Лиганды к рецептору фолликулостимулирующего гормона (fsh) в диагностике и лечении опухолей

Изобретение относится к применению лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ), представляющего собой β-субъединицу фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ) и характеризующегося последовательностью SEQ. ID. no. 2 или последовательностью по меньшей мере на 90% схожей с последовательностью, соответствующей SEQ. ID. no. 2, предпочтительно на 90-99.9% и более предпочтительно на 95-97%, для лечения и/или диагностики опухолей. Также предложен способ получения лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ), представляющего собой β-субъединицу фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ), с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Формы субъединиц ФСГβ настоящего изобретения связываются с ФСГР с высоким сродством. 4 н. и 17 з.п. ф-лы, 21 ил.

 

Область техники

Настоящее изобретение находит применение в сфере медицины, в частности в диагностике и лечении опухолей.

Уровень техники

Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) представляет собой гликопротеин, относящийся к классу гликопротеиновых гормонов (ГПГ), который включает в себя белки, характеризующиеся высокой структурной схожестью, такие как тиреотропный гормон (ТТГ) и хорионический гонадотропин (ХГ).

ФСГ синтезируется в передней части гипофиза и выделяется в кровоток в результате стимуляции гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ).

ФСГ играет ключевую роль в физиологии размножения, вызывая созревание фолликул яичников у женщин, тогда как у мужчин он стимулирует клетки Сертоли, способствуя сперматогенезу (Simoni и др. 1997).

Рекомбинантные препараты на основе ФСГ, такие как Puregon® и Gonal-F®, или экстракты из мочи, такие как Fostimon®, обычно используются в клинической практике для лечения бесплодия как у женщин, так и у мужчин, а также в протоколах вспомогательной репродукции (De Barross и др. 2013).

ФСГ представляет собой гетеродимер, состоящий из двух нековалентно связанных субъединиц, α и β.

α-субъединица является общей для всех ГПГ, тогда как β-субъединица в разных гликопротеиновых гормонах бывает разной и определяет их специфическую биологическую активность.

β субъединица (код UniProt: P01225) фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ) имеет молекулярную массу приблизительно 12,5 кДа и состоит из 111 аминокислотных остатков, из которых 12 цистеиновых остатков, вовлечены в образование 6 дисульфидных мостиков. В белке имеется два участка N-гликозилирования на уровне остатков аспарагина 7 и 24 аспарагина.

Биологическая активность гормона ФСГ зависит от состояния гликозилирования остатка аспарагина 52 α-цепи, который играет важную роль в индукции биологического ответа.

Более того, профиль гликозилирования на уровне ФСГβ влияет на способность гормонов связываться со специфическим рецептором.

Гипогликозилированные формы обладают большей аффинностью к рецептору in vitro, но более коротким временем периода полураспада in vivo, тогда как для изоформ, характеризующихся полным гликозилированием, наблюдается обратное явление (Ulloa-Aguirre и др. 2011).

ФСГ, выделяющийся в кровоток, способен посредством микроциркуляции проникать в любой участок организма. ФСГ проявляет свое физиологическое действие посредством связывания и активации специфического рецептора (ФСГ рецептора, РФСГ).

В физиологических условиях рецептор экспрессируется у мужчин только в клетках Сертоли яичек и только в клетках гранулезы яичников у женщин.

Рецептор FSH принадлежит к семейству рецепторов, связанных с G-белком, и образование комплекса лиганд-рецептор запускает серию каскадных сигналов, метаболическая значимость которых до конца не известна.

Наиболее изученным физиологическим эффектом является активация фермента аденилциклазы, который превращает аденозинмонофосфат (АМФ) во второй мессенджер циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), повышая его цитозольную концентрацию.

цАМФ является сильным активатором протеинкиназы A (ПKA), которая представляет собой ключевой фермент в регуляции различных процессов, важных для жизни клетки.

Например, в клетках Сертоли активация РФСГ приводит к увеличению экспрессии ароматазы, фермента, который превращает тестостерон в 17β-эстрадиол, стимулируя связанные с ним метаболические процессы (Ulloa-Aguirre и др. 1998).

Уже в 1999-2000 годы научное сообщество стало обращать внимание на аномальную экспрессию РФСГ при раке предстательной железы, и, главным образом, при раке яичников (Ben-Josef и др. 1999; Zheng и др. 2000).

В последующие годы очевидность этого эффекта значительно возросла, но только в 2010 году Radu и его сотрудники (Radu и др. 2010) продемонстрировали, что РФСГ экспрессируется ненормальным образом на уровне микроциркуляции эндотелиальных тканей многих солидных опухолей.

Позднее были получены доказательства того, что в опухолях яичников избыточная экспрессия РФСГ соотносится с тяжестью заболевания; также был предоставлен ряд доказательств, подтверждающих работу Раду (Radu и др. 2010) и продемонстрировано, что РФСГ экспрессируется на высоком уровне в различных типах первичных или метастатических солидных опухолей (Pawlikowski и др. 2015; Planeix и др. 2015; Siraj и др. 2013; Sardella и др. 2012; Siraj и др. 2010).

Разрабатывающиеся лиганды РФСГ

В настоящее время исследование специфичных для РФСГ лигандов проводится двумя способами: 1) разработка синтетических пептидов, 2) разработка моноклональных антител.

Оба способа имеют существенные недостатки, такие как ограниченная специфичность в случае пептидов или присущая нестабильность в случае антител.

Известная молекула с самой высокой специфичностью связывания РФСГ представляет собой ФСГ, физиологически присутствующий в кровотоке в наномолярной (нМ) концентрации.

Поэтому необходимо определить новые и действительные альтернативы существующим, которые позволяют специфически достигать, диагностировать и лечить рак, включая рецептор ФСГ.

В известном документе Luo S. и др. (European Journal of nuclear medicine and molecular imaging, vol. 40, no. 2, 16 October 2013) описывается ФСГβ субъединица пептида для диагностики рака предстательной железы. В нем не описывается применение для лечения нейробластомы.

В публикации Zhang Xiaoyan и др. (International Journal of Pharmaceutics, vol. 453, no. 2, 2013) описывается сопряжение ФСГβ субъединицы пептида с паклитакселом при лечении рака.

В европейской заявке на патент EP 2,090,322 A1 (Inst. Nat. Rech. Med.) описывается лиганд РФСГ для визуализации и лечения опухолей, которые могут быть представлены ФСГ. Как известно, ФСГ содержит две субъединицы (α и β).

В европейской заявке на патент EP 2,924,049 A1 описывается применение химерных гонадотропинов в лечении связанных с трофическим гормоном заболеваний.

В международной заявке на патент WO 2014/078533 A1 описываются слитые конструкции, содержащие фрагменты субъединицы ФСГβ или субъединицы ФСГβ, связанной с литическим доменом. В ней не приводятся каких-либо свидетельств применения для лечения нейробластомы.

В международной заявке на патент WO 2016/054153 A1 описывается генетическая конструкция, содержащая фрагмент ФСГ или субъединицу ФСГβ.

В публикации Zhang и др. (Cancer Research, vol. 69, no. 16, 15 August 2009) описывается сопряжение паклитаксела с фрагментом субъединицы ФСГβ при лечении рака.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении того, что β-субъединица фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ) способна с высоким сродством связываться с РФСГ.

В частности, было обнаружено, что β-субъединица фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ) может инактивировать РФСГ.

Также авторы настоящей заявки на патент обнаружили, что формы субъединиц ФСГβ, полученные с использованием технологии рекомбинантной ДНК, могут быть также получены в высокостабильной форме.

Показано, что эти формы связываются с ФСГР с высоким сродством, что дает им особые и удивительные преимущества.

Предмет изобретения

Первым объектом настоящего изобретения является медицинское применение β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона (ФСГβ).

В соответствии с конкретными аспектами β-субъединица фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ) находит медицинское применение в лечении и/или диагностике опухолей.

Вторым объектом данного изобретения является биотехнологическая платформа получения β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека в рекомбинантной форме (ABRβ).

β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (ABRβ), полученные с такой платформой, являются дополнительным объектом настоящего изобретения.

Медицинское применение этих субъединиц, и, в частности, медицинское применение в лечении и/или диагностике рака, являются дополнительными объектами настоящего изобретения.

Согласно другому аспекту, описываются фармацевтические препараты для введения субъединиц ФСГβ и ABRβ.

В таких препаратах упомянутые субъединицы ФСГβ и ABRβ могут быть конъюгированы с молекулами, проявляющими терапевтическую или диагностическую активность.

Каждая нуклеотидная последовательность структур и векторов, использованных для получения описанных рекомбинантных форм, отображает дополнительные аспекты настоящего изобретения, как описанную новую аминокислотную последовательность.

В качестве другого объекта настоящего изобретения описывается способ лечения и/или диагностики рака, включающий использование субъединиц ФСГβ или ABRβ.

Дополнительным объектом настоящего изобретения является применение субъединиц ФСГβ или ABRβ для инактивации рецептора ФСГ (РФСГ).

В соответствии с дополнительным аспектом изобретения описывается способ получения лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (ABRβ или ABRβ1), включающий получение β-субъединицы рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ) с модификацией С-концевого участка, представленной введением последовательности KDEL.

В конкретном случае такой способ может дополнительно содержать модификацию на N-конце последовательности β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ), представленную введением His-метки.

Следовательно, использование последовательности KDEL на C-конце и, возможно, использование His-метки на N-конце последовательности β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ) для получения лигандов рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ) являются дополнительными объектами настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

На фигуре 1 показана структура бинарного вектора pABR: RB/LB, конкретные сайты рекомбинации, левый край и правый край; Tml_p, промотор морфологии опухоли большой ДНК; NPT II, неомицин фосфотрансфераза II; Tml_t, терминатор морфологии опухоли большой ДНК; CaMV35x2_p, протор вируса мозаики цветной капусты; TEV 5’, нетранслируемая последовательность TEV; Nos_t, терминатор nopalyne synthase;

На фигуре 2 приведены результаты электрофоретического анализа очищенной ABRβ1;

На фигуре 3 приведен анализ ДНС-ПААГ после дегликозилирования очищенной ABRβ1;

На фигуре 4 приведен масс-спектр очищенной ABRβ1 (полоса у 25кДа);

На фигуре 5 приведены результаты анализа агрегатного состояния лиганда ABRβ1 посредством эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии;

На фигуре 6 приведены результаты анализа стабильности лиганда ABRβ1 флуориметрическим способом;

На фигуре 7 показаны результаты анализа влияния ABRβ1 на активацию РФСГ посредством измерения образования эстрадиола (E2) в клетках Сертоли. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (n=3). CTR: необработанные клетки; Gonal F: клетки, обработанные коммерческим препаратом; ABRβ1: клетки, обработанные очищенным лигандом ABRβ1; T: клетки, дополненные тестостероном;

На фигуре 8 приведены результаты анализа связывания ABRβ1, маркированного NBD, с РФСГ в раковых клетках;

На фигуре 9 приведены результаты анализа интернализации препарата Gonal F (панель A и B) и ABRβ1 (панель C и D) в клетках линии HeLa, трансформированных человеческим РФСГ. Клетки инкубировали только с вторичным антителом FITC (панель A и C);

На фигуре 10 приведены результаты образования циклического аденозин монофосфата (cAMP), индуцированного препаратом Gonal F и нейтрализованного лигандом ABRβ1;

На фигуре 11 показано влияние лиганда ABRβ1 на рост раковых клеток;

На фигуре 12 показано влияние лиганда ABRβ1, маркированного Alexa Fluor 647, на рост раковых клеток;

На фигуре 13 приведены результаты анализа интернализации лиганда ABRβ1 в раковых клетках, выполненного способом проточной цитометрии;

На фигуре 14 показано местоположение лиганда ABRβ1 и его локализация в лизосомном отделе раковых клеток;

На фигуре 15 приведен результат анализа экспрессии РФСГ, выполненного способом иммунопроточной цитометрии на панели раковых клеток человека;

На фигуре 16 приведен пример коробчатых диаграмм, полученных в результате анализа данных экспрессии генов РФСГ, проведенного путем мониторинга базы данных ArrayExpress (EMBL). Анализируемый набор данных включает 504 образца нейробластомы у младенцев;

На фигуре 17 приведены результаты анализа связывания ABRβ1, маркированного NBD, с РФСГ в клетках NB3;

На фигуре 18 показаны результаты анализа интернализации ABRβ1, маркированного NBD, в клетках NB3 (фракция выше 96% обработанных клеток показывает появление сигнала, локализованного в цитоплазматических везикулах (панель B) (n = 3). Необработанные клетки (панель A));

На фигуре 19 показано покрытие аминокислотной последовательности посредством масс-спектрометрического анализа дегликозилированной формы лиганда ABRβ1, подвергнутой триптическому расщеплению (CAM: карбамидометилцистеин; (1): пропущенное расщепление; MSO: сульфоксид метионина);

На фигуре 20 приведен результат анализа экспрессии РФСГ, выполненного способом иммунопроточной цитометрии на раковых клетках нейробластомы человека;

На фигуре 21 показан эффект (по прошествии времени) инъекции ABRβ1 в каудальную вену на мышиной модели.

Осуществление изобретения

Определения

В настоящем подробном описании изобретения, если не указано иное, термины следует понимать как имеющие изложенное ниже значение.

«РФСГ» означает рецептор фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГ); этот гормон содержит две субъединицы α и β.

«ФСГβ» означает одну бета субъединицу фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГ); эта субъединица характеризуется последовательностью, соответствующей SEQ. ID. no. 1.

«ABRβ» означает бета субъединицу фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГ), которую можно получить посредством биотехнологической платформы в соответствии с настоящим изобретением.

«ABRβ1» означает специфическую бета субъединицу фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГ), полученную с использованием биотехнологической платформы для производства растительных клеток Nicotiana benthamiana в соответствии с настоящим изобретением; эта субъединица характеризуется аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ. ID. no. 2.

В более общем смысле, субъединицы ФСГβ, ABRβ и ABRβ1 могут упоминаться как «лиганд» рецептора РФСГ, поскольку они способны связываться с самим рецептором.

Первым объектом настоящего изобретения является медицинское применение β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ).

В частности, настоящее изобретение описывает применение β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ) для лечения и/или диагностики рака.

Термин «рак» относится к опухоли и раку, то есть к тем тканям, которые характеризуются аномальным ростом, вызванным неконтролируемым размножением клеток.

В предпочтительном варианте такая опухоль или рак представляет собой первичную или метастатическую солидную опухоль.

А именно сюда относятся опухоли и раковые заболевания простаты (в частности, аденокарцинома простаты), молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы, почки, легких, печени, яичка, яичников, мозга и щитовидной железы, включая саркомы.

Согласно одному из аспектов изобретения, оно может найти применение для лечения нейробластомы у детей.

В частности, такое медицинское применение описано у пациентов детского возраста и, предпочтительно, у пациентов до 6-летнего возраста.

В целях настоящего изобретения субъединица ФСГβ используется в лечении рака как отдельно, так и в сочетании с противораковыми препаратами.

В форме, не конъюгированной с каким-либо лекарственным средством, субъединица ФСГβ может использоваться в качестве конкурента ФСГ в связывании с РФСГ и, таким образом, способна блокировать активность рецептора.

Что касается противораковых препаратов, которые можно использовать вместе с β-субъединицами, то они могут принадлежать:

- к классу цитотоксических препаратов. Такие соединения предпочтительно выбираются из группы, включающей: антагонисты пиримидина, например, капецитабин, ингибиторы фермента, например, семейство камптотецинов, например, иринотекан;

- к классу алкилирующих препаратов. Такие соединения предпочтительно выбираются из группы, включающей: семейства солей металлов, например, цисплатин, ДНК-интеркаляторов, например, доксорубицин, семейства антрациклинов;

- к классу модуляторов синтеза белка. Такие соединения предпочтительно выбираются из группы, включающей: семейство ингибиторов протеасом, например, бортезомиб, семейство ингибиторов mTOR, например, темсиролимус;

- к классу ингибиторов митоза.

Такие соединения предпочтительно выбираются из группы, включающей: семейство ансамитоцина, например, майтанзин, семейство ингибиторов полимеризации микротрубочках, например, ауристатин Е;

- к классу β-излучающих радиоизотопов. Такие соединения предпочтительно выбираются из группы, включающей: ¹³¹I, ¹⁶⁹Er, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁵³Sm, ⁸⁹Sr и ⁹⁰Y.

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения, субъединица ФСГβ используется в диагностике опухолей.

В частности, опухолей и раковых заболеваний, упомянутых выше.

После соответствующего конъюгирования субъединица ФСГβ может быть использована для диагностической визуализации в онкологии.

Способы, используемые для этой цели, включают в себя, например, следующие: Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), ядерно-магнитный резонанс (ЯМР), однофотонная эмиссионная томография (ОФЭКТ) и ультразвук; следовательно, субъединица ФСГβ может быть подходящим образом конъюгирована с молекулами, подходящими для диагностики, с использованием таких способов, как: позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), ядерно-магнитный резонанс (ЯМР), однофотонная эмиссионная томография (ОФЭКТ) и ультразвук.

В целях настоящего изобретения термин «диагноз» касается также способности контролировать прогрессирование опухоли во времени и/или ее прогрессирование или регрессию во время лечения.

В целях настоящего исследования термин «диагноз» означает также использование субъединицы ФСГβ для проведения in vitro лабораторного анализа.

Согласно первой характеристике, субъединица ФСГβ может быть подходящим образом конъюгирована с флуоресцирующими молекулами, такими как изотиоцианат флуоресцеина (FITC), фикоэритрин (PE) или индоцианин (Cy5).

В области ядерной медицины субъединицы ФСГβ могут быть конъюгированы с радиоактивными молекулами, такими как: ¹²³I, ¹¹¹In, ¹⁸⁸Re, ¹⁸F, ³⁵S, ⁹⁹Tc.

В конкретном случае субъединица ФСГβ может быть конъюгирована также с наночастицами, имеющими другую природу.

Конъюгирование с наночастицами может осуществляться через подходящее связующее звено.

Наночастицы

Наночастицы, используемые в медицине в качестве носителей (например, для лекарственных препаратов, радиоизотопов, флуоресцирующих молекул или ферментов), обычно имеют размер от 1 нм до 1 мкм.

Наночастицы могут иметь гладкую или неровную поверхность, могут быть твердыми, полыми, пересеченными канальцами или состоять из двояковыпуклых структур.

Наночастицы - это частицы, сделанные из неорганических или органических материалов; наночастицы на неорганической основе могут состоять из Au, Ag, Si, Se, Cd или углерода, например графен, тогда как наночастицы на органической основе могут состоять, например, из полимеров сахаров или липидов (мицелл, липосом) или молекул, например, сополимер молочной и гликолевой кислот (полилактид-ко-гликолид) (ПЛГА).

Назначение наночастиц заключается в том, чтобы доставить большое количество молекул, содержащихся в них, к контрольному участку.

Для целей настоящего изобретения термин «конъюгированный» означает, что субъединица ФСГβ или субъединица ABRβ или, более конкретно, субъединица ABRβ1 связана с молекулой с диагностической или терапевтической активностью.

Такая связь, в частности, может быть представлена ковалентной химической связью, направленной или полученной подходящим звеном, или координационной связью.

Что касается происхождения субъединицы ФСГβ, то ее можно получить путем очистки мочи человека или с использованием способов рекомбинантной ДНК; она также может быть получена из коммерческих продуктов, таких как Fertinex®, Metrodin HP®, Gonal-F® (Serono), Follistim®, Puregon® (Merk Sharp & Dohme).

Согласно другому аспекту настоящего изобретения, субъединица ФСГβ в конъюгированной или не конъюгированной форме с молекулами, обладающими терапевтической активностью, используется в лечении опухолей в сочетании с терапевтическим агентом (комбинированная терапия).

Комбинация субъединицы ФСГβ с терапевтическим агентом способна обеспечить синергетический эффект.

Такой терапевтический агент может быть выбран из группы молекул, используемой для лечения специфической формы рака.

В качестве второго объекта, изобретение описывает биотехнологическую платформу для получения β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека из растительных клеток, а именно, из Nicotiana benthamiana (ABRβ1).

В более общем смысле, в биотехнологической платформе используется способ, посредством которого аминокислотная последовательность субъединицы ФСГβ соответствующим образом модифицируется со вставлением сигнального пептида, характерного для клеток растения, для направления в эндоплазматический ретикулум.

Следовательно, настоящее изобретение использует последовательность KDEL для модификации C-концевой области β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ), особенно для того, чтобы удерживать белок в эндоплазматическом ретикулуме.

Таким образом, полученный белок подвергается специфическому процессу гликозилирования, который неожиданно оставляет без изменения процессы, которые управляют сворачиванием белка.

В частности, лиганд ABRβ1 настоящего изобретения подвергается гликозилированию по остаткам аспарагина 13 и 30 зрелого белка.

Подробнее, участки гликозилирования включают в себя разветвленные структуры остатков маннозы.

Общее количество остатков маннозы составляет приблизительно 45-75 единиц, предпочтительно 50-70 единиц и более предпочтительней 58-62 единиц, где они могут быть 60 или 61 единца.

Каждый сайт гликозилирования содержит два остатка N-ацетилглюкозамина и разветвленную структуру остатков маннозы.

В частности, каждая разветвленная структура содержит 29, 30 или 31 остатков маннозы.

Каждый остаток маннозы может включать в себя фосфорилирование, сульфорилирование или метилирование.

Также полисахаридные участки могут быть связаны с молекулами, содержащими фенольные группы.

Молекулы, содержащие фенольные группы характерны для клеток растений.

В частности, такие фенольные группы характерны для клеток растения Nicotiana benthamiana.

Конкретно, объектом настоящего изобретения является субъединица ФСГβ (ABRβ1), полученная посредством процесса, описанного в настоящем документе.

В частности, такой процесс заключается в модификации на С-конце последовательностью KDEL и на N-конце с помощью 6 His-меток β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ).

Следовательно, описанная в настоящем изобретении платформа использует последовательность KDEL на C-конце и, возможно, также His-метку на N-конце последовательности β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ) для получения лигандов рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ).

Следовательно, в соответствии с предпочтительным вариантом настоящего изобретения, в нем описывается способ получения рекомбинантной формы β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), содержащий следующие этапы:

I) получают подходящий вектор, трансформированный плазмидой, содержащей последовательность, соответствующую SEQ. ID. no. 3;

II) трансформируют клетки Nicotiana benthamiana вектором с этапа I);

III) отбирают трансформированные клетки Nicotiana benthamiana;

IV) культивируют стабильные клетки Nicotiana benthamiana;

V) подготавливают клеточный экстракт;

VI) очищают лиганд рецептора РФСГ.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, вектор с этапа I) представлен Agrobacterium tumefaciens.

В частности, на этапе II) трансформация осуществляется в течение 48 часов совместного культивирования в темноте при температуре около 25°C и при постоянном перемешивании.

После этого выполняется отбор клеток.

Предпочтительно, на этапе III), используется селективная среды, которая содержит: MS с добавлением 0,9% (масса/объем) агара и антибиотиков.

В предпочтительном варианте для этой цели используют следующее: карбенициллин и канамицин, более предпочтительно 250 мг/л карбенициллина и 100 мг/л канамицина.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения на этапе V), культивация клеток Nicotiana benthamiana осуществляется в суспензии.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, предусматривается первоначальная инокуляция клеток Nicotiana benthamiana в количестве 10% от конечного объема культуры.

Клеточную культуру подвергают инкубированию в среде MS (Murashige 1962), дополненной сахарозой, нафталинуксусной кислотой (NAA) и кинетином, в течение 15 дней при температуре 24-27°C и аэрации 50-100 мбар.

Также субкультуры готовят каждые 7 дней путем помещения аликвоты клеточной суспензии в свежую питательную среду.

Инкубирование клеток проводится при помешивании, в темноте и при постоянной температуре 25°C.

В соответствии с настоящим изобретением, этап V) включает использование буфера для экстракции, который содержит: 50 ммоль Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl, 20 мМ лимонной кислоты, 40 мМ аскорбиновой кислоты, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонил хлорида PMSF, 0,05% (объем/объем) Tвин-20, pH 6,5 с добавлением 1% (масса/объем) XAD-4 и 1% (масса/объем) поливинилполипирролидона (ПВПП).

После этого к экстракту добавляют сульфат аммония до получения 70%-ной концентрации насыщения, инкубируют при 4°C в течение 1 часа при постоянном помешивании.

Затем полученный осадок отделяют посредством ценрифугирования и подвергают повторному суспендированию в буфере IMAC.

Осадок центрифугируют и фильтруют.

Полученный раствор очищают на этапе VI), пропуская его через колонку.

В частности, раствор загружают в хроматографическую колонку с IMAC.

Предпочтительно используется колонка Ni Sepharose 6 FF.

Затем интересующие фракции объединяют и пропускают через колонку для обессоливания.

Предпочтительно используется колонка Sephadex G-25 Medium.

Затем интересующие фракции объединяют и пропускают через ионообменную хроматографическую колонку.

Предпочтительно используется колонка SP Sepharose HP.

Во время очистки выполняется мониторинг оптической плотности при 280 и 254 нм.

Как описано выше, β-субъединица фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ), полученная способом, описанным в настоящем документе (ABRβ1), и медицинское применение настоящего изобретения для лечения и/или диагностики опухолей являются дополнительными объектами настоящего изобретения.

В частности, в настоящем изобретении описывается применение ABRβ субъединицы для лечения и/или диагностики рака.

Термин «рак» относится к опухоли и раку, то есть к тем тканям, которые характеризуются аномальным ростом, вызванным неконтролируемым размножением клеток.

В предпочтительном варианте такая опухоль или рак представляет собой первичную или метастатическую солидную опухоль.

А именно сюда относятся опухоли и раковые заболевания простаты, молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы, почки, легких, печени, яичка, яичников, мозга и щитовидной железы, включая саркомы.

Согласно одному из аспектов изобретения, оно может найти применение для лечения нейробластомы у детей.

В частности, такое медицинское применение описано у пациентов детского возраста и, предпочтительно, у пациентов до 6-летнего возраста.

Как описано выше, субъединица ABRβ1 получена биотехнологическим путем культивации растительных клеток Nicotiana benthamiana в суспензии.

В соответствии с альтернативными вариантами настоящего изобретения субъединица ABRβ может быть получена биотехнологическим путем в других клетках, таких как клетки млекопитающих, дрожжей, бактериальные клетки или клетки другого растения.

В частности, могут быть использованы клетки растений Daucus carota, Oryza sativa, Glycine max, Maize и др.

В соответствии с другим аспектом изобретения, описываются фармацевтические препараты для введения субъединиц ФСГβ и ABRβ, и в частности, субъединицы ABRβ1.

Более конкретно, такие препараты могут включать в себя субъединицу ФСГβ или субъединицу ABRβ или, более конкретно, субъединицу ABRβ1 и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и/или наполнителей.

Такие субъединицы в предпочтительных вариантах изобретения могут быть конъюгированы с подходящими молекулами, обладающими терапевтической или диагностической активностью, как описано выше в отношении субъединицы ФСГβ.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения субъединица ABRβ1 в конъюгированной или не конъюгированной форме с молекулами, обладающими терапевтической активностью, используется в лечении опухолей в сочетании с терапевтическим агентом (комбинированная терапия).

Комбинация субъединицы ABRβ1 с терапевтическим агентом способна обеспечить синергетический эффект.

Такой терапевтический агент может быть выбран из группы молекул, используемой для лечения специфической формы рака.

Следовательно, настоящее изобретение предлагает диагностические и терапевтические составы, включающие описанные выше субъединицы ABRβ1, ФСГβ или другие субъединицы ABRβ (которые можно получить с помощью технологии рекомбинантной ДНК, применяемой к другим клеткам).

Более конкретно, такие препараты составлены для внутривенного введения.

В соответствии с дополнительной задачей, в настоящем изобретении описывается способ лечения и/или диагностики опухолей, включающий использование субъединиц ФСГβ, ABRβ1 или других субъединиц ABRβ.

В частности, такой способ включает этап введения нуждающемуся в этом пациенту фармацевтически эффективного количества субъединиц ФСГβ или ABRβ или ABRβ1, возможно, введенного в состав подходящего фармацевтического препарата.

Для настоящих целей пациент должен быть субъектом, страдающим первичной или метастатической солидной опухолью.

А именно сюда относятся опухоли и раковые заболевания простаты (в частности, аденокарцинома простаты), молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы, почки, легких, печени, яичка, яичников, мозга и щитовидной железы, включая саркомы.

В соответствии с одним из аспектов изобретения, такой способ может найти применение для лечения нейробластомы у детей.

В частности, такое медицинское применение описано у пациентов детского возраста и, предпочтительно, у пациентов до 6-летнего возраста.

Способ диагностики касается также способности контролировать прогрессирование опухоли во времени и/или ее прогрессирование или регрессию во время лечения.

Иными словами, ссылка делается на способ проверки прогрессирования опухоли во времени и/или ее прогрессирования или регрессии во время лечения, включающий этапы определения степени развития опухоли у субъекта в разные и последующие моменты времени (такие как время t₀ и время t₁), причем между указанными моментами (t₀ и t₁) может быть проведен этап лечения опухоли.

В настоящем изобретении предлагается способ in vivo инактивации рецептора РФСГ, включающий этап введения фармацевтически активного количества субъединицы ФСГβ или ABRβ или ABRβ1.

Такой способ может поочередно выполняться in vitro в лаборатории для различных целей.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения, описывается применение субъединиц ФСГβ или ABRβ или ABRβ1 для инактивации рецептора ФСГ (РФСГ).

Такая инактивация, в частности, может выполняться in vivo или in vitro.

Поэтому в настоящей заявке на патент, описываются следующие последовательности:

SEQ ID. no. 1	Последовательность субъединицы человеческого ФСГβ
SEQ ID. no. 2	Последовательность ABRβ1
SEQ ID no. 3	Кодирование последовательности ABRβ1

Со ссылкой на последовательность субъединицы ABRβ1, все последовательности, имеющие сходство с SEQ. ID. no 2, которые не изменяют взаимодействие с рецептором РФСГ, предназначены для включения в объекты настоящего изобретения.

В частности, под «сходством» подразумевается процентное количество аминокислот, занимающих такое положение, которое может быть замещено другой или структурно эквивалентной аминокислотой, причем сходство, равное 100%, означает, что две последовательности идентичны.

Сходство может быть определено посредством выравнивания, проводимого, в частности, согласно одному или нескольким известным алгоритмам или программам, таким как CLUSTALW или BLAST.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения процент сходства касается только последовательности субъединицы ABRβ1, совокупно с последовательностью субъединицы ФСГβ.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения процент сходства касается только аминокислот участков последовательности ABRβ1, которые не включают в себя аминокислоты, вовлеченные во взаимодействие с рецептором.

Аминокислоты ABRβ1, вовлеченные во взаимодействие с рецептором, соответствуют аминокислотам 33-53 последовательности ФСГβ.

Для целей настоящего изобретения сходство составляет, примерно, более 90%, предпочтительно оно находится между 90-99,9% и, наиболее предпочтительно, между 95-97%.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Получение и очистка лиганда ABR

Белковая последовательность человеческого ФСГβ (UniProt: P01225) была модифицирована in silico, как это описано в нижеследующем разделе, касающемся материалов и способов. Кодирующая последовательность гена для нового белка, включающая область сигнального пептида (лиганд ABRβ1), была оптимизирована для экспрессии в растениях (SEQ. ID. no. 3).

Затем нуклеотидную последовательность вставляли в кассету экспрессии бинарного вектора pABR (Фигура 1) и с использованием Agrobacterium tumefaciens в качестве системы трансформации растительных клеток получали и выбирали стабильные клоны Nicotiana benthamiana, экспрессирующие самый высокий уровень лиганда ABRβ1.

Лиганд ABRβ1 очищали от культивируемых в суспензии клеток растений с использованием последовательного хроматографирования.

2. Химическая характеризация лиганда ABRβ1

Анализ лиганда ABRβ1, полученного после оптимизации процесса очистки, выполнялся с использованием электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ).

Анализ иммуноблоттинга с человеческими специфичными к ФСГβ антителами и полиакриламидными гелями, подвергнутыми окрашиванию красителем Coomassie Brilliant Blue (кумасси бриллиантовым синим) или с более чувствительным окрашиванием серебром, показывает, что лиганд ABRβ1 достигает уровня чистоты 95-98%. Анализ выявляет присутствие двух реактивных видов антител к FSHβ.

На фигуре 2 приведены результаты электрофоретического анализа очищенного ABRβ1; Выполнялся анализ 0,1 мкг очищенной ABRβ1 способом ДСН-ПААГ. MW - маркер молекулярной массы; SS - окрашивание серебром; WB - иммуноблоттинг с использованием человеческого специфического антитела к ФСГβ. Формы при 25 и 37 кДа, обнаруженные при окрашивании серебром, являются реактивными по отношению к человеческому специфическому антителу к ФСГβ. Два вида со средней молекулярной массой 25 кДа и 37 кДа являются результатом различной картины гликозилирования белка. Обработка образца гликозилазой (PNGase F) приводит к объединению двух высокомолекулярных частиц в единую форму со средней молекулярной массой 14 кДа.

На фигуре 3 приведены результаты анализа ДСН-ПААГ после дегликозилирования очищенной ABRβ1; 0,1 мкг очищенной ABRβ1 подвергались дегликозилированию и анализу способом ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием серебром. Слева - маркер молекулярной массы; 1 - очищенный и не дегликозилированный лиганд ABRβ1; 2 - очищенный и дегликозилированный лиганд ABRβ1. Гликозилированные формы с массой 25 и 37 кДа исчезают после дегликозилирования, и наблюдается образование не дегликозилированной формы со средней массой 14 кДа.

Все молекулярные виды были проанализированы с использованием различных способов масс-спектрометрии для определения точной молекулярной массы и аминокислотной последовательности. Гликозилированным видам была присвоена молекулярная масса 24 493,2 Да и 37 654,57 Да, соответственно, дегликозилированный белок имеет молекулярную массу 13 783,6 Да.

Анализ отпечатков белков показал, что аминокислотная последовательность лиганда ABRβ1 идентична последовательности зрелого человеческого ФСГβ с модификациями, сделанными, как описано в настоящей заявке на патент (фигура 19).

Поскольку третичная структура является важной для эффективного связывания с РФСГ, конфигурация дисульфидных связей лиганда ABRβ1 была подтверждена. Масс-спектрометрический анализ образцов, полученных частичным протеолизом лиганда ABRβ1, позволил выявить пары цистеина, участвующие в образовании дисульфидных связей. Идентификация пар цистеина, участвующих в образовании дисульфидных связей, показывает структуру, идентичную той, которая наблюдается в зрелом человеческом ФСГβ, подтверждая, что лиганд ABRβ1 имеет правильное сворачивание белка.

3. Гликозилирование

Лиганд ABRβ1 имеет аминокислотную последовательность KDEL на C-конце. Принимая во внимание молекулярную массу двух гликозилированных и одной дегликозилированной белковых форм, можно определить массу глюкозной части в белках. Предполагая, что в двух остатках аспарагина, присутствующих в одной и той же форме белке, конфигурация гликозилирования является сходной, мы можем заключить, что в белке с молекулярной массой 24 493 Да имеется первая глюкозная часть, состоящая из N-ацетилглюкозамина и 30 остатков маннозы, и вторая глюкозная часть, состоящая из 2 остатков N-ацетилглюкозамина и 31 остатка маннозы. В форме белка с молекулярной массой 37 654 имеется глюкозная часть, состоящая из остатка N-ацетилглюкозамина и 70 остатков маннозы, и вторая глюкозная часть, состоящая из 2 остатков N-ацетилглюкозамина и 71 остатка маннозы.

На втором этапе процесса образования и очистки лиганда ABRβ1 условия культивирования клеток были модифицированы для оптимизации процесса и получения одной и конкретной формы гликозилированного ABRβ1. Единственная форма ABRβ1, полученная таким образом, имеет молекулярную массу дегликозилированной аминокислотной последовательности с молекулярной массой 13 783,6. Масс-спектрометрический анализ показал, что в полосе, соответствующей гликозилированной форме с молекулярной массой 24 493, присутствуют 3 изоформы гликозилирования, которые отличаются друг от друга присутствием одного или двух остатков фосфата маннозы (Фиг. 4). Такое расположение гипергликозилирования является совершенно неожиданным и довольно сильно отличается от конфигурации гликозилирования в клетках млекопитающих и, в частности, у человека.

4. Стабильность и агрегация

Чтобы проверить стабильность и тенденцию к агрегации лиганда ABRβ1, очищенный белок подвергали трем циклам замораживания/оттаивания, крио-сублимационной сушке в вакууме или инкубации при температуре 20 и 37°С в течение 72 часов.

Оценка агрегации проводилась с использованием способа эксклюзивной ВЭЖХ (SEC).

Анализ показал, что процентное содержание агрегированного белка по отношению к общему белку в лиганде ABRβ1 в конце процесса очистки составляет менее 4%.

На фигуре 5 показаны результаты анализа состояния агрегации лиганда ABRβ1 с помощью эксклюзивной ВЭЖХ; лиганд ABRβ1 показывает хроматографический профиль с присутствием только одного основного пика, соответствующего растворимым формам. Анализ площадей под пиками показал агрегацию менее 4% во всех исследованных образцах (n=3, p≤0.05).

Стабильность очищенного лиганда ABRβ1 в растворе со временем была проанализирована флуорометрическим способом. Аликвоту ABRβ1 размораживали и доводили до конечного объема 1600 мкл (концентрация 1 мкM c 20 мМ буфера HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,1% PEG-8000 (масса/объем). Затем образец немедленно подвергали анализу и хранению в холодильнике при температуре 4°C. Образец повторно анализировали по прошествии времени, измеряя и регистрируя спектр флуоресцентного излучения. Как показано на фигуре 6, флуоресцентные спектральные характеристики ABRβ1 со временем не изменялись в течение 7 дней после первого анализа.

Образцы очищенного белка, подвергнутые описанным выше обработкам, не показывают значительных изменений в процентах агрегации, указывая на то, что белок в таких условиях характеризуется превосходной растворимостью и стабильностью во времени.

5. Влияние лиганда ABRβ1 на активацию рецептора РФСГ в клетках Сертоли.

Клетки Сертоли представляют собой модель выбора для изучения ФСГ и активации РФСГ “in vitro”. В этих клетках активация РФСГ вызывает повышение экспрессии фермента ароматазы, который превращает тестостерон в эстрадиол. Таким образом, повышение количества вырабатываемого эстрадиола представляет собой важный параметр, позволяющий определить, способна ли молекула активировать РФСГ. В этой модели Gonal-F® вызывает повышение количества вырабатываемого эстрадиола примерно на 300% по сравнению с необработанными клетками. Удивительно, что в тех же экспериментальных условиях лиганд ABRβ1 не вызывает каких-либо изменений в продукции эстрадиола, что доказывает его полную неспособность активировать РФСГ.

На фигуре 7 показаны результаты анализа влияния ABRβ1 на активацию РФСГ посредством измерения образования эстрадиола (E2) в клетках Сертоли. Данные приведены в виде среднего значения ± SD (n=3). CTR: необработанные клетки; Gonal F: клетки, обработанные коммерческим препаратом; ABRβ1: клетки, обработанные очищенным лигандом ABRβ1; T: клетки с добавлением тестостерона. Различные реагенты используются в концентрациях, показанных на фигуре. Gonal F связывает РФСГ и приводит к увеличению E2 примерно на 300% по отношению к Ctr, лиганд ABRβ1 не способен активировать РФСГ, и продуцирование E2 является нулевым (p≤0,0001). Обработка тестостероном выявляет максимальную потенциальную активность ароматазы в разных условиях (экспериментальный контроль)

6. Маркировка лиганда ABRβ1 и его связывание с РФСГ

Чтобы проверить гипотезу о том, что лиганд ABRβ1 способен специфически и эффективно связывать РФСГ, необходимо было дериватизировать очищенный белок с помощью флуоресцентных зондов, позволяющих проводить анализ связывания лиганд-рецептор на клеточных моделях in vitro.

Для этого были использованы способы, основанные на флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Лиганд ABRβ1 был дериватизирован двумя разными флуоресцирующими молекулами: 4-хлор-7-нитробензофуразан (NBD) и Alexa Fluor 647.

Линии иммортализованных клеток человека (модель рака яичников), OVCAR-3, OVCAR-5, CAOV-3, были выбраны в качестве моделей in vitro, поскольку они экспрессируют РФСГ. Клетки, подвергшиеся инкубированию в течение короткого времени с флуоресцирующим лигандом ABRβ1, демонстрируют однородное и маркированное оформление клеточной мембраны, которое зависит от концентрации флуоресцирующего белка, используемого во время инкубирования, и исчезает при совместном инкубировании с Gonal-F® с проявлением специфичности связывания лиганда ABRβ1 с РФСГ.

Проточный цитометрический анализ показывает, что процент маркированных клеток в сравнении с общим количеством клеток во всех случаях превышает 96%.

Аналогичные результаты были получены и на других клеточных линиях, таких как LS-180 (модель рака толстой кишки человека).

На фигуре 8 приведены результаты анализа связывания ABRβ1, маркированного NBD, с РФСГ в раковых клетках.

Приведенные на фигуре раковые клетки обрабатывали маркированным лигандом ABRβ1 и затем перед анализом сигнала флуоресценции промывали физиологическим раствором (FL; канал ФИТЦ). Эксперимент проводился на проточном цитометре. Анализ показывает, что клетки, связывающие ABRβ1 (светло-серый пик), составляют более 96% от общего количества обработанных клеток (темно-серый пик) (n = 3).

7. Анализ интернализации ABRβ1

Анализ влияния лиганда ABRβ1 на динамику интернализации рецептора РФСГ проводился cпособом иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии. Клетки HeLa (культивируемые в полной среде DMEM), посеянные на предметном стекле, трансфицировали плазмидой, которая обеспечивает сверхэкспрессию человеческого РФСГ, через 24 часа после посева клетки обрабатывали 0,1 мкг/мл Gonal-F®, ABRβ1 или ABRβ1 маркированным НБД.

Клетки, обработанные ABRβ1, маркированные НБД, фиксировали (как описано в разделе «Материалы и Способы») и анализировали cпособом флуоресцентной микроскопии с использованием конфокального микроскопа. Клетки, обработанные Gonal-F® или немаркированным лигандом ABRβ1, фиксировали и подвергали обработке в соответствии с иммуноцитохимическим протоколом. В этом случае интернализация РФСГ была выявлена благодаря использованию специфического антитела к РФСГ человека и вторичного антитела, которое позволяет выявить его cпособом конфокальной флуоресцентной микроскопии. Как видно из фигуры 9, появление флуоресцирующих цитоплазматических везикул наблюдается во всех случаях. Клетки HeLa, прилипшие к предметному стеклу, трансформировали плазмидой для экспрессии человеческого РФСГ. Через 24 часа после трансфекции клетки инкубировали с Gonal F или с лигандом ABRβ1 (100 нг/мл в течение 15 минут) и затем промывали физиологическим раствором, далее инкубировали в течение 30 минут при 37°C, после чего фиксировали и подвергали иммуногистохимическому анализу с использованием специфического человеческого антитела к РФСГ и вторичного конъюгированного с ФИТЦ антитела, которое обнаруживается способом конфокальной флуоресцентной микроскопии. Анализ показывает, что Gonal F (панель A и B) и лиганд ABRβ1 (панель C и D) имеют высокую скорость интернализации, о чем свидетельствует появление локализованного сигнала в цитоплазматических везикулах. Клетки, инкубированные только с вторичным антителом ФИТЦ (панель A и C).

Различные используемые способы показывают и подтверждают, что наблюдаемое явление связано со специфической индуцированной лигандом интернализацией РФСГ.

8. Анализ образования цАМФ, индуцированного Gonal-F® и нейтрализации, индуцированной ABRβ1

Для проверки специфичности и эффективности связывания лиганда ABRβ1 с РФСГ, его влияние на продукцию цАМФ (результат связывания и активации рецептора) оценивали в конкурентных исследованиях с Gonal-F®. Клетки HEK293 трансфицировали совместно с плазмидой, содержащей ген, кодирующий РФСГ человека, и плазмидой, кодирующей белковый зонд Epac1-camps, который позволяет измерять изменения в цАМФ с помощью флуоресцентной микроскопии. Предварительный анализ зависимости от дозы, выполненный с Gonal-F®, позволил определить чувствительность, диапазон динамического отклика системы и концентрацию, при которой Gonal-F® дает наибольший эффект. Мера вариации цАМФ в конкурентных экспериментах, в которых концентрация лиганда ABRβ1 поддерживается на фиксированном уровне 500 нг/мл, а концентрация Gonal-F® варьируется в диапазоне 1-100 нг/мл, что позволяет получить кривую сравнения Gonal-F®/ABRβ1 лиганда.

На фигуре 10 приведены результаты образования циклического аденозин монофосфата (цАМФ), индуцированного препаратом Gonal F и нейтрализованного лигандом ABRβ1. Клетки HEK293 трансфицировали с человеческим РФСГ и зондом, что позволяет измерять цитоплазматическую концентрацию цАМФ при флуоресценции с помощью FRET (Epac2-camps). Gonal F индуцирует образование цАМФ в зависимости от дозы (черная линия). В присутствии лиганда ABRβ1 в концентрации 500 нг/мл (серая линия) для получения 50% максимальной активности в отсутствии конкуренции требуется добавление 50 нг/мл Gonal F. Dr/R/min, изменение флуоресценции нормализовано по исходной флуоресценции. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение SD (*=p≤0,01; **=p≤0,05).

Полученные данные показывают, что в присутствии 500 нг/мл лиганда ABRβ1 требуется 50 нг/мл Gonal-F® для достижения 50% максимальной активности препарата в отсутствие конкуренции. Отсюда следует, что для нейтрализации 50 нг/мл Gonal-F®, самого мощного из известных лигандов РФСГ, достаточно 500 нг/мл лиганда ABRβ1. Такое соотношение концентраций, то есть 1:10, оказывается очень низким и подчеркивает чрезвычайную эффективность ABRβ1 в сравнении с Gonal-F® в отношении человеческого РФСГ, также подтверждая его чрезвычайную аффинность и специфичность.

9. Влияние лиганда ABRβ1 на скорость роста раковых клеток: сравнение с Gonal F

Поскольку активация РФСГ вовлечена в механизмы, которые регулируют рост клеток, авторы изобретения проверили влияние лиганда ABRβ1 на скорость роста клеток в трех модельных линиях опухоли человека: CAOV-3, OVCAR-3 (опухоль яичников) и MDA-MB-231 (тройной негативный рак молочной железы). Во всех клеточных линиях обработка препаратом Gonal F (0,1 мкг/мл) через 48 часов после его введения вызывает значительное возрастание скорости роста клеток (CAOV-3, MDA-MB-231 + 40% OVCAR-3 + 20%) Обработка лигандом ABRβ1 (0,1 мкг/мл) снижает скорость роста клеток на 15% в клетках CAOV-3 и на 40% в клетках OVCAR-3 по сравнению с данными, полученными в контрольных условиях. Удивительно, но лиганд ABRβ1 во всех линиях способен нейтрализовать влияние Gonal F на клеточный рост, сводя на нет его эффекты.

На фигуре 11 показано влияние лиганда ABRβ1 на рост раковых клеток. Раковые клетки, приведенные на фигуре, обрабатывали лигандом ABRβ1 (0,1 мкг/мл), Gonal F (0,1 мкг/мл) или смесью Gonal F + ABRβ1 (оба в концентрации 0,1 мкг/мл) в однократной дозе при t = 0 часов. Gonal F вызывает повышение скорости роста через 48 часов примерно на 40% (р ≤ 0,05) в клетках CAOV-3 и MDA-MB-231 и примерно на 20% (р ≤ 0,05) в OVCAR-3 по отношению к контролю (Ctr). Лиганд ABRβ1 вызывает снижение скорости роста через 48 часов приблизительно на 15% (p≤0,1) в клетках CAOV-3 и приблизительно на 40% (p≤0,05) в клетках OVCAR-3. В клеточных линиях лиганд ABRβ1 конкурирует с Gonal F, сводя на нет его влияние на рост клеток (p≤0,005). В целях четкости, стандартные отклонения (n=3) на фигуре не приведены.

Это означает, что в условиях in vitro, лиганд ABRβ1 взаимодействует с РФСГ, конкурируя с Gonal F в сопоставимых концентрациях.

10. Влияние лиганда ABRβ1, маркированного Alexa fluor 647, на скорость роста раковых клеток: сравнение с Gonal F

Лиганд ABRβ1 маркировали Alexa Fluor 647, чтобы получить молекулу, способную прослеживаться у животных в экспериментах in vivo. Это важно для проверки, например, специфического аккумулирования лиганда ABRβ1 в опухолевой массе, индуцированной у животных. Чтобы убедиться, что процесс маркирования не влияет на способность к связыванию лиганда ABRβ1 с РФСГ, эксперименты, описанные в пункте 8, были повторены. ABRβ1 Alexa Fluor 647 способен конкурировать с Gonal F, хотя и менее эффективно по сравнению с немаркированным лигандом ABRβ1 (Фиг. 12).

В частности, на фигуре 12 показано влияние лиганда ABRβ1, маркированного Alexa Fluor 647 на рост раковых клеток. Раковые клетки обрабатывали лигандом ABRβ1, маркированным Alexa Fluor 647 (ABRβ1_FL) (0,1 мкг/мл), Gonal F (0,1 мкг/мл) или смесью Gonal F + ABRβ1_FL (оба в концентрации 0,1 мкг/мл) в однократной дозе при t = 0 часов. Лиганд ABRβ1_FL ингибирует влияние Gonal F способом, подобным тому, что вызывается лигандом ABRβ1, доказывая, что маркировка Alexa Fluor 647 только частично влияет на его эффективность. В целях четкости, стандартные отклонения (n=3) на фигуре не приведены. Потеря эффективности происходит из-за связывания с флуоресцирующей молекулой, которая ухудшает способность лиганда ABRβ1 к взаимодействию с РФСГ. Наблюдаемый эффект все еще сохраняется и подтверждает, что ABRβ1 Alexa Fluor 647 можно использовать в экспериментах in vivo.

11. Проточный цитометрический анализ интернализации ABRβ1 NBD в OVCAR-3 и MDA-MB-231.

Клетки (4 × 10^4 OVCAR-3 или MDA-MB-231) высевали на 24-луночные планшеты за 24 часа до проведения эксперимента. Чтобы определить наилучшие условия эксперимента, клетки инкубировали с повышением концентрации флуоресцирующих лигандов ABRβ1. По прошествии 1 часа инкубации клетки промывали раствором Версена, отделяли от чашек с использованием трипсина, который нейтрализовали добавлением 200 мкл FBS (фетальной бычьей сыворотки). Центрифугированные клетки повторно суспендировали в растворе Версена для измерения сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS - fluorescence-activated cell sorting). Для возбуждения флуорофора (ABRβ1, дериватизированный NBD) использовали лазер 488 нм. В каждом эксперименте проводился трехкратный анализ событий 1×10⁴. Анализ данных проводился с использованием программного обеспечения FACSDiva. Как показано на фигуре 13, интернализация флуоресцирующего лиганда в клетках зависит от концентрации флуоресцирующего лиганда, используемого при инкубировании.

12. После интернализации в OVCAR-3 и MDA-MB-231 лиганд ABRβ1 накапливается в лизосомах.

Интернализацию и субклеточную локализацию лиганда ABRβ1 проводили с использованием лиганда, дериватизированного Alexa Fluor 647, и оценивали с помощью конфокальной микроскопии на клетках, сверхэкспрессирующих РФСГ OVCAR-3 и MDA-MB-231. Клетки (1×10⁵ OVCAR-3 и 8×10⁴ MDA-MB-231) высевали на предметные стекла для конфокальной микроскопии за 24 часа до инкубирования с флуоресцирующим лигандом. Затем клетки совместно инкубировали с меченым лигандом ABRβ1 (500 нг/мл ABRβ1 Alexa Fluor 647 и LysoTracker Green DND-26, 75 нМ) в течение 1 часа при температуре 37°C в полной среде. Перед получением изображения клетки дважды промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса, хранили в том же буфере и немедленно анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Как показано на фигуре 14, в обеих клеточных линиях сигнал, вызванный LysoTracker Green, который накапливается главным образом в клеточных лизосомах, локализуется вместе с сигналом ABRβ1. Это означает, что после интернализации ABRβ1 компартментализируется в клеточных лизосомах.

13. Анализ экспрессии РФСГ на панели линий опухолевых клеток.

Панель модели клеточных линий опухолей человека была проанализирована cпособом FACS для проверки наличия РФСГ на поверхности клетки, анализ был проведен с использованием специфического первичного антитела, разработанного для человеческого РФСГ. Клетки (0,5×10⁶/образец) собирали из культуральных колб и хранили на льду в пробирках для проточной цитометрии в течение всего эксперимента. Для каждой клеточной линии было приготовлено три образца: 1) необработанные клетки, 2) клетки, инкубированные с первичными антителами против РФСГ кролика (SAB4501041, Sigma-Aldrich), и с вторичными антителами против IgG, сопряженными с Alexa Fluor® 488 (TermoFisher), 3) клетки, инкубированные только с вторичными антителами. В конце процесса маркировки клетки подвергали анализу cпособом FACS, для каждого образца отбирали 2×10⁵ события и анализировали с использованием программного обеспечения FACSDiva. Перечень проанализированных клеточных линий и результаты анализа приведены на фигуре 15.

14. ABRβ1 и РФСГ при нейробластоме у детей

Чтобы определить структуру экспрессии гена РФСГ в нейробластоме детей (NB), был проанализирован набор данных, названный E-MTAB-16, хранящихся в Европейской лаборатории молекулярной биологии - EMBL).

В базе данных собраны результаты анализа экспрессии гена, полученные с использованием технологии микроматрицы.

Коллекция состоит из 504 образцов нейробластомы, сгруппированных в 7 перечисленных ниже классов: классы риска, стадии развития опухоли, состояние гена MYCN, выжившие/скончавшиеся, рецидивы, возраст на момент установления диагноза и выживаемость после установления диагноза.

Первичные данные были получены из базы в виде нормализованных данных https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/files/E-MTAB-161/E-MTAB-161.processed.1.zip).

Последовательности, идентифицированные как зонды для представляющих интерес генов, были переведены для эталонного генома hg19 с использованием программного обеспечения bowtie2.

Для последующего анализа были использованы только те зонды, которые идентифицируют представляющие интерес гены с высокой специфичностью и достоверностью.

Уровни экспрессии гена, полученные в случае разных зондов, появившихся на одном и том же гене, были нормализованы с использованием среднего значения имеющихся данных. Анализ был проведен для определения экспрессии гена РФСГ в отношении многих различных параметров, используемых для классификации нейробластомы, таких как возраст пациента на момент постановки диагноза, стадия опухоли, состояние экспрессии MYCN.

Коробочные диаграммы (фигура 16) экспрессии гена РФСГ были получены и проанализированы с использованием статистического критерия Уилкоксона и присвоения значения статистической значимости данным, относящимся к различным группам.

Авторы настоящей заявки на патент обнаружили, что РФСГ сверхэкспрессируется в РФСГ нейробластомы младенцев во всех образцах, составляющих группу пациентов, независимо от состояния эволюции патологического состояния.

Важно, что РФСГ сверхэкспрессирован как в образцах, взятых у пациентов с ранней диагностикой и высокой вероятностью выживания, так и у пациентов с поздней диагностикой и скончавшихся.

Для проверки экспрессии белка РФСГ в нейробластоме использовали клетки NB3 (клеточная модель нейробластомы). Клетки инкубировали с флуоресцирующим лигандом ABRβ1 и анализировали Способами флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Эти данные показывают, что процент клеток, меченных флуоресцирующим лигандом ABRβ1 и, следовательно, экспрессирующих РФСГ на клеточной поверхности превышает 96% во всех проанализированных клетках.

На фигуре 17 приведены результаты анализа связывания ABRβ1, меченого NBD, с РФСГ в раковых клетках NB3. Клетки NB3 (in vitro модель нейробластомы) обрабатывали меченым лигандом ABRβ1 и затем промывали физиологическим раствором перед анализом сигнала флуоресценции (FL), проводимым cпособом проточной цитометрии в канале ФИТЦ. Анализ показывает, что клетки, связывающие ABRβ1 (панель Б), составляют более 96% от общего количества обработанных клеток (панель А) (n = 3).

Также проведенные на микроскопе эксперименты показывают, что лиганд ABRβ1 в клетках NB3 обладает высокой скоростью интернализации, которая затрагивает большинство клеток, что проявляется появлением флуоресцирующих цитоплазматических везикул в более чем 96% проанализированных клеток.

На фигуре 18 приведены результаты интернализации ABRβ1, меченного NBD, в клетках NB3. Клетки NB3, прилипшие к предметному стеклу, инкубировали с меченым лигандом ABRβ1 (150 нг/мл в течение 15 минут), затем промывали в физиологическом растворе, снова инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°C и проводили анализ Способом флуоресцентной микроскопии (канал ФИТЦ). Анализ показал, что лиганд ABRβ1 имеет высокую скорость интернализации. Более 96% обработанных клеток показывают появление сигнала, локализованного в цитоплазматических везикулах (панель В) (n = 3). Необработанные клетки (панель A) Проточный цитометрический анализ с использованием специфических антител к РФСГ человека, проведенный на клеточной модели нейробластомы человека - клетках IMR-32 и SH-SY5Y, - выявляет присутствие рецептора на клеточной мембране, фигура 20.

15. Предварительный анализ острой токсичности лиганда ABRβ1

В предварительном исследовании проводилась оценка in vivo острой токсичности лиганда ABRβ1. С этой целью самцов мышей вида CD1 (n = 3) и самок мышей (n = 3) в возрасте 12-14 недель обрабатывали лигандом ABRβ1 (носитель: 140 ммоль NaCl, 50 мМ NaHPO₄, 60 мкМ Tween 20, pH 6,8). Каждой мыши вводили 200 мкл/25 г раствора, содержащего ABRβ1 в концентрации 1,25 мг/мл, предварительно профильтрованного на полиэфирсульфоновой (ПЭС) мембране с размером пор 0,22 мкм. 50 мкл раствора высевали на питательную среду лизогенный бульон/пептон/агар и инкубировали при 37°C в течение 3 дней (КОЕ = 0) и определяли содержание эндотоксина (Е.Э. <0,1/1 мкг ABRβ1). Контрольные мыши представлены необработанными животными (n = 2) или животными, которым вводили только носитель (n = 2). Животных взвешивали перед обработкой, через 24 часа, а затем каждые 72 часа вплоть до 15 дней после внутривенной инъекции, наблюдали за их поведением в течение 2 часов после обработки и при каждом последующем взвешивании, которое выполнялось утром в период между 9:00 и 10:00 часами.

Животные, которым вводился только носитель, во время обработки и в течение последующих 2 часов не проявляли никаких признаков боли. Наблюдение за поведением животных в течение следующих 15 дней не выявило аномалий или признаков недомогания. Ни у одной из мышей, которым вводили лиганд ABRβ1 (10 мг/кг) не наблюдалось никакой боли в течение 2 часов или в течение 15 дней после обработки. Масса тела во всех случаях в течение более 15 дней оставалась без изменения, как и до лечения (Фиг. 21), и не имелось существенных различий между различными группами животных одного пола.

Мышей умерщвляли спустя 15 дней после обработки, и состояние основных органов оценивали макроскопически. Во всех органах (тимус, сердце, легкие, желудок, печень, селезенка, кишечник, почки, надпочечники, яичники, яички) отсутствовали значительные макроскопические изменения (в сравнении с контрольными образцами), вызванные лечением носителем или ABRβ1 (10 мг/кг).

Материалы и Способы

Построение вектора

Для трансформации бактерий и клеток растений мы использовали вектор pABR, полученный из бинарного вектора pGreenII, в котором участок поликлонирования и последовательность гена lacZ были удалены и заменены новой последовательностью, содержащей ген, который придает устойчивость к канамицину в эукариотах и новой экспрессионной кассете.

Экспрессионная кассета образуется стимулятором транскрипции гена дубликата вируса мозаики цветной капусты CaMV 35Sx2 (Franck и др. 1980), ниже которого расположена последовательность TEV, которая усиливает как транскрипцию, так и трансляцию гена, кодирующего человеческий белок (Nopo и др. 2012).

Между последовательностью VTE и терминатором нопалин синтазы (Luo Z. и др. 2007), который служит повышению стабильности продуцируемой мРНК и эффективности в прекращении ее трансляции, находится участок поликлонирования для вставки последовательности cNDA, кодирующей экзогенный белок (фигура 1, на котором RB/LB - это рекомбинантно-специфические участки, границы слева и справа; Tml p - большой стимулятор ДНК морфологии опухоли; NPT II - неомицинфосфотрансфераза II; Tml t - большой терминатор ДНК морфологии опухоли; CaMV35 x2_p - стимулятор вируса мозаики цветной капусты; TEV 5 '- нетранслируемая TEV, 5' последовательность; Nos t - терминатор нопалин-синтазы).

Структура последовательности, кодирующей лиганд ABRβ1 (человеческий ФСГβ)

Аминокислотная последовательность человеческого ФСГβ получена путем запроса в базу данных UniProtKB, доступной по адресу www.expasy.org. Идентификационный номер белка - P01225.

Последовательность зрелого белка подходящим образом модифицировали для целей настоящего изобретения, с получением приведенной ниже новой аминокислотной последовательности:

SEQ. ID. no. 2

HHHHHHNSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKEKDEL

Благодаря использованию инструментов биоинформатики была создана нуклеотидная последовательность, кодирующая такой белок, затем такая последовательность была оптимизирована для экспрессии в клетках растений.

На участках 5’и 3’ такой последовательности находятся участки распознавания для ферментов рестрикции Eco RI и Xba I для правильного клонирования внутри экспрессионной кассеты в векторе pABR.

Фрагмент ДНК, соответствующий такой последовательности, был получен в процессе синтеза генов в лаборатории.

Ниже приведена новая последовательность, кодирующая лиганд ABRβ1, включая сигнальный пептид, направляемый в эндоплазматический ретикулум.

SEQ. ID. no. 3

GAATTCAACAATGGCTACTCAGAGAAGGGCTAACCCATCTTCTCTTCACCTGATTACCGTGTTCTCTCTGCTTGTGGCTGTGGTGTCTGCTGAGGTGTTCCATCATCACCATCATCACAATTCTTGCGAGCTGACCAACATCACCATTGCTATCGAGAAAGAAGAGTGCAGGTTCTGCATCAGCATCAACACTACTTGGTGCGCTGGTTACTGCTACACCAGGGATCTTGTGTACAAGGATCCTGCTAGGCCTAAGATCCAAAAGACCTGCACCTTCAAAGAGCTGGTTTACGAGACTGTTAGGGTGCCAGGTTGTGCTCATCATGCTGATTCTCTGTACACCTACCCTGTTGCTACTCAGTGCCATTGCGGTAAGTGCGATAGCGATTCTACTGATTGCACCGTGAGAGGTCTGGGACCTTCTTACTGTTCTTTCGGTGAGATGAAAGAAAAGGATGAGCTGTAGTCTAGA

Клеточная культура в суспензии Nicotiana benthamiana

Клеточную культуру Nicotiana benthamiana поддерживают в жидкой питательной среде, содержащей 250 мл MS (Murashige 1962), 30 г/л сахарозы и 2 мг/л нафталинуксусной кислоты (NAA) и 0,2 мг/л кинетина.

Субкультуры готовят каждые 7 дней путем помещения 125 мл аликвоты клеточной суспензии в свежую питательную среду.

Инкубирование клеток проводится с перемешиванием (120 об/мин), в темноте и при постоянной температуре 25°C.

Стабильная трансформация клеточной культуры Nicotiana benthamiana

Agrobacterium tumefaciens (LBA4404), трансформированную плазмидой pABR, культивировали в питательной среде YEP (0,5% масса/объем дрожжевого экстракта, 0,5% масса/объем растительного пептона, 25 г/л лизогенного бульона Миллера) с добавлением 100 мг/л стрептомицина и 50 мг/л канамицина (Duchefa).

25 мл бактериальной культуры готовили в колбе объемом 100 мл, подвергали инкубированию при температуре 28°C, перемешивании со скоростью 120 об/мин до достижения 1 OD.

Затем бактерии собирали при помощи центрифугирования (10 минут при 4000 г при комнатной температуре) и ресуспендировали в 25 мл MS. 200 мкл бактериальной суспензии инокулировали в 25 мл культуры Nicotiana benthamiana (свежая масса клеток растений, равная 9 г).

После 48 часов совместного культивирования в темноте при температуре 25°C и скорости перемешивания 120 об/мин клетки фильтровали через нейлоновый фильтр, промывали избытком культуральной питательной среды и затем ресуспендировали в 25 мл той же среды. Затем клетки высевали на чашки Петри, содержащие селективную среду, состоящую из MS с добавлением 0,9% масса/объем агара, 250 мг/л карбенициллина и 100 мг/л канамицина (Duchefa).

Капсулы инкубировали при температуре 25°C в темноте в течение приблизительно 3 недель, вплоть до появления каллюсов. Впоследствии каллюсы переносили в свежую селекционную среду каждые 15 дней в течение 2 месяцев. По завершении этого периода стабильные клоны хранили в среде MS без антибиотиков.

Протокол очистки лиганда ABRβ1 от клеточной культуры в суспензии Nicotiana benthamiana

1. Приготовление экстракционного буфера

Экстракционный буфер: 50 ммоль Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl, 20 мМ лимонной кислоты, 40 мМ аскорбиновой кислоты, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 1 мМ фенилметилсульфонил хлорида (PMSF), 0,05% (объем/объем) Tвин-20, pH 6,5 с добавлением 1% (масса/объем) XAD-4 и 1% (масса/объем) поливинилполипирролидона (ПВПП).

Полистирольная смола XAD-4 требует обработки перед добавлением в экстракционный буфер, которая состоит из промывки в метаноле в течение по меньшей мере 1 или 2 ч с последующим обильным промыванием деионизированной водой.

По меньшей мере за 2-4 часа до использования в экстракционный буфер следует добавить поливинилполипирролидон (PVPP), чтобы обеспечить его гидратацию.

2. Экстракция

Аликвоту клеток в суспензии, отфильтрованную на оплетке (отсечение около 50 мкм) и хранящуюся при температуре -80°C, помещают в условия 4

°C для размораживания в течение одной ночи. Буфер 20 мМ Na₂HPO₄, 10 мМ ЭДТА, pH 7,2 добавляют в соотношении 2:1, т.е. 2 мл буфера на грамм клеток. Суспензию выдерживают при 4°C при постоянном перемешивании в течение 1 часа, а затем центрифугируют со скоростью 18000 об/мин в течение 20 мин при контролируемой температуре 4°С, отбрасывая супернатант.

Экстракционный буфер добавляют к осадку после центрифугирования в соотношении 3:1 (3 мл/грамм клеток) и выдерживают при температуре 4°C в течение 1 часа. Затем экстракт центрифугируют со скоростью 18000 об/мин в течение 20 минут при температуре 4°C, отделяя супернатант.

3. Осаждение с сульфатом аммония

Сульфат аммония добавляют к экстракту вплоть до получения концентрации насыщения 70% (концентрация, при которой было продемонстрировано полное осаждение лиганда ABRβ1).

Раствор выдерживают при температуре 4°С в течение 1 ч при постоянном перемешивании. После центрифугирования со скоростью 18000 об/мин в течение 20 мин при температуре 4°С супернатант отбрасывают и осадок повторно суспендируют в 1/10 от первоначального объема буфера, подходящего для стимулирования взаимодействия между белками и смолой IMAC.

4. Хроматография IMAC

Осадок, полученный после обработки сульфатом аммония, повторно суспендируют в 1/10 от первоначального объема буфера, состоящего из 20 ммоль Na₂HPO₄, 300 ммоль NaCl, 10 ммоль имидазола, с рН 8,0, центрифугируют со скоростью 18000 об/мин и фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Полученный раствор загружают в колонку, заполненную смолой Ni Sepharose 6 FF (GE Healthcare, 17-5318-01), уравновешенной буфером, содержащим 20 ммоль Na₂HPO₄, 300 ммоль NaCl, 10 ммоль имидазола, с pH 8,0 и элюируют буфером 20 ммоль Na₂HPO₄, 300 ммоль NaCl, 500 ммоль имидазола, рН 8,0 с использованием многоступенчатого градиента. Мониторинг оптической плотности выполняется при 280 и 254 нм.

Фракции, полученные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) и иммуноблоттинга с использованием в качестве cпособа обнаружения усиленную хемилюминесценцию (ECL).

В этих анализах используются экспрессируемые у кролика поликлональные первичные антитела к hФСГ-β (Abcam, AB171431), вторичные антитела к IgG кролика, дериватизированные пероксидазой хрена (KPL, 474-1506) и человеческий рекомбинантный hФСГ-β, экспрессируемый в E.coli, в качестве эталонного стандарта (Abnova, H00002488-Q01).

5. Эксклюзионная хроматография

Фракции, полученные с помощью IMAC хроматографии, в которых был обнаружен лиганд ABRβ1, объединяют и загружают в колонку, заполненную средой Sephadex G-25 (GE Healthcare, 17-0033-01). Колонку доводят до равновесного состояния и выполняют элюирование буферным раствором, содержащим 50 мМ ацетата натрия, 150 мМ NaCl, 60 мкМ Твин-20, рН 5,5. Мониторинг оптической плотности выполняется при 280 и 254 нм.

Элюаты, собранные на хроматографических пиках, анализируют с помощью электрофореза ДСН-ПААГ и иммуноблоттинга с детекцией ECL, чтобы контролировать присутствие в них рекомбинантного белка. В этих анализах используются экспрессируемые у кролика поликлональные первичные антитела к hФСГ-β (Abcam, AB171431), вторичные антитела к IgG кролика, дериватизированные пероксидазой хрена (KPL, 474-1506) и человеческий рекомбинантный hФСГ-β, экспрессируемый в E.coli, в качестве эталонного стандарта (Abnova, H00002488-Q01).

6. Ионообменная хроматография

Фракции, полученные с помощью молекулярной эксклюзионной хроматографии, которые оказались положительными в отношении присутствия лиганда ABβR, объединяли и загружали в колонку, заполненную смолой SP Sepharose HP (GE Healthcare, 17-1087-01), доведенную в равновесное состояние буфером, содержащим 50 мМ ацетата натрия, 150 мМ NaCl, 60 мкМ Твин-20, с рН 5,5 и элюировали буфером, содержащим 50 мМ ацетата натрия, 1 М NaCl, 60 мкМ Твин-20, рН 5,5, с использованием многоступенчатого градиента. Мониторинг оптической плотности выполняется при 280 и 254 нм.

Как и в случае предшествующих хроматографирований, необходимо проанализировать полученные фракции, чтобы определить, в какой из них присутствует человеческий рекомбинантный белок.

Дегликозилирование посредством фермента PNGase F

Аликвоту лиганда ABRβ1 из ионообменной хроматографии концентрировали до 0,5 мг/мл с использованием концентратора Vivaspin с отсечкой около 10 кДа (VS0403, Sartorious) и с заменой буферного раствора буфером, содержащим 50 мМ NH₄HCO₃, 0,1% (объем/объем) Rapigest SF (Waters, Манчестер, Великобритания), рН 7,9.

Концентрацию белка определяли с помощью анализа бицинхониновой кислотой (QuantiPro™ BCA Assay Kit, QPBCA, Sigma Aldrich) по протоколу, описанному производителем.

Образец с добавлением PNGase F (Roche Custom Biotech, Mannheim, Germany) в молярном соотношении 1:50 (фермент: субстрат), инкубировали в течение ночи при постоянной температуре 37°C.

В конце реакции в раствор добавляли 45 трифторуксусной кислоты (масса/объем) и центрифугировали со скоростью 13 000 об/мин в течение 10 минут.

Затем образец анализировали с помощью ДСН-ПААГ (Laemmli 1970) на 12%-ном полиакриламидном геле и высокоэффективной масс-спектрометрии.

Триптическое расщепление in situ

Полиакриламидный гель, окрашенный Кумасси бриллиантовым синим G250, промывают ультра-чистой водой и иссекают электрофоретическую полосу, соответствующую белковой последовательности. Эту полосу разрезают на маленькие фрагменты, которые промывают 100-150 мкл ультрачистой воды в течение 5 минут. Раствор центрифугируют и удаляют жидкость. Добавляют объем ацетонитрила(CH₃CN), равный 3-4 объемам фрагментов и выдерживают 10-15 минут, до получения «мятой» усадки кубиков.

Удаляют супернатант и доводят до сухости посредством сублимационной сушки. Его восстанавливают буфером, содержащим 0,1 M NH₄HCO₃, 10 мM ДТТ, в количестве, необходимом для покрытия фрагментов, инкубируют в течение 30 минут при температуре 56°C для ослабления дисульфидных связей белков.

Его центрифугируют, жидкость удаляют и снова обрабатывают ацетонитрилом, как это указано выше.

Ацетонитрил заменяют буфером, содержащим 0,1 M NH₄HCO₃, 55 мM йодоацетамида, и инкубируют защищая от света в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы дериватизировать остатки цистеина.

Раствор йодоацетамина удаляют и промывают приблизительно 150 мкл буфера, содержащего 0,1 M NH₄HCO₃ в течение 15 минут.

Его центрифугируют, жидкость удаляют и снова обрабатывают ацетонитрилом.

Если фрагменты геля все еще окрашены голубым цветом, их регидратируют 150 мкл буфера, содержащего 0,1 M NH₄HCO₃ в течение 10-15 минут.

Затем добавляют равный объем ацетонитрила и выдерживают в орбитальном шейкере в течение 20 минут.

Центрифугируют, удаляют раствор и обрабатывают ацетонитрилом, доводя до сухости посредством сублимационной сушки.

Эти этапы повторяют до тех пор, пока сохраняется синее окрашивание. Впоследствии, добавляют 13 мкл модифицированного трипсином в количестве 12,5 нг/мкл раствора (Sequencing Grade Modified Trypsin V5111, Promega) и фрагменты покрывают мкг 50 мM NH₄HCO₃.

Образцы выдерживают при температуре 4°C в течение 30-45 минут, чтобы фрагменты подверглись регидратации и абсорбировали раствор, содержащий фермент.

На этом этапе проверяется, является ли объем раствора достаточным для покрытия фрагментов, и при необходимости добавляют буфер, содержащий 50 мМ NH₄HCO_3.. Образцы инкубируют в течение 24 часов при контролируемой температуре 37°C.

В конце инкубирования экстрагируют пептиды, полученные путем триптического протеолиза.

1) К раствору добавляют 10-15 мкл буфера, содержащего 25 мM NH₄HCO₃ и образцы перемешивают термомиксером при температуре 37°C в течение 15 минут. Раствор центрифугируют и добавляют объем CH₃CN, в 1-2 раза превышающий объем фрагментов геля. Перемешивают в течение 15 минут при температуре 37°C в термомиксере. Центрифугируют и собирают супернатант.

2) Остаточные фрагменты геля смешивают с 40-50 мкл муравьиной кислоты (HCOOH) в количестве 5% (объем/объем). Образцы выдерживают при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 15 минут. Раствор центрифугируют и добавляют объем CH₃CN, в 1-2 раза превышающий объем фрагментов геля. Перемешивают в течение 15 минут при температуре 37°C в термомиксере. Центрифугируют и собирают супернатант.

Экстракты объединяют и испаряют до сухости в лиофилизаторе.

Хроматографический анализ триптического гидролизата

После протеолиза in situ, белковый материал лиофилизировали и ресуспендировали в смеси муравьиной кислоты: ацетнитрила: воды в соотношении 2:3:95.

20 мкл раствора загружали в колонку Vydac C18 (1x150 мм, размер частиц 5 мкм, пористость 300 Å), доведенную до равновесного состояния 2%-ным (объем/объем) водным раствором ацетонитрила и 2%-ной (объем/объем) муравьиной кислотой. Колонку элюируют со скоростью 50 мкл/мин с линейным градиентом ацетонитрила 3-65% в течение 25 минут.

Элюат исследовали путем мониторинга полного ионного тока (TIC - Total Ion Current) с использованием масс-спектрометра Xevo G2-XS Q-TOF.

Определение процента агрегации способом молекулярной эксклюзионной хроматографии

Стандартное состояние агрегации лиганда ABRβ1 оценивали способом молекулярной эксклюзионной хроматографии с использованием колонки YARRA, 3 мм SEC 3000, 150 мм × 7,8 мм (Phenomenex) с интервалом разделения 10-600 кДа.

Загружали 20 мкл аликвоты лиганда ABRβ1 (160 мкг/мл) и колонку элюировали буферным раствором 20 мМ Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl, рН 7,4.

Анализ стабильности посредством флуорометрии

Аликвоту ABRβ1 (250 мкл очищенного белка) разбавляли до конечного объема 1600 мкл (конечная концентрация ABRβ1, равная 1 мкМ с буфером 20 мМ HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 0,1% ПЭГ-8000 (масса/объем). Образец анализировали (T0) и хранили при температуре 4°C в течение одной недели. Анализ повторяли с интервалом в 24 часа на том же образце. Спектр флуоресценции получали в следующих условиях: T= 25°C, λ_exc= 280 нм, λ_em= 295-500 нм.

Определение сульфидных связей

Аликвоту лиганда ABRβ1 подвергали ферментативному дегликозилированию через PNGase F, как описано выше, и реакционную смесь анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле в условиях без восстановления. Гель окрашивали Кумасси бриллиантовым синис G250. Полосу, соответствующую полностью дегликозилированному лиганду ABRβ1, подвергали трехкратному расщеплению in situ, как описано выше, но сохраняли сульфидные связи нетронутыми и, таким образом, избегая восстановления и алкилирования остатков цистеина.

Лиофилизированный продукт пептидной смеси, полученной в результате триптического протеолиза, извлекали буферным раствором, состоящим из 50 мМ NH₄HCO₃, 1 мМ CaCl₂, pH 8,2 с добавлением субтилизина (Subtilisin Carlsberg P-5380, Sigma) в молярном соотношении фермент: субстрат, равном 1:50.

Раствор инкубировали при контролируемой температуре 37°C в течение ночи и затем лиофилизировали.

Образец снова солюбилизировали в смеси уксусная кислота: ацетонитрил: вода в соотношении 2:3:95.

Объем, равный 20 мкл загружали в колонку Vydac C18 (1x150 мм, размер частиц 5 мкм, пористость 300 Å). Колонку элюировали при постоянной скорости 50 мкл/мин с линейным градиентом ацетонитрила от 3% до 65% в течение 12 минут.

Анализ контролировали путем регистрации сигнала TIC (суммарного ионного тока) с использованием масс-спектрометра Xevo G2-XS Q-TOF, и для каждого хроматографического пика определяли молекулярную массу присутствующих частиц.

Выделение и культуры клеток Сертоли

Для приготовления клеток Сертоли (SC) использовались яички поросят от препубертатных самцов животных крупной белой породы в возрасте 7-15 дней. Материал собирался и хранился надлежащим образом квалифицированным персоналом во время рутинных операций кастрации, связанных с разведением, поэтому его использование в экспериментах in vitro в исследовательских целях не требовало одобрения местного комитета по этике.

Процедура выделения SC заключается в удалении яичек у анестезированных поросят. После удаления фиброзного утолщения яички тонко измельчали для получения гомогенной фрагментации ткани, которую впоследствии подвергали последовательному ферментативному расщеплению с использованием 2 мг/мл коллагеназы Р (Roche Diagnostics) в сбалансированном физиологическом растворе Хэнкса (HBSS, Sigma-Aldrich).

Расщепление продолжали вплоть до физического разрушения семенных канальцев.

После промывки суспензию разрушенной ткани инкубировали с раствором HBSS с добавлением трипсина и ДНазы I в течение 15 минут (Sigma-Aldrich).

В конце этого второго расщепления осадок тканей, оставшийся после декантации, дважды промывали в HBSS, а затем центрифугировали со скоростью 120 об/мин в течение 3 минут. Полученный осадок фильтровали через сетку из нержавеющей стали с размером пор 500 микрометров и повторно суспендировали в буфере, состоящем из 2 М глицина, 2 мМ ЭДТА, рН 7,2. Цель заключается в устранении всех остаточных клеток Лейдига.

Остаточные канальцы без перитубулярных клеток затем собирали и выдерживали в культуре в присутствии 0,166 нМ ретиноевой кислоты (Sigma-Aldrich) и 5 мл/500 мл инсулина/селена (Becton Dickinson) Клеточную культуру помещали в инкубатор при температуре 37°C. После 3 дней культивирования клетки обрабатывали таким образом, чтобы удалить любые остаточные зародышевые клетки (Galdieri и др., 1981; Korbutt и др., 1997; Luca и др., 2005; Luca и др., 2007).

Измерение активности фермента ароматазы

Прежде чем приступить к различным гормональным обработкам, жизнеспособность культивируемых клеток оценивали путем окрашивания бромидом этидия и диацетатом флуоресцеина (Sigma-Aldrich) способом флуоресцентной микроскопии (Nikon Optiphot-2, Nikon Corporation). Чтобы оценить активность α-ароматазы, клетки 20×10⁶ обрабатывали в течение 3 дней различными концентрациями фолликулостимулирующего гормона (Gonal-F) или такими же концентрациями лиганда ABRβ1; в конце периода обработки к культурам добавляли 0,2 мг/мл тестостерона и дополнительно инкубировали в течение 8 часов.

В конце стимуляции продуцируемый 17β-эстрадиол (E2) высвобождается в среде для культивирования клеток и оценивается с использованием специального высокочувствительного набора (ADVIA Centaur, Estradiol-6 III, Bayer Diagnostics).

Маркировка лиганда ABRβ1 флуоресцирующими молекулами

Для экспериментов по связыванию in vitro и локализации in vivo лиганд ABRβ1 конъюгировали с двумя различными флуоресцентными молекулами: 4-хлор-7-нитробензофуразан (NBD) (Sigma) and Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific).

Для маркировки NBD готовили концентрированный раствор 50 мМ флуоресцирующего зонда в ацетонитриле.

Реакция мечения лиганда ABRβ1 50 мкМ/мл происходит в растворе, состоящем из 50 мМ ацетата натрия, 500 мМ NaCl, 60 мкМ Tween 20, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 30 мМ трис (гидроксиметил) аминометана (трис/HCl) pH 7,0 и 5 мМ NBD (Bernal-Perez и др. 2012).

Раствор инкубируют при 24°C в течение 16 часов, маркировку белка и возможное присутствие агрегации оценивают с помощью флюорометрического и флуоресцентного микроскопического анализа (за исключением 465 нм; еm. 515 нм). Что касается сопряжения лиганда ABRβ1 с Alexa Fluor 647 (за исключением 650 нм; еm. 665 нм), использовался коммерческий набор Alexa Fluor 647, набор для маркировки антител (Thermo Fisher Scientific), следуя инструкциям, предоставленным производителем.

Анализ связывания с рецептором лиганда ABRβ1 посредством проточной цитометрии

Стабилизированные клеточные линии человека (OVCAR-3, OVCAR-5 рака яичников и LS180 рака ободочной кишки) и линию первичной карциномы яичников A116 культивировали в среде RPMI1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 1% глютамина и 1% пенициллин стрептомицина.

Некоторые контрольные эксперименты проводились в отсутствие антибиотиков или спустя 24 часов культивирования в среде без сыворотки, чтобы исключить любое вмешательство компонентов сыворотки или антибиотиков.

После иммунофлуоресцентного анализа клетки отделяли от культуральной подложки путем инкубации с трипсином-ЭДТА и после подсчета их разбавляли до концентрации 100 000 клеток/100 мкл и инкубировали с флуоресцирующим лигандом ABRβ1. Прямую иммунофлюоресценцию с использованием цитофлуориметрического анализа проводили на клетках, предварительно инкубированных в течение 15 мин при 37°C с 10 мкл/мл (350 нг) меченого NBD лиганда ABRβ1, анализ проводили с использованием канала FITC на проточном цитометре. Мечение клеток может проводиться также при более низких концентрациях лиганда ABRβ1, сигнал флуоресценции не заметен, причем клетки предварительно инкубируются с концентрациями лиганда ABRβ1 ниже 70 нг/мл. Перед анализом способом проточной цитометрии для оценки жизнеспособности клеток и связывания лиганда ABRβ1 без вмешательства протеолитических ферментов, которые могли бы изменить результаты, вызывая отделение лиганда от специфического рецептора, некоторые эксперименты проводились без выделения клеток из субстрата, такие анализы проводились с использованием конфокального микроскопа Olympus FV500.

Интернализация ABRβ1

Анализ влияния лиганда ABRβ1 на динамику интернализации рецептора РФСГ проводился способом иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии. Клетки HeLa (культивируемые в полной среде DMEM), посеянные на предметном стекле, трансфицировали плазмидой, которая обеспечивает сверхэкспрессию человеческого РФСГ, через 24 часа после посева клетки обрабатывали 0,1 мкг/мл Gonal-F®, ABRβ1 или ABRβ1 маркированным НБД.

Затем клетки фиксировали в 4% параформальдегиде (w: v PBS1X, натрий-фосфатный буфер PBS) в течение 30 минут при температуре 4°C и промывали PBS 1X (3 промывки по 5 минут каждая). В случае иммунофлюоресценции фиксированные клетки становятся проницаемыми после инкубации с PBS 1X с добавлением 1% BSA (бычьего сывороточного альбумина) и 0,1% Triton-X100 (Sigma) в течение 5 минут при комнатной температуре. Раствор для повышения проницаемости удаляют посредством промывания PBS 1X (3 промывания по 5 минут каждая). Затем клетки инкубируют с первичным антителом (анти-FSHR SAB4501041), разбавленным физиологическим раствором с добавлением 1% BSA в течение 2 часов при температуре 37°C. В конце процесса инкубации первичное антитело удаляют промывкой PBS 1X (3 по 5 минут каждая) и клетки инкубируют с соответствующим вторичным антителом, разведенным в PBS 1X с добавлением 1% BSA в течение 30 мин при температуре 37°C. В данном исследовании использовалось вторичное антитело, сопряженное с цианином-3, (которое возбуждается при 550 нм и излучает красный свет при 570 нм). Затем клетки промывали PBS 1X (3 промывания по 5 минут каждое), ядра, меченые DAPI (4',6-диамидин-2-фенилиндол) (1:5000, объем: объем в PBS 1X) (Sigma) в течение 5 минут при комнатной температуре. Предметные стекла фиксировали с помощью эльванола, хранили при 4°C и анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica SP5 или флуоресцентного микроскопа LEICA DFC300FX. В случае обработки лигандом ABRβ1, меченным NBD, клетки фиксировали после промывания и сразу же подготавливали для наблюдения под микроскопом (как описано выше) с использованием пары фильтров для наблюдения в канале FITC.

Анализ кривых, отражающих рост клеток

Клетки CAOV-3 культивировали в питательной среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки and 2 мM глютамина (Sigma), а клетки MDA-MB-231 - в среде L15 (ATCC) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Клетки OVCAR-3 культивировали в питательной среде RPMI с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки и 2 мM глютамина и 0,01 мг/мл инсулина (Sigma).

Клеточные культуры держали в инкубаторе при температуре 37°C. Для анализа скорости роста клетки высевали на 6-луночные планшеты в концентрации 5×10⁴ клеток/лунку в присутствии подходящей среды в зависимости от клеточной линии. Клетки обрабатывали Gonal-F®, лигандом ABRβ1 или обоими вместе в концентрации 0,1 мкг/мл. Оценку роста клеток выполняли через 24, 48 и 72 часа после добавления в культуральную среду Gonal-F® и ABRβ1. Скорость пролиферации клеток оценивали по количеству клеток в упомянутые моменты времени, с использованием теста на жизнеспособность (тест на вытеснение трипанового синего).

Анализ экспрессии РФСГ в линиях опухолевых клеток человека.

Анализ проводили cпособом проточной цитометрии с использованием специфического первичного антитела, разработанного для человеческого РФСГ. Клетки собирали из культуральных колб и хранили на льду вплоть до проведения измерения. Для каждого анализа было приготовлено три образца: 1) необработанные клетки, 2) клетки, инкубированные с первичными антителами к РФСГ кролика (SAB4501041, Sigma-Aldrich), и с вторичными антителами к IgG, сопряженными с Alexa Fluor® 488 (TermoFisher), 3) клетки, инкубированные только с вторичными антителами. Подготовка трех условий эксперимента позволяет назначить положительный сигнал и исключить любые ложноположительные результаты. В конце процесса маркировки и промывки, клетки подвергаются анализу в FACS. Для каждого образца получали и анализировали 2×10⁵ события (клетки).

Анализ связывания ABRβ1 с РФСГ в клетках NB3 (модель нейробластомы младенцев)

Данные, полученные в результате анализа FACS с использованием маркированного NBD лиганда ABRβ1, показывают, что процент меченых клеток, которые таким образом экспрессируют РФСГ на клеточной поверхности, превышает 96% во всех проанализированных клетках.

Проточный цитометрический анализ интернализации ABRβ1, маркированного NBD.

Клетки (4×10^4 OVCAR-3 или MDA-MB-231) высевали на 24-луночный планшет за 24 часа до проведения эксперимента и инкубировали в течение 1 часа с повышением концентрации флуоресцирующего лиганда ABRβ1. Клетки промывали раствором Версена, отделяли с культуральных пластинок трипсином с последующей нейтрализацией посредством добавления 200 мкл FBS. Затем клетки центрифугировали и повторно суспендировали в растворе Версена для проведения измерений cпособом проточной цитометрии. Для возбуждения флуорофора (ABRβ1, дериватизированный NBD) использовали лазер 488 нм.

Анализ накопления ABRβ1 в лизосомах после интернализации

Интернализацию и субклеточную локализацию лиганда АBRβ1 проводили с помощью конфокальной микроскопии. Клетки высевали на предметные стекла для конфокальной микроскопии за 24 часа до инкубирования с флуоресцирующим лигандом ABRβ1, дериватизированным Alexa Fluor 647. Затем клетки совместно инкубировали с маркированным лигандом ABRβ1 (250 нг/мл ABRβ1 и LysoTracker Green DND-26, 75 нМ) в течение 1 часа при температуре 37°C в полной среде. Перед получением изображения клетки дважды промывали сбалансированным физиологическим раствором Хенкса, хранили в том же буфере и немедленно анализировали с помощью микроскопа.

Интернализация ABRβ1 в клетках NB3

Клетки NB3 культивировали в питательной среде DMEM и высевали на слайд за 24 часа до проведения эксперимента. Клетки инкубировали со 150 нг/мл лиганда ABRβ1, маркированного NBD, в течение 15 минут в инкубаторе при температуре 37°C. В конце обработки клетки промывали физиологическим раствором, инкубировали в полной культуральной среде в течение различных периодов времени, промывали физиологическим раствором и наблюдали под флуоресцентным микроскопом с использованием пары фильтров для FITC. Это позволяет оценить интернализацию флуоресцирующего лиганда ABRβ1 в клетки благодаря появлению флуоресцирующих везикул, локализованных в цитоплазме.

Анализ образования цАМФ, индуцированного Gonal-F® и нейтрализации, индуцированной ABRβ1

Для анализа использовали клетки HEK293, в которых экзогенная экспрессия РФСГ человека (HG15960-UT DBA) и биосенсора циклического АМФ- (цАМФ), Epac1-camps была получена путем кратковременной котрансфекции генов, кодирующих эти две структуры. Анализ проводился посредством флуоресцентной микроскопии в отдельной живой клетке по ранее оптимизированному и проверенному в лаборатории протоколу.

Динамическое измерение внутриклеточных вариаций цАМФ, индуцированных активацией РФСГ человека с помощью агониста Gonal-F®, сравнивали в отсутствие или в присутствии лиганда ABRβ1 в различных концентрациях. Анализ влияния лиганда ABRβ1 на динамику интернализации рецептора РФСГ проводился cпособом иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии.

Трансфекция клеток HEK293 выполнялась с помощью липофектамина (инвитрогена) в соответствии с инструкциями производителя, оптимизированными в лаборатории. Смесь для котрансфекции получали смешиванием ДНК Epac2-camps и РФСГ в соотношении 1:1. В конце процедуры котрансфекции клетки промывали и инкубировали в культуральной среде DMEM при температуре 37°C в течение 48 часов (для способствования синтезу трансфицированного экзогенного белка).

Анализ фармакологии молекулы ABRβ1 выполнялся посредством измерения изменения внутриклеточных уровней цАМФ в жизнеспособных клетках, синтез которого происходит очень быстро и активируется рецептором ФСГ. Этот cпособ основан на экспрессии в клетке биосенсора по технологии FRET для цАМФ (Nikolaev и др. 2006). Биосенсор кодирует два варианта цвета флуоресцирующего белка GFP, связанного с высокоаффинным белковым доменом цАМФ. Относительная интенсивность эмиссии двух вариантов GFP варьируется в зависимости от внутриклеточной концентрации цАМФ. Измерение изменения флуоресценции проводится с помощью флуоресцентной микроскопии в одной ячейке, с вычислением соотношения между интенсивностью излучения в канале при 480 +/- 25 нм и в канале при 535 +/- 35 нм в зависимости от метода подтвержденной сенсибилированной величины коэффициента эмиссии. Клетки HEK293 высевали на предметные стекла с диаметром 24 мм и трансфицировали для совместной экспрессии EPAC1-cAMPs и РФСГ. Для экспериментов по визуализации предметные стекла устанавливаются в небольшую камеру, подходящую для использования с инвертированными микроскопами. Культуральную среду удаляют и заменяют на физиологический раствор Рингера (модифицированный Рингер: 125 NaCl, 5 KCl; 1 Na₃PO₄; 1 MgSO₄; 5,5 глюкозы; 20 Hepes; 1.8 CaCl₂, в H₂O, pH 7,4) забуференный Hepes-ом.

Чтобы определить синтез цАМФ, клетки обрабатывали Gonal-F® в концентрациях от 1 до 100 нг/мл. Препарат-агонист добавляли непосредственно в раствор для визуализации после двухминутного сбора данных, нацеленного на оценку базовых уровней FRET. В отдельной серии экспериментов измерение цАМФ проводилось с теми же концентрациями Gonal-F® в клетках, инкубированных с лигандом ABRβ1 в концентрациях в диапазоне 10-500 нг/мл, в течение 5 минут. Получение и анализ изображений проводился с помощью программного обеспечения Image J (NIH, Bethesda, MD, США). Сравнение между экспериментальными группами проводили с использованием теста Anova, считая значение P<0,05 статистически значимым. Все данные приводятся в виде среднего значения ± среднее стандартное отклонение.

Специалисты в данной области техники смогут понять преимущества настоящего изобретения из приведенного выше описания.

Что касается β субъединицы ФСГ, неожиданно было обнаружено, что она не активирует так называемый каскад цАМФ.

β-субъединица, полученная рекомбинантным способом, вместо и, в частности, субъединицы ABRβ1, полученной с помощью рекомбинантной технологии и экспрессии в Nicotiana benthamiana, оказалась имеющей много преимуществ, включая: высокое качество и биологическую безопасность, благодаря почти нулевому риску заражения вирусами, онкогенами, прионами, токсинами или опасными остатками реагентов, которые обычно используются при производстве терапевтических белков.

Способность получать такую субъединицу ABRβ1 в растении-хозяине является одинаково полезной и удивительной.

Также субъединица ABRβ1 продемонстрировала удивительную стабильность, значительно более высокую, чем у ФСГ и антител.

Эти преимущества не наносили ущерб активности и сродству к рецептору ФСГ; в частности, сродство проявлялось на наномолярном (нМ) уровне.

Еще одним преимуществом является то, что субъединица ABRβ1 не активирует рецептор ФСГ, о чем свидетельствует отсутствие активации каскада цАМФ.

Эти свойства особенно удивительны и неожиданны в свете структуры гликозилирования, отличающейся от структуры гликозилирования субъединицы ФСГβ дрожжей, насекомых, млекопитающих и, в частности, клеток человека.

Было обнаружено, что специфическое связывание с РФСГ как субъединицы ФСГβ, так и субъединицы ABRβ1 не увеличивает скорость роста раковых клеток.

Несмотря на то, что ABRβ1 не активирует рецептор, он показывает значительную скорость интернализации в клетках, используемых в качестве модельной системы.

Существующий уровень техники описывал возможное применение пептидных фрагментов субъединицы ФСГβ в терапии.

Это никоим образом не делает очевидным терапевтическое применение субъединицы ФСГβ.

Фактически, эти две структуры существенно отличаются друг от друга.

Например, структура ФСГ33-53 пептида, известная из работы Agris и др. (J. Prot. Chem. 1992) включает в себя два витка между остатками 41-46 и 50-52, тогда как в тех же областях субъединицы ФСГβ она имеет конформацию β-тяж. Также пептид имеет небольшую спиральную область между аминокислотами 34-36, тогда как в ФСГβ-субъединице те же самые области являются β-тяжем. Другим отличием является то, что цистеин Cys51 образует дисульфидную связь с субъединицей ФСГβ, которая отсутствует в пептиде.

Абсолютно важным преимуществом настоящего изобретения является его потенциальное применение для лечения и диагностики нейробластомы.

Нейробластома фактически является наиболее распространенным внечерепным солидным раком в младенческом возрасте, который берет начало в недифференцированных клетках нервного гребня.

Это самый распространенный вид рака у детей в возрасте до 1 года и до сих пор широко распространен в возрастной группе до 6 лет.

Первичная опухоль часто обнаруживается в области мозгового слоя надпочечников или в параспинальных ганглиях, и, к сожалению, на момент постановки диагноза метастаз уже присутствует в более чем 50% случаев.

У пациентов с нейробластомой анализ экспрессии онкогена MYCN (V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene Neuroblastoma) является положительным в 20% случаев, что тесно связано с высоким риском смертельного исхода.

В настоящее время амплификация MYCN представляет собой наилучший генетический маркер оценки риска при нейробластоме.

Оценка риска смертельного исхода основано на интеграции различных клинических и биологических факторов, включая стадию развития нейробластомы (Brodeur и др. 1993), возраст во время постановки диагноза (Brodeur и др. 1988), амплификация MYCN (Seeger и др. 1985) и гистологическое исследование (Shimada и др. 1984).

Среди всех этих критериев возраст и ранняя диагностика являются наиболее важными переменными для оценки рисков у пациентов с метастазами.

В промежуточную группу риска входят пациенты, которым поставлен диагноз до достижения ими возраста одного года.

Пациенты с задержкой постановки диагноза вместо этого включаются в класс высокого риска, тогда как пациенты с низким и средним риском обычно имеют благоприятный прогноз с выживаемостью около 80%.

Ситуация крайне неблагоприятна для пациентов с высоким риском, где выживаемость опускается ниже 40%.

Более того, недавно был идентифицирован класс пациентов с «очень высоким риском», которые не реагируют на противоопухолевую терапию или у которых с большой вероятностью имеют место рецидивы (Maris et al., 2007; Matthay и др., 2012).

Изучаемые в настоящее время способы лечения нейробластомы основаны на радиоактивно меченых молекулах, которые предпочтительным образом захватываются опухолью по сравнению со здоровыми тканями, на иммунотерапии, которая использует моноклональные антитела к поверхностным опухолевым антигенам, и на синтетических ингибиторах киназ, которые контролируют клеточный цикл.

Однако из-за нестабильности антител и ограниченной специфичности других молекул к опухолевой ткани у пациентов возникают значительные побочные явления, которые ограничивают эффективность протоколов лечения (Matthay и др., 2012b).

Настоящее изобретение может являться многообещающей альтернативой доступным в настоящее время способам лечения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ONCOGREEN THERAPEUTICS SA.

ОНКОГРЕЕН ТХЕРАПЕУТИКС СА

<120> LIGANDS OF THE FSH HORMONE RECEPTOR IN THE DIAGNOSIS

AND TREATMENT OF TUMORS

Лиганды к рецептору фолликулостимулирующего гормона (FSH)

в диагностике и лечении опухолей

<130> 412363

<150> IT102016000101852

<151> 2016-10-11

<150> IT102016000101862

<151> 2016-10-11

<150> IT102016000101870

<151> 2016-10-11

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu

1 5 10 15

Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys

20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln

35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro

50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr

65 70 75 80

Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val

85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu

100 105 110

<210> 2

<211> 121

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FSHR лиганд

<400> 2

His His His His His His Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile

1 5 10 15

Ala Ile Glu Lys Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr

20 25 30

Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro

35 40 45

Ala Arg Pro Lys Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr

50 55 60

Glu Thr Val Arg Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp

85 90 95

Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe

100 105 110

Gly Glu Met Lys Glu Lys Asp Glu Leu

115 120

<210> 3

<211> 472

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> encoding SEQ. ID. n. 2

<400> 3

gaattcaaca atggctactc agagaagggc taacccatct tctcttcacc tgattaccgt 60

gttctctctg cttgtggctg tggtgtctgc tgaggtgttc catcatcacc atcatcacaa 120

ttcttgcgag ctgaccaaca tcaccattgc tatcgagaaa gaagagtgca ggttctgcat 180

cagcatcaac actacttggt gcgctggtta ctgctacacc agggatcttg tgtacaagga 240

tcctgctagg cctaagatcc aaaagacctg caccttcaaa gagctggttt acgagactgt 300

tagggtgcca ggttgtgctc atcatgctga ttctctgtac acctaccctg ttgctactca 360

gtgccattgc ggtaagtgcg atagcgattc tactgattgc accgtgagag gtctgggacc 420

ttcttactgt tctttcggtg agatgaaaga aaaggatgag ctgtagtcta ga 472

<---

1. Применение лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ), представляющего собой β-субъединицу фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ) и характеризующегося последовательностью SEQ. ID. no. 2 или последовательностью по меньшей мере на 90% схожей с последовательностью, соответствующей SEQ. ID. no. 2, предпочтительно на 90-99.9% и более предпочтительно на 95-97%, для лечения и/или диагностики опухолей.

2. Применение лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ) по п. 1, последовательность которого кодируется последовательностью, соответствующей SEQ. ID. no. 3.

3. Применение лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ) по п. 1, последовательность которого включает сайты гликозилирования в остатках аргинина N13 и N30 зрелого белка, причем каждый из упомянутых сайтов гликозилирования включает в себя по два остатка N-ацетилглюкозамина и остатки маннозы.

4. Применение лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ) по п. 1, в котором упомянутые опухоли являются первичными или метастатическими солидными опухолями.

5. Применение лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ) по п. 1, в котором упомянутые опухоли включают рак простаты и, в частности, аденокарциному простаты, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак почки, рак легких, рак печени, рак яичка, рак яичников, рак мозга и рак щитовидной железы, саркому и нейробластому.

6. Применение лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ) по п. 1, в котором упомянутая опухоль, и, предпочтительно, упомянутая нейробластома имеет место у пациента детского возраста, и, предпочтительно, у пациента в возрасте до 6 лет.

7. Применение лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ) по п. 1, в котором упомянутый лиганд конъюгирован с молекулой, имеющей противоопухолевую активность, выбранной из группы, содержащей:

- класс цитотоксических агентов, в котором такие соединения предпочтительно выбираются из группы, включающей: антагонисты пиримидина, такие как капецитабин, ингибиторы фермента, такие как семейство камптотецинов, например иринотекан;

- класс алкилирующих агентов, в котором такие соединения предпочтительно выбираются из группы, включающей: семейство солей металлов, таких как цисплатин, ДНК-интеркаляторов, таких как доксорубицин, семейство антрациклинов;

- класс модуляторов синтеза белка, в котором такие соединения предпочтительно выбираются из группы, включающей: семейство ингибиторов протеасом, такие как бортезомиб, семейство ингибиторов mTOR, такие как темсиролимус;

- класс ингибиторов митоза, в котором такие соединения предпочтительно выбираются из группы, включающей: семейства ансамитоцина, например майтанзин, семейства ингибиторов полимеризации микротрубочек, например ауристатин Е;

- класс β-излучающих радиоактивных изотопов, в котором такие соединения предпочтительно выбираются из группы, включающей: ¹³¹I, ¹⁶⁹Er, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁵³Sm, ⁸⁹Sr и ⁹⁰Y.

8. Применение лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ) по п. 1, в котором лиганд в конъюгированной или не конъюгированной форме в комбинации с одним или более агентами с противоопухолевой активностью.

9. Применение лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ) по п. 1, в котором указанный лиганд конъюгирован:

- с флуоресцирующими молекулами, выбранными из группы, включающей: флуоресцеин изотиоцианата (FITC), фикоэритрин (РЕ) или индоцианин (Су5); или

- с радиоактивными молекулами, выбранными из группы, содержащей: ¹²³I, ¹¹¹In, ¹⁸⁸Re, ¹⁸F, ³⁵S, ⁹⁹Тс;

- с наночастицами.

10. Применение лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ) по п. 1 для проведения in vitro анализа, в котором указанный лиганд конъюгирован:

- с флуоресцирующими молекулами, выбранными из группы, включающей: флуоресцеин изотиоцианата (FITC), фикоэритрин (РЕ) или индоцианин (Су5); или

- с радиоактивными молекулами, выбранными из группы, содержащей: ¹²³I, ¹¹¹In, ¹⁸⁸Re, ¹⁸F, ³⁵S, ⁹⁹Тс;

- с наночастицами.

11. Фармацевтический препарат для лечения опухолей, включающий фармацевтически эффективное количество лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ), характеризующегося последовательностью SEQ. ID. no. 2 или последовательностью по меньшей мере на 90% схожей с последовательностью, соответствующей SEQ. ID. no. 2, предпочтительно на 90-99.9% и более предпочтительно на 95-97%, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и/или наполнителей.

12. Фармацевтический препарат по п. 11 для внутривенного введения.

13. Применение лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ) по п. 1 для in vitro инактивации указанного рецептора.

14. Способ получения лиганда рецептора фолликулостимулирующего гормона человека (РФСГ), представляющего собой β субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГβ), включающий этапы:

I) получение подходящего вектора, трансформированного плазмидой, содержащей последовательность, соответствующую SEQ. ID. no. 3;

II) трансформирование клеток Nicotiana bentha.mia.na. вектором с этапа I);

III) отбор клеток Nicotiana benthamiana;

IV) культивирование стабильных клеток Nicotiana benthamiana;

V) приготовление клеточного экстракта;

VI) очистка лиганд рецептора РФСГ,

где культивация упомянутых клеток Nicotiana benthamiana осуществляется в суспензии.

15. Способ по п. 14, а котором вектор с этапа I) представлен Agrobacterium tumefaciens.

16. Способ по п. 14, в котором на этапе II) трансформация осуществляется в течение 48 часов совместного культивирования в темноте при температуре около 25°С и при постоянном перемешивании.

17. Способ по п. 14, в котором на этапе III) используется селективная среда, которая содержит MS с добавлением 0,9% (w/v) агара и антибиотиков.

18. Способ по п. 14, в котором на этапе III) используются карбенициллин и канамицин.

19. Способ по п. 14, в котором на этапе V) клетки Nicotiana benthamiana подвергаются инкубации в питательной среде MS (Мурасиге 1962) с добавлением сахарозы, нафтилуксусной кислоты (NAA) и кинетина в течение 15 дней при температуре 24-27°С и с поддержанием аэрации 50-100 мбар.

20. Способ по п. 14, в котором на этапе V) используется буфер для экстракции, который содержит: 50 ммоль Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl, 20 мМ лимонной кислоты, 40 мМ аскорбиновой кислоты, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонил хлорида PMSF, 0,05% (ν/ν) Твин-20, рН 6,5 с добавлением 1% (w/v) XAD-4 и 1% (w/v) поливинилполипирролидона (PVPP).

21. Способ по п. 14, в котором этап VI) проводится с последовательным использованием: хроматографической колонки IMAC, колонки для обессоливания и ионообменной хроматографической колонки.