Способ изготовления жидкого культурального продукта

Изобретение относится к медицине и биотехнологии. Предложен способ изготовления жидкого культурального продукта с использованием стволовых клеток, полученных из спинномозговой жидкости. Способ включает выделение промежуточного слоя из костномозговой жидкости, разделенной на слои, его культивирование вместе с культуральной жидкостью; прикрепление первых стволовых клеток к нижней поверхности первого культурального контейнера, сбор первых стволовых клеток из первого культурального контейнера; сбор расположенных в нижнем слое первых стволовых клеток, разделенных на слои, вторых стволовых клеток, их культивирование, включающее прикрепление к нижней поверхности второго культурального контейнера; затем выделение из второго культурального контейнера жидкого культурального продукта. Изобретение обеспечивает получение предопределенного метаболита, секретируемого единственным типом растущих стволовых клеток, для лечения предопределенных заболеваний или для косметического применения. 12 з.п. ф-лы, 19 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу изготовления культурального продукта, которым производят жидкий культуральный продукт с использованием стволовой клетки, полученной из костно-мозговой жидкости, которая была собрана у донора.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ранее описан аппарат для культивирования стволовых клеток, включающий резервуар для культивирования, культуральную жидкость, заполняющую резервуар для культивирования, и подложку с различием поверхности подложки по высоте и покрытую материалом для адгезии стволовых клеток, в которой присутствует множество более низких частей, обеспечивающих различие по высоте на поверхности подложки (см. Патентный документ 1). Аппарат для культивирования стволовых клеток выполнен с возможностью плавания подложки в культуральной жидкости и пролиферации стволовой клетки, которая прикреплена к поверхности подложки при помощи материала для адгезии стволовых клеток в диспергированном состоянии без отслаивания от поверхности подложки.

ДОКУМЕНТЫ ПО ИЗВЕСТНОМУ УРОВНЮ ТЕХНИКИ

ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ

Патентный документ 1: JP-A-2014-183770

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ЗАДАЧА, ПОДЛЕЖАЩАЯ РЕШЕНИЮ ПОСРЕДСТВОМ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В аппарате для культивирования стволовых клеток, описанном в патентном документе 1, культуральная жидкость, содержащая культивируемые стволовые клетки, удаляется как отходы. Культуральную жидкость, содержащую культивируемые стволовые клетки, которая содержит метаболиты, секретируемые этими стволовыми клетками, можно использовать для лечения заболеваний и в косметических целях. Однако, поскольку различные типы стволовых клеток присутствуют в ткани или в ее клетках, собранных у донора, культивирование таких стволовых клеток приводит к их собственной пролиферации, и в культуральной жидкости содержатся в результате различные типы метаболитов, секретируемые из этих стволовых клеток, что таким образом препятствует успешному производству жидкого культурального продукта только с определенным эффектом при каждом лечении заболевания или косметическом применении.

Целью настоящего изобретения является создание способа изготовления жидкого культурального продукта, которым возможно производить жидкий культуральный продукт, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый из единственного типа стволовой клетки, и оказывает только определенный эффект при каждом лечении заболевания или косметическом применении.

СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ ЗАДАЧИ

Для решения этих проблем настоящее изобретение предлагает способ изготовления жидкого культурального продукта, с помощью которого производят жидкий культуральный продукт с использованием стволовой клетки, полученной из костно-мозговой жидкости, которая была собрана у донора.

Способ изготовления жидкого культурального продукта в соответствии с настоящим изобретением включает: разделение костно-мозговой жидкости для разделения на слои костно-мозговой жидкости, собранной у донора; выделение костно-мозговой жидкости для выделения костно-мозговой жидкости промежуточного слоя, расположенной в промежуточном слое костно-мозговой жидкости, разделенной на слои на этапе разделения костно-мозговой жидкости; первое прикрепление стволовой клетки для заполнения костно-мозговой жидкостью из промежуточного слоя, выделенной на этапе выделения костно-мозговой жидкости, и предопределенной культуральной жидкостью первого культурального контейнера с предопределенной емкостью и предопределенной площадью нижней поверхности, оставления первого культурального контейнера в статическом состоянии на предопределенный период времени, и прикрепления первой стволовой клетки, содержащейся в костно-мозговой жидкости промежуточного слоя, к нижней поверхности первого культурального контейнера; первое культивирование стволовой клетки для удаления культуральной жидкости из первого культурального контейнера после прикрепления первой стволовой клетки к нижней поверхности первого культурального контейнера на этапе первого прикрепления стволовой клетки, заполнения новой культуральной жидкостью первого культурального контейнера, оставления первого культурального контейнера в статическом состоянии на предопределенный период времени, и культивирования первой стволовой клетки до тех пока общая площадь первой стволовой клетки не достигнет первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности первого культурального контейнера; первый сбор стволовой клетки для сбора первой стволовой клетки из первого культурального контейнера, когда общая площадь первой стволовой клетки достигнет первого целевого соотношения в процессе культивирования первой стволовой клетки на этапе первого культивирования стволовой клетки; выделение стволовой клетки для разделения на слои путем центрифугирования первой стволовой клетки, собранной на этапе первого сбора стволовой клетки; второй сбор стволовой клетки для сбора второй стволовой клетки, расположенной в самом нижнем слое первой стволовой клетки, разделенной на слои на этапе разделения стволовой клетки; второе прикрепление стволовой клетки для заполнения второй стволовой клеткой, собранной на этапе второго сбора стволовой клетки, и предопределенной культуральной жидкостью второго культурального контейнера с большей емкостью и большей площадью нижней поверхности, чем у первого культурального контейнера, оставления второго культурального контейнера в статическом состоянии на предопределенный период времени, и прикрепления второй стволовой клетки к нижней поверхности второго культурального контейнера; второе культивирование стволовой клетки для удаления культуральной жидкости из второго культурального контейнера после прикрепления второй стволовой клетки к нижней поверхности второго культурального контейнера на этапе второго прикрепления стволовой клетки, заполнения новой культуральной жидкостью второго культурального контейнера, оставления второго культурального контейнера в статическом состоянии на предопределенный период времени и культивирования второй стволовой клетки до тех пока общая площадь второй стволовой клетки не достигнет второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности второго культурального контейнера; и первое выделение жидкого культурального продукта для выделения из второго культурального контейнера жидкого культурального продукта, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый из единственного типа пролиферирующей второй стволовой клетки, когда общая площадь второй стволовой клетки достигает второго целевого соотношения в процессе культивирования на этапе второго культивирования стволовой клетки.

В качестве одного из примеров способа изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению, на этапах первого прикрепления стволовой клетки и первого культивирования стволовой клетки, первый культуральный контейнер может находиться в статическом состоянии под предопределенным углом наклона в течение предопределенного периода времени, и на этапах второго прикрепления стволовой клетки и второго культивирования стволовой клетки, второй культуральный контейнер может находиться в статическом состоянии под предопределенным углом наклона в течение предопределенного периода времени.

В качестве другого примера способа изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению, способ изготовления жидкого культурального продукта включает: второй сбор стволовой клетки для сбора второй стволовой клетки из второго культурального контейнера после выделения жидкого культурального продукта из второго культурального контейнера на этапе первого выделения жидкого культурального продукта; третье прикрепление стволовой клетки для заполнения второй стволовой клеткой, собранной при втором сборе стволовой клетки, и новой культуральной жидкостью третьего культурального контейнера с предопределенной емкостью и предопределенной площадью нижней поверхности, где емкость и площадь нижней поверхности больше, чем у второго культурального контейнера, оставления третьего культурального контейнера в статическом состоянии на предопределенный период времени и прикрепления второй стволовой клетки к нижней поверхности третьего культурального контейнера; третье культивирование стволовой клетки для удаления культуральной жидкости из третьего культурального контейнера после прикрепления второй стволовой клетки к нижней поверхности третьего культурального контейнера на этапе третьего прикрепления стволовой клетки, заполнения новой культуральной жидкостью третьего культурального контейнера, оставления третьего культурального контейнера в статическом состоянии на предопределенный период времени и культивирования второй стволовой клетки до тех пор, пока общая площадь второй стволовой клетки не достигнет третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности третьего культурального контейнера; и второе выделение жидкого культурального продукта для выделения из третьего культурального контейнера жидкого культурального продукта, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый из единственного типа пролиферирующей второй стволовой клетки, когда общая площадь второй стволовой клетки достигает третьего целевого соотношения в процессе культивирования на этапе третьего культивирования стволовой клетки.

В качестве другого примера способа изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению, на этапах третьего прикрепления стволовой клетки и третьего культивирования стволовой клетки третий культуральный контейнер может находиться в статическом состоянии под предопределенным углом наклона в течение предопределенного периода времени.

В качестве другого примера способа изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению, на этапе разделения костно-мозговой жидкости, у донора забирают от 2 до 3 см³ костно-мозговой жидкости, от 2 до 3 см³ костно-мозговой жидкости помещают в вертикально удлиняющийся контейнер для разделения, контейнер для разделения оставляют в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на предопределенный период времени, и костно-мозговая жидкость вертикально разделяется на слои в контейнере для разделения, и на этапе выделения костно-мозговой жидкости выделяют костно-мозговую жидкость промежуточного слоя, расположенную в промежуточном слое костно-мозговой жидкости, разделенной на слои в контейнере для разделения.

В качестве другого примера способа изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению, емкость первого культурального контейнера составляет приблизительно от 20 до 30 см³, исходная форма поверхности первой стволовой клетки приблизительно является круглой формой, и форма поверхности деформированной первой стволовой клетки является приблизительно, в основном, круглой формой, и плоской формой, когда первая стволовая клетка удлиняется в аморфной форме в одном направлении, и на этапе первого прикрепления стволовой клетки, первый культуральный контейнер может оставаться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 12 до 24 часов, деформацию первой стволовой клетки от исходной формы поверхности в первом культуральном контейнере наблюдают в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 12 до 24 часов, и, когда первая стволовая клетка деформируется из начальной формы поверхности в аморфную плоскую форму, определяют, что первая стволовая клетка прикрепилась к нижней поверхности первого культурального контейнера.

В качестве другого примера способа изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению, на этапе первого сбора стволовой клетки, первый культуральный контейнер может оставаться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 36 до 48 часов, и общую площадь первой стволовой клетки, прикрепленной к нижней поверхности первого культурального контейнера по отношению к площади нижней поверхности первого культурального контейнера наблюдают в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 36 до 48 часов.

В качестве другого примера способа изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению, первое целевое соотношение общей площади первой стволовой клетки составляет от 70 до 80% от площади нижней поверхности первого культурального контейнера.

В качестве другого примера способа изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению, на этапе разделения стволовой клетки, первую стволовую клетку загружают в контейнер для разделения, контейнер для разделения помещают в центрифужный сепаратор для разделения путем центрифугирования первой стволовой клетки, и на этапе первого сбора стволовой клетки собирают вторую стволовую клетку, расположенную в самом нижнем слое первой стволовой клетки, разделенной путем центрифугирования на слои в контейнере для разделения.

В качестве другого примера способа изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению, емкость второго культурального контейнера составляет приблизительно от 40 до 60 см³, емкость третьего культурального контейнера составляет приблизительно от 70 до 80 см³, исходная форма поверхности второй стволовой клетки приблизительно является круглой формой, и форма поверхности деформированной второй стволовой клетки является приблизительно, в основном, круглой формой, и плоской формой, когда вторая стволовая клетка удлиняется в аморфной форме в одном направлении, и на этапах второго прикрепления стволовой клетки и третьего прикрепления стволовой клетки второй и третий культуральные контейнеры могут оставаться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 36 до 48 часов, деформацию второй стволовой клетки от исходной формы поверхности во втором и третьем культуральных контейнерах наблюдают в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 36 до 48 часов, и когда вторая стволовая клетка деформируется из начальной формы поверхности в аморфную плоскую форму, определяют, что вторая стволовая клетка прикрепилась к нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров.

В качестве другого примера способа изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению, на этапах второго сбора стволовой клетки и третьего сбора стволовой клетки, второй и третий культуральные контейнеры могут находиться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 36 до 48 часов, общую площадь второй стволовой клетки, прикрепленной к нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров по отношению к площади нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров наблюдают в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 36 до 48 часов.

В качестве другого примера способа изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению, второе целевое соотношение общей площади второй стволовой клетки составляет от 88 до 92% от площади нижней поверхности второго культурального контейнера, и третье целевое соотношение общей площади третьей стволовой клетки составляет от 88 до 92% от площади нижней поверхности третьего культурального контейнера.

В качестве другого примера способа изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению, первая и вторая стволовые клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки.

ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению предназначен для выделения костно-мозговой жидкость промежуточного слоя, расположенной в промежуточном слое костно-мозговой жидкости, разделенной на слои, культивирования костно-мозговой жидкости промежуточного слоя вместе с культуральной жидкостью, прикрепления первой стволовой клетки к нижней поверхности первого культурального контейнера, сбора первой стволовой клетки из первого культурального контейнера, когда общая площадь первой стволовой клетки достигает первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности первого культурального контейнера с одновременным культивированием первой стволовой клетки, сбора второй стволовой клетки, расположенной в самом нижнем слое первой стволовой клетки, разделенной на слои, культивирования второй стволовой клетки вместе с культуральной жидкостью, прикрепления второй стволовой клетки к нижней поверхности второго культурального контейнера, подачи новой культуральной жидкости во второй культуральный контейнер, культивирования второй стволовой клетки, и выделения из второго культурального контейнера жидкого культурального продукта, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый из единственного типа пролиферирующей второй стволовой клетки, когда общая площадь второй стволовой клетки достигает второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности второго культурального контейнера в процессе культивирования второй стволовой клетки, таким образом, с использованием единственного типа культивируемой второй стволовой клетки присутствуют не различные типы метаболитов, секретируемых различными типами стволовых клеток, а только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом второй стволовой клетки, и можно производить жидкий культуральный продукт, способный обеспечивать только специфический эффект на предопределенные заболевания и предопределенные косметические применения, такие как уход за кожей, уход за волосами и уход за телом, можно производить жидкий культуральный продукт, который можно эффективно использовать для лечения предопределенных заболеваний, и можно производить жидкий культуральный продукт, который можно эффективно использовать для предопределенных косметических применений. Способом изготовления жидкого культурального продукта можно производить жидкий культуральный продукт с использованием чистой (очищенной) второй стволовой клетки, полученной путем удаления ненужной стволовой клетки, что позволяет жидкому культуральному продукту содержать только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом второй стволовой клетки, таким образом, обеспечивая достоверный эффект лечения предопределенных заболеваний и производя жидкий культуральный продукт, эффективный для лечения таких заболеваний, и делая возможным производство жидкого культурального продукта с достоверным эффектом на предопределенные косметические применения.

Способом изготовления жидкого культурального продукта, который позволяет первому культуральному контейнеру статически находиться под предопределенным углом наклона в течение предопределенного периода времени на этапах первого прикрепления стволовой клетки и первого культивирования стволовой клетки, и позволяет второму культуральному контейнеру статически находиться под предопределенным углом наклона в течение предопределенного периода времени на этапах второго прикрепления стволовой клетки и второго культивирования стволовой клетки, можно несомненно прикреплять первую стволовую клетку к нижней поверхности первого культурального контейнера и несомненно поддерживать пролиферацию первой стволовой клетки, позволяя первому культуральному контейнеру статически находиться под предопределенным углом наклона в течение предопределенного периода времени на этапах первого прикрепления стволовой клетки и первого культивирования стволовой клетки. С помощью способа изготовления жидкого культурального продукта можно несомненно прикреплять вторую стволовую клетку к нижней поверхности второго культурального контейнера и несомненно поддерживать пролиферацию второй стволовой клетки, позволяя второму культуральному контейнеру статически находиться под предопределенным углом наклона в течение предопределенного периода времени на этапах второго прикрепления стволовой клетки и второго культивирования стволовой клетки.

Способом изготовления жидкого культурального продукта, при котором собирают вторую стволовую клетку из второго культурального контейнера после выделения жидкого культурального продукта из второго культурального контейнера, культивируют вторую стволовую клетку вместе с культуральной жидкостью, прикрепляют вторую стволовую клетку к нижней поверхности третьего культурального контейнера с большей емкостью и площадью нижней поверхности, чем у второго культурального контейнера, заполняют новой культуральной жидкостью третий культуральный контейнер, культивируют вторую стволовую клетку, и выделяют из третьего культурального контейнера жидкий культуральный продукт, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый из единственного типа пролиферирующей второй стволовой клетки, когда общая площадь второй стволовой клетки достигает третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности третьего культурального контейнера в процессе культивирования второй стволовой клетки, далее культивируют вторую стволовую клетку в третьем культуральном контейнере, выделяют из третьего культурального контейнера жидкий культуральный продукт, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый из единственного типа пролиферирующей второй стволовой клетки, когда общая площадь второй стволовой клетки достигает третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности третьего культурального контейнера в процессе культивирования второй стволовой клетки, таким образом, в процессе культивирования стволовой клетки не культивируются различные типы стволовых клеток, присутствуют не различные типы метаболитов, секретируемых различными типами стволовых клеток, а только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом второй стволовой клетки, и можно производить жидкий культуральный продукт, обеспечивающий только специфический эффект на предопределенное заболевание и предопределенные косметические применения, можно производить жидкий культуральный продукт, который можно эффективно использовать для лечения предопределенных заболеваний, и можно производить жидкий культуральный продукт, который можно эффективно использовать для предопределенных косметических применений. Способом изготовления жидкого культурального продукта можно производить большое количество жидкого культурального продукта одновременно с использованием третьего культурального контейнера с большей емкостью, чем у второго культурального контейнера.

Способом изготовления жидкого культурального продукта, который позволяет третьему культуральному контейнеру статически находиться под предопределенным углом наклона в течение предопределенного периода времени на этапах третьего прикрепления стволовой клетки и третьего культивирования стволовой клетки, можно несомненно прикреплять вторую стволовую клетку к нижней поверхности третьего культурального контейнера и несомненно поддерживать пролиферацию второй стволовой клетки, позволяя третьему культуральному контейнеру статически находиться под предопределенным углом наклона в течение предопределенного периода времени на этапах третьего прикрепления стволовой клетки и третьего культивирования стволовой клетки.

Способ изготовления жидкого культурального продукта, при котором собирают от 2 до 3 см³ костно-мозговой жидкости у донора путем разделения костно-мозговой жидкости, помещают от 2 до 3 см³ костно-мозговой жидкости в вертикально удлиняющийся контейнер для разделения, оставляют контейнер для разделения в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на предопределенный период времени, вертикально разделяют костно-мозговую жидкость на слои в контейнере для разделения, и на этапе выделения костно-мозговой жидкости выделяют костно-мозговую жидкость промежуточного слоя, расположенную в промежуточном слое костно-мозговой жидкости, разделенной на слои в контейнере для разделения, позволяет костно-мозговой жидкости, содержащей различные типы стволовых клеток, оставаться в статическом состоянии приблизительно при температуре, равной температуре тела, на предопределенный период времени для вертикального разделения на слои, тем самым гарантируя выделение конкретной костно-мозговой жидкости промежуточного слоя из костно-мозговой жидкости и культивирование одного типа второй стволовой клетки из костно-мозговой жидкости промежуточного слоя, таким образом, можно производить жидкий культуральный продукт, который содержит только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом стволовой клетки, полученной путем удаления ненужной стволовой клетки, и оказывающий только специфический эффект на предопределенные заболевания и предопределенные косметические применения, можно производить жидкий культуральный продукт, эффективно использоваться для лечения предопределенных заболеваний, и можно производить жидкий культуральный продукт, способный эффективно использоваться для предопределенных косметических применений.

Способ изготовления жидкого культурального продукта, в котором емкость первого культурального контейнера составляет приблизительно от 20 до 30 см³, исходная форма поверхности первой стволовой клетки приблизительно является круглой формой, и форма поверхности деформированной первой стволовой клетки является приблизительно, в основном, круглой формой, и плоской формой, когда первая стволовая клетка удлиняется в аморфной форме в одном направлении, и на этапе первого прикрепления стволовой клетки, первый культуральный контейнер может оставаться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 12 до 24 часов, деформацию первой стволовой клетки от исходной формы поверхности в первом культуральном контейнере наблюдают в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 12 до 24 часов, и когда первая стволовая клетка деформируется из начальной формы поверхности в аморфную плоскую форму, определяют, что первая стволовая клетка прикрепилась к нижней поверхности первого культурального контейнера, первая стволовая клетка не прикрепляется к нижней поверхности первого культурального контейнера, когда емкость первого культурального контейнера превышает 30 см³ и пролиферация первой стволовой клетки замедляется, но первая стволовая клетка сразу и легко прикрепляется к нижней поверхности первого культурального контейнера при использовании первого культурального контейнера с указанной емкостью, предназначен для получения единственного типа стволовой клетки в течение короткого периода времени за счет быстрой пролиферации первой стволовой клетки в первом культуральном контейнере, и им можно производить за короткий период времени большое количество жидкого культурального продукта, который содержит только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом стволовой клетки, полученного путем удаления ненужной стволовой клетки. Способ изготовления жидкого культурального продукта позволяет первому культуральному контейнеру оставаться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 12 до 24 часов, и предназначен для наблюдения за деформацией первой стволовой клетки сначала от начальной формы поверхности в культуральном контейнере интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 12 до 24 часов, и для определения того, что первая стволовая клетка прикрепилась к нижней поверхности первого культурального контейнера, когда первая стволовая клетка деформируется для обеспечения приблизительно, в основном, круглой формы, и плоской формы, когда первая стволовая клетка удлиняется в аморфной форме в одном направлении, таким образом, невозможно пропустить подтверждение прикрепления первой стволовой клетки к нижней поверхности первого культурального контейнера, и должным образом подтверждают прикрепление первой стволовой клетки к нижней поверхности первого культурального контейнера в соответствии с изменениями формы поверхности первой стволовой клетки, удаляют культуральную жидкость из первого культурального контейнера после подтверждения прикрепления первой стволовой клетки к нижней поверхности первого культурального контейнера, заполняют новой культуральной жидкостью первый культуральный контейнер для несомненного стимулирования пролиферации первой стволовой клетки, и с использованием первой стволовой клетки можно однозначно производить жидкий культуральный продукт, который содержит только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом стволовой клетки.

Способом изготовления жидкого культурального продукта, который позволяет первому культуральному контейнеру оставаться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 36 до 48 часов на этапе первого сбора стволовой клетки, наблюдают общую площадь первой стволовой клетки, прикрепленной к нижней поверхности первого культурального контейнера по отношению к площади нижней поверхности первого культурального контейнера в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 36 до 48 часов, и можно надлежащим образом подтверждать общую площадь первой стволовой клетки по отношению к площади нижней поверхности первого культурального контейнера путем наблюдения общей площади в интервале приблизительно от 1 до 2 часов, можно уверенно подтверждать, что общая площадь первой стволовой клетки достигает первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности первого культурального контейнера, поддерживать активность первой стволовой клетки без нарушения своевременного сбора первой стволовой клетки из первого культурального контейнера, собирать первую стволовую клетку из первого культурального контейнера, и с использованием первой стволовой клетки можно однозначно производить жидкий культуральный продукт, содержащий только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом стволовой клетки.

Способом изготовления жидкого культурального продукта, в котором первое целевое соотношение общей площади первой стволовой клетки составляет от 70 до 80% от площади нижней поверхности первого культурального контейнера, постепенно снижают активность первой стволовой клетки, когда общая площадь первой стволовой клетки по отношению к площади нижней поверхности первого культурального контейнера превышает 80%, для пролиферации первой стволовой клетки, и собирают первую стволовую клетку из первого культурального контейнера, когда общая площадь первой стволовой клетки по отношению к площади нижней поверхности первого культурального контейнера увеличивается от 70 до 80%, для пролиферации, таким образом, поддерживая активность первой стволовой клетки, таким образом, размножая первую стволовую клетку, и однозначно производя жидкий культуральный продукт, содержащий только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом стволовой клетки.

Способом изготовления жидкого культурального продукта, которым вносят первую стволовую клетку в контейнер для разделения на этапе разделения стволовой клетки, помещают контейнер для разделения в центрифужный сепаратор для разделения путем центрифугирования первой стволовой клетки, и собирают вторую стволовую клетку, расположенную в самом нижнем слое первой стволовой клетки, разделенной путем центрифугирования на слои в контейнере для разделения на этапе первого сбора стволовой клетки, разделяют путем центрифугирования на слои первую стволовую клетку, содержащую ненужную стволовую клетку и собирают вторую стволовую клетку, расположенную в самом нижнем слое первой стволовой клетки, разделенной путем центрифугирования на слои, таким образом, несомненно выделяют конкретную вторую стволовую клетку из первой стволовой клетки и удаляют ненужную стволовую клетку из первой стволовой клетки. Способом изготовления жидкого культурального продукта можно культивировать только конкретный тип второй стволовой клетки, подлежащий культивированию, и однозначно производить жидкий культуральный продукт, содержащий только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом стволовой клетки.

Способом изготовления жидкого культурального продукта, в котором емкость второго культурального контейнера составляет приблизительно от 40 до 60 см³, емкость третьего культурального контейнера составляет приблизительно от 70 до 80 см³, начальная форма поверхности второй стволовой клетки приблизительно является круглой формой, и форма поверхности деформированной второй стволовой клетки первично является приблизительно круглой формой, и плоской формой, когда вторая стволовая клетка удлиняется в аморфной форме в одном направлении, и на этапах второго прикрепления стволовой клетки и третьего прикрепления стволовой клетки второй и третий культуральные контейнеры могут оставаться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 36 до 48 часов, деформацию второй стволовой клетки от исходной формы поверхности во втором и третьем культуральных контейнерах наблюдают в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 36 до 48 часов, и когда вторая стволовая клетка деформируется из начальной формы поверхности в аморфную плоскую форму, определяют, что вторая стволовая клетка прикрепилась к нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров, нельзя с легкостью прикрепить вторую стволовую клетку к нижней поверхности второго и третьего культуральныых контейнеров и пролиферация второй стволовой клетки замедляется, когда емкость второго культурального контейнера превышает 60 см³ и емкость третьего культурального контейнера превышает 80 см³, но сразу и легко вторая стволовая клетка прикрепляется к нижней поверхности второго и третьего культурального контейнеров, с использованием второго и третьего культурального контейнеров с указанными емкостями, производится единственный тип второй стволовой клетки в течение короткого периода времени за счет быстрой пролиферации второй стволовой клетки во втором и третьем культуральных контейнерах, и можно производить за короткий период времени большое количество жидкого культурального продукта, содержащего только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом второй стволовой клетки, полученный путем удаления ненужной стволовой клетки. Способ изготовления жидкого культурального продукта позволяет второму и третьему культуральным контейнерам оставаться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 36 до 48 часов, позволяет наблюдать деформацию второй стволовой клетки от исходной формы поверхности во втором и третьем культуральных контейнерах в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 36 до 48 часов, и определять, что вторая стволовая клетка прикрепилась к нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров, когда вторая стволовая клетка деформируется для обеспечения первично приблизительно круглой формы, и плоской формы, когда вторая стволовая клетка удлиняется в аморфной форме в одном направлении, таким образом, тем самым, никогда не ошибаясь в подтверждении прикрепления прикрепление второй стволовой клетки к нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров, должным образом подтверждать прикрепление второй стволовой клетки к нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров в соответствии с изменениями формы поверхности второй стволовой клетки, удалять культуральную жидкость из второго и третьего культуральных контейнеров после подтверждения прикрепления второй стволовой клетки к нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров, заполнять новой культуральной жидкостью второй и третий культуральный контейнеры для несомненного стимулирования пролиферации второй стволовой клетки, и с использованием второй стволовой клетки можно однозначно производить жидкий культуральный продукт, содержащий только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом второй стволовой клетки.

Способом изготовления жидкого культурального продукта, который позволяет второму и третьему культуральным контейнерам оставаться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 36 до 48 часов на этапах второго и третьего сборов стволовой клетки и наблюдает общую площадь второй стволовой клетки, прикрепленной к нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров по отношению к площади нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 36 до 48 часов, можно надлежащим образом подтверждать общую площадь второй стволовой клетки по отношению к площади нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров путем наблюдения общей площади в интервале приблизительно от 1 до 2 часов, можно с уверенностью подтверждать, что общая площадь второй стволовой клетки достигает второго и третьего целевых соотношений с площадью нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров, поддерживать активность второй стволовой клетки без нарушения своевременного сбора второй стволовой клетки из второго и третьего культуральных контейнеров, собирать вторую стволовую клетку из второго и третьего культуральных контейнеров, и с использованием второй стволовой клетки можно однозначно производить жидкий культуральный продукт, содержащий только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом стволовой клетки.

Способом изготовления жидкого культурального продукта, в котором второе целевое соотношение общей площади второй стволовой клетки составляет от 88 до 92% от площади нижней поверхности второго культурального контейнера, и третье целевое соотношение общей площади второй стволовой клетки составляет от 88 до 92% от площади нижней поверхности третьего культурального контейнера, постепенно снижают активность второй стволовой клетки, когда общая площадь второй стволовой клетки по отношению к площади нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров превышает 92%, для пролиферации второй стволовой клетки, и собирают вторую стволовую клетку из второго и третьего культуральных контейнеров, когда общая площадь второй стволовой клетки по отношению к площади нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров увеличивается от 88 до 92%, для пролиферации, таким образом, поддерживая активность второй стволовой клетки, таким образом, размножая вторую стволовую клетку, и однозначно производя с использованием второй стволовой клетки жидкий культуральный продукт, содержащий только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом второй стволовой клетки.

Способом изготовления жидкого культурального продукта, в котором первая и вторая стволовые клетки представляют мезенхимальные стволовые клетки, с использованием одного типа культивированной второй стволовой клетки, присутствуют не различные типы метаболитов, секретируемые различными типами стволовых клеток, а только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом второй стволовой клетки, можно производить жидкий культуральный продукт, обеспечивающий только специфический эффект на предопределенные заболевания и предопределенные косметические применения, такие как, уход за кожей, уход за волосами и уход за телом, можно производить жидкий культуральный продукт, способный эффективно использоваться для лечения предопределенных заболеваний, и можно производить жидкий культуральный продукт, способный эффективно использоваться для предопределенных косметических применений.

Способом изготовления жидкого культурального продукта можно производить жидкий культуральный продукт, с использованием чистой (очищенной) второй стволовой клетки, полученной путем удаления ненужной стволовой клетки, что позволяет жидкому культуральному продукту содержать только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом второй стволовой клетки, таким образом, обеспечивая достоверный эффект лечения предопределенных заболеваний и производя жидкий культуральный продукт, эффективный для лечения таких заболеваний, и возможно производить жидкий культуральный продукт с достоверным эффектом на предопределенные косметические применения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один из примеров системы для производства жидкого культурального продукта;

ФИГ. 2 представляет собой иллюстративный чертеж, иллюстрирующий один из примеров этапа разделения костно-мозговой жидкости;

ФИГ. 3 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий этап разделения костно-мозговой жидкости после этапа на ФИГ. 2;

ФИГ. 4 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий этап разделения костно-мозговой жидкости после этапа на ФИГ. 3;

ФИГ. 5 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий один из примеров этапа первого наблюдения за стволовой клеткой;

ФИГ. 6 представляет собой вид сбоку первого плоского культурального контейнера;

ФИГ. 7 представляет собой частично увеличенный вид, иллюстрирующий один из примеров формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки;

ФИГ. 8 представляет собой частично увеличенный вид, иллюстрирующий другой пример формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки;

ФИГ. 9 представляет собой частично увеличенный вид, иллюстрирующий другой пример формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки;

ФИГ. 10 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий один из примеров этапа разделения стволовой клетки;

ФИГ. 11 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий один из примеров этапа второго выделения стволовой клетки;

ФИГ. 12 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий один из примеров этапа третьего наблюдения за стволовой клеткой;

ФИГ. 13 представляет собой вид сбоку второго плоского культурального контейнера;

ФИГ. 14 представляет собой частично увеличенный вид, иллюстрирующий один из примеров формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки;

ФИГ. 15 представляет собой частично увеличенный вид, иллюстрирующий другой пример формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки;

ФИГ. 16 представляет собой частично увеличенный вид, иллюстрирующий другой пример формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки;

ФИГ. 17 предcтавляет собой чертеж, иллюстрирующий один из примеров выделенного жидкого культурального продукта и сохраненной второй мезенхимальной стволовой клетки;

ФИГ. 18 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий один из примеров этапа пятого наблюдения за стволовой клеткой; и

ФИГ. 19 представляет собой вид сбоку третьего плоского культурального контейнера.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Ниже будет описан способ изготовления жидкого культурального продукта по настоящему изобретению со ссылкой на прилагаемые чертежи, такие как ФИГ. 1, иллюстрирующая блок-схему одного из примеров системы 10 для производства жидкого культурального продукта. ФИГ. 2 представляет собой иллюстративный чертеж, иллюстрирующий один из примеров этапа разделения костно-мозговой жидкости, и ФИГ. 3 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий этап разделения костно-мозговой жидкости после этапа на ФИГ. 2 ФИГ. 2. ФИГ. 4 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий этап разделения костно-мозговой жидкости после этапа на ФИГ. 3.

Способом изготовления жидкого культурального продукта культивируют единственный и конкретный тип мезенхимальной стволовой клетки (единственный тип стволовой клетки) среди множества типов мезенхимальных стволовых клеток, содержащихся в костно-мозговой жидкости, и производят жидкий культуральный продукт, содержащий предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом мезенхимальной стволовой клетки. Конкретно, способом изготовления жидкого культурального продукта производят жидкий культуральный продукт, с использованием костно-мозговой жидкости (неочищенной костно-мозговой жидкости), собранной у нескольких доноров (людей), в качестве неочищенного материала, и системы 10 для производства жидкого культурального продукта, посредством этапа разделения костно-мозговой жидкости, этапа выделения костно-мозговой жидкости, этапа первого прикрепления стволовой клетки, этапа первого культивирования стволовой клетки, этапа первого сбора стволовой клетки, этапа разделения стволовой клетки, этапа второго сбора стволовой клетки, этапа второго прикрепления стволовой клетки, этапа второго культивирования стволовой клетки, этапа первого выделения жидкого культуральный продукта. Далее, с использованием системы 10 для производства жидкого культурального продукта, производят жидкий культуральный продукт посредством этапа второго сбора стволовой клетки, этапа третьего прикрепления стволовой клетки, этапа третьего культивирования стволовой клетки и этапа второго выделения второго жидкого культурального продукта.

Этап первого прикрепления стволовой клетки включает этап первого наблюдения за стволовой клеткой, и этап второго сбора стволовой клетки включает этап второго наблюдения за стволовой клеткой. Этап второго прикрепления стволовой клетки включает этап третьего наблюдения за стволовой клеткой, и этап первого выделения жидкого культурального продукта включает этап четвертого наблюдения за стволовой клеткой. Этап третьего прикрепления стволовой клетки включает этап пятого наблюдения за стволовой клеткой, и этап второго выделения жидкого культурального продукта включает этап шестого наблюдения за стволовой клеткой.

Система 10 для производства жидкого культурального продукта снабжена компьютером 11, сканером штрих-кодов 12 и электронным микроскопом 13. Компьютер 11, включающий центральный процессор (ЦП или виртуальный ЦП), запоминающее устройство (память или виртуальная память), и запоминающее устройство большой емкости (в том числе, жесткий диск или виртуальный жесткий диск), эксплуатируют при помощи физической ОС (операционной системы) и виртуальной ОС (виртуальной операционной системы). С компьютером 11 соединены устройства ввода данных, такие как клавиатура 14 и мышь 15 и устройства вывода данных, такие как экран 16 и принтер (не показан) через интерфейс (проводной или беспроводной).

Система 10 для производства жидкого культурального продукта использует QR-код (зарегистрированная торговая марка) для управления данными доноров (конкретная информация о доноре). Данные доноров включают имя донора, постоянный адрес, номер телефона, дату рождения, пол, группу крови, рост, вес, и адрес электронной почты. Система 10 использует QR-код в виде двухмерного кода, но можно дополнительно использовать матричный код SP, код Veri, код Maxi, код CP, Data Matrix, Code1, код Aztec, код intacta и электронную карту. Другие двухмерные коды для применения в системе 10 включают все коды, которые должны быть разработаны как таковые.

На этапе разделения фракции костно-мозговой жидкости разделяют на слои костно-мозговую жидкость 18, собранную у донора. На этапе сбора костно-мозговой жидкости, собирают от 2 до 3 см³ (от 2 до 3 мл) костно-мозговой жидкости 18 из грудины или подвздошной кости (тазовой) донора. После применения местной анестезии костно-мозговую жидкость 18 забирают у донора путем «костно-мозговой пункции» (также известной как «MARK», от немецкого слова «Knochenmark», означающего костный мозг) для пунктирования костного мозга и отсасывания костно-мозговой жидкости (крови костного мозга). Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, после сбора костно-мозговой жидкости 18, активируют систему 10 на компьютере 11, и вводят данные доноров на компьютер 11, с использованием устройств для ввода данных, таких как клавиатура 14 и мышь 15.

Компьютер 11 создает уникальный идентификатор донора для идентификации каждого донора каждый раз, когда вводят данные донора (костно-мозговую жидкость 18 собирают у донора), и хранит данные донора на запоминающем устройстве, таким образом, что они связаны с идентификатором донора (этап хранения данных донора). Компьютер 11 переводит введенные данные донора в QR-код (двухмерный код) посредством функции для написания двухмерного кода (способы конвертирования двухмерного кода (QR-кода)), выводит бумагу с первым кодом 17, на которой напечатан QR-код (этап вывода двухмерного кода (QR-кода)), и хранит QR-код на запоминающем устройстве, таким образом, что он связан с идентификатором донора для идентификации каждого донора (этап хранения двухмерного кода (QR-кода)). Когда вводят данные второго донора, выводится бумага для второго кода, на которой напечатан QR-код, и когда вводят данные третьего донора, выводится бумага для третьего кода, на которой напечатан QR-код, и, таким образом, от первой до n-ной бумаги для кода от первого до n-ного выводятся для различных доноров.

QR-код, напечатанный на бумаге для первого кода 17, на которой напечатан NO1, хранит NO. 1, являющийся индикатором для этапа разделения костно-мозговой жидкости, этапа выделения костно-мозговой жидкости, этапа первого наблюдения за стволовой клеткой, этапа первого прикрепления стволовой клетки, этапа первого культивирования стволовой клетки, этапа второго наблюдения за стволовой клеткой, этапа первого сбора стволовой клетки, этапа разделения стволовой клетки, этапа второго сбора стволовой клетки, этапа третьего наблюдения за стволовой клеткой, этапа второго прикрепления стволовой клетки, этапа второго культивирования стволовой клетки, этапа четвертого наблюдения за стволовой клеткой, этапа первого выделения жидкого культурального продукта, этапа второго сбора стволовой клетки, этапа третьего прикрепления стволовой клетки, этапа третьего культивирования стволовой клетки, этапа второго выделения жидкого культурального продукта, этапа второго сбора стволовой клетки, этапа пятого наблюдения за стволовой клеткой, этапа третьего прикрепления стволовой клетки, этапа третьего культивирования стволовой клетки, и этапа шестого наблюдения за стволовой клеткой, этапа второго выделения жидкого культурального продукта. Компьютер 11, каждый раз, когда происходят этапы от этапа разделения костно-мозговой жидкости до этапа первого выделения жидкого культурального продукта, сравнивает данные донора, хранящиеся на запоминающем устройстве с данными донора, показанными путем QR-кода, считанного сканером для штрих-кодов 12.

От 2 до 3 см³ костно-мозговой жидкости 18, собранной у донора, как показано на ФИГ. 2, загружают (помещают) в вертикально удлиняющуюся стеклянную тестовую пробирку 19 (контейнер для разделения). От 2 до 3 см³ костно-мозговой жидкости 18 содержит от 0,5 до 1 мл (приблизительно 5×10⁷ (клеток/мл)) множества типов мезенхимальных стволовых клеток. На внешней периферийной поверхности стеклянной тестовой пробирки 19 для заполнения костно-мозговой жидкостью 18 прикрепляют бумагу с первым кодом 17. Стеклянную тестовую пробирку 19, заполненную костно-мозговой жидкостью 18, как показано на ФИГ. 3, помещают в штатив для тестовых пробирок 20 и держат на бане с постоянной температурой 21 вместе со штативом для тестовых пробирок 20.

Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, после прикрепления бумаги с первым кодом 17, на которой напечатан QR-код, на внешнюю периферийную поверхность стеклянной тестовой пробирки 19, позволяют сканеру для штрих-кодов 12 считать QR-код на стеклянной тестовой пробирке 19. Сканер для штрих-кодов 12 соединен с компьютером 11 посредством интерфейса (проводного или беспроводного). Сканер для штрих-кодов 12 передает считанный QR-код на компьютер 11.

Компьютер 11 извлекает NO. 1, показанный при помощи QR-кода, переданного сканером для штрих-кодов 12, и данные донора из запоминающего устройства, читает их в кэш-памяти, и отображает первое пошаговое экранное окно (не показано) на экране 16. Первое пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также кнопку разделения костно-мозговой жидкости, кнопку выделения костно-мозговой жидкости, кнопку первого наблюдения за стволовой клеткой, кнопку второго наблюдения за стволовой клеткой, кнопку первого сбора стволовой клетки и кнопку выхода. Кнопку выхода нажимают для остановки системы 10 на компьютере 11.

Ответственные, после нажатия кнопки разделения костно-мозговой жидкости, отображаемой на экране 16, вводят костно-мозговую жидкость 18 из шприца в стеклянную тестовую пробирку 19, и ставят стеклянную тестовую пробирку 19, в которую загружена (помещена) костно-мозговая жидкость 18, в штатив для тестовых пробирок 20. Ответственные, как показано на ФИГ. 3, держат штатив для тестовых пробирок 20 на бане с постоянной температурой 21, и позволяют стеклянной тестовой пробирке 19, в которую загружена костно-мозговая жидкость 18, находиться в статическом состоянии на бане с постоянной температурой 21 в течение предопределенного периода времени (приблизительно 2 часа) (статически без движения). Температуру в бане с постоянной температурой 21 поддерживают на уровне приблизительно равном температуре тела, примерно от 36 до 37^°C. Компьютер 11 показывает NO. 1, показанный посредством QR-кода, напечатанного на бумаге с первым кодом 17, и данные донора на экране 16, а также сообщение о том, что проходит процесс разделения костно-мозговой жидкости, и кнопку окончания разделения костно-мозговой жидкости.

Стеклянную тестовую пробирку 19 оставляют в статическом состоянии в бане с постоянной температурой 21 в течение предопределенного периода времени (приблизительно 2 часа), как показано на ФИГ. 4, для вертикального разделения на слои в тестовой пробирке 19 костно-мозговой жидкости 18, введенной в тестовую пробирку 19 (этап разделения костно-мозговой жидкости). Культивирование стволовой клетки, как правило, требует от 150 до 200 см³ (от 150 до 200 мл) костно-мозговой жидкости, но способом изготовления жидкого культурального продукта производят единственный тип стволовой клетки из 2-3 см³ костно-мозговой жидкости 18, собранной в малых количествах у донора, таким образом, необходим сбор только от 2 до 3 см³ костно-мозговой жидкости 18 в малых количествах у донора и минимизируется нагрузка на донора при сборе костно-мозговой жидкости 18.

За этапом разделения костно-мозговой жидкости для разделения на слои костно-мозговой жидкости 18 идет этап выделения костно-мозговой жидкости. На этапе выделения костно-мозговой жидкости, костно-мозговую жидкость промежуточного слоя 22 выделяют из костно-мозговой жидкости 18, разделенной на слои. Ответственные, после подтверждения того, что костно-мозговая жидкость 18 разделена на слои, нажимают кнопку окончания разделения костно-мозговой жидкости, отображенную на экране 16. Когда нажата кнопка окончания разделения костно-мозговой жидкости, компьютер 11 отображает второе пошаговое экранное окно на экране (не показано) на экране 16. Второе пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончания разделения костно-мозговой жидкости, кнопку выделения костно-мозговой жидкости, кнопку первого наблюдения за стволовой клеткой, кнопку второго наблюдения за стволовой клеткой и кнопку первого сбора стволовой клетки.

Ответственные нажимают кнопку выделения костно-мозговой жидкости на втором пошаговом экранном окне, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код на стеклянной тестовой пробирки 19. Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16 с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, на экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения костно-мозговой жидкости, сообщение о том, что проходит процесс выделения костно-мозговой жидкости, и кнопку окончания выделения костно-мозговой жидкости. Если эти данные донора не совпадают, компьютер 11 выводит сообщение об ошибке и сообщение об отмене культивирования на экран 16.

Ответственные забирают штатив для тестовых пробирок 20 из бани с постоянной температурой 21, удаляют стеклянную тестовую пробирку 19 из штатива для тестовых пробирок 20, и выделяют костно-мозговую жидкость промежуточного слоя 22, находящуюся в конкретном слое костно-мозговой жидкости 18, разделенной на слои (этап выделения костно-мозговой жидкости). Ответственные выделяют (отсасывают) костно-мозговую жидкость промежуточного слоя 22, толщиной от 2 до 4 мм, расположенную в промежуточном слое костно-мозговой жидкости 18, разделенной на слои, с использованием шприца (не показано). Альтернативно, ответственные выделяют (отсасывают) костно-мозговую жидкость промежуточного слоя 22, толщиной от 2 до 4 мм, расположенную в промежуточном слое костно-мозговой жидкости 18, разделенной на слои, с использованием пипетки (не показано).

Способом изготовления жидкого культурального продукта, после вертикального разделения на слои костно-мозговой жидкости 18, содержащей различные типы мезенхимальных стволовых клеток, можно несомненно выделять костно-мозговую жидкость конкретного промежуточного слоя 22 из костно-мозговой жидкости 18, с использованием шприца или пипетки, и удалять ненужную мезенхимальную стволовую клетку, содержащуюся в костно-мозговой жидкости 18.

ФИГ. 5 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий один из примеров этапа первого наблюдения за стволовой клеткой, и ФИГ. 6 представляет собой вид сбоку, показывающий первый плоский культуральный контейнер. ФИГ. 7 представляет собой частично увеличенный вид, иллюстрирующий один из примеров формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26, и ФИГ. 8 представляет собой частично увеличенный вид, иллюстрирующий другой пример формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26. ФИГ. 7 и 8 представляют собой увеличенные виды формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26, полученные при помощи электронного микроскопа 13.

За этапом выделения костно-мозговой жидкости для выделения из костно-мозговой жидкости 18 конкретной костно-мозговой жидкости промежуточного слоя 22, расположенной в промежуточном слое, следует этап первого наблюдения за стволовой клеткой. На этапе первого наблюдения за стволовой клеткой, костно-мозговую жидкость промежуточного слоя 22 и культуральную жидкость 23 загружают (помещают) в первый плоский культуральный контейнер 24 (первый культуральный контейнер), культуральный контейнер 24 оставляют при температуре, приблизительно равной температуре тела, (приблизительно от 36 до 37^°C) в статическом состоянии в течение от 12 до 24 часов (статически без движения).

Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, после выделения костно-мозговой жидкости из конкретного промежуточного слоя 22 из костно-мозговой жидкости 18, нажимают кнопку окончания выделения костно-мозговой жидкости, расположенную на экране 16. Когда нажимают кнопку окончания выделения костно-мозговой жидкости, компьютер 11 выводит третье пошаговое экранное окно (не показано) на экран 16. Третье пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения костно-мозговой жидкости, сообщение об окончании выделения костно-мозговой жидкости, кнопку первого наблюдения за стволовой клеткой, кнопку второго наблюдения за стволовой клеткой и кнопку первого сбора стволовой клетки.

Ответственные прикрепляют бумагу с первым кодом 17, на которой напечатан QR-код, на дно 27 (внешняя поверхность нижней стенки) первого плоского культурального контейнера 24. Затем, ответственные нажимают кнопку первого наблюдения за стволовой клеткой на третьем пошаговом экранном окне, и позволяют сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код культурального контейнера 24. Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16 с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, на экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения костно-мозговой жидкости, сообщение об окончании выделения костно-мозговой жидкости, сообщение о том, что идет процесс первого наблюдения за стволовой клеткой, и кнопка окончания первого наблюдения за стволовой клеткой. Если эти данные донора не совпадают, компьютер 11 выводит сообщение об ошибке и сообщение об отмене культивирования на экран 16.

Ответственные загружают (наполняют) культуральный контейнер 24 костно-мозговой жидкостью промежуточного слоя 22, забранной в шприц или пипетку, и с использованием шприца или пипетки загружают культуральную жидкость 23 в культуральный контейнер 24. Первый плоский культуральный контейнер 24 (первый культуральный контейнер) сделан из прозрачного стекла или прозрачного пластика, и плоский контейнер, чья форма поверхности приблизительно является правильным прямоугольником, и имеет небольшую емкость и дно 27 предопределенной площади. Первый плоский культуральный контейнер 24 включает верхнюю часть 40, нижнюю часть 38, и отверстие для заполнения 41 на верхней части 40. Отверстие для заполнения 41 герметизируют водонепроницаемой крышкой 42. Первый плоский культуральный контейнер 24 может быть плоским контейнером, чья форма поверхности является круглой или овальной, с небольшой емкостью и дном 27 предопределенной площади. Первый плоский культуральный контейнер 24, используемый в способе первого наблюдения за стволовой клеткой, имеет емкость приблизительно от 20 до 30 см³ (предпочтительно, 25 см³), и площадь нижней поверхности приблизительно от 25 до 36 мм². Культуральный контейнер 24 имеет длину стороны от 5 до 6 мм.

Культуральная жидкость 23 состоит из раствора минеральных солей и аминокислот, содержащего пенициллин (приблизительно 100 Ед/мл), амфотерицин (приблизительно 100 нг/мл), стрептомицин (приблизительно 100 мкг/мл), L-глутамин (приблизительно от 2 до 4 мл), и 20% эмбриональную телячью сыворотку. Первая мезенхимальная стволовая клетка 26, которая содержится в костно-мозговой жидкости промежуточного слоя 22, загруженной в культуральный контейнер 24, прикрепляется ко дну 27 культурального контейнера 24 по прошествии времени, культивируется при помощи культуральной жидкости 23, и постепенно пролиферирует (дифференцируется) на дне 27 культурального контейнера 24 с образованием колонии.

Культуральная жидкость может быть модифицированной Дульбекко средой Игла (DMEM), минимальной поддерживающей средой в модификации Глазго (GMEM), RPMI640, и т.д. Культуральная жидкость может содержать инсулин, трансферрин, этаноламин, селен, 2-меркаптоэтанол, L-аланил-L-глутамин, пируват натрия, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, глицин, L-пролин и L-серин.

Ответственные, после загрузки костно-мозговой жидкости промежуточного слоя 22 и культуральной жидкости 23 в первый плоский культуральный контейнер 24, устанавливают (помещают) культуральный контейнер 24 в держатель для образцов электронного микроскопа 13. Прокладка 39 расположена между верхней поверхностью 37 держателя для образцов 36 электронного микроскопа 13 и нижней частью 38 первого плоского культурального контейнера 24 таким образом, чтобы поддерживать нижнюю часть 38 культурального контейнера 24, поднятую прокладкой 39, позволяя нижней части 38 культурального контейнера 24 и верхней части 40 (отверстию для заполнения 41) культурального контейнера 24 оставаться в верхнем и нижнем положениях, соответственно, и поддерживать культуральный контейнер 24 при предопределенном угле наклона. Также, прокладка 39 может быть расположена между верхней поверхностью 37 держателя для образцов электронного микроскопа 13 и верхней частью 40 первого плоского культурального контейнера 24 таким образом, чтобы поддерживать верхнюю часть 40 культурального контейнера 24, поднятую прокладкой 39, позволяя верхней части 40 культурального контейнера 24 и нижней части 38 культурального контейнера 24 оставаться в верхнем и нижнем положениях, соответственно, и поддерживать культуральный контейнер 24 при предопределенном угле наклона. Угол наклона α1 первого плоского культурального контейнера 24 по отношению к верхней поверхности 37 держателя для образцов 36 находится в диапазоне от 2 до 5°, предпочтительно от 2 до 3°.

В способе изготовления жидкого культурального продукта располагают первый плоский культуральный контейнер 24 по отношению к верхней поверхности 37 держателя для образцов 36 с углом наклона, таким образом, позволяя костно-мозговой жидкости промежуточного слоя 22 и культуральной жидкости 23 в культуральном контейнере 24 наклоняться в сторону верхней части 40 культурального контейнера 24 (или в сторону нижней части 38), что приводит к повышению водного давление костно-мозговой жидкости промежуточного слоя 22 и культуральной жидкости 23 на стороне верхней части 49 культурального контейнера 24 (или на стороне нижней части 38), позволяя первой мезенхимальной стволовой клетке 26 скапливаться на стороне нижней части 38 культурального контейнера 24, и, таким образом, повышая активность первых мезенхимальных стволовых клеток 26 в отношении быстрого и легкого прикрепления первой мезенхимальной стволовой клетки 26 ко дну 27 культурального контейнера 24.

Электронный микроскоп 13 соединен с компьютером 11 посредством интерфейса (проводного или беспроводного). Электронный микроскоп 13 включает функцию изображения, чтобы дать возможность датчику изображения показать увеличенный вид объекта, и функцию передачи изображения для передачи увеличенного вида на компьютер 11. Электронный микроскоп 13 создает изображение увеличенного вида формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26, которая содержится в костно-мозговой жидкости промежуточного слоя 22, загруженной в культуральный контейнер 24, в интервале приблизительно от 1 до 2 часов, и передает увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 26, для которой получают изображение, на компьютер 11 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов. Интервал получения изображения или передачи изображения в электронном микроскопе 13 можно устанавливать от 1 до 2 часов при помощи устройств для ввода, таких как клавиатура 14 и мышь 15.

Компьютер 11 загружает увеличенный вид формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26, переданный с электронного микроскопа 13 и время получения изображения в память, таким образом, чтобы они были связаны с идентификатором донора (этап первой загрузки изображения стволовых клеток). Компьютер 11 выводит на экран 16 увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 28, переданный с электронного микроскопа 13 и время получения изображения. Ответственные подтверждают (визуально распознают) увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 26, выведенный на экран 16 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 12 до 24 часов, и наблюдают изменения формы поверхности стволовой клетки 26, которая содержится в костно-мозговой жидкости промежуточного слоя 22 (этап первого наблюдения за стволовой клеткой). Ответственные могут непосредственно наблюдать изменения формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26 через окошко для наблюдений электронного микроскопа 13 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 12 до 24 часов.

Способом изготовления жидкого культурального продукта культивируют первую мезенхимальную стволовую клетку 26, которая содержится в костно-мозговой жидкости промежуточного слоя 22, и прикрепляют первую мезенхимальную стволовую клетку 26 ко дну 27 первого плоского культурального контейнера 24 (первого культурального контейнера) (этап первого прикрепления стволовой клетки). Начальная форма поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26 приблизительно представляет собой круглую форму, и когда форма поверхности стволовой клетки 26 приблизительно представляет собой круглую форму, стволовая клетка 26 не прикрепляется ко дну 27 of культурального контейнера 24 (внутренней поверхности нижней стенки), что не позволяет стволовой клетке 26 начать пролиферацию (дифференцировку). Форма поверхности деформированной первой мезенхимальной стволовая клетка 26 является сначала приблизительно круглой до прикрепления, и плоской формой, когда стволовая клетка 26 удлиняется (расширяется) в аморфную форму в одном направлении (предопределенном направлении), таким образом, прикрепляя стволовую клетку 26 ко дну 27 культурального контейнера 24 (внутренней поверхности нижней стенки) и давая возможность стволовой клетке 26 начать пролиферацию (дифференцировку).

Ответственные, в соответствии с наблюдением на этапе первого наблюдения за стволовой клеткой, как показано на ФИГ. 6, когда увеличенный вид формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26, выведенный на экран 16, остается при наблюдении приблизительно круглой формы, определяют, что стволовая клетка 26 не прикрепилась ко дну 27 культурального контейнера 24 (внутренней поверхности нижней стенки), и постоянно наблюдают за изменениями формы поверхности стволовой клетки 26 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов. Ответственные, в соответствии с наблюдением на этапе первого наблюдения за стволовой клеткой, как показано на ФИГ. 7, когда форма поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26, выведенная на экран 16, деформируется приблизительно от круглой до приблизительно, в основном, круглой и аморфной плоской формы, определяют, что стволовая клетка 26 прикрепилась ко дну 27 культурального контейнера 24.

Использование большого культурального контейнера, емкость которого превышает 30 см³ и площадь нижней поверхности превышает 36 мм², для прикрепления первой мезенхимальной стволовой клетки 26 не позволяет стволовой клетке 26 легко прикрепиться к нижней поверхности контейнера и замедляет пролиферацию стволовой клетки 26, но способом изготовления жидкого культурального продукта с использованием первого плоского культурального контейнера 24 с указанными емкостью и площадью нижней поверхности, можно легко прикреплять стволовую клетку 26 ко дну 27 культурального контейнера 24 и сразу же размножать стволовую клетку 26 в культуральном контейнере 24.

Способ изготовления жидкого культурального продукта позволяет оставлять культуральный контейнер 24 в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, в течение периода от 12 до 24 часов, и наблюдать деформацию первой мезенхимальной стволовой клетки 26 от начальной формы поверхности в культуральном контейнере 24 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 12 до 24 часов, тем самым, никогда не ошибаясь в подтверждении прикрепления стволовой клетки 26 и надлежащим образом подтверждая прикрепление стволовой клетки 26 ко дну 27 культурального контейнера 24.

ФИГ. 9 представляет собой частично увеличенный вид, иллюстрирующий другой пример формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26. ФИГ. 9 представляет собой увеличенный вид формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26, полученный при помощи электронного микроскопа 13. В соответствии с наблюдением на этапе первого наблюдения за стволовой клеткой, первая мезенхимальная стволовая клетка 26 (первая стволовая клетка) деформируется от приблизительно круглой (исходной формы поверхности) до приблизительно, в основном, круглой и аморфной плоской формы, и после этапа первого прикрепления стволовой клетки для подтверждения прикрепления стволовой клетки 26 ко дну 27 первого плоского культурального контейнера 24 (первого культурального контейнера) следует этап первого культивирования стволовой клетки и этап второго наблюдения за стволовой клеткой.

На этапе первого культивирования стволовой клетки и этапе второго наблюдения за стволовой клеткой, культуральную жидкость 23, загруженную в культуральный контейнер 24, удаляют (убирают) из культурального контейнера 24, и заполняют (наполняют) культуральный контейнер 24 новой культуральной жидкостью 23. Затем, культуральный контейнер 24 оставляют в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела (приблизительно от 36 до 37^°C), в течение от 36 до 48 часов (статически без движения), и культивируют стволовую клетку 26, до тех пор, пока общая площадь первой мезенхимальной стволовой клетки 26 не достигнет первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 24 (этап первого культивирования стволовой клетки).

Общую площадь первой мезенхимальной стволовой клетки 26, прикрепленной ко дну 27 культурального контейнера 24, за счет оставления культурального контейнера 24 в статическом состоянии в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов, по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 24, наблюдают при помощи электронного микроскопа 13, и определяют, достигла ли общая площадь стволовой клетки 26 первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 24. Первое целевое соотношение общей площади первой мезенхимальной стволовой клетки 26 составляет от 70 до 80% от площади нижней поверхности культурального контейнера 24 (от 70 до 80% конфлюэнтности).

Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, после подтверждения прикрепления первой мезенхимальной стволовой клетки 26, которая содержится в костно-мозговой жидкости промежуточного слоя 22, ко дну 27 культурального контейнера 24, нажимают кнопку окончания первого наблюдения за стволовой клеткой на экране 16. Когда нажата кнопка окончания первого наблюдения за стволовой клеткой, компьютер 11 выводит на экран 16 четвертое пошаговое экранное окно (не показано). Четвертое пошаговое экранное окно на экране показывает NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения костно-мозговой жидкости, сообщение об окончании выделения костно-мозговой жидкости, сообщение об окончании первого наблюдения за стволовой клеткой, кнопку второго наблюдения за стволовой клеткой и кнопку первого сбора стволовой клетки.

Ответственные нажимают кнопку второго наблюдения за стволовой клеткой на четвертом пошаговом экранном окне, удаляют культуральный контейнер 24 из держателя для образцов электронного микроскопа 16, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код культурального контейнера 24. Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16, с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, NO. 1 и данные донора выводятся на экран 16, а также сообщение об окончании разделения костно-мозговой жидкости, сообщение об окончании выделения костно-мозговой жидкости, сообщение об окончании первого наблюдения за стволовой клеткой, сообщение о том, что идет процесс второго наблюдения за стволовой клеткой и кнопку окончания второго наблюдения за стволовой клеткой. Если эти данные донора не совпадают, компьютер 11 выводит сообщение об ошибке и сообщение об отмене культивирования на экран 16.

Ответственные удаляют (убирают) из культурального контейнера 24 культуральную жидкость 23, загруженную в культуральный контейнер 24 на этапе первого наблюдения за стволовой клеткой, и заполняют (загружают) культуральный контейнер 24 новой культуральной жидкостью 23. Новая культуральная жидкость 23 является такой же, какая была загружена на этапе первого наблюдения за стволовой клеткой. Ответственные заполняют новой культуральной жидкостью 23 культуральный контейнер 24, а затем устанавливают (помещают) культуральный контейнер 24 в держатель для образцов электронного микроскопа 13.

Прокладка 39 расположена между верхней поверхностью 37 держателя для образцов 36 электронного микроскопа 13 и нижней частью 38 первого плоского культурального контейнера 24 таким образом, чтобы поддерживать нижнюю часть 38 культурального контейнера 24, поднятую прокладкой 39, позволяя нижней части 38 культурального контейнера 24 и верхней части 40 (отверстию для заполнения 41) культурального контейнера 24 оставаться в верхнем и нижнем положениях, соответственно, и поддерживать культуральный контейнер 24 при предопределенном угле наклона (см. ФИГ. 6). Также, прокладка 39 может быть расположена между верхней поверхностью 37 держателя для образцов 36 электронного микроскопа 13 и верхней частью 40 первого плоского культурального контейнера 24 таким образом, чтобы поддерживать верхнюю часть 40 культурального контейнера 24, поднятую прокладкой 39, позволяя верхней части 40 культурального контейнера 24 и нижней части 38 культурального контейнера 24 оставаться в верхнем и нижнем положениях, соответственно, и поддерживать культуральный контейнер 24 при предопределенном угле наклона. Угол наклона α1 первого плоского культурального контейнера 24 по отношению к верхней поверхности 37 держателя для образцов 36 находится в диапазоне от 2 до 5°, предпочтительно от 2 до 3°.

В способе изготовления жидкого культурального продукта подтверждают прикрепление первой мезенхимальной стволовой клетки 26, затем удаляют культуральную жидкость 23 из культурального контейнера 24, и заполняют новой культуральной жидкостью 23 культуральный контейнер 24, таким образом, несомненно стимулируя пролиферацию стволовой клетки 26. В способе изготовления жидкого культурального продукта располагают первый плоский культуральный контейнер 24 по отношению к верхней поверхности 37 держателя для образцов 36 с углом наклона, таким образом, позволяя первой мезенхимальной стволовой клетке 26 и культуральной жидкости 23 в культуральном контейнере 24 наклоняться в сторону верхней части 40 культурального контейнера 24 (или в сторону нижней части 38), вызывая повышение водного давления первой мезенхимальной стволовой клетки 26 и культуральной жидкости 23 на стороне верхней части 40 культурального контейнера 24 (или на стороне нижней части 38), позволяя первой мезенхимальной стволовой клетке 26 скапливаться на стороне нижней части 38 культурального контейнера 24, и, таким образом, повышая активность первых мезенхимальных стволовых клеток 26 в отношении быстрой и легкой пролиферации (дифференцировки) первой мезенхимальной стволовой клетки 26 на дне 27 культурального контейнера 24.

Электронный микроскоп 13 создает изображение увеличенного вида формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26 в культуральном контейнере 24, в интервале приблизительно от 1 до 2 часов, и передает увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 26, для которой получают изображение, на компьютер 11 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов. Компьютер 11 загружает увеличенный вид формы поверхности первой мезенхимальной стволовой клетки 26, переданный с электронного микроскопа 13 и время получения изображения в память, таким образом, чтобы они были связаны с идентификатором донора (этап второй загрузки изображения стволовых клеток). Компьютер 11 выводит на экран 16 увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 28, переданный с электронного микроскопа 13 и время получения изображения.

Ответственные подтверждают (визуально распознают) увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 26, выведенный на экран 16 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов, наблюдают общую площадь стволовой клетки 26, прикрепленной ко дну 27 культурального контейнера 24 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 24, и определяют, достигла ли общая площадь стволовой клетки 26 первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 24 (от 70 до 80% конфлюэнтности) (этап второго наблюдения за стволовой клеткой). Ответственные могут непосредственно наблюдать общую площадь первой мезенхимальной стволовой клетки 26 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 24 через окошко для наблюдений электронного микроскопа 13 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов и определять, достигла ли общая площадь стволовой клетки 26 первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 24 (от 70 до 80% конфлюэнтности)

Ответственные, в соответствии с наблюдением на этапе второго наблюдения за стволовой клеткой, как показано на ФИГ. 7, если общая площадь первой мезенхимальной стволовой клетки 26, выведенная на экран 16, не достигает первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 24 (от 70 до 80% конфлюэнтности), постоянно наблюдают общую площадь стволовой клетки 26 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 24 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов. Если общая площадь первой мезенхимальной стволовой клетки 26 достигает первого целевого соотношения ко всей площади увеличенного вида, выведенного на экран 16, определяют, что общая площадь стволовой клетки 26 достигает первого целевого соотношения к площади нижней поверхности культурального контейнера 24.

В соответствии с наблюдением на этапе второго наблюдения за стволовой клеткой, первая мезенхимальная стволовая клетка 26 размножается на дне 27 (внутренняя поверхность нижней стенки) культурального контейнера 24, образуя колонию и удлиняя свою форму поверхности, и как показано на ФИГ. 8, когда общая площадь стволовой клетки 26, выведенной на экран 16, достигает первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 24 (от 70 до 80% конфлюэнтности), запускают этап первого сбора стволовой клетки для сбора стволовой клетки 26 из культурального контейнера 24. На этапе первого сбора стволовой клетки, после того как общая площадь первой мезенхимальной стволовой клетки 26 достигла первого целевого соотношения, собирают из культурального контейнера 24 первую мезенхимальную стволовую клетку 26, которая пролиферировала (дифференцировалась) в культуральном контейнере 24.

Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, после подтверждения того, что общая площадь первой мезенхимальной стволовой клетки 26 достигает первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 24, нажимают кнопку окончания этапа второго наблюдения за стволовой клеткой, выведенную на экран 16. Когда нажата кнопка окончания этапа второго наблюдения за стволовой клеткой, компьютер 11 выводит на экран 16 пятое пошаговое экранное окно (не показано). Пятое пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения костно-мозговой жидкости, сообщение об окончании выделения костно-мозговой жидкости, сообщение об окончании первого наблюдения за стволовой клеткой, сообщение об окончании второго наблюдения за стволовой клеткой и кнопку первого сбора стволовой клетки.

Ответственные нажимают кнопку первого сбора стволовой клетки на пятом пошаговом экранном окне, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код культурального контейнера 24. Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16, с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, на экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения костно-мозговой жидкости, сообщение об окончании выделения костно-мозговой жидкости, сообщение об окончании первого наблюдения за стволовой клеткой, сообщение об окончании второго наблюдения за стволовой клеткой, сообщение о том, что идет этап первого сбора стволовой клетки и кнопку окончания первого сбора стволовой клетки. Если эти данные донора не совпадают, компьютер 11 выводит сообщение об ошибке и сообщение об отмене культивирования на экран 16.

Ответственные удаляют (убирают) при помощи шприца или пипетки из культурального контейнера 24 культуральную жидкость 23, загруженную в культуральный контейнер 24 на этапе второго наблюдения за стволовой клеткой, и после промывания культурального контейнера 24 PBS, вводят при помощи шприца или пипетки раствор трипсина в культуральный контейнер 24. Когда раствор трипсина вводят в культуральный контейнер 24, первая мезенхимальная стволовая клетка 26, прикрепленная ко дну 27 культурального контейнера 24 отслаивается раствором трипсина от дна 27, плавая на поверхности раствора трипсина. Ответственные собирают (отсасывают) стволовую клетку 26 с использованием пипетки, и хранят стволовую клетку 26 в пипетке (этап первого сбора стволовой клетки).

В способе изготовления жидкого культурального продукта наблюдают общую площадь в интервале приблизительно от 1 до 2 часов, чтобы должным образом подтвердить общую площадь первой мезенхимальной стволовой клетки 26 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 24, тем самым, убедительно подтверждая, что общая площадь стволовой клетки 26 достигает первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 24.

ФИГ. 10 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий один из примеров этапа разделения стволовой клетки. За этапом первого сбора стволовой клетки для сбора первого мезенхимальной стволовой клетки 26 из культурального контейнера 24 следует этап разделения стволовой клетки. Этап разделения стволовой клетки путем центрифугирования в центрифужном сепараторе 28 разделяет на слои первую мезенхимальную стволовую клетку 26, собранную посредством первого сбора. Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, после засасывания первой мезенхимальной стволовой клетки 26 из культурального контейнера 24 в пипетку, нажимают кнопку окончания первого сбора стволовой клетки, выведенную на экран 16.

Когда нажата кнопка окончания первого сбора стволовой клетки, компьютер 11 выводит на экран 16 шестое пошаговое экранное окно (не показано). Шестое пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также кнопку разделения стволовой клетки, кнопку второго выделения стволовой клетки, кнопку третьего наблюдения за стволовой клеткой, кнопку четвертого наблюдения за стволовой клеткой, и кнопку первого выделения. Ответственные прикрепляют бумагу с первым кодом 17, на которой напечатан QR-код, к внешней периферийной поверхности стеклянной тестовой пробирки 29 для заполнения первой мезенхимальной стволовой клеткой 26.

Затем, ответственные нажимают кнопку разделения стволовой клетки на шестом пошаговом экранном окне, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код стеклянной тестовой пробирки 29. Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16, с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, на экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение о том, что идет этап разделения стволовой клетки и кнопка окончания разделения стволовой клетки. Если эти данные донора не совпадают, компьютер 11 выводит сообщение об ошибке и сообщение об отмене культивирования на экран 16.

Ответственные загружают (помещают) первую мезенхимальную стволовую клетку 26 в пипетке в стеклянную тестовую пробирку 29, и помещают (устанавливают) стеклянную тестовую пробирку 29 в центрифужный сепаратор 28. Ответственные, после разделения путем центрифугирования стволовой клетки 26 в центрифужном сепараторе 28 в течение предопределенного периода времени, вынимают стеклянную тестовую пробирку 29 из центрифужного сепаратора 28. Первая мезенхимальная стволовая клетка 26 в стеклянной тестовой пробирке 29 вертикально разделяется на слои при помощи центрифужного сепаратора 28 (этап разделения стволовой клетки).

ФИГ. 11 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий один из примеров этапа второго выделения стволовой клетки. После этапа разделения стволовой клетки для разделения на слои первой мезенхимальной стволовой клетки 26 следует этап второго сбора стволовой клетки. Этап второго сбора стволовой клетки собирает вторую мезенхимальную стволовую клетку 30, расположенную в нижнем слое (самом нижнем слое) первой мезенхимальной стволовой клетки 26, разделенной на слои. Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, после вертикального разделения на слои первой мезенхимальной стволовой клетки 26 при помощи центрифужного сепаратора 28, удаляют стеклянную тестовую пробирку 29 из центрифужного сепаратора 28, и нажимают на кнопку окончания разделения стволовой клетки, выведенную на экран 16.

Когда нажата кнопка окончания разделения стволовой клетки, компьютер 11 выводит на экран 16 седьмое пошаговое экранное окно (не показано). Седьмое пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения стволовой клетки, кнопку второго сбора стволовой клетки, кнопку третьего наблюдения за стволовой клеткой, кнопку четвертого наблюдения за стволовой клеткой и кнопку первого выделения жидкого культурального продукта.

Ответственные нажимают кнопку второго сбора стволовой клетки на седьмом пошаговом экранном окне, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код стеклянной тестовой пробирки 29. Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16, с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, на экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения стволовой клетки, сообщение о том, что идет этап второго сбора стволовой клетки и кнопка окончания второго сбора стволовой клетки. Если эти данные донора не совпадают, компьютер 11 выводит сообщение об ошибке и сообщение об отмене культивирования на экран 16.

Ответственные собирают вторую мезенхимальную стволовую клетку 30, находящуюся в нижнем слое (самом нижнем слое) первой мезенхимальной стволовой клетки 26, разделенной на слои в стеклянной тестовой пробирке 29 (этап второго сбора стволовой клетки). Ответственные собирают (отсасывают) с использованием шприца вторую мезенхимальную стволовую клетку 30, находящуюся в нижнем слое (самом нижнем слое) первой мезенхимальной стволовой клетки 26, разделенной на слои. Альтернативно, ответственные собирают (отсасывают) вторую мезенхимальную стволовую клетку 30, находящуюся в нижнем слое (самом нижнем слое) первой мезенхимальной стволовой клетки 26, разделенной на слои, с использованием пипетки.

Способом изготовления жидкого культурального продукта разделяют путем центрифугирования первую мезенхимальную стволовую клетку 26, содержащую ненужную стволовую клетку, при помощи центрифужного сепаратора 28 для вертикального разделения на слои и собирают вторую мезенхимальную стволовую клетку 30, находящуюся в нижнем слое (самом нижнем слое) стволовой клетки 26, разделенной путем центрифугирования на слои, тем самым, несомненно собирая конкретную вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 из стволовой клетки 26 и удаляя ненужную мезенхимальную стволовую клетку из стволовой клетки 26.

Способом изготовления жидкого культурального продукта постепенно снижают активность стволовой клетки 26, когда общая площадь первой мезенхимальной стволовой клетки 26 по отношению к площади нижней поверхности первого плоского культурального контейнера 24 (первого культурального контейнера) превышает 80% для пролиферации стволовой клетки 26, и собирают стволовую клетку 26 из культурального контейнера 24, когда общая площадь стволовой клетки 26 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 24 увеличивается от 70 до 80% для пролиферации, таким образом, поддерживая активность стволовой клетки 26, таким образом, размножая стволовую клетку 26, и собирают вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 с указанной активностью из стволовой клетки 26.

ФИГ. 12 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий один из примеров этапа третьего наблюдения за стволовой клеткой, содержащейся в устройствах для второго прикрепления, и ФИГ. 13 представляет собой вид сбоку второго плоского культурального. ФИГ. 14 представляет собой частично увеличенный вид, иллюстрирующий один из примеров формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, и ФИГ. 15 представляет собой частично увеличенный вид, иллюстрирующий другой пример формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30. ФИГ. 14 и 15 представляют собой увеличенные виды, иллюстрирующие формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30 при помощи изображения, полученного электронным микроскопом 13.

После этапа второго сбора стволовой клетки для сбора конкретной второй мезенхимальной стволовой клетки 30, находящуюся в нижнем слое (самом нижнем слое), из первой мезенхимальной стволовой клетки 26 следует этап третьего наблюдения за стволовой клеткой и этап второго прикрепления стволовой клетки. На этапе третьего наблюдения за стволовой клеткой и этапе второго прикрепления стволовой клетки, вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 и культуральную жидкость 23 загружают (помещают) во второй плоский культуральный контейнер 25 (второй культуральный контейнер), и оставляют культуральный контейнер 25 в статическом состоянии (статически без движения) при температуре, приблизительно равной температуре тела (приблизительно от 36 до 37^°C) в течении от 36 до 48 часов.

Деформацию второй мезенхимальной стволовой клетки 30 (второй стволовой клетки) от начальной формы поверхности в культуральном контейнере 25, за счет нахождения культурального контейнера 25 в статическом состоянии в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов, наблюдают при помощи электронного микроскопа 13, и определяют, прикрепилась ли стволовая клетка 30 ко дну 27 культурального контейнера 25. Ко дну 27 (внешняя поверхность нижней стенки) культурального контейнера 25, в который загружают вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 и культуральную жидкость 23, прикрепляют бумагу с первым кодом 17, на которой напечатан QR-код для идентификации донора.

Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, после сбора конкретной второй мезенхимальной стволовой клетки 30 из первой мезенхимальной стволовой клетки 26, нажимают кнопку окончания второго сбора стволовой клетки, выведенную на экран 16. Когда нажата кнопка окончания второго сбора стволовой клетки, компьютер 11 выводит на экран 16 восьмое пошаговое экранное окно (не показано). Восьмое пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения стволовой клетки, сообщение об окончании второго сбора стволовой клетки, кнопку третьего наблюдения за стволовой клеткой, кнопку четвертого наблюдения за стволовой клеткой и кнопку первого выделения жидкого культурального продукта.

Ответственные прикрепляют бумагу с первым кодом 17, на которой напечатан QR-код, ко дну 27 второго плоского культурального контейнера 25 (внешняя поверхность нижней стенки). Затем, ответственные нажимают кнопку третьего наблюдения за стволовой клеткой на восьмом пошаговом экранном окне, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код культурального контейнера 25. Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16, с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, на экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения стволовой клетки, сообщение об окончании второго сбора стволовой клетки, сообщение о том, что идет этап третьего наблюдения за стволовой клеткой и кнопка окончания третьего наблюдения за стволовой клеткой. Если эти данные донора не совпадают, компьютер 11 выводит сообщение об ошибке и сообщение об отмене культивирования на экран 16.

Ответственные загружают (помещают) вторую мезенхимальную стволовую клетку 30, отобранную в шприц или пипетку, в культуральный контейнер 25, и загружают (помещают) культуральную жидкость 23 в культуральный контейнер 25. Второй плоский культуральный контейнер 25 (второй культуральный контейнер) сделан из прозрачного стекла или прозрачного пластика, и является плоским контейнером, чья форма поверхности является приблизительно прямоугольной, с предопределенной емкостью и дном 27 предопределенной площади; и площадь дна 27 приблизительно вдвое больше, чем у первого плоского культурального контейнера 24 (первого культурального контейнера). Второй плоский культуральный контейнер 25 включает верхнюю часть 43, нижнюю часть 44, и отверстие для заполнения 45, расположенное на верхней части 43. Отверстие для заполнения 45 герметизируют водонепроницаемой крышкой 46. Второй плоский культуральный контейнер 25 может быть плоским контейнером, чья форма поверхности является круглой или овальной, с предопределенной емкостью и дном 27 предопределенной площади.

Второй плоский культуральный контейнер 25 (второй культуральный контейнер), который используют на этапе третьего наблюдения за стволовой клеткой, имеет емкость приблизительно от 40 до 60 см³ (предпочтительно 50 см³) и площадь нижней поверхности приблизительно от 50 до 72 мм². Культуральный контейнер 25 имеет длину стороны приблизительно от 7 до 8,5 мм. Культуральная жидкость 23 является такой же жидкостью, которую вводили на этапе первого наблюдения за стволовой клеткой. Вторая мезенхимальная стволовая клетка 30, загруженная в культуральный контейнер 25, прикрепляется ко дну 27 культурального контейнера 25 с течением времени, культивируется при помощи культуральной жидкости 23, и постепенно пролиферирует (дифференцируется) на дне 27 культурального контейнера 25 с образованием колонии.

Ответственные, после заполнения второй мезенхимальной стволовой клеткой 30 и культуральной жидкостью 23 второго плоского культурального контейнера 25, устанавливают (помещают) культуральный контейнер 25 в держатель для образцов 36 электронного микроскопа 13. Прокладка 39 расположена между верхней поверхностью 37 держателя для образцов 36 электронного микроскопа 13 и нижней частью 44 второго плоского культурального контейнера 24 таким образом, чтобы поддерживать нижнюю часть 38 культурального контейнера 25, поднятую прокладкой 39, позволяя нижней части 38 культурального контейнера 25 и верхней части 43 (отверстию для заполнения 45) культурального контейнера 25 оставаться в верхнем и нижнем положениях, соответственно, и поддерживать культуральный контейнер 25 при предопределенном угле наклона. Также, прокладка 39 может быть расположена между верхней поверхностью 37 держателя для образцов 36 электронного микроскопа 13 и верхней частью 43 второго плоского культурального контейнера 25 таким образом, чтобы поддерживать верхнюю часть 43 культурального контейнера 25, поднятую прокладкой 39, позволяя верхней части 43 культурального контейнера 25 и нижней части 44 культурального контейнера 25 оставаться в верхнем и нижнем положениях, соответственно, и поддерживать культуральный контейнер 25 при предопределенном угле наклона. Угол наклона α2 второго плоского культурального контейнера 25 по отношению к верхней поверхности 37 держателя для образцов 36 находится в диапазоне от 2 до 5°, предпочтительно от 2 до 3°.

Способом изготовления жидкого культурального продукта располагают второй плоский культуральный контейнер 24 по отношению к верхней поверхности 37 держателя для образцов 36 с углом наклона, таким образом, позволяя второй мезенхимальной стволовой клетке 30 и культуральной жидкости 23 в культуральном контейнере 25 наклоняться в сторону верхней части 43 культурального контейнера 25 (или в сторону нижней части 44), увеличивая водное давление второй мезенхимальной стволовой клетки 30 и культуральной жидкости 23 на стороне верхней части 43 культурального контейнера 25 (или на стороне нижней части 44), позволяя второй мезенхимальной стволовой клетке 30 скапливаться на стороне нижней части 44 культурального контейнера 25, и, таким образом, повышая активность вторых мезенхимальных стволовых клеток 30 в отношении быстрого и легкого прикрепления второй мезенхимальной стволовой клетки 30 ко дну 27 культурального контейнера 25.

Электронный микроскоп 13 создает изображение увеличенного вида формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, загруженной в культуральный контейнер 25, в интервале приблизительно от 1 до 2 часов, и передает увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 30, для которой получают изображение, на компьютер 11 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов. Компьютер 11 загружает увеличенный вид формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, переданный с электронного микроскопа 13 и время получения изображения в память, таким образом, чтобы они были связаны с идентификатором донора (этап первой загрузки изображения стволовых клеток). Компьютер 11 выводит на экран 16 увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 30, переданный с электронного микроскопа 13 и время получения изображения. Ответственные подтверждают (визуально распознают) увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 30, выведенный на экран 16, в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов, и наблюдают изменения формы поверхности стволовой клетки 30 (этап третьего наблюдения за стволовой клеткой). Ответственные могут непосредственно наблюдать изменения формы поверхности стволовой клетки 30 через окошко для наблюдений электронного микроскопа 13 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов.

Начальная форма поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30 приблизительно представляет собой круглую форму, и когда форма поверхности стволовой клетки 30 приблизительно представляет собой круглую форму, стволовая клетка 30 не прикрепляется ко дну 27 культурального контейнера 25 (внутренней поверхности нижней стенки), что не позволяет стволовой клетке 30 начать пролиферацию (дифференцировку). Форма поверхности деформированной второй мезенхимальной стволовой клетки 30 является сначала приблизительно круглой до прикрепления, и плоской формой, когда стволовая клетка 30 удлиняется (расширяется) в аморфную форму в одном направлении (предопределенном направлении), таким образом, прикрепляя стволовую клетку 30 ко дну 27 культурального контейнера 25 (внутренней поверхности нижней стенки) и давая возможность стволовой клетке 30 начать пролиферацию (дифференцировку).

Ответственные, в соответствии с наблюдением на этапе третьего наблюдения за стволовой клеткой, как показано на ФИГ. 12, когда увеличенный вид формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, выведенный на экран 16, остается при наблюдении приблизительно круглой формы, определяют, что стволовая клетка 30 не прикрепилась ко дну 27 культурального контейнера 25 (внутренней поверхности нижней стенки), и постоянно наблюдают за изменениями формы поверхности стволовой клетки 30 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов. Ответственные, в соответствии с наблюдением на этапе третьего наблюдения за стволовой клеткой, как показано на ФИГ. 13, когда форма поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, выведенная на экран 16, деформируется приблизительно от круглой до приблизительно, в основном, круглой и аморфной плоской формы, определяют, что стволовая клетка 30 прикрепилась ко дну 27 культурального контейнера 25 (этап второго прикрепления стволовой клетки).

Использование большого культурального контейнера, емкость которого превышает 60 см³ и площадь нижней поверхности превышает 72 мм², для прикрепления второй мезенхимальной стволовой клетки 30 не позволяет стволовой клетке 30 легко прикрепиться к нижней поверхности контейнера и замедляет пролиферацию стволовой клетки 30, но способом изготовления жидкого культурального продукта с использованием второго плоского культурального контейнера 25 с указанной емкостью и площадью нижней поверхности, можно легко прикреплять стволовую клетку 30 ко дну 27 культурального контейнера 25 и сразу же размножать стволовую клетку 30 в культуральном контейнере 25.

Способ изготовления жидкого культурального продукта позволяет оставлять культуральный контейнер 25 в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, в течение периода от 36 до 48 часов, и наблюдать деформацию второй мезенхимальной стволовой клетки 30 от начальной формы поверхности в культуральном контейнере 25 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 36 до 48 часов, тем самым, никогда не ошибаясь в подтверждении прикрепления стволовой клетки 30 и надлежащим образом подтверждая прикрепление стволовой клетки 30 ко дну 27 культурального контейнера 25.

ФИГ. 16 представляет собой частично увеличенный вид, иллюстрирующий другой пример формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, и ФИГ. 17 представляет собой чертеж, иллюстрирующий один из примеров хранения выделенного жидкого культурального продукта и сохраненной второй мезенхимальной стволовой клетки. ФИГ. 16 представляет собой увеличенный вид, иллюстрирующий форму поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, полученный при помощи электронного микроскопа 13. В соответствии с наблюдением на этапе третьего наблюдения за стволовой клеткой, вторая мезенхимальная стволовая клетка 30 (вторая стволовая клетка) деформируется от приблизительно круглой (исходной формы поверхности) до приблизительно, в основном, круглой и аморфной плоской формы, и после этапа третьего наблюдения за стволовой клеткой для подтверждения прикрепления стволовой клетки 30 ко дну 27 второго плоского культурального контейнера 25 (второго культурального контейнера) следует этап второго культивирования стволовой клетки и этап четвертого наблюдения за стволовой клеткой.

На этапе второго культивирования стволовой клетки и этапе четвертого наблюдения за стволовой клеткой, культуральную жидкость 23, загруженную в культуральный контейнер 25, удаляют (убирают) из культурального контейнера 25, и заполняют (загружают) культуральный контейнер 25 новой культуральной жидкостью 23. Культуральный контейнер 25 оставляют в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела (приблизительно от 36 до 37^°C), в течение от 36 до 48 часов (статически без движения), и культивируют вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 в культуральном контейнере 25 (этап второго культивирования стволовой клетки).

Общую площадь второй мезенхимальной стволовой клетки 30, прикрепленной ко дну 27 культурального контейнера 25, за счет оставления культурального контейнера 25 в статическом состоянии в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов, по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 25, наблюдают при помощи электронного микроскопа 13, и определяют, достигла ли общая площадь стволовой клетки 30 второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 25. Второе целевое соотношение общей площади второй мезенхимальной стволовой клетки 30 составляет от 88 до 92% от площади нижней поверхности культурального контейнера 25 (от 88 до 92% конфлюэнтности).

Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, после подтверждения прикрепления второй мезенхимальной стволовой клетки 30 ко дну 27 культурального контейнера 25, нажимают кнопку окончания третьего наблюдения за стволовой клеткой, выведенную на экран 16. Когда нажата кнопка окончания третьего наблюдения за стволовой клеткой, компьютер 11 выводит на экран 16 восьмое пошаговое экранное окно (не показано). Восьмое пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения стволовой клетки, сообщение об окончании второго сбора стволовой клетки, сообщение об окончании третьего наблюдения за стволовой клеткой, кнопку четвертого наблюдения за стволовой клеткой и кнопку первого выделения жидкого культурального продукта.

Ответственные нажимают кнопку четвертого наблюдения за стволовой клеткой на восьмом пошаговом экранном окне, удаляют культуральный контейнер 25 из держателя для образцов электронного микроскопа 16, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код культурального контейнера 25. Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16, с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, на экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения стволовой клетки, сообщение об окончании второго сбора стволовой клетки, сообщение об окончании третьего наблюдения за стволовой клеткой, сообщение о том, что идет процесс четвертого наблюдения за стволовой клеткой и кнопку окончания четвертого наблюдения за стволовой клеткой. Если эти данные донора не совпадают, компьютер 11 выводит сообщение об ошибке и сообщение об отмене культивирования на экран 16.

Ответственные удаляют (убирают) из культурального контейнера 25 культуральную жидкость 23, загруженную в культуральный контейнер 25 на этапе второго наблюдения за стволовой клеткой и этапе четвертого наблюдения за стволовой клеткой, и заполняют (загружают) культуральный контейнер 25 новой культуральной жидкостью 23. Новая культуральная жидкость 23 является такой же, какая была загружена на этапе первого наблюдения за стволовой клеткой. Ответственные заполняют новой культуральной жидкостью 23 культуральный контейнер 25, а затем устанавливают (помещают) культуральный контейнер 25 в держатель для образцов электронного микроскопа 13. Прокладка 39 расположена между верхней поверхностью 37 держателя для образцов 36 электронного микроскопа 13 и нижней частью 44 второго плоского культурального контейнера 25 таким образом, чтобы поддерживать нижнюю часть 44 культурального контейнера 25, поднятую прокладкой 39, позволяя нижней части 44 культурального контейнера 24 и верхней части 43 (отверстию для заполнения 41) культурального контейнера 25 оставаться в верхнем и нижнем положениях, соответственно, и поддерживать культуральный контейнер 25 при предопределенном угле наклона. Также, прокладка 39 может быть расположена между верхней поверхностью 37 держателя для образцов 36 электронного микроскопа 13 и верхней частью 43 второго плоского культурального контейнера 25 таким образом, чтобы поддерживать верхнюю часть 43 культурального контейнера 25, поднятую прокладкой 39, позволяя верхней части 43 культурального контейнера 25 и нижней части 44 культурального контейнера 25 оставаться в верхнем и нижнем положениях, соответственно, и поддерживать культуральный контейнер 25 при предопределенном угле наклона. Угол наклона α2 второго плоского культурального контейнера 25 по отношению к верхней поверхности 37 держателя для образцов 36 находится в диапазоне от 2 до 5°, предпочтительно от 2 до 3°.

Способом изготовления жидкого культурального продукта подтверждают прикрепление второй мезенхимальной стволовой клетки 30, затем удаляют культуральную жидкость 23 из культурального контейнера 25, и заполняют новой культуральной жидкостью 23 культуральный контейнер 25, таким образом, несомненно стимулируя пролиферацию второй мезенхимальной стволовой клетки 30. Способом изготовления жидкого культурального продукта располагают второй плоский культуральный контейнер 25 по отношению к верхней поверхности 37 держателя для образцов 36 с углом наклона, таким образом, позволяя второй мезенхимальной стволовой клетке 30 и культуральной жидкости 23 в культуральном контейнере 25 наклоняться в сторону верхней части 43 культурального контейнера 25 (или в сторону нижней части 44), увеличивая водное давление второй мезенхимальной стволовой клетки 30 и культуральной жидкости 23 на стороне верхней части 43 культурального контейнера 25 (или на стороне нижней части 44), позволяя второй мезенхимальной стволовой клетке 36 скапливаться на стороне нижней части 44 культурального контейнера 25, и, таким образом, повышая активность вторых мезенхимальных стволовых клеток 30 для быстрой и легкой пролиферации (дифференцировки) второй мезенхимальной стволовой клетки 30 на дне 27 культурального контейнера 25.

Электронный микроскоп 13 создает изображение увеличенного вида формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30 в культуральном контейнере 24, в интервале приблизительно от 1 до 2 часов, и передает увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 30, для которой получают изображение, на компьютер 11 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов. Компьютер 11 загружает увеличенный вид формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, переданный с электронного микроскопа 13 и время получения изображения в память, таким образом, чтобы они были связаны с идентификатором донора (этап второй загрузки изображения стволовых клеток). Компьютер 11 выводит на экран 16 увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 30, переданный с электронного микроскопа 13 и время получения изображения.

Ответственные подтверждают (визуально распознают) увеличенный вид формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, выведенный на экран 16 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов, наблюдают общую площадь стволовой клетки 30, прикрепленной ко дну 27 культурального контейнера 25 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 25, и определяют, достигла ли общая площадь стволовой клетки 30 второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 25 (от 82 до 92% конфлюэнтности) (этап четвертого наблюдения за стволовой клеткой). Ответственные могут непосредственно наблюдать общую площадь второй мезенхимальной стволовой клетки 30 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 25 через окошко для наблюдений электронного микроскопа 13 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов и определять, достигла ли общая площадь стволовой клетки 30 второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 25 (от 88 до 92% конфлюэнтности).

Ответственные, в соответствии с наблюдением на этапе четвертого наблюдения за стволовой клеткой, как показано на ФИГ. 13, если общая площадь второй мезенхимальной стволовой клетки 30, выведенная на экран 16, не достигает второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 25 (от 88 до 92% конфлюэнтности), постоянно наблюдают общую площадь стволовой клетки 30 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 25 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов. Если общая площадь второй мезенхимальной стволовой клетки 30 достигает второго целевого соотношения со всей площадью увеличенного вида, выведенного на экран 16, определяют, что общая площадь стволовой клетки 30 достигла второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 25.

Ответственные, в соответствии с наблюдением на этапе четвертого наблюдения за стволовой клеткой, позволяют второй мезенхимальной стволовой клетке 30 пролиферировать на дне 27 (внутренняя поверхность нижней стенки) культурального контейнера 25, образуя колонию и удлиняя свою форму поверхности, и как показано на ФИГ. 14, когда общая площадь стволовой клетки 30, выведенной на экран 16, достигает второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 25 (от 88 до 92% конфлюэнтности), единственный тип второй мезенхимальной стволовой клетки 30 пролиферирует в культуральном контейнере 25, и производится жидкий культуральный продукт 31, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый из единственного типа стволовой клетки 30 с указанной активностью.

Cпособом получения жидкого культурального продукта постепенно снижают активность стволовой клетки 30, когда общая площадь второй мезенхимальной стволовой клетки 30 по отношению к площади нижней поверхности второго плоского культурального контейнера 25 (второго культурального контейнера) превышает 92% для пролиферации стволовой клетки 30, и выделяют стволовую клетку 30 из культурального контейнера 25, когда общая площадь стволовой клетки 30 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 25 повышается от 88 до 92% для пролиферации, таким образом, поддерживая активность стволовой клетки 30, и таким образом, размножая стволовую клетку 30.

Когда общая площадь стволовой клетки 30 достигает второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 25, наступает этап первого выделения жидкого культурального продукта для выделения жидкого культурального продукта 31 из культурального контейнера 25. На этапе первого выделения жидкого культурального продукта, из культурального контейнера 25 выделяют жидкий культуральный продукт 31, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый активной второй мезенхимальной стволовой клеткой 30. Способом изготовления жидкого культурального продукта наблюдают общую площадь в интервале приблизительно от 1 до 2 часов для надлежащего подтверждения общей площади второй мезенхимальной стволовой клетки 30 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 25, тем самым убедительно подтверждая, что общая площадь стволовой клетки 30 достигает второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 25.

Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, после подтверждения того, что общая площадь второй мезенхимальной стволовой клетки 30 достигла второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 25, нажимают кнопку окончания четвертого наблюдения за стволовой клеткой, выведенную на экран 16. Когда нажата кнопка окончания четвертого наблюдения за стволовой клеткой, компьютер 11 выводит на экран 16 девятое пошаговое экранное окно (не показано). Девятое пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения стволовой клетки, сообщение об окончании второго сбора стволовой клетки, сообщение об окончании третьего наблюдения за стволовой клеткой, сообщение об окончании четвертого наблюдения за стволовой клеткой и кнопку первого выделения жидкого культурального продукта.

Ответственные нажимают кнопку первого выделения жидкого культурального продукта на девятом пошаговом экранном окне, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код культурального контейнера 25. Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16, с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, на экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения стволовой клетки, сообщение об окончании второго сбора стволовой клетки, сообщение об окончании третьего наблюдения за стволовой клеткой, сообщение об окончании четвертого наблюдения за стволовой клеткой, сообщение о том, что идет процесс первого выделения жидкого культурального продукта и кнопку окончания первого выделения жидкого культурального продукта. Если эти данные донора не совпадают, компьютер 11 выводит сообщение об ошибке и сообщение об отмене культивирования на экран 16.

Ответственные на этапе четвертого наблюдения за стволовой клеткой, отсасывают из культурального контейнера 25 жидкий культуральный продукт 31, преобразованный из культуральной жидкости 23, загруженной в культуральный контейнер 25, с использованием шприца или пипетки (этап первого выделения жидкого культурального продукта), и загружают (помещают) жидкий культуральный продукт 31 в контейнер для хранения 32. Жидкий культуральный продукт 31, загруженный в контейнер для хранения 32, представляет собой жидкий культуральный продукт 31, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый одним конкретным типом мезенхимальной стволовой клетки (единственным типом стволовой клетки), проявляющей активность, из которого удалена ненужная мезенхимальная стволовая клетка.

Ответственные загружают жидкий культуральный продукт 31 в контейнер для хранения 32, а затем прикрепляют бумагу с первым кодом 17, на которой напечатан QR-код, к внешней периферийной поверхности контейнера для хранения 32. Ответственные нажимают кнопку окончания первого выделения жидкого культурального продукта на девятом пошаговом экранном окне, выведенном на экран 16, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код контейнера для хранения 32, а затем помещают контейнер для хранения 32, в который загружен жидкий культуральный продукт 31, в холодильник 34. Жидкий культуральный продукт 31 хранят в холодильнике 34 при температуре приблизительно от 3 до 4^°C.

Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16, с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, на экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании разделения стволовой клетки, сообщение об окончании второго сбора стволовой клетки, сообщение об окончании третьего наблюдения за стволовой клеткой, сообщение об окончании четвертого наблюдения за стволовой клеткой, сообщение об окончании выделения жидкого культурального продукта, кнопку окончания получения жидкого культурального продукта и кнопку продолжения получения жидкого культурального продукта. Когда получение жидкого культурального продукта завершено, нажимают кнопку окончания получения жидкого культурального продукта. Кнопку окончания получения жидкого культурального продукта нажимают для остановки системы 10 на компьютере 11.

Когда нажимают кнопку окончания получения жидкого культурального продукта, наступает этап сбора стволовой клетки для сбора стволовой клетки 30 из культурального контейнера 25. На этапе сбора стволовой клетки, вторую мезенхимальную стволовую клетка 30, пролиферировавшую (дифференцированную) в культуральном контейнере 25, собирают из культурального контейнера 25. После промывания культурального контейнера 25 при помощи PBS, вводят раствор трипсина в культуральный контейнер 25. Когда раствор трипсина вводят в культуральный контейнер 25, вторая мезенхимальная стволовая клетка 30, прикрепленная ко дну 27 культурального контейнера 25, отслаивается раствором трипсина от дна 27, плавая на поверхности раствора трипсина. Ответственные отсасывают вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 с использованием шприца или пипетки, и загружают (помещают) стволовую клетку 30 в контейнер для хранения 33 из шприца или пипетки.

Вторая мезенхимальная стволовая клетка 30, загруженная в контейнер для хранения 33, представляет собой один конкретный тип мезенхимальной стволовой клетки (единственный тип стволовой клетки), проявляющей активность, при которой ненужная мезенхимальная стволовая клетка удалена. Ответственные загружают вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 (единственный тип мезенхимальной стволовой клетки) в контейнер для хранения 33, затем прикрепляют бумагу с первым кодом 17, на которой напечатан QR-код, к внешней периферийной поверхности контейнера для хранения 33, и помещают контейнер для хранения 33, в который загружена вторая мезенхимальная стволовая клетка 30, в холодильник 34. Вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 (единственный тип мезенхимальной стволовой клетки) хранят в холодильнике 34 при температуре приблизительно от 3 до 4^°C.

Способом изготовления жидкого культурального продукта выделяют костно-мозговую жидкость промежуточного слоя, расположенную в промежуточном слое костно-мозговой жидкости, разделенной на слои, культивируют костно-мозговую жидкость промежуточного слоя вместе с культуральной жидкостью 23, прикрепляют первую мезенхимальную стволовую клетку 26 ко дну 27 первого культурального контейнера 24, собирают стволовую клетку 26 из культурального контейнера 24, когда общая площадь стволовой клетки 26 достигает первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 24 с одновременным культивированием стволовой клетки 26, собирают вторую мезенхимальную стволовую клетку 30, расположенную в нижнем слое (самом нижнем слое) стволовой клетки 26, разделенной на слои, прикрепляют стволовую клетку 30 к нижней поверхности 27 второго культурального контейнера 25, загружают новую культуральную жидкость 23 в культуральный контейнер 25, культивируют стволовую клетку 30 вместе с культуральной жидкостью 23, и выделяют из культурального контейнера 25 жидкий культуральный продукт 31, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый из единственного типа пролиферирующей стволовой клетки 30, когда общая площадь стволовой клетки 30 достигает второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 25 в процессе культивирования стволовой клетки 30, таким образом, при использовании одного типа культивируемой активной второй стволовой клетки 30 присутствуют не различные типы метаболитов, секретируемые различными типами стволовых клеток, а только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом стволовой клетки 30, проявляющей активность, и можно производить жидкий культуральный продукт 31, способный обеспечивать только специфический эффект на предопределенные заболевания и предопределенные косметические применения, такие как уход за кожей, уход за волосами и уход за телом, можно производить жидкий культуральный продукт 31, способный эффективно использоваться для лечения предопределенных заболеваний, и можно производить жидкий культуральный продукт 31, способный эффективно использоваться для предопределенных косметических применений.

Способом изготовления жидкого культурального продукта можно производить жидкий культуральный продукт 31 с использованием чистой (очищенной) второй мезенхимальной стволовой клетки 30 (второй стволовой клетки), полученной путем удаления ненужной стволовой клетки, что позволяет жидкому культуральному продукту 31 содержать только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом второй стволовой клетки, таким образом, обеспечивая достоверный эффект лечения предопределенных заболеваний и производя жидкий культуральный продукт 31, эффективный для лечения таких заболеваний, и делая возможным производство жидкого культурального продукта 31 с достоверным эффектом на предопределенные косметические применения. Жидкий культуральный продукт 31, произведенный при помощи способа для получения жидкого культурального продукта можно использовать для лечения кожных заболеваний, таких как ожоги и экзема, путем нанесения на кожу, использовать в качестве глазнх капель путем закапывания в глаз, можно использовать при лечении сенной лихорадки путем закапывания в нос, и можно использовать при лечении заболеваний кожи головы путем нанесения на кожу головы. Также, жидкий культуральный продукт 31 можно использовать для лечения огрубевшей кожи, прыщей и загара, и можно использовать для косметических применений, таких как отбеливание кожи и удаление морщин.

ФИГ. 18 представляет собой пояснительный чертеж, иллюстрирующий один из примеров этапа пятого наблюдения за стволовой клеткой, и ФИГ. 19 представляет собой вид сбоку третьего плоского культурального контейнера. Когда непрерывно получают жидкий культуральный продукт, происходит этап второго сбора стволовой клетки для сбора второй мезенхимальной стволовой клетки 30, пролиферирующей (дифференцирующейся) в культуральном контейнере 25, из культурального контейнера 25. На этапе второго сбора стволовой клетки, вторую мезенхимальную стволовую клетку 30, пролиферирующую (дифференцирующуюся) в культуральном контейнере 25, собирают из культурального контейнера 25.

Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, нажимают кнопку продолжения получения жидкого культурального продукта, выведенную на экран 16. Когда нажата кнопка продолжения получения жидкого культурального продукта, компьютер 11 выводит на экран 16 десятое пошаговое экранное окно (не показано). Десятое пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также кнопку второго сбора стволовой клетки, кнопку пятого наблюдения за стволовой клеткой, кнопку шестого наблюдения за стволовой клеткой, и кнопку второго выделения жидкого культурального продукта.

Ответственные нажимают кнопку второго сбора стволовой клетки на десятом пошаговом экранном окне, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код культурального контейнера 25. Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16, с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, На экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение о том, что идет этап второго сбора стволовой клетки, кнопку окончания второго сбора стволовой клетки, кнопку пятого наблюдения за стволовой клеткой, кнопку шестого наблюдения за стволовой клеткой и кнопку второго выделения жидкого культурального продукта. Если эти данные донора не совпадают, компьютер 11 выводит сообщение об ошибке и сообщение об отмене культивирования на экран 16.

Ответственные, после промывания культурального контейнера 25 PBS, загружают раствор трипсина в культуральный контейнер 25, собирают (отсасывают) вторую мезенхимальную стволовую клетку 30, плавающую на поверхности раствора трипсина, с использованием шприца или пипетки, и хранят стволовую клетку 30 в шприце или пипетке (способы второго сбора стволовой клетки). Ответственные, после сбора стволовой клетки 30 из культурального контейнера 25, нажимают кнопку окончания второго сбора стволовой клетки. Когда нажата кнопка окончания второго сбора стволовой клетки, компьютер 11 показывает на экране 16 одиннадцатое пошаговое экранное окно (не показано). Одиннадцатое пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании второго сбора стволовой клетки, кнопку пятого наблюдения за стволовой клеткой, кнопку шестого наблюдения за стволовой клеткой и кнопку второго выделения жидкого культурального продукта.

После этапа второго сбора стволовой клетки для сбора второй мезенхимальной стволовой клетки 30 из культурального контейнера 25, следует этап пятого наблюдения за стволовой клеткой и этап третьего прикрепления стволовой клетки. На этапе пятого наблюдения за стволовой клеткой и этапе третьего прикрепления стволовой клетки, вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 и культуральную жидкость 23 загружают (помещают) в третий плоский культуральный контейнер 35 (третий культуральный контейнер), и оставляют культуральный контейнер 35 в статическом состоянии (статически без движения) при температуре, приблизительно равной температуре тела (приблизительно от 36 до 37^°C) в течении от 36 до 48 часов.

Деформацию второй мезенхимальной стволовой клетки 30 (второй стволовой клетки) от начальной формы поверхности в культуральном контейнере 35, за счет нахождения культурального контейнера 35 в статическом состоянии в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов, наблюдают при помощи электронного микроскопа 13, и определяют, прикрепилась ли стволовая клетка 30 ко дну 27 культурального контейнера 35. Ко дну 27 (внешняя поверхность нижней стенки) культурального контейнера 35, в который загружают вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 и культуральную жидкость 23, прикрепляют бумагу с первым кодом 17, на которой напечатан QR-код для идентификации донора.

Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, собирают вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 из культурального контейнера 35, а затем прикрепляют бумагу с первым кодом 17, на которой напечатан QR-код, ко дну 27 третьего плоского культурального контейнера 35 (внешняя поверхность нижней стенки). Затем, ответственные нажимают кнопку пятого наблюдения за стволовой клеткой на одиннадцатом пошаговом экранном окне, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код культурального контейнера 35. Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16, с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, На экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании второго сбора стволовой клетки, сообщение о том, что идет процесс пятого наблюдения за стволовой клеткой, кнопку шестого наблюдения за стволовой клеткой и кнопку второго выделения жидкого культурального продукта. Если эти данные донора не совпадают, компьютер 11 выводит сообщение об ошибке и сообщение об отмене культивирования на экран 16.

Ответственные загружают (переносят) вторую мезенхимальную стволовую клетку 30, отобранную в шприц или пипетку, в культуральный контейнер 35, и загружают (переносят) культуральную жидкость 23 в культуральный контейнер 35. Третий плоский культуральный контейнер 35 (третий культуральный контейнер) сделан из прозрачного стекла или прозрачного пластика, и является плоским контейнером, чья форма поверхности является приблизительно прямоугольной, с предопределенной емкостью и дном 27 предопределенной площади, и площадь дна 27 больше, чем у второго плоского культурального контейнера 25 (второго культурального контейнера). Третий плоский культуральный контейнер 35 включает верхнюю часть 47, нижнюю часть 48, и отверстие для заполнения 49, расположенное на верхней части 47. Отверстие для заполнения 49 герметизируют водонепроницаемой крышкой 50. Третий плоский культуральный контейнер 35 может быть плоским контейнером, чья форма поверхности является круглой или овальной, с предопределенной емкостью и дном 27 предопределенной площади.

Третий плоский культуральный контейнер 35 (третий культуральный контейнер), который используют на этапе пятого наблюдения за стволовой клеткой, имеет емкость приблизительно от 70 до 80 см³ (предпочтительно 75 см³) и площадь нижней поверхности приблизительно от 75 до 108 мм². Культуральный контейнер 35 имеет длину стороны приблизительно от 8,7 до 10,4 мм. Культуральная жидкость 23 является такой же жидкостью, которую вводили на этапе первого наблюдения за стволовой клеткой. Вторая мезенхимальная стволовая клетка 30, загруженная в культуральный контейнер 35, прикрепляется ко дну 27 культурального контейнера 35 с течением времени, культивируется при помощи культуральной жидкости 23, и постепенно пролиферирует (дифференцируется) на дне 27 культурального контейнера 35 с образованием колонии.

Ответственные, после заполнения второй мезенхимальной стволовой клеткой 30 и культуральной жидкостью 23 третьего плоского культурального контейнера 35, устанавливают (помещают) культуральный контейнер 35 в держатель для образцов 36 электронного микроскопа 13. Прокладка 39 расположена между верхней поверхностью 37 держателя для образцов 36 электронного микроскопа 13 и нижней частью 48 третьего плоского культурального контейнера 35 таким образом, чтобы поддерживать нижнюю часть 48 культурального контейнера 35, поднятую прокладкой 39, позволяя нижней части 48 культурального контейнера 35 и верхней части 47 (отверстию для заполнения 49) культурального контейнера 35 оставаться в верхнем и нижнем положениях, соответственно, и поддерживать культуральный контейнер 35 при предопределенном угле наклона. Также, прокладка 39 может быть расположена между верхней поверхностью 37 держателя для образцов 36 электронного микроскопа 13 и верхней частью 47 второго плоского культурального контейнера 35 таким образом, чтобы поддерживать верхнюю часть 47 культурального контейнера 35, поднятую прокладкой 39, позволяя верхней части 47 культурального контейнера 35 и нижней части 48 культурального контейнера 35 оставаться в верхнем и нижнем положениях, соответственно, и поддерживать культуральный контейнер 35 при предопределенном угле наклона. Угол наклона α2 третьего плоского культурального контейнера 35 по отношению к верхней поверхности 37 держателя для образцов 36 находится в диапазоне от 2 до 5°, предпочтительно от 2 до 3°.

Способом изготовления жидкого культурального продукта располагаю третий плоский культуральный контейнер 35 по отношению к верхней поверхности 37 держателя для образцов 36 с углом наклона, таким образом, позволяя второй мезенхимальной стволовой клетке 30 и культуральной жидкости 23 в культуральном контейнере 35 наклоняться в сторону верхней части 47 культурального контейнера 35 (или в сторону нижней части 48), увеличивая водное давление второй мезенхимальной стволовой клетки 30 и культуральной жидкости 23 на стороне верхней части 47 культурального контейнера 35 (или на стороне нижней части 48), позволяя второй мезенхимальной стволовой клетке 30 скапливаться на стороне нижней части 48 культурального контейнера 35, и, таким образом, повышая активность вторых мезенхимальных стволовых клеток 30 в отношении быстрого и легкого прикрепления второй мезенхимальной стволовой клетки 30 ко дну 27 культурального контейнера 35.

Электронный микроскоп 13 создает изображение увеличенного вида формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30 в культуральном контейнере 35, в интервале приблизительно от 1 до 2 часов, и передает увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 30, для которой получают изображение, на компьютер 11 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов. Компьютер 11 загружает увеличенный вид формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, переданный с электронного микроскопа 13 и время получения изображения в память, таким образом, чтобы они были связаны с идентификатором донора (этап пятой загрузки изображения стволовых клеток). Компьютер 11 выводит на экран 16 увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 30, переданный с электронного микроскопа 13 и время получения изображения.

Ответственные подтверждают (визуально распознают) увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 30, выведенный на экран 16, в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов, и наблюдают изменения формы поверхности стволовой клетки 30 (этап пятого наблюдения за стволовой клеткой). Ответственные могут непосредственно наблюдать изменения формы поверхности стволовой клетки 30 через окошко для наблюдений электронного микроскопа 13 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов.

Начальная форма поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30 приблизительно представляет собой приблизительно круглую форму, и когда форма поверхности стволовой клетки 30 приблизительно представляет собой приблизительно круглую форму, стволовая клетка 30 не прикрепляется ко дну 27 культурального контейнера 35 (внутренней поверхности нижней стенки), что не позволяет стволовой клетке 30 начать пролиферацию (дифференцировку). Форма поверхности деформированной второй мезенхимальной стволовой клетки 30 является сначала приблизительно круглой до прикрепления, и плоской формой, когда стволовая клетка 30 удлиняется (расширяется) в аморфную форму в одном направлении (предопределенном направлении), таким образом, прикрепляя стволовую клетку 30 ко дну 27 культурального контейнера 35 (внутренней поверхности нижней стенки) и давая возможность стволовой клетке 30 начать пролиферацию (дифференцировку).

Ответственные, в соответствии с наблюдением на этапе пятого наблюдения за стволовой клеткой, когда форма поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, выведенной на экран 16, остается при наблюдении приблизительно круглой формы (см. ФИГ. 12, цитируемую путем ссылки), определяют, что стволовая клетка 30 не прикрепилась ко дну 27 культурального контейнера 35 (внутренней поверхности нижней стенки), и постоянно наблюдают за изменениями формы поверхности стволовой клетки 30 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов. Ответственные, в соответствии с наблюдением на этапе пятого наблюдения за стволовой клеткой, когда форма поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, выведенная на экран 16, деформируется приблизительно от круглой до приблизительно, в основном, круглой и аморфной плоской формы (см. ФИГ. 13, цитируемую путем ссылки), определяют, что стволовая клетка 30 прикрепилась ко дну 27 культурального контейнера 35 (этап третьего прикрепления стволовой клетки).

Использование большого культурального контейнера, емкость которого превышает 80 см³ и площадь нижней поверхности превышает 108 мм², для прикрепления второй мезенхимальной стволовой клетки 30 не позволяет стволовой клетке 30 легко прикрепиться к нижней поверхности контейнера и замедляет пролиферацию стволовой клетки 30, но способ изготовления жидкого культурального продукта с использованием третьего плоского культурального контейнера 35 с указанной емкостью и площадью нижней поверхности, можно легко прикреплять стволовую клетку 30 ко дну 27 культурального контейнера 35 и сразу же размножать стволовую клетку 30 в культуральном контейнере 35.

Способ изготовления жидкого культурального продукта позволяет оставлять культуральный контейнер 35 в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, в течение периода от 36 до 48 часов, и наблюдать деформацию второй мезенхимальной стволовой клетки 30 от начальной формы поверхности в культуральном контейнере 35 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 36 до 48 часов, тем самым, никогда не ошибаясь в подтверждении прикрепления стволовой клетки 30 и надлежащим образом подтверждая прикрепление стволовой клетки 30 ко дну 27 культурального контейнера 35.

В соответствии с наблюдением на этапе пятого наблюдения за стволовой клеткой, вторая мезенхимальная стволовая клетка 30 (вторая стволовая клетка) деформируется от приблизительно круглой (исходной формы поверхности) до приблизительно, в основном, круглой и аморфной плоской формы, и после этапа пятого наблюдения за стволовой клеткой для подтверждения прикрепления стволовой клетки 30 ко дну 27 третьего плоского культурального контейнера 35 (третьего культурального контейнера) следует этап третьего культивирования стволовой клетки и этап шестого наблюдения за стволовой клеткой.

На этапе третьего культивирования стволовой клетки и этапе шестого наблюдения за стволовой клеткой, культуральную жидкость 23, загруженную в культуральный контейнер 35, удаляют (убирают) из культурального контейнера 35, и заполняют (загружают) культуральный контейнер 35 новой культуральной жидкостью 23. Культуральный контейнер 35 оставляют в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела (приблизительно от 36 до 37^°C), в течение от 36 до 48 часов (статически без движения), и культивируют вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 в культуральном контейнере 35 (этап третьего культивирования стволовой клетки). Общую площадь второй мезенхимальной стволовой клетки 30, прикрепленной ко дну 27 культурального контейнера 35, за счет оставления культурального контейнера 35 в статическом состоянии в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов, по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 35, наблюдают при помощи электронного микроскопа 13, и определяют, достигла ли общая площадь стволовой клетки 30 третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 35. Третье целевое соотношение общей площади второй мезенхимальной стволовой клетки 30 составляет от 88 до 92% от площади нижней поверхности культурального контейнера 35 (от 88 до 92% конфлюэнтности).

Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, после подтверждения прикрепления второй мезенхимальной стволовой клетки 30 ко дну 27 культурального контейнера 35, нажимают кнопку окончания пятого наблюдения за стволовой клеткой, выведенную на экран 16. Когда нажата кнопка окончания пятого наблюдения за стволовой клеткой, компьютер 11 выводит на экран 16 двенадцатое пошаговое экранное окно (не показано). Двенадцатое пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании второго сбора стволовой клетки, сообщение об окончании пятого наблюдения за стволовой клеткой, кнопку шестого наблюдения за стволовой клеткой и кнопку второго выделения жидкого культурального продукта.

Ответственные нажимают кнопку шестого наблюдения за стволовой клеткой на двенадцатом пошаговом экранном окне, удаляют культуральный контейнер 35 из держателя для образцов электронного микроскопа 16, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код культурального контейнера 35. Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16, с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, на экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании второго сбора стволовой клетки, сообщение об окончании пятого наблюдения за стволовой клеткой, сообщение о том, что идет процесс шестого наблюдения за стволовой клеткой, кнопку окончания шестого наблюдения за стволовой клеткой и кнопку второго выделения жидкого культурального продукта. Если эти данные донора не совпадают, компьютер 11 выводит сообщение об ошибке и сообщение об отмене культивирования на экран 16.

Ответственные удаляют (убирают) из культурального контейнера 35 культуральную жидкость 23, загруженную в культуральный контейнер 35 на этапе пятого наблюдения за стволовой клеткой, и заполняют (загружают) культуральный контейнер 35 новой культуральной жидкостью 23. Новая культуральная жидкость 23 является такой же, какая была загружена на этапе первого наблюдения за стволовой клеткой. Ответственные заполняют новой культуральной жидкостью 23 культуральный контейнер 35, а затем устанавливают (помещают) культуральный контейнер 35 в держатель для образцов электронного микроскопа 13.

Прокладка 39 расположена между верхней поверхностью 37 держателя для образцов 36 электронного микроскопа 13 и нижней частью 48 третьего плоского культурального контейнера 35 таким образом, чтобы поддерживать нижнюю часть 48 культурального контейнера 35, поднятую прокладкой 39, позволяя нижней части 48 культурального контейнера 35 и верхней части 47 (отверстию для заполнения 49) культурального контейнера 35 оставаться в верхнем и нижнем положениях, соответственно, и поддерживать культуральный контейнер 35 при предопределенном угле наклона. Также, прокладка 39 может быть расположена между верхней поверхностью 37 держателя для образцов 36 электронного микроскопа 13 и верхней частью 47 третьего плоского культурального контейнера 35 таким образом, чтобы поддерживать верхнюю часть 47 культурального контейнера 35, поднятую прокладкой 39, позволяя верхней части 47 культурального контейнера 35 и нижней части 48 культурального контейнера 35 оставаться в верхнем и нижнем положениях, соответственно, и поддерживать культуральный контейнер 35 при предопределенном угле наклона. Угол наклона α2 третьего плоского культурального контейнера 35 по отношению к верхней поверхности 37 держателя для образцов 36 находится в диапазоне от 2 до 5°, предпочтительно от 2 до 3°.

Способом изготовления жидкого культурального продукта подтверждают прикрепление второй мезенхимальной стволовой клетки 30, затем удаляют культуральную жидкость 23 из культурального контейнера 35, и заполняют новой культуральной жидкостью 23 культуральный контейнер 35, таким образом, несомненно стимулируя пролиферацию второй мезенхимальной стволовой клетки 30. Способом изготовления жидкого культурального продукта располагают третий плоский культуральный контейнер 35 по отношению к верхней поверхности 37 держателя для образцов 36 с углом наклона, таким образом, позволяя второй мезенхимальной стволовой клетке 30 и культуральной жидкости 23 в культуральном контейнере 35 наклоняться в сторону верхней части 47 культурального контейнера 35 (или в сторону нижней части 48), увеличивая водное давление второй мезенхимальной стволовой клетки 30 и культуральной жидкости 23 на стороне верхней части 47 культурального контейнера 35 (или на стороне нижней части 48), позволяя второй мезенхимальной стволовой клетке 30 скапливаться на стороне нижней части 48 культурального контейнера 35, и, таким образом, повышая активность вторых мезенхимальных стволовых клеток 30 для быстрой и легкой пролиферации (дифференцировки) второй мезенхимальной стволовой клетки 30 на дне 27 культурального контейнера 35.

Электронный микроскоп 13 создает изображение увеличенного вида формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30 в культуральном контейнере 35, в интервале приблизительно от 1 до 2 часов, и передает увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 30, для которой получают изображение, на компьютер 11 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов. Компьютер 11 загружает увеличенный вид формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, переданный с электронного микроскопа 13 и время получения изображения в память, таким образом, чтобы они были связаны с идентификатором донора (этап шестой загрузки изображения стволовых клеток). Компьютер 11 выводит на экран 16 увеличенный вид формы поверхности стволовой клетки 30, переданный с электронного микроскопа 13 и время получения изображения.

Ответственные подтверждают (визуально распознают) увеличенный вид формы поверхности второй мезенхимальной стволовой клетки 30, выведенный на экран 16 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов, наблюдают общую площадь стволовой клетки 30, прикрепленной ко дну 27 культурального контейнера 35 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 35, и определяют, достигла ли общая площадь стволовой клетки 30 третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 35 (от 82 до 92% конфлюэнтности) (этап шестого наблюдения за стволовой клеткой). Ответственные могут непосредственно наблюдать общую площадь второй мезенхимальной стволовой клетки 30 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 35 через окошко для наблюдений электронного микроскопа 13 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение от 36 до 48 часов и определять, достигла ли общая площадь стволовой клетки 30 третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 35 (от 88 до 92% конфлюэнтности).

Ответственные, в соответствии с наблюдением на этапе шестого наблюдения за стволовой клеткой, как показано на ФИГ. 13, если общая площадь второй мезенхимальной стволовой клетки 30, выведенная на экран 16, не достигает третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 35 (от 88 до 92% конфлюэнтности), постоянно наблюдают общую площадь стволовой клетки 30 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 35 в интервале приблизительно от 1 до 2 часов (см. ФИГ. 13, цитируемую путем ссылки). Если общая площадь второй мезенхимальной стволовой клетки 30 достигает третьего целевого соотношения со всей площадью увеличенного вида, выведенного на экран 16, определяют, что общая площадь стволовой клетки 30 достигает третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 35.

В соответствии с наблюдением на этапе шестого наблюдения за стволовой клеткой, вторая мезенхимальная стволовая клетка 30 размножается на дне 27 (внутренняя поверхность нижней стенки) третьего культурального контейнера 35, образуя колонию и удлиняя свою форму поверхности, и когда общая площадь стволовой клетки 30, выведенной на экран 16, достигает третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 35 (от 88 до 92% конфлюэнтности) (см. ФИГ. 14, цитируемую посредством ссылки), единственный тип второй мезенхимальной стволовой клетки 30 пролиферирует в культуральном контейнере 35, и производится жидкий культуральный продукт 31, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом стволовой клетки 30, проявляющей активность.

Cпособом получения жидкого культурального продукта постепенно снижают активность стволовой клетки 30, когда общая площадь второй мезенхимальной стволовой клетки 30 по отношению к площади нижней поверхности третьего плоского культурального контейнера 35 (третьего культурального контейнера) превышает 92%, для пролиферации стволовой клетки 30, и выделяют стволовую клетку 30 из культурального контейнера 35, когда общая площадь стволовой клетки 30 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 35 повышается от 88 до 92% для пролиферации, таким образом, поддерживая активность стволовой клетки 30, и таким образом, размножая стволовую клетку 30.

Когда общая площадь стволовой клетки 30 достигает третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 35, наступает этап второго выделения жидкого культурального продукта для выделения жидкого культурального продукта 31 из культурального контейнера 35. На этапе второго выделения жидкого культурального продукта, из культурального контейнера 35 выделяют жидкий культуральный продукт 31, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый второй мезенхимальной стволовой клеткой 30 с указанной активностью. Способом изготовления жидкого культурального продукта наблюдают общую площадь в интервале приблизительно от 1 до 2 часов для надлежащего подтверждения общей площади второй мезенхимальной стволовой клетки 30 по отношению к площади нижней поверхности культурального контейнера 35, тем самым убедительно подтверждая, что общая площадь стволовой клетки 30 достигает третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 35.

Ответственные, такие как доктора, медицинские сестры и исследователи, после подтверждения того, что общая площадь второй мезенхимальной стволовой клетки 30 достигла третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 35, нажимают кнопку окончания шестого наблюдения за стволовой клеткой, выведенную на экран 16. Когда нажата кнопка окончания шестого наблюдения за стволовой клеткой, компьютер 11 выводит на экран 16 тринадцатое пошаговое экранное окно (не показано). Тринадцатое пошаговое экранное окно показывает NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании второго сбора стволовой клетки, сообщение об окончании пятого наблюдения за стволовой клеткой, сообщение об окончании шестого наблюдения за стволовой клеткой и кнопку второго выделения жидкого культурального продукта.

Ответственные на этапе шестого наблюдения за стволовой клеткой, отсасывают из культурального контейнера 35 жидкий культуральный продукт 31, преобразованный из культуральной жидкости 23, загруженной в культуральный контейнер 35, с использованием шприца или пипетки (этап второго выделения жидкого культурального продукта), и загружают (помещают) жидкий культуральный продукт 31 в контейнер для хранения 32. Жидкий культуральный продукт 31, загруженный в контейнер для хранения 32, представляет собой жидкий культуральный продукт 31, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый одним конкретным типом мезенхимальной стволовой клетки (единственным типом стволовой клетки), проявляющей активность, из которого удалена ненужная мезенхимальная стволовая клетка.

Ответственные загружают жидкий культуральный продукт 31 в контейнер для хранения 32, а затем прикрепляют бумагу с первым кодом 17, на которой напечатан QR-код, к внешней периферийной поверхности контейнера для хранения 32. Ответственные нажимают кнопку окончания второго выделения жидкого культурального продукта на тринадцатом пошаговом экранном окне, выведенном на экран 16, и дают возможность сканеру штрих-кодов 12 считать QR-код контейнера для хранения 32, а затем помещают контейнер для хранения 32, в который загружен жидкий культуральный продукт 31, в холодильник 34. Жидкий культуральный продукт 31 хранят в холодильнике 34 при температуре приблизительно от 3 до 4^°C.

Когда QR-код передается со сканера штрих-кодов 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), выведенные на экран 16, с данными донора, показанными посредством QR-кода, прочитанного сканером штрих-кодов 12, и если эти данные донора совпадают, На экран 16 выводятся NO. 1 и данные донора, а также сообщение об окончании выделения жидкого культурального продукта и кнопку окончания получения жидкого культурального продукта. Ответственные нажимают кнопку окончания получения жидкого культурального продукта. Кнопку окончания получения жидкого культурального продукта нажимают для остановки системы 10 на компьютере 11.

Когда нажимают кнопку окончания получения жидкого культурального продукта, наступает этап сбора стволовой клетки для сбора стволовой клетки 30 из культурального контейнера 35. На этапе сбора стволовой клетки, вторую мезенхимальную стволовую клетка 30, пролиферировавшую (дифференцированную) в культуральном контейнере 35, собирают из культурального контейнера 35. После промывания культурального контейнера 35 при помощи PBS, вводят раствор трипсина в культуральный контейнер 35. Когда раствор трипсина вводят в культуральный контейнер 35, вторая мезенхимальная стволовая клетка 30, прикрепленная ко дну 27 культурального контейнера 35, отслаивается раствором трипсина от дна 27, плавая на поверхности раствора трипсина. Ответственные отсасывают вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 с использованием шприца или пипетки, и загружают (помещают) стволовую клетку 30 в контейнер для хранения 33 из шприца или пипетки.

Вторая мезенхимальная стволовая клетка 30, загруженная в контейнер для хранения 33, представляет собой один конкретный тип мезенхимальной стволовой клетки (единственный тип стволовой клетки), проявляющей активность, при которой ненужная мезенхимальная стволовая клетка удалена. Ответственные загружают вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 (единственный тип мезенхимальной стволовой клетки) в контейнер для хранения 33, затем прикрепляют бумагу с первым кодом 17, на которой напечатан QR-код, к внешней периферийной поверхности контейнера для хранения 33, и помещают контейнер для хранения 33, в который загружена вторая мезенхимальная стволовая клетка 30, в холодильник 34. Вторую мезенхимальную стволовую клетку 30 (единственный тип мезенхимальной стволовой клетки) хранят в холодильнике 34 при температуре приблизительно от 3 до 4^°C.

Способ изготовления жидкого культурального продукта, которым собирают вторую стволовую клетку 30 из второго культурального контейнера 25 после выделения жидкого культурального продукта 31 из второго культурального контейнера 25, культивируют вторую стволовую клетку 30 вместе с культуральной жидкостью 23, прикрепляют вторую стволовую клетку 30 ко дну 27 третьего культурального контейнера 35 с большей емкостью и площадью нижней поверхности, чем у второго культурального контейнера 25, заполняют новой культуральной жидкостью 23 третий культуральный контейнер 35, культивируют стволовую клетку 30, и выделяют из третьего культурального контейнера 35 жидкий культуральный продукт 31, содержащий предопределенный метаболит, секретируемый из единственного типа пролиферирующей стволовой клетки 30, когда общая площадь стволовой клетки 30 достигает третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности культурального контейнера 35 в процессе культивирования стволовой клетки 30, таким образом, в процессе культивирования стволовой клетки 30 не культивируются различные типы стволовых клеток, присутствуют не различные типы метаболитов, секретируемых различными типами стволовых клеток, а только предопределенный метаболит, секретируемый единственным типом второй стволовой клетки 30, проявляющей активность, можно производить жидкий культуральный продукт 31, обеспечивающий только специфический эффект на предопределенное заболевание и предопределенные косметические применения, можно производить жидкий культуральный продукт 31, способный эффективно использоваться для лечения предопределенных заболеваний, и можно производить жидкий культуральный продукт 31, способный эффективно использоваться для предопределенных косметических применений.

ПОЯСНЕНИЯ БУКВ И ЦИФР

10 Система для производства жидкого культурального продукта

11 Компьютер

12 Сканер штрих-кодов

13 Электронный микроскоп

14 Клавиатура

15 Мышь

16 Экран

17 Бумага с первым кодом

18 Неочищенная костно-мозговая жидкость

19 Стеклянная тестовая пробирка

20 Штатив для тестовых пробирок

21 Баня с постоянной температурой

22 Костно-мозговая жидкость промежуточного слоя

23 Культуральная жидкость

24 Первый культуральный контейнер (первый плоский культуральный контейнер)

25 Второй культуральный контейнер (второй плоский культуральный контейнер)

26 Первая мезенхимальная стволовая клетка (первая стволовая клетка)

27 Дно

28 Центрифужный сепаратор

29 Стеклянная тестовая пробирка

30 Вторая мезенхимальная стволовая клетка (вторая стволовая клетка)

31 Жидкий культуральный продукт

32 Контейнер для хранения

33 Контейнер для хранения

34 Холодильник

35 Третий культуральный контейнер (третий плоский культуральный контейнер)

36 Держатель для образцов

37 Верхняя поверхность

38 Нижняя поверхность

39 Прокладка

40 Верхняя часть

41 Отверстие для заполнения

42 Пробка

43 Верхняя часть

44 Нижняя часть

45 Отверстие для заполнения

46 Пробка

47 Верхняя часть

48 Нижняя часть

49 Отверстие для заполнения

50 Пробка

1. Способ изготовления жидкого культурального продукта с использованием стволовых клеток, полученных из костномозговой жидкости, собранной у донора, включающий этапы:

разделения на слои костномозговой жидкости, собранной у донора;

выделения костномозговой жидкости из промежуточного слоя, полученного на этапе разделения костномозговой жидкости;

первого прикрепления стволовых клеток, включающего заполнение стволовыми клетками и костномозговой жидкостью из промежуточного слоя, выделенными на этапе выделения костномозговой жидкости, и предопределенной культуральной жидкостью первого культурального контейнера с предопределенной емкостью и предопределенной площадью нижней поверхности, оставление первого культурального контейнера в статическом состоянии на предопределенный период времени и прикрепление первых стволовых клеток, содержащихся в костномозговой жидкости промежуточного слоя, к нижней поверхности первого культурального контейнера;

первого культивирования стволовых клеток и удаления культуральной жидкости из первого культурального контейнера после прикрепления первых стволовых клеток к нижней поверхности первого культурального контейнера на этапе первого прикрепления стволовых клеток, заполнения новой культуральной жидкостью первого культурального контейнера, оставления первого культурального контейнера в статическом состоянии на предопределенный период времени и культивирования первых стволовых клеток до тех пор, пока общая площадь первых стволовых клеток не достигнет первого целевого соотношения с площадью нижней поверхности первого культурального контейнера;

первого сбора стволовых клеток для сбора первых стволовых клеток из первого культурального контейнера, когда общая площадь первых стволовых клеток достигнет первого целевого соотношения в процессе культивирования первых стволовых клеток на этапе первого культивирования стволовых клеток;

выделения стволовых клеток и разделения на слои путем центрифугирования первых стволовых клеток, собранных на этапе первого сбора стволовых клеток;

второго сбора стволовых клеток для сбора вторых стволовых клеток, расположенных в самом нижнем слое первых стволовых клеток, разделенных на слои на этапе разделения стволовых клеток;

второго прикрепления стволовых клеток, включающего заполнение вторыми стволовыми клетками, собранными на этапе второго сбора стволовых клеток, и предопределенной культуральной жидкостью второго культурального контейнера с большей емкостью и большей площадью нижней поверхности, чем у первого культурального контейнера, оставление второго культурального контейнера в статическом состоянии на предопределенный период времени и прикрепление вторых стволовых клеток к нижней поверхности второго культурального контейнера;

второго культивирования стволовых клеток и удаления культуральной жидкости из второго культурального контейнера после прикрепления вторых стволовых клеток к нижней поверхности второго культурального контейнера на этапе второго прикрепления стволовых клеток, заполнения новой культуральной жидкостью второго культурального контейнера, оставления второго культурального контейнера в статическом состоянии на предопределенный период времени и культивирования вторых стволовых клеток до тех пор, пока общая площадь вторых стволовых клеток не достигнет второго целевого соотношения с площадью нижней поверхности второго культурального контейнера; и

первого выделения жидкого культурального продукта для выделения из второго культурального контейнера жидкого культурального продукта, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый из единственного типа пролиферирующих вторых стволовых клеток, когда общая площадь вторых стволовых клеток достигает второго целевого соотношения в процессе культивирования на этапе второго культивирования стволовых клеток.

2. Способ изготовления жидкого культурального продукта по п. 1, где на этапах первого прикрепления стволовых клеток и первого культивирования стволовых клеток первый культуральный контейнер может находиться в статическом состоянии под предопределенным углом наклона в течение предопределенного периода времени и на этапах второго прикрепления стволовых клеток и второго культивирования стволовых клеток второй культуральный контейнер может находиться в статическом состоянии под предопределенным углом наклона в течение предопределенного периода времени.

3. Способ изготовления жидкого культурального продукта по п. 1 или 2, включающий этапы:

второго сбора стволовых клеток для сбора вторых стволовых клеток из второго культурального контейнера после выделения жидкого культурального продукта из второго культурального контейнера на этапе первого выделения жидкого культурального продукта;

третьго прикрепления стволовых клеток для заполнения вторыми стволовыми клетками, собранными при втором сборе стволовых клеток, и новой культуральной жидкостью третьего культурального контейнера с предопределенной емкостью и предопределенной площадью нижней поверхности, где емкость и площадь нижней поверхности больше, чем у второго культурального контейнера, оставления третьего культурального контейнера в статическом состоянии на предопределенный период времени и прикрепления вторых стволовых клеток к нижней поверхности третьего культурального контейнера;

третьего культивирования стволовых клеток для удаления культуральной жидкости из третьего культурального контейнера после прикрепления вторых стволовых клеток к нижней поверхности третьего культурального контейнера на этапе третьего прикрепления стволовых клеток, заполнения новой культуральной жидкостью третьего культурального контейнера, оставления третьего культурального контейнера в статическом состоянии на предопределенный период времени и культивирования вторых стволовых клеток до тех пор, пока общая площадь вторых стволовых клеток не достигнет третьего целевого соотношения с площадью нижней поверхности третьего культурального контейнера; и

второго выделения жидкого культурального продукта для выделения из третьего культурального контейнера жидкого культурального продукта, который содержит предопределенный метаболит, секретируемый из единственного типа пролиферирующих вторых стволовых клеток, когда общая площадь вторых стволовых клеток достигает третьего целевого соотношения в процессе культивирования на этапе третьего культивирования стволовых клеток.

4. Способ изготовления жидкого культурального продукта по п. 3, где на этапах третьего прикрепления стволовых клеток и третьего культивирования стволовых клеток третий культуральный контейнер может находиться в статическом состоянии под предопределенным углом наклона в течение предопределенного периода времени.

5. Способ изготовления жидкого культурального продукта по любому из пп. 1-4, где на этапе разделения костномозговой жидкости у донора забирают от 2 до 3 см³ костномозговой жидкости, от 2 до 3 см³ костномозговой жидкости помещают в вертикально удлиняющийся контейнер для разделения, контейнер для разделения оставляют в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на предопределенный период времени, и костномозговая жидкость вертикально разделяется на слои в контейнере для разделения, и на этапе выделения костномозговой жидкости выделяют костномозговую жидкость промежуточного слоя, расположенную в промежуточном слое костномозговой жидкости, разделенной на слои в контейнере для разделения.

6. Способ изготовления жидкого культурального продукта по любому из пп. 1-5, где емкость первого культурального контейнера составляет приблизительно от 20 до 30 см³, исходная форма поверхности первых стволовых клеток приблизительно является круглой формой и форма поверхности деформированных первых стволовых клеток является приблизительно, в основном, круглой формой и плоской формой, когда первые стволовые клетки удлиняются в аморфной форме в одном направлении, и на этапе первого прикрепления стволовых клеток первый культуральный контейнер может оставаться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 12 до 24 часов, деформацию первых стволовых клеток от исходной формы поверхности в первом культуральном контейнере наблюдают в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 12 до 24 часов и, когда первые стволовые клетки деформируется из начальной формы поверхности в аморфную плоскую форму, определяют, что первые стволовые клетки прикрепились к нижней поверхности первого культурального контейнера.

7. Способ изготовления жидкого культурального продукта по любому из пп. 1-6, где на этапе первого сбора стволовых клеток первый культуральный контейнер может оставаться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 36 до 48 часов, и общую площадь первых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности первого культурального контейнера, по отношению к площади нижней поверхности первого культурального контейнера наблюдают в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 36 до 48 часов.

8. Способ изготовления жидкого культурального продукта по п. 7, где первое целевое соотношение общей площади первых стволовых клеток составляет от 70 до 80% от площади нижней поверхности первого культурального контейнера.

9. Способ изготовления жидкого культурального продукта по любому из пп. 1-8, где на этапе разделения стволовых клеток первые стволовые клетки загружают в контейнер для разделения, контейнер для разделения помещают в центрифужный сепаратор для разделения путем центрифугирования первых стволовых клеток и на этапе первого сбора стволовых клеток собирают вторые стволовые клетки, расположенные в самом нижнем слое первых стволовых клеток, разделенных путем центрифугирования на слои в контейнере для разделения.

10. Способ изготовления жидкого культурального продукта по любому из пп. 3-9, где емкость второго культурального контейнера составляет приблизительно от 40 до 60 см³, емкость третьего культурального контейнера составляет приблизительно от 70 до 80 см³, исходная форма поверхности вторых стволовых клеток приблизительно является круглой формой и форма поверхности деформированных вторых стволовых клеток является приблизительно, в основном, круглой формой и плоской формой, когда вторые стволовые клетки удлиняются в аморфной форме в одном направлении, и на этапах второго прикрепления стволовых клеток и третьего прикрепления стволовых клеток второй и третий культуральные контейнеры могут оставаться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 36 до 48 часов, деформацию вторых стволовых клеток от исходной формы поверхности во втором и третьем культуральных контейнерах наблюдают в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 36 до 48 часов и, когда вторые стволовые клетки деформируются из начальной формы поверхности в аморфную плоскую форму, определяют, что вторые стволовые клетки прикрепились к нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров.

11. Способ изготовления жидкого культурального продукта по любому из пп. 3-10, где на этапах второго сбора стволовых клеток и третьего сбора стволовых клеток второй и третий культуральные контейнеры могут находиться в статическом состоянии при температуре, приблизительно равной температуре тела, на период от 36 до 48 часов, общую площадь вторых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров, по отношению к площади нижней поверхности второго и третьего культуральных контейнеров наблюдают в интервале приблизительно от 1 до 2 часов в течение периода от 36 до 48 часов.

12. Способ изготовления жидкого культурального продукта по любому из пп. 3-11, где второе целевое соотношение общей площади вторых стволовых клеток составляет от 88 до 92% от площади нижней поверхности второго культурального контейнера и третье целевое соотношение общей площади третьих стволовых клеток составляет от 88 до 92% от площади нижней поверхности третьего культурального контейнера.

13. Способ изготовления жидкого культурального продукта по любому из пп. 1-12, где первые и вторые стволовые клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки.