Полигистидиновую метку добавляют к С-концу HER2-ECD для способствования очистке. Клетки HEK293 (ATCC, USA) трансфицируют сконструированным вектором экспрессии ДНК, и растворимый белок HER2-ECD с his-меткой очищают из культуральной среды Ni-NTA аффинной хроматографией (Qiagen). SDS-PAGE и окрашивание кумасси бриллиантовым синим показало, что очищенный HER2-ECD белок имеет более 95% гомогенности, как показано на фигуре 1. Растворимый HER2-ECD появляется как мономер с относительной молекулярной массой около 75 кДа, слегка больше, чем рассчитанная молекулярная масса (71 кДа), показывая, что белок был гликозилирован в клетках HEK293. Очищенный HER2-ECD белок затем концентрируют и переносят в стерильный pH 7,4 ФРФБ буфер для последующего in vivo и in vitro анализа.

2. Создание и скрининг клеток гибридомы

Мышей иммунизируют HER2-ECD, полученным выше, в качестве антигена с получением антител. Иммунизацию, гибридизацию клеток гибридомы и предварительный скрининг проводят согласно стандартным методам (ссылка: WHO Technical Report Series, No. 822, 1992 Annex 3). 0,25 мкл белка HER2-ECD (50-100 мкг) и 0,25 мл полного адъюванта Фрейнда (Difco Lab) смешивают в равном объеме и применяют для иммунизации 4Balb/c мышей (купленных у Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd). Вторую инъекцию делают через 2 недели. Неполный адъювант Фрейнда (Difco Lab) и антиген с количеством 25-50 мкг/0,5 мл/на мышь применяют для второй инъекции. Через 3 недели делают третью инъекцию в той же дозе, как и вторая инъекция. Кровь берут через 10 дней после третьей инъекции. Сыворотку мышей анализируют фермент-связанным иммуносорбентным исследованием (ELISA). Клетки из селезенок двух мышей с наиболее высокими титрами анти-HER2 антитела берут и затем гибридизируют с клетками миеломы P3X63Ag8 (ATCC, CRL-1580). Гибридизированные клетки разводят в 96-луночном планшете и проводят предварительный скрининг с помощью ELISA по способности к связыванию с HER2-ECD. В типовом ELISA, 96-луночный планшет NuncMaxisorb покрывают HER2-ECD (0,2-1 мкг/мл) и затеем инкубируют с градиентным разведением мышиной сывороткой или надосадочной жидкостью гибридомы (100 мкл). Мышиное анти-HER2 антитело определяют с применением конъюгированного с пероксидазой хрена козьего F(ab')₂ анти-мышиного IgG Fc (Invitrogen) вторичного антитела.

ELISA применяют для скрининга надосадочных жидкостей 400 колоний клеток гибридомы, из которых 36 показали сильное связывание с HER2-ECD. Десять клеток гибридомы с сильнейшей HER2 связывающей способностью выбирают, и субклонированные колонии клеток гибридомы снова подвергают скринингу методом серийных разведений. Субклонированные колонии клеток гибридомы культивируют в суспензии, белки очищают, и сродство связывания с HER2 определяют ELISA. Способность к связыванию указанных выше антител с HER2, экспрессированным на поверхности колонии клеток рака молочной железы человека далее тестируют проточной цитометрией (BD FACS Calibur) (см. пример 4 для подробного описания). Наконец, колонию клеток гибридомы mRC48 (мышиного IgG1k) идентифицируют через анализ последовательности, которая имеет сильную HER2 связывающую емкость. Клетки гибридомы mRC48 вносят с номером образца № 8102 в China General Microbiological Culture Collection Center of China Committee for Culture Collection of Microorganisms 22 августа 2013 (дата перехода на депозит согласно Будапештскому соглашению 29 октября 2013).

3. Анализ последовательности анти-HER2 антитела из клона клеток гибридомы mRC48

5' концы вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи клона mRC48 быстро амплифицируют с применением коммерческого набора для амплификации кДНК SMART™ RACE (Clontech) для секвенирования согласно инструкциям.

Полную РНК экстрагируют из клеток гибридомы с помощью RNApure Tissue Kit (Beijing ComWin Biotech Co.,Ltd) и проводят обратную транскрипцию с применением набора для амплификации кДНК SMART™ RACE. Первую цепь кДНК для RACE-Ready получают обратной транскрипцией согласно протоколу, поставляемому с набором, применяя полную РНК в качестве шаблона, праймеры, поставляемые с набором и обратную транскриптазу SMARTScribe™ Reverse Transcriptase. И затем проводят два раунда ПЦР. Для первого раунда ПЦР полученная кДНК являлась шаблоном, UPM, поставляемый с набором, применяют в качестве 5' конечного праймера, и mRC48-VL-1/mRC48-VH-1 в качестве 3' конечного праймера. Условия реакции ПЦР: пре-денатурация при 94°C в течение 5 минут; 25 циклов (денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 68°C в течение 30 с и расширение при 72°C в течение 2 минут); и расширение при 72°C в течение 10 минут.

Второй раунд ПЦР проводят с применением продуктов первого раунда ПЦР в качестве шаблона, NUP15, поставляемый с набором, в качестве 5' конечного праймера и mRC48-VL-2/mRC48-VH-2 в качестве 3' конечного праймера. Условия реакции ПЦР: пре-денатурация при 94°C в течение 5 минут; 25 циклов (денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 68°C в течение 30 с и расширение при 72°C в течение 2 минут); расширение при 72°C в течение 10 минут. Получают обе вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи указанного выше антитела из клона клеток гибридомы mRC48.

Праймеры были следующими:

mRC48-VL-1: 5'-GTTGGTGCAGCATCAGCCCGTT-3' (SEQ ID NO: 9);

mRC48-VL-2: 5'-GTTCACTGCCATCAATCTTCCAC-3'(SEQ ID NO: 10);

mRC48-VH-1: 5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3'(SEQ ID NO: 11);

mRC48-VH-2: 5'-AGGTCACTGTCACTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 12).

Продукты ПЦР очищают электрофорезом в агарозном геле и затем субклонируют в pCR2.1TOPO вектор клонирования (Invitrogen). ДНК плазмида из десяти независимых клонов получают ПЦР и затем секвенируют с применением M13 прямого и обратного праймеров. Анализ последовательности ДНК показал, что все 10 клонов имеют кДНК, кодирующие одинаковый VH или VL полипептид. Последовательности аминокислот областей, определяющих комплементарность (CDR) анализируют с применением таблицы кодирования и перечисляют в таблице 1. Сравнительный анализ последовательности показал, что CDR анти-HER2 mRC48 значительно отличались от CDR известных HER2 антител, включая Герцептин (трастузумаб).

Таблица 1. Последовательности аминокислот CDR анти-HER2 моноклонального антитела mRC48

	VH	VL
CDR1	DYYIH (SEQ ID NO: 1)	KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 4)
CDR2	RVNPDHGDSYYNQKFKD (SEQ ID NO: 2)	WASIRHT (SEQ ID NO: 5)
CDR3	ARNYLFDHW (SEQ ID NO: 3)	HQFATYT (SEQ ID NO: 6)

Пример 2. Гуманизация анти-HER2 моноклонального антитела mRC48 (способ, описанный в CN105008398A)

Мышиное анти-HER2 моноклональное антитело mRC48 гуманизируют трансплантацией CDR легкой цепи или тяжелой цепи в человеческие IgG1к каркасные области.

Вариабельную область легкой цепи гуманизированного RC48 антитела (RC48-VL) и вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного RC48 антитела (RC48-VH) были созданы и составили гуманизированное анти-HER2 антитело: RC48. Сходство между всей последовательностью RC48-VH и человеческим IgG1VH составляет 84%. RC48 антитело содержит вариабельную область легкой цепи RC48-VL и вариабельную область тяжелой цепи RC48-VH.

Гуманизированное анти-HER2 моноклональное антитело RC48 получают трансплантацией CDR. Последовательности нуклеиновых кислот вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи прямо синтезированы Nanjing GenScript Biotech Corporation. Синтетическая вариабельная область содержит консенсусную последовательность Козака, инициирующий кодон, сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи, человеческую каркасную область и мышиные CDR. Вариабельные области и человеческую IgG1k константную область лигируют в полный фрагмент ПЦР с перекрывающимися праймерами.

Праймеры для ПЦР с перекрывающимися праймерами:

Тяжелая цепь VH1: 5’CGCGGATCC GCCGCCACCATGGGATGGAGCT3′ (SEQ ID NO: 13)

VH2: 5’GATGGGCCCTTGGTGCTAGCGGAGCTCACTGTCACCAGTGTT3’ (SEQ ID NO: 14)

CH1: 5’ GCTAGCACCAAGGGCCCATC 3’ (SEQ ID NO: 15)

CH2: 5’ CCGGAATTCTTTACCGGGAGACAGGGAGA 3’ (SEQ ID NO: 16)

Легкая цепь VL1: 5’ CGCGGATCC GCCGCCACCATGGACATGAGGGT 3’ (SEQ ID NO: 17)

VL2: 5’ GATGGTGCAGCCACAGTACGCTTTATCTCAACTTTTG TAC3’ (SEQ ID NO: 18)

CL1: 5’ CGTACTGTGGCTGCACCAT 3’ (SEQ ID NO: 19)

CL2: 5’ CCGGAATTCACACTCTCCCCTGTTGAAGC 3’ (SEQ ID NO: 20)

Для создания нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, сначала, вариабельную область тяжелой цепи амплифицируют с применением синтетической вариабельной области в качестве шаблона и VH1 и VH2 в качестве праймеров, вместе с тем, постоянную область тяжелой цепи человеческого IgG1к используют в качестве шаблона и CH1 и CH2 в качестве праймеров для амплификации постоянной области тяжелой цепи. Условия амплификации: денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 60°C в течение 30 с, расширение при 72°C в течение 1 минуты, 30 циклов, и расширение при 72°C в течение 10 минут. Затем последовательность тяжелой цепи RC48 амплифицируют с применением полученных выше двух продуктов ПЦР в качестве шаблона, и VH1 и CH2 в качестве праймеров. Условия амплификации: денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 60°C в течение 30 с, расширение при 72°C в течение 2 минут, 30 циклов, и расширение при 72°C в течение 10 минут.

Для создания нуклеиновой кислоты легкой цепи, сначала, вариабельную область легкой цепи амплифицируют с применением синтетической переменной области в качестве шаблона и VL1 и VL2 в качестве праймеров, вместе с тем, постоянную область легкой цепи человеческого IgG1к применяют в качестве шаблона и CL1 и CL2 в качестве праймеров для амплификации постоянной области легкой цепи. Условия амплификации: денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 60°C в течение 30 с, расширение при 72°C в течение 1 минуты, 30 циклов, и расширение при 72°C в течение 10 минут. Затем последовательность легкой цепи RC48 амплифицируют с применением полученных выше двух продуктов ПЦР в качестве шаблона, и VL1 и CL2 в качестве праймеров. Условия амплификации: денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 60°C в течение 30 с, расширение при 72°C в течение 2 минут, 30 циклов, и расширение при 72°C в течение 10 минут.

Таким образом получают последовательность гуманизированного анти-HER2 моноклонального антитела RC48, где RC48 содержит постоянную область тяжелой цепи человеческого IgG1к и вариабельную область тяжелой цепи RC48-VH, и постоянную область легкой цепи человеческого IgG1к и вариабельную область легкой цепи RC48- VL.

Человеческое-мышиное химерное антитело cRC48 также получают тем же способом. Мышиную вариабельную область и постоянную область человеческого IgG1k лигируют в полную последовательность ПЦР с перекрывающимися праймерами.

Каждый из амплифицированных фрагментов субклонируют в вектор экспрессии pкДНК3.0, соответственно. Полученные конструкты трансфицируют в суспензию клеток CHO (Invitrogen) для получения различных рекомбинантных антител. Антитела очищают белком A и подвергают последующей характеризации. Химерные анти-HER2 RC48 (названные cRC48) содержат мышиную-человеческую химерную тяжелую цепь и легкую цепь. RC48 содержит гуманизированную тяжелую цепь RC48-VH и гуманизированную легкую цепь RC48-VL. Оба cRC48 и RC48 могут экспрессироваться в клетках. Антитела собирают из надосадочных жидкостей клеток CHO, очищают Белком A и анализируют SDS-PAGE в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях (см. фигуру 2). Клетки CHO, способные секретировать RC48 антитело как описано выше (т.е. клетки CHO, трансфицированные постоянной областью тяжелой цепи человеческого IgG1к и вариабельной областью тяжелой цепи RC48-VH, и постоянной областью легкой цепи человеческого IgG1к и вариабельной областью легкой цепи RC48-VL) вносят в China Center for Type Culture Collection 6 ноября 2013 с номером образца C2013170.

Пример 3. Характеризация Анти-HER2 RC48 Антитела

Константу сродства связывания HER2 (Kd) для cRC48 (химерного антитела) и RC48 антитела (гуманизированного антитела) измеряют ELISA. Конкретный способ описан в примере 1. Коротко, 96-луночный планшет покрывают растворимым HER2-ECD, затем инкубируют с разведенными антителами (Герцептин и химерное cRC48 в качестве контроля), и HRP-конъюгированное козье F(ab')₂ анти-человеческое IgGFc (Invitrogen) применяют в качестве специфического вторичного антитела для определения HER2-ECD-родственных антител (всех форм человеческого IgG1к). Значение константы сродства поверхностного связывания (Kd) для каждого анти-HER2 антитела рассчитывают построением кривой связывания с последующим использованием нелинейного уравнения моносайтового специфического связывания (Journal of Immunological Methods, 270: 155-162, 2002) (на фигуре 3 показана типовая кривая связывания HER2, полученная из трех независимых исследований ELISA). Результаты ELISA показаны на фигуре 3.

Из трех независимых исследований можно видеть, что RC48 (гуманизированное антитело) показывает среднюю константу сродства 44 пМ, показывая значительно улучшенное сродство связывания HER2-ECD по сравнению с cRC48 (средняя константа сродства 77 пМ) и Герцептином (средняя константа сродства 97 пМ). Результаты показаны в таблице 2.

Таблица 2. Сравнение средней константы сродства между антителами в соответствии с данным изобретением и Герцептином

Образец	Средняя константа сродства
Герцептин	97 пМ
cRC48	77 пМ
RC48	44 пМ

Пример 4. Сродство связывания RC48 (гуманизированного антитела) с HER2

1) Тестирование сродства связывания RC48 антитела с HER2

Проточную цитометрию применяют для определения сродства связывания эндогенно экспрессированного HER2 в клетках рака молочной железы человека с гуманизированным анти-HER2 антителом RC48. Результаты показаны на фигуре 3. 6 мкг человеческого IgG (в качестве контрольной группы), Герцептин, cRC48 и RC48 соответственно инкубируют с двумя типами клеток рака молочной железы: SK-BR-3 и BT4745 по отдельности, а также клетками HER2^-MDA-MB468 (2 Ч 10⁷ клеток) на льду в течение 30-45 минут. После тщательного промывания 4 мл холодного ФРФБ дважды, антитела, связанные с поверхностью клеток, определяют R-PE-конъюгированным козьим анти-человеческим IgG Fc (15 мкл, 25 мкг/мл) вторичным антителом и затем анализируют на проточном цитометре (BDFACSCalibur). Человеческий IgG1 в контрольной группе не показывает связывание с указанными выше тремя типами раковых клеток. Наоборот, Герцептин, cRC48 и RC48 сильно связываются с двумя типами HER2-положительных клеток, но не с HER2-отрицательными клетками, показывая, что это связывание является HER2-специфическим (см. фигуру 4a). Сравнением средней интенсивности флуоресценции в одной и той же группе, было обнаружено, что RC48 показало более высокое сродство связывания, чем Герцептин и cRC48. Титрованием концентрации анти-HER2 антитела и количества клеток, анализированных проточной цитометрией, получают кривую связывания клеточного анти-HER2 антитела с поверхностью клеток HER2. Результаты показаны на фигуре 4b. Гуманизированное анти-HER2 антитело RC48 показало очевидное сродство связывания с HER2, из которого Kd сродства связывания с HER2 на поверхности клеток BT474 составляет 4 нМ, а Герцептин и cRC48 показали 10 нМ и 5 нМ, соответственно. Результаты показаны в таблице 3:

Образец	Kd сродства связывания
Герцептин	10 нМ
cRC48	5 нМ
RC48	4 нМ

2) тестирование специфичности связывания антигена

ELISA применяют для определения способности связывания Герцептина, cRC48, RC48 с различными поверхностными антигенами: EGFR, HER2, HER3, HER4. ELISA проводят как описано в примере 1. 96-луночный планшет покрывают EGFR, HER2, HER3 или HER4, 20 нг для каждой лунки, инкубируют с разными анти-HER2 антителами, т.е. Герцептином, cRC48 и RC48, и затем определяют с применением HRP-конъюгированного козьего F (ab’)₂ анти-мышиного IgG-Fc вторичного антитела (Invitrogen). Результаты показаны в таблице 5. Показано, что Герцептин, cRC48 и RC48 практически не имеют связывающей емкости для EGFR, HER3 и HER4, но имеют сильную связывающую емкость для HER2, демонстрируя, что Герцептин и RC48 имеют высокую специфичность связывания для HER2.

Пример 5. Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство

1) Очистка моноклонального антитела RC48

Моноклональное антитело RC48 собирают из надосадочной жидкости клеточной культуры CHO с применением Белка A. Антитело подвергают SDS-PAGE электрофорезу и ГПХ анализом, и чистота составляет более 95%. Полученное антитело диализируют с ФРФБ буфером в 30 КД предельным мембранным мешком и концентрируют. Концентрацию антитела калибруют с применением устройства для измерения УФ абсорбции для последующего конъюгирования.

2) Конъюгирование моноклонального антитела RC48 с лекарственным средством

Восстанавливающий агент и защитный агент соответственно готовят с ФРФБ буфером следующим образом: исходный раствор 1-20 ммоль/л TCEP (трис-2-карбоксиэтилфосфина), 1-20 ммоль/л DTPA (диэтилентриаминпентауксусной кислоты). Восстанавливающий агент добавляют в определенном интервале концентрации согласно желаемому коэффициенту связывания, смешивают с определенной концентрацией моноклональных антител (например: 5-30 мг/мл) согласно определенному объемному отношению (например, 1:1), так, что конечное молярное отношение TCEP к антителу составляет 0,5-6,0:1, и перемешивают при 25°C в течение 2 ч. Концентрацию свободных тиольных групп определяют способом DTNB при 412 нм, и количество свободных тиольных групп рассчитывают через молярное отношение с антителом. Восстановление TCEP имеет хорошую воспроизводимость, и количество свободных тиольных групп может достигать 1,0-8,0 после восстановления.

Антитела могут быть непосредственно подвергнуты конъюгированию после восстановления TCEP. Определенную концентрацию (10 мМ) лекарственного средства (vc-MMAE, vc-MMAF или mc-MMAF) (купленного у Shanghai HaoYuan Chemical Technology Co., Ltd.) готовят в 25% ДМСО (диметилсульфоксиде). Лекарственное средство добавляют медленно к раствору антитела согласно молярному отношению лекарственных средств к тиольной группе 0,3-2,8:1 и перемешивают для взаимодействия при 25°C в течение 2 ч. Способ DTNB применяют для определения концентрации свободной тиольной группы (близкой к 0) при 412 нм. Оставшиеся непрореагировавшие лекарственные средства удаляют Sephadex G-25 и свободными маленькими молекулами, такими как ДМСО. SDS-PAGE, Р-ВЭЖХ и ГИХ-ВЭЖХ применяют для определения конъюгирования.

Пример 6. Сродство связывания конъюгатов Антитело-Лекарственное средство

Тестирование сродства связывания по ELISA

Планшет ELISA покрывают рекомбинантным белком HER2-ECD (концентрация: 0,5 мг/мл) и инкубируют в течение ночи при 2°C-8°C. После промывания планшета промывкой для планшетов 3 раза добавляют 3% БСА-ФСБТ раствор для блокирования при 37°C в течение 2 ч, и затем планшет промывают промывкой для планшетов 3 раза. Загрузка образца: стандарт, начиная с 1000 нг/мл, разводят ФСБТ буфером с получением 11 точек разведения, 100 мкл/лунку, инкубируют при 37°C в течение 2 ч. Планшет промывают промывкой для планшетов 3 раза. Вторичное антитело (козье анти-человеческое IgG-Fc-HRP) разводят 5000-кратно ФСБТ буфером. Добавляют ТМБ раствор для проведения реакции и инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 8-10 минут. Реакцию останавливают 2M H₂SO₄, и микропланшетный ридер применяют для считывания при 450/655 нм. Результаты показаны в таблице 4.

Таблица 4. Сравнение сродства связывания конъюгатов антитело-лекарственное средство (VC короткая для mc-vc-pAB) и T-DM1

Образец	Сродство связывания нг/мл	Мольный эквивалент
RC48-VC-MMAE	2,237	15,22
RC48-VC-MMAF	3,349	13,51
RC48-MC-MMAF	2,902	16,42
T-DM1	2,376	15,16

Как показано в результатах, RC48-VC-MMAE (т.е. RC48-mc-vc-pAB-MMAE), RC48-VC-MMAF и RC48-MC-MMAF имеют сродство связывания с HER2-ECD, эквивалентое T-DM1.

Пример 7. Тестирование эффективности и безопасности монотерапии HER2-положительной местнорастпространенной или метастатической уротелиальной карциномы

Целью этого эксперимента является оценка эффективности и безопасности монотерапии HER2-положительной местнорастпространенной или метастатической уротелиальной карциномы. Конъюгатом антитело-лекарственное средство для тестирования является RC48-mc-vc-pAB-MMAE. RC48 сочетают с MMAE через линкер mc-vc-pAB, и количество сопряженных лекарственных средств варьируется от 1 до 8.

Критерии выбора для субъектов следующие:

Возраст: от 18 лет (минимальный возраст) до 80 лет (максимальный возраст);

где критериями выбора являются:

1. Субъекты согласны участвовать в исследовании и подписали информированное согласие;

2. Мужчины или женщины в возрасте 18-60 лет;

3. Ожидаемое время выживания составляет 12 недель или более;

4. Местнорастпространенная или метастатическая уротелиальная карцинома мочевого пузыря, которая не может быть полностью удалена хирургическим вмешательством на основе патологического диагноза;

5. Субъекты, которым диагностирована местрораспространенная или метастатическая карцинома, которая не может быть удалена хирургией, и все еще происходит развитие болезни или возникла резистентность после получения, по крайней мере, системной химиотерапии первой линии;

6. По крайней мере, имеют измеримые очаги, определенные стандартом RECIST 1.1;

7. Положительная HER2 экспрессия подтверждена в тестирующей лаборатории;

8. Физический статус по ВООГ 0 или 1;

9. Удовлетворительное функционирование сердца, костного мозга, печени и почек;

10. Женщины должны быть хирургически стерилизованы или находится в постменопаузе, или согласны использовать, по крайней мере, один из одобренных медициной контрацептивов (таких как внутриматочная спираль, контрацептивные пилюли или презервативы) в течение периода лечения и в течение 6 месяцев после лечения; мужчины должны быть согласны использовать, по крайней мере, один из одобренных медициной контрацептивов (таких как презервативы, воздержание и т.д.) в течение периода лечения и в течение 6 месяцев после лечения;

11. Имеют намерение и возможность следовать процедурам исследования и отслеживания.

В то же время, критериями исключения являются:

1. Известная аллергическая реакция на конъюгат рекомбинантное гуманизированное анти-HER2 моноклональное антитело-MMAE и его компоненты;

2. Получает другое противоопухолевое лечение в течение 4 недель до лечения;

3.Ранее получал конъюгат рекомбинантное гуманизированное анти-HER2 моноклональное антитело-MMAE;

4. Имел значительное хирургическое вмешательство в течение 4 недель до начала введения и не полностью восстановился;

5. Получал живую вакцину в течение 4 недель до введения или планирует получить какую-либо вакцину во время периода лечения;

6. Имеет другие тяжелые и неконтролируемые сопутствующие заболевания, которые могут влиять на совместимость с протоколом или вмешиваться в интерпретацию результатов;

7. Имел другие злокачественные опухоли в течение 5 лет до начала введения;

8. Страдает метастатическим в ЦНС и/или злокачественным менингитом;

9. Имеет активное аутоиммунное заболевание, которое требует системного лечения в последние 2 года;

10. Ранее получил аллогенный трансплантат гемопоэтических стволовых клеток или трансплантат солидного органа;

11. Имеет большое количество плевральной жидкости или асцит с клиническими симптомами или требующий симптоматического лечения;

12. Беременная или кормящая женщина;

13. Положительный результат тестирования на ВИЧ;

14. Пациенты с активным гепатитом B или C;

15. Активный туберкулез в анамнезе;

16. Страдает любым другим заболеванием, аномальным метаболизмом, имеет аномальные результаты физического обследования или аномальные лабораторные тесты, где, в соответствии с суждением исследователя, резонно подозревать, что субъект имеет определенное заболевание или состояние, неподходящее для применения исследуемого лекарственного средства, или влияющее на интерпретацию результатов исследования, или подвержен высокой степени риска;

17. Кто, по оценкам, может в достаточной степени соблюдать это клиническое исследование.

Методы эксперимента:

Это исследование включает субъектов с местнораспространенной или метастатической уротелиальной карциномой, у которых ранее была неэффективной или вызвала резистентность, по крайней мере, системная химиотерапия первой линии, и которые имеют измеримые очаги поражения, приемлемое физическое состояние и функционирование органов. Патологические срезы опухолевой ткани субъектов подвергают лабораторному тестированию на подтверждение экспрессии HER2, и положительный результат обозначают оценкой 2+ или 3+ иммуногистохимического (ИГХ) анализа (независимо от результатов определения флуоресценции гибридизации in situ [FISH]).

Результаты определения HER2 в иммуногистохимии (ИГХ) были согласно критериям для интерпретации HER2 в "Guideline for HER2 detection in breast cancer (2014 Edition, China)". Подробности показаны в таблице 5.

Таблица 5. Критерии интерпретации HER2 в "Guideline for HER2 detection in breast cancer (2014 Edition, China)".

Критерии оценки	Результаты ИГХ	Уровень экспрессии активированной HER2
Отсутствие окрашивания мембран клетки или ≤10% инвазивных раковых клеток показывают неполное, слабое окрашивание мембраны клетки.	0	отрицательная
>10% инвазивных раковых клеток показывают слабое и неполное окрашивание мембраны клетки.	1+	отрицательная
>10% инвазивных раковых клеток показывают неполное и/или от слабого до умеренного окрашивание мембраны клетки или ≤10% инвазивных раковых клеток показывают сильное и не поврежденное окрашивание мембраны клетки.	2+	положительная
>10% инвазивных раковых клеток показывают сильное, полное и однородное окрашивание мембраны клетки.	3+	положительная

Субъекты, соответствующие всем критериям, получают лечение RC48-ADC (2,0 мг/кг, внутривенное вливание, один раз каждые 2 недели), и эффективность оценивают каждые 6 недель пока болезнь не начнет прогрессировать, не появится непереносимая токсичность или субъект не выйдет из исследования. Первичным ожидаемым результатом исследования является объективно оцененная суммарная эффективность терапии (СЭТ). Вторичные ожидаемые результаты включают выживание при прогрессировании, общее выживание и безопасность лечения.

Результаты исследования:

Исследование начинают в декабре 2017. По состоянию на 31 июля 2018, всего 18 субъектов получали лечение, включая 15 мужчин и 3 женщин, со средним возрастом 63 года. Первичные очаги поражения включают мочевой пузырь (50,0%), почечную лоханку (27,8%) и мочеточник (22,2%). Основные места метастазирования включали легкие, печень и лимфатические узлы. 16 пациентов (88,9%) ранее получали платиновую терапию первой линии. Иммуногистохимические (ИГХ) результаты для экспрессии HER2 (проведенные в лаборатории) показали, что имеется 11 (61,1%) ИГХ2+ субъектов и 7 (38,9%) ИГХ3+ субъектов.

Оценку эффективности проводят для 13 из 18 субъектов, и 10 субъектов имели частичную ремиссию (ЧР) (где 4 субъекта имели подтвержденную ЧР (две последовательные ЧР называют подтвержденной ЧР)). Согласно стандарту RECIST: "если каждый субъект отвечает критерию для частичной или полной ремиссии и эффективность подтверждается снова в более поздний момент времени (обычно через четыре недели), то может быть установлена полная или частичная ремиссия”. То есть две последовательные оценки ЧР для субъекта называют подтвержденной ЧР. Другие 6 случаев еще не достигли временной точки для подтверждения эффективности, и только одно подтверждение было завершено. Суммарная эффективность терапии (СЭТ) составляет 76,9% (10/13), и частота контроля заболевания (ЧКЗ) (10 случаев из 13 подвергнутых оценке эффективности были с ЧР и 2 случая были стабильным заболеванием (СЗ)) составляет 92,3% (12/13). Текущий максимальный период лечения, получаемого субъектами, составлял более 7 месяцев. Среди субъектов, достигших ремиссии, 7 (53,8%) получали лечение таксаном и 4 (30,8%) получали лечение PD-1/PD-L1.

16 из 18 субъектов были субъектами для оценки безопасности. Наиболее частыми связанными с лечением нежелательными реакциями (СЛНР) при оценке безопасности были повышенная ALT (50,0%, степень 1-2), гипестезия (50,0%, степень 1-2) и пониженное количество лейкоцитов (50,0%, степень 1-2); СЛНР больше 3 степени является снижением количества нейтрофилов (12,5%, степень 3). Никаких связанных с лекарственным средством серьезных нежелательных явлений (СНЯ) не возникло.

Описания суммарного эффекта лечения в некоторых случаях показаны следующим образом:

1. Пациент 01001: женщина, возраст 57 лет, с множественными метастазами в легкие после хирургической резекции правой лоханки. Патологический диагноз уротелиальная карцинома, HER2 ИГХ 3+.

Согласно фигуре 6, через 12 недель лечения очаги опухоли в нижней доле правого легкого были уменьшены с 54 Ч 31 мм (6 недель лечения) до 37 Ч 23 мм (12 недель лечения), снижение на 49%.

2. Пациент 01003：женщина, возраст 45 лет, метастазы в абдоминальный лимфатический узел после хирургической резекции правой почечной лоханки. Патологический диагноз уротелиальная карцинома, HER2 ИГХ 3+.

Согласно фигуре 7, через 6 недель лечения очаг опухоли, расположенный около правой поясничной мышцы, был уменьшен с 56 Ч 48 мм до 33 Ч 22мм, снижение на 72,9%.

3. Пациент 01007: мужчина, возраст 63 года, после раза мочевого пузыря и хирургической резекции правой лоханки, метастазы в легких, метастазы в печени, метастазы в цервикальный лимфатический узел, метастазы в средостение, множественные метастазы в кости. Патологический диагноз уротелиальная карцинома, HER2 ИГХ 3+.

Согласно фигуре 8, можно увидеть, что через 6 недель лечения очаги опухоли, расположенные в левой верхней доле, метастазы в печени и средостенные лимфатические углы были значительно снижены. Опухоль, расположенная в левой верхней доле была уменьшена с 45 Ч 36 мм до 28Ч22 мм, снижение на 61,9%; опухоль в месте метастазов в печень была уменьшена с 38Ч32 мм до 25Ч21 мм, снижение на 56,8%; и опухоль в средостенных лимфатических узлах была уменьшена с 29Ч15 мм до 18Ч7 мм, снижение на 71,03%.

Представленные выше клинические данные и визуальные патологические изменения показали, что конъюгат анти-HER2 моноклонального антитела-MMAE в соответствии с данным изобретением обладает очень значительным терапевтическим действием. Это также можно увидеть через сравнение с продаваемыми на рынке лекарственными средствами, что конъюгат в соответствии с данным изобретением значительно лучше, чем подобные современные лекарственные средства, одобренные Европейским Союзом и Соединенными Штатами. Например, Атезолизумаб (Roche) имеет СЭТ только 23% на фазе III клинических данных, и Ниволумаб (Bristol-Myers Squibb) едва 19,6%. Эрдафитиниб (Jansen) нацелен только на пациентов с уротелиальным раком с определенными мутациями гена FGFR. Наоборот, СЭТ конъюгата рекомбинантного гуманизированного анти-HER2 моноклонального антитела-MMAE в соответствии с данным изобретением составляет 76,9%, и частота контроля заболевания (ЧКЗ) составляет 92,3%, что значительно лучше, чем подобные лекарственные средства, присутствующие на рынке, и побочные эффекты также значительно меньшие, чем у подобных лекарственных средств, без каких-либо серьезных побочных эффектов (СПЭ). Это делает его более доступным для пациентов, предоставляя другой вариант для пациентов с уротелиальным раком, нуждающихся в лечении. Можно увидеть, что конъюгат анти-HER2 антитела в соответствии с данным изобретением обладает превосходными перспективами применения при лечении уротелиальной карциномы, могут эффективно улучшать, или даже обращать процесс развития заболевания у пациентов, и достигает неожиданных технических эффектов.

1. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC) при получении лекарственного средства для лечения уротелиальной карциномы, где конъюгатом антитело-лекарственное средство является анти-HER2 антитело или его функциональный фрагмент, сопряженное с цитотоксической молекулой,

где конъюгат антитело-лекарственное средство представлен формулой Ab-(LU)n, где Ab представляет собой антитело или его функциональный фрагмент, L представляет собой линкер, U представляет собой конъюгированную цитотоксическую молекулу и n представляет собой целое число от 1 до 8, представляющее количество молекул терапевтического агента, связанных с антителом,

где антитело или его функциональный фрагмент способны конкурировать с определенным антителом против того же эпитопа,

где указанное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, определенную последовательностями области, определяющей комплементарность (CDR), и где

(i) вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR, при этом аминокислотные последовательности CDR представлены соответственно в SEQ ID NO: 1, 2 и 3; и

(ii) вариабельная область легкой цепи содержит три CDR, при этом аминокислотные последовательности CDR представлены соответственно в SEQ ID NO: 4, 5 и 6; и

где L представляет собой валин цитруллин п-аминобензил (mc-vc-pAB) и

U представляет собой MMAE.

2. Применение по п.1, где антитело или его функциональный фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где

(i) вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR, где последовательности аминокислот CDR соответственно представлены далее в SEQ ID NO: 1, 2 и 3; и

(ii) вариабельная область легкой цепи содержит три CDR, где последовательности аминокислот CDR соответственно представлены в SEQ ID NO: 4, 5 и 6.

3. Применение по п.1 или 2, где антитело или его функциональный фрагмент является мышиным, химерным или гуманизированным.

4. Применение по любому из представленных выше пунктов, где антитело или его функциональный фрагмент получают из антитела, секретированного гибридомой, внесенной в China General Microbiological Culture Collection Center of China Committee for Culture Collection of Microorganisms 22 августа 2013 г., с номером образца CGMCC № 8102.

5. Применение по любому из представленных выше пунктов, где антителом является гуманизированное антитело, предпочтительно антитело секретируется клетками CHO, внесенными в China Center for Type Culture Collection 6 ноября 2013 г. с номером образца CCTCC C2013170.

6. Применение по любому из представленных выше пунктов, где уротелиальную карциному выбирают из группы, состоящей из местнораспространенной уротелиальной карциномы, которая не может быть удалена хирургически, местнораспространенной или метастатической уротелиальной карциномы, HER2-положительной уротелиальной карциномы и HER2-положительной местнораспространенной или метастатической уротелиальной карциномы.

7. Применение по любому из представленных выше пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель; лекарственное средство предпочтительно представляет собой лиофилизированный состав или жидкий состав; носитель является одним или несколькими, выбранными из группы, состоящей из стабилизатора, защитного агента, буфера, лиопротектора, защитного агента активности, поверхностно-активного вещества, адсорбционного носителя и промотора абсорбции.

8. Применение по любому из представленных выше пунктов, где лекарственное средство может вводиться интраназально, подкожно, внутрикожно, внутримышечно или внутривенно.