Рекомбинантный штамм ad6-htert-gmcsf, содержащий встройку промотора теломеразы человека htert, а также гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, обладающий избирательной цитолитической активностью против теломераза-положительных опухолевых клеток и экспрессирующий активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
Владельцы патента RU 2753742:
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (Новосибирский государственный университет, НГУ) (RU)
Настоящее изобретение относится к генной терапии злокачественных опухолей, в частности к онколитическим аденовирусным векторам. Оно может быть применимо в производстве лекарственных средств для лечения злокачественных опухолей. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам продуцирования гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (ГМ-КСФ) в опухолевой клетке, подвергаемой онколизису, для включения противоопухолевого иммунного ответа. Настоящий штамм аденовируса как платформа для конструирования противоопухолевых и вакцинных препаратов обладает целым рядом преимуществ. Он реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток в автономных образованиях - вирусных фабриках, не контактирует с клеточным генетическим материалом, не встраивается в хромосомы, не имеет онкогенного потенциала. Аденовирус серотипа 6 имеет более низкую серопревалентность, что увеличивает эффективность его использования в качестве противоопухолевого препарата. 6 ил., 5 пр.
Настоящее изобретение относится к генной терапии злокачественных опухолей. Более точно, настоящее изобретение относится к онколитическим аденовирусным векторам и фармацевтическим композициям, содержащим такие векторы. Настоящее изобретение также относится к применению указанных векторов в производстве лекарственных средств для лечения злокачественных опухолей. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам продуцирования гранулоцитарно макрофагально колониестимулирующего фактора человека (ГМ-КСФ) в опухолевой клетке, подвергаемой онколизису, для включения противоопухолевого иммунного ответа.
С середины XIX века известно множество кейс-репортов, когда регрессия опухоли совпадала с естественным заражением вирусной инфекцией. Чаще всего такие пациенты страдали от гематологических новообразований, таких как лейкемия или лимфома, которые ассоциированы со значительным снижением работы иммунитета. В одном часто цитируемом случае, произошедшем в 1896, доктор Джордж Док описал временную ремиссию после перенесенного гриппа у 42-летней женщины, больной лейкемией [1]. Однако эффект был заметен и на солидных опухолях, схожий случай регрессии был зафиксирован в 1912 году, когда больной раком шейки матки вводилась вакцина от вируса бешенства после укуса собаки [2].
Ко второй половине XX века накопилось достаточно большое количество подобных единичных случаев, когда естественное заражение вирусной инфекцией производило противоопухолевый эффект. Вследствие этого к середине двадцатого столетия идея использования вирусов стала набирать популярность. В 1950-1970 годы было начато множество клинических испытаний для исследования методов лечения, предполагающих введение различных представителей некоторых вирусных семейств, включая вирусы гепатита (Hepadnaviridae, Picornaviridae, Flaviviridae), лихорадку Западного Нила (Flaviviridae), желтую лихорадку (Flaviviridae), лихорадку денге (Flaviviridae), болезни Ньюкасла (Paramixoviridae), а также аденовирусов [3]. Поскольку на тот момент еще не возникли генно-инженерные методы, и молекулярные механизмы действия вирусов оставались неизвестными, использовались неаттенуированные вирусы дикого типа, что часто приводило к тяжелым побочным эффектам. К 90-м годам стали понятны некоторые молекулярные механизмы процессов, протекающих при заражении клеток вирусами, а также возник инструментарий генной инженерии. В настоящее время ведется более тысячи клинических испытаний противоопухолевых препаратов на основе различных вирусных векторов, среди которых, согласно ресурсу http://www.abedia.com/wiley/index.html. одними из наиболее часто встречающихся (26%) являются аденовирусы.
Существенными достоинствами аденовирусных векторов являются относительная простота получения очищенных вирусных суспензий, неспособность интегрироваться в геном клеток, рекомбинантные аденовирусы довольно стабильны и экспрессия встроенных генов может достигать высоких уровней [4]. Изначально для онколитической виротерапии создавались аденовирусные векторы, которые были лишены области ранних генов, необходимых для вирусной репликации. В настоящее время более перспективными противоопухолевыми агентами являются условно репликативные аденовирусы, либо экспрессию ранних генов контролируют опухолеспецифическими промоторами. Кроме того, появилась стратегия "вооружения" векторов генами-иммуномодуляторами для усиления противоопухолевого иммунного ответа.
Аденовирусы в генной терапии начали активно использовать в начале 90-х годов. Были предприняты попытки доставки дисфункциональных и дефицитных генов при различных заболеваниях [5, 6]. Разработка препаратов потребовала более тщательного изучения безопасности использования аденовирусных векторов в генной терапии. На данный момент наиболее часто встречается вариант с удаленными 24 п.о. в участке малого белка Е1А, отвечающего за связывание белков семейства ретинобластомы и выход из ареста клеточного цикла [7-9]. Такой вариант позволяет вирусу селективно реплицироваться в клетках с нарушенным Rb-путем.
Еще один способ модификации аденовирусных векторов для адресного воздействия на опухолевые клетки заключается во внедрении в геном ткане- и/или опухолеспецифичных промоторов вместо природного промотора области Е1А [10-12]. Одним из вариантов подобных модификаций является встройка промотора теломеразы человека hTERT, поскольку активна в более чем 90% злокачественных клеток [13]. Было установлено, что такие аденовирусные векторы подавляют рост опухоли in vitro и in vivo, проявляя при этом специфичность к опухолевым клеткам [14, 15]. Кроме того, онколитический аденовирус ОВР-301 с промотором hTERT был протестирован в клинических испытаниях 1 и 2 фаз, в доклиническом исследовании с антителом против PD-1 с хорошими результатами [16].
Несмотря на способность аденовирусов активировать разные звенья иммунного ответа, использование диких типов или аттенуированных векторов не приводит к полному уничтожению метастазирующих опухолей, вероятно, из-за их иммуносупрессивного клеточного микроокружения. Использование онколитических векторов с генами-иммуномодуляторами должно приводить к разрушению этой супрессии и, следовательно, к более эффективной терапии [17]. Примерами используемых трансгенов являются цитокины, хемокины, костимулирующие молекулы и молекулы BiTEs (Bi-specific T-cell engagers) [18].
Такой цитокин как ГМ-КСФ может нарабатываться в достаточном количестве в инфицированных клетках, затем в результате онколиза высвобождаться в микроокружение опухоли для стимуляции антиген-презентирующих клеток, в том числе дендритных клеток, которые взаимодействуют с CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами [19]. Клинические исследования с участием онколитических аденовирусов со встройкой гена ГМ-КСФ показывают хорошие результаты и безопасность применения таких векторов [20-22].
Одним из наиболее близких аналогов к создаваемому в рамках темы НИР аденовирусному вектору является конструкция онколитического аденовирусного вектора, разработанная китайской компанией Чэнгду Кангхонг Байотекнолоджиз (патент России 2361611, опубл. 20.06.2009). Вектор содержит генетически улучшенный промотор теломеразы человека, контролирующий ключевые для репликации вируса гены, а также встройку гена человеческого ГМ-КСФ. Однако данные модификации до сих пор применялись только к Ад5, но на основе Ад6 пока не было создано онколитических аденовирусов с подобными модификациями.
Использование Ад5 в качестве онколитика осложнено тем, что это широко встречающийся серотип, из чего следует высокая распространенность предсуществующего иммунитета, ограничивающий время существования вируса в организме пациента, получающего терапию [23]. Другая проблема кроется в способности клеток Купфера захватывать Ад5 из кровотока, что приводит к воспалительной реакции в печени, повышенной гепатотоксичности, а также снижению времени циркуляции вируса [23, 24]. Вариантом решения данной проблемы является использование альтернативных серотипов, среди которых наиболее близким к Ад 5, но при этом лишенным указанных недостатков является аденовирус серотипа 6 (Ад6) [25].
Техническим результатом является создание онколитического аденовируса серотипа 6, обладающего пониженной серопревалентностью, избегающего связывания клетками Купфера, предназначенного для лечения злокачественных опухолей, продуцирования гранулоцитарно макрофагально колониестимулирующего фактора человека в опухолевой клетке, подвергаемой онколизису и включения противоопухолевого иммунного ответа.
Результат достигается созданием Рекомбинантного штамма Ad6-hTERT-GMCSF, сконструированного на основе штамма аденовируса серотипа 6, содержащего встройку промотора теломеразы человека (hTERT), структура которого соответствует коровому промотору гена теломеразы человека, депонированного в GenBank (Accession АН007699) позиции 10854-11273 в месте удаленного промотора гена Е1А между позициями соответствующими позициям нуклеотидов 357-558 штамма Ад6 Tonsil99, депонированного в GenBank (Accession HQ413315), а также гена гранулоцитарно макрофагального колониестимулирующего фактора человека, структура которого соответствует кодирующей последовательности мРНК человеческого ГМ-КСФ, депонированного в GenBank (Accession NM 000758) позиции 36-469, в месте удаленных генов Е3-6.7к и Е3-gp19k между позициями 28608 и 29270, обладающего избирательной цитолитической активностью против теломераза-положительных опухолевых клеток и экспрессирующего активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор.
Модифицированный геном аденовируса серотипа 6, содержит:
- левый ITR
- промотор hTERT
- последовательность аденовируса, включающая гены от Е1А до Е3-12.5К
- ген человеческого GMCSF
- последовательность аденовируса, включающая гены от Е3-13.4К до правого ITR
Создание штамма достигается за счет гидролиза эндонуклеазой рестрикции AsiSI продукта гомологичной рекомбинации in vitro при помощи набора In-fusion (Takara Bio, Япония) между ДНК Ад6 штамма ЛМВ, гидролизованной эндонуклеазами рестрикции по сайтам ClaI и PacI, и плазмидной ДНК pBRAd4.2. Плазмида pBRAd4.2 (фиг. 1) была сконструирована на основе pBR322 за счет последовательных встроек фрагментов ДНК Ад6 штамма ЛМВ, соответствующих позициям нуклеотидов штамма Ад6 Tonsil99, депонированного в GenBank (Accession HQ413315): 1-1772, где вместо нуклеотидной последовательности 357-558 встроена последовательность промотора hTERT, затем 27576-27665 и 27667-35759, где вместо нуклеотидной последовательности 28608-29270 встроена последовательность гена ГМ-КСФ человека. Также были встроены сайты гидролиза эндонуклеазой рестрикци AsisI слева от участков, соответствующих позициям 1-1772 Ад6 и справа от участков, соответствующих 27667-35759 Ад6. Последовательность промотора теломеразы человека hTERT соответствует коровому промотору гена теломеразы человека, депонированного в GenBank (Accession АН007699) позиции 10854-11273, но имеет дополнительные встройки: сайтов рестрикции BamHI слева от последовательности промотора, PstI справа от последовательности промотора и последовательность Козак GCCACC, примыкающая справа от сайта рестрикции PstI. Последовательность гена ГМ-КСФ человека соответствует кодирующей последовательности мРНК человеческого ГМ-КСФ, депонированного в GenBank (Accession NM_000758) позиции 36-469. Полученная в результате рекомбинации между плазмидой pBRAd4.2 и геномной ДНК Ад6 штамма ЛМВ плазмида pAd6-hTERT-GMCSF затем подвергалась гидролизу эндонуклеазой рестрикции AsiSI и дальнейшей трансфекции в клетки НЕК Ad293.
Штамм обладает следующими признаками: Морфологические признаки. Штамм относится к семейству Adenoviridae рода Mastadenovirus и обладает признаками, характерными для аденовирусов вида С: икосаэдрический вирион, однако отличается дополнительной экспрессей ГМ-КСФ и hTERT-зависимой репликацией.
Физиолого-биохимические характеристики и культуральные свойства штамма. ДНК рекомбинантного Ад6 имеет длину 35779 п.н. Наличие в его геноме встроек промотора hTERT и гена человеческого ГМ-КСФ было подтверждено секвенированием по Сэнгеру. Селективная репликация в hTERT-положительных клетках была подтверждена методом ХТТ(фиг. 3). Цитотоксическое действие вируса подтверждена методом ХТТ на клетках двух раковых линий (фиг. 4).Экспрессия гена ГМ-КСФ человека подтверждена Western blot анализом культуральной среды и лизатов клеток А549, инфицированных штаммом Ad6-hTERT-GMCSF (фиг. 5). Биологическая активность секретируемого рекомбинантного ГМ-КСФ была оценена в культуре клеток эритролейкоза человека TF-1, которая является ГМ-КСФ зависимой и пролиферирует только в присутствии ГМ-КСФ и ряда других цитокинов человека (фиг. 6).
Заявляемый штамм аденовируса, как платформа для конструирования противоопухолевых и вакцинных препаратов, обладает целым рядом преимуществ. Он реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток в автономных образованиях -вирусных фабриках, не контактирует с клеточным генетическим материалом, не встраивается в хромосомы, не имеет онкогенного потенциала. Аденовирус серотипа 6 имеет более низкую серопревалентность, что увеличивает эффективность его использования в качестве противоопухолевого препарата. Заявляемый штамм аденовируса Ad6-hTERT-GMCSF получен на основе штамма ЛМВ.
Изобретение иллюстрировано следующими фигурами:
Фигура 1. Схема получения полногеномной плазмиды, содержащей геном рекомбинантного аденовируса Ad6-hTERT-GMCSF
Фигура 2. Электрофореграмма гидролизованной плазмиды pAd6-hTERT-GMCSF: 1, 5 - маркерная ДНК (50 кб, СибЭнзим); 2, 6 - анализируемая плазмида, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции EcoICRI; 3, 7 - анализируемая плазмида, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции EcoRV; 4, 8 - анализируемая плазмида гидролизованная эндонуклеазой рестрикции АраЫ
Фигура 3. Жизнеспособность клеток молочной железы после обработки различными разведениями Ad6 и Ad6-hTERT-GMCSF. А - жизнеспособность клеток линии MCF-7, Б - жизнеспособность клеток линии MCF-10. Все распределения были проверены на нормальность тестом Шапиро-Уилка, показано среднее ± стандартное отклонение, достоверность отличий оценена тестом Стьюдента, *р<0.05.
Фигура 4. Жизнеспособность опухолевых клеток после обработки различными разведениями Ad6 и Ad6-hTERT-GMCSF. А - жизнеспособность клеток линии MDA-MB-231, Б - жизнеспособность клеток линии U87. Все распределения были проверены на нормальность тестом Шапиро-Уилка, показано среднее ± стандартное отклонение, достоверность отличий оценена тестом Стьюдента, *р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001.
Фигура 5. Результаты вестерн-блот анализа: 1) среда после заражения Ад6 дикого типа; 2,3) среда после заражения рек2-Адб; 4) среда контрольных клеток; 5) лизат после заражения Ад6 дикого типа; 6, 7) лизат после заражения рек2-Адб; 8) лизат контрольных клеток; 9) рекомбинантный негликозилированный ГМ-КСФ из Е. coli. Контроль молекулярного веса - Thermo Scientific Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder
Фигура 6. Анализ биологической активности ГМ-КСФ человека, экспрессированного в составе рекомбинантного аденовируса на клетках Ad293. На оси Y показана биологическая активность ГМ-КСФ - % стимуляции пролиферации цитокин-зависимых клеток эритролейкоза человека TF-1. За 100% принимали количество живых клеток, выращенных в необработанной среде и при добавлении неразведенной среды с неинфицированных клеток Ad293 (отрицательный контроль). На оси X - концентрация рекомбинантного прокариотического препарата ГМ-КСФ (калибровка) или разведение культуральной среды клеток, инфицированных рекомбинантом.
Ниже приведены примеры воплощения изобретения.
Пример 1. Способ получения рекомбинантного аденовируса серотипа 6 Ad6-hTERT-GMCSF
Для получения плазмиды pAd6 проводилась рекомбинация in vitro при помощи набора In-fusion (Takara Bio, Япония) между линеаризованной плазмидой pBRAd4.2 и геномом Ад6 штамма ЛМВ, гидролизованным при помощи эндонуклеаз рестрикции ClaI и Pad (фиг. 1). ДНК полученной в результате плазмиды pAd6-hTERT-GMCSF была наработана в препаративных количествах из 250 мл среды Лурия-Бертани и выделена с использованием набора лабораторных реагентов для выделения плазмидной ДНК, очищенной от эндотоксинов, EndoFree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN). Линеаризация плазмиды pBRAd4.2 проводилась методом ПЦР с использованием праймеров:
Продуктами рекомбинации трансформировали клетки Е. coli штамма Stellar. Для подтверждения встройки из полученных колоний бьша выделена плазмидная ДНК, которые затем гидролизовали эндонуклеазами рестрикции EcoRV, EcoICRI и ApaLI; теоретическая и экспериментальная картины расщепления приведены на фигуре 2.
Полученную плазмиду pAd6-hTERT-GMCSF затем гидролизовали эндонуклеазой рестрикции AsiSI. Полученный продукт очищали этанольной преципитацией. Для трансфекции реагент Lipofectamine™ LTX в количестве 0,1 мкл добавляли к 100 нг гидролизованной плазмиды в 50 мкл среды opti-MEM (Invitrogen). Трансфекцию проводили на 90%-ном монослое клеток НЕК Ad293, вьфащенном в 96-луночных планшетах (Greiner). Клетки инкубировали 1 час при 37°С в атмосфере 5% СО2, после чего добавляли 100 мкл среды DMEM (Invitrogen) и инкубировали еще 48 часов при 37°С в атмосфере 5% СО2 до развития цитопатического эффекта. Материал трижды замораживали-оттаивали для получения вирусной суспензии. Вирус клонировали методом серийного разведения на клетках линии А549. Наличие встройки промотора hTERT оценивали секвенированием по Сэнгеру с использованием праймера Вирус был препаративно наработан на клетках линии А549, его геномная ДНК выделена и определена геномным секвенированием. Приложение 1
Пример 2. Оценка селективности репликации рекомбинантного штамма Ad6-hTERT-GMCSF
Для оценки избирательной репликации полученного рекомбинантного штамма Ад6 проводили тест на цитотоксичность с использованием ХТТ реагента. Для этого брали две клеточные линии - MCF-10 и MCF-7, в которых известно, что теломеразная активность существенно различается, и заражали и с помощью рек2-Адб, с различным количеством вирусных частиц на клетку. Спустя три дня определялась жизнеспособность клеток путем измерения оптической плотности образовавшегося формазана. Из результатов ХТТ-теста (фиг. 3) видно, что оба варианта вируса обладали схожей цитотоксичностью на клетках линии MCF-7, однако в эксперименте на клетках линии MCF-10, hTERT-модифицированный вирус проявлял меньшую литическую активность.
Пример 3. Оценка цитотоксического эффекта в опухолевых линиях клеток.
Чтобы выяснить, не снижена ли противоопухолевая активность вируса из-за внесенных модификаций, проводили тест на жизнеспособность после обработки клеток различными количествами вирусных частиц природного Ad6 и Ad6-hTERT-GMCSF на клетку с использованием ХТТ реагента. Оценка проводилась на клетках рака молочной железы MDA-MB-231, а также клетках глиобластомы U87 (фиг. 4). При тестировании на клетках линии MDA-MB-231 достоверной разницы не было обнаружено, однако при тестировании на U87 были выявлены статистически значимые отличия. Таким образом, внесенные модификации не снижают цитотоксическое действие вируса.
Пример 4. Оценка продукции ГМ-КСФ человека рекомбинантным штаммом Ad6-hTERT-GMCSF
Для подтверждения экспрессии белка ГМ-КСФ в полученном рек2-Ад6 при инфицировании был проведен вестерн-блот анализ. Для этого клеточная линия А549 заражалась при 70%-ном монослое рек2-Ад6 и Ад6 дикого типа. В качестве контроля использовали незараженные клетки. Спустя 12 ч со всех матрасов собирали среду и концентрировали ее, а клетки подвергали лизису. Лизаты клеток и концентраты среды центрифугировали при 12 тыс об/мин 30 мин при 6°С, затем отбирали супернатант. Белки разделяли при помощи электрофореза в 14% полиакриламидном геле. Затем производили перенос белков на мембрану с последующим блокированием мембраны и окрашиванием белков мышиными античеловеческими антителами против ГМ-КСФ человека. После 16-часовой инкубации мембраны ее промывали и окрашивали вторичным антителом к мышиному IgG с конъюгированной щелочной фосфатазой. После инкубирования и промывки мембраны, мембрана переносилась в раствор с субстратом для щелочной фосфатазы (BCIP и NBT).
Из полученных результатов анализа следует, что встроенный ген ГМ-КСФ экспрессируется в клетках (фиг. 5). Наличие белка не наблюдается ни при заражении Ад6 дикого типа, ни в контрольном образце. При заражении рек2-Ад6 наибольшее количество белка наблюдается в среде, в которой росли клетки.
Пример 5. Анализ биологической активности ГМ-КСФ человека, экспрессированного в составе Ad6-hTERT-GMCSF
Биологическую активность ГМ-КСФ человека, секретируемого клетками Ad293, инфицированными рекомбинантными аденовирусом рек2-Ад6, оценивали по выраженному в процентах уровню стимуляции пролиферации цитокин-зависимых клеток эритролейкоза человека TF-1 [26]. Пролиферативный эффект препаратов определяли в фотометрическом тесте с использованием субстрата для митохондриальных дегидрогеназ 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфо-фенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилида (реагент ХТТ). Оценивали стимулирующую пролиферативную активность культуральной среды, полученной через 48 часов после заражения клеток рекомбинантным аденовирусом с множественностью 0,5 БОЕ/клетка. Перед использованием культуральную среду центрифугировали 10 мин при 2000g для осаждения клеточного дебриса и фильтровали через ячейку Amicon Ultra - 100К (Millipore) для удаления вируса. Аналогично получали контрольный образец среды неинфицированных Ad293 клеток. Для оценки концентрации ГМ-КСФ в культуральной среде использовали очищенный и охарактеризованный препарат рекомбинантного ГМ-КСФ, полученного в клетках E.coli [26, 27]. Для проведения эксперимента в среде RPMI (Invitrogen) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки готовили 4-кратные разведения культуральной среды от инфицированных рекомбинантными вирусами клеток Ad293 в диапазоне 1:4-1024 или рекомбинантного белка ГМ-КСФ до конечных концентраций 0,25; 0,5; 1; 2 и 4 нг/мл (калибровка). В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду неинфицированных клеток. В лунки 96-ти луночного планшета вносили 50 мкл вышеуказанных разведений или контрольных образцов и добавляли 50 мкл суспензии клеток TF-1 в среде RPMI с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки по 2×104 клеток/лунка. Планшеты помещали в термостат при температуре 37°С, 5% СО2, влажности 85% и инкубировали 72 часа. После инкубации в каждую тестируемую лунку добавляли 50 мкл реагента ХТТ (Sigma). Планшет инкубировали еще 4 часа и определяли оптическую плотность ОП490/620 на планшетном спектрофотометре SpectraCount (Packard). Каждую точку делали в пяти повторностях, определяли среднее значение и дисперсию для различных концентраций культуральной среды и очищенного рекомбинантного белка ГМ-КСФ, строили гистограмму зависимости ОП от разведений и концентрации. Стимуляцию пролиферации TF-1 клеток рассчитывали в процентах по отношению к контролю. За 100% принимали количество живых клеток в отрицательном контроле. Все расчеты проводили с использованием программного обеспечения LabView. Результаты представлены на фигуре 6.
Источники информации.
1. Dock G. The influence of complicating diseases upon leukaemia. Am J Med Sci, 1904. P.
2. DePace N. Sulla Scomparsa di un enorme cancro vegetante del callo dell'utero senza cura chirurgica. // Ginecologia. 1912. Vol. 9. P. 82-89.
3. Kelly E., Russell S.J. History of oncolytic viruses: genesis to genetic engineering. // Mol. Ther. 2007. Vol. 15, №4. P. 651-659.
4. Chaurasiya S., Hitt M.M. Adenoviral Vector Construction I: Mammalian Systems // Adenoviral Vectors for Gene Therapy: Second Edition. Second Edi. Elsevier Inc., 2016. 85-112 p.
5. Lemarchand P. et al. Adenovirus-mediated transfer of a recombinant human al-antitrypsin cDNA to human endothelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Proc Natl Acad Sci USA, 1992. Vol. 89, №14. P. 6482-6486.
6. Griesenbach U. et al. Gene therapy progress and prospects: Cystic fibrosis // Gene Therapy. Gene Ther, 2002. Vol. 9, №20. P. 1344-1350.
7. Fueyo J. et al. A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo. // Oncogene. 2000. Vol. 19, №1. P. 2-12.
8. Kimball K.J. et al. A phase I study of a tropism-modified conditionally replicative adenovirus for recurrent malignant gynecologic diseases // Clin. Cancer Res. Clin Cancer Res, 2010. Vol. 16, №21. P. 5277-5287.
9. Page J.G. et al. Identifying the safety profile of a novel infectivity-enhanced conditionally replicative adenovirus, Ad5-A24-RGD, in anticipation of a phase I trial for recurrent ovarian cancer // Am. J. Obstet. Gynecol. Mosby Inc., 2007. Vol. 196, №4. P. 389.e1-389.e10.
10. Vile R.G., Hart I.R. In Vitro and in Vivo Targeting of Gene Expression to Melanoma Cells // Cancer Res. 1993. Vol. 53, №5. P. 962-967.
11. Osaki T. et al. Gene Therapy for Carcinoembryonic Antigen-producing Human Lung Cancer Cells by Cell Type-specific Expression of Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase Gene // Cancer Res. Cancer Res, 1994. Vol. 54, №20. P. 5258-5261.
12. Chen L. et al. Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3/MUC1 promoter // J. Clin. Invest. American Society for Clinical Investigation, 1995. Vol. 96, №6. P. 2775-2782.
13. Hahn W.C., Weinberg R.A. Modelling the molecular circuitry of cancer // Nature Reviews Cancer. European Association for Cardio-Thoracic Surgery, 2002. Vol. 2, №5. P. 331-341.
14. Gu J., Kagawa S., Takakura M. Tumor-specific Transgene Expression from the Human Telomerase Reverse Transcriptase Promoter Enables Targeting of the Therapeutic Effects of the Bax Gene to Cancers Advances in Brief Tumor-specific Transgene Expression from the Human Telomerase Reverse Tr. 2000. Vol. 260, №16. P. 5359-5364.
15. Komata T. et al. A novel treatment of human malignant gliomas in vitro and in vivo: FADD gene transfer under the control of the human telomerase reverse transcriptase gene promoter. // Int. J. Oncol, bit J Oncol, 2001. Vol. 19, №5. P. 1015-1020.
16. Khan U. et al. Phase II study of a telomerase-specific oncolytic adenovirus (OBP-301, Telomelysin) in combination with pembrolizumab in gastric and gastroesophageal junction adenocarcinoma. // J. Clin. Oncol. 2019. Vol. 37, №15_suppl. P. TPS4145-TPS4145.
17. Rosewell Shaw A., Suzuki M. Recent advances in oncolytic adenovirus therapies for cancer // Current Opinion in Virology. Elsevier B.V., 2016. Vol. 21. P. 9-15.
18. Rosewell Shaw A., Suzuki M. Oncolytic Viruses Partner With T-Cell Therapy for Solid Tumor Treatment // Frontiers in immunology. NLM (Medline), 2018. Vol. 9. P. 2103.
19. Ramesh N. et al. CG0070, a Conditionally Replicating Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor-Armed Oncolytic Adenovirus for the Treatment of Bladder Cancer // Clin. Cancer Res. 2006. Vol. 12, №1. P. 305-313.
20. Cerullo V. et al. Oncolytic adenovirus coding for granulocyte macrophage colony-stimulating factor induces antitumoral immunity in cancer patients // Cancer Res. Cancer Res, 2010. Vol. 70, №11. P. 4297-4309.
21. Vassilev L. et al. T-cell response and robust cellular and transcriptional immune activation at tumor site in a patient with ovarian cancer.
22. Packiam V.T. et al. An open label, single-arm, phase II multicenter study of the safety and efficacy of CG0070 oncolytic vector regimen in patients with BCG-unresponsive non-muscle-invasive bladder cancer: Interim results // Urol. Oncol. Semin. Orig. Investig. Elsevier Inc., 2018. Vol. 36, №10. P. 440-447.
23. Mennechet F.J.D. et al. A review of 65 years of human adenovirus seroprevalence // Expert Rev. Vaccines. Taylor & Francis, 2019. Vol. 18, №6. P. 597-613.
24. Khare R. et al. Identification of Adenovirus Serotype 5 Hexon Regions That Interact with Scavenger Receptors // J. Virol. 2012. Vol. 86, №4. P. 2293-2301.
25. Weaver E.A. et al. Characterization of species С human adenovirus serotype 6 (Ad6) // Virology. 2011. Vol. 412, №1. P. 19-27.
26. Grazhdantseva A.A. et al. Highly effective production of biologically active, secreted, human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by recombinant vaccinia virus // Appl. Biochem. Microbiol. Pleiades Publishing, 2016. Vol. 52, №7. P. 685-691.
27. Топоркова Л.Б., Орловская И.А., Сенников С.В., Сахно Л.В., Козлова, Ю.Н., Лебедев Л.Р. И.П.Г. Изучение in vitro биологических свойств рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора // Иммунология. 2009. Vol. 4. Р. 203-205.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Новосибирский Государственный Университет
<120> Рекомбинантный штамм Ad6-hTERT-GMCSF, содержащий встройку промотора
теломеразы человека hTERT, а также гена гранулоцитарно-макрофагального
колониестимулирующего фактора человека, обладающий избирательной
цитолитической активностью против теломераза-положительных опухолевых клеток
и экспрессирующий активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный
колониестимулирующий фактор.
<130> 249/11
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35779
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<400> 1
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgtaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgccggatg tggtaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacgg gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccaag taatatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataattct gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcgga 360
tccgattcga cctctctccg ctggggccct cgctggcgtc cctgcaccct gggagcgcga 420
gcggcgcgcg ggcggggaag cgcggcccag acccccgggt ccgcccggag cagctgcgct 480
gtcggggcca ggccgggctc ccagtggatt cgcgggcaca gacgcccagg accgcgctcc 540
ccacgtggcg gagggactgg ggacccgggc acccgtcctg ccccttcacc ttccagctcc 600
gcctcctccg cgcggacccc gccccgtccc gacccctccc gggtccccgg cccagccccc 660
tccgggccct cccagcccct ccccttcctt tccgcggccc cgccctctcc tcgcggcgcg 720
agtttcaggc agcgctgcgt cctgctgcgc acgtgggaag ccctggcccc ggccaccccc 780
gcgctgcagg ccaccatgag acatattatc tgccacggag gtgttattac cgaagaaatg 840
gccgccagtc ttttggacca gctgatcgaa gaggtactgg ctgataatct tccacctcct 900
agccattttg aaccacctac ccttcacgaa ctgtatgatt tagacgtgac ggcccccgaa 960
gatcccaacg aggaggcggt ttcgcagatt tttcccgagt ctgtaatgtt ggcggtgcag 1020
gaagggattg acttattcac ttttccgccg gcgcccggtt ctccggagcc gcctcacctt 1080
tcccggcagc ccgagcagcc ggagcagaga gccttgggtc cggtttctat gccaaacctt 1140
gtgccggagg tgatcgatct tacctgccac gaggctggct ttccacccag tgacgacgag 1200
gatgaagagg gtgaggagtt tgtgttagat tatgtggagc accccgggca cggttgcagg 1260
tcttgtcatt atcaccggag gaatacgggg gacccagata ttatgtgttc gctttgctat 1320
atgaggacct gtggcatgtt tgtctacagt aagtgaaaaa ttatgggcag tgggtgatag 1380
agtggtgggt ttggtgtggt aatttttttt tttaattttt acagttttgt ggtttaaaga 1440
attttgtatt gtgatttttt aaaaggtcct gtgtctgaac ctgagcctga gcccgagcca 1500
gaaccggagc ctgcaagacc tacccggcgt cctaaattgg tgcctgctat cctgagacgc 1560
ccgacatcac ctgtgtctag agaatgcaat agtagtacgg atagctgtga ctccggtcct 1620
tctaacacac ctcctgagat acacccggtg gtcccgctgt gccccattaa accagttgcc 1680
gtgagagttg gtgggcgtcg ccaggctgtg gaatgtatcg aggacttgct taacgagtct 1740
gggcaacctt tggacttgag ctgtaaacgc cccaggccat aaggtgtaaa cctgtgattg 1800
cgtgtgtggt taacgccttt gtttgctgaa tgagttgatg taagtttaat aaagggtgag 1860
ataatgttta acttgcatgg cgtgttaaat ggggcggggc ttaaagggta tataatgcgc 1920
cgtgggctaa tcttggttac atctgacctc atggaggctt gggagtgttt ggaagatttt 1980
tctgctgtgc gtaacttgct ggaacagagc tctaacagta cctcttggtt ttggaggttt 2040
ctgtggggct cctcccaggc aaagttagtc tgcagaatta aggaggatta caagtgggaa 2100
tttgaagagc ttttgaaatc ctgtggtgag ctgtttgatt ctttgaatct gggtcaccag 2160
gcgcttttcc aagagaaggt catcaagact ttggattttt ccacaccggg gcgcgctgcg 2220
gctgctgttg cttttttgag ttttataaag gataaatgga gcgaagaaac ccatctgagc 2280
ggggggtacc tgctggattt tctggccatg catctgtgga gagcggtggt gagacacaag 2340
aatcgcctgc tactgttgtc ttccgtccgc ccggcaataa taccgacgga ggagcaacag 2400
caggaggaag ccaggcggcg gcggcggcag gagcagagcc catggaaccc gagagccggc 2460
ctggaccctc gggaatgaat gttgtacagg tggctgaact gtttccagaa ctgagacgca 2520
ttttaaccat taacgaggat gggcaggggc taaagggggt aaagagggag cggggggctt 2580
ctgaggctac agaggaggct aggaatctaa cttttagctt aatgaccaga caccgtcctg 2640
agtgtgttac ttttcagcag attaaggata attgcgctaa tgagcttgat ctgctggcgc 2700
agaagtattc catagagcag ctgaccactt actggctgca gccaggggat gattttgagg 2760
aggctattag ggtatatgca aaggtggcac ttaggccaga ttgcaagtac aagattagca 2820
aacttgtaaa tatcaggaat tgttgctaca tttctgggaa cggggccgag gtggagatag 2880
atacggagga tagggtggcc tttagatgta gcatgataaa tatgtggccg ggggtgcttg 2940
gcatggacgg ggtggttatt atgaatgtga ggtttactgg tcccaatttt agcggtacgg 3000
ttttcctggc caataccaat cttatcctac acggtgtaag cttctatggg tttaacaata 3060
cctgtgtgga agcctggacc gatgtaaggg ttcggggctg tgccttttac tgctgctgga 3120
agggggtggt gtgtcgcccc aaaagcaggg cttcaattaa gaaatgcctg tttgaaaggt 3180
gtaccttggg tatcctgtct gagggtaact ccagggtgcg ccacaatgtg gcctccgact 3240
gtggttgctt tatgctagtg aaaagcgtgg ctgtgattaa gcataacatg gtgtgtggca 3300
actgcgagga cagggcctct cagatgctga cctgctcgga cggcaactgt cacttgctga 3360
agaccattca cgtagccagc cactctcgca aggcctggcc agtgtttgag cacaacatac 3420
tgacccgctg ttccttgcat ttgggtaaca ggaggggggt gttcctacct taccaatgca 3480
atttgagtca cactaagata ttgcttgagc ccgagagcat gtccaaggtg aacctgaacg 3540
gggtgtttga catgaccatg aagatctgga aggtgctgag gtacgatgag acccgcacca 3600
ggtgcagacc ctgcgagtgt ggcggtaaac atattaggaa ccagcctgtg atgctggatg 3660
tgaccgagga gctgaggccc gatcacttgg tgctggcctg cacccgcgct gagtttggct 3720
ctagcgatga agatacagat tgaggtactg aaatgtgtgg gcgtggctta agggtgggaa 3780
agaatatata aggtgggggt ctcatgtagt tttgtatctg ttttgcagca gccgccgcca 3840
tgagcgccaa ctcgtttgat ggaagcattg tgagctcata tttgacaacg cgcatgcccc 3900
catgggccgg ggtgcgtcag aatgtgatgg gctccagcat tgatggtcgc cccgtcctgc 3960
ccgcaaactc tactaccttg acctacgaga ccgtgtctgg aacgccgttg gagactgcag 4020
cctccgccgc cgcttcagcc gctgcagcca ccgcccgcgg gattgtgact gactttgctt 4080
tcctgagccc gcttgcaagc agtgcagctt cccgttcatc cgcccgcgat gacaagttga 4140
cggctctttt ggcacaattg gattctttga cccgggaact taatgtcgtt tctcagcagc 4200
tgttggatct gcgccagcag gtttctgccc tgaaggcttc ctcccctccc aatgcggttt 4260
aaaacataaa taaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt cttgctgtct 4320
ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt cgttgagggt 4380
cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat acatgggcat 4440
aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg gggtggtgtt 4500
gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt ctttcagtag 4560
caagctgatt gccaggggca ggcccttggt gtaagtgttt acaaagcggt taagctggga 4620
tgggtgcata cgtggggata tgagatgcat cttggactgt atttttaggt tggctatgtt 4680
cccagccata tccctccggg gattcatgtt gtgcagaacc accagcacag tgtatccggt 4740
gcacttggga aatttgtcat gtagcttaga aggaaatgcg tggaagaact tggagacgcc 4800
cttgtgacct ccaagatttt ccatgcattc gtccataatg atggcaatgg gcccacgggc 4860
ggcggcctgg gcgaagatat ttctgggatc actaacgtca tagttgtgtt ccaggatgag 4920
atcgtcatag gccattttta caaagcgcgg gcggagggtg ccagactgcg gtataatggt 4980
tccatccggc ccaggggcgt agttaccctc acagatttgc atttcccacg ctttgagttc 5040
agatgggggg atcatgtcta cctgcggggc gatgaagaaa accgtttccg gggtagggga 5100
gatcagctgg gaagaaagca ggttcctaag cagctgcgac ttaccgcagc cggtgggccc 5160
gtaaatcaca cctattaccg gctgcaactg gtagttaaga gagctgcagc tgccgtcatc 5220
cctgagcagg ggggccactt cgttaagcat gtccctgact tgcatgtttt ccctgaccaa 5280
atccgccaga aggcgctcgc cgcccagcga tagcagttct tgcaaggaag caaagttttt 5340
caacggtttg aggccgtccg ccgtaggcat gcttttgagc gtttgaccaa gcagttccag 5400
gcggtcccac agctcggtca cgtgctctac ggcatctcga tccagcatat ctcctcgttt 5460
cgcgggttgg ggcggctttc gctgtacggc agtagtcggt gctcgtccag acgggccagg 5520
gtcatgtctt tccacgggcg cagggtcctc gtcagcgtag tctgggtcac ggtgaagggg 5580
tgcgctccgg gttgcgcgct ggccagggtg cgcttgaggc tggtcctgct ggtgctgaag 5640
cgctgccggt cttcgccctg cgcgtcggcc aggtagcatt tgaccatggt gtcatagtcc 5700
agcccctccg cggcgtggcc cttggcgcgc agcttgccct tggaggaggc gccgcacgag 5760
gggcagtgca gacttttaag ggcgtagagc ttgggcgcga gaaataccga ttccggggag 5820
taggcatccg cgccgcaggc cccgcagacg gtctcgcatt ccacgagcca ggtgagctct 5880
ggccgttcgg ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt cttacctctg 5940
gtttccatga gccggtgtcc acgctcggtg acgaaaaggc tgtccgtgtc cccgtataca 6000
gacttgagag gcctgtcctc gagcggtgtt ccgcggtcct cctcgtatag aaactcggac 6060
cactctgaga cgaaggctcg cgtccaggcc agcacgaagg aggctaagtg ggaggggtag 6120
cggtcgttgt ccactagggg gtccactcgc tccagggtgt gaagacacat gtcgccctct 6180
tcggcatcaa ggaaggtgat tggtttatag gtgtaggcca cgtgaccggg tgttcctgaa 6240
ggggggctat aaaagggggt gggggcgcgt tcgtcctcac tctcttccgc atcgctgtct 6300
gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctcaaaag cgggcatgac ttctgcgcta 6360
agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc ggtgatgcct 6420
ttgagggtgg ccgcgtccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc aagcttggtg 6480
gcaaacgacc cgtagagggc gttggacagc aacttggcga tggagcgcag ggtttggttt 6540
ttgtcgcgat cggcgcgctc cttggccgcg atgtttagct gcacgtattc gcgcgcaacg 6600
caccgccatt cgggaaagac ggtggtgcgc tcgtcgggca ctaggtgcac gcgccaaccg 6660
cggttgtgca gggtgacaag gtcaacgctg gtggctacct ctccgcgtag gcgctcgttg 6720
gtccagcaga ggcggccgcc cttgcgcgag cagaatggcg gtagtgggtc tagctgcgtc 6780
tcgtccgggg ggtctgcgtc cacggtaaag accccgggca gcaggcgcgc gtcgaagtag 6840
tctatcttgc atccttgcaa gtctagcgcc tgctgccatg cgcgggcggc aagcgcgcgc 6900
tcgtatgggt tgagtggggg accccatggc atggggtggg tgagcgcgga ggcgtacatg 6960
ccgcaaatgt cgtaaacgta gaggggctct ctgagtattc caagatatgt agggtagcat 7020
cttccaccgc ggatgctggc gcgcacgtaa tcgtatagtt cgtgcgaggg agcgaggagg 7080
tcgggaccga ggttgctacg ggcgggctgc tctgctcgga agactatctg cctgaagatg 7140
gcatgtgagt tggatgatat ggttggacgc tggaagacgt tgaagctggc gtctgtgaga 7200
cctaccgcgt cacgcacgaa ggaggcgtag gagtcgcgca gcttgttgac cagctcggcg 7260
gtgacctgca cgtctagggc gcagtagtcc agggtttcct tgatgatgtc atacttatcc 7320
tgtccctttt ttttccacag ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc tttccagtac 7380
tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtaagagc ctagcatgta gaactggttg 7440
acggcctggt aggcgcagca tcccttttct acgggtagcg cgtatgcctg cgcggccttc 7500
cggagcgagg tgtgggtgag cgcaaaggtg tccctaacca tgactttgag gtactggtat 7560
ttgaagtcag tgtcgtcgca tccgccctgc tcccagagca aaaagtccgt gcgctttttg 7620
gaacgcgggt ttggcagggc gaaggtgaca tcgttgaaga gtatctttcc cgcgcgaggc 7680
ataaagttgc gtgtgatgcg gaagggtccc ggcacctcgg aacggttgtt aattacctgg 7740
gcggcgagca cgatctcgtc aaagccgttg atgttgtggc ccacaatgta aagttccaag 7800
aagcgcggga tgcccttgat ggaaggcaat tttttaagtt cctcgtaggt gagctcttca 7860
ggggagctga gcccgtgctc tgaaagggcc cagtctgcaa gatgagggtt ggaagcgacg 7920
aatgagctcc acaggtcacg ggccattagc atttgcaggt ggtcgcgaaa ggtcctaaac 7980
tggcgaccta tggccatttt ttctggggtg atgcagtaga aggtaagcgg gtcttgttcc 8040
cagcggtccc atccaaggtc cgcggctagg tctcgcgcgg cggtcactag aggctcatct 8100
ccgccgaact tcatgaccag catgaagggc acgagctgct tcccaaaggc ccccatccaa 8160
gtataggtct ctacatcgta ggtgacaaag agacgctcgg tgcgaggatg cgagccgatc 8220
gggaagaact ggatctcccg ccaccagttg gaggagtggc tgttgatgtg gtgaaagtag 8280
aagtccctgc gacgggccga acactcgtgc tggcttttgt aaaaacgtgc gcagtactgg 8340
cagcggtgca cgggctgtac atcctgcacg aggttgacct gacgaccgcg cacaaggaag 8400
cagagtggga atttgagccc ctcgcctggc gggtttggct ggtggtcttc tacttcggct 8460
gcttgtcctt gaccgtctgg ctgctcgagg ggagttacgg tggatcggac caccacgccg 8520
cgcgagccca aagtccagat gtccgcgcgc ggcggtcgga gcttgatgac aacatcgcgc 8580
agatgggagc tgtccatggt ctggagctcc cgcggcgtca ggtcaggcgg gagctcctgc 8640
aggtttacct cgcatagccg ggtcagggcg cgggctaggt ccaggtgata cctgatttcc 8700
aggggctggt tggtggcggc gtcgatggct tgcaagaggc cgcatccccg cggcgcgact 8760
acggtaccgc gcggcgggcg gtgggccgcg ggggtgtcct tggatgatgc atctaaaagc 8820
ggtgacgcgg gcgggccccc ggaggtaggg ggggctcggg acccgccggg agagggggca 8880
ggggcacgtc ggcgccgcgc gcgggcagga gctggtgctg cgcgcggagg ttgctggcga 8940
acgcgacgac gcggcggttg atctcctgaa tctggcgcct ctgcgtgaag acgacgggcc 9000
cggtgagctt gaacctgaaa gagagttcga cagaatcaat ttcggtgtcg ttgacggcgg 9060
cctggcgcaa aatctcctgc acgtctcctg agttgtcttg ataggcgatc tcggccatga 9120
actgctcgat ctcttcctcc tggagatctc cgcgtccggc tcgctccacg gtggcggcga 9180
ggtcgttgga gatgcgggcc atgagctgcg agaaggcgtt gaggcctccc tcgttccaga 9240
cgcggctgta gaccacgccc ccttcggcat cgcgggcgcg catgaccacc tgcgcgagat 9300
tgagctccac gtgccgggcg aagacggcgt agtttcgcag gcgctgaaag aggtagttga 9360
gggtggtggc ggtgtgttct gccacgaaga agtacataac ccagcgccgc aacgtggatt 9420
cgttgatatc ccccaaggcc tcaaggcgct ccatggcctc gtagaagtcc acggcgaagt 9480
tgaaaaactg ggagttgcgc gccgacacgg ttaactcctc ctccagaaga cggatgagct 9540
cggcgacagt gtcgcgcacc tcgcgctcaa aggctacagg ggcctcttct tcttcttcaa 9600
tctcctcttc cataagggcc tccccttctt cttcttctgg cggcggtggg ggagggggga 9660
cacggcggcg acgacggcgc accgggaggc ggtcgacaaa gcgctcgatc atctccccgc 9720
ggcgacggcg catggtctcg gtgacggcgc ggccgttctc gcgggggcgc agttggaaga 9780
cgccgcccgt catgtcccgg ttatgggttg gcggggggct gccgtgcggc agggatacgg 9840
cgctaacgat gcatctcaac aattgttgtg taggtactcc gccaccgagg gacctgagcg 9900
agtccgcatc gaccggatcg gaaaacctct cgagaaaggc gtctaaccag tcacagtcgc 9960
aaggtaggct gagcaccgtg gcgggcggca gcgggcggcg gtcggggttg tttctggcgg 10020
aggtgctgct gatgatgtaa ttaaagtagg cggtcttgag acggcggatg gtcgacagaa 10080
gcaccatgtc cttgggtccg gcctgctgaa tgcgcaggcg gtcggccatg ccccaggctt 10140
cgttttgaca tcggcgcagg tctttgtagt agtcttgcat gagcctttct accggcactt 10200
cttcttctcc ttcctcttgt cctgcatctc ttgcatctat cgctgcggcg gcggcggagt 10260
ttggccgtag gtggcgccct cttcctccca tgcgtgtgac cccgaagccc ctcatcggct 10320
gaagcagggc caggtcggcg acaacgcgct cggctaatat ggcctgctgc acctgcgtga 10380
gggtagactg gaagtcgtcc atgtccacaa agcggtggta tgcgcccgtg ttgatggtgt 10440
aagtgcagtt ggccataacg gaccagttaa cggtctggtg acccggctgc gagagctcgg 10500
tgtacctgag acgcgagtaa gcccttgagt caaagacgta gtcgttgcaa gtccgcacca 10560
ggtactggta tcccaccaaa aagtgcggcg gcggctggcg gtagaggggc cagcgtaggg 10620
tggccggggc tccgggggcg aggtcttcca acataaggcg atgatatccg tagatgtacc 10680
tggacatcca ggtgatgccg gcggcggtgg tggaggcgcg cggaaagtca cggacgcggt 10740
tccagatgtt gcgcagcggc aaaaagtgct ccatggtcgg gacgctctgg ccggtcaggc 10800
gcgcgcagtc gttgacgctc tagaccgtgc aaaaggagag cctgtaagcg ggcactcttc 10860
cgtggtctgg tggataaatt cgcaagggta tcatggcgga cgaccggggt tcgaaccccg 10920
gatccggccg tccgccgtga tccatgcggt taccgcccgc gtgtcgaacc caggtgtgcg 10980
acgtcagaca acgggggagc gctccttttg gcttccttcc aggcgcggcg gatgctgcgc 11040
tagctttttt ggccactggc cgcgcgcggc gtaagcggtt aggctggaaa gcgaaagcat 11100
taagtggctc gctccctgta gccggagggt tattttccaa gggttgagtc gcgggacccc 11160
cggttcgagt ctcgggccgg ccggactgcg gcgaacgggg gtttgcctcc ccgtcatgca 11220
agaccccgct tgcaaattcc tccggaaaca gggacgagcc ccttttttgc ttttcccaga 11280
tgcatccggt gctgcggcag atgcgccccc ctcctcagca gcggcaagag caagagcagc 11340
ggcagacatg cagggcaccc tccccttctc ctaccgcgtc aggaggggca acatccgcgg 11400
ctgacgcggc ggcagatggt gattacgaac ccccgcggcg ccggacccgg cactacttgg 11460
acttggagga gggcgagggc ctggcgcggc taggagcgcc ctctcctgag cgacacccaa 11520
gggtgcagct gaagcgtgac acgcgcgagg cgtacgtgcc gcggcagaac ctgtttcgcg 11580
accgcgaggg agaggagccc gaggagatgc gggatcgaaa gttccatgca gggcgcgagt 11640
tgcggcatgg cctgaaccgc gagcggttgc tgcgcgagga ggactttgag cccgacgcgc 11700
ggaccgggat tagtcccgcg cgcgcacacg tggcggccgc cgacctggta accgcgtacg 11760
agcagacggt gaaccaggag attaactttc aaaaaagctt taacaaccac gtgcgcacgc 11820
ttgtggcgcg cgaggaggtg gctataggac tgatgcatct gtgggacttt gtaagcgcgc 11880
tggagcaaaa cccaaatagc aagccgctca tggcgcagct gttccttata gtgcagcaca 11940
gcagggacaa cgaggcattc agggatgcgc tgctaaacat agtagagccc gagggccgct 12000
ggctgctcga tttgataaac attctgcaga gcatagtggt gcaggagcgc agcttgagcc 12060
tggctgacaa ggtggccgcc attaactatt ccatgctcag tctgggcaag ttttacgccc 12120
gcaagatata ccatacccct tacgttccca tagacaagga ggtaaagatc gaggggttct 12180
acatgcgcat ggcgctgaag gtgcttacct tgagcgacga cctgggcgtt tatcgcaacg 12240
agcgcatcca caaggccgtg agcgtgagcc ggcggcgcga gctcagcgac cgcgagctga 12300
tgcacagcct gcaaagggcc ctggctggca cgggcagcgg cgatagagag gccgagtcct 12360
actttgacgc gggcgctgac ctgcgctggg ccccaagccg acgcgccctg gaggcagctg 12420
gggccggacc tgggctggcg gtggcacccg cgcgcgctgg caacgtcggc ggcgtggagg 12480
aatatgacga ggacgatgag tacgagccag aggacggcga gtactaagcg gtgatgtttc 12540
tgatcagatg atgcaagacg caacggaccc ggcggtgcgg gcggcgctgc agagccagcc 12600
gtccggcctt aactccacgg acgactggcg ccaggtcatg gaccgcatca tgtcgctgac 12660
tgcgcgcaac cctgacgcgt tccggcagca gccgcaggcc aaccggctct ccgcaattct 12720
ggaagcggtg gtcccggcgc gcgcaaaccc cacgcacgag aaggtgctgg cgatcgtaaa 12780
cgcgctggcc gaaaacaggg ccatccggcc cgatgaggcc ggcctggtct acgacgcgct 12840
gcttcagcgc gtggctcgtt acaacagcag caacgtgcag accaacctgg accggctggt 12900
gggggatgtg cgcgaggccg tggcgcagcg tgagcgcgcg cagcagcagg gcaacctggg 12960
ctccatggtt gcactaaacg ccttcctgag tacacagccc gccaacgtgc cgcggggaca 13020
ggaggactac accaactttg tgagcgcact gcggctaatg gtgactgaga caccgcaaag 13080
tgaggtgtat cagtccgggc cagactattt tttccagacc agtagacaag gcctgcagac 13140
cgtaaacctg agccaggctt tcaagaactt gcaggggctg tggggggtgc gggctcccac 13200
aggcgaccgc gcgaccgtgt ctagcttgct gacgcccaac tcgcgcctgt tgctgctgct 13260
aatagcgccc ttcacggaca gtggcagcgt gtcccgggac acatacctag gtcacttgct 13320
gacactgtac cgcgaggcca taggtcaggc gcatgtggac gagcatactt tccaggagat 13380
tacaagtgtt agccgcgcgc tggggcagga ggacacgggc agcctggagg caaccctgaa 13440
ctacctgctg accaaccggc ggcaaaaaat cccctcgttg cacagtttaa acagcgagga 13500
ggagcgcatt ttgcgctatg tgcagcagag cgtgagcctt aacctgatgc gcgacggggt 13560
aacgcccagc gtggcgctgg acatgaccgc gcgcaacatg gaaccgggca tgtatgcctc 13620
aaaccggccg tttatcaatc gcctaatgga ctacttgcat cgcgcggccg ccgtgaaccc 13680
cgagtatttc accaatgcca tcttgaaccc gcactggcta ccgccccctg gtttctacac 13740
cgggggattc gaggtgcccg agggtaacga tggattcctc tgggacgaca tagacgacag 13800
cgtgttttcc ccgcaaccgc agaccctgct agagttgcaa caacgcgagc aggcagaggc 13860
ggcgctgcga aaggaaagct tccgcaggcc aagcagcttg tccgatctag gcgctgcggc 13920
cccgcggtca gatgctagta gcccatttcc aagcttgata gggtctctta ccagcactcg 13980
caccacccgc ccgcgcctgc tgggcgagga ggagtaccta aacaactcgc tgctgcagcc 14040
gcagcgcgaa aagaacctgc ctccggcgtt tcccaacaac gggatagaga gcctagtgga 14100
caagatgagt agatggaaga cgtatgcgca ggagcacagg gatgtgcccg gcccgcgccc 14160
gcccacccgt cgtcaaaggc acgaccgtca gcggggtctg gtgtgggagg acgatgactc 14220
ggcagacgac agcagcgtct tggatttggg agggagtggc aacccgtttg cacaccttcg 14280
ccccaggctg gggagaatgt tttaaaaaaa gcatgatgca aaataaaaaa ctcaccaagg 14340
ccatggcacc gagcgttggt tttcttgtat tccccttagt atgcggcgcg cggcgatgta 14400
tgaggaaggt cctcctccct cctacgagag cgtggtgagc gcggcgccag tggcggcggc 14460
gctgggttca cccttcgatg ctcccctgga cccgccgttc gtgcctccgc ggtacctgcg 14520
gcctaccggg gggagaaaca gcatccgtta ctctgagttg gcacccctat tcgacaccac 14580
ccgtgtgtac cttgtggaca acaagtcaac ggatgtggca tccctgaact accagaacga 14640
ccacagcaac tttctaacca cggtcattca aaacaatgac tacagcccgg gggaggcaag 14700
cacacagacc atcaatcttg acgaccggtc gcactggggc ggcgacctga aaaccatcct 14760
gcataccaac atgccaaatg tgaacgagtt catgtttacc aataagttta aggcgcgggt 14820
gatggtgtcg cgctcgctta ctaaggacaa acaggtggag ctgaaatacg agtgggtgga 14880
gttcacgctg cccgagggca actactccga gaccatgacc atagacctta tgaacaacgc 14940
gatcgtggag cactacttga aagtgggcag gcagaacggg gttctggaaa gcgacatcgg 15000
ggtaaagttt gacacccgca acttcagact ggggtttgac ccagtcactg gtcttgtcat 15060
gcctggggta tatacaaacg aagccttcca tccagacatc attttgctgc caggatgcgg 15120
ggtggacttc acccacagcc gcctgagcaa cttgttgggc atccgcaagc ggcaaccctt 15180
ccaggagggc tttaggatca cctacgatga cctggagggt ggtaacattc ccgcactgtt 15240
ggatgtggac gcctaccagg caagcttgaa agatgacacc gaacagggcg ggggtggcgc 15300
aggcggcggc aacaacagtg gcagcggcgc ggaagagaac tccaacgcgg cagctgcggc 15360
aatgcagccg gtggaggaca tgaacgatca tgccattcgc ggcgacacct ttgccacacg 15420
ggcggaggag aagcgcgctg aggccgaggc agcggccgaa gctgccgccc ccgctgcgga 15480
ggctgcacaa cccgaggtcg agaagcctca gaagaaaccg gtgattaaac ccctgacaga 15540
ggacagcaag aaacgcagtt acaacctaat aagcaatgac agcaccttca cccagtaccg 15600
cagctggtac cttgcataca actacggcga ccctcaggcc gggatccgct catggaccct 15660
gctttgcact cctgacgtaa cctgcggctc ggagcaggta tactggtcgt tgcccgacat 15720
gatgcaagac cccgtgacct tccgctccac gcgccagatc agcaactttc cggtggtggg 15780
cgccgagctg ttgcccgtgc actccaagag cttctacaac gaccaggccg tctactccca 15840
gctcatccgc cagtttacct ctctgaccca cgtgttcaat cgctttcccg agaaccagat 15900
tttggcgcgc ccgccagccc ccaccatcac caccgtcagt gaaaacgttc ctgctctcac 15960
agatcacggg acgctaccgc tgcgcaacag catcggagga gtccagcgag tgaccattac 16020
tgacgccaga cgccgcacct gcccctacgt ttacaaggcc ctgggcatag tctcgccgcg 16080
cgtcctatcg agccgcactt tttgagcaag catgtccatc cttatatcgc ccagcaataa 16140
cacaggctgg ggcctgcgct tcccaagcaa gatgtttggc ggggccaaga agcgctccga 16200
ccaacaccca gtgcgcgtgc gcgggcacta ccgcgcgccc tggggcgcgc acaaacgcgg 16260
ccgcactggg cgcaccaccg tcgatgacgc catcgacgcg gtggtggagg aggcgcgcaa 16320
ctacacgccc acgccgccgc cagtgtccac cgtggacgcg gccattcaga ccgtggtgcg 16380
cggagcccgg cgctacgcta aaatgaagag acggcggagg cgcgtagcac gtcgccaccg 16440
ccgccgaccc ggcactgccg cccaacgcgc ggcggcggcc ctgcttaacc gcgcacgtcg 16500
caccggccga cgggcggcca tgcgagccgc tcgaaggctg gccgcgggta ttgtcactgt 16560
gccccccagg tccaggcgac gagcggccgc cgcagcagcc gcggccatta gtgctatgac 16620
tcagggtcgc aggggcaacg tgtactgggt gcgcgactcg gttagcggcc tgcgcgtgcc 16680
cgtgcgcacc cgccccccgc gcaactagat tgcaataaaa aactacttag actcgtactg 16740
ttgtatgtat ccagcggcgg cggcgcgcat cgaagctatg tccaagcgca aaatcaaaga 16800
agagatgctc caggtcatcg cgccggagat ctatggcccc ccgaagaagg aagagcagga 16860
ttacaagccc cgaaagctaa agcgggtcaa aaagaaaaag aaagatgatg atgatgatga 16920
acttgacgac gaggtggaac tgttgcacgc gaccgcgccc aggcgacggg tacagtggaa 16980
aggtcgacgc gtaagacgtg ttttgcgacc cggcaccacc gtagtcttta cgcccggtga 17040
gcgctccacc cgcacctaca agcgcgtgta tgatgaggtg tacggcgacg aggacctgct 17100
tgagcaggcc aacgagcgcc tcggggagtt tgcctacgga aagcggcata aggacatgct 17160
ggcgttgccg ctggacgagg gcaacccaac acctagccta aagcccgtga cactgcagca 17220
ggtgctgccc gcgcttgcac cgtccgaaga aaagcgcggc ctaaagcgcg agtctggtga 17280
cttggcaccc accgtgcagc tgatggtacc caagcgtcag cgactggaag atgtcttgga 17340
aaaaatgacc gtggagcctg ggctggagcc cgaggtccgc gtgcggccaa tcaagcaggt 17400
ggcaccggga ctgggcgtgc agaccgtgga cgttcagata cccaccacca gtagcactag 17460
tattgccact gccacagagg gcatggagac acaaacgtcc ccggttgcct cggcggtggc 17520
agatgccgcg gtgcaggcgg ccgctgcggc cgcgtccaag acctctacgg aggtgcaaac 17580
ggacccgtgg atgtttcgtg tttcagcccc ccggcgtccg cgccgttcaa ggaagtacgg 17640
cgccgccagc gcgctactgc ccgaatatgc cctacatcct tccatcgcgc ctacccccgg 17700
ctatcgtggc tacacctacc gccccagaag acgagcaact acccgacgcc gaaccaccac 17760
tggaacccgc cgccgccgtc gccgtcgcca gcccgtgctg gccccgattt ccgtgcgcag 17820
ggtggctcgc gaaggaggca ggaccctggt gctgccaaca gcgcgctacc accccagcat 17880
cgtttaaaag ccggtctttg tggttcttgc agatatggcc ctcacctgcc gcctccgttt 17940
cccggtgccg ggattccgag gaagaatgca ccgtaggagg ggcatggccg gccacggcct 18000
gacgggcggc atgcgtcgtg cgcaccaccg gcggcggcgc gcgtcgcacc gtcgcatgcg 18060
cggcggtatc ctgcccctcc ttattccact gatcgccgcg gcgattggcg ccgtgcccgg 18120
aattgcatcc gtggccttgc aggcgcagag acactgatta aaaacaagtt acatgtggaa 18180
aaatcaaaat aaaagtctgg actctcacgc tcgcttggtc ctgtaactat tttgtagaat 18240
ggaagacatc aactttgcgt cactggcccc gcgacacggc tcgcgcccgt tcatgggaaa 18300
ctggcaagat atcggcacca gcaatatgag cggtggcgcc ttcagctggg gctcgctgtg 18360
gagcggcatt aaaaatttcg gttccgccgt taagaactat ggcagcaaag cctggaacag 18420
cagcacaggc cagatgctga gggacaagtt gaaagagcaa aatttccaac aaaaggtggt 18480
agatggcctg gcctctggca ttagcggggt ggtggacctg gccaaccagg cagtgcaaaa 18540
taagattaac agtaagcttg atccccgccc tcccgtagag gagcctccac cggccgtgga 18600
gacagtgtct ccagaggggc gtggcgaaaa gcgtccgcga cccgacaggg aagaaactct 18660
ggtgacgcaa atagacgagc ctccctcgta cgaggaggca ctaaagcaag gcctgcccac 18720
cacccgtccc atcgcgccca tggctaccgg agtgctgggc cagcacacac ccgtaacgct 18780
ggacctgcct ccccccgccg acacccagca gaaacctgtg ctgccaggcc cgtccgccgt 18840
tgttgtaacc cgtcctagcc gcgcgtccct gcgccgcgcc gccagcggtc cgcgatcgtt 18900
gcggcccgta gccagtggca actggcaaag cacactgaac agcatcgtgg gtttgggggt 18960
gcaatccctg aagcgccgac gatgcttctg atagctaacg tgtcgtatgt gtgtcatgta 19020
tgcgtccatg tcgccgccag aggagctgct gagccgccgc gcgcccgctt tccaagatgg 19080
ctaccccttc gatgatgccg cagtggtctt acatgcacat ctcgggccag gacgcctcgg 19140
agtacctgag ccccgggctg gtgcagttcg cccgcgccac cgagacgtac ttcagcctga 19200
ataacaagtt tagaaacccc acggtggcgc ctacgcacga cgtgaccaca gaccggtctc 19260
agcgtttgac gctgcggttc atccccgtgg accgcgagga tactgcgtac tcgtacaagg 19320
cgcggttcac cctagctgtg ggtgataacc gtgtgctaga catggcttcc acgtactttg 19380
acatccgcgg cgtgctggac aggggcccta cttttaagcc ctactctggc actgcctaca 19440
acgcactggc ccccaagggt gcccccaact cgtgcgagtg ggaacaaaat gaaactgcac 19500
aagtggatgc tcaagaactt gacgaagagg agaatgaagc caatgaagct caggcgcgag 19560
aacaggaaca agctaagaaa acccatgtat atgcccaggc tccactgtcc ggaataaaaa 19620
taactaaaga aggtctacaa ataggaactg ccgacgccac agtagcaggt gccggcaaag 19680
aaattttcgc agacaaaact tttcaacctg aaccacaagt aggagaatct caatggaacg 19740
aagcggatgc cacagcagct ggtggaaggg ttcttaaaaa gacaactccc atgaaaccct 19800
gctatggctc atacgctaga cccaccaatt ccaacggcgg acagggcgtt atggttgaac 19860
aaaatggtaa attggaaagt caagtcgaaa tgcaattttt ttccacatcc acaaatgcca 19920
caaatgaagt taacaatata caaccaacag ttgtattgta cagcgaagat gtaaacatgg 19980
aaactccaga tactcatctt tcttataaac ctaaaatggg ggataaaaat gccaaagtca 20040
tgcttggaca acaagcaatg ccaaacagac caaattacat tgcttttaga gacaatttta 20100
ttggtctcat gtattacaac agcacaggta acatgggtgt ccttgctggt caggcatcgc 20160
agttgaacgc tgttgtagat ttgcaagaca gaaacacaga gctgtcctac cagcttttgc 20220
ttgattcaat tggcgacaga acaagatact tttcaatgtg gaatcaagct gttgacagct 20280
atgatccaga tgtcagaatt attgagaacc atggaactga ggatgagttg ccaaattatt 20340
gctttcctct tggtggaatt gggattactg acacttttca agctgttaaa acaactgctg 20400
ctaacgggga ccaaggcaat actacctggc aaaaagattc aacatttgca gaacgcaatg 20460
aaataggggt gggaaataac tttgccatgg aaattaacct gaatgccaac ctatggagaa 20520
atttccttta ctccaatatt gcgctgtacc tgccagacaa gctaaaatac aaccccacca 20580
atgtggaaat atctgacaac cccaacacct acgactacat gaacaagcga gtggtggctc 20640
ctgggcttgt agactgctac attaaccttg gggcgcgctg gtctctggac tacatggaca 20700
acgttaatcc ctttaaccac caccgcaatg cgggcctgcg ttaccgctcc atgttgttgg 20760
gaaacggccg ctacgtgccc tttcacattc aggtgcccca aaagtttttt gccattaaaa 20820
acctcctcct cctgccaggc tcatacacat atgaatggaa cttcaggaag gatgttaaca 20880
tggttctgca gagctctctg ggaaacgacc ttagagttga cggggctagc attaagtttg 20940
acagcatttg tctttacgcc accttcttcc ccatggccca caacacggcc tccacgctgg 21000
aagccatgct cagaaatgac accaacgacc agtcctttaa tgactacctt tccgccgcca 21060
acatgctata tcccataccc gccaacgcca ccaacgtgcc catctccatc ccatcgcgca 21120
actgggcagc atttcgcggt tgggccttca cacgcttgaa gacaaaggaa accccttccc 21180
tgggatcagg ctacgaccct tactacacct actctggctc cataccatac cttgacggaa 21240
ccttctatct taatcacacc tttaagaagg tggccattac ttttgactct tctgttagct 21300
ggccgggcaa cgaccgcctg cttactccca atgagtttga gattaagcgc tcagttgacg 21360
gggagggcta taacgtagct cagtgcaaca tgacaaagga ctggttccta gtgcagatgt 21420
tggccaacta caatattggc taccagggct tctacattcc agaaagctac aaagaccgca 21480
tgtactcgtt cttcagaaac ttccagccca tgagccggca agtggtggac gatactaaat 21540
acaaagatta tcagcaggtt ggaattatcc accagcataa caactcaggc ttcgtaggct 21600
acctcgctcc caccatgcgc gagggacaag cttaccccgc taatgttccc tacccactaa 21660
taggcaaaac cgcggttgat agtattaccc agaaaaagtt tctttgcgac cgcaccctgt 21720
ggcgcatccc cttctccagt aactttatgt ccatgggtgc gctcacagac ctgggccaaa 21780
accttctcta cgcaaactcc gcccacgcgc tagacatgac ctttgaggtg gatcccatgg 21840
acgagcccac ccttctttat gttttgtttg aagtctttga cgtggtccgt gtgcaccagc 21900
cgcaccgcgg cgtcatcgag accgtgtacc tgcgcacgcc cttctcggcc ggcaacgcca 21960
caacataaag aagcaagcaa catcaacaac agctgccgcc atgggctcca gtgagcagga 22020
actgaaagcc attgtcaaag atcttggttg tgggccatat tttttgggca cctatgacaa 22080
gcgcttccca ggctttgttt ccccacacaa gctcgcctgc gccatagtta acacggccgg 22140
tcgcgagact gggggcgtac actggatggc ctttgcctgg aacccgcgct caaaaacatg 22200
ctacctcttt gagccctttg gcttttctga ccaacgtctc aagcaggttt accagtttga 22260
gtacgagtca ctcctgcgcc gtagcgccat tgcctcttcc cccgaccgct gtataacgct 22320
ggaaaagtcc acccaaagcg tgcaggggcc caactcggcc gcctgtggcc tattctgctg 22380
catgtttctc cacgcctttg ccaactggcc ccaaactccc atggatcaca accccaccat 22440
gaaccttatt accggggtac ccaactccat gcttaacagt ccccaggtac agcccaccct 22500
gcgccgcaac caggaacagc tctacagctt cctggagcgc cactcgccct acttccgcag 22560
ccacagtgcg caaattagga gcgccacttc tttttgtcac ttgaaaaaca tgtaaaaata 22620
atgtactagg agacactttc aataaaggca aatgttttta tttgtacact ctcgggtgat 22680
tatttacccc cacccttgcc gtctgcgccg tttaaaaatc aaaggggttc tgccgcgcat 22740
cgctatgcgc cactggcagg gacacgttgc gatactggtg tttagtgctc cacttaaact 22800
caggcacaac catccgcggc agctcggtga agttttcact ccacaggctg cgcaccatca 22860
ccaacgcgtt tagcaggtcg ggcgccgata tcttgaagtc gcagttgggg cctccgccct 22920
gcgcgcgcga gttgcgatac acagggttac agcactggaa cactatcagc gccgggtggt 22980
gcacgctggc cagcacgctc ttgtcggaga tcagatccgc gtccaggtcc tccgcgttgc 23040
tcagggcgaa cggagtcaac tttggtagct gccttcccaa aaagggtgca tgcccaggct 23100
ttgagttgca ctcgcaccgt agtggcatca gaaggtgacc gtgcccagtc tgggcgttag 23160
gatacagcgc ctgcatgaaa gccttgatct gcttaaaagc cacctgagcc tttgcgcctt 23220
cagagaagaa catgccgcaa gacttgccgg aaaactgatt ggccggacag gccgcgtcat 23280
gcacgcagca ccttgcgtcg gtgttggaga tctgcaccac atttcggccc caccggttct 23340
tcacgatctt ggccttgcta gactgctcct tcagcgcgcg ctgcccgttt tcgctcgtca 23400
catccatttc aatcacgtgc tccttattta tcataatgct cccgtgtaga cacttaagct 23460
cgccttcgat ctcagcgcag cggtgcagcc acaacgcgca gcccgtgggc tcgtggtgct 23520
tgtaggttac ctctgcaaac gactgcaggt acgcctgcag gaatcgcccc atcatcgtca 23580
caaaggtctt gttgctggtg aaggtcagct gcaacccgcg gtgctcctcg tttagccagg 23640
tcttgcatac ggccgccaga gcttccactt ggtcaggcag tagcttgaag tttgccttta 23700
gatcgttatc cacgtggtac ttgtccatca acgcgcgcgc agcctccatg cccttctccc 23760
acgcagacac gatcggcagg ctcagcgggt ttatcaccgt gctttcactt tccgcttcac 23820
tggactcttc cttttcctct tgcatccgca taccccgcgc cactgggtcg tcttcattca 23880
gccgccgcac cgtgcgctta cctcccttgc cgtgcttgat tagcaccggt gggttgctga 23940
aacccaccat ttgtagcgcc acatcttctc tttcttcctc gctgtccacg atcacctctg 24000
gggatggcgg gcgctcgggc ttgggagagg ggcgcttctt tttctttttg gacgcaatgg 24060
ccaaatccgc cgtcgaggtc gatggccgcg ggctgggtgt gcgcggcacc agcgcatctt 24120
gtgacgagtc ttcttcgtcc tcggactcga gacgccgcct cagccgcttt tttgggggcg 24180
cgcggggagg cggcggcgac ggcgacgggg acgagacgtc ctccatggtt ggtggacgtc 24240
gcgccgcacc gcgtccgcgc tcgggggtgg tttcgcgctg ctcctcttcc cgactggcca 24300
tttccttctc ctataggcag aaaaagatca tggagtcagt cgagaaggag gacagcctaa 24360
ccgccccctt tgagttcgcc accaccgcct ccaccgatgc cgccaacgcg cctaccacct 24420
tccccgtcga ggcacccccg cttgaggagg aggaagtgat tatcgagcag gacccaggtt 24480
ttgtaagcga agacgacgaa gatcgctcag taccaacaga ggataaaaag caagaccagg 24540
acgacgcaga ggcaaacgag gaacaagtcg ggcgggggga ccaaaggcat ggcgactacc 24600
tagatgtggg agacgacgtg ctgttgaagc atctgcagcg ccagtgcgcc attatctgcg 24660
acgcgttgca agagcgcagc gatgtgcccc tcgccatagc ggatgtcagc cttgcctacg 24720
aacgccacct gttctcaccg cgcgtacccc ccaaacgcca agaaaacggc acatgcgagc 24780
ccaacccgcg cctcaacttc taccccgtat ttgccgtgcc agaggtgctt gccacctatc 24840
acatcttttt ccaaaactgc aagatacccc tatcctgccg tgccaaccgc agccgagcgg 24900
acaagcagct ggccttgcgg cagggcgctg tcatacctga tatcgcctcg ctcgacgaag 24960
tgccaaaaat ctttgagggt cttggacgcg acgagaagcg cgcggcaaac gctctgcaac 25020
aagaaaacag cgaaaatgaa agtcactgtg gagtgctggt ggaacttgag ggtgacaacg 25080
cgcgcctagc cgtgctgaaa cgcagcatcg aggtcaccca ctttgcctac ccggcactta 25140
acctaccccc caaggttatg agcacagtca tgagcgagct gatcgtgcgc cgtgcacgac 25200
ccctggagag ggatgcaaac ttgcaagaac aaaccgagga gggcctaccc gcagttggcg 25260
atgagcagct ggcgcgctgg cttgagacgc gcgagcctgc cgacttggag gagcgacgca 25320
agctaatgat ggccgcagtg cttgttaccg tggagcttga gtgcatgcag cggttctttg 25380
ctgacccgga gatgcagcgc aagctagagg aaacgttgca ctacaccttt cgccagggct 25440
acgtgcgcca ggcctgcaaa atttccaacg tggagctctg caacctggtc tcctaccttg 25500
gaattttgca cgaaaaccgc cttgggcaaa acgtgcttca ttccacgctc aagggcgagg 25560
cgcgccgcga ctacgtccgc gactgcgttt acttatttct gtgctacacc tggcaaacgg 25620
ccatgggcgt gtggcagcag tgcctggagg agcgcaacct gaaggagctg cagaagctgc 25680
taaagcaaaa cttgaaggac ctatggacgg ccttcaacga gcgctccgtg gccgcgcacc 25740
tggcggacat tatcttcccc gaacgcctgc ttaaaaccct gcaacagggt ctgccagact 25800
tcaccagtca aagcatgttg caaaacttta ggaactttat cctagagcgt tcaggaattc 25860
tgcccgccac ctgctgtgcg cttcctagcg actttgtgcc cattaagtac cgtgaatgcc 25920
ctccgccgct ttggggtcac tgctaccttc tgcagctagc caactacctt gcctaccact 25980
ccgacatcat ggaagacgtg agcggtgacg gcctactgga gtgtcactgt cgctgcaacc 26040
tatgcacccc gcaccgctcc ctggtctgca attcacaact gcttagcgaa agtcaaatta 26100
tcggtacctt tgagctgcag ggtccctcgc ctgacgaaaa gtccgcggct ccggggttga 26160
aactcactcc ggggctgtgg acgtcggctt accttcgcaa atttgtacct gaggactacc 26220
acgcccacga gattaggttc tacgaagacc aatcccgccc gccaaatgcg gagcttaccg 26280
cctgcgtcat tacccagggc cacatccttg gccaattgca agccattaac aaagcccgcc 26340
aagagtttct gctacgaaag ggacgggggg tttacttgga cccccagtcc ggcgaggagc 26400
tcaacccaat ccccccgccg ccgcagccct atcagcagcc gcgggccctt gcttcccagg 26460
atggcaccca aaaagaagct gcagctgccg ccgccgccac ccacggacga ggaggaatac 26520
tgggacagtc aggcagagga ggttttggac gaggaggagg agatgatgga agactgggac 26580
agcctagacg aggaagcttc cgaggccgaa gaggtgtcag acgaaacacc gtcaccctcg 26640
gtcgcattcc cctcgccggc gccccagaaa tcggcaaccg ttcccagcat tgctacaacc 26700
tccgctcctc aggcgccgcc ggcactgccc gttcgccgac ccaaccgtag atgggacacc 26760
actggaacca gggccggtaa gtctaagcag ccgccgccgt tagcccaaga gcaacaacag 26820
cgccaaggct accgctcgtg gcgcgtgcac aagaacgcca tagttgcttg cttgcaagac 26880
tgtgggggca acatctcctt cgcccgccgc tttcttctct accatcacgg cgtggccttc 26940
ccccgtaaca tcctgcatta ctaccgtcat ctctacagcc cctactgcac cggcggcagc 27000
ggcagcaaca gcagcggcca cgcagaagca aaggcgaccg gatagcaaga ctctgacaaa 27060
gcccaagaaa tccacagcgg cggcagcagc aggaggagga gcactgcgtc tggcgcccaa 27120
cgaacccgta tcgacccgcg agcttagaaa caggattttt cccactctgt atgctatatt 27180
tcaacagagc aggggccaag aacaagagct gaaaataaaa aacaggtctc tgcgctccct 27240
cacccgcagc tgcctgtatc acaaaagcga agatcagctt cggcgcacgc tggaagacgc 27300
ggaggctctc ttcagcaaat actgcgcgct gactcttaag gactagtttc gcgccctttc 27360
tcaaatttaa gcgcgaaaac tacgtcatct ccagcggcca cacccggcgc cagcacctgt 27420
cgtcagcgcc attatgagca aggaaattcc cacgccctac atgtggagtt accagccaca 27480
aatgggactt gcggctggag ctgcccaaga ctactcaacc cgaataaact acatgagcgc 27540
gggaccccac atgatatccc gggtcaacgg aatccgcgcc caccgaaacc gaattctcct 27600
cgaacaggcg gctattacca ccacacctcg taataacctt aatccccgta gttggcccgc 27660
tgccctggtg taccaggaaa gtcccgctcc caccactgtg gtacttccca gagacgccca 27720
ggccgaagtt cagatgacta actcaggggc gcagcttgcg ggcggctttc gtcacagggt 27780
gcggtcgccc gggcagggta taactcacct gaaaatcaga gggcgaggta ttcagctcaa 27840
cgacgagtcg gtgagctcct ctcttggtct ccgtccggac gggacatttc agatcggcgg 27900
cgctggccgc tcttcattta cgccccgtca ggcgatccta actctgcaga cctcgtcctc 27960
ggagccgcgc tccggaggca ttggaactct acaatttatt gaggagttcg tgccttcggt 28020
ttacttcaac cccttttctg gacctcccgg ccactacccg gaccagttta ttcccaactt 28080
tgacgcggta aaagactcgg cggacggcta cgactgaatg accagtggag aggcagagca 28140
actgcgcctg acacacctcg accactgccg ccgccacaag tgctttgccc gcggctccgg 28200
tgagttttgt tactttgaat tgcccgaaga gcatatcgag ggcccggcgc acggcgtccg 28260
gctcaccacc caggtagagc ttacacgtag cctgattcgg gagtttacca agcgccccct 28320
gctagtggag cgggagcggg gtccctgtgt tctgaccgtg gtttgcaact gtcctaaccc 28380
tggattacat caagatcttt gttgtcatct ctgtgctgag tataataaat acagaaatta 28440
gaatctactg gggctcctgt cgccatcctg tgaacgccac cgtttttacc cacccaaagc 28500
agaccaaagc aaacctcacc tccggtttgc acaagcgggc caataagtac cttacctggt 28560
actttaacgg ctcttcattt gtaatttaca acagtttcca gcgagacgaa gtaagtttgc 28620
cacacaacct tctcggcttc aactacaccg tcaagaaaaa caccaccacc accctcctca 28680
cctgccggga acgtacgagt gcgtcaccgg ttgctgcgcc cacacctaca gcctgagcgt 28740
aaccagacat tactcccatt ttcccaaaac aggaggtgag ctcaactccc ggaactcagg 28800
tcaaaaaagc attttgcggg gtgctgggat tttttaatta agtatatgtg gctgcagagc 28860
ctgctgctct tgggcactgt ggcctgcagc atctctgcac ccgcccgctc gcccagcccc 28920
agcacgcagc cctgggagca tgtgaatgcc atccaggagg cccggcgtct cctgaacctg 28980
agtagagaca ctgctgctga gatgaatgaa acagtagaag tcatctcaga aatgtttgac 29040
ctccaggagc cgacctgcct acagacccgc ctggagctgt acaagcaggg cctgcggggc 29100
agcctcacca agctcaaggg ccccttgacc atgatggcca gccactacaa gcagcactgc 29160
cctccaaccc cggaaacttc ctgtgcaacc cagattatca cctttgaaag tttcaaagag 29220
aacctgaagg actttctgct tgtcatcccc tttgactgct gggagccagt ccaggagtga 29280
agctattttc cgcttgcttg tattcccctg gacaatttac tctatgtggg atatgcgcca 29340
ggcgggaaag attataccca caaccttcaa atcaaacttt cctggacgtt agcgcctgac 29400
ttctgccagc gcctgcactg caaatttgat caaacccagc ttcagcttgc ctgctccaga 29460
gatgaccggc tcaaccatcg cgcccacaac ggactatcgc aacaccactg ctaccggact 29520
aaaatctgcc ctaaatttac cccaagttca tgcctttgtc aatgactggg cgagcttggg 29580
catgtggtgg ttttccatag cgcttatgtt tgtttgcctt attattatgt ggcttatttg 29640
ttgcctaaag cgcagacgcg ccagaccccc catctatagg cctatcattg tgctcaaccc 29700
acacaatgaa aaaattcata gattggacgg tctcaaacca tgttctcttc ttttacagta 29760
tgattaaatg agacatgatt cctcgagtcc ttatattatt gacccttgtt gcgcttttct 29820
gtgcgtgctc tacattggct gcggtcgctc acatcgaagt agattgcatc ccacctttca 29880
cagtttacct gctttacgga tttgtcaccc ttatcctcat ctgcagcctc gtcactgtag 29940
tcatcgcctt cattcagttc attgactgga tttgtgtgcg cattgcgtac cttaggcacc 30000
atccgcaata cagagacagg actatagctg atcttctcag aattctttaa ttatgaaacg 30060
gattgtcact tttgttttgc tgattttctg cgccctacct gtgctttgct cccaaacctc 30120
agcgcctccc aaaagacata tttcctgcag attcactcaa atatggaaca ttcccagctg 30180
ctacaacaaa cagagcgatt tgtcagaagc ctggttatac gccatcatct ctgtcatggt 30240
tttttgcagt accatttttg ccctagccat atacccatac cttgacattg gttggaatgc 30300
catagatgcc atgaaccacc ctactttccc agcgcccaat gtcataccac tgcaacaggt 30360
tattgcccca atcaatcagc ctcgcccccc ttctcccacc cccactgaga ttagctactt 30420
taatttgaca ggtggagatg actgaatctc tagatctaga attggatgga attaacaccg 30480
aacagcgcct actagaaagg cgcaaggcgg cgtccgagcg agaacgccta aaacaagaag 30540
ttgaagacat ggttaacctg caccagtgta aaagaggtat cttttgtgtg gtcaagcagg 30600
ccaaacttac ctacgaaaaa accactaccg gcaaccgcct tagctacaag ctacccaccc 30660
agcgccaaaa actggtgctt atggtgggag aaaaacctat caccgtcacc cagcactcgg 30720
cagaaacaga aggctgcctg cacttcccct atcagggtcc agaggacctc tgcactctta 30780
ttaaaaccat gtgtggcatt agagatctta ttccattcaa ctaacaataa acacacaata 30840
aattacttac ttaaaatcag tcagcaaatc tttgtccagc ttattcagca tcacctcctt 30900
tccctcctcc caactctggt atttcagcag ccttttagct gcgaactttc tccaaagtct 30960
aaatgggatg tcaaattcct catgttcttg tccctccgca cccactatct tcatattgtt 31020
gcagatgaaa cgcgccagac cgtctgaaga caccttcaac cctgtgtacc catatgacac 31080
ggaaaccggc cctccaactg tgcctttcct tacccctccc tttgtgtcgc caaatgggtt 31140
ccaagaaagt ccccccggag tgctttcttt gcgtctttca gaacctttgg ttacctcaca 31200
cggcatgctt gcgctaaaaa tgggcagcgg cctgtccctg gatcaggcag gcaaccttac 31260
atcaaataca atcactgttt ctcaaccgct aaaaaaaaca aagtccaata taactttgga 31320
aacatccgcg ccccttacag tcagctcagg cgccctaacc atggccacaa cttcgccttt 31380
ggtggtctct gacaacactc ttaccatgca atcacaagca ccgctaaccg tgcaagactc 31440
aaaacttagc attgctacca aagagccact tacagtgtta gatggaaaac tggccctgca 31500
gacatcagcc cccctctctg ccactgataa caacgccctc actatcactg cctcacctcc 31560
tcttactact gcaaatggta gtctggctgt taccatggaa aacccacttt acaacaacaa 31620
tggaaaactt gggctcaaaa ttggcggtcc tttgcaagtg gccaccgact cacatgcact 31680
aacactaggt actggtcagg gggttgcagt tcataacaat ttgctacata caaaagttac 31740
aggcgcaata gggtttgata catctggcaa catggaactt aaaactggag atggcctcta 31800
tgtggatagc gccggtccta accaaaaact acatattaat ctaaatacca caaaaggcct 31860
tgcttttgac aacaccgcaa taacaattaa cgctggaaaa gggttggaat ttgaaacaga 31920
ctcctcaaac ggaaatccca taaaaacaaa aattggatca ggcatacaat ataataccaa 31980
tggagctatg gttgcaaaac ttggaacagg cctcagtttt gacagctccg gagccataac 32040
aatgggcagc ataaacaatg acagacttac tctttggaca acaccagacc catccccaaa 32100
ttgcagaatt gcttcagata aagactgcaa gctaactctg gcgctaacaa aatgtggcag 32160
tcaaattttg ggcactgttt cagctttggc agtatcaggt aatatggcct ccatcaatgg 32220
aactctaagc agtgtaaact tggttcttag atttgatgac aacggagtgc ttatgtcaaa 32280
ttcatcactg gacaaacagt attggaactt tagaaacggg gactccacta acggtcaacc 32340
atacacttat gctgttgggt ttatgccaaa cctaaaagct tacccaaaaa ctcaaagtaa 32400
aactgcaaaa agtaatattg ttagccaggt gtatcttaat ggtgacaagt ctaaaccatt 32460
gcattttact attacgctaa atggaacaga tgaaaccaac caagtaagca aatactcaat 32520
atcattcagt tggtcctgga acagtggaca atacactaat gacaaatttg ccaccaattc 32580
ctataccttc tcctacattg cccaggaata aagaatcgtg aacctgttgc atgttatgtt 32640
tcaacgtgtt tatttttcaa ttgcagaaaa tttcaagtca tttttcattc agtagtatag 32700
ccccaccacc acatagctta tactaatcac cgtaccttaa tcaaactcac agaaccctag 32760
tattcaacct gccacctccc tcccaacaca cagagtacac agtcctttct ccccggctgg 32820
ccttaaacag catcatatca tgggtaacag acatattctt aggtgttata ttccacacgg 32880
tctcctgtcg agccaaacgc tcatcagtga tgttaataaa ctccccgggc agctcgctta 32940
agttcatgtc gctgtccagc tgctgagcca caggctgctg tccaacttgc ggttgctcaa 33000
cgggcggcga aggagaagtc cacgcctaca tgggggtaga gtcataatcg tgcatcagga 33060
tagggcggtg gtgctgcagc agcgcgcgaa taaactgctg ccgccgccgc tccgtcctgc 33120
aggaatacaa catggcagtg gtctcctcag cgatgattcg caccgcccgc agcataaggc 33180
gccttgtcct ccgggcacag cagcgcaccc tgatctcact taagtcagca cagtaactgc 33240
agcacagtac cacaatattg tttaaaatcc cacagtgcaa ggcgctgtat ccaaagctca 33300
tggcggggac cacagaaccc acgtggccat cataccacaa gcgcaggtag attaagtggc 33360
gacccctcat aaacacgctg gacataaaca ttacctcttt tggcatgttg taattcacca 33420
cctcccggta ccatataaac ctctgattaa acatggcgcc atccaccacc atcctaaacc 33480
agctggccaa aacctgcccg ccggctatgc actgcaggga accgggactg gaacaatgac 33540
agtggagagc ccaggactcg taaccatgga tcatcatgct cgtcatgata tcaatgttgg 33600
cacaacacag gcacacgtgc atacacttcc tcaggattac aagctcctcc cgcgtcagaa 33660
ccatatccca gggaacaacc cattcctgaa tcagcgtaaa tcccacactg cagggaagac 33720
ctcgcacgta actcacgttg tgcattgtca aagtgttaca ttcgggcagc agcggatgat 33780
cctccagtat ggtagcgcgt gtctctgtct caaaaggagg taggcgatcc ctactgtacg 33840
gagtgcgccg agacaaccga gatcgtgttg gtcgtagtgt catgccaaat ggaacgccgg 33900
acgtagtcat atttcctgaa gcaaaaccag gtgcgggcgt gacaaacaga tctgcgtctc 33960
cggtctcgtc gcttagctcg ctctgtgtag tagttgtagt atatccactc tctcaaagca 34020
tccaggcgcc ccctggcttc gggttctatg taaactcctt catgcgccgc tgccctgata 34080
acatccacca ccgcagaata agccacaccc agccaaccta cacattcgtt ctgcgagtca 34140
cacacgggag gagcgggaag agctggaaga accatgtttt tttttttttt attccaaaag 34200
attatccaaa acctcaaaat gaagatctat taagtgaacg cgctcccctc cggtggcgtg 34260
gtcaaactct acagccaaag aacagataat ggcatttgta agatgttgca caatggcttc 34320
caaaaggcaa actgccctca cgtccaagtg gacgtaaagg ctaaaccctt cagggtgaat 34380
ctcctctata aacattccag caccttcaac catgcccaaa taattttcat ctcgccacct 34440
tatcaatatg tctctaagca aatcccgaat attaagtccg gccattgtaa aaatctgctc 34500
cagagcgccc tccaccttca gcctcaagca gcgaatcatg attgcaaaaa ttcaggttcc 34560
tcacagacct gtataagatt caaaagcgga acattaacaa aaataccgcg atcccgtagg 34620
tcccttcgca gggccagctg aacataatcg tgcaggtctg cacggaccag cgcggccact 34680
tccccgccag gaaccatgac aaaagaaccc acactgatta tgacacgcat actcggagct 34740
atgctaacca gcgtagcccc gatgtaagct tgttgcatgg gcggcgatat aaaatgcaag 34800
gtactgctca aaaaatcagg caaagcctcg cgcaaaaaag caagcacatc gtagtcatgc 34860
tcatgcagat aaaggcaggt aagttccgga accaccacag aaaaagacac catttttctc 34920
tcaaacatgt ctgcgggttc ctgcataaac acaaaataaa ataacaaaaa aaaaaaaaaa 34980
catttaaaca ttagaagcct gtcttacaac aggaaaaaca acccttataa gcataagacg 35040
gactacggcc atgccggcgt gaccgtaaaa aaactggtca ccgtgattaa aaagcaccac 35100
cgacagttcc tcggtcatgt ccggagtcat aatgtaagac tcggtaaaca catcaggttg 35160
gttaacatcg gtcagtgcta aaaagcgacc gaaatagccc gggggaatac atacccgcag 35220
gcgtagagac aacattacag cccccatagg aggtataaca aaattaatag gagagaaaaa 35280
cacataaaca cctgaaaaac cctcctgcct aggcaaaata gcaccctccc gctccagaac 35340
aacatacagc gcttccacag cggcagccat aacagtcagc cttaccagta aaaaaaccta 35400
ttaaaaaaca ccactcgaca cggcaccagc tcaatcagtc acagtgtaaa aagggccaag 35460
tacagagcga gtatatatag gactaaaaaa tgacgtaacg gttaaagtcc acaaaaacca 35520
cccagaaaac cgcacgcgaa cctacgccca gaaacgaaag ccaaaaaacc cacaacttcc 35580
tcaaatcttc acttccgttt tcccacgata cgtcacttcc cattttaaaa aaaaaactac 35640
aattcccaat acatgcaagt tactccgccc taaaacctac gtcacccgcc ccgttcccac 35700
gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat attggcttca atccaaaata 35760
aggtatatta ttgatgatg 35779
<---
Рекомбинантный штамм Ad6-hTERT-GMCSF, содержащий встройку промотора теломеразы человека hTERT, структура которого соответствует коровому промотору гена теломеразы человека, позиции 10854-11273 в месте удаленного промотора гена Е1А между позициями, соответствующими позициям нуклеотидов 357-558 штамма Ад6 Tonsil99, а также гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, структура которого соответствует кодирующей последовательности мРНК человеческого ГМ-КСФ, позиции 36-469, в месте удаленных генов Е3-6.7k и E3-gp19k между позициями 28608 и 29270; обладающий избирательной цитолитической активностью против теломераза-положительных опухолевых клеток и экспрессирующий активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор.