Композиции и способы для экспрессии нескольких биологически активных полипептидов с одного вектора для лечения заболеваний сердца и других патологий

Авторы патента:

ПАТЕЛ Димки С. (US)

ПАТЕЛ Амит Н. (US)

C12N2840/007 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)

C12N15/62 - ДНК последовательности, кодирующие белки при слиянии

C12N15/09 - метод рекомбинантных ДНК

C07K2319/50 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

C07K19/00 - Гибридные пептиды

C07K14/52 - цитокины, лимфокины, интерфероны

A61P9/00 - лекарственные средства для лечения сердечно-сосудистой системы

A61K48/00 - Лекарственные препараты, содержащие генетический материал, который включен в клетки живого организма для лечения генетических заболеваний; для генной терапии

A61K38/1738 - Лекарственные препараты, содержащие пептиды (пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца A61K 31/00; циклические дипептиды, не имеющие в молекуле какой-либо другой пептидной связи кроме формирующей их ядро, наприме

A61K38/17 - из животных; из человека

Владельцы патента RU 2758489:

ПРЕСИДЖЕН, ИНК. (US)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полинуклеотиду для экспрессии функциональных кальций-связывающего белка S100А1, фактора стромальной клетки-1α (SDF-1α) и фактора роста эндотелия сосудов 165 (VEGF165), и может быть использовано в медицине. Полученный полинуклеотид позволяет осуществлять одновременную экспрессию S100А1, SDF-1α и VEGF165 и может быть использован для эффективной терапии заболеваний сердца. 8 н. и 11 з.п. ф-лы, 33 ил., 16 табл., 14 пр.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/254,139, поданной 11 ноября 2015 года, содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 11 ноября 2016 года, называется INX00339WO_2016111 l_SL.txt и имеет размер 271843 байта.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] В настоящем изобретении предложены новые нуклеиновые кислоты и векторы, а также полипептиды, кодируемые этими нуклеиновыми кислотами и векторами, для терапевтического лечения заболеваний, нарушений (расстройств) и патологических состояний с применением полигенных средств. Более конкретно, в настоящем изобретении предложены новые нуклеиновые кислоты, векторы, полипептиды и способы терапевтического лечения и предотвращения заболеваний сердца и сердечных нарушений с применением полигенных средств. Кроме того, в настоящем изобретении предложены новые нуклеиновые кислоты и полипептидные линкеры, которые обеспечивают экспрессию предпочтительного белка с нуклеиновых кислот и векторов, подходящих для терапевтического лечения заболеваний, нарушений и патологических состояний с применением полигенных средств.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Потребность в лечении заболевания сердца остается чрезвычайно неудовлетворенной в области медицины; по некоторым оценкам заболевание сердца имеют по меньшей мере 25 миллионов пациентов во всем мире. Более того, согласно данным «Информационного бюллетеня по сердечной недостаточности» Государственных Центров США по контролю и профилактике заболеваний (CDC), по состоянию на 2013 год более 5 миллионов человек в США страдают от сердечной недостаточности. 1

[0005] По оценкам, сердечная недостаточность вызывает 1 из 9 смертей наряду с выявлением почти что 825000 новых случаев каждый год. Средний показатель выживаемости через 5 лет после постановки диагноза составляет приблизительно 40% и данное заболевание имеет самый высокий показатель повторной госпитализации среди любой клинико-статистической группы. Стоимость лечения в США оценивается в 32 млрд долларов в год. Варианты лечения сердечной недостаточности включают лекарственные средства, инвазивные устройства и трансплантацию сердца.

[0006] Застойную сердечную недостаточность (ЗСН) описывают как неспособность сердца обеспечить достаточную объемную скорость кровотока для обеспечения метаболических потребностей организма. В настоящее время во всем мире ЗСН диагностирована более чем у 22 миллионов человек, и свыше, чем у 5 миллионов пациентов в США. Поскольку с возрастом увеличивается уровень заболеваемости заболеваниями сердца и их тяжесть, ожидается, что общий уровень заболеваемости в будущем будет возрастать по причине старения популяции. Для пациентов с ЗСН прогноз остается неудовлетворительным, при этом пятилетний показатель смертности составляет 50%. По данным Американской кардиологической ассоциации (AHA), в 2013 году сердечно-сосудистые заболевания являлись причиной смерти 810000 человек в Соединенных Штатах Америки, что составляет ~1 на каждых из 3 зарегистрированных случаев смерти. Фармакологическое контролирование сердечной недостаточности на конечной стадии сосредоточено на трех следующих целях: 1) улучшение показателей заболеваемости и смертности (ингибиторы АПФ, антагонисты рецепторов ангиотензина II типа I, отдельные β-блокаторы и антагонисты альдостерона); 2) контроль симптомов (диуретики (в конечном итоге тиазид и петлевые диуретики), наперстянка (дигиталис, в низкой дозе), инотропы для временного приема и отдельные антиаритмические средства); и 3) паллиативная терапия (опиоиды, антидепрессанты, анксиолитики, кислород и инотропы для непрерывного приема). Однако по мере прогрессирования заболевания возможности терапии начинают ограничиваться сердечной ресинхронизирующей терапией (CRT), в ряде обстоятельств имплантируемым кардиовертер-дефибриллятором (ICD); трансплантацией (пересадкой) сердца и желудочковыми устройствами вспомогательного кровообращения (VAD), которые применяются как в качестве предшествующей трансплантации терапии, так и все чаще в качестве конечной целевой терапии из-за отсутствия донорских сердец. Хотя общая 5-летняя выживаемость у пациентов с пересаженным сердцем, получающих тройную иммуноподавляющую терапию, составляет 70-80%, пересадка сердца в качестве варианта лечения ограничена продолжающейся нехваткой донорских сердец, увеличением числа кандидатов на пересадку и очень высокой стоимостью, свыше 100000 долларов США в год. Данные, собранные с применением межведомственного регистра для устройств механической поддержки кровообращения (INTERMACS), показали, что с 23 июня 2006 года по 30 июня 2013 года 12335 пациентов получили одобренное американским Управлением по контролю за продуктами и лекарственными средствами (FDA) устройство надежной механической поддержки кровообращения (MCS), при этом частота набора испытуемых в такое исследование составляет 2000 пациентов в год.

[0007] Клеточная и генная терапия, направленные на лечение ЗСН исследуются все больше, однако результаты таких исследований немногочисленны вследствие проблем, связанных с биологическим воздействием, удержанием клеток, сроками доставки и отсутствием механизма или ограниченным воздействием одиночного гена. Тем не менее, во многих клинических испытаниях с применением генной терапии были продемонстрированы незначительные результаты после одного года терапии. Хотя генная терапия обладает определенным механизмом действия, одиночных генов, применяемых для улучшения ангиогенеза, хоуминга (homing) стволовых клеток или инотропии, оказывается недостаточно для лечения ЗСН. Поскольку ЗСН является многофакторным заболеванием по причине рубцевания, пониженной сократительной функции и потери клеток, подход с применением полигенной терапии может обеспечить лучшее адресное лечение таких отдельных факторов, при этом обеспечивая безопасность таких тяжелобольных пациентов.

[0008] Обычно векторы для генной терапии содержат одиночные гены. В последние годы возрос спрос на более сложные полигенные векторы. В частности, этот спрос стимулируется потребностью в комбинированной терапии, включающей лечение рака и противовирусное лечение. Комбинированная генная терапия - это наилучший подход с точки зрения медицины для предотвращения мутации и резистентности к раку. Объединив два или три агента, можно получить более полный и эффективный ответ.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[0009] Все публикации, патенты и заявки на патент включены в настоящее описание посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были бы напрямую или косвенно указаны для включения посредством ссылки. В случае разночтений между описанием в настоящем документе и описанием в цитируемом документе, решающее значение будет иметь описание в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ОПИСАНИЯ

[0010] Для все большего числа пациентов с застойной сердечной недостаточностью (ЗСН) по-прежнему существуют ограниченные возможности терапии. Например, стандартное лечение ЗСН заканчивается установкой левожелудочкового аппарата вспомогательного кровообращения (LVAD). Соответственно, необходим другой подход с применением биологических возможностей для стимулирования восстановления после ЗСН.

[0011] Подход к лечению сердечных нарушений, основанный на применении одиночных генов, целесообразен для пациентов с уникальными генетическими мутациями, т.е. в тропонине I или тяжелой цепи миозина. Однако у большинства пациентов с сердечной патологией терминальная стадия заболевания обусловлена множеством факторов. Поэтому в таких случаях вероятно, что подход, направленный на один ген, будет неэффективен. У пациентов с сердечной недостаточностью обычно присутствует рубцовая ткань, и им необходимо положительное ремоделирование с помощью постоянного привлечения (рекуртинга) клеток и/или ангиогенеза. Для них также необходимо увеличение инотропной функции через кальциевый или другие пути. Следовательно, комбинация генов, которые совместно действуют на транспорт кальция, рекрутинг клеток и ангиогенез, обеспечивает более подходящий способ лечения и восстановления таких пациентов с терминальной стадией ЗСН. Кроме того, при рассмотрении основанного на генах подхода к лечению сердечных нарушений (таких как, но не ограничиваясь ею, ЗСН), применение вирусных векторов может вызывать противодействие иммунной системы человека, или у пациентов уже могут быть предварительно образованные противовирусные антитела (например, антитела против AAV1/AAV2), что может вызвать проблемы с безопасностью и эффективностью. Таким образом, применение плазмидной ДНК, которая не вызывает или вызывает незначительный побочный иммунный ответ у людей, и применение дозы, которую можно повторно вводить по мере надобности, обеспечивает предпочтительный способ доставки терапевтического гена.

[0012] Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения предложен невирусный вектор на основе плазмидной ДНК, содержащий три эффекторных гена, для терапевтического лечения заболеваний сердца и сердечных нарушений (расстройств) (например, но не ограничиваясь ею, ЗСН). В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложен невирусный вектор (конструкция) на основе плазмидной ДНК, содержащий три эффекторых гена. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения плазмида экспрессии, обозначенная как рХоХ, кодирует и экспрессирует биологически активные SDF1α, S100A1 и VEGF, при этом эти три представляющих интерес эффекторных гена (GOI) разделены с помощью выборочно разработанных линкерных последовательностей, описанных в настоящем документе.

[0013] Подход с применением полигенной плазмидной ДНК для лечения сердечных заболеваний и нарушений (например, но не ограничиваясь ею, ЗСН) основан на полученных in vitro положительных, доклинических и клинических данных, полученных из других исследований, в которых используются одиночные гены. Каждый из представляющих интерес генов, описанных ниже, обладает специфической функцией в отношении инотропности (например, S100A1), хоуминга клеток (например, SDF-1α) и ангиогенеза (например, VEGF165). Целесообразность выбора одной плазмидной конструкции, содержащей все три гена вместо одиночного гена в составе отдельно доставляемых плазмид, заключается в том, что если в клетки доставляются одиночные гены (в составе индивидуальных, отдельных векторах), то не существует способов, при помощи которых можно контролировать количество трансфекций каждого гена в клетку. Такая изменчивость в доставке генов делает терапию небезопасной и невоспроизводимой, даже в том случае, если она обеспечивает более простой подход в сравнении с одиночными полигенными конструкциями согласно настоящему изобретению. Следовательно, в одном варианте реализации такие векторы, как рХоХ, конститутивно экспрессируют S100A1 (внутриклеточный белок), SDF-1α (секретируемый белок) и VEGF165 (секретируемый белок). В присутствии рХоХ конструкция pDNA транскрибируется в виде одной мРНК, которая транслируется в виде трех отдельных функциональных белков посредством расщепления за счет комбинированной активности фурина и Р2А (fp2a). Способный к саморасщеплению 2А-пептид кодирует последовательность (Р2А), которая опосредует трансляционный эффект, известный как трансляция по механизму «рибосомного перепрыгивания» (ribosome skipping), «stop-go» и «stop-carry on», что приводит к совместной экспрессии нескольких белков с одного транскрипта мРНК под контролем одиночного промотора. Конститутивная экспрессия управляется промоторами, такими как, но не ограничиваясь ими, CAG-промотор (гибридный промотор, содержащий промотор бета-актина курицы (СВА) с CMV-энхансером и гибрид экзон 1 СВА/интрон бета-глобина кролика). Дальнейшее описание трех эффекторов и целесообразность их выбора для включения в конструкции согласно настоящему изобретению описаны ниже.

S100A1

[0014] S100A1 является членом суперсемейства Са²⁺-связывающих белков EF-руки (EF-hand) (Rohde et al., J. Cardiovasc. Transl. Res., vol. 3, №5, pp. 525-537, 2010). S100A1 представляет собой белок с массой 10,4 кДа, который в основном функционирует как гомодимер в кардиомиоцитах для регулирования контролируемых ионами Са²⁺ сетей и потоков для контроля сократительной функции, возбудимости, метаболизма, поддержания и выживания. Исследования на животных и человеке продемонстрировали пониженную экспрессию S100A1 при сердечной недостаточности (Pleger et al., Circulation, vol. 115, №19, pp. 2506-2515, 2007; и Remppis et al., Biochim. Biophys. Acta., vol. 1313, №3, pp. 253-257, 1996). Вирусную доставку S100A1 успешно применяли на моделях сердечной недостаточности у крупных животных. В частности, генная терапия с применением AAV9-S100A1, которую оценивали в модели на свиньях, продемонстрировала защиту от гемодинамического ухудшения, улучшение сердечной функции и нормализацию сердечного ритма (Rohde et al., J. Mol. Cell. Cardiol., vol. 50, №5, pp. 777-784, 2011). Другое исследование с применением AAV6-S100A1 в модели сердечной недостаточности у свиньи продемонстрировало безопасность гиперэкспрессии S100A1, свидетельствуя об отсутствии увеличения аритмий или дисфункции правого желудочка; однако было отмечено значительное увеличение фракции выброса левого желудочка и ремоделирования сердца (Weber et al., Gene Ther., vol. 21, pp. 131-138, 2014). Такие исследования подтверждают эффективность терапии с применением S100A1 у людей с термальной стадией сердечной недостаточности.

SDF-1α

[0015] Фактор-1α стромальной клетки (SDF-1α) представляет собой хемокин с массой 8 кДа, который играет важную роль в рекуртинге мышечных стволовых клеток сердца, ингибировании гибели кардиомиоцитов и улучшении сердечной функции путем связывания с рецептором CXCR4 на поверхности мезенхимальных стволовых клеток (Penn et al, Gene Ther., vol. 19, №6, pp. 583-587, 2012). Невирусную ДНК-плазмиду, кодирующую человеческий SDF-1α, исследовали в нескольких клинических испытаниях (Penn et al., Circ Res, vol. 112, №5, pp. 816-825, 2013; и Chung et al., Eur. Heart. J., vol. 36, pp. 2228-2238, 2015). Результаты этих испытаний показали, что гиперэкспрессия SDF-1α является относительно безопасной без каких-либо серьезных непредвиденных, связанных с гиперэкспрессией, побочных явлений, включая аритмии или прогрессирование до дальнейших приступов сердечной недостаточности. Такое исследование также продемонстрировало, что гиперэкспрессия SDF-1 может улучшать функцию у пациентов с ЗСН при вводимых внутримышечно дозах в 15 мг или 30 мг. Кроме того, было обнаружено, что плазмидная ДНК, доставляемая ретроградно через коронарный синус в дозе 45 мг, является безопасной.

VEGF

[0016] Семейство белков фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) участвует в образовании новых сосудов, миграции и активации эндотелиальных клеток, рекрутинге стволовых клеток и регенерации тканей (Taimeh et al., Nat. Rev. Cardiol., vol. 10, №9, pp. 519-530, 2013). Нарушение сосудистой регуляции является важным компонентом патофизиологии сердечной недостаточности, а пониженные уровни VEGF наблюдаются в моделях прогрессирующей сердечной недостаточности. Существует несколько изоформ VEGF. Тем не менее VEGF165 применяли как в доклинических, так и в клинических моделях. Была продемонстрирована целесообразность выбора VEGF в качестве варианта лечения сердечной недостаточности с применением переноса генов при помощи векторов, таких как «оголенная» плазмидная ДНК и аденовирус, в животных моделях, в которых показаны улучшенная коллатеральная перфузия и общая сердечная функция. Клиническое применение VEGF 165 изучали как при непосредственном введении плазмидной ДНК, так и при введении посредством вирусного вектора с положительными, но немногочисленными результатами. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 27 по 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или с 34 по 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 или 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 30 по 185 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе.

[0017] CAG-промотор, применяемый в сочетании с каждым отдельным геном (т.е. S100A1, SDF1α и VEGF165), продемонстрировал индивидуальное воздействие на рубцовую ткань, сердечную функцию и ремоделирование. Эффект каждого из генов в сердечной ткани является уникальным. Потенциально улучшенное воздействие всех трех генов исследовали только in vitro. Тем не менее, было продемонстрировано в мышиной модели ишемии тазовой конечности, что местное введение комбинации VEGF с SDF-1α усиливается путем стимулирования индуцированной эндотелиальной клеткой-предшественником неоваскуляризации (Yu et al., J. Vase. Surg., vol. 50, №3, pp. 608-616, 2009).

[0018] В настоящем документе соответственно предложены полинуклеотидные конструкции (такие как, но не ограничиваясь ими, невирусные плазмидные векторы), кодирующие полипептид, содержащий первый функциональный (т.е. биологически активный) полипептид, второй функциональный полипептид и необязательно третий функциональный полипептид.

[0019] В настоящем документе предложены полинуклеотидные конструкции, кодирующие полипептид, содержащий полипептид S100, второй функциональный полипептид и необязательно третий функциональный полипептид, при этом указанный второй и необязательно третий функциональный полипептид содержат любое из цитокина, хемокина или ангиогенного полипептида.

[0020] В настоящем документе предложены полинуклеотидные конструкции, содержащие полинуклеотидные последовательности, кодирующие последовательности полипептидного линкера для разделения первого и второго и необязательно для разделения второго и третьего функциональных полипептидов.

[0021] В настоящем документе предложены полипептиды, кодируемые полинуклеотидом, описанным в настоящем документе. Также предложены клетки, содержащие по меньшей мере один полинуклеотид или вектор, описанные в настоящем документе.

[0022] В настоящем документе предложены способы лечения патологии (заболевания) сердца, включающие приведение в контакт клетки с терапевтически эффективным количеством полинуклеотида, описанного в настоящем документе. В некоторых случаях указанная клетка представляет собой клетку миокарда.

[0023] В настоящем документе предложены способы лечения заболеваний сердца и сердечных нарушений, например, но не ограничиваясь ею, застойной сердечной недостаточности (ЗСН), у субъекта, включающие обеспечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции, содержащей описанные в настоящем документе полинуклеотид или вектор. В некоторых случаях субъект является млекопитающим или человеком. В некоторых случаях указанному субъекту назначают по меньшей мере одну дополнительную терапию.

[0024] В настоящем документе предложены фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотид, описанный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый описанным в настоящем документе полинуклеотидом, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

[0025] В настоящем документе предложены композиции, содержащие: по меньшей мере один комплекс плазмиды и микропузырька, при этом указанный микропузырек содержит липид, газ и плазмиду, содержащую описанный в настоящем документе полинуклеотид. В некоторых вариантах реализации указанный липид образует оболочку, окружающую указанные газ и плазмиду. В некоторых случаях указанный газ представляет собой перфторуглеродный газ, как, например, перфторпропан. В некоторых вариантах реализации комплекс плазмиды и микропузырька содержит по меньшей мере одно из 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолина и 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламинглицерина.

[0026] В настоящем документе предложены способы, включающие введение субъекту композиции комплекса плазмиды и микропузырька, описанного в настоящем документе; и воздействие на указанного субъекта энергией ультразвука, достаточной для того, чтобы привести к разрушению ультразвуком по меньшей мере одного микропузырька в заранее определенной ткани или органе. В некоторых случаях разрушение по меньшей мере одного микропузырька в указанной заранее определенной ткани или органе обеспечивает доставку указанной плазмиды в указанную ткань или орган. В некоторых случаях указанная ткань или орган представляет собой орган, который может быть сердцем, печенью или почкой.

[0027] В настоящем документе предложен способ лечения заболевания сердца или сердечного нарушения (например, но не ограничиваясь ими, застойная сердечная недостаточность, кардиомиопатия, аритмия, заболевание перикарда, заболевание аорты, синдром марфана и заболевание коронарной артерии) у субъекта, включающий: введение указанному субъекту количества композиции комплекса плазмиды и микропузырька, описанного в настоящем документе; воздействие на указанного субъекта энергией ультразвука, достаточной для того, чтобы привести к разрушению ультразвуком по меньшей мере одного микропузырька, и доставку плазмиды в сердце указанного субъекта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0028] Уникальные и предпочтительные характеристики настоящего изобретения подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Понимание характеристик и преимуществ настоящего изобретения также можно получить со ссылкой на нижеследующее подробное описание, в котором представлены примеры вариантов реализации, в которых используются принципы настоящего изобретения, и сопровождающие их чертежи:

[0029] На ФИГ. 1 представлены способы, в которых невирусную доставку генов кардиальных эффекторных белков осуществляют путем альтернативных конфигураций новых векторных конструкций, содержащих описанные в настоящем документе линкерные последовательности.

[0030] На ФИГ. 2 показана устойчивая экспрессия люциферазы в кардиомиоцитах с конструкций, содержащих линкеры, описанные в настоящем документе, в первичных клетках (in vitro) посредством введения векторов, содержащих att-сайт люциферазы, с трансфекцией SPBc2 (рекомбиназы). Клетки, лишенные либо att-сайта, либо рекомбиназы, быстро возвращались к исходным уровням экспрессии. День 2 (D2), День 5 (D5), День 9 (D9),День 14 (D14).

[0031] На ФИГ. 3 показаны данные полученной в модели грызунов экспрессии люциферазы с остова плазмидного вектора, с которого могут экспрессироваться гены кардиальных эффекторных белков (рХоХ, кодирующий биологически активные SDF1α, S100A1 и VEGF), разделенные описанными в настоящем документе линкерами.

[0032] На ФИГ. 4 показаны различные стадии прогрессирования состояний сердечной недостаточности и соответствующие стандартные режимы лечения и способы для воздействия и лечения.

[0033] На ФИГ. 5А и ФИГ. 5В показан анализ пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). A. HUVEC после обработки рекомбинантным VEGF В. Показана пролиферация HUVEC после обработки супернатантом VEGF-трансфицированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Клетки iPSC трансфицировали и инкубировали в течение 96 часов. Супернатант собирали и применяли для культивирования HUVECS. Пролиферацию HUVEC измеряли при помощи CellTiter-Glo.

[0034] На ФИГ. 6 показана пролиферация HUVEC после обработки супернатантами трансфицированных iPSC кардиомиоцитов. Клетки iPSC кардиомиоцитов получали от пациентов с дилатационной кардиомиопатией (DCM), гипертрофической кардиомиопатией (НСМ) или здоровых контрольных групп, и они демонстрируют эффективную экспрессию и активность функциональных полипептидов, кодируемых полинуклеотидами, описанными в настоящем документе, содержащих описанные в настоящем документе линкеры.

[0035] На ФИГ. 7 представлены iPSC-CM, трансфицированные конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена полипептида SDF1, показывающие повышенную миграцию лимфоцитов периферической крови (PBL), демонстрирующие эффективную экспрессию и активность функциональных полипептидов, кодируемых полинуклеотидами, описанными в настоящем документе, содержащих описанные в настоящем документе линкеры.

[0036] На ФИГ. 8 показан анализ миграции, где AMD3100 (антагонист CXCR4) специфическим образом ингибирует зависимую от SDF1-CXCR4 миграцию. Данные показывают, что SDF1 является функциональным в конструкциях, содержащих два гена и содержащих три гена, поскольку миграция снижается в присутствии AMD3100.

[0037] На ФИГ. 9 показано исследование на свинье, в котором изображения биолюминесценции показывают ретроградную перфузию репортерной плазмиды через коронарный синус, также содержащей линкер, описанный в настоящем документе, которая приводит к доставке в сердце и экспрессии доставляемого репортерного гена через 24 часа. Интенсивность излучения и распределение через 24 часа после ретроградной инфузии экспрессирующих люциферазу плазмид через коронарный синус сердца свиньи. Три дозы плазмиды (40, 80 и 120 мг) исследовали в трех повторах.

[0038] На ФИГ. 10 показан анализ миграции, в котором кардиомиоциты трансфицировали конструкциями, содержащими два гена и содержащими три гена, экспрессирующими SDF1. Миграция клеток Jurkat с применением супернатанта iPSC-CM показывает, что трансфекция и SDF1-белок является функциональным и вызывает значительную миграцию, демонстрируя эффективную экспрессию и активность функциональных полипептидов, кодируемых описанными в настоящем документе полинуклеотидами, содержащих линкеры, описанные в настоящем документе.

[0039] На ФИГ. 11 показан анализ миграции, в котором кардиомиоциты трансфицировали конструкциями, содержащими два и содержащими три гена, экспрессирующими SDF1. Миграция клеток Jurkat с применением супернатанта iPSC-CM показывает, что трансфекция и SDF1-белок является функциональным и вызывает значительную миграцию. Данные показывают зависимую от дозы миграцию клеток Jurkat, демонстрирующую эффективную экспрессию и активность функциональных полипептидов, кодируемых описанными в настоящем документе полинуклеотидами, содержащих линкеры, описанные в настоящем документе.

[0040] На ФИГ. 12 показаны кардиомиоциты, полученные от субъекта с дилатационной кардиомиопатией, трансфицированные конструкциями, содержащими два гена и содержащими три гена, кодирующими SDF1. Данные показывают SDF1-зависимую миграцию клеток Jurkat. SDF1, экспрессируемый конструкциями, содержащими два и содержащими три гена, в клетках iPSC-CM дилатационной кардиомиопатии, является функциональным.

[0041] На ФИГ. 13 показаны кардиомиоциты, полученные от субъекта с гипертрофической кардиомиопатией, трансфицированные конструкциями, содержащими два гена и содержащими три гена, кодирующими SDF1. Данные показывают SDF1-зависимую миграцию клеток Jurkat. SDF1, экспрессируемый конструкциями, содержащими два гена и содержащими три гена, в клетках iPSC-CM гипертрофической кардиомиопатии, является функциональным.

[0042] На ФИГ. 14А и ФИГ. 14В показан анализ пролиферации, выполненный с применением клеток HUVECS. А. показывает, что полученные от субъекта с DCM кардиомиоциты, трансфицированные конструкциями, содержащими два гена и содержащими три гена, продуцируют функциональный VEGF-белок, способный индуцировать пролиферацию HUVEC. (Примечание. Образец 8 не исследовали в 1 и 2 цикле анализа) На ФИГ. 14В показано, что полученные от здорового субъекта кардиомиоциты, трансфицированные конструкциями, содержащими два гена и содержащими три гена, продуцируют функциональный VEGF-белок, который способен индуцировать пролиферацию HUVEC.

[0043] На ФИГ. 15А и ФИГ. 15В представлена экспрессия белка SDF1 в 293Т-клетках, трансфицированных вектором, содержащим два гена, кодирующих S100A1-SDF1. А. Полученная по результатам анализа ELISA стандартная кривая, показывающая поглощение SDF1. В. Концентрация SDF1 в супернатанте 293Т-клеток. Данные свидетельствуют об эффективной экспрессии функциональных (т.е. биологически активных) полипептидов, кодируемых описанными в настоящем документе полинуклеотидами, содержащих линкеры, описанные в настоящем документе.

[0044] На ФИГ. 16А и ФИГ. 16В представлена экспрессия белка VEGF в 293Т-клетках, трансфицированных вектором, содержащим два гена, кодирующих S100A1-VEGF191. А. Полученная по результатам анализа ELISA стандартная кривая, показывающая поглощение VEGF. В. Концентрация VEGF в супернатанте 293Т-клеток. Эти данные свидетельствуют об эффективной экспрессии функциональных (т.е. биологически активных) полипептидов, кодируемых описанными в настоящем документе полинуклеотидами, содержащих линкеры, описанные в настоящем документе.

[0045] На ФИГ. 17А и ФИГ. 17В представлена экспрессия белка S100A1 в 293Т-клетках, трансфицированных вектором, содержащим два гена, кодирующих S100A1-SDF1. А. Полученная по результатам анализа ELISA стандартная кривая, показывающая поглощение S100A1. В. Концентрация S100A1 в супернатанте 293Т-клеток. Эти данные свидетельствуют об эффективной экспрессии функциональных (т.е. биологически активных) полипептидов, кодируемых описанными в настоящем документе полинуклеотидами, содержащих линкеры, описанные в настоящем документе.

[0046] На ФИГ. 18 показана гистограмма концентраций S100A1, продуцируемого кардиомиоцитами, трансфицированными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена.

[0047] На ФИГ. 19 показана гистограмма концентраций SDF-1α, продуцируемого кардиомиоцитами, трансфицированными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена.

[0048] На ФИГ. 20 показана гистограмма концентраций VEGF, продуцируемого кардиомиоцитами, трансфицированными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена.

[0049] На ФИГ. 21 показано обнаружение методом вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга) расщепления полипептида S100A1, продуцируемого кардиомиоцитами, трансфицированными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена.

[0050] На ФИГ. 22 показано обнаружение методом вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга) расщепления полипептида SDF-1α, продуцируемого кардиомиоцитами, трансфицированными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена.

[0051] На ФИГ. 23 показано обнаружение методом вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга) расщепления полипептида VEGF, продуцируемого кардиомиоцитами, трансфицированными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена.

[0052] На ФИГ. 24 показано образование димерного S100A1 в результате экспрессии генов с конструкций, содержащих три гена, с применением линкеров согласно настоящему изобретению, которые обнаруживаются методами неденатурирующего ПААГ-электрофореза и иммуноблоттинга.

[0053] На ФИГ. 25А и ФИГ. 25В показано сравнение iPSC-клеток, полученных от пациентов с дилатационной кардиомиопатией, со здоровыми клетками контроля в показателях А. частоты биения iPSC-клеток, трансфицированных pStuffer, вектором, кодирующим pS100A1, или вектором, кодирующим S100A1, содержащим 2А-хвост; В. продолжительности сокращения iPSC-клеток, трансфицированных pStuffer, вектором, кодирующим pS100A1, или вектором, кодирующим S100A1, содержащим 2А-хвост. Данные свидетельствуют о том, что наличие 2А-хвоста на 3'-конце вектора, кодирующего S100A1, не влияет на функцию S100A1. (pStuffer представляет собой плазмиду с той же конфигурацией остова, что и у рХоХ, при этом открытая рамка считывания (ОРС) заменена на неэкспрессирующую спейсерную последовательность аналогичного размера).

[0054] На ФИГ. 26А, ФИГ. 26В и ФИГ. 26С показано сравнение iPSC-клеток, полученных от пациентов с дилатационной кардиомиопатией, со здоровыми клетками контроля в показателях А. частоты биения iPSC-клеток, трансфицированных ДНК1 (CAGStufferNXB-V2), ДНК2 (CAG-S100A1 (без последовательности Козак (Kozak)), ДНК3 (CAG-S100A1-fp2a-SDF1), ДНК4 (CAG-S100A1-fp2a-SDF1-fp2a-VEGF), ДНК5 (CAG-S100A1-CMV-SDF1-fp2a-VEGF 191) или нетрансфицированным контролем; В. частоты сокращения iPSC-клеток, трансфицированных ДНК 1, ДНК2, ДНК3, ДНК4, ДНК5 или нетрансфицированным контролем; С. продолжительности сокращения iPSC-клеток, трансфицированных ДНК1, ДНК2, ДНК3, ДНК4, ДНК5 или нетрансфицированным контролем. Данные показывают восстановление сократительных свойств у пациентов с DCM до уровней здорового контроля.

[0055] На ФИГ. 27А и ФИГ. 27В показан вектор, содержащий три гена, которые кодируют S100A1, SDF-1-альфа и VEGF165. На ФИГ. 27А показано схематическое изображение вектора рХоХ, содержащего три гена, которые кодируют биологически активные SDF1α, S100A1 и VEGF. На ФИГ. 27В представлены отдельные генные элементы в векторе, содержащем три гена.

[0056] На ФИГ. 28 показаны данные экспрессии VEGF в экспериментах по титрованию рекомбиназы. Данные свидетельствуют об интеграции VEGF в геномную ДНК.

[0057] На ФИГ. 29 показаны данные экспрессии SDF-1α в экспериментах по титрованию рекомбиназы. Данные свидетельствуют об интеграции SDF-1α в геномную ДНК.

[0058] На ФИГ. 30 показаны данные экспрессии S100A1 в экспериментах по титрованию рекомбиназы. Данные свидетельствуют об интеграции S100A1 в геномную ДНК.

[0059] На ФИГ. 31А-С терапевтические результаты in vivo показаны через измерение структуры сердца с помощью эхокардиографии и как функция фракции сокращения. На ФИГ. 31А результаты представлены как функция фракции сокращения в процентах. На ФИГ. 31В показана толщина задней стенки левого желудочка (см) при введении конструкции pStuffer в сравнении с конструкцией рХоХ. На ФИГ. 31С показана толщина межжелудочковой перегородки в конце диастолы (IVSd) (см) при введении конструкции pStuffer в сравнении с конструкцией рХоХ. Значения представлены как среднее ± средняя ошибка среднего. **Р<0,001 в сравнении с pStuffer.

[0060] На ФИГ. 32 показаны результаты ядерной локализации РНН3 (фосфогистона Н3 (Ser10)). Сигнал митотического маркера в мышечных клетках сердца, демонстрирующий регенерацию кардиомиоцитов. Примеры изображений 4-х из 8 крыс на плазмиду. Масштаб полоски составляет 25 мкм.

[0061] На ФИГ. 33 показаны результаты визуализации, демонстрирующие отрицательные результаты ISL-1, маркер ранних клеток-предшественников мышечных клеток сердца, подтверждающий, что клетки-предшественники не участвует в регенерации. Следовательно, наблюдаемая регенерация кардиомиоцитов является результатом генной терапии с применением UTMD-pXoX. Примеры изображений 4-х из 8 крыс на плазмиду. Масштаб полоски составляет 25 мкм.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0062] Нижеследующее описание и примеры подробно иллюстрируют варианты реализации настоящего изобретения. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами реализации, описанными в настоящем документе, и в этой связи они могут варьироваться. Специалистам в данной области техники будет понятно, что существует многочисленные вариации и модификации настоящего изобретения, которые входят в его объем.

[0063] Все термины предназначены для понимания в том смысле, в котором они их понимает специалист в данной области техники. Если не указано иное, то все технические и научные термины, применяемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно понимает специалист в данной области техники, к которой относится настоящее описание. Следующие определения дополняют такие определения в данной области техники и относятся к текущей заявке, и не имеют отношения к какому-либо соединенному или несоединенному случаю, например, к любому совместному патенту или заявке. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, можно применять на практике для исследования настоящего описания, в настоящем документе описаны предпочтительные материалы и способы. Соответственно, применяемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для их ограничения.

[0064] Семейство белков S100 включает, например, S100A1, S100A2, S100A3, S100A4, S100A5, S100A6, S100A7, S100A8, S100A9, S100A10, S100A11, S100A12, S100A13, S100A14, S100A15 и S100A16. В некоторых случаях белки похожи на белок S100A, например, S100A7L (подобный S100 кальций-связывающему белку А7). Другие белки S100 включают S100B, S100G, S100P и S100Z, а также их варианты и фрагменты, которые могут быть включены в описанные в настоящем документе варианты реализации. Также в описанные в настоящем документе варианты реализации включены белки S100, являющиеся результатом продуктов псевдогенов, которые могут экспрессироваться описанными в настоящем документе векторами [61].

[0065] Семейство белков SDF включает, например, белок, кодируемый противомикробным геном, который может кодировать фактор стромальной клетки 1 альфа, член интеркринового семейства хемокинов [62]. Описанные в настоящем документе варианты реализации могут включать кодируемые белки, которые могут функционировать в качестве лигандов для рецептора, соединенного с G-белком, рецептора 4 хемокина (СХС-мотив) и могут играть роль во многих разнообразных клеточных функциях, включая эмбриогенез, иммунный надзор, воспалительный ответ, гомеостаз ткани, рост опухоли и метастазирование. Также включены варианты транскриптов, кодирующих различные изоформы, и указанные изоформы и варианты транскриптов могут экспрессироваться векторами, описанными в настоящем документе. Некоторые варианты реализации, описанные в настоящем документе, включают белки семейства SDF, в которых первые два остатка цистеина разделены одной аминокислотой (С-Х-С-хемокин). Следующие изоформы белка были идентифицированы у людей, и они могут экспрессироваться описанными в настоящем документе векторами и включены в описанные в настоящем документе способы и композиции: SDF-1-альфа, SDF-1-бета, SDF-1-гамма, SDF-1-дельта, SDF-1-эпсилон и SDF-1-тета, как и их фрагменты и варианты.

[0066] Семейство белков VEGF, описанное в настоящем документе, включает членов семейства факторов роста PDGF/VEGF. Например, включенные в описанные в настоящем документе способы и композиции могут представлять собой сплайс-варианты и изоформы, и фрагменты и производные VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF191, VEGF206 [63].

[0067] В некоторых случаях полипептид S100 может представлять собой S100A1 и любое его функциональное производное. В некоторых вариантах реализации второй функциональный полипептид может представлять собой ангиогенный полипептид. Ангиогенный полипептид может представлять собой полипептид фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). В нескольких вариантах реализации полипептид VEGF выбран из группы, состоящей из VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF191, VEGF206, их фрагментов и вариантов. В некоторых вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 27 по 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или с 34 по 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 или 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 30 по 185 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В некоторых случаях описанный в настоящем документе полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF 191 или VEGF165, описанной в настоящем документе. В некоторых случаях полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности описанного настоящего в документе полипептида VEGF191.

[0068] В других вариантах реализации третий функциональный полипептид может представлять собой хемокин. Хемокин может представлять собой полипептид фактора стромальной клетки 1 (SDF). Полипептид SDF может быть выбран из группы, состоящей из SDF1, SDF-1α, SDF-1β, их фрагментов и вариантов [62]. Полипептид SDF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности полипептида SDF1, описанного в настоящем документе.

[0069] В некоторых описанных в настоящем документе вариантах реализации полипептид S100 может быть соединен со вторым полипептидом с помощью первого полипептидного линкера. В некоторых случаях указанный полипептидный линкер может представлять собой расщепляемый линкер или нерасщепляемый линкер.

[0070] В настоящем документе предложены варианты реализации, в которых полипептидная конструкция, кодируемая описанным в настоящем документе полинуклеотидом, может содержать полипептид кальций-связывающего белка (S100), второй функциональный полипептид и дополнительно содержать третий функциональный полипептид. В некоторых случаях указанный третий функциональный полипептид может представлять собой любой из цитокина, хемокина, ангиогенного полипептида и любого их функционального производного.

[0071] В определенных вариантах реализации третий функциональный полипептид может представлять собой ангиогенный полипептид. В некоторых вариантах реализации ангиогенный полипептид может представлять собой полипептид VEGF. Полипептид VEGF может быть выбран из группы, состоящей из VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF191, VEGF206, их фрагментов и вариантов. Полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности полипептида VEGF 165. В некоторых случаях полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности полипептида VEGF191.

[0072] В некоторых вариантах реализации третий функциональный полипептид может представлять собой хемокин. В определенных вариантах реализации указанный хемокин может представлять собой полипептид SDF. В некоторых вариантах реализации указанный полипептид SDF выбран из группы, состоящей из SDF1, SDF-1α, SDF-1β, их фрагментов и вариантов. В некоторых случаях указанный полипептид SDF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности описанного в настоящем документе полипептида SDF1.

[0073] В некоторых вариантах реализации третий функциональный полипептид может быть соединен с по меньшей мере одним из указанного полипептида S100 и указанного второго функционального полипептида при помощи второго полипептидного линкера, который может быть необязательно расщепляемым. Полипептидные линкеры могут быть независимо выбраны из линкеров, описанных в настоящем документе.

[0074] В настоящем документе предложены полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере одну полипептидную конструкцию, содержащую по меньшей мере первый полипептид и второй полипептид, при этом первый полипептид может представлять собой ангиогенный полипептид, а второй полипептид может представлять собой хемокин или его вариант или фрагмент. В некоторых случаях ангиогенный полипептид может представлять собой полипептид VEGF, выбранный из группы, состоящей из VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF191, VEGF206, их фрагментов и вариантов. Полипептид может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности полипептида VEGF.

[0075] В настоящем документе предложены полипептиды VEGF, содержащие последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF191. В некоторых случаях второй полипептид может представлять собой полипептид SDF. Полипептид SDF может быть выбран из группы, состоящей из SDF1, SDF-1α, SDF-1β, их фрагментов и вариантов. В некоторых случаях полипептид SDF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности SDF1.

[0076] В настоящем документе предложены способы улучшения васкулогенеза у субъекта, включающие обеспечение указанного субъекта терапевтически эффективным количеством композиции, содержащей описанный в настоящем документе полинуклеотид, или полипептид, кодируемый описанным в настоящем документе полинуклеотидом.

[0077] В настоящем документе предложены векторы экспрессии, содержащие по меньшей мере один промотор, функционально соединенный по меньшей мере с двумя полипептидами, выбранными из полипептида SDF1, полипептида S100A1, полипептида VEGF и их фрагментов и вариантов. В некоторых случаях по меньшей мере два полипептида соединены линкером. В некоторых случаях по меньшей мере один промотор может быть выбран из группы, состоящей из промотора CAG, промотора CMV, промотора SV40, промотора аденовируса, промотора бета-актина, промотора металлотионина, промотора EF1a, промотора легкой цепи миозина, промотора тяжелой цепи миозина, промотора NCX1 и других подходящих кардиальных промоторов. Вектор экспрессии может представлять собой вектор для экспрессии в сердце.

[0078] В настоящем документе предложены полипептидные конструкции, содержащие по меньшей мере первый полипептид и второй полипептид, при этом указанный первый полипептид может представлять собой кальций-связывающий белок или его вариант или фрагмент, а указанный второй полипептид может представлять собой ангиогенный полипептид, хемокин или их варианты или фрагменты. Также описаны полипептидные конструкции, содержащие по меньшей мере первый полипептид, второй полипептид и третий полипептид, при этом указанный первый полипептид может представлять собой ангиогенный полипептид или его вариант или фрагмент, второй полипептид может представлять собой хемокин или его вариант или фрагмент, и третий полипептид может представлять собой кальций-связывающий белок или его вариант или фрагмент. В некоторых случаях описанная в настоящем документе полипептидная конструкция может содержать S100A1, его вариант или фрагмент. В некоторых случаях полипептидная конструкция может содержать SDF1, его вариант или фрагмент. В других случаях описанная в настоящем документе полипептидная конструкция может содержать VEGF, его вариант или фрагмент.

[0079] Предложены фармацевтические композиции, содержащие описанный в настоящем документе полинуклеотид, или предложенную в настоящем документе полипептидную конструкцию, или полипептидную конструкцию, кодируемую описанным в настоящем документе полинуклеотидом, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В настоящем документе предложены способы лечения заболеваний сердца и сердечных нарушений у субъекта, включающие обеспечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции, содержащей описанный в настоящем документе полинуклеотид или предложенную в настоящем документе полипептидную конструкцию, или полипептидную конструкцию, кодируемую описанным в настоящем документе полинуклеотидом.

[0080] В некоторых вариантах реализации полинуклеотидная конструкция, кодирующая описанную в настоящем документе полипептидную конструкцию, дополнительно содержит третий функциональный полипептид, соединенный при помощи второго линкерного полипептида со вторым функциональным полипептидом. В некоторых случаях третий функциональный полипептид может быть выбран из списка, состоящего из VEGF, SDF1, S100A1, их вариантов и производных. В некоторых случаях указанный второй линкер может быть таким же или отличным от первого линкера, описанного в настоящем документе. В некоторых случаях линкеры и функциональные полипептиды могут экспрессироваться внутри рамки считывания.

[0081] В настоящем документе предложены клетки, содержащие описанный в настоящем документе полинуклеотид.

[0082] В настоящем документе предложен способ, включающий: приведение в контакт по меньшей мере одной клетки сердца (cardiac cell) с полинуклеотидом, кодирующим полипептидную конструкцию, содержащую по меньшей мере первый полипептид и второй полипептид, при этом первый полипептид представляет собой вариант ангиогенного полипептида или его фрагмент; и второй полипептид представляет собой по меньшей мере один из хемокина, кальций-связывающего белка или их вариантов или фрагментов. В некоторых вариантах реализации вариант ангиогенного полипептида или его фрагмент может представлять собой полипептид VEGF, выбранный из группы, состоящей из VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF191, VEGF206, их фрагментов и вариантов. Полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF165. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 27 по 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или с 34 по 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 или 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 30 по 185 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В некоторых случаях полипептид VEGF, описанный в настоящем документе, может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF 191 или VEGF165, описанной в настоящем документе. Полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF191. В некоторых случаях второй полипептид может представлять собой хемокин. Хемокин может представлять собой полипептид фактора стромальной клетки 1 (SDF). В некоторых случаях полипептид SDF, применяемый в предложенных в настоящем документе композициях и способах, может быть выбран из группы, состоящей из SDF1, SDF-1α, SDF-1β, их фрагментов и вариантов. Полипептид SDF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности SDF1-α.

[0083] В некоторых случаях полинуклеотид, кодирующий полипептидную конструкцию, можно вводить ex vivo. В определенных вариантах реализации полинуклеотид, кодирующий полипептидную конструкцию, можно вводить in vivo. Способ введения in vivo можно выбрать из группы, состоящей из чрескожной катетеризации коронарной артерии, блокады коронарной вены, сердечной рециркуляции, антеградной инфузии коронарной артерии, ретроградной перфузии, прямой инъекции и любой их комбинации.

[0084] В настоящем документе предложены способы лечения заболевания или расстройства сердца у субъекта (например, но не ограничиваясь ими, путем улучшения васкулогенеза, функции сердца или кардиального ремоделирования у субъекта), включающие введение указанному субъекту количества полинуклеотида, кодирующего конструкцию, содержащую полипептид VEGF и по меньшей мере один из полипептида SDF и полипептида S100. Полипептид VEGF в описанном в настоящем документе варианте реализации может быть выбран из группы, состоящей из VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF191, VEGF206, их фрагментов и вариантов. Полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF165. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 27 по 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. Полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF191. Полипептид SDF может быть выбран из группы, состоящей из SDF1, SDF-1α, SDF-1β, их фрагментов и вариантов. Полипептид S100 может представлять собой S100A1, его фрагмент или вариант.

[0085] В определенных вариантах реализации субъект, который получает лечение способами и композициями согласно настоящему изобретению, может иметь застойную сердечную недостаточность (ЗСН). У субъекта может быть установлен левожелудочковый аппарат вспомогательного кровообращения (LVAD). У субъекта может быть кардиомиопатия. Кардиомиопатия может быть выбрана из группы, состоящей из дилатационной кардиомиопатии (DCM), гипертрофической кардиомиопатии (НСМ), рестриктивной кардиомиопатии (RCM), аритмогенной кардиомиопатии правого желудочка (ARVC) и любой их комбинации.

[0086] В других вариантах реализации у субъекта, который получает лечение способами и композициями согласно настоящему изобретению, может быть по меньшей мере любое одно из: аневризма, атеросклероза, врожденного порока сердца, перикардиального нарушения, острой декомпенсированной сердечной недостаточности, стенокардии, артериосклеротической болезни сердца, синдрома спортивного сердца («сердце атлета»), атриовентрикулярной фистулы, аутоиммунной болезни сердца, бурой атрофии сердца, амилоидоза сердца, аритмии сердца, сердечной астмы, модуляции сердечной сократимости, сердечного синдрома X, кардиогенного шока, кардиомегалии, кардиомиопатии, кардиофобии, кардиоренального синдрома, кардиотоксичности, сердечно-сосудистого заболевания, кардита, хронических ревматических заболеваний сердца, сердца в виде «деревянного башмака» (coeur an sabot), аневризма коронарной артерии, аномалии коронарной артерии, болезни коронарной артерии, рассечения коронарной артерии, эктазии коронарной артерии, коронарной окклюзии, синдрома «обкрадывания» коронарных артерий, коронарного тромбоза, коронароспазма, индуцируемой вирусом Коксаки кардиомиопатии, диастолической сердечной недостаточности, синдрома Дресслера, болезни Дюрозье, синдрома Эйзенменгера, эмбриокардии, эмбрионального отказа (embryonic recall), эндокардиального фиброэластоза, сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса, сердечной неоплазии, сердечной недостаточности с высоким сердечным выбросом, гипердинамического прекордиума, гипертонической болезни сердца, идиопатического гигантоклеточного миокардита, воспалительного заболевания сердца, межжелудочковой диссинхронии, внутрижелудочковой диссинхронии, ишемической болезни сердца, изолированного амилоидоза предсердий, болезни Кешана, синдрома Коуниса, приема препарата мидикар (mydicar), миокардиального мостика, нарушений миокарда, разрывов миокарда, рубцевания миокарда, поражения миокарда, миокардита, небактериального тромботического эндокардита, остеомиелита, заболевания периферических артерий и неатеросклеротического заболевания сердца и заболевания сердца, вызванного нарушением обмена фосфора, синдрома постпикардиотомии, контролируемой давлением интермиттирующей окклюзии коронарного синуса (picso), восстановления после сердечно-легочной реанимации, восстановления после травматической остановки сердца, отклонения в правой оси сердца, ревматической болезни сердца, синдрома Ремхельда, сердечно-сосудистого заболевания, невызванного употреблением насыщенных жиров, применения силиконовых пластин scar-fc, синдрома Шона, подострого бактериального эндокардита, клапанной болезни сердца, аневризма желудочков и вирусной кардиомиопатии.

[0087] В настоящем документе предложены способы лечения или предотвращения сердечно-сосудистого заболевания у субъекта, включающие: введение субъекту количества конструкции, содержащей полипептид S100A и второй функциональный полипептид, при этом указанный второй функциональный полипептид представляет собой по меньшей мере один из цитокина, хемокина и ангиогенного полипептида. В некоторых случаях введение субъекту можно осуществлять превентивно. В некоторых случаях введение субъекту можно осуществлять терапевтически. В некоторых случаях указанному субъекту можно вводить по меньшей мере одно дополнительное средство лечения. В некоторых случаях второй функциональный полипептид может представлять собой VEGF, SDF или их комбинацию.

[0088] В настоящем документе предложены способы, включающие введение субъекту по меньшей мере одного невирусного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий описанную в настоящем документе полипептидную последовательность, включающую по меньшей мере два функциональных белка или их участка; по меньшей мере один промотор; и по меньшей мере один сконструированный сайт рекомбинации; при этом указанный по меньшей мере один промотор стимулирует экспрессию указанных по меньшей мере двух функциональных белков. В некоторых случаях по крайней мере один промотор может быть конститутивным. В некоторых случаях по меньшей мере один промотор может быть тканеспецифичным. В некоторых случаях по меньшей мере один промотор может быть индуцируемым. В некоторых случаях по меньшей мере один тканеспецифичный промотор представляет собой промотор легкой цепи миозина (MLC). В некоторых случаях индуцируемый промотор представляет собой индуцируемый низкомолекулярным лигандом переключатель гена на основе двухполипептидного рецептора экдизона.

[0089] Индуцируемый промотор использует лиганд для дозорегулируемого контроля экспрессии указанных по меньшей мере двух генов. В некоторых случаях лиганд может быть выбран из группы, состоящей из экдистероида, 9-цис-ретиноевой кислоты, синтетических аналогов ретиноевой кислоты, N,N'-диацилгидразинов, оксадиазолинов, дибензоилалкилциангидразинов, N-алкил-N,N'-диароилгидразинов, N-ацил-N-алкилкарбонилгидразинов, N-ароил-N-алкил-N'-ароилгидразинов, арнидокетонов, 3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокси-N-изобутилбензамида, 8-O-ацетилгарпагида, оксистеролов, 22(R)--гидроксихолестерина, 24(S)-гидроксихолестерина, 25-эпоксихолестерина, Т0901317, 5-альфа-6-альфа-эпоксихолестерин-3-сульфата (ECHS), 7-кетохолестерин-3-сульфата, фрамесола (framesol), желчных кислот, 1,1-бифосфонатных эфиров, ювенильного гормона III, RG-115819 (N-(1-этил-2,2-диметилпропил)-N'-(2-метил-3-метоксибензоил)гидразид 3,5-диметилбензойной кислоты), RG-115932 (N-(1-трет-бутилбутил)-N'-(2-этил-3-метоксибензоил)гидразид (Р)-3,5-диметилбензойной кислоты) и RG-115830 (N-(1-трет-бутилбутил)-N'-(2-этил-3-метоксибензоил)гидразид 3,5-диметилбензойной кислоты) и любой их комбинации. Линкер может представлять собой расщепляемый линкер.

[0090] В некоторых вариантах реализации первый функциональный полипептид и второй функциональный полипептид соединены при помощи первого линкерного полипептида, при этом указанный первый линкерный полипептид содержит последовательность с по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 80% или 100% идентичностью к последовательности APVKQ (SEQ ID №42). В некоторых случаях указанный линкерный полипептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из APVKQ (SEQ ID №42), GPVKQ (SEQ ID №43), VPVKQ (SEQ ID №44), IPVKQ (SEQ ID №45), MPVKQ (SEQ ID №46), APIKQ (SEQ ID №47), GPIKQ (SEQ ID №48), VPIKQ (SEQ ID №49), IPIKQ (SEQ ID №50), MPIKQ (SEQ ID №51), APAKQ (SEQ ID №52), GPAKQ (SEQ ID №53), VPAKQ (SEQ ID №54), IPAKQ (SEQ ID №55), MPAKQ (SEQ ID №56), APVRQ (SEQ ID №57), GPVRQ (SEQ ID №58), VPVRQ (SEQ ID №59), IPVRQ (SEQ ID №60), MPVRQ (SEQ ID №61), APIRQ (SEQ ID №62), GPIRQ (SEQ ID №63), VPIRQ (SEQ ID №64), IPIRQ (SEQ ID №65), MPIRQ (SEQ ID №66), APARQ (SEQ ID №67), GPARQ (SEQ ID №68), VPARQ (SEQ ID №69), IPARQ (SEQ ID №70), MPARQ (SEQ ID №71), APVKN (SEQ ID №72), GPVKN (SEQ ID №73), VPVKN (SEQ ID №74), IPVKN (SEQ ID №75), MPVKN (SEQ ID №76), APIKN (SEQ ID №77), GPIKN (SEQ ID №78), VPIKN (SEQ ID №79), IPIKN (SEQ ID №80), MPIKN (SEQ ID №81), APAKN (SEQ ID №82), GPAKN (SEQ ID №83), VPAKN (SEQ ID №84), IPAKN (SEQ ID №85), MPAKN (SEQ ID №86), APVRN (SEQ ID №87), GPVRN (SEQ ID №88), VPVRN (SEQ ID №89), IPVRN (SEQ ID №90), MPVRN (SEQ ID №91), APIRN (SEQ ID №92), GPIRN (SEQ ID №93), VPIRN (SEQ ID №94), IPIRN (SEQ ID №95), MPIRN (SEQ ID №96), APARN (SEQ ID №97), GPARN (SEQ ID №98), VPARN (SEQ ID №99), IPARN (SEQ ID №100) и MPARN (SEQ ID №101). В некоторых случаях полипептидный линкер может также содержать по меньшей мере одну последовательность GS-линкера, например, (GS)_n (SEQ ID №109), (SG)_n (SEQ ID №110), (GSG)_n (SEQ Ю №111) и (SGS)_n (SEQ ID №112), где n может быть любым числом от нуля до пятнадцати. В некоторых вариантах реализации указанный первый функциональный полипептид может отличаться от указанного второго функционального полипептида.

[0091] В некоторых вариантах реализации способ может дополнительно включать введение субъекту по меньшей мере одного вторичного вектора. По меньшей мере один вторичный вектор может представлять собой мРНК. По меньшей мере один вторичный вектор может представлять собой плазмиду. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один вторичный вектор может содержать по меньшей мере одну рекомбиназу. Рекомбиназа может быть выбрана из группы, состоящей из рекомбиназы фага Listeria monocytogenes, рекомбиназы фага Streptococcus pyogenes, рекомбиназы фага Bacillus subtilis, рекомбиназы фага Mycobacterium tuberculosis и рекомбиназы фага Mycobacterium smegmatis. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере два гена можно интегрировать в геном субъекта при помощи рекомбиназы. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один сайт рекомбинации может представлять собой сайт присоединения (рекомбинации) в геноме фага (attP) или сайт присоединения (рекомбинации) в бактериальном геноме (attB). В некоторых вариантах реализации рекомбиназа, применяемая в описанном в настоящем документе изобретении, содержит сайт-специфическую сериновую рекомбиназу, как, например, но не ограничиваясь ею, рекомбиназу SpBC2 (см., например, патент США №9034650, выданный 19 мая 2015 г. (патент США №2006/0172377), указанный документ полностью включен в настоящее описание посредством ссылки).

[0092] Вектор может соответствовать стандартам надлежащей производственной практики (GMP).

[0093] Предложены полипептиды, содержащие последовательность с по меньшей мере 40%, 50% 60%, 80% или 100% идентичностью к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №32, SEQ ID №34, SEQ ID №36, SEQ ID №38 и SEQ ID №40. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит последовательность с по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №32, SEQ ID №34, SEQ ID №36, SEQ ID №38 и SEQ ID №40.

[0094] Предложены полипептиды, содержащие последовательность с по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 80% или 100% идентичностью к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №102, SEQ ID №104 и SEQ ID № ID №106. В некоторых вариантах реализации такой пептид представляет собой полипептид, содержащий последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №102, SEQ ID №104 и SEQ ID №106.

[0095] Предложен полипептид, содержащий последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью SEQ ID №108.

[0096] В настоящем документе предложены полинуклеотиды, кодирующие полипептидную конструкцию, содержащую первый функциональный полипептид и второй функциональный полипептид, соединенные при помощи первого линкерного полипептида, при этом указанный первый линкерный полипептид содержит последовательность с по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 80% или 100% идентичностью к последовательности APVKQ. В некоторых случаях указанный линкерный полипептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из APVKQ (SEQ ID №42). В некоторых случаях линкерный полипептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из APVKQ (SEQ ID №42), GPVKQ (SEQ ID №43), VPVKQ (SEQ ID №44), IPVKQ (SEQ ID №45), MPVKQ (SEQ ID №46), APIKQ (SEQ ID №47), GPIKQ (SEQ ID №48), VPIKQ (SEQ ID №49), IPIKQ (SEQ ID №50), MPIKQ (SEQ ID №51), APAKQ (SEQ ID №52), GPAKQ (SEQ ID №53), VPAKQ (SEQ ID №54), IPAKQ (SEQ ID №55), MPAKQ (SEQ ID №56), APVRQ (SEQ ID №57), GPVRQ (SEQ ID №58), VPVRQ (SEQ ID №59), IPVRQ (SEQ ID №60), MPVRQ (SEQ ID №61), APIRQ (SEQ ID №62), GPIRQ (SEQ ID №63), VPIRQ (SEQ ID №64), IPIRQ (SEQ ID №65), MPIRQ (SEQ ID №66), APARQ (SEQ ID №67), GPARQ (SEQ ID №68), VPARQ (SEQ ID №69), IPARQ (SEQ ID №70), MPARQ (SEQ ID №71), APVKN (SEQ ID №72), GPVKN (SEQ ID №73), VPVKN (SEQ ID №74), IPVKN (SEQ ID №75), MPVKN (SEQ ID №76), APIKN (SEQ ID №77), GPIKN (SEQ ID №78), VPIKN (SEQ ID №79), IPIKN (SEQ ID №80), MPIKN (SEQ ID №81), APAKN (SEQ ID №82), GPAKN (SEQ ID №83), VPAKN (SEQ ID №84), IPAKN (SEQ ID №85), MPAKN (SEQ ID №86), APVRN (SEQ ID №87), GPVRN (SEQ ID №88), VPVRN (SEQ ID №89), IPVRN (SEQ ID №90), MPVRN (SEQ ID №91), APIRN (SEQ ID №92), GPIRN (SEQ ID №93), VPIRN (SEQ ID №94), IPIRN (SEQ ID №95), MPIRN (SEQ ID №96), APARN (SEQ ID №97), GPARN (SEQ ID №98), VPARN (SEQ ID №99), IPARN (SEQ ID №100) и MPARN (SEQ ID №101). В некоторых случаях полипептидный линкер может также содержать по меньшей мере одну последовательность GS-линкера, например, (GS)_n (SEQ ID №113), (SG)_n (SEQ ID №114), (GSG)_n (SEQ ID №115) и (SGS)_n (SEQ ID №116), где n может быть любым числом от одного до пятнадцати. В некоторых вариантах реализации первый функциональный полипептид может отличаться от второго функционального полипептида. В других случаях по меньшей мере один из указанных первого и второго функциональных полипептидов может представлять собой белок, гормон, антитело, гликопротеин или их производные или фрагменты.

[0097] В настоящем документы представлены полинуклеотиды, кодирующие полипептидную конструкцию, содержащую полипептид фурина и 2А-полипептид, при этом указанные полипептид фурина и 2А-полипептид соединены полипептидным линкером, содержащим по меньшей мере три гидрофобные аминокислоты. В некоторых случаях по меньшей мере три гидрофобные аминокислоты выбраны из списка, состоящего из глицина (Gly) (G), аланина (Ala) (А), валина (Val) (V), лейцина (Leu) (L), изолейцина (Ile) (I), пролина (Pro) (Р), фенилаланина (Phe) (F), метионина (Met) (M), триптофана (Trp) (W).

[0098] Предложены полипептиды, кодируемые описанными в настоящем документе полинуклеотидами, и композиции, содержащие такие полипептиды. Также предложены способы терапии и/или диагностики, включающие приведение в контакт индивидуума с полинуклеотидом, описанным в настоящем документе, или экспрессируемым с него полипептидом, или его производным или конъюгатом.

[0099] Предложены способы получения улучшенной экспрессии полипептидной конструкции, включающие: обеспечение полинуклеотида, кодирующего указанную полипептидную конструкцию, содержащую первый функциональный полипептид и второй функциональный полипептид, при этом указанный первый функциональный полипептид и второй функциональный полипептид соединены при помощи линкерного полипептида, содержащего последовательность с по меньшей мере 60% идентичностью к последовательности APVKQ (SEQ ID №42); и экспрессию указанного полинуклеотида в клетке-хозяине, при этом указанная экспрессия приводит к улучшенной экспрессии полипептидной конструкции в сравнении с соответствующей полипептидной конструкцией, которая не содержит линкерный полипептид, содержащий последовательность с по меньшей мере 60% идентичностью к последовательности APVKQ (SEQ) ID №42).

[0100] В контексте настоящего описания термин «приблизительно» при ссылке на числовые значения и их грамматические эквиваленты может включать само числовое значение и диапазон значений плюс или минус 10% от этого числового значения. Например, количество «приблизительно 10» включает 10 и любые количества от 9 до 11. Например, термин «приблизительно» при ссылке на числовое значение также может включать диапазон значений плюс или минус 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от этого значения.

[0101] Термин «сердечно-сосудистые заболевания» и «нарушение кровообращения» применяются взаимозаменяемо, и в контексте настоящего описания применяются для описания заболевания или нарушения, которое вызвано поражением системы кровообращения, и такое поражение можно снизить и/или уменьшить, обеспечивая терапевтически эффективным количеством описанного в настоящем документе полинуклеотида или полипептидной конструкции, кодируемой полинуклеотидом, описанным в настоящем документе, пораженные заболеванием области сердца и/или систему кровообращения у указанного субъекта. В контексте настоящего описания термин «поражение кровообращения» применяется для обозначения повреждения системы кровообращения, которое может быть вызвано любым из ряда заболеваний или нарушений. Примеры сердечно-сосудистых заболеваний, которые можно лечить с применением описанного в настоящем документе полинуклеотида или полипептидной конструкции, кодируемой полинуклеотидом, описанным в настоящем документе, и способов в соответствии с настоящим изобретением, включают, например, инфаркт миокарда, кардиомиопатию, заболевание периферических сосудов, врожденный порок сердца, другие генетические заболевания, повреждения или травмы, вызванные ишемией, несчастными случаями, экологическим воздействием. Кроме того, терапевтически эффективное количество описанного в настоящем документе полинуклеотида или полипептидной конструкции, кодируемой полинуклеотидом, описанным в настоящем описании, можно применять для уменьшения и/или устранения последствий сердечного приступа на центральную нервную систему у субъекта, которые в противном случае обусловлены отсутствием кровообращения или ишемией на участке головного мозга указанного субъекта или которые произошли от физического повреждения головного и/или спинного мозга.

[0102] В контексте настоящего описания термин «вектор» или его грамматический эквивалент может относиться к любой полинуклеотидной конструкции, способной управлять экспрессией представляющей интерес полипептидной конструкции, и которая является подходящей для переноса указанной интересующей полипептидной конструкции в клетки-мишени. Таким образом, этот термин включает носители для клонирования и экспрессии, а также интегрирующие векторы.

[0103] На основании роста числа пациентов с застойной сердечной недостаточностью (ЗСН) с ограниченными возможностями (например, в результате обычно возникает необходимость в терапии с применением левожелудочкового аппарата вспомогательного кровообращения (LVAD)), требуются биологические возможности для стимулирования восстановления после ЗСН. Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения предложен вектор рХоХ на основе плазмидной ДНК, содержащей три эффекторных гена (SDF1α, S100A1 и VEGF), для улучшения работоспособности сердца (например, но не ограничиваясь этим, которую оценивают измерением числа и продолжительности временных отключений от поддержки LVAD у пациентов, которым были имплантированы назначенные LVAD, по меньшей мере в течение тридцать дней после операции). Имплантация только LVAD может привести к улучшению работоспособности сердца, большинство случаев из которых происходит в течение первых 30 дней или около того после имплантации. Кроме того, обычно связанные с хирургическим вмешательством воспалительные процессы нормализуются до нового исходного уровня на 30 день после операции, что может привести к снижению риска лечения рХоХ для этой популяции пациентов с высоким риском.

[0104] Плазмида рХоХ конститутивно экспрессирует три белка (S100A1, SDF-1α и VEGF165) под контролем CAG-промотора в виде одной мРНК, которая процессируется до отдельных эффекторных белков во время трансляции посредством расщепления за счет комбинированной активности фурина и способных к саморасщеплению 2А-пептидов (fp2a). Остов плазмиды содержит селективный маркер к канамицину и точку начала репликации, полученный из pBR322. Пример плазмиды рХоХ представлен ниже на ФИГ. 27А и ФИГ. 27В.

[0105] В настоящем изобретении также предложены линкеры для применения, например, в композициях и способах, подходящих для лечения патологий сердца, заболеваний сердца и сердечных нарушений (например, сердечной недостаточности, кардиомиопатии, аритмии, заболевания перикарда, заболеваний аорты, синдрома марфана и заболеваний коронарной артерии), с применением новых полигенных векторов, комбинаций генетических последовательностей, белков (полипептидов) и методов, описанных и предложенных в настоящем документе. В контексте настоящего описания термин «линкер» может означать любую полинуклеотидную или полипептидную последовательность, которая применяется для соединения любой одной полинуклеотидной или полипептидной последовательности с другой полинуклеотидной или полипептидной последовательностью соответственно (например, первый GOI-Лмнкер-Второй GOI-Лмнкер-Третий GOI-Линкер-и т.д.). Например, в некоторых случаях линкер может представлять собой полинуклеотидную открытую рамку считывания, кодирующую белок слияния, так что первая полипептидная последовательность ковалентно связана («слита») при помощи промежуточной аминокислотной последовательности со второй полипептидной последовательностью (и так далее для третьей, четвертой, пятой и т.д. полипептидной последовательности в одной и той же открытой рамке считывания). В контексте настоящего описания термин «линкер» также может представлять собой некодирующую, связывающую полинуклеотидную последовательность, такую как промотор (например, CAG-промотор или CMV-промотор), или IRES (участок внутренней посадки рибосомы), которая функционирует для соединения первой полинуклеотидной кодирующей области (ОРС) со второй полинуклеотидной кодирующей областью (ОРС) (и так далее для третьей, четвертой, пятой и т.д. полинуклеотидных открытых рамок считывания).

[0106] В контексте настоящего описания генная терапия относится к переносу представляющего интерес полинуклеотида, описанного в настоящем документе (например, ДНК или РНК), в организм субъекта для лечения или предотвращения генетического или приобретенного заболевания или состояния. Представляющий интерес полинуклеотид может кодировать продукт (например, полипептидную конструкцию), продуцирование которого желательно in vivo. В некоторых вариантах реализации представляющий интерес полинуклеотид также кодирует суицидальный ген. В некоторых случаях генную терапию можно применять для лечения сердечно-сосудистого заболевания, описанного в настоящем документе.

Векторы

[0107] В настоящем документе предложены векторы для генной терапии нарушения, включающей применение описанного в настоящем документе полинуклеотида. Вектор можно использовать для введения экзогенных нуклеиновых кислот, таких как ДНК, мРНК, малая интерферирующая РНК (миРНК), микроРНК или антисмысловые олигонуклеотиды. Учитывая большой размер и отрицательный заряд этих макромолекул, их доставка может быть опосредована носителями или векторами. Представляющие интерес векторы включают, в частности, любой эписомальный вектор, например, вирусные векторы, плазмидные векторы, искусственные хромосомы, миникольца и им подобные.

[0108] Системы доставки генов можно разделить на две категории: невирусные системы и рекомбинантные вирусные системы, каждая из которых может иметь уникальные профили экспрессии переносимых генов. Невирусные векторы могут включать «оголенную» плазмидную ДНК, комплексы липосомальной ДНК, ДНК, нанесенную на полимер, и олигонуклеотиды. Плазмиды могут представлять собой содержащие двухцепочечные кольцевые ДНК трансгены, кодирующие представляющие интерес белки, а также они могут содержать энхансерные и промоторные последовательности. Вектор может представлять собой невирусный вектор.

[0109] Вектор может содержать гены или их фрагменты или варианты, при этом по меньшей мере один ген, его фрагмент или вариант соединен с другим геном, его фрагментом или вариантом при помощи описанного в настоящем документе линкера. Вектор может содержать один ген или несколько генов, или их фрагменты или варианты. Вектор может содержать гены или их фрагменты или варианты, при этом по меньшей мере один ген, его фрагмент или вариант могут быть соединены с другим геном, его фрагментом или вариантом при помощи описанного в настоящем документе линкера. Например, вектор может представлять собой один ген, два гена (см., например, Таблицу 1) или три гена, при этом по меньшей мере один ген, его фрагмент или вариант соединены с другим геном, его фрагментом или вариантом при помощи описанного в настоящем документе линкера. Вектор может содержать несколько генов от 1 до 10 или их фрагментов или вариантов. Вектор может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 генов, их фрагментов или вариантов. Пример вектора, содержащего три гена, показан на ФИГ. 20А и ФИГ. 20В. Пример векторной последовательности показан в Таблице 5. В некоторых случаях вектор может обеспечивать одновременную отдельную экспрессию двух, трех или более полипептидов из одного и того же транскрипта РНК. Вектор также может содержать репортерный полипептид. Например, вектор может экспрессировать один, два, три или более полипептида и репортерный полипептид.

[0110] В некоторых случаях вектор можно сконструировать так, чтобы он содержал по меньшей мере один ген или его фрагмент. В других случаях вектор может содержать вплоть до 10 генов или их фрагментов. Гены или их фрагменты, которые могут экспрессироваться, можно описать при помощи последовательностей от SEQ ID №102 до 107. Любые гомологи, изоформы, предшественники или их модифицированные части, соответствующие SEQ ID №№102-107, также могут экспрессироваться векторами, описанными в настоящем документе. Гены или их фрагменты могут быть разделены при помощи описанного в настоящем документе линкера. Различные линкеры, которые могут быть использованы в векторе, могут содержать последовательности, представленные, например, в SEQ ID №№32-41. В других случаях соответствующие линкеры, которые могут быть использованы в векторе, могут содержать, например, последовательность, представленную любой последовательностью из SEQ ID №№42-101. Например, участок гена может представлять собой по меньшей мере один из гена SDF (кодируемый SEQ ID №103 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной), гена VEGF (кодируемый SEQ ID №105 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной) и гена S100A (кодируемый SEQ ID №107 или на 60%, 70% 80%, 90% или 95% к ней идентичной), за которым может следовать первая линкерная последовательность, второй ген или его участок, который выбран из гена SDF (кодируемый SEQ ID №103 или на 60%, 70% 80%, 90% или 95% к ней идентичной), гена VEGF (кодируемый SEQ ID №105 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной) и гена S100A (кодируемый SEQ ID №107 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной), за которым необязательно следует вторая линкерная последовательность и затем третий ген или его участок, выбранный из гена SDF (кодируемый SEQ ID №103 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной), ген VEGF (кодируемый SEQ ID №105 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной) и гена S100A (кодируемый SEQ ID №107 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной). Различные комбинации таких конструкций, например, описываются SEQ ID №№1-31, и их можно использовать для терапевтических целей.

[0111] Вектор может быть модульным. Модульный вектор может обеспечивать замещение одного гена или сегмента нуклеиновой кислоты на другой ген или сегмент нуклеиновой кислоты, например, с применением расщепления рестрикционным ферментом.

[0112] Полигенная экспрессия представляющих интерес генов и белков может опосредоваться вектором. Можно применять любую векторную систему включая, но не ограничиваясь ими, плазмидные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, поксвирусные векторы, векторы на основе вируса герпеса, векторы на основе аденоассоциированного вируса и т.д. Плазмидные векторы являются преимущественными для предотвращения противовирусного иммунного ответа хозяина. Плазмиды могут представлять собой эписомальные и неинтегрирующие плазмиды, что может снизить риск инсерционного мутагенеза по сравнению с вирусными векторами. В некоторых случаях в полинуклеотидных конструкциях согласно настоящему изобретению можно применять энхансер. Энхансер может относиться к последовательности, которая может функционировать на свободном (нефиксированном) расстоянии от сайта начала транскрипции и может располагаться либо на 5'-, либо на 3'-конце единицы транскрипции. Кроме того, энхансеры могут находиться внутри интрона, а также внутри самой кодирующей последовательности. Длина энхансеров обычно составляет от 10 до 300 пар оснований, и они действуют в cis. Длина энхансера может составлять от 10 до 50 п. о., от 50 до 100 п. о., от 100 до 150 п. о., от 150 п. н. до 200 п. о., от 200 до 250 п. о., от 250 до 300 п. о. Энхансеры могут функционировать для того, чтобы повысить транскрипцию с соседних промоторов. Энхансеры также могут содержать элементы ответа, которые опосредуют регуляцию транскрипции. Хотя в настоящее время известно о многих последовательностях энхансеров, полученных из генов млекопитающих (глобин, эластаза, альбумин, фетопротеин и инсулин), для общей экспрессии можно также применять энхансер, полученный из вируса эукариотической клетки. Выбор комбинации энхансер-промотор оказывает большое влияние как на уровень, так и на продолжительность экспрессии трансгена. Среди прочих, энхансер может представлять собой энхансер вируса обезъян 40 (SV40), энхансер вируса иммунодефицита человека I (ВИЧ-1), энхансер вируса гепатита земляной белки (GHV), энхансер аденовируса, энхансер протромбина человека (hTHGB) или энхансер гена комплемента С2 человека (hC2).

[0113] В некоторых вариантах реализации последовательность энхансера можно применять для повышения экспрессии гена. Например, энхансер CMV может повышать экспрессию трансгена под контролем различных клеточноспецифичных промоторов и различных типов клеток, что делает его широко применимым инструментом для повышения уровней экспрессии трансгена.

[0114] В некоторых случаях может применять миникольцевой вектор. Миникольцевые векторы могут отличаться от бактериальных плазмидных векторов тем, что у них может отсутствовать точка начала репликации, и они могут не содержать маркеры отбора по чувствительности к лекарственному средству, обычно обнаруживаемые в бактериальных плазмидах, например, β-лактамаза, tet и им подобные. Миникольцо может по существу не содержать векторные последовательности, отличные от последовательности гибридного продукта рекомбиназы и представляющей интерес последовательности, т.е. транскрибируемой последовательности и регуляторных последовательностей, необходимых для экспрессии. В некоторых случаях можно использовать вектор dog bone. Вектор dog bone можно получить без применения бактерий, и он может содержать пониженное количество бактериальных элементов по сравнению с плазмидой. Пониженное количество бактериальных элементов могут снижать токсичность введения вектора в клетку, в субъект или комбинацию их обоих.

[0115] Некоторые описанные в настоящем документе варианты реализации включают полинуклеотиды (и полипептиды, кодируемые указанными полинуклеотидами), которые могу быть введены в векторы (включая невирусные и вирусные векторы (включая ДНК- и РНК/мРНК-векторы, которые могут представлять собой линейные или кольцевые векторы)), при этом указанные полинуклеотиды содержат конфигурацию конструкции, выбранную из группы, состоящей из:

a) 5'-(промотор)-S100-(линкер)-SDF-(линкер)-VEGF-3';

b) 5'-(промотор)-S100-(линкер)-VEGF-(линкер)-SDF-3';

c) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDR1-(линкер)-VEGF-3';

d) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF-(линкер)-SDF1-3';

e) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDF1-(линкер)-VEGF165-3';

f) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF165-(линкер)-SDF1-3';

g) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDF1α-(линкер)-VEGF165-3';

h) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF165-(линкер)-SDF1α-3';

i) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDF1-(линкер)-VEGF191-3';

j) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF191-(линкер)-SDF1-3';

k) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDF1α-(линкер)-VEGF191-3';

l) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF191-(линкер)-SDF1α-3';

m) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-SDF-(линкер)-VEGF-3';

n) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-VEGF-(линкер)-SDF-3';

о) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(линкер)-VEGF-3';

p) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(линкер)-SDF1-3';

q) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(линкер)-VEGF165-3';

r) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(линкер)-SDF1-3';

s) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(линкер)-VEGF165-3';

t) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(линкер)-SDF1α-3';

u) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(линкер)-VEGF191-3';

v) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(линкер)-SDF1-3';

w) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(линкер)-VEGF191-3';

x) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(линкер)-SDF1α-3';

y) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-SDF-(fp2a)-VEGF-3';

z) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-VEGF-(fp2a)-SDF-3';

aa) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF-3';

ab) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(fp2a)-SDF1-3';

ac) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF165-3';

ad) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fp2a)-SDF1-3';

ae) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fp2a)-VEGF165-3';

af) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fp2a)-SDF1α-3';

ag) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF191-3';

ah) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fp2a)-SDF1-3';

ai) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fp2a)-VEGF191-3';

aj) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fp2a)-SDF1α-3';

ak) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-SDF-(fmdv)-VEGF-3';

al) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-VEGF-(fmdv)-SDF-3';

am) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF-3';

an) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(fmdv)-SDF1-3';

ao) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF165-3';

ap) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fmdv)-SDF1-3';

aq) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fmdv)-VEGF165-3';

ar) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fmdv)-SDF1α-3';

as) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF191-3';

at) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fmdv)-SDF1-3';

au) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fmdv)-VEGF191-3';

av) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fmdv)-SDF1α-3';

aw) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-SDF-(p2a)-VEGF-3';

ax) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-VEGF-(p2a)-SDF-3';

ay) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF-3';

az) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(p2a)-SDF1-3';

ba) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF165-3';

bb) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(p2a)-SDF1-3';

bc) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(p2a)-VEGF165-3';

db) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(p2a)-SDF1α-3';

be) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF191-3';

bf) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(p2a)-SDF1-3';

bg) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(p2a)-VEGF191-3';

bh) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(p2a)-SDF1α-3',

bi) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-SDF-(GSG-p2a)-VEGF-3';

bk) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-VEGF-(GSG-p2a)-SDF-3';

bl) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF-3';

bm) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(GSG-p2a)-SDF1-3';

bn) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF165-3';

bo) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(GSG-p2a)-SDF1-3';

bp) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(GSG-p2a)-VEGF165-3';

bq) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(GSG-p2a)-SDF1α-3';

br) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF191-3';

bs) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(GSG-p2a)-SDF1-3';

bt) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(GSG-p2a)-VEGF191-3' и

bu) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(GSG-p2a)-SDF1α-3';

где «промотор» представляет собой любую транскрипционную промоторную последовательность;

где «S100» кодирует любой полипептид, изоформу или их фрагмент в семействе белков S100;

где «SDF» кодирует любой полипептид, изоформу или их фрагмент в семействе белков SDF;

где «VEGF» кодирует любой полипептид, изоформу или их фрагмент в семействе белков VEGF;

где условные символы "("и")" обозначают любое число дополнительных нуклеотидов (nts) (от 0 до 1000 nts) независимо от того, являются ли последовательности кодирующими или некодирующими;

где «линкер» обозначает любой линкер, подходящий для экспрессии смежных биологически активных полипептидов;

где «S100A1» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №105 или аминокислотной последовательности SEQ ID №104 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «SDF-1» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №103 или аминокислотной последовательности SEQ ID №102 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «VEGF165» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №127 или аминокислотной последовательности SEQ ID №126 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «VEGF191» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №107 или аминокислотной последовательности SEQ ID №106 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «fp2a» по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №41 или аминокислотной последовательности SEQ ID №40 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «fmdv» по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №35 или аминокислотной последовательности SEQ ID №34 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «р2а» по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №37 или аминокислотной последовательности SEQ ID №36 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно; а также

где «GSG-p2a» по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №39 или аминокислотной последовательности SEQ ID №40 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно.

В некоторых вариантах реализации кандидаты-лидеры на роль терапевтических полинуклеотидов согласно настоящему изобретению включают полинуклеотиды (и полипептиды, кодируемые указанными полинуклеотидами), которые могут быть введены в векторы (включая невирусные и вирусные векторы (включая ДНК- и РНК/мРНК-векторы, которые могут представлять собой линейные или кольцевые векторы)), при этом указанные полинуклеотиды содержат конфигурацию конструкции, выбранную из группы, состоящей из:

a) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDF1α-(линкер)-VEGF191-3';

b) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF191-(линкер)-SDF1α-3';

c) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDF1α-(линкер)-VEGF165-3';

d) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF165-(линкер)-SDF1α-3';

e) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(линкер)-VEGF191-3';

f) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(линкер)-SDF1α-3';

g) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(линкер)-VEGF165-3';

h) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(линкер)-SDF1α-3';

i) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fp2a)-VEGF191-3';

j) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fp2a)-SDF1α-3';

k) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fp2a)-VEGF165-3';

1) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fp2a)-SDF1α-3';

m) 5'-(промотор)-S100A1 -(fp2a)-SDF1α-(fmdv)-VEGF191-3';

n) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fmdv)-SDF1α-3';

о) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fmdv)-VEGF165-3';

p) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fmdv)-SDF1α-3';

q) 5'-(промотор)-S100A1 -(fp2a)-SDF1α-(p2a)-VEGF191-3';

r) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(p2a)-SDF1α-3';

s) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(p2a)-VEGF165-3';

t) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(p2a)-SDF1α-3';

u) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(GSG-p2a)-VEGF191-3';

v) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(GSG-p2a)-SDF1α-3';

w) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(GSG-p2a)-VEGF165-3' и

x) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(GSG-p2a)-SDF1α-3';

где «промотор» представляет собой любую транскрипционную промоторную последовательность;

где «S100» кодирует любой полипептид, изоформу или их фрагмент в семействе белков S100;

где «SDF» кодирует любой полипептид, изоформу или их фрагмент в семействе белков SDF;

где «VEGF» кодирует любой полипептид, изоформу или их фрагмент в семействе белков VEGF;

где «SDF-1α» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №103 или аминокислотной последовательности SEQ ID №102 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

[0116] В предпочтительном варианте реализации композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения застойной сердечной недостаточности (например, композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения застойной сердечной недостаточности у пациентов с имплантируемыми левожелудочковым аппаратом вспомогательного кровообращения (LVAD)).

[0117] В предпочтительном варианте реализации композиции согласно настоящему изобретению вводят пациентам при помощи ретроградной инфузии через коронарный синус (RCSI).

[0118] В одном варианте реализации композиции согласно настоящему изобретению вводят в животные модели (например, но не ограничиваясь ими, свиньям (свиная модель)), при этом ретроградную инфузию через коронарный синус (RCSI) применяют для изучения модели ишемии миокарда у животных.

[0119] В определенных вариантах реализации функциональность каждого эффектора в рХоХ проверяли в трансфицированных индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSC), полученных от здоровых пациентов и пациентов с заболеванием, с применением специфичных к эффектору анализов. В частности, S100A1 продемонстрировал улучшение сократительных свойств. Было показано, что SDF-1α индуцирует CXCR4-зависимую миграцию клеток Jurkat и лимфоцитов периферической крови (PBL). VEGF165 продемонстрировал увеличение пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC).

[0120] В другом варианте реализации исследование на определение безопасности in vitro трансфекции рХоХ в кардиомиоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) от здоровых пациентов и пациентов с заболеванием, не продемонстрировало риска возникновения побочных эффектов на сердечную проводимость, которое было основано на оценках изменений продолжительности потенциала поля (с применением системы МЕА), которые тесно коррелируют с воздействиями на интервалы QT электрокардиограммы (ЭКГ).

[0121] В другом варианте реализации трансфекция рХоХ восстанавливала частоту биения, продолжительность сокращения и частоту сокращения в iPSC-CM-клетках пациентов с дилатационной кардиомиопатией до уровней, сравнимых с теми, которые наблюдаются в iPSC-CM-клетках, полученных от здорового фенотипа. В предпочтительном варианте реализации наилучшие улучшения сократительных свойств наблюдали для плазмиды pXoX, содержащей три эффекторных гена, по сравнению с плазмидами, содержащими один и содержащими два эффекторных гена.

[0122] В определенных вариантах реализации векторы и полинуклеотидные конструкции согласно настоящему изобретению содержат последовательности парных генов (двойных генов) (и полипептидов, ими же кодируемых), как, например, те, которые описаны в Таблице 1.

*«CAG» и «NXB-V2» представляют собой CAG-промотор плюс 5' и 3' элементы и новую версию 2 остова вектора X, обнаруженную в конструкциях согласно настоящему изобретению (как, например, в рХоХ, указанную ниже):

Последовательность векторных элементов «CAG» и «NXB-V2»

Промоторы

[0123] Промоторы являются основным цис-действующим элементом в конструкции векторного генома, который может определять общую силу экспрессии, а также клеточную специфичность. Промотор может представлять собой универсальный промотор, клеточноспецифичный промотор или их комбинацию. Универсальный или конститутивный промотор, среди прочих, может представлять собой CMV, CBA (CAG и CBh), EF-1-альфа, PKG, UBC, GUSB (hGBp), UCOE. Промотор может представлять собой промотор, который обладает активностью в представляющей интерес клетке-мишени, например, кардиальный промотор. В некоторых случаях промотор представляет собой CAG. В других случаях промотор представляет собой конститутивный промотор, такой как Ef1a. Промотор может представлять собой человеческий промотор, такой как Ef1a (hEf1a) человека. Также можно применять двунаправленный промотор. Например, конститутивный двунаправленный промотор может представлять собой промотор цитомегаловируса человека.

[0124] В некоторых вариантах реализации, таких как те, в которых секретируется генный продукт, полипептид, может потребоваться универсальная экспрессия во всех или выбранных типах клеток. Такие конститутивные промоторы, как промотор субъединицы фактора элонгации 1α человека (EF1α), немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV), промотор β-актина цыпленка (CBA) и его производного CAG, промоторы β-глюкуронидазы (GUSB) или убиквитина С (UBC), можно применять для стимулирования экспрессии в большинстве тканей (Husain et al., 2009; Qin et al., 2010; Norrman et al., 2010). В целом CBA и CAG среди конститутивных промоторов способствуют большей экспрессии (Xu et al., 2001; Yin et al., 2011); однако их размер в ~1,7 тыс. п.о. в сравнении с CMV (~0,8 тыс. п.о.) или EF1α (~1,2 тыс. п.о.) может ограничивать их применение в векторах с точки зрения их упаковки. В некоторых случаях промотор GUSB или UBC может обеспечить универсальную экспрессию генов с меньшим размером в 378 п. о. и 403 п. о. соответственно, однако он может быть значительно слабее, чем CMV-промотор или СВА (Husain et al., 2009; Qin et al., 2010). Таким образом, были осуществлены модификации конститутивных промоторов с целью уменьшения их размера без влияния на их экспрессию, и такие примеры, как CBh (~800 п. о.) и миниСВА (~800 п. о.) могут стимулировать экспрессию, сопоставимую и даже более повышенную в отдельных тканях (Gray et al., 2011). В некоторых случаях «универсальные» промоторы могут иметь тенденцию к подавлению (сайленсингу) или стимулированию экспрессии различной силы в выбранных типах клеток (McCown et al., 1996; Klein et al., 1998; Gray et al., 2011).

[0125] Вирусные энхансеры и промоторы, полученные из цитомегаловируса (ЦМВ), респираторно-синцитиального вируса (RSV) и вируса обезьян 40 (SV40), можно применять для получения высоких уровней экспрессии в ряде типов клеток и тканей млекопитающих, как, например, в кардиомиоцитах. Конститутивные промоторы млекопитающих, такие как промоторы человеческого убиквитина С (UBC) и фактора элонгации трансляции 1 альфа 1 у эукариот (EEF1A1) могут обладать более устойчивой экспрессией. Тканеспецифические промоторы можно использовать для уменьшения экспрессии нецелевых трансгенов. Многочисленные цис-действующие последовательности, включая сигналы полиаденилирования, интроны и области присоединения к скаффолду/матрице (S/MAR) 52, могут в некоторых случаях могут повышать уровень и устойчивую экспрессию трансгенов.

[0126] Компактные ДНК-векторы, которые не имеют бактериального остова (например, миникольца), могут поддерживать высокие уровни и обеспечивать хорошую продолжительность экспрессии гена относительно полноразмерных ДНК-плазмид. Также можно использовать вектор dog bone. Вектор dog bone можно получить без использования бактерий. В некоторых случаях также можно применять ДНК-векторы на основе липидов, в некоторых случаях можно использовать систему транспозонов. Например, система транспозиции может представлять собой или может быть основана на рекомбиназах phiC31, PiggyBac57, «спящая красавица» или их комбинациях.

[0127] В некоторых случаях описанные в настоящем документе векторы, содержащие кардиальные эффекторные гены, можно интегрировать в клеточный геном с применением рекомбиназы, ФИГ. 2. Рекомбиназа может представлять собой рекомбиназу для att-сайта. В некоторых случаях рекомбиназа может быть выбрана из рекомбиназ, описанных в патенте США №9034650; публикации патента США №2015/0275232 и W02008/073154, полное содержание каждой публикации включено в настоящее описание посредством ссылки.

[0128] Рекомбиназу можно вводить в клетку через мРНК, кодирующую рекомбиназу. В определенных вариантах реализации интеграцию рекомбиназы в геном клетки можно предотвратить путем введения и экспрессии рекомбиназы, применяя мРНК, кодирующую рекомбиназу. В некоторых случаях мРНК, кодирующая рекомбиназу, может представлять собой синтетическую мРНК или мРНК класса cGMP, ФИГ. 1.

[0129] В некоторых случаях рекомбиназу можно вводить в клетку посредством плазмиды экспрессии, содержащей «суицидальный ген» и ген, кодирующий рекомбиназу. В некоторых вариантах реализации суицидальный ген и ген рекомбиназы могут быть разделены промежуточным участком внутренней посадки рибосомы (IRES).

[0130] В некоторых случаях клетка, в которую можно ввести или генетически интегрировать векторы (например, посредством рекомбиназы), может представлять собой первичную клетку (например, такую как, но не ограничиваясь ею, кардиомиоцит, ФИГ. 2). В некоторых случаях ген, кодируемый внутри вектора, можно ввести в клетку при помощи генетических методов в целевое местоположение в геноме.

[0131] Элементы участка внутренней посадки рибосомы (IRES) могут способствовать экспрессии нескольких генов с одного транскрипта (Mountford and Smith 1995). В контексте настоящего описания подразумевается, что термин «IRES» обозначает участок внутренней посадки рибосомы. В векторе, содержащем последовательность IRES, первый ген может транслироваться при помощи кэп-зависимого (сканирующего) механизма с участием собственной 5'-НТО, тогда как трансляция последующего гена может осуществляться путем непосредственного рекрутинга рибосомы в IRES кэп-независимым образом.

[0132] Последовательность IRES может способствовать тому, что рибосомы у эукариот связываются и начинают трансляцию без связывания с 5'-кэпированныи концом. В определенных случаях область IRES можно получить из последовательности IRES таких вирусов, как, например, пикорнавируса, вируса энцефаломиокардита, вируса гепатита С. В других случаях последовательность IRES можно получить из вируса энцефаломиокардита. В контексте настоящего описания термин «EMCV» или «вирус энцефаломиокардита» относится к любому члену изолятов или штаммов видов вируса энцефаломиокардита рода семейства Picornaviridae. Примерами являются: штамм вируса EMCV-R (Rueckert), вирус Columbia-SK. В некоторых случаях можно применять клеточный элемент IRES, такой как фактор инициации у эукариот 4G, белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина, протоонкоген c-myc, фактор роста эндотелия сосудов, IRES фактора роста фибробластов 1 или любую их комбинацию или модификацию. В некоторых случаях клеточный IRES может обладать повышенной экспрессией гена по сравнению с вирусным IRES.

[0133] В контексте настоящего описания термин «КЭП» или «кэп» относится к модифицированному нуклеотиду, обычно к 7-метилгуанозину, присоединенному в направлении 3' к 5' (7meG-ppp-G), к 5'-концу эукариотической мРНК, который выступает в роли необходимого элемента в нормальном пути инициации трансляции во время экспрессии белка с такой мРНК.

[0134] IRES-последовательность вируса, клетки или их комбинации можно использовать в векторе. IRES можно получить из вируса энцефаломиокардита (EMCV) или полиовируса (PV).

[0135] В некоторых случаях элемент IRES выбран из группы, состоящей из полиовируса (PV), вируса энцефаломиелита (EMCV), вируса ящура (FMDV), тесковируса свиней 1 (PTV-1), аичивируса (AiV), вируса долины Сенека (SVV), вируса гепатита С (HCV), вируса классической чумы свиней (CSFV), вируса иммунодефицита человека 2 (ВИЧ-2), вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), вируса лейкоза Молони грызунов (MoMLV), вирус иммунодефицита кошачьих (FIV), вирус опухоли молочной железы мыши (MMTV), цитомегаловируса человека, находящегося в латентном состоянии (pUL138), вирус Эпштейна-Барра (EBNA-1), вируса герпеса, вызывающего болезнь Марека (MDV RLORF9), вируса SV40, содержащего полицистронную 19S (SV40 19S), вируса Rhopalosiphum padi (RhPV), вируса паралича крикета (CrPV), пикорнаподобного вируса Ectropis obliqua (EoPV), кишечного вируса Plautia stali (PSIV), вируса Triatoma (TrV), дицистровируса паралича пчел (IAPV, KBV), вируса реверсии черной смородины (BRV), вируса разрыва цветков пеларгонии (PFBV), вируса хлоротической кольцевой пятнистости гибискуса (HCRSV), тобамовируса крестоцветных (CrT MV), полеровируса скручиваемости листьев картофеля (PLRV), вируса травы табака (TEV), гиардиавируса (GLV), РНК-вируса лейшмании 1 (LRV-1) и их комбинаций или модификаций.

[0136] В некоторых случаях IRES выбран из группы, состоящей из Apaf-1, XIAP, HIAP/с-IAP1, DAP5, Bcl-2, c-myc, САТ-1, INR, фактора дифференцировки LEF-1, PDGF2, HIF-1a, VEGF, FGF2, BiP, BAG-1, CIRP, p53, SHMT1, PITSLREp58, CDK1, Rpr, hid, hsp70, grim, skl, Antennapedia, dFoxO, dInR, Adh-Adhr, HSP101, ADH, URE -2, GPR1, NCE102, YMR181a, MSN1, BOI1, FL08, GIC1 и любой их комбинации или модификации.

[0137] Когда элемент IRES расположен между двумя открытыми рамками считывания (ОРС), инициирование трансляции может происходить при помощи канонического 5'-m7GpppN кэп-зависимого механизма в первой ОРС и посредством кэп-независимого механизма во второй ОРС, расположенной после элемента IRES.

[0138] В некоторых случаях гены могут быть соединены при помощи участка внутренней посадки рибосомы (IRES). IRES может способствовать одновременной экспрессии нескольких генов. Например, последовательность IRES может способствовать образованию несколько белков из одного транскрипта мРНК. Рибосомы могут связываться с IRES 5'-кэп-независимым образом и инициировать трансляцию.

[0139] В некоторых случаях последовательность IRES может составлять или может составлять приблизительно 500 пар оснований. Последовательность IRES может составлять от 300 пар оснований до 1000 пар оснований. Например, длина IRES может составлять 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 пар оснований.

[0140] В некоторых случаях можно понизить экспрессию гена внутри вектора, содержащего последовательность IRES, который расположенного за этой последовательностью. Например, экспрессия гена, следующего за последовательностью IRES, может быть понижена по сравнению с уровнем экспрессии гена, находящегося перед последовательностью IRES. Снижение уровня экспрессии может составлять от 1% до 99% от уровня экспрессии предшествующего гена.

[0141] В некоторых случаях можно применять вирусную 2А-последовательность. 2А-последовательность можно получить из 2А-последовательности пикорнавируса. 2А-последовательность пикорнавируса можно выбрать из группы, состоящей из 2А-последовательностей энтеровируса, 2А-последовательностей риновируса, 2А-последовательностей кардиовируса, 2А-последовательностей афтовируса, 2А-последовательностей гепатовируса, последовательностей 2А арбовируса, 2А-последовательностей кобувируса, 2А-последовательностей тесковируса и 2А-последовательностей парэховируса.

[0142] 2А-элементы могут быть короче, чем IRES, от 5 до 100 пар оснований. В некоторых случаях длина 2А-последовательности может составлять 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 100 пар оснований. Соединенные с 2А гены могут экспрессироваться в одной открытой рамке считывания и «саморасщепление» может происходить котрансляционно между двумя последними аминокислотами, GP, на С-конце 2А-полипептида, что приводит к равным количествам совместно экспрессированных белков. В некоторых случаях полипептид, содержащий 2А-последовательность, может не приводить к равным количествам белка после расщепления. В некоторых случаях концентрация первого белка может быть на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или вплоть до 100% больше по сравнению с концентрацией второго белка. В некоторых случаях концентрация второго белка может быть на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или вплоть до 100% больше по сравнению с концентрацией второго белка.

[0143] Длина вирусной 2А-последовательности может составлять приблизительно 20 аминокислот. В некоторых случаях вирусная 2А-последовательность может содержать консенсусный мотив Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro (SEQ ID №117). Последовательность консенсусного мотива может действовать котрансляционно. Например, можно предотвратить образование нормальной пептидной связи между остатком глицина и пролина, что может привести к «рибосомному перепрыгиванию» и тем самым «расщеплению» зарождающегося полипептида. Несколько генов могут обеспечить такой эффект на эквимолярных уровнях.

[0144] 2А-пептид может способствовать трансляции нескольких белков в одной открытой рамке считывания в полипептид, который впоследствии может быть «расщеплен» до отдельного полипептида через механизм «рибосомного перепрыгивания» (Funston, Kallioinen et al., 2008). В некоторых вариантах реализации «2А»-последовательность может содержать: р2а, GSG-p2a, Т2А, Е2А, F2A и BmCPV2A, BmIFV2A и любую их комбинацию.

[0145] Вектор может также содержать дополнительную 2А/фурин-последовательность, расположенную между полицистронными генами для обеспечения образования продуктов экспрессии, образующихся, например, со второго гена путем ферментативного расщепления полипептидного продукта. В некоторых случаях дополнительные линкеры можно использовать для облегчения расщепления между несколькими генами в полигенном векторе.

[0146] В некоторых случаях вектор может содержать IRES-последовательность и 2А-последовательность. В других случаях экспрессии нескольких генов, соединенных с 2А-пептидами, может способствовать спейсерная последовательность (GSG) перед 2А-пептидами. В некоторых случаях в конструкциях могут комбинироваться спейсеры, линкеры, адаптеры, промоторы или их комбинации. Например, конструкция может содержать сайт расщепления линкера спейсером (SGSG (SEQ ID №118) или GSG) и фурином (RAKR (SEQ ID №32)) с различными 2А-пептидами. Спейсер может представлять собой I-Ceui (интрон-кодирующая эндонуклеаза). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере два кардиальных эффекторных гена разделены участком внутренней посадки рибосомы (IRES).

Полинуклеотидные линкеры

[0147] В описанных в настоящем документе вариантах реализации полинуклеотидный линкер можно использовать в описанном в настоящем документе полинуклеотиде. Полинуклеотидный линкер может представлять собой двухцепочечный сегмент ДНК, содержащий требуемые сайты рестрикции, которые можно добавить для создания концевых структур, совместимых с вектором, содержащим описанный в настоящем документе полинуклеотид. В некоторых случаях полинуклеотидный линкер может быть подходящим для модификации векторов, содержащих описанные в настоящем документе полинуклеотиды. Например, модификация вектора, содержащего полинуклеотидный линкер, может представлять собой изменение в сайте множественного клонирования или добавление полигистидинового хвоста. Полинуклеотидные линкеры также можно применять для адаптации тупых концов ДНК-вставки для клонирования в вектор, расщепляемый рестрикционным ферментом с «липкими» концами. Применение полинуклеотидных линкеров может быть более эффективным, чем лигирование тупых концов в векторе, и оно может обеспечить способ высвобождения вставки из вектора в последующих способах применений. В некоторых случаях вставка может представлять собой полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды, подходящие для терапевтических применений (например, полипептид SDF1, полипептид S100A1, полипептид VEGF и их фрагменты и варианты).

[0148] Полинуклеотидный линкер может представлять собой олигомер. Например, длина линкера может составлять от приблизительно 5 до 20 нуклеотидов. Длина полинуклеотидного линкера может составлять или может приблизительно составлять от 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов. Полинуклеотидный линкер может представлять собой двухцепочечную ДНК, одноцепочечную ДНК или их комбинацию. В некоторых случаях линкер может представлять собой РНК. Полинуклеотидный линкер можно лигировать в вектор, содержащий описанный в настоящем документе полинуклеотид, в некоторых случаях при помощи Т4-лигазы. Для содействия лигированию избыток полинуклеотидных линкеров можно добавить к композиции, содержащей вставку и вектор. В некоторых случаях вставку и вектор предварительно обрабатывают до введения линкера. Например, предварительная обработка метилазой может предотвратить нежелательное расщепление ДНК-вставки.

Полипептидные линкеры

[0149] В определенных вариантах реализации два или более полипептидов, кодируемых описанным в настоящем документе полинуклеотидом, могут быть разделены промежуточной последовательностью, кодирующей полипептидный линкер. В определенных случаях указанный линкер представляет собой чувствительный к расщеплению линкер. В некоторых вариантах реализации представляющие интерес полипептиды экспрессируются в виде белков слияния, связанных при помощи чувствительного к расщеплению полипептидного линкера. В определенных вариантах реализации чувствительный к расщеплению полипептидный линкер(-ы) может представлять собой по меньшей мере один из Furinlink, fmdv, р2а, GSG-p2a и/или fp2a, описанных ниже. В некоторых случаях линкер представляет собой APVKQGSG (SEQ ID №119).

[0150] В некоторых случаях полипептидный линкер может содержать аминокислотную последовательность «RAKR» (SEQ ID №32). В некоторых случаях полипептидный линкер furin может кодироваться полинуклеотидной последовательностью, содержащей «CGTGCAAAGCGT» (SEQ ID №33).

[0151] В некоторых случаях полипептидный линкер может представлять собой линкер, содержащий последовательность, описанную в таблице ниже:

[0152] В некоторых вариантах реализации линкер можно использовать в описанном в настоящем документе полинуклеотиде. Линкер может представлять собой гибкий линкер, негибкий (жесткий) линкер, расщепляемый in vivo линкер или любую их комбинацию. В некоторых случаях линкер может связывать вместе функциональные домены (в случае как гибких, так и негибких линкеров), либо высвобождать свободный функциональный домен in vivo, как, например, в случае расщепляемых in vivo линкеров.

[0153] Линкеры могут улучшать биологическую активность, повышать выход экспрессии и способствовать достижению требуемых фармокинетических профилей. Линкер может также содержать гидразон, пептид, дисульфид или тиоэфир.

[0154] В некоторых случаях описанная в настоящем документе линкерная последовательность может включать последовательность гибкого линкера. Гибкие линкеры можно применять в случае, когда объединенный домен требует определенной степени движения или взаимодействия. Гибкие линкеры могут состоять из низкомолекулярных, неполярных (например, Gly) или полярных (например, Ser или Thr) аминокислот.Гибкий линкер может иметь последовательности, состоящие в основном из участков остатков Gly и Ser («GS» линкер). Пример гибкого линкера может иметь последовательность (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n (SEQ ID №120). Регулируя число копий «n», длину такого приведенного в качестве примера GS-линкера можно оптимизировать для обеспечения соответствующего разделения функциональных доменов или для поддержания необходимых междоменных взаимодействий. Помимо GS-линкеров, для получения рекомбинантных белков слияния можно использовать другие гибкие линкеры. В некоторых случаях гибкие линкеры также могут быть обогащены низкомолекулярными или полярными аминокислотами, такими как Gly и Ser, однако для поддержания гибкости они могут содержать и дополнительные аминокислоты, такие как Thr и Ala. В других случаях полярные аминокислоты, такие как Lys и Glu, можно применять для улучшения растворимости.

[0155] Для обеспечения хорошей гибкости и растворимости, гибкие линкеры, содержащиеся в описанных в настоящем документе линкерных последовательностях, могут быть обогащены низкомолекулярными или полярными аминокислотами, такими как Gly и Ser. Гибкие линкеры могут быть подходящим выбором в случае, когда требуются определенные движения или взаимодействия для доменов белков слияния. Кроме того, хотя гибкие линкеры могут и не иметь жестких структур, они могут служить в качестве пассивных линкеров для сохранения расстояния между функциональными доменами. Длину гибких линкеров можно регулировать для обеспечения надлежащего фолдинга или достижения оптимальной биологической активности указанных белков слияния.

[0156] Описанный в настоящем документе линкер может также включать негибкий линкер. Негибкий линкер можно использовать для поддержания фиксированного расстояния между доменами полипептида. Примерами негибких линкеров, среди прочих, могут быть: образующие альфа-спираль линкеры, богатая пролином последовательность, (XP)_n (SEQ ID №121), X-Pro-осТОВ, A (EAAAK)_nA (n=2-5) (SEQ ID №122). Негибкие линкеры могут представлять собой относительно жесткие структуры, в некоторых случаях за счет принятия формы α-спиральной структуры или содержания несколько остатков пролина (Pro).

[0157] В некоторых случаях описанный в настоящем документе линкер может быть расщепляемым. В других случаях линкер не является расщепляемым. Линкеры, которые не являются расщепляемыми, могут ковалентно соединять функциональные домены, чтобы действовать как одна молекула во всех процессах in vivo или в процессе ex vivo. Линкер также может быть расщепляемым in vivo. Расщепляемый линкер можно вводить для высвобождения свободных функциональных доменов in vivo. Расщепляемый линкер может расщепляться, среди прочего, в присутствии восстанавливающих реагентов, протеаз. Например, для получения расщепляемого линкера можно использовать восстановление дисульфидной связи. В случае дисульфидного линкера расщепление происходит через реакцию дисульфидного обмена с тиолом, как, например, глутатионом. В других случаях расщепление in vivo линкера в рекомбинантном белке слияния также может осуществляться протеазами, которые могут экспрессироваться in vivo в патологических условиях (например, рак или воспаление), в определенных клетках или тканях, или находиться в определенных клеточных компартментах. В некоторых случаях расщепляемый линкер может способствовать целевому расщеплению. Например, специфичность многих протеаз может обеспечить более медленное расщепление линкера в ограниченных компартментах. Расщепляемый линкер может также содержать гидразон, пептиды, дисульфиды или тиоэфир. Например, гидразон может обеспечивать стабильность сыворотки. В других случаях гидразон может обеспечивать расщепление в кислотном компартменте. рН кислотного компартмента может достигать 7. Линкер может также содержать тиоэфир. Тиоэфир может быть невосстанавливаемым. Тиоэфир можно сконструировать для внутриклеточного протеолитического разложения.

[0158] В определенных вариантах реализации полипептидный линкер fmdv содержит последовательность, которая может быть по меньшей мере на приблизительно 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №34. В определенных вариантах реализации линкерный полипептид fmdv представляет собой по меньшей мере один линкер, кодируемый в одном векторе, связывающем два или более белка слияния. В определенных случаях линкерный полипептид fmdv может кодироваться полинуклеотидом нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания (ОРС). В некоторых случаях ОРС, кодирующая fmdv, содержит или состоит из последовательности SEQ ID №35. В определенных вариантах реализации полинуклеотидная последовательность, кодирующая fmdv, по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №35.

[0159] В определенных случаях линкерный полипептид может представлять собой «р2а» линкер. В определенных вариантах реализации р2а-полипептид может содержать последовательность, которая может быть по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №36. В определенных вариантах реализации линкерный полипептид р2а может представлять собой по меньшей мере один из линкеров, кодируемых в одном векторе, связывающем два или более белка слияния. В некоторых случаях линкерный полипептид р2а может кодироваться полинуклеотидом нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания (ОРС). В определенных вариантах реализации ОРС, кодирующая р2а, содержит или состоит из последовательности SEQ ID №37. В определенных случаях последовательность полинуклеотида, кодирующего р2а, может быть или может быть по меньшей мере на приблизительно 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №37.

[0160] В некоторых случаях линкерный полипептид может представлять собой линкер «GSG-p2a». В определенных вариантах реализации линкерный полипептид GSG-p2a может содержать последовательность, которая может быть по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №38. В определенных вариантах реализации линкерный полипептид GSG-p2a может представлять собой по меньшей мере один из линкеров, кодируемых в одном векторе, связывающем два или более белка слияния. В некоторых случаях линкерный полипептид GSG-p2a может кодироваться полинуклеотидом полинуклеотидной последовательности открытой рамки считывания (ОРС). ОРС, кодирующая GSG-p2a, может содержать последовательность SEQ ID №39. В некоторых случаях последовательность полинуклеотида, кодирующего GSG-p2a, может быть или может быть по меньшей мере на приблизительно 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №39.

[0161] Предложенный в настоящем документе линкерный полипептид может представлять собой линкер «fp2a». В определенных вариантах реализации линкерный полипептид fp2a может содержать последовательность, которая может быть по меньшей мере на приблизительно 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №40. В определенных случаях линкерный полипептид fp2a может представлять собой по меньшей мере один из линкеров, кодируемых в одном векторе, связывающем два или более белка слияния. В некоторых случаях линкерный полипептид fp2a может кодироваться полинуклеотидом полинуклеотидной последовательности открытой рамки считывания (ОРС). В определенных вариантах реализации последовательность полинуклеотида, кодирующего fp2a-линкер, может быть или может быть по меньшей мере на приблизительно 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №41.

[0162] В некоторых случаях вектор можно сконструировать. Например, линкер можно сконструировать таким образом, чтобы он обладал такими химическими характеристиками, как гидрофобность. В некоторых случаях по меньшей мере две линкерные последовательности могут продуцировать один и тот же белок. Последовательность может быть или может быть по меньшей мере на приблизительно 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% или 100% идентична последовательностям с SEQ ID №42 по SEQ ID №101. В других случаях в векторе можно применять несколько линкеров. Например, представляющие интерес гены (например, S100A1, SDF-1α и VEGF165) могут быть разделены по меньшей мере двумя линкерами, как это показано на ФИГ. 20А и ФИГ. 20В. В некоторых случаях гены могут быть разделены 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или вплоть до 10 линкерами.

[0163] Линкер может представлять собой сконструированный линкер. Способы конструирования линкеров могут быть вычислительными. В некоторых случаях вычислительные способы могут включать графические методы. Вычислительные способы можно применять для поиска подходящих пептидов из библиотек трехмерных пептидных структур, полученных из баз данных. Например, Брукхейвенский банк данных белков (PDB) можно применять для определения расстояния в пространстве между выбранными аминокислотами линкера.

[0164] В некоторых вариантах реализации предложены полинуклеотиды, кодирующие полипептидную конструкцию, содержащую полипептид фурина и 2А-полипептид, при этом указанный полипептид фурина и 2А-полипептид соединены полипептидным линкером, содержащим по меньшей мере три гидрофобные аминокислоты. В некоторых случаях по меньшей мере три гидрофобные аминокислоты выбраны из списка, состоящего из глицина (Gly) (G), аланина (Ala) (А), валина (Val) (V), лейцина (Leu) (L), изолейцина (Ile) (I), пролина (Pro) (Р), фенилаланина (Phe) (F), метионина (Met) (М), триптофана (Trp) (W). В некоторых случаях указанный линкер содержит последовательность, представленную в Таблице 3, описанную в настоящем документе. В некоторых случаях полипептидный линкер может также содержать по меньшей мере одну последовательность GS-линкера, например, (GS)_n (SEQ ID №109), (SG)_n (SEQ ID №110), (GSG)_n (SEQ ID №111) и (SGS)_n (SEQ ID №112), где n может быть любым числом от нуля до пятнадцати.

Предложены способы получения улучшенной экспрессии полипептидной конструкции, включающие: обеспечение полинуклеотида, кодирующего указанную полипептидную конструкцию, содержащую первый функциональный полипептид и второй функциональный полипептид, при этом указанные первый функциональный полипептид и второй функциональный полипептид соединены при помощи линкерного полипептида, содержащего последовательность с по меньшей мере 60% идентичностью к последовательности APVKQ (SEQ ID №42); и экспрессию указанного полинуклеотида в клетке-хозяине, при этом указанная экспрессия приводит к улучшенной экспрессии указанной полипептидной конструкции по сравнению с соответствующей полипептидной конструкцией, которая не содержит линкерный полипептид, содержащий последовательность с по меньшей мере 60% идентичностью к последовательности APVKQ (SEQ) ID №42). В некоторых случаях указанный линкер содержит последовательность, представленную в Таблице 3, описанную в настоящем документе. В некоторых случаях полипептидный линкер может также содержать по меньшей мере одну последовательность GS-линкера, например, (GS)_n (SEQ ID №109), (SG)_n (SEQ ID №110), (GSG)_n (SEQ ID №111) и (SGS)_n (SEQ ID №112), где n может быть любым числом от нуля до пятнадцати. В некоторых случаях уровень улучшенной экспрессии по меньшей мере приблизительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% выше по сравнению с соответствующей полипептидной конструкцией, которая не содержит линкерного полипептида, содержащего последовательность с по меньшей мере 60% идентичностью к последовательности APVKQ (SEQ ID №42).

[0165] В предпочтительных вариантах реализации предложен уникальный аспект согласно настоящему изобретению, который относится к конкретному последовательному порядку полипептидов, кодируемых конструкциями согласно настоящему изобретению. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения специфическое размещение белка S100A1 вначале конструкции позволяет достичь и способствует функциональной экспрессии биологически активных молекул S100A1, поскольку неожиданно было обнаружено, что оставшийся 2А-хвост на поверхности S100A1 не препятствует биологической активности S100A1. В тоже время было обнаружено, что размещение S100A1 в качестве второго гена приводит к неполному расщеплению генов, экспрессируемых посредством конструкции.

[0166] Соответственно, анализ экспрессии рХоХ методом масс-спектрометрии, как это указано ниже в Таблице 13, показал, что S100A1 является единственным эффектором, который не расщепляет фурин, что приводит к удалению С-концевого 2А-пептида. Следовательно, на поверхности SDF1-α или VEGF не остается С-концевого 2А-хвоста. Только S100A1 имеет 2А-линкерный хвост. Точная концевая аминокислотная последовательность представляет собой PG. Она расщепляется между G и Р концевой PGP-последовательности. Следовательно, С-концевой линкерный хвост на поверхности S100A1, экспрессируемого с рХоХ, содержит последовательность (от N- к С-концу) полипептида S101A1, слитую с последовательностью вида (N-конец)-RAKRAPVKQGSGATNFSLLKQAGDVEENPG-(C-конец) (SEQ ID №123), которая в настоящем документе может упоминаться как «2А-хвост». Например, в одном варианте реализации от исходного метионина S100A1 до С-концевой области хвоста расщепляемого линкера fp2a первый GOI согласно настоящему изобретению содержит последовательность:

которая может кодироваться полинуклеотидной последовательностью:

или вырожденные полинуклеотиды, кодирующие одну и ту же аминокислотную последовательность, или аминокислотные последовательности или нуклеотидные последовательности по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97% 98% или 99% идентичные вышеупомянутому 2А-хвосту.

[0167] Тем не менее, как это показано в представленных в настоящем документе данных, было продемонстрировано, что этот хвост S100A1 является «инертным», т.е. не влияет на функцию (биологическая активность) S100A1.

Векторные модификации

[0168] Полинуклеотидный вектор, подходящий для описанных в настоящем документе способов и композиций, может представлять собой вектор, соответствующий стандартам надлежащей производственной практики (GMP). Например, соответствующий GMP вектор может быть более чистым, чем вектор, не соответствующий GMP. В некоторых случаях чистоту можно измерить с помощью бионагрузки. Например, бионагрузка может представлять собой наличие или отсутствие аэробов, анаэробов, спорообразователей, грибов или их комбинаций в векторной композиции. В некоторых случаях чистый вектор может быть с низким содержанием эндотоксина или не содержать его вовсе. Чистоту можно также измерить методом секвенирования двухцепочечной «блуждающей затравки». Идентификация плазмиды может служить источником определения чистоты вектора. Соответствующий GMP вектор согласно настоящему изобретению может быть на 10%-99% более чистым, чем вектор, не соответствующий GMP. Соответствующий GMP вектор может быть на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% более чистым, чем не соответствующий GMP вектор, что измеряется присутствием бионагрузки, эндотоксина, путем секвенирования или при помощи таких комбинаций.

[0169] В некоторых случаях в конце программы первого гена применяют терминирующую последовательность. Терминирующая последовательность может гарантировать, что транскрипт заканчивается до начала программы второго гена. Например, векторы экспрессии могут содержать последовательности, необходимые для прекращения транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доступны с 5' и иногда 3'-нетранслируемых областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области могут содержать нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемом участке мРНК. Клетки, содержащие указанный вектор экспрессии, выращивают в условиях, которые обеспечивают экспрессию требуемого полипептида либо in vivo, либо in vitro.

[0170] В некоторых случаях можно применять спейсерную последовательность на конце первого полипептида, кодируемого полинуклеотидом в векторе. В других случаях спейсерную последовательность можно применять на конце второго гена в векторе. Спейсерную последовательность можно также применять после первого и второго генов в векторе.

[0171] Эти векторы можно применять для экспрессии полипептида, кодируемого геном или частью представляющего интерес гена. Часть гена или сам ген можно вставить с применением любого способа, вирусного или невирусного. Например, способ может представлять собой методику, основанную на использовании не-вирусов.

[0172] В некоторых случаях можно произвести векторные модификации. Например, модификация может включать добавление индуцируемого переключателя генов для контролируемой экспрессии генов, изменения порядка и/или отбора кардиальных эффекторных генов, которые необходимо скомбинировать, замену промотора (например, для обеспечения сильной, специфической экспрессии в левом желудочке) и их комбинации.

[0173] В определенных вариантах реализации последовательности инициации трансляции, предшествующие кодирующей последовательности кардиального эффекторного полипептида в векторах согласно настоящему изобретению, содержат консенсусную последовательность Козак (Kozak). В настоящем документе это может быть указано в описаниях как «Kozak»=«Да».

[0174] В определенных вариантах реализации последовательности инициации трансляции, предшествующие кодирующей последовательности кардиального эффекторного полипептида в векторах согласно настоящему изобретению, не содержат консенсусной последовательности Kozak. В настоящем документе это может быть указано в описаниях как «Kozak»=«Нет».

[0175] В определенных вариантах реализации экспрессией любого одного, двух или трех кардиальных эффекторных полипептидов (таких как SDF1, S100A1 и VEGF191) можно управлять через конститутивный или индуцируемый промотор. В определенных случаях уровень экспрессии по меньшей мере двух генов является равным. В других случаях уровень экспрессии по меньшей мере двух генов не является равным. В некоторых случаях ген, располагающийся в конструкции выше, может экспрессироваться с более высокой концентрацией, чем ген, располагающийся ниже. В других случаях ген, располагающийся в конструкции ниже, может экспрессироваться с более высокой концентрацией, чем ген, располагающийся выше. Линкер может участвовать в контроле уровней экспрессии. Например, расщепляемый линкер можно сконструировать таким образом, чтобы расщепление было более эффективным или менее эффективным.

[0176] В некоторых случаях индуцируемый промотор может представлять собой индуцируемый низкомолекулярным лигандом переключатель генов на основе двухполипептидного рецептора экдизона. В некоторых случаях переключатель генов может быть выбран из рецепторных компонентов на основе экдизона, описанных, без ограничений, в любой из систем, описанных в: PCT/US2001/009050 (WO 2001/070816); патентах США №№7091038; 7776587; 7807417; 8202718; PCT/US2001/030608 (WO 2002/029075); патентах США №№8105825; 8168426; PCT/1J52002/005235 (WO 2002/066613); публикации патента США №10/468200 (публикация патента США №20120167239); PCT/US2002/005706 (WO 2002/066614); патентах США №№7531326; 8236556; 8598409; PCT/U52002/005090 (WO 2002/066612); патентах США №№8715959 (публикация патента США №20060100416); PCT/US2002/005234 (WO 2003/027266); патентах США №№7601508; 7829676; 7919269; 8030067; PCT/U52002/005708 (WO 2002/066615); публикации патента США №10/468192 (публикация патента США №20110212528); PCT/US2002/005026 (WO 2003/027289); патентах США №№7563879; 8021878; 8497093; PCT/US2005/015089 (WO 2005/108617); патентах США №№7935510; 8076454; PCT/U52008/011270 (WO 2009/045370); публикации патента США №12/241018 (публикация патента США №20090136465); PCT/US2008/011563 (WO 2009/048560); публикации патента США №12/247738 (публикация патента США №20090123441); PCT/US2009/005510 (WO 2010/042189); публикации патента США №13/123129 (публикация патента США №20110268766); PCT/US2011/029682 (WO 2011/119773); публикации патента США №13/636473 (публикация патента США №20130195800); PCT/US2012/027515 (WO 2012/122025) и публикации патента США №14/001943 (публикация патента США №20140308247), каждый документ полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.

[0177] В некоторых случаях лиганд, применяемый для регулируемого дозой контроля регуляции индуцируемого переключателя гена на основе рецептора экдизона, можно выбрать из любого одного, без ограничений, экдистероида, такого как экдизон, 20-гидроксиэкдизона, понастерона А, муристерона А и им подобных, 9-цис-ретиноевой кислоты, синтетических аналогов ретиноевой кислоты, N,N'-диацилгидразинов, как, например, тех, которые описаны в патентах США №№6013836; 5117057; 5530028 и 5378726 и опубликованных заявках на патент США №№2005/0209283 и 2006/0020146; оксадиазолинов, описанных в опубликованной заявке на патент США №2004/0171651; дибензоилалкилцианогидразинов, таких как тех, которые описаны в европейской заявке №461809; N-алкил-N,N'-диароилгидразинов, таких как тех, которые описаны в патенте США №5225443; N-ацил-N-алкилкарбонилгидразинов, таких как тех, которые описаны в европейской заявке №234994; N-ароил-N-алкил-N'-ароилгидразинов, таких как тех, которые описаны в патенте США №4985461; арнидокетонов, таких как те, которые описаны в опубликованной заявке на патент США №2004/0049037; каждый из указанных документов включен в настоящее описание посредством ссылки, и других аналогичных материалов, включая 3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокси-N-изобутилбензамид, 8-O-ацетилгарпагид, оксистеролы, 22(R)-гидроксихолестерин, 24(S)-гидроксихолестерин, 25-эпоксихолестерин, Т0901317, 5-альфа-6-альфа-эпоксихолестерин-3-сульфат (ECHS), 7-кетохолестерин-3-сульфат, фрамесол (framesol), желчные кислоты, 1,1-бифосфонатные эфиры, ювенильный гормон III и им подобные. Примеры подходящих в настоящем изобретении диацилгидразиновых лигандов включают RG-115819 (N-(1-этил-2,2-диметилпропил)-N'-(2-метил-3-метокси-бензоил)-гидразид 3,5-диметилбензойной кислоты), RG-115932 (N-(1-трет-бутилбутил)-N'-(2-этил-3-метоксибензоил)гидразид (R)-3,5-диметилбензойной кислоты) и RG-115830 (N-(1-трет-бутилбутил)-N'-(2-этил-3-метоксибензоил)гидразид 3,5-диметилбензойной кислоты). См., например, публикацию заявки на патент США серии №12/155111 и публикацию РСТ №PCT/US2008/006757, оба документа полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

[0178] В некоторых вариантах реализации два или три гена, представляющие интерес (например, но не ограничиваясь ими, кардиальные эффекторные гены), которые экспрессируют представляющие интерес полипептиды, можно включить в и/или экспрессировать с одного вектора под контролем одного промотора. В определенных вариантах реализации указанный один промотор представляет собой конститутивный промотор. В определенных вариантах реализации указанный один промотор представляет собой конститутивный тканеспецифичный промотор. В определенных вариантах реализации указанный один промотор представляет собой индуцируемый низкомолекулярным лигандом промотор на основе рецептора экдизона.

[0179] В определенных вариантах реализации экспрессия полипептидов переключателей генов находится под контролем промотора легкой цепи миозина (MLC).

[0180] Векторы можно доставить in vivo путем введения субъекту, обычно путем системного введения (например, внутривенной, внутрибрюшинной, внутримышечной, подкожной или внутричерепной инфузии) или местного нанесения, как это описано ниже. В альтернативном варианте векторы можно доставлять в клетки ex vivo, как, например, клетки, эксплантированные из субъекта (например, кардиомиоциты, биопсия сердечной ткани), с последующей реимплантацией указанных клеток в субъект, обычно после отбора клеток, которые были включены в вектор. Указанные клетки можно размножить до или после отбора.

[0181] Эффективность трансфекции клеток при помощи любой из платформ доставки нуклеиновой кислоты, описанной в настоящем документе, например, методом нуклеофекции или электропорации, может составлять или может составлять приблизительно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или быть больше, чем 99,9%.

[0182] Эффективность интеграции гена в клетку (например, кардиомиоцит, но не ограничиваясь им) может составлять или может составлять приблизительно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, 99,5%, 99,9% или быть больше, чем 99,9%.

[0183] В определенных аспектах, описанных в настоящем документе, можно использовать векторы. Например, векторы, которые можно применять, включают, но не ограничиваются ими, бактериальные векторы: pBs, pQE-9 (Qiagen), phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), эукариотические векторы: pWL-neo, pSv2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPv, pMSG, pSVL (Pharmiacia). Кроме того, можно применять любые другие плазмиды и векторы, если они могут реплицироваться и быть жизнеспособными в выбранном хозяине. Любой вектор и коммерчески доступный вектор (и их варианты или производные) можно сконструировать так, чтобы они содержали по меньшей мере один сайт рекомбинации для применения в способах. Такие векторы можно получить, например, от компаний Vector Laboratories Inc., Invitrogen, Promega, Novagen, NEB, Clontech, Boehringer Mannheim, Pharmacia, EpiCenter, OriGenes Technologies Inc., Stratagene, PerkinElmer, Pharmingen, and Research Genetics. Другие представляющие интерес векторы включают такие эукариотические векторы экспрессии, как pFastBac, pFastBacHT, pFastBacDUAL, pSFV и pTet-Splice (Invitrogen), pEUK-C1, pPUR, pMAM, pMAMneo, pBI101, pBI121, pDR2, pCMVEBNA и pYACneo (Clontech), pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110 и pKK232-8 (Pharmacia, Inc.), p3'SS, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo и pOG44 (Stratagene, Inc.) и pYES2, pAC360, pBlueBa-cHis А, В и С, pVL1392, pBlueBac111, pCDM8, pcDNA1, pZeoSV, pcDNA3 pREP4, pCEP4 и pEBVHis (Invitrogen, Corp.) и их варианты и производные. Другие векторы включают pUC18, pUC19, pBlueScript, pSPORT, космиды, фагмиды, YAC (искусственные хромосомы дрожжей), ВАС (искусственные хромосомы бактерий), Р1 (фаг Escherichia coli), pQE70, pQE60, pQE9 (quagan), векторы pBS, векторы PhageScript, векторы BlueScript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene), pcDNA3 (Invitrogen), pGEX, pTrsfus, pTrc99A, pET-5, pET-9, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pSPORT1, pSPORT2, pCMVSPORT2.0 и pSYSPORT1 (Invitrogen) и их варианты и производные. Дополнительные представляющие интерес векторы также могут включать pTrxFus, pThioHis, pLEX, pTrcHis, pTrcHis2, pRSET, pBlueBa-cHis2, pcDNA3.1/His, pcDNA3.1(-)/Myc-His, pSecTag, pEBVHis, pPIC9K, pPIC3.5K, pA081S, pPICZ, pPICZA, pPICZB, pPICZC, pGAPZA, pGAPZB, pGAPZC, pBIue-Bac4.5, pBlueBacHis2, pMelBac, pSinRep5, pSinHis, pIND, pIND(SP1), pVgRXR, pcDNA2.1, pYES2, pZEr01.1, pZErO-2.1, pCR-Blunt, pSE280, pSE380, pSE420, pVL1392, pVL1393, pCDM8, pcDNA1.1, pcDNA1.1/Amp, pcDNA3.1, pcDNA3.1/Zeo, pSe, SV2, pRc/CMV2, pRc/ RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREP 10, pCEP4, pEBVHis, pCR3.1, pCR2.1, pCR3.1-Uni и pCRBac от компании Invitrogen; X ExCell, X gt11, pTrc99A, pKK223-3, pGEX-1X T, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, pGEX-4T-3, pGEX-3X, pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, pKK232-8, pSL1180, pNEO и pUC4K от компании Pharmacia; pSCREEN-lb(+), pT7Blue(R), pT7Blue-2, pCITE-4-abc(+), pOCUS-2, pTAg, pET-32L1C, pET-30LIC, pBAC-2 cp LIC, pBACgus-2 cp LIC, pT7Blue-2 LIC, pT7Blue-2, X SCREEN-1, X BlueSTAR, pET-3abcd, pET-7abc, pET9abcd, pET11 abcd, pET12abc, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b-pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21abcd(+), pET-22b(+), pET-23abcd(+), pET-24abcd (+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28abc(+), pET-29abc(+), pET-30abc(+), pET-31b(+), pET-32abc(+), pET-33b(+), pBAC-1, pBACgus-1, pBAC4x-1, pBACgus4x-1, pBAC-3 cp, pBACgus-2 cp, pBACsurf-1, pig, Signal pig, pYX, Selecta Vecta-Neo, Selecta Vecta-Hyg и Selecta Vecta-Gpt от компании Novagen; pLexA, pB42AD, pGBT9, pAS2-1, pGAD424, pACT2, pGAD GL, pGAD GH, pGADIO, pGilda, pEZM3, pEGFP, pEGFP-1, pEGFPN, pEGFP-C.

[0184] pEBFP, pGFPuv, pGFP, p6xHis-GFP, pSEAP2-Basic, pSEAP2-Contral, pSEAP2-промотор, pSEAP2-энхансер, p I3gal-Basic, pl3gal-Control, p I3gal-промотор, p I3gal-энхансер, pCMV, pTet-Off, pTet-On, pTK-Hyg, pRetro-Off, pRetro-On, pIRESlneo, pIRES1hyg, pLXSN, pLNCX, pLAPSN, pMAMneo, pMAMneo-CAT, pMAMneo-LUC, pPUR, pSV2neo, pYEX4T-1/2/3, pYEX-S1, pBacPAK-His, pBacPAK8/9, pAcUW31, BacPAK6, pTriplEx, 2Xgt10, Xgt11, pWE15 и X TriplEx от компании Clontech; Lambda ZAP II, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II KS+/-, pBluescript II SK+/-, pAD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pSurfscript, Lambda FIX II, Lambda DASH, Lambda EMBL3, Lambda EMBL4, SuperCos, pCR-Scrigt Amp, pCR-Script Cam, pCR-Script Direct, pBS+/-, pBC KS+/-, pBC SK+/, Phag-escript, pCAL-n-EK, pCAL-n, pCAL-c, pCAL-kc, pET-3abcd, pET-llabcd, pSPUTK, pESP-1, pCMVLaI, pOPRSVI/MCS, pOPI3 CAT, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, pMClneo Poly A, pOG44, pOG45, pFRTI3AL, pNE0I3GAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415 и pRS416 от компании Stratagene, pPC86, pDBLeu, pDBTrp, pPC97, p2.5, pGAD1-3, pGAD10, pACt, pACT2, pGADGL, pGADGH, pAS2-1, pGAD424, pGBT8, pGBT9, pGAD-GAL4, pLexA, pBD-GAL4, pHISi, pHISi-1, placZi, pB42AD, pDG202, pJK202, pJG4-5, pNLexA, pYESTrp и их варианты и производные.

Показания к терапии

[0185] В настоящем документе предложены способы и композиции для улучшения васкулогенеза у субъекта. Также предложены способы и композиции для лечения сердечнососудистых заболеваний. В некоторых случаях сердечно-сосудистое заболевание может представлять собой кардиомиопатию. Кардиомиопатию можно определить по патологически аномальному миокарду. Существует четыре основных типа классификации кардиомиопатии: дилатационная (DCM), гипертрофическая (НСМ), рестриктивная (RCM) и аритмогенная RV (ARVC). Векторы, содержащие описанные в настоящем документе полинуклеотиды, можно применять для лечения кардиомиопатии с применением генной терапии. В некоторых случаях по меньшей мере одну дополнительную терапию также вводят до, во время, после лечения генной терапией или при любой такой комбинации.

[0186] В некоторых случаях полипептид можно включить в описанную в настоящем документе полинуклеотидную последовательность и вводить субъекту с нарушением или субъекту, нуждающемуся в улучшенном васкулогенезе. Например, у субъекта может быть кардиомиопатия, и он может получать лечение путем введения описанного в настоящем документе полинуклеотида для лечения указанного нарушения. В некоторых случаях полинуклеотид, кодирующий ген, или полипептид, описанный в настоящем документе, можно вводить при помощи генной терапии. Гены и полипептиды, которые могут быть введены субъекту с кардиомиопатией, могут включать, например: член 9 АТФ-связывающей кассеты подсемейства С (АВСС9), α-актин сердечной мышцы 1 (ACTC1), α-актинин 2 (ACTN2), домен анкинирового повтора 1 (сердечная мышца) (ANKRD1), BCL2-ассоциированный атаноген 3 (BAG3), калсеквестрин 2 (сердечная мышца) (CASQ2), кавеолин 3 (CAV3), гомолог СОХ15, белок сборки цитохром с-оксидазы (СОХ 15), богатый α-В-кристаллином, цистеином и глицином белок 3 (CRYAB), богатый цистеином и глицином белок 3 (CSRP3), кардиотрофин 1 (CTF1), десмин (DES), дистрофии (DMD), гомолог DnaJ (Hsp40), подсемейство С, член 19 (DNAJC19), десмоколлин 2 (DSC2), десмоглиин 2 (DSG2), десмоплакин (DSP), дистробревин α (DTNA), эмерин (EMD), гомолог отсутствия глаз 4 (EYA4), четыре с половиной домена LIM 2 (FHL2), фукутин (FKTN), Forkhead box D4 (FOXD4), галактозидазу-α (GLA), соединительный плакоглобин (JUP), ламинин-α4 (LAMA4), белок лизосомальной мембраны 2 (LAMP2), связывающий LIM-домен белок 3 (LDB3), ламин А/С (LMNA), миозинсвязывающий белок С, кардиальный белок (MYBPC3), а-тяжелую цепь миозина 6 сердечной мышцы (MYH6), α-тяжелую цепь миозина 7 сердечной мышцы (MYH7), регуляторную легкую цепь миозина 2 медленной сердечной мышцы (MYH12), щелочную легкую цепь миозина 3 медленной скелетной и желудочковой мышцы (MYL3), киназу легкой цепи моизина 2 (MYLK2), миозенин 2 (MYOZ2), нексилин (F-актинсвязывающий белок) (NEXN), плакофилин 2 (PKP2), фосфоламбан (PLN), некаталитическую субъединицу γ2 АМФ-активируемой протеинкиназы (PREN), пресенилин 1 (PSEN2), пресенилин 2 (PSEN2), протеин 20 (RBM20), РНК-связывающий мотив белка 20 (RBM20), рианодиновый рецептор 2 (сердечный) (RYR2), α-субъединицу потенциалзависимого натриевого канала V-типа (SCN5A), субъединицу А фловопротеина сукцинатдегидрогеназного комплекса (SDHA), саркогликан δ (SGCD), белок ядерной оболочки 1, содержащий спектриновые повторы (SYNE 1), белок ядерной оболочки 2, содержащий спектриновые повторы (SYNE2), тафазин (TAZ), Titin-кэп (телетонин) (ТСАР), трансмембранный белок 43 (TMEM43), тимопоэтин (ТМРО), тропонин С 1 типа (медленный) (TNNC1), тропонин I 3 типа (сердечный) (TNNi3), тропонин Т типа 2 (сердечный) (TNNT2), (α)титин тропомиозина 1 (TPM1), транстиретин (TTR), титан (TTN), винкулин (VCL) и любые их комбинации частей. Полипептиды или ген, которые могут быть введены для лечения сердечно-сосудистого заболевания и/или улучшенного васкулогенеза, могут представлять собой VEGF, SDF1, S100A1 или их участки или комбинации.

[0187] В настоящем документе представлены полинуклеотидные конструкции, содержащие функциональные полипептиды, соединенные при помощи описанной в настоящем документе линкерной конструкции. Также предложены способы для лечения, диагностики и других терапевтических целей, включающие применение или введение субъекту полинуклеотида, описанного в настоящем документе, или полипептида, им кодируемого, или его конъюгатов или производных. Описанные способы и композиции можно применять для лечения заболеваний и состояний. Пример состояния может представлять собой рак. Рак или злокачественные опухоли могут включать, но не ограничиваться ими: острый лимфобластный лейкоз у детей, острый лимфобластный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, адренокортикальный рак, (первичный) гепатоцеллюлярный рак у взрослых, (первичный) рак печени у взрослых, острый лимфоцитарный лейкоз у взрослых, острый миелоидный лейкоз у взрослых, лимфому Ходжкина у взрослых, лимфоцитарный лейкоз у взрослых, неходжкинскую лимфому у взрослых, первичный рак печени у взрослых, саркому мягких тканей у взрослых, связанную с СПИДом лимфому, связанные с СПИДом злокачественные опухоли, анальный рак, астроцитому, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак кости, глиому ствола головного мозга, опухоли головного мозга, рак молочной железы, рак почечной лоханки и мочеточника, лимфому (первичную) центральной нервной системы, лимфому центральной нервной системы, астроцитому мозжечка, церебральную астроцитому, рак шейки матки, (первичный) гепатоцеллюлярный рак у детей, (первичный) рак печени у детей, острый лимфобластный лейкоз у детей, острый миелоидный лейкоз у детей, глиому ствола головного мозга у детей, астроцитому мозжечка у детей, церебральную астроцитому у детей, экстракраниальные эмбрионально-клеточные опухоли у детей, болезнь Ходжкина у детей, Ходжкинскую лимфому у детей, гипоталамическую глиому и глиому зрительного пути у детей, лимфобластный лейкоз у детей, медуллобластому у детей, неходжкинскую лимфому у детей, пинеальные и супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли у детей, первичный рак печени у детей, рабдомиосаркому у детей, саркому мягкой ткани у детей, глиому зрительного пути и гипоталамическую глиому у детей, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, рак толстой кишки, кожную Т-клеточную лимфому, карциному островковых клеток эндокринной части поджелудочной железы, рак эндометрия, эпендимому, эпителиальный рак, рак пищевода, саркому Юинга и связанные с ней опухоли, рак экзокринной части поджелудочной железы, экстракраниальную эмбрионально-клеточную опухоль, внегонадную эмбрионально-клеточную опухоль, внепеченочный рак желчных протоков, рак глаз, рак груди у женщин, болезнь Гоше, рак желчного пузыря, рак желудка, желудочно-кишечную карциноидную опухоль, желудочно-кишечные опухоли, эмбрионально-клеточные опухоли, гестационную трофобластическую опухоль, волосатоклеточный лейкоз, рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак, лимфому Ходжкина, гипергаммаглобулинемию, гипофарингеальный рак, раки кишечника, внутриглазную меланому, рак островковых клеток, рак островковых клеток поджелудочной железы, саркому Капоши, рак почек, рак гортани, рак губной и ротовой полости, рак печени, рак легких, лимфопролиферативные нарушения, макроглобулинемию, рак груди у мужчин, злокачественную мезотелиому, злокачественную тимому, медуллобластому, меланому, мезотелиому, метастатический оккультный первичный плоскоклеточный рак шеи, метастатический первичный плоскоклеточный рак шеи, метастатический плоскоклеточный рак шеи, множественную миелому, множественную миелому/плазмаклеточную опухоль, миелодисплатический синдром, миелогенный лейкоз, миелоидный лейкоз, миелопролиферативные нарушения, рак полости носа и рак параназального синуса, рак носоглотки, нейробластому, неходжкинскую лимфому, немеланомный рак кожи, немелкоклеточный рак легкого, оккультный первичный метастатический плоскоклеточный рак, рак носоглотки, остео-/злокачественную фиброзную саркому, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому кости, рак эпителия яичников, эмбрионально-клеточную опухоль яичника, опухоль яичника с низким потенциалом злокачественности, рак поджелудочной железы, парапротеинемии, истинную полицитемию, рак паращитовидной железы, рак полового члена, феохромоцитому, опухоль гипофиза, первичную лимфому центральной нервной системы, первичный рак печени, рак предстательной железы, рак прямой кишки, почечно-клеточный рак, рак почечной лоханки и мочеточника, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак слюнных желез, саркоидные саркомы, синдром сезари, рак кожи, мелкоклеточный рак легкого, рак тонкой кишки, саркому мягких тканей, плоскоклеточный рак шеи, рак желудка, супратенториальные примитивные нейроэктодермальные и пинеальные опухоли, Т-клеточную лимфому, рак яичек, тимому, рак щитовидной железы, переходно-клеточный рак эпителия почечной лоханки и мочеточника, трофобластические опухоли, рак клеток мочеточника и почечной лоханки, рак уретры, рак матки, саркому матки, рак влагалища, гипоталамическую глиому и глиому зрительного пути, рак вульвы, макроглобулинемию Вальденстрема, опухоль Вильмса и любое другое гиперпролиферативное заболевание помимо неоплазии, локализованное в системе органов, перечисленных выше.

[0188] Функциональные полипептиды, соединенные при помощи описанного в настоящем документе линкерного полипептида, могут быть подходящими в описанных в настоящем документе способах и композициях, и их можно применять для лечения злокачественных или предраковых состояний и для предотвращения прогрессирования в неопластическое или злокачественное состояние, включая, но не ограничиваясь ими, описанные выше нарушения. Такие применения показаны для лечения при известных или предполагемых состояниях, предшествующих прогрессированию до неоплазии или рака, в частности, в случае, когда происходит рост неопухолевых клеток, состоящий из гиперплазии, метаплазии или, в частности, дисплазии. Зачастую дисплазия может быть предвестником рака и обнаруживается главным образом в эпителии. Это самая хаотичная форма роста неопухолевых клеток, связанная с потерей однородности в индивидуальной клетке и архитектурной ориентации клеток. Дисплазия характерно возникает там, где существует хроническое раздражение или воспаление. Диспластические расстройства, которые можно лечить, включают, но не ограничиваются ими, ангидродермическую эктодермальную дисплазию, передне-фациальную дисплазию, асфиксическую торакальную дисплазию, атриодигитальную дисплазию, бронхолегочную дисплазию, дисплазию головного мозга, дисплазию шейки матки, дисплазию хондроэктодермальной области, клейдокраниальную дисплазию, врожденную эктодермальную дисплазию, кранио-диафизарную дисплазию, кранио-карпотарзальную дисплазию, кранио-матафизарную дисплазию, дентинную дисплазию, диафизарную дисплазию, эктодермальную дисплазию, дисплазию эмали, энцефало-офтальмологическую дисплазию, гемимелическую эпифазарную дисплазию, множественную эпифазарную дисплазию, эпифазарную дисплазию сетчатки, эпителиальную дисплазию, лице-генитальную дисплазию, семейную фиброзную дисплазию челюстей, семейную дисплазию white folded, фиброзно-мышечную дисплазию, фиброзную дисплазию кости, цементную дисплазию, наследственную дисплазию почек и сетчатки, гидродинамическую этодермальную дисплазию, гипогидротическую эктодермальную дисплазию, лимфопеническую дисплазию тимуса, дисплазию молочных желез, челюстно-лицевую дисплазию, метафизическую дисплазию, дисплазию Мондини, моностатическую фиброзную дисплазию, мукоэпителиальную дисплазию, множественную эпифизарную дисплазию, окулоаурикуловертебральную дисплазию, окулодентодигитальную дисплазию, окуловертебральную дисплазию, одонтогенную дисплазию, офтальмомандибуломическую дисплазию, периапикальную цементную дисплазию, полиостотическую фиброзную дисплазию, псевдоахондропластическую спондилоэпифизарную дисплазию, дисплазию сетчатки, септо-оптическую дисплазию, спондилоэпифизарную дисплазию и вентрикулорадиальную дисплазию. Дополнительные преднеопластические расстройства, которые можно лечить, включают, но не ограничиваются ими, доброкачественные диспролиферативные расстройства (например, доброкачественные опухоли, фиброзно-кистозные состояния, гипертрофию тканей, кишечные полипы или аденомы и дисплазию пищевода), лейкоплакию, кератозы, болезнь Боуэна, ромбовидную кожу шеи («кожу крестьянина»), солнечный хейлит и солнечный кератоз. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения полипептидную конструкцию, кодируемую описанным в настоящем документе полинуклеотидом, содержащую по меньшей мере два функциональных полипептида, соединенных описанным в настоящем документе линкером, применяют для ингибирования роста, прогрессирования и/или метастазирования рака, в частности тех видов рака, которые перечислены выше. Дополнительные гиперпролиферативные заболевания, нарушения и/или состояния включают, но не ограничиваются, прогрессирование и/или метастазы злокачественных новообразований и связанных с ними нарушений, таких как лейкоз (включая острый лейкоз (например, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз (включая миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный и эритролейкозный)) и хронические лейкозы (например, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз)), полицитемия, лимфомы (например, болезнь Ходжкина и неходжкинская болезнь), множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, заболевание тяжелой цепи и солидные опухоли, включая, но не ограничиваясь ими, саркомы и карциномы, такие как фибросаркома, миосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак груди, рак яичников, рак предстательной железы, плоскоклеточная карцинома, базальноклеточный рак, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальных желез, папиллярная карцинома, папиллярная аденокарцинома, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенная карцинома, карцинома почек, гепатома, карцинома желчных протоков, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильма, рак шейки матки, опухоль яичков, карцинома легкгих, плоскоклеточная карцинома легких, карцинома мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, эмангиобластома, акустическая неврома, олигодендроглиома, менингиома, меланома, нейробластома и ретинобластома.

[0189] В некоторых вариантах реализации полипептидную конструкцию, кодируемую описанным в настоящем документе полинуклеотидом, содержащую по меньшей мере два функциональных полипептида, соединенных описанным в настоящем документе линкером, применяют для лечения заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, болезнь иммунной дисрегуляции и связанные с ней аутоиммунные заболевания, включая аутоиммунные заболевания класса III, такие как иммуно-опосредованные тромбоцитопении, такие как острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, дерматомиозит, синдром Шегрена, множественный склероз, хорею Сиденхама, миастению гравис, системную красную волчанку, волчаночный нефрит, ревматическую лихорадку, полиглоточные синдромы, буллезный пемфигоид, сахарный диабет, пурпуру Хенох-Шонлейна, пост-стрептококковый нефрит, узловатую эритему, артериит Такаясу, болезнь Аддисона, ревматоидный артрит, саркоидоз, язвенный колит, мультиформную эритему, IgA нефропатию, узелковый полиартериит, анкилозирующий спондилит, синдром Гудпасчера, облитерирующий тромбангинит, синдром Шегрена, первичный билиарный цирроз, тиреоидит Хашимото, тиреотоксикоз, склеродермию, хронический активный гепатит, ревматоидный артрит, полимиозит/дерматомиозит, полихондрит, вульгарную пузырчатку, гранулематоз Вегенера, мембранную нефропатию, боковой амиотрофический склероз, сухотку спинного мозга, гигантоклеточный артериит/полимиалгию, пернициозную анемию, быстро прогрессирующий гломерулонефрит и фиброзный альвеолит, а также ювенильный диабет.

[0190] В некоторых вариантах реализации полипептидную конструкцию, кодируемую описанным в настоящем документе полинуклеотидом, содержащую по меньшей мере два функциональных полипептида, соединенных описанным в настоящем документе линкером, применяют для лечения инфекционных заболеваний. Инфекционные заболевания могут представлять собой инфекции, вызываемые патогенами, такими как бактерии, риккетсии, микоплазма, простейшие, грибы, вирусы, паразиты или другие микробные агенты. Примеры включают вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающий СПИД, микобактерии туберкулеза, Streptococcus agalactiae, устойчивые к метициллину Staphylococcus aureus, Legionella pneumophilia, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Pneumococcus, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Hemophilis influenzae B, Treponema pallidum, спирохеты болезни Лайма, вирус Западного Нила, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium leprae, Brucella abortus, вирус бешенства, вирус гриппа, цитомегаловирус, вирус простого герпеса I, вирус простого герпеса II, парвоподобный вирус сыворотки крови человека, респираторно-синцитиальный вирус, вирус ветряной оспы, вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирус кори, аденовирус, вирусы лейкоза Т-клеток человека, вирус Эпштейна-Барра, вирус лейкоза грызунов, вирус свинки, вирус везикулярного стоматита, вирус Синдбис, вирус лимфоцитарного хориоменингита, вирус бородавок, вирус голубого языка, вирус Сендай, вирус лейкоза кошачьих, рео-вирус, вирус полиомиелита, вирус обезьян 40, вирус опухоли молочной железы мыши, вирус лихорадки денге, вирус краснухи, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii, Trypanosoma rangeli, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rhodesiensei, Trypanosoma brucei, Schistosoma mansoni, Schistosoma japanicum, Babesia bovis, Elmeria tenella, Onchocerca volvulus, Leishmania tropica, Trichinella spiralis, Theileria parva, Taenia hydatigena, Taenia ovis, Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Mesocestoides corti, Mycoplasma arthritidis, M. hyorhinis, M. orale, M. arginini, Acholeplasma laidlawii, M. salivarium и M. pneumoniae.

[0191] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения полипептидную конструкцию, кодируемую описанным в настоящем документе полинуклеотидом, содержащую по меньшей мере два функциональных полипептида, соединенных описанным в настоящем документе линкером, применяют при конъюгации с химиотерапевтическим агентом или в дополнение к химиотерапевтическому агенту, или одновременно с ним. В контексте настоящего описания «химиотерапевтический агент» или «химиотерапевтическое соединение» и их грамматические эквиваленты могут представлять собой химической соединение, подходящее для лечения рака.

[0192] Гены и полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, подходящими для генной терапии, можно вводить субъекту последовательно, одновременно или их можно вводить при таких комбинациях. Гены и полипептиды, вводимые субъекту, могут располагаться на одном полинуклеотидном векторе или на отдельных полинуклеотидных векторах. В некоторых случаях полигенный вектор применяется для введения нескольких генов с применением одной векторной конструкции.

Полипептидные конструкции, кодируемые описанными в настоящем документе полинуклеотидами:

[0193] Полинуклеотидные конструкции, описанные в настоящем документе, можно использовать для лечения сердечно-сосудистых заболеваний и/или улучшения васкулогенеза у субъекта. Например, молекулярной мишенью для сердечно-сосудистой терапии могут быть VEGF-A, FGF4, саркоплазматическая Са²⁺-АТФаза, S100A1, бета-адренергический рецептор, аденилил-циаклаза 6 или их комбинации. В некоторых случаях гены, вводимые для генной терапии сердечно-сосудистой системы, могут представлять собой гены SDF1, S100A1, VEGF191 или любую их комбинацию.

[0194] S100 является частью семейства Саβ+-модулированных белков, участвующих в регуляторной активности внутри клетки. S100A1 в сердце может выступать в качестве самой распространенной изоформы белка S100. Он может способствовать сократительной функции сердца, а также сердечной релаксации, усиливая активность как рианодиновых рецепторов (RYR), так и SERCA2a.

[0195] S100 может оказывать глубокие ионотропные действия через модуляцию гомеостаза ионов Са²⁺ в кардиомиоцитах и функции миофиламентов вне зависимости от бета-адренергической стимуляции. S100A1 может взаимодействовать Са²⁺-зависимым образом с RyR, и он стабилизирует комплекс SERCA2a-PLN. S100A1 также может уменьшать диастолическую утечку Са²⁺, и он влияет на сердечный титин и митохондриальную F1-АТФазу.

[0196] В некоторых вариантах реализации ангиогенный полипептид или ген можно использовать для терапии сердечно-сосудистой системы или для улучшения васкулогенеза, как это описано в настоящем документе, путем введения полинуклеотидов, кодирующих ангиогенные факторы роста, такие как VEGF-A165, ангиополиты, FGF, 126, HIF-1a26 или их комбинации. Эти полипептиды могут способствовать развитию коллатеральных кровеносных сосудов при связанных с ишемией заболеваниях, таких как хроническая критическая ишемия конечностей, ишемия миокарда, стенокардия или окклюзионное заболевание периферических артерий. Ангиогенные факторы также могут индуцировать образование новых сосудистых сетей, которые могут сделать их подходящими терапевтическими вариантами лечения острых коронарных синдромов и заболеваний периферических сосудов. Несколько типов ангиогенных факторов могут проявлять различные свойства, что было исследовано при их применениях в терапевтических целях, направленных на лечение сердечно-сосудистых заболеваний. Например, можно применять VEGF и подтипы VEGF. Подтипы VEGF могут включать: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, плацентарный фактор роста (PlGF) и их комбинации. Некоторые из этих факторов также образуют различимые изоформы. Внутриклеточные сигналы указанных подтипов VEGF могут быть опосредованы в основном тремя различными тирозинкиназными рецепторами: VEGFR1, VEGFR2 и VEGFR3. Конкретное взаимодействие между этими подтипами VEGF и их родственными клеточными рецепторами может вызывать дифференциальный клеточный ответ в эндотелиальных клетках и кардиомиоцитах. В некоторых случаях изоформа VEGF-A, VEGF-A165, может обладать высокой ангиогенностью. VEGF-A165 может взаимодействовать с VEGFR1 и VEGFR2. Взаимодействие VEGF-A165 с VEGFR1 на поверхности эндотелиальных клеток может способствовать устойчивости сосудов в новообразованных сосудов. Его взаимодействие с VEGFR2 на поверхности эндотелиальных клеток может индуцировать ангиогенез, васкулогенез и артериогенез, вазодилатацию, выживание клеток и увеличение проницаемости клеток. Активация VEGFR2 в новообразованных кардиомиоцитах может повышать экспрессию антиапоптотических белков и уменьшать экспрессию проапоптотических белков. В некоторых случаях активация VEGFR2 может индуцировать рекрутинг резидентных стволовых клеток сердца в ишемических областях.

[0197] Проангиогенный фактор или ген может экспрессироваться в векторе согласно настоящему изобретению. Например, проангиогенный фактор может представлять собой VEGF, основной фактор роста фибробластов (bFGF) или трансформирующий фактор роста β-1 (TGFβ-1), кислый фактор роста фибробластов, ангиогенин, фактор роста гепатоцитов, интерлейкин-8, плацентарный фактор роста, фактор роста тромбоцитов, плейотропин, пролиферин, фактор некроза опухоли альфа и любую их комбинацию.

[0198] В некоторых случаях кардиальные эффекторные гены или полипептиды, применяемые и включенные в векторы для экспрессии в сердце (кардиальные векторы) согласно настоящему изобретению, можно выбрать из любого одного, как например, SDF1, S100A1 и VEGF191. В некоторых случаях вектор для экспрессии в сердце согласно настоящему изобретению содержит или состоит из любых двух генов, выбранных из SDF1, S100A1 и VEGF191, в любой комбинации их последовательного порядка на векторе. В определенных вариантах реализации вектор для экспрессии в сердце содержит полинуклеотид, кодирующий SDF1, S100A1 и VEGF191, в любой комбинации их последовательного порядка на векторе.

[0199] В определенных вариантах реализации кодирующая SDF1 последовательность содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид SDF1. В определенных вариантах реализации указанный полипептид последовательность SDF1 по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №102. В определенных случаях кодирующая SDF1 последовательность содержит кодон-оптимизированную открытую рамку считывания SDF1 (ОРС), соответствующую SEQ ID №103.

[0200] В определенных вариантах реализации последовательность полинуклеотида, кодирующего SDF1, по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №103.

[0201] В определенных случаях кодирующая S100A1 последовательность содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид S100A1. В определенных вариантах реализации последовательность полипептида S100A1 по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №104. В определенных вариантах реализации кодирующая S100A1 последовательность содержит или состоит из открытой рамки считывания S100A1 (ОРС). В определенных случаях последовательность кодирующего S100A1 полинуклеотида по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №105.

[0202] В определенных вариантах реализации кодирующая VEGF191 последовательность может содержать последовательность полинуклеотида, кодирующего полипептид VEGF191. В определенных вариантах реализации последовательность полипептида VEGF191 по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №106.

[0203] В определенных случаях кодирующая VEGF191 последовательность может содержать открытую рамку считывания VEGF191 (ОРС). В определенных вариантах реализации последовательность полинуклеотида, кодирующая VEGF191, по меньшей мере на 45%, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №107.

Фармацевтические композиции и составы:

[0204] Композиции, описанные в настоящем документе, можно ввести в состав фармацевтического лекарственного средства, и их можно применять для лечения человека или млекопитающего, нуждающегося в этом, у которого диагностировано заболевание, например, сердечно-сосудистое заболевание. В некоторых вариантах реализации композиции, описанные в настоящем документе, используются для терапии сердечнососудистой системы или для улучшения васкулогенеза, как это описано в настоящем документе. Эти лекарственные средства можно вводить совместно при помощи по меньшей мере одного вектора.

[0205] Векторы, содержащие описанные в настоящем документе полинуклеотиды, включают вирусные и невирусные векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие сконструированные молекулы CRISPR, TALEN, Argonaut, молекулы на основе транспозона, ZEN, мегануклеазы или Mega-TAL, транспозоны и/или трансгены также можно вводить непосредственно в организм для трансфекции или трансдукции клеток in vivo.

В альтернативном варианте можно вводить «оголенную» ДНК или мРНК, содержащие полинуклеотиды, описанные в настоящем документе. Введение осуществляют любым путем, обычно применяемом для приведения молекулы в непосредственный контакт с клетками крови или тканевыми клетками, включая, но не ограничиваясь ими, инъекцию, инфузию, местное нанесение и электропорацию. Для введения конкретной композиции можно применять более одного пути. Конкретная композиция для введения частично определяет выбор фармацевтически приемлемых носителей, также как и конкретный способ, применяемый для введения указанной композиции.

[0206] В некоторых случаях векторы, содержащие описанные в настоящем документе полинуклеотиды, можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, в сочетании с препаратами для вторичной терапии или отдельно от них. Вторичная терапия может быть представлена агентами для улучшенного васкулогенеза, легочной гипертензии, антагонистами альдостероновых рецепторов, ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента, блокаторами рецепторов ангиотензина, блокаторами рецепторов ангиотензина и ингибиторами неприлизина, антиадренергическими агентами, центрально действующими антиадренергическими агентами, периферийно действующими антиангинальными агентами, антиаритмическими агентами, антиаритмическими агентами группы I, антиаритмическими агентами группы II, антиаритмическими агентами группы III, антиаритмическими агентами группы IV, антиаритмическими агентами группы V, антихолинергическими хронотропными агентами, комбинациями антигипертензивных препаратов, АПФ-ингибиторами с блокирующими агентами кальциевых каналов, АПФ-ингибиторами с тиазидами, ингибиторами ангиотензина II с блокаторами кальциевых каналов, ингибиторами ангиотензина II с тиазидами, антиадренергическими агентами (центральными) с тиазидами, антиадренергическими агентами (периферическими) с тиазидами, бета-блокаторами с тиазидами, калийсберегающими диуретиками с тиазидами, бета-адренергическими блокирующими агентами, кардиоселективными бета-блокаторами, некардиоселективными бета-блокаторами, блокирующими кальциевые каналы агентами, катехоламинами, диуретиками, ингибиторами карбоангидразы, петлевыми диуретиками, калийсберегающими диуретиками, тиазидными диуретиками, инотропными агентами, периферическими сосудорасширяющими средствами, ингибиторами ренина, склерозирующими агентами, сосудорасширяющими средствами, антагонистами вазопрессина, вазопрессорами.

[0207] Антиангиогенные агенты также могут быть использованы в сочетании с описанными в настоящем документе полинуклеотидами. Подходящие антиангиогенные агенты для применения в описанных способах и композициях включают антитела против VEGF, включая гуманизированные и химерные антитела, анти-VEGF аптамеры и антисмысловые олигонуклеотиды. В некоторых случаях, например, в композициях, составах и способах лечения рака, единица дозирования вводимой композиции или состава может составлять 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мг.

[0208] Другие ингибиторы ангиогенеза включают ангиостатин, эндостатин, интерфероны, интерлейкин 1 (включая α и β) интерлейкин 12, ретиноевую кислоту и тканевые ингибиторы металлопротеиназы-1 и -2. (TIMP-1 и -2). Также можно применять низкомолекулярные вещества, включая топоизомеразы, такие как разоксан, ингибитор топоизомеразы II с антиангиогенной активностью.

[0209] В некоторых случаях, например, в композициях, составах и способах лечения рака единица дозирования вводимой композиции или состава может составлять 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мг. В некоторых случаях общее количество вводимой композиции или состава может составлять 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 г.

Способы и показания

[0210] Векторы, содержащие полинуклеотиды, описанные в настоящем документе, можно сконструировать и ввести субъекту, как это описано в настоящем документе. Эти векторы можно применять для генной терапии. Эти векторы можно применять для лечения заболевания у реципиента (например, человека). Например, полинуклеотиды, описанные в настоящем документе, и/или полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, описанными в настоящем документе, можно вводить субъекту для лечения сердечно-сосудистого заболевания или улучшения васкулогенеза у указанного субъекта. Субъект, получивший лечение способом, описанным в настоящем документе, или путем приведения в контакт с композицией или введения композиции, описанной в настоящем документе, может представлять собой млекопитающее, которое может быть человеком, приматом, не являющимся человеком, млекопитающим из семейства псовых, млекопитающим из семейства кошачьих или другим млекопитающим.

[0211] В настоящем документе описан способ лечения заболевания (например, сердечнососудистого заболевания) у реципиента, включающий введение по меньшей мере одного вектора, содержащего по меньшей мере один полинуклеотид, описанный в настоящем документе, субъекту с сердечно-сосудистым заболеванием. В некоторых случаях вектор вводят в клетку.

[0212] В некоторых случаях сердечно-сосудистые заболевания могут представлять собой кардиомиопатию. Кардиомиопатию можно определить по патологически аномальному миокарду. Существует четыре основных типа классификации кардиомиопатии: дилатационная (DCM), гипертрофическая (НСМ), рестриктивная (RCM) и аритмогенная кардиомиопатия правого желудочка (ARVC). Кардиомиопатию можно диагностировать методами визуализации in vivo либо с применением эхокардиографии или, что все более чаще, с помощью МРТ сердца. DCM может относиться к увеличению сердца, что часто затрагивает все четыре камеры, особенно на поздней стадии развития заболевания. Чаще всего DCM может быть ассоциирована с пониженной функцией ЛЖ или систолической функцией, хотя в начале заболевания ЛЖ может быть дилатированным и быть только с минимально пониженной функцией. Напротив, НСМ может характеризоваться увеличением толщины стенки ЛЖ, часто в отношении перегородки, которая отделяет ЛЖ от ПЖ. В некоторых случаях RCM может и не определяться, отчасти потому, что сердце может оказаться морфологически близким к нормальному, с незначительной увеличенной толщиной стенки или умеренно сниженной фракцией выброса ЛЖ. Инфильтративный процесс, лежащий в основе RCM, бывает трудно обнаружить in vivo даже при применении самой чувствительной методик визуализации. RCM можно охарактеризовать как наносящее ущерб здоровью наполнение сердца, известное как диастолическая дисфункция, которая снижает сердечный выброс.ARVC можно охарактеризовать как снижение функции и истончение ПЖ с инфильтрацией фиброфитов, которая может наблюдаться при МРТ. В некоторых случаях пациента с кардиомиопатией можно лечить при помощи вектора согласно настоящему изобретению.

[0213] Предложенный в настоящем документе способ можно применять для лечения или предотвращения заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, рак, сердечнососудистые заболевания, заболевания легких, заболевания печени, кожные заболевания или неврологические заболевания. Предложенный в настоящем документе способ можно применять для улучшенного васкулогенеза у субъекта.

[0214] В контексте настоящего описания «улучшение» и его грамматические эквиваленты могут означать любое улучшение, признанное специалистом в данной области техники. Например, улучшение сердечно-сосудистого заболевания может означать ослабление аритмии, которая может включать уменьшение, ослабление или исчезновение нежелательного эффекта или симптома. В другом примере улучшение заболевания может означать ослабление нагрузки на опухоль, которая может включать уменьшение, ослабление или устранение нежелательного эффекта или симптома. Например, субъект, среди прочих улучшений, может испытывать уменьшение нагрузки на опухоль, продолжительную выживаемость, полную ремиссию, стабилизацию.

[0215] Еще одним признаком улучшения может быть количество дней, в течение которых субъект не нуждается в терапии. Например, после введения предложенного в настоящем документе лекарственного средства реципиент может не нуждаться в терапии по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более дней. Это может свидетельствовать о том, что лечение было успешным. Это также может свидетельствовать об отсутствии токсичности, ассоциированной с введением описанных в настоящем документе полинуклеотидов.

[0216] Субъект может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 1 дня. Реципиент также может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 7 дней. Реципиент может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 14 дней. Реципиент может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 21 дня. Реципиент может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 28 дней. Реципиент может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 60 дней. Кроме того, реципиент может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и более лет.

[0217] Другим признаком улучшения может быть количество дней, в течение которых реципиенту требуется восстановительная терапия. Например, после предложенного в настоящем документе лечения реципиенту может потребоваться назначение восстановительной терапии в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более дней. Это может свидетельствовать о том, что лечение было успешным.

[0218] Например, реципиенту может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 1 дня. Реципиенту также может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 7 дней. Реципиенту может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 14 дней. Реципиенту может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 21 дня. Реципиенту может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 28 дней. Реципиенту может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 60 дней. Кроме того, реципиенту может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более лет.

[0219] При лечении больных с сердечной недостаточностью чрескожная катетеризация коронарной артерии может представлять собой минимально инвазивную процедуру, которая может обеспечить доставку гомогенного гена в каждую область сердца. В некоторых случаях доставка генов может быть затруднена у пациентов с тяжелой формой заболевания коронарной артерии. Например, во время инфузии коронарной артерии вектор может быть введен в катетер без прерывания коронарного кровотока.

[0220] В некоторых случаях увеличенное время нахождения вектора в коронарном кровотоке можно обеспечить путем коронарной венозной блокады. Например, антеградная инфузия коронарной артерии с короткой окклюзией как коронарной артерии, так и коронарной вены, увеличила экспрессию гена в миокарде и может улучшить время нахождения вектора.

[0221] В других случаях для того, чтобы максимизировать длительность воздействия вектора на эндотелий с одновременной минимизацией системного распределения, можно применять подход с применением рециркуляции сердца. В этом случае экстракорпоральное устройство может откачивать кровь из коронарного синуса при помощи окклюзионного катетера и возвращать насыщенную кислородом коронарную венозную кровь в левую основную коронарную артерию через перистальтический насос (V-Focus; Osprey Medical Inc.). Используя этот способ, можно обеспечить селективное введение эндотелиальных пермеабилизирующих агентов без системных побочных эффектов.

[0222] В некоторых случаях эффективность трансфекции может коррелировать с коронарным кровотоком, а также временем воздействия и концентрацией вектора. Например, антеградная инфузия коронарной артерии, поддерживаемая увеличенным коронарным кровотоком, например, с применением внутриаортальной баллонной помпы, может улучшить перенос кардиального гена.

[0223] В некоторых случаях можно осуществить прямую инъекцию вектора в сердце. Вектор можно вводить эпикардиально или эндокардиально в целевую область. В некоторых случаях прямая инъекция может обойти эндотелиальный барьер. Это может привести к высокой локальной концентрации в месте инъекции. В некоторых случаях прямая инъекция позволяет избежать воздействия на циркулирующую кровь. В других случаях прямая инъекция вектора позволяет избежать дезактивации вектора циркулирующими ДНКазами или нейтрализующими антителами. Прямая инъекция вектора также может уменьшить воздействие вектора на нецелевые органы, хотя местное введение не позволяет полностью избежать некоторого системного распределения вектора. Низкие объемы при высоких концентрациях могут также увеличить удержание вектора в миокарде.

[0224] В некоторых случаях вектор можно вводить во время торакотомии. Вектор также можно водить перикардиально. В некоторых случаях вектор можно вводить с применением ретроградной перфузии, например, как это показано на ФИГ. 9.

[0225] После генной терапии трансфицированные клетки могут функционировать у реципиента. Функциональность в некоторых случаях позволяет определить, была ли генная терапия успешной. Например, трансфицированные клетки могут быть функциональными по меньшей мере в течение или по меньшей мере в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более дней. Это может свидетельствовать об успешной генной терапии. Это также может свидетельствовать об отсутствии отторжения указанных трансплантированных клеток или векторов.

[0226] В некоторых случаях трансфицированные клетки могут быть функциональными в течение по меньшей мере 1 дня. Трансфицированные клетки также могут быть функциональными в течение по меньшей мере 7 дней. Трансфицированные клетки также могут быть функциональными в течение по меньшей мере 14 дней. Трансфицированные клетки также могут быть функциональными в течение по меньшей мере 21 дня. Трансфицированные клетки также могут быть функциональными в течение по меньшей мере 28 дней. Трансфицированные клетки также могут быть функциональными в течение по меньшей мере 60 дней.

[0227] Ранее методы доставки терапевтических средств в сердце включали внутримиокардиальное введение (трансекардиально или трансэндокардиально) или антеградную доставку в коронарную артерию. Недостатком трансепикардиального пути является хирургическая инвазивность. Трансэндокардиальный подход требует сложного электромагнитного картирования с применением таких систем, как, например, устройство NOGA, которое нельзя применять у пациентов с истонченным миокардом, поскольку данный метод может вызвать перфорирование. Другие устройства, такие как Biocardia - инфузионный катетер Helical или Celyad-C-Cath, также имеют ограничение по применению из-за толщины стенки.

[0228] Антеградное введение в коронарную артерию ассоциируют с более низким биологическим удержанием [12] по сравнению с внутримиокардиальным введением. Кроме того, было показано, что введение биологических препаратов в коронарную артерию увеличивает риск развития коронарной эмболии и подъема сегмента ST [13] [14] [15] [16] [17]. Также при введении pDNA прямой контакт с большим объемом крови может уменьшить эффект перед проникновением в ткань-мишень.

Ретроградное введение

[0229] У людей коронарный синус выводит (drain) систему вен полостей желудочков, которые отвечают за большинство сердечных сокращений. Метод ретроградной доставки в коронарный синус широко применяют для введения кардиоплегического раствора, отчасти благодаря превосходному распределению указанного раствора по всему миокарду по сравнению с антеградной доставкой [18]. Кроме того, было продемонстрировано, что данная процедура является клинически безопасной для введения насыщенной кислородом крови во время чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики с высокой степенью риска [19] [20] [21]. Процесс ретроградного введения в коронарный синус включает временную окклюзию афферентного коронарного кровотока при помощи баллонного катетера с последующим введением в противоположном вытекающей крови направлении. Это приводит к тому, что указанный раствор поступает в миокард через посткапиллярные венулы. В отличие от артериолов или капилляров, посткапиллярные венулы имеют наименьший диаметр сосуда и теоретически позволяют обеспечить максимальную передачу материала в интерстиции [22]. С физиологической точки зрения известно, что посткапиллярные венулы являются основной мишенью миграции иммунной/воспалительной клетки через эндотелий, частично вследствие экспрессии молекул адгезии, таких как ELAM-1 [23], ICAM-1 [24], CD18 [25] и CD44 [26], и частично вследствие биомеханических свойств. Patel и др. продемонстрировали в испытании REVIVE, с применением того же катетера доставки, который предлагается и в этом доклиническом исследовании (Cook Regentec), что более 3 миллиардов зародышевых клеток можно безопасно доставить в объеме 60 см в коронарный синус пациентов с терминальной стадией ЗСН [27].

Генная терапия путем ретроградного введения

[0230] В нескольких исследованиях в области регенерации сердца успешно использовали ретроградное введение. Boekstegers и др. [32] доставляли аденовирус, экспрессирующий beta-gal и люциферазу, в миокард свиньи, сравнивая антеградную или ретроградную доставку в коронарную артерию через переднюю сердечную вену. Значительно повышенную экспрессию указанного гена в инфарктной ткани естественным образом наблюдали при применении ретроградного способа по сравнению с антеградным. Об аналогичных результатах сообщал Alino и др. [33], который наблюдал интерстициальную экспрессию eGFP в сердцах свиней, которых инъецировали ретроградным способом с «обнаженной» ДНК. В другом исследовании введение в организм свиней кодирующей beta-gal плазмиды с применением ретроградного способа приводило к более высокой экспрессии гена в миокарде по сравнению с антеградным и внутримышечным введением [34]. Такой превосходный уровень экспрессии генов по сравнению с внутримиокардиальной доставкой был воспроизведен и в других исследованиях [35]. Применение ретроградного введения также успешно осуществляли для доставки белковых терапевтических средств. Von Degenfeld и др. [36] сообщили об исследовании на свиньях, в котором ретроградное введение белка FGF-2 применялось для предотвращения экспериментально индуцированного стеноза. Уровни радиоактивно меченого FGF-2 в миокарде свиней, получавших лечение ретроградным способом, были почти в два раза выше, чем при использовании антеградной инфузии. Кроме того, сообщалось о значительном улучшении трансмурального кровотока и региональной функции миокарда при введении FGF-2 посредством ретроградного способа. Также сообщалось о безопасной ретроградной доставке pDNA SDN-1α у пациентов с сердечной недостаточностью (RETRO-HF).

[0231] Соответственно, предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения включает применение ретроградного введения через коронарный синус. Другой вариант реализации настоящего изобретения включает применение внутрикоронарных или внутримиокардиальных путей введения.

Доставка гена методом направленного разрушения микропузырьков ультразвуком (UTMD)

[0232] Наполненные газом микропузырьки являются подходящими ультразвуковыми контрастными агентами. В некоторых вариантах реализации микропузырьки применяют для доставки векторов, генов и/или конструкций, описанных в настоящем документе, в ткани и/или органы у субъекта [65]. В некоторых случаях доставка может быть орган- или тканеспецифичной. Микропузырьки колеблются при обработке их ультразвуком вблизи своей резонансной частоты. При более высоких энергиях ультразвука амплитуды колебаний увеличиваются, что приводит к разрушению микропузырьков. Это явление применяют для доставки вектора или композиции, описанных в настоящем документе, в орган-мишень, например, путем введения микропузырьков, нагруженных описанными в настоящем документе композициями или векторами для генной терапии, например, с помощью в.в. инъекции и последующего на них воздействия энергией ультразвука, приводящей к разрушению микропузырьков в участке-мишени.

[0233] В варианте реализации UTMD биоактивные молекулы, как, например, описанные в настоящем документе плазмидные векторы, полинуклеотиды, кодирующие генные конструкции, описанные в настоящем документе, добавляют, например, к катионным оболочкам липидных микропузырьковых контрастных агентов. Эти переносящие вектор микропузырьки можно вводить субъекту, среди прочих других вариантов введения, например, внутривенно или непосредственно в левый желудочек сердца. Для некоторых пациентов указанные микропузырьки можно вводить через внутрикоронарный катетер. Последующая доставка из кровотока в орган-мишень происходит путем акустической кавитации на резонансной частоте микропузырьков. В некоторых вариантах реализации механическая энергия, создаваемая разрушением микропузырьков, может приводить к образованию транзитных пор внутри или между эндотелиальными клетками микроциркуляторного русла целевой области. В некоторых вариантах реализации эффективность трансфекции во внутрь и через эндотелиальные клетки улучшается, и векторы, кодирующие трансген, накапливаются в окружающей ткани. Таким образом, в некоторых случаях, когда доставку описанного в настоящем документе вектора осуществляют методом UTMD, любая дополнительная плазмидная ДНК, оставшаяся в кровотоке, может быть разрушена нуклеазами в крови, что тем самым приводит к высокоспецифичной нацеленной на орган трансфекции органов, подвергающихся озвучанию ультразвуком, и уменьшению вероятности доставки в неозвученные ткани.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Трансфекции кардиомиоцитов для опосредованной att-сайтом рекомбинации

[0234] Кардиомиоциты трансфицировали люциферазными векторами с или без (например, плюс (+) или минус (-)) att-сайтом и плюс (+) или минус (-) SpBC2 рекомбиназой. После этого экспрессию люциферазы отслеживали в динамике для оценки опосредованной att-сайтом рекомбинации. Чтобы определить специфичность сайта и эффективность SpBC2 и его предполагаемого сайта активности (Att-сайт), кардиомиоциты совместно трансфицировали с помощью плазмиды SpBC2 и плазмидного вектора с геном люциферазы светлячка (FLUC) или Luc Luc, содержащего att-сайт вокруг представляющего интерес гена. Контроли были включены в плазмиду Att-Luc без SpBC2 (для измерения случайной интеграции), плазмиду No-Att-Luc с SpBC2 (для измерения неспецифичной к att-сайту интеграции) и плазмиду No-Att-Luc без SpBC2 (для измерения транзиентной экспрессии). Клетки трансфицировали через DNAfectin (Applied Biological Materials Inc., Richmond, ВС, Канада) и культивировали в течение 14 дней, периодически совместно культивируя клетки, исследуя клетки при помощи люциферазного анализа и собирая клетки для проведения анализов с применением количественной ПЦР.

[0235] Трансфекцию осуществляли с использованием готовой питательной среды и среды для трансфекции (Prigrow I без ФБС/антибиотиков). По меньшей мере за 1 час до трансфекции, среду удаляли из кардиомиоцитов и заменяли свежей питательной средой в количестве 3 мл/лунку в 6-луночном планшете или 1,5 мл/лунку в 12-луночных планшетах. Реагент DNAfectin нагревали до комнатной температуры перед применением и быстро перемешивали для смешивания. Различные комбинации комплексов DNAfectin-плазмидная ДНК получали в средах для трансфекции следующим образом:

[0236] ДНК добавляли в среду для трансфекции. Указанную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. К клеткам добавляли 300 мкл на лунку комплекса DNAfectin-ДНК.

Пассаж и сбор клеток для проведения количественной ПЦР, люциферазного анализа

[0237] Через 48 часов после трансфекции среду удаляли из клеток в 12-луночных планшетах. Клетки трипсинизировали и собирали в микроцентрифужные пробирки. Затем клетки ресуспендировали в 1 мл свежей питательной среды. Клетки высевали в свежий 12-луночный планшет в концентрации 5×10⁴ клеток/лунка и измеряли люциферазу. Оставшиеся клетки собирали для проведения количественной ПЦР.

Результаты:

[0238] В течение двухнедельного курса экспрессия FLUC с вектора Att-Luc + SPBc2 рекомбиназы понизилась приблизительно в 10 раз, тогда как экспрессия FLUC при других условиях трансфекции (без att-сайта или без рекомбиназы) понизилась в 100-1000 раз, возвращаясь почти к фоновому уровню экспрессии (данные не показаны). Также наблюдали опосредованную att-сайтом рекомбинацию FLUC GOI (представляющего интерес гена) в геноме кардиомиоцитов (данные не показаны).

Пример 2: Анализ пролиферации клеток HUVEC

[0239] Анализ пролиферации эндотелиальной клетки пупочной вены человека (HUVEC) применяли для оценки функциональности VEGF165, экспрессируемого рХоХ. Находящиеся в бессывороточных условиях клетки HUVEC обрабатывали кондиционированной средой, полученной от пациентов (с дилатационной, гипертрофической кардиомиопатией), или полученными из здоровых iPSC кардиомиоцитами, трансфицированными рХоХ или одиночным эффектором, представляющими собой контроль (положительный контроль pVEGF165, отрицательный контроль pSDF-1). После 96 часов инкубации пролиферацию HUVEC количественно определяли с применением люциферазного анализа. Анализ повторяли три раза (например, СМ-1,СМ-2, СМ-3).

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

[0240] Клетки iPSC кардиомиоцитов трансфицировали векторами, содержащими один ген, два гена или три гена, кодирующих S100A1 и VEGF; S100A1, SDF1 и VEGF; или VEGF. Клеточный супернатант собирали через 48 часов после трансфекции. HUVEC высевали в 6-луночные планшеты с плотностью приблизительно 1:10, 1:100 и 1:1000 в супернатанте, собранном из трансфицированных iPSC-клеток. Через 96 часов после введения указанного супернатанта пролиферацию HUVEC измеряли при помощи анализа CellTiter-Glo, на ФИГ. 5А и ФИГ. 5В показаны экспериментальные данные. ФИГ. 14А и ФИГ. 14В показывают аналогичные результаты для iPSC-клеток, полученных от пациента с дилатационной кардиомиопатией.

Кардиомиоциты, полученные от пациентов с кардиомиопатией и здоровых контролей

[0241] Клетки iPSC кардиомиоцитов были получены от пациентов с дилатационной кардиомиопатией (DCM), гипертрофической кардиомиопатией (НСМ) или здоровых контролей. iPSC-клетки трансфицировали векторами, содержащими один ген, два гена или три гена, кодирующих S100A1 и VEGF; S100A1, SDF1 и VEGF; или VEGF. Клеточный супернатант собирали через 48 часов после трансфекции. HUVEC высевали в 6-луночные планшеты с плотностью приблизительно 1:10, 1:100 и 1:1000 в супернатант, собранный из трансфицированных iPSC-клеток. Через 96 часов после введения указанного супернатанта пролиферацию HUVEC измеряли при помощи анализа CellTiter-Glo, на ФИГ. 6 показаны экспериментальные данные.

Результаты

[0242] iPSC-CM, трансфицированные векторными конструкциями, содержащими один ген, два гена или три гена, показали 4-10-кратное увеличение пролиферации HUVEC в обоих случаях. Таким образом, результаты успешно демонстрируют, что VEGF является функциональным (т.е. биологически активным) в случае, когда он экспрессируется как часть связанной полигенной конструкции с векторов экспрессии, содержащих два и содержащих три гена, при применении описанных в настоящем документе линкеров (т.е. индуцирует пролиферацию HUVEC, аналогичную той, которую наблюдали при одной эффекторной плазмиде VEGF 165).

Пример 3: Анализ образования эндотелиальной трубки

[0243] В дополнение к анализу пролиферации клеток HUVEC применяют анализ образования эндотелиальной трубки (СВА200, Cell Biolabs Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Гель ЕСМ оттаивают при 4°С и смешивают до однородности с применением охлажденных наконечников пипеток. Дно планшетов для культивирования клеток (96-луночные планшеты) покрывали тонким слоем геля ЕСМ (50 мкл/лунку), который оставляли для полимеризации при 37°С в течение 60 мин. HUVEC (2-3×10⁴ клеток) высевают в планшет для культивирования клеток в супернатант, собранный из клеток iPSC кардиомиоцитов, которые трансфицировали вектором, содержащим один ген, два гена или три гена, кодирующих S100A1 и VEGF, соединенные описанным в настоящем документе линкером; кодирующих S100A1, SDF1 и VEGF, соединенные описанным в настоящем документе линкером; или кодирующих только VEGF. 150 мкл смеси супернатант-HUVEC добавляют в каждую лунку на затвердевший ЕСМ-гель. Указанные планшеты инкубируют при 37°С в течение 12-18 часов и эндотелиальные трубки количественно определяют при помощи флуоресцентного микроскопа после окрашивания Calcein AM. В случайном порядке отбирают три поля микроскопа и фотографируют. Способность к образованию трубки количественно определяют путем подсчета общего количества клеточных кластеров (узлов) и ветвей при 4-кратном увеличении и в четырех разных полях на лунку. Результаты выражаются как среднее изменение ветвления по сравнению с контрольными группами. Каждый эксперимент выполняют как минимум три раза.

Пример 4: Функционирование SDF-1α - Анализ миграции

[0244] Эксперименты с хемотаксисом проводили с применением 24-луночной камеры системы Трасвел для определения хемотаксиса (Millipore, Billerica, штат Массачусетс, США). Вкратце, лейкоциты периферической крови (PBL) выделяли из образцов, полученных от здоровых добровольцев, и трансфицировали вектором, содержащим два или содержащим три гена, кодирующих S100A1 и VEGF, соединенные описанным в настоящем документе линкером, или кодирующих S100A1, SDF1 и VEGF, соединенные описанным в настоящем документе линкером. В верхнюю камеру (с диаметром пор 8 мкм) высевали в общей сложности 1×10⁵ PBL в 200 мкл среды. Для остановки эксперимента половину PBL предварительно инкубировали с антагонистом CXCR4 (AMD3100) в концентрации 10 нмоль/л в течение 30 мин до посева. Затем PBL и среду транфицировали в верхней камере. Затем указанную камеру инкубировали в течение 12 ч при 37°С в увлажненной атмосфере в атмосфере 5% СО₂. Мембрану (Millipore) удаляли, а ее верхнюю поверхность вытирали ватным тампоном для удаления неподвижных PBL. Затем указанную мембрану фиксировали в нейтральном формалине в течение 10 мин при комнатной температуре и затем окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 5 мин. Число PBL, которые мигрировали на нижнюю поверхность мембраны, подсчитывали в 10 случайно выбранных полях зрения при большом увеличении (HPF) в световом микроскопе (Nikon Eclipse, Nikon Instruments, Inc., Melville, Нью-Йорк, США).

[0245] Был рассчитан хемотаксический индекс (CI) для стимулированной экспрессией миграции: CI = стимулированная миграция (количество CSC на НРР)/случайная миграция (количество CSC на HPF). Каждый анализ проводили в трех лунках.

Результаты

[0246] Подтверждение SDF1-специфичной миграции с применением AMD3100 (антагонист CXCR4) было успешным. AMD3100 показал полное ингибирование зависимой от SDF1-CXCR4 миграции (образец №2, 6). SDF1, экспрессируемый в iPSC-CM является функциональным в предложенных авторами настоящего изобретения конструкциях, содержащих два и содержащих три гена, поскольку миграция уменьшается в присутствии AMD3100 (образец №7,12,13). На ФИГ. 7 и ФИГ. 8 показаны экспериментальные данные. Аналогичный эксперимент, выполненный с векторными конструкциями, экспрессирующими VEGF, показывает аналогичные результаты, ФИГ. 6. Таким образом, эти результаты успешно демонстрируют, что SDF-1a является функциональным (т.е. биологически активным) в случае, когда он экспрессируется как часть полигенных связанных конструкций с векторов экспрессии, содержащих два и содержащих три гена, при применении описанных в настоящем документе линкеров.

Пример 5А: Функционирование SDF-1α - Анализ миграции клеток Jurkat

Трансфицированные клетки Jurkat продуцируют функциональный белок SDF1, который подтверждает клеточную миграцию

[0247] SDF-1α исследовали на определение функциональности, демонстрирующей CXCR4-опосредованную миграцию двух типов клеток: клеток Jurkat и лимфоцитов периферической крови (PBL). Для миграции клеток Jurkat клетки в бессывороточной среде высевали на поверхность вставок системы Трансвел. Нижние камеры заполняли кондиционированными средами, полученными от пациентов (с дилатационной, гипертрофической кардиомиопатией), или полученными из здоровых iPSC кардиомиоцитами, трансфицированными рХоХ или одиночными эффекторами, представляющими собой контроль. Число клеток, которые мигрировали через вставку системы Трансвел в нижнюю камеру, содержащую кондиционированную среду, через два часа количественно определяли при помощи люминесцентного анализа.

[0248] Клетки Jurkat трансфицировали генными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена, кодирующими SDF1. Контрольные клетки Jurkat и Jurkat, подвергнутые воздействию AMD3100 (антагонист CXCR4), измеряли для определения эффективности миграции через 2 часа после добавления указанного лекарственного средства. На ФИГ. 8 и ФИГ. 10 показаны экспериментальные данные. Подобный эксперимент, проведенный на клетках Jurkat, культивированных в присутствии супернатанта клеток iPSC человека, транфицированных векторными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена, кодирующими SDF1, показывает сходные результаты; ФИГ. 11.

Результаты

[0249] Миграция клеток Jukart в направлении рекомбинантного SDF1 зависит от CXCR4. Таким образом, эти результаты успешно демонстрируют, что SDF-1α является функциональным (т.е. биологически активным) в случае, когда он экспрессируется как часть полигенных связанных конструкций с векторов экспрессии, содержащих два и содержащих три гена, при применении описанных в настоящем документе линкеров.

Пример 5В: Трансфицированные кардиомиоциты, полученные от пациентов с кардиомиопатией, продуцируют функциональный белок SDF1, который поддерживает клеточную миграцию

[0250] Клетки iPSC кардиомиоцитов (iPSC-CM) были получены от пациентов с дилатационной кардиомиопатией (DCM), гипертрофической кардиомиопатией (НСМ) или здоровых контролей. Клетки iPSC трансфицировали вектором, содержащим один ген, два гена или три гена, кодирующих S100A1 и VEGF, соединенные описанным в настоящем документе линкером; кодирующих S100A1, SDF1 и VEGF, соединенные описанным в настоящем документе линкером; или кодирующих только VEGF. Клеточный супернатант собирали через 48 часов после трансфекции. Клетки Jurkat высевали в 6-луночные планшеты с плотностью приблизительно 1:10, 1:100 и 1:1000 в супернатант, собранный из трансфицированных iPSC-клеток. Через 96 часов после введения супернатанта измеряли миграцию клеток Jurkat, на ФИГ. 12 показаны экспериментальные данные в модели дилатационной кардиомиопатии. На ФИГ. 13 показаны экспериментальные данные в модели гипертрофической кардиомиопатии.

Результаты

[0251] iPSC-CM, трансфицированные векторными конструкциями, содержащими один ген, два гена или три гена, показали 4-10-кратное увеличение пролиферации HUVEC в обоих случаях.

Пример 6: ELISA

Трансфицированные 293Т-клетки продуцируют количественные уровни белка

[0252] 293Т-клетки трансфицировали посредством Fugene 6 (Promega) при помощи генных конструкций Xogenx, содержащих один ген, два гена, три гена, и соответствующих конструкций, представляющих собой контроль. Супернатант клеток и лизат собирали в требуемый момент(-ы) времени. 293Т-клетки трансфицировали векторными конструкциями, кодирующими S100A, SDF1, VEGF191 или их различные комбинации, соединенные описанным в настоящем документе линкером, используя векторы, отличающиеся по наличию или отсутствию последовательностей Козак (Kozak), линкеров (Furin-AP-F2A, GSG-P2A, Furin-APVKQGSG-P2A) (SEQ ID №119) или всех их, как это показано на ФИГ. 15-17. Концентрации продуцируемого белка измеряли методом ELISA.

Результаты

[0253] 293Т-клетки, трансфицированные векторами, содержащими два гена, кодирующих S100A, SDF1, VEGF191 или их различные комбинации, продуцируют измеряемые уровни белка. На ФИГ. 15А и ФИГ. 15В показаны уровни белка SDF1. На ФИГ. 16А и ФИГ. 16В показаны уровни белка VEGF. На ФИГ. 17А и ФИГ. 17 В показаны уровни белка S100A1.

Пример 7: Конструкции экспрессии, содержащие три гена

[0254] Была разработана матрица (многообразие) конструкций, содержащих два гена, три гена и четыре гена, показанная в Таблице 5.

[0256] Экспрессию полипептида и эффективность расщепления исследовали на моделях типов клеток (т.е. 293Т-клетки, 8У40-трансформированные кардиомиоциты и полученные из iPSC кардиомиоциты, каждые полученные от здоровых доноров, доноров (пациентов) с дилатационной кардиомиопатией и гипертрофической кардиомиопатией. Результаты экспрессии, результаты эффективности расщепления и рассмотрение результатов экспрессии для различных комбинаций линкеров (т.е. связывающих последовательностей) показаны ниже в Таблице 6.

[0257] Конфигурации конструкций-лидеров:

[0257] (5')-CAG Промотор-S100A1-fp2a (линкер)-SDF1α-fp2a (линкер)-VEGF191-(3')

[0258] (5')-CAG Промотор-S100A1-fp2a (линкер)-VEGF191-fp2a (линкер)-SDF1α-(3')

[0260] Анализ ELISA - Экспрессия S100A1 с конструкций, содержащих три гена

[0261] Анализы ELISA проводили для количественного определения экспрессии S100A1 с конструкций рХоХ, содержащих три гена, в сравнении с конструкциями рХоХ, содержащими один ген и представляющими собой контроль, и ранее идентифицированным кандидатом-лидером, конструкциями, содержащими два гена. SV40-трансформированные кардиомиоциты трансфицировали каждой из исследуемых плазмидных конструкций, и клеточный супернатант и лизаты собирали в требуемый момент(-ы) времени. Кардиомиоциты трансфицировали векторными конструктами, содержащими гены, кодирующие S100A, SDF1α, VEGF191 или их различные комбинации, соединенные линкерными последовательностями, описанными в настоящем документе и указанными ниже в Таблице 7, соответственно первой, второй и третьей линкерными последовательностями (например, fp2a, fmdv, р2а, IRES, CMV или связывающая последовательность отсутствует). Концентрации продуцируемого белка измеряли методом ELISA. См. ФИГ. 18; номера образцов соответствуют номерам примеров, приведенным ниже в Таблице 7.

[0262] Конфигурация конструкций и результаты экспрессии S100A1 показаны в Таблице 7 (см. ниже).

[0263] Анализ ELISA - Экспрессия SDF1α с конструкций, содержащих три гена

[0264] Анализы ELISA проводили для количественного определения экспрессии S100A1 с конструкций рХоХ, содержащих три гена, в сравнении с конструкциями рХоХ, содержащими один ген и представляющими собой контроль, и ранее идентифицированным кандидатом-лидером, конструкциями, содержащими два гена. 8У40-трансформированные кардиомиоциты трансфицировали каждой из исследуемых плазмидных конструкций, и клеточный супернатант и лизаты собирали в требуемый момент(-ы) времени. Кардиомиоциты трансфицировали векторными конструктами, содержащими гены, кодирующие S100A, SDF1α, VEGF 191 или их различные комбинации, соединенные линкерными последовательностями, описанными в настоящем документе и указанными ниже в Таблице 8, соответственно первой, второй и третьей линкерными последовательностями (например, fp2a, fmdv, р2а, IRES, CMV или связывающая последовательность отсутствует). Концентрации продуцируемого белка измеряли методом ELISA. См. ФИГ. 19; номера образцов соответствуют номерам примеров, приведенным ниже в Таблице 8.

Анализ ELISA - Экспрессия VEGF191 с конструкций, содержащих три гена

[0265] Анализы ELISA проводили для количественного определения экспрессии VEGF191 с конструкций рХоХ, содержащих три гена, в сравнении с конструкциями рХоХ, содержащими один ген и представляющими собой контроль, и ранее идентифицированным кандидатом-лидером, конструкциями, содержащими два гена. SV40-трансформированные кардиомиоциты трансфицировали каждой из исследуемых плазмидных конструкций, и клеточный супернатант и лизаты собирали в требуемый момент(-ы) времени. Кардиомиоциты трансфицировали векторными конструктами, содержащими гены, кодирующие S100A, SDF1α, VEGF191 или их различные комбинации, соединенные линкерными последовательностями, описанными в настоящем документе и указанными ниже в Таблице 9, соответственно первой, второй и третьей линкерными последовательностями (например, fp2a, fmdv, р2а, IRES, CMV или связывающая последовательность отсутствует). Концентрации продуцируемого белка измеряли методом ELISA. См. ФИГ. 20; номера образцов соответствуют номерам примеров, приведенным ниже в Таблице 9.

Вестерн-блот-анализ (иммуноблот-анализ) подтверждает эффективное расщепление S100A1, SDF-1a и VEGF191 с конструкций, содержащих три гена

[0266] Подтверждение соответствующего размера и последовательности отдельных эффекторных белков в соответствующих типах клеток было продемонстрировано при помощи иммуноблот-анализа и масс-спектрометрического анализа (как это описано далее в настоящем документе). Несколько подходящих клеточных линий трансфицировали рХоХ и анализировали либо лизаты клеток (для S100A1), либо кондиционированные среды (для SDF-1α и VEGF 165). Контроли для иммуноблот-анализов представляли собой лизаты/кондиционированные среды клеток, трансфицированных соответствующим одиночным эффектором (pS100A1, pSDF-1α, pVEGF165) и соответствующим коммерчески доступным очищенным рекомбинантным белком.

[0267] Результаты ДСН-ПААГ-электрофореза/иммуноблот-анализа согласовывались во всех исследуемых клеточных линиях (293Т, SV40-иммортализованные кардиомиоциты, полученные из iPSC кардиомиоциты, полученные от здорового индивидуума, пациента с дилатационной кардиомиопатией, пациента с гипертрофической кардиомиопатией). Данные иммуноблот-анализа для SV40-иммортализованных кардиомиоцитов показаны ниже на ФИГ. 21-23 со стрелками, указывающими ожидаемый размер каждого из указанных эффекторных белков.

[0268] Для каждого GOI иммуноблот-анализ проводили с применением стандартных процедур в соответствии с инструкциями производителя. Условия для реагентов для обнаружения были следующими:

Обнаружение S100A1 - Антитело против S100A1 (R&D Systems, Inc.) разбавляли в соотношении 1:200, инкубировали с содержащей антиген мембраной в течение ночи при 4°С; антитело овцы против HRP (пероксидаза хрена) (KPL Inc., Gaithersburg, штат Мэриленд, США) разбавляли в соотношении 1:20000, инкубировали с содержащей антиген мембраной при комнатной температуре (RT) 30 минут; обнаружение сигнала при помощи LUMIGLO® Ultra (KPL Inc.);

Обнаружение SDF-1α - Антитело против SDF-1α (R&D Systems, Inc.) разбавляли в соотношении 1:2000, инкубировали с содержащей антиген мембраной в течение ночи при 4°С; антитело козы против HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grov, штат Пенсильвания, США) разбавляли в соотношении 1:20000, инкубировали с блотом при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут; обнаружение сигнала при помощи LUMIGLO® Ultra (KPL Inc.).

Обнаружение VEGF - Антитело против VEGF (Abeam, Pic, Кембридж, штат Массачусетс) разбавляли в соотношении 1:2000, инкубировали с содержащей антиген мембраной в течение ночи при 4°С; антитело кролика против HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grov, штат Пенсильвания, США) разбавляли в соотношении 1:20000, инкубировали с блотом при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут; обнаружение сигнала при помощи LUMIGLO® Ultra (KPL Inc.).

[0269] Примеры иммуноблотов приведены на ФИГ. 21, 22 и 23.

[0270] Результаты свидетельствуют о том, что каждый из трех GOI эффективно расщепляется, поскольку экспрессируется с конструкций, содержащих три гена.

Масс-спектрометрический анализ

Продукты полигенной экспрессии оценивали методом масс-спектрометрии.

[0271] Продукты расщепления кандидатов-лидеров подтверждали методом масс-спектрометрии. Расщепление трипсином, химотрипсином и эластазой проводили с применением стандартных процедур. Каждый гелевый гидролизат дополнительно анализировали при помощи наноЖХ/МС/МС* с применением ситемы ВЭЖХ Waters NanoAcquity (Waters Corp., Milford, штат Массачусетс, США), сопряженной с ThermoFisher Q Exactive HF (ThermoFisher Scientific, Waltham, штат Массачусетс, США). Данные обрабатывали с применением базы данных Mascot. DAT-файлы из Mascot анализировали при помощи программного обеспечения Scaffold для подтверждения, фильтрования и создания неизбыточного списка на образец. Данные фильтровали с применением минимального объема белка 90%, минимального объема пептида 50% (оценки Prophet) и обязательным применением по меньшей мере двух уникальных пептидов на белок. В соответствии с описанным выше вестерн-блот-анализом (иммуноблот-анализом), метод масс-спектрометрии дополнительно подтверждает протеолитическое расщепление S100A1, SDF-1 и VEGF при экспрессии с конструкций-лидеров, содержащих два и содержащих три гена; см. Таблицу 11.

*ЖХ/МС/МС обозначает жидкостную хроматографию (ЖХ) с масс-спектрометрией (МС). МС/МС представляет собой комбинацию двух масс-анализаторов в одном приборе для масс-спектрометрии. В первых МС-фильтрах для ионов-предшественников происходит фрагментация иона-предшественника с высокой энергией и, например, газообразного азота. Второй масс-анализатор затем фильтрует продукты ионов, образованные в результате фрагментации. Преимуществом МС/МС является повышенная чувствительность.

[0272] Метод масс-спектрометрии (МС) также применяли для оценки наличия или отсутствия аминокислотных остатков линкера на конце (С-концевой области) каждого GOI. МС проводили так, как это указано выше. Результаты приведены ниже в Таблице 12.

«Да» означает наличие > (более чем) 2 аминокислотных (АА) остатков на С-концевом хвосте (который может упоминаться в настоящем документе как «линкерный хвост»);

«Нет» означает наличие < или = (меньше или равнее) 2А на С-концевом хвосте.

Вестерн-блот-анализ (иммуноблот-анализ) димеризации полипептида S100A1

[0274] Электрофорез в неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) проводили для оценки образования димеров полипептидов S100A1, экспрессированных с конструкций, содержащих два и содержащих три гена. Кондиционированную среду трансфицированных 293Т-клеток анализировали методом нативного ПААГ-электрофореза/иммуноблота для мономерных и димерных уровней S100A1. Результаты показывают, что S100A1, расщепляемый из кандидатов-лидеров с двумя и тремя генами, находится преимущественно в димерной форме, тогда как S100A1, экспрессируемый одиночной эффекторной конструкцией pS100A1 и конструкциями, содержащими три гена, имеющими CMV-линкер в С-концевой области S100A1, является преимущественно мономерным; см. ФИГ. 24.

[0275] Следует отметить, что предложен уникальный аспект согласно настоящему изобретению, который относится к конкретному последовательному порядку полипептидов, кодируемых конструкциями согласно настоящему изобретению. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения специфическое размещение белка S100A1 вначале конструкции позволяет достичь и способствует функциональной экспрессии биологически активных молекул S100A1, поскольку неожиданно было обнаружено, что оставшийся 2А-хвост на поверхности S100A1 не препятствует биологической активности S100A1. В тоже время было обнаружено, что размещение S100A1 в качестве второго гена приводит к неполному расщеплению генов, экспрессируемых через конструкции.

[0276] Соответственно, анализ экспрессии рХоХ методом масс-спектрометрии, как это указано ниже в Таблице 13, показал, что S100A1 был единственным эффектором, который расщеплял фурин, что приводило к удалению С-концевого 2А-пептида. Следовательно, на поверхности SDF1α или VEGF не оставалось С-концевого хвоста 2А. Только S100A1 имеет 2А-линкерный хвост. Точная концевая аминокислотная последовательность представляет собой PG. Она расщепляется между G и Р конечной последовательности PGP. Следовательно, С-концевой линкерный хвост на поверхности S100A1, экспрессируемого с рХоХ, содержит последовательность (otN- до С-концевой области) полипептида S101A1, слитую с последовательностью RAKRAPVKQGSGATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID №123); которая может упоминаться в настоящем документе как «2А-хвост». Например, в одном варианте реализации от исходного метионина S100A1 до С-концевой области хвоста расщепляемого линкера fp2a первый GOI согласно настоящему изобретению содержит последовательность:

[0277] Тем не менее как это показано при помощи представленных в настоящем документе данных, было продемонстрировано, что этот хвост S100A1 является «инертным», т.е. не влияет на функцию S100A1 (биологическую активность).

Пример 8: Трансфекции вектора, содержащего три гена

[0279] 293Т-клетки высевали в концентрации 750000 клеток на лунку в 6-луночный планшет и инкубировали в течение ночи в планшете в инкубаторе при 37°С/5% CO₂. На следующий день указанные клетки трансфицировали, применяя FuGENE 6 (Promega) с генными конструкциям, содержащими один ген, два гена, три гена, Таблица 14, и соответствующими представляющими собой контроль конструкциями с применением плазмидного вектора при концентрации 100 нг/мл, разбавленными в среде OptiMEM (LifeTechnologies). После трансфекции клетки инкубировали. В случае необходимости, супернатант и лизат клеток собирали через 72 часа.

Результаты

[0281] Поскольку эффекторы с рХоХ экспрессируются как одна полигенная мРНК, относительный уровень экспрессии каждого эффектора является фиксированным. Чтобы определить относительные уровни экспрессии каждого эффектора рХоХ, трансфицировали несколько соответствующих клеточных линий, а экспрессию белка оценивали методом ELISA. Клетки трансфицировали плазмидами для каждого отдельного эффектора (pS100A1, pSDF-1α или pVEGF165) или всех трех эффекторов (рХоХ).

[0282] Соответственно, как показано в Таблице 16, различные клетки, трансфицированные вектором рХоХ, содержащим три гена, кодирующих S100A1, SDF-1α и VEGF165, продуцировали измеряемые уровни белка, которые были обнаружены при помощи анализов ELISA. Исследуемые типы клеток включали 293Т-клетки, SV40-трансформированные кардиомиоциты, iPSC-CM (кардиомиоциты), полученные от здорового индивидуума, iPSC-CM, полученные от пациента с дилатационной кардиомиопатией, и iPSC-CM, полученные от пациента с гипертрофической кардиомиопатией.

[0283] Через 72 часа после трансфекции среду и лизат клеток собирали и анализировали отдельно для оценки экспрессии секретируемых белков (VEGF165 и SDF-1α) или внутриклеточных белков (S100A1). Ниже в Таблице 16 показаны уровни белка каждого эффектора по сравнению с уровнями, достигаемыми с применением плазмид, экспрессирующих отдельно каждый из эффекторов, выраженными как нг/мл.

Пример 8: Трансфекция кардиомиоцитов

SV40-иммортализованные кардиомиоциты

[0284] SV40-иммортализованные кардиомиоциты трансфицировали при помощи DNAfectin Plus (ABM) с применением конструкций Xogenex, содержащих один ген, два гена и три гена, при этом по меньшей мере два гена связаны описанным в настоящем документе линкером, и соответствующими конструкциями, представляющими собой контроль. 6-луночный планшет покрывали внеклеточной матрицей (АВМ) в течение ночи. Через 24 часа кардиомиоциты высевали в 6-луночный планшет при концентрации 225000 клеток/лунку в каждую покрытую ЕСМ лунку. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С/5% СО₂. Через 72 часа среду собирали из клеток в блок с глубиной 2 мл и хранили для проведения анализа ELISA для определения и количественной оценки образования белка.

Клетки iPSC кардиомиоцитов

[0285] Клетки iPSC кардиомиоцитов трансфицировали при помощи реагента трансфекции GeneJammer (Agilent) с применением конструкций Xogenex, содержащих один ген, два гена и три гена, и соответствующих конструкций, представляющих собой контроль. 12-луночный планшет покрывали фибронектином (ThermoScientiflc) и инкубировали при 37°С/5% СО₂ в течение 1 часа. ДНКазу восстанавливали в ультрачистой воде до конечной концентрации 10 мг/мл. Кардиомиоциты трипсинизировали с применением TrypLE и 1X ДНКазы I и инкубировали в течение 5 минут при 37°С или до тех пор, пока клетки не отсоединялись от колбы. Клетки iPSC высевали при концентрации 4×10⁵ клеток/лунку в каждую покрытую фибронектином лунку 12-луночных планшетов. Клетки в лунках инкубировали в инкубаторе при 37°С/5% СО₂ в течение 24 часов. На следующий день кардиомиоциты трансфицировали с использованием плазмидной ДНК в концентрации 2 мкг (рХоХ и контроли).

Результаты

[0286] Иммортализованные и первичные кардиомиоциты, трансфицированные вектором, содержащим три гена, кодирующих S100A, SDF1, VEGF165, продуцировали измеряемые уровни белка, ФИГ. 21.

Пример 9: Количественное определение образования белка трансфицированными кардиомиоцитами

[0287] Лизаты, полученные из 293Т-клеток, SV40 СМ и iPSC-CM разбавляли в соотношении 1:100 карбонат-бикарбонатном буфере BuPH из упаковки (0,2М) (ThermoFisher) и анализировали с применением анализа ELISA.

Результаты

[0288] Белки S100A1, SDF-1α и VEGF165 определяли в лизатах трансфицированных 293Т-клеток, SV40 СМ и iPSC-CM, ФИГ. 21.

Пример 10: Частота биения и продолжительность сокращения

[0289] Для оценки эффективности рХоХ и функции S100A1, экспрессируемого рХоХ, сократительные свойства iPSC-кардиомиоцитов, полученных от здорового индивидуума и пациента с дилатационной кардиомиопатией (несущего мутацию R173W в кардиальном гене TNNT2), трансфицированных рХоХ или соответствующими контролями, измеряли при помощи системы для визуализации живых клеток Sony SI8000. Клеточные сокращения записывались как видео с высоким разрешением и высокой частотой кадров (2048*2048 пикселей, 150 кадров в секунду, 10 секунд на лунку). Запись сокращений дополнительно анализировали при помощи программного обеспечения для анализатора Sony S18000C, и сократительные параметры были определены для каждой отдельной лунки. Реактивность (ответ) iPSC-CM на β-адренергическую стимуляцию, изопротеренол (ISO, 100 нМ), измеряли на основе сократительных свойств, которые регистрировали в течение 30 минут инкубации. В ходе исследования были оценены три параметра сокращения: частота биений, частота (скорость) сокращений и продолжительность сокращений.

Результаты

[0290] Частота биений и продолжительность сокращений свидетельствуют о том, что наличие 2А-хвоста на 3'-конце вектора, кодирующего S100A1, не влияет на функцию S100A1, ФИГ. 18А и ФИГ. 18В. В отдельном эксперименте показана частота биений и продолжительность сокращений, ФИГ. 19А, ФИГ. 19В и ФИГ. 19С показывают восстановление сократительных свойств у пациента с DCM до здоровых контрольных уровней с применением белка, полученного из трансфицированных клеток iPSC-CM.

[0291] Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что сократительные свойства in vitro iPSC-кардиомиоцитов, полученных от пациента с дилатационной кардиомиопатией, улучшились при помощи pS100A1, pS100A1-SDF-1α и рХоХ по сравнению с pStuffer и нетрансфицированными контролями (pStuffer представляет собой плазмиду с той же конфигурацией остова, что и у рХоХ, при этом открытая рамка считывания (ОРС) заменена на неэкспрессирующую спейсерную последовательность аналогичного размера).

[0292] pS100A1 и pS100A1-SDF-1α показали сопоставимый функциональный выход (повышенная частота биения, улучшенная продолжительность сокращения), что свидетельствует о том, что наличие 2А-хвоста на 3'-конце гена S100A1 в pS100A1-SDF-1α и рХоХ не влияет на функцию S100A1.

[0293] рХоХ был наиболее эффективен при восстановлении сократительных свойств у пациента с дилатационной кардиомиопатией до уровней, наблюдаемых у здоровых индивидуумов, что свидетельствует о том, что эффекторы в рХоХ являются комплементарными.

Пример 11: Титрование рекомбиназы

[0294] На ФИГ. 28 показаны данные для экспрессии VEGF в экспериментах по титрованию рекомбиназы, в которых проводили анализ ELISA для определения устойчивости экспрессии VEGF при трансфекции SV40-трансформированных кардиомиоцитов различными соотношениями вектора экспрессии рХоХ, содержащего три гена, и рекомбиназы. На 3-й день после трансфекции существенного отличия в экспрессии VEGF между группами с SPBc2 и Stuffer не наблюдали. В течение 10, 17 и 24 дней после трансфекции группы с SPBc2 показали значительно большую секрецию VEGF, чем контрольные (Stuffer) группы, когда соотношение люциферазагрекомбиназа составляло 1:0,2-1:0,04.

[0295] На ФИГ. 29 показаны данные экспрессии SDF-1 в экспериментах по титрованию рекомбиназы, в которых проводили анализ ELISA для определения устойчивости экспрессии VEGF при трансфекции SV40-трансформированных кардиомиоцитов различными соотношениями вектора экспрессии рХоХ, содержащего три гена, и рекомбиназы. На 3-й день после трансфекции существенного отличия в экспрессии SDF-1 между группами с SPBc2 и Stuffer не наблюдали. Уровень белка SDF1 был ниже предела обнаружения на 10 и 17 день после трансфекции. Уровни белка SDF1 обнаружили на 24 день после трансфекции, группы с SPBc2 показали значительно большую секрецию SDF1, чем контрольные (Stuffer) группы, когда соотношение люцифераза : рекомбиназа составляло 1:0,2-1:0,04.

[0296] На ФИГ. 30 показаны данные экспрессии S100A1 в кардиомиоцитах, трансфицированных рекомбиназой и без нее. На 3-й день после трансфекции существенного отличия в экспрессии S100A1 между группами с SPBc2 и Stuffer не наблюдали. На 10, 17 и 24 день после трансфекции группы с SPBc2 показали значительно большую секрецию S100A1, чем контрольные группы (Stuffer).

Пример 12: Исследование экспрессии плазмидного остова на крысах

[0297] рХоХ содержит стандартный плазмидный остов с геном устойчивости к канамицину. Кроме того, экспрессия эффекторных белков регулируется гибридным CAG-промотором, и он использует синтетический 3'НТО/полиА-хвост, описанный в Таблице 15. Для подтверждения способности этой конфигурации остова поддерживать экспрессию гена в сердце в динамике, эффектор ОРС в рХоХ заменяли репортерным геном люциферазы (fLuc) (pCAG-fLuc) и оценивали с применением прижизненной визуализации на определение продолжительности экспрессии люциферазы после инъекции плазмиды в сердце. Аналогичную плазмиду с CMV-промотором и неэкспрессирующую спейсерную последовательность (pCMV-stuffer) применяли в качестве контроля для определения размера плазмиды и фоновой экспрессии fLuc.

[0298] Для этого исследования экспрессии плазмидную ДНК (250 мкг) инъецировали в стенку левого желудочка 12-14-недельных самцов крыс Sprague Dawley (n=5 на группу). За крысами наблюдали в динамике, и уровни экспрессии люциферазы измеряли с применением системы живой визуализации in vivo (IVIS). Активность люциферазы у крыс, инъецированных pCAG-fLuc, была первоначально на значение в 21og выше фоновых уровней, наблюдаемых у крыс, инъецированных конструкцией pCMV-fLuc, представляющей собой контроль. Как и ожидалось, уровни экспрессии постепенно снижались через 28 дней после дозирования транзиентно экспрессирующих плазмид. Эти данные свидетельствуют о том, что данный плазмидный остов способен инициировать экспрессию белка, которая постепенно снижается до почти контрольных уровней приблизительно на 28 день. Данные не показаны.

Пример 13: Метод доставки - ретроградная инфузия через коронарный синус у свиней

[0299] Ретроградная инфузия через коронарный синус является предлагаемым методом доставки для невирусных плазмидных конструкций (таких как, но не ограничиваясь ими, рХоХ) в сердце. Техническая сложность этого метода доставки исключает его оценку на небольших животных моделях, как, например, мышах и крысах. Таким образом, свиньи предложены для применения в фармакологических и токсикологических исследованиях и исследованиях биораспределения. Для проверки осуществимости данного метода, пилотное (экспериментальное) исследование провели на свиньях в качестве исследуемых субъектов. Применяя стандартные интервенционные методы, баллонный катетер (Cook Regentec) размещали в коронарном синусе с применением системы доставки стента по проводнику (over the wire). Баллон увеличивался в размерах, окклюзия подтверждали и затем осуществляли инфузию репортерной плазмиды с геном люциферазы. Исследовали три разных дозы (40 мг, 80 мг и 120 мг) с концентрацией плазмиды 1 мг/мл. В общей сложности было исследовано 9 животных, что обеспечило 3 повтора для каждой дозы. В каждом животном инфузию проводили с шагом повышения дозы в 10 мл до тех пор, пока весь объем не был введен. Инфузия составляла 10 мл/мин, а окклюзия баллона после инфузии составляла 10 минут.

[0300] Приблизительно через 24 часа после инфузии плазмиды проводили катетеризацию большой сердечной вены и в коронарную венозную систему методом инфузии вводили раствор субстрата D-люциферина (в когцентрации приблизительно 0,125 мг/мл). Затем животных подвергали эвтаназии и их сердца эксплантировали. Затем эксплантированные сердца оценивали на определение биолюминесценции с применением CCD-камеры для подсчета, используя системы визуализации IVIS® Lumina. Биолюминесцентные изображения, показывающие интенсивность яркости и распределения люциферазы через 24 часа после инъекции выделенных сердец, представлены на ФИГ. 9, свидетельствуют о том, что опосредованная плазмидой экспрессия люциферазы клетками сердца происходит в течение 24 часов после дозирования.

[0301] Дальнейшее биораспределение опосредованной плазмидой экспрессии люциферазы изучали на срезах сердечной и легочной тканей. Данные ПЦР с обратной транскрипцией дополнительно подтвердили экспрессию люциферазы только в левом желудочке сердца у свиней в группе лечения, получавшей 120 мг (данные не показаны). Ни одно из животных не умерло до начала запланированного умерщвления. Соответственно, данное исследование показало, что доставка невирусных плазмид, таких как рХоХ, является безопасной, практичной и приводит к ограниченному системному распределению указанной плазмиды.

[0302] Пример 14: Регенерация кардиомиоцитов in vivo при помощи рХоХ при индуцированной адриамицином кардиомиопатии методом направленного разрушения микропузырьков ультразвуком (UTMD) [64]

Индуцированная адриамицином кардиомиопатия у крыс представляет собой хорошо себя зарекомендовавшую модель застойной сердечной недостаточности (ЗСН). Метод направленного разрушения микропузырьков ультразвуком (UTMD) применяли для доставки рХоХ (который экспрессирует биологически активные SDF1α, S100A1 и VEGF) в сердца крыс при индуцированной адриамицином кардиомиопатии. В общей сложности 16 крыс с индуцированной адриамицином установленной кардиомиопатией были разделены на 2 группы по восемь штук в каждой. Каждая группа получала лечение одной из 2 плазмид: (1) pStuffer или (2) рХоХ. pStuffer представляет собой плазмиду, являющуюся отрицательным контролем, с той же конфигурацией остова, что и у рХоХ, при этом открытая рамка считывания (ОРС) заменена на неэкспрессирующуюся спейсерную последовательность аналогичного размера. Содержащие плазмиды микропузырьки, стабилизированные при помощи липидов, получали в растворе 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолина с концентрацией 2,5 мг/мл, 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина с концентрацией 0,5 мг/мл и 10% глицерина, смешанного с 2 мг плазмиды, растворенной в 50 мл липофектамина 3000 (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния). Аликвоты по 0,5 мл данного раствора фосфолипид-плазмида помещали в 1,5 мл прозрачные флаконы; оставшееся пространство заполняли перфторпропановым газом (Air Products, Inc, Аллентаун, штат Пенсильвания). Каждый флакон инкубировали при 4°С в течение 30 мин, и затем механически встряхивали в течение 30 сек при помощи стоматологического амальгаматора (VialmixTM, Bristol-Myers Squibb Medical Imaging N, Биллерика, штат Массачусетс). Эхокардиографические измерения фракции сокращения, толщины стенки задней стенки левого желудочка (ЛЖ) и межжелудочковой перегородки в конце диастолы и конечной систолы (IVSd) были получены по цифровым изображениям, полученным при помощи 12 МГц широкополосного преобразователя (зонд S12, Philips Ultrasound, Ботелл, штат Вашингтон) в М-режиме в условиях двумерной левой парастернальной позиции по короткой оси левого желудочка.

[0303] Результаты эхокардиографического измерения структуры и функции сердца демонстрируют, что генная терапия с применением UTMD-pXoX восстанавливает индекс фракции сокращения, диаметр задней стенки ЛЖ и IVSd, ФИГ. 31А, ФИГ. 31В и ФИГ. 31С. Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение среднего. ** Р<0,001 в сравнении с pStuffer. Результаты показывают, что эхокардиографическое измерение продемонстрировало инверсию установленной ADM-кардиомиопатии после лечения одиночной UTMD-pXoX, тем самым свидетельствуя об успешном лечении кардиомиопатии in vivo в модели застойной сердечной недостаточности путем введения конструкции рХоХ (три гена с линкерами), которая экспрессирует биологически активные SDF1α, S100A1 и VEGF.

[0304] Результаты ядерной локализации РННЗ (фосфогистона Н3 (Ser10))

Сигнал митотического маркера в мышечных клетках сердца крыс, получающих плазмиду pStuffer или рХоХ, показан на ФИГ. 32, и он демонстрирует регенерацию кардиомиоцитов. Митотический маркер РНН3 подтвердил пролиферацию мышечных клеток сердца у взрослых крыс с установленной сердечной недостаточностью при применении UTMD-рХоХ. Отрицательные результаты по ISL-1, маркеру ранних клеток-предшественников мышечных клеток сердца, подтверждают, что клетки-предшественники не участвуют в регенерации у тех же самых крыс; ФИГ. 33. Отрицательные результаты по ISL-1 подтверждают, что регенерация кардиомиоцитов действительно является результатом генной терапии с применением UTMD-pXoX.

[0305] Эти результаты свидетельствуют о том, что введение конструкции рХоХ, которая экспрессирует биологически активные SDF1α, S100A1 и VEGF, является подходящей при регенерации кардиомиоцитов и успешном лечении кардиомиопатии в моделях застойной сердечной недостаточности. Результаты также свидетельствуют о том, что метод направленного разрушения микропузырьков ультразвуком (UTMD) представляет собой эффективный способ введения векторов и генных конструкций, описанных в настоящем документе, например, включая полигенные конструкции, такие как рХоХ, для лечения сердечных заболеваний и других патологий.

[0306] Хотя в настоящем документе были показаны и описаны предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, специалистам в данной области техники будет понятно, что такие варианты реализации предложены только в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены теперь могут быть осуществлены специалистами в данной области техники, не отклоняясь от настоящего изобретения. Следует понимать, что различные альтернативные варианты вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, можно использовать при реализации настоящего изобретения на практике. Предполагается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем настоящего изобретения, и что тем самым способы и структуры, входящие в объем формулы изобретения, и их эквиваленты также ею охватываются.

[0307] Ссылки

[1] J.L. Hellawell and К.В. Marguiles, "Myocardial reverse remodeling," Cardiovasc. Ther., vol. 30, №3, pp. 172-181, 2012.

[2] D. Rohde, J. Ritterhoff, M. Voelkers, H. Katus, T.G. Parker and P. Most, "S100A1: a multifaceted therapeutic target in cardiovascular disease," J. Cardiovasc. Transl. Res., vol. 3, №5, pp. 525-537, 2010.

[3] S.T. Pleger, P. Most, M. Boucher and S. Soltys, "Stable myocardial-specific AAV6-S100A1 gene therapy results in chronic functional heart failure rescue," Circulation, vol. 115, №19, pp. 2506-2515, 2007.

[4] A. Remppis, T. Greten, B. Schafer and P. Hunziker, "Altered expression of the Ca 2+-binding protein S100A1 in human cardiomyopathy," Biochim. Biophys. Acta., vol. 1313, №3, pp. 253-257, 1996.

[5] D. Rohde, H. Brinks, J. Ritterhoff, G. Qui, S. Ren and P. Most, "S100A1 gene therapy for heart failure: a novel strategy on the verge of clinical trials," J. Mol. Cell Cardiol, vol. 50, №5, pp. 777-784, 2011.

[6] C. Weber, I. Neacsu, B. Krautz, P. Schlegel, S. Sauer, P. Raake, J. Ritterhoff, A. Jungmann, A.B. Remppis, M. Stangassinger, W.J. Koch, H.A. Katus, O.J. Muller, P. Most and S.T. Pleger, "Therapeutic safety of high myocardial expression levels of the molecular inotrope S100A1 in a preclinical heart failure model," Gene Ther., vol. 21, pp. 131-138, 2014.

[7] M.S. Penn, J. Pastore, T. Miller and R. Aras, "SDF-1 in myocardial repair," Gene Ther., vol. 19, №6, pp. 583-587, 2012.

[8] M.S. Penn, F.O. Mendelsohn, G.L. Schaer, W. Sherman, M. Farr, J. Pastore, D. Rouy, R. Clemens, R. Aras and D.W. Losordo, "An open-label dose escalation study to evaluate the safety of administration of nonviral stromal cell-derived factor-1 plasmid to treat symptomatic ischemic heart failure," Circ. Res., vol. 112, №5, pp. 816-825, 2013.

[9] E.S. Chung, L. Miller, A.N. Patel, R.D. Anderson, F.O. Mendelsohn, J. Traverse, К.H. Silver, J. Shin, G. Ewald, M.J. Farr and S. Anwaruddin, "Changes in ventricular remodelling and clinical status during the year following a single administration of stromal cell-derived factor-1 non-viral gene therapy in chronic ischaemic heart failure patients: the STOP-HF randomized Phase II trial," Eur. Heart. J., vol. 36, pp. 2228-2238, 2015.

[10] Z. Taimeh, J. Loughran, E.J. Birks and R. Bolli, "Vascular endothelial growth factor in heart failure," Nat. Rev. Cardiol, vol. 10, №9, pp. 519-530, 2013.

[11] J.X. Yu, X.F. Huang, W.M. Lv, C.S. Ye, X.Z. Peng, H. Zhang, L.B. Xiao and S.M. Wang, "Combination of stromal-derived factor-la and vascular endothelial growth factor gene-modified endothelial progenitor cells is more effective for ischemic neovascularization," J. Vase. Surg., vol. 50, №3, pp. 608-616, 2009.

[12] E. Perin, G.V. Silva, J.A. Assad, D. Vela, L.M. Buja, A.L. Sousa, S. Litovsky, J. Lin, W.K. Vaughn, S. Coulter and M.R. Fernandes, "Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction," J. Mol. Cell Cardiol., vol. 44, №3, pp. 486-95, 2008.

[13] S. Robinson, P.W. Cho, H.I. Levitsky, J.L. Olson, R.H. Hruban, M.A. Acker and P.D. Kessler, "Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts," Cell Transplant., vol. 5, №1, pp. 77-91, 1996.

[14] K. Suzuki, N.J. Brand, R.T. Smolenski, J. Jayakumar, B. Murtuza and M.H. Yacoub, "Development of a novel method for cell transplantation through the coronary artery," Circulation, vol. 102, №19 Suppl 3, pp. 111359-64, 2000.

[15] K. Suzuki, B. Murtuza, N. Suzuki, R.T. Smolenski and M.H. Yacoub, "Intracoronary infusion of skeletal myoblasts improves cardiac function in doxorubicin-induced heart failure," Circulation, vol. 104, №12 Suppl 1, pp. 1213-7, 2001.

[16] P. Musialek, L. Tekieli, M. Kostkiewicz, M. Majka, W. Szot, Z. Walter and M. Olszowska, "Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity," J. Nuclear Cardiol., vol. 18, №1, pp. 104-16, 2011.

[17] P.W. Musialek, A.B. Tracz, K. Skotnicki, P. Zmudka, Z. Pieniazek and W.M. Szostek, "Transcoronary stem cell delivery using physiological endothelium-targeting perfusion technique: the rationale and a pilot study involving a comparison with conventional over-the-wire balloon coronary occlusions in patients after recent myocardial infarcti," Kardiol. Pol., vol. 64, №5, pp. 489-98, 2006.

[18] L. Noyez, J.A. van Son, J.T. Van Der Werf, J. Knape, J. Gimbrere, W.N. van Asten, L.K. Lacquet and W. Flameng, "Retrograde versus antegrade delivery of cardioplegic solution in myocardial revascularization. A clinical trial in patients with three-vessel coronary artery disease who underwent myocardial revascularization with extensive use of the internal mammary art," J. Thorac. Cardiovasc. Surg., vol. 105, №5, pp. 854-63,1993.

[19] P. Boekstegers, W. Giehrl, G. von Degenfeld and G. Steinbeck, "Selective suction and pressure-regulated retroinfusion: an effective and safe approach to retrograde protection against myocardial ischemia in patients undergoing normal and high risk percutaneous transluminal coronary angioplasty," J. Am. Coll. Cardiol., vol. 31, №7, pp. 1525-33,1998.

[20] T. Pohl, W. Giehrl, B. Reichart, C. Kupatt, P. Raake, S. Paul, H. Reichenspurner, G. Steinbeck and P. Boekstegers, "Retroinfusion-supported stenting in high-risk patients for percutaneous intervention and bypass surgery: results of the prospective randomized myoprotect I study," Cath. Cardiovasc. Intervent, vol. 62, №3, pp. 323-30, 2004.

[21] R. Incorvati, S.G. Tauberg, M.J. Pecora, R.S. Macherey, S.B. Dianzumba, В.C. Donohue and M.W. Krucoff, "Clinical applications of coronary sinus retroperfusion during high risk percutaneous transluminal coronary angioplasty," J. Am. Coll. Cardiol., vol. 22, №1, pp. 127-34, 1993.

[22] Z. a. G.M. Lokmic, "Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels," Histolog. Histopathol., vol. 26, №6, pp. 781-96,2011.

[23] D. Rohde, W. Schluter-Wigger, V. Mielke, P. von den Driesch, B. von Gaudecker and W. Sterry, "Infiltration of both T cells and neutrophils in the skin is accompanied by the expression of endothelial leukocyte adhesion molecule-1 (ELAM-1): an immunohistochemical and ultrastructural study," J. Invest. Dermatol., vol. 98, №5, pp. 794-9,1992.

[24] S. Anderson, R. Shiner, M.D. Brown and O. Hudlicka, "ICAM-1 expression and leukocyte behavior in the microcirculation of chronically ischemic rat skeletal muscles," Microvasc. Res., vol. 71, №3, pp. 205-11, 2006.

[25] H. Habazettl, C. Kupatt, S. Zahler, B.F. Becker and K. Messmer, "Selectins and beta 2-integrins mediate post-ischaemic venular adhesion of polymorphonuclear leukocytes, but not capillary plugging, in isolated hearts," Pflugers. Arch., vol. 438, №4, pp. 479-85, 1999.

[26] J. Lesley, I. Gal, D.J. Mahoney, M.R. Cordell, M.S. Rugg, R. Hyman, A.J. Day and K. Mikecz, "TSG-6 modulates the interaction between hyaluronan and cell surface CD44," J. Biol. Chem., vol. 279, №24, pp. 25745-54, 2004.

[27] A.N. Patel, S. Mittal, G. Turan, A.A. Winters, T.D. Henry, H. Ince and N. Trehan, "REVIVE Trial: Retrograde Delivery of Autologous Bone Marrow in Patients With Heart Failure," Stem Cells Transl. Med., vol. 4, pp. 1021-1027, 2015.

[28] R.E. Henschler, E. Deak and E. Seifried, "Homing of Mesenchymal Stem Cells," Infusionsther Transfusionsmed, vol. 35, №4, pp. 306-312, 2008.

[29] В. Ruster, S. Gottig, R.J. Ludwig, R. Bistrian, S. Miiller, E. Seifried, J. Gille and R. Henschler, "Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells," Blood, vol. 108, №12, pp. 3938-44,2006.

[30] C. Hart, D. Drewel, G. Mueller, J. Grassinger, M. Zaiss, L.A. Kunz-Schughart, R. Andreesen, A. Reichle, E. Holler and B. Hennemann, "Expression and function of homing-essential molecules and enhanced in vivo homing ability of human peripheral blood-derived hematopoietic progenitor cells after stimulation with stem cell factor," Stem Cells, vol. 22, №4, pp. 580-9, 2004.

[31] C. Rampon, N. Weiss, C. Deboux, N. Chaverot, F. Miller, D. Buchet, H. Tricoire-Leignel, S. Cazaubon, B.-V. Evercooren and P.-O. Couraud, "Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44," Stem Cells, vol. 26, №7, pp. 1673-82, 2008.

[32] E. Bachrach, A.L. Perez, Y.H. Choi, В.M. Illigens, S.J. Jun, P.D. Nido, F.X. McGowan, S. Li, A. Flint, J. Chamberlain and L. M. Kunkel, "Muscle engraftment of myogenic progenitor cells following intraarterial transplantation," Muscle Nerve, vol. 34, №1, pp. 44-52, 2006.

[33] P. Boekstegers, G. Von Degenfeld, D. Giehrl, R. Heinrich, C. Hullin, G. Kupatt, G. Steinbeck, G. Baretton, G. Middeler, H. Katus and W.M. Franz, "Myocardial gene transfer by selective pressure-regulated retroinfusion of coronary veins," Gene Ther., vol. 7, №3, pp. 232-40, 2000.

[34] S. Alino, M. Jose Herrero, V. Bodi, I. Noguera, L. Mainar, F. Dasi, A. Sempere, M. Sanchez, A. Diaz, L. Sabater and S. Lledo, "Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization," J. Gene Med., vol. 12, №11, pp. 920-6, 2010.

[35] E. Youssef, P. Zhang, P. I. Rogers, P. Tremble, J. Rokovich, В.H. Johnstone, K.L. March and D. Hou, "Enhancing myocardial plasmid expression by retrograde coronary venous delivery," Cath. Cardiovasc. Intervent, vol. 65, №4, pp. 528-34, 2005.

[36] P. Raake, G. von Degenfeld, R. Hinkel, R. Vachenauer, T. Sandner, S. Beller, M. Andrees, C. Kupatt, G. Schuler and P. Boekstegers, "Myocardial gene transfer by selective pressure-regulated retroinfusion of coronary veins: comparison with surgical and percutaneous intramyocardial gene delivery," J. Am. Coll. Cardiol., vol. 44, №5, pp. 1124-9, 2004.

[37] G. von Degenfeld, P. Raake, C. Kupatt, C. Leberhz, R. Hinkel, F.J. Gildehaus, W. Mtinzing, A. Kranz, J. Waltenberger, M. Simoes and M. Schwaiger, "Selective pressure-regulated retroinfusion of fibroblast growth factor-2 into the coronary vein enhances regional myocardial blood flow and function in pigs with chronic myocardial ischemia," J. Am. Coll. Cardiol., vol. 42, №6, pp. 1120-8, 2003.

[38] К. Suzuki, В. Murtuza, S. Fukushima, R. T. Smolenski, A. Varela-Carver, S. R. Coppen and M. H. Yacoub, "Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function," Circulation, vol. 110, №11 Suppl 1, pp. II225-30, 2004.

[39] J. George, J. Goldberg, M. Joseph, N. Abdulhameed, J. Crist, H. Das and V. J. Pompili, "Transvenous intramyocardial cellular delivery increases retention in comparison to intracoronary delivery in a porcine model of acute myocardial infarction," J. Interv. Cardiol., vol. 21, №5, pp. 424-31,2008.

[40] C. Thompson, B. A. Nasseri, J. Makower, S. Houser, M. McGarry, T. Lamson, I. Pomerantseva, J.Y. Chang, H.K. Gold, J.P. Vacanti and S.N. Oesterle, "Percutaneous transvenous cellular cardiomyoplasty: A novel nonsurgical approach for myocardial cell transplantation," J. Am. Coll. Cardiol., vol. 41, №11, pp. 1964-71, 2003.

[41] P.W. Raake, R. Hinkel, S. Muller, S. Delker, R. Kreuzpointner, C. Kupatt, H.A. Katus, J.A. Kleinschmidt, P. Boekstegers and O. J. Mtiller, "Cardio-specific long-term gene expression in a porcine model after selective pressure-regulated retroinfusion of adeno-associated viral (AAV) vectors," Gene Ther., vol. 15, №1, pp. 12-7, 2008.

[42] J. Tuma, R. Fernandez-Vina, A. Carrasco, J. Castillo, C. Cruz, A. Carrillo, J. Ercilla, C. Yarleque, J. Cunza, T.D. Henry and A.N. Patel, "Safety and feasibility of percutaneous retrograde coronary sinus delivery of autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients with chronic refractory angina," J. Transl. Med., vol. 9, p. 183, 2011.

[43] N.T. Wright, K.M. Varney, K.C. Ellis, J. Markowitz, R.K. Gitti, D.B. Zimmer and D.J. Weber, "The three-dimensional solution structure of Ca(2+)-bound S100A1 as determined by NMR spectroscopy," J. Mol. Biol, vol. 353, №2, pp. 410-426, 2005.

[44] R. Donato, "Functional roles of SI00 proteins, calcium-binding proteins of the EF-hand type," Biochim. Biophys. Acta., vol. 1450, №3, pp. 191-231, 1999.

[45] D.B. Zimmer, P. Wright Sadosky and D.J. Weber, "Molecular mechanisms of S100-target protein interactions," Microsc. Res. Tech., vol. 60, №6, pp. 552-559, 2003.

[46] L. Hove-Madsen and D.M. Bers, "Sarcoplasmic reticulum Ca2+ uptake and thapsigargin sensitivity in permeabilized rabbit and rat ventricular myocytes," Circ. Res., vol. 73, №5, pp. 820-828,1993.

[47] J. James, Y. Zhang, K. Wright, S. Witt and E. Glascock, "Transgenic rabbits expressing mutant essential light chain do not develop hypertrophic cardiomyopathy.," J. Mol. Cell. Cardiol., vol. 34, №7, pp. 872-882, 2002.

[48] J. Woda, S.J. Fisher, J. Pastore and A.N. Patel, "Coronary Sinus Delivery of SDF-1 Plasmid for the Treatment of Heart Failure," American Society of Gene and Cell Therapy, p. poster presentation, 2014.

[49] M. Hedman, J. Hartikainen, M. Syvanne, J. Stjernvall, A. Hedman, A. Kivela, E. Vanninen, H. Mussalo, E. Kauppila, S. Simula and O. Narvanen, "Safety and Feasibility of Catheter-Based Local Intracoronary Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transfer in the Prevention of Postangioplasty and In-Stent Restenosis and in the Treatment of Chronic Myocardial Ischemia. Phase II Results of the Kuopio," Circulation, vol. 107, pp. 2677-2683, 2003.

[50] M.G. Katz, A.S. Fargnoli, A.P. Kendle, R.J. Hajjar and C.R. Bridges, "Gene Therapy in Cardiac Surgery: Clinical Trials, Challenges and Perspectives," Ann. Thorac. Surg., vol. 101, pp. 2407-2416,2016.

[51] P. Kolsut, M. Malecki, P. Zelazny, B. Teresinska, P. Firek, P. Janik and Z. Religa, "Gene therapy of coronary artery disease with phvegfl65-early outcome," Kardiol. Pol, vol. 59, pp. 373-384, 2003.

[52] M. Ruel, R.S. Beanlands, M. Lottie, V. Chan, N. Camack, E.J. Suuronen, F.D. Rubens, J.N. DaSilva, F.W. Sellke, D.J. Stewart and T.G. Mesana, "Concomitant treatment with oral L-arginine improves the efficacy of surgical angiogenesis in patients with severe diffuse coronary artery disease: the Endothelial Modulation in Angiogenic Therapy randomized controlled trial," J. Thorac. Cardiovasc. Surg., vol. 135, pp. 762-770, 2008.

[53] S.T. Pleger, C. Shan, J. Ksienzyk, R. Bekeredjian, P. Boekstegers, R. Hinkel, S. Schinkel, B. Leuchs, J. Ludwig, G. Qiu and C. Weber, "Cardiac AAV9-S100A1 gene therapy rescues postishemic heart failure in a preclinical large animal model," Sci. Transl. Med., vol. 3, №92, pp. 92ra64-92ra64, 2011.

[54] R.J. Lee, M.L. Springer, W. E. Blanco-Bose, R. Shaw, P.C. Ursell and H.M. Blau, "VEGF Gene Delivery to Myocardium: Deleterious Effects of Unregulated Expression," Circulation, vol. 102, pp. 898-901, 2000.

[55] J.J. Lopez, R. Laham, A. Stamler, J.D. Pearlman, S. Bunting, A. Kaplan, J.P. Carrozza, F.W. Sellke and M. Simons, "VEGF administration in chronic myocardial ischemia in pigs," Cardiovasc. Res., pp. 272-281, 1998.

[56] M. Katz, A. Fargnoli, R. Williams and C. Bridges, "Gene Therapy Delivery Systems for Enhancing Viral and Nonviral Vectors for Cardiac Diseases: and Nonviral Vectors for Cardiac Diseases: Current Concepts and Future Applications," Human Gene Ther., vol. 24, pp. 914-927, 2013.

[57] Brinks H, D. Rohde, M. Voelkers, G. Qiu and S. Pleger, "S100A1 genetically targeted therapy reverses dysfunction of human failing cardiomyocytes," J. Am. Coll. Cardiol, vol. 58, №9, pp. 966-973, 2011.

[58] F.J. Giordano, "Retrograde coronary perfusion: a superior route to deliver therapeutics to the heart?", J. Am. Coll. Cardiol, vol. 42, №6, pp. 1129-1131,2003.

[59] Y. Wang, F. Wang, R. Wang, P. Zhao and Q. Xia, "2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori," Sci. Rep., vol. 5, №16273, pp. 1-10, 2015.

[60] M.C. Scimia, A.M. Gumpert and W.J. Koch, "Cardiovascular gene therapy for myocardial infarction," Expert Opin. Biol. Ther., vol. 14, №2, pp. 183-195, 2014.

[61] I. Marenholz, C.W. Heizmann, G. Fritz, "S100 proteins in mouse and man: from evolution to function and pathology (including an update of the nomenclature)," Biochem. Biophys. Res. Commun. vol. 322, №4, pp. 1111-22, 2004.

[62] T. Nagasawa, "CXCL12/SDF-1 and CXCR4," Front. Immunol, vol. 6, pp. 301, 2015.

[63] David I.R. Holmes, I. Zachary, "The Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Family: Angiogenic Factors in Health and Disease." Genome Biol Vol. 6, №2, pp. 209, (2005).

[64] S. Chen, J. Chen, P Huang, XL Meng, Clayton, JS Shen, PA Graybum, "Myocardial regeneration in adriamycin cardiomyopathy by nuclear expression of GLP1 using ultrasound targeted microbubble destruction." Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 458, №4, pp. 823-9, 2015.

[65] C.R. Mayer, N.A. Geis, H.A. Katus, R. Bekeredjian, "Ultrasound targeted microbubble destruction for drug and gene delivery." Expert Opin. DrugDeliv., vol. 5, №10, pp. 1121-38, 2008.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> INTREXON CORPORATION

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ НЕСКОЛЬКИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

ПОЛИПЕПТИДОВ С ОДНОГО ВЕКТОРА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЕРДЦА И ДРУГИХ

ПАТОЛОГИЙ

<130> INX00339WO2

<140> PCT/US2016/061668

<141> 2016-11-11

<150> 62/254,139

<151> 2015-11-11

<160> 127

<210> 1

<211> 5350

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 1

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gggcagcgaa ctggaaaccg ccatggagac 1980

tttgataaat gttttccacg cgcatagcgg caaagaaggg gacaagtaca agctgtcaaa 2040

aaaggagctg aaagaactgc tgcagaccga attgagcggc ttcctggacg ctcagaaaga 2100

tgtcgatgcc gtcgacaaag tgatgaaaga gcttgacgag aacggtgacg gtgaagtcga 2160

ttttcaggaa tatgtggtgc tggtggccgc ccttactgta gcatgcaaca atttcttttg 2220

ggaaaattca agagccaaga gggcaccggt gaaacagact ttgaattttg accttctgaa 2280

gttggcagga gacgttgagt ccaaccctgg gcccatgaat gccaaggtcg ttgtggtgct 2340

tgtacttgtg ctgactgctc tgtgtctgag cgacggaaaa ccagtctccc tcagctacag 2400

gtgcccatgc cgattcttcg aatctcatgt ggcccgggcc aatgtgaagc acttgaaaat 2460

cctgaataca cccaactgcg cgttgcagat cgtggcccgc ctgaaaaata ataataggca 2520

ggtatgtatc gatccaaagc ttaagtggat ccaggagtat ctggaaaagg ctctcaataa 2580

ataaatcgat tacgctcctc tactctttga gacatcactg gcctataata aatgggttaa 2640

tttatgtaac aaaattgcct tggcttgtta actttattag acattctgat gtttgcattg 2700

tgtaaatact gttgtattgg aaaagcgtgc caagatggat tattgtaatt cagtgtcttt 2760

tttagtagcg tcacgtgcca aacactgtta gtcacagagg gcatgagaca gcctgtgctg 2820

gaacagctca gttcataggg ctatggagat ggggagaaag gggcgcttct gtcagagaca 2880

agctgtggtc tgggaaggcc ttagcactaa aagcaccaca atgagaagca accgccagaa 2940

gcagggcccg caggcctttg ttccagctgc aaagagaaag gaaaaagtgg ggaataagag 3000

ttggggctgc ggagggggtg gggagcattg tgcaggttcc gtacttgaac agaaagcagg 3060

gaccaacaca aggaaggctc gagctggcgg aataggttcc aatctgtcgc ggccgcatta 3120

ccctgttatc cctaatctcg tttaactatg actctcttaa ggtagccaaa ttccggaact 3180

ataaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 3240

taaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcg cttccgcttc 3300

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 3360

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 3420

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 3480

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 3540

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 3600

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 3660

ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 3720

ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 3780

tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 3840

tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 3900

ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 3960

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 4020

ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 4080

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 4140

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 4200

aagtatatat gagtaaactt ggtctgacat gcgcatctga cgctcagtgg aacgaaaact 4260

cacgttaagg gattttggtc atgcctcaga agaactcgtc aagaaggcga tagaaggcga 4320

tgcgctgcga atcgggagcg gcgataccgt aaagcacgag gaagcggtca gcccattcgc 4380

cgccaagctc ttcagcaata tcacgggtag ccaacgctat gtcctgatag cggtccgcca 4440

cacccagccg gccacagtcg atgaatccag aaaagcggcc attttccacc atgatattcg 4500

gcaagcaggc atcgccatgg gtcacgacga gatcctcgcc gtcgggcatg cgcgccttga 4560

gcctggcgaa cagttcggct ggcgcgagcc cctgatgctc ttcgtccaga tcatcctgat 4620

cgacaagacc ggcttccatc cgagtacgtg ctcgctcgat gcgatgtttc gcttggtggt 4680

cgaatgggca ggtagccgga tcaagcgtat gcagccgccg cattgcatca gccatgatgg 4740

atactttctc ggcaggagca aggtgagatg acaggagatc ctgccccggc acttcgccca 4800

atagcagcca gtcccttccc gcttcagtga caacgtcgag cacagctgcg caaggaacgc 4860

ccgtcgtggc cagccacgat agccgcgctg cctcgtcctg cagttcattc agggcaccgg 4920

acaggtcggt cttgacaaaa agaaccgggc gcccctgcgc tgacagccgg aacacggcgg 4980

catcagagca gccgattgtc tgttgtgccc agtcatagcc gaatagcctc tccacccaag 5040

cggccggaga acctgcgtgc aatccatctt gttcaatcat gcgaaacgat cctcattcat 5100

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttagg ctgagcatct 5160

atgtcgggtg cggagaaaga ggtaatgaaa tggcaggcgc ctttttcgtt agatatgtag 5220

taagtatctt aatatacagc tttatctgtt ttttaagata cttactactt ttcttagtgg 5280

aaactattag tggctgttaa ttaagctagt actacccaag atttgacaga atgcatcgtt 5340

tgcattcgaa 5350

<210> 2

<211> 5350

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 2

ctagcatgaa tgccaaggtc gttgtggtgc ttgtacttgt gctgactgct ctgtgtctga 60

gcgacggaaa accagtctcc ctcagctaca ggtgcccatg ccgattcttc gaatctcatg 120

tggcccgggc caatgtgaag cacttgaaaa tcctgaatac acccaactgc gcgttgcaga 180

tcgtggcccg cctgaaaaat aataataggc aggtatgtat cgatccaaag cttaagtgga 240

tccaggagta tctggaaaag gctctcaata aaagagccaa gagggcaccg gtgaaacaga 300

ctttgaattt tgaccttctg aagttggcag gagacgttga gtccaaccct gggcccatgg 360

gcagcgaact ggaaaccgcc atggagactt tgataaatgt tttccacgcg catagcggca 420

aagaagggga caagtacaag ctgtcaaaaa aggagctgaa agaactgctg cagaccgaat 480

tgagcggctt cctggacgct cagaaagatg tcgatgccgt cgacaaagtg atgaaagagc 540

ttgacgagaa cggtgacggt gaagtcgatt ttcaggaata tgtggtgctg gtggccgccc 600

ttactgtagc atgcaacaat ttcttttggg aaaattcata aatcgattac gctcctctac 660

tctttgagac atcactggcc tataataaat gggttaattt atgtaacaaa attgccttgg 720

cttgttaact ttattagaca ttctgatgtt tgcattgtgt aaatactgtt gtattggaaa 780

agcgtgccaa gatggattat tgtaattcag tgtctttttt agtagcgtca cgtgccaaac 840

actgttagtc acagagggca tgagacagcc tgtgctggaa cagctcagtt catagggcta 900

tggagatggg gagaaagggg cgcttctgtc agagacaagc tgtggtctgg gaaggcctta 960

gcactaaaag caccacaatg agaagcaacc gccagaagca gggcccgcag gcctttgttc 1020

cagctgcaaa gagaaaggaa aaagtgggga ataagagttg gggctgcgga gggggtgggg 1080

agcattgtgc aggttccgta cttgaacaga aagcagggac caacacaagg aaggctcgag 1140

ctggcggaat aggttccaat ctgtcgcggc cgcattaccc tgttatccct aatctcgttt 1200

aactatgact ctcttaaggt agccaaattc cggaactata aattgcgttg cgctcactgc 1260

ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcataa atgaatcggc caacgcgcgg 1320

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgcgctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1380

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1440

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1500

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1560

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1620

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1680

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 1740

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 1800

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 1860

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 1920

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 1980

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2040

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2100

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 2160

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 2220

tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 2280

ctgacatgcg catctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2340

cctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg 2400

ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 2460

cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 2520

aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 2580

acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 2640

gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 2700

gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 2760

agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 2820

tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 2880

tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc 2940

cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga 3000

accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt 3060

tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat 3120

ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct cattcattta tcagggttat tgtctcatga 3180

gcggatacat atttgaatgt atttaggctg agcatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt 3240

aatgaaatgg caggcgcctt tttcgttaga tatgtagtaa gtatcttaat atacagcttt 3300

atctgttttt taagatactt actacttttc ttagtggaaa ctattagtgg ctgttaatta 3360

agctagtact acccaagatt tgacagaatg catcgtttgc attcgaataa ctataacggt 3420

cctaaggtag cgacgtacga accgttgggc gcgcctgggg atagcgatcg ctgctggcgc 3480

ggtccgctat gaggtctctg atagaccaca gacgcgtcga cattgattat tgactagtta 3540

ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 3600

ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 3660

aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 3720

ggactattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 3780

gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 3840

cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggg 3900

tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 3960

ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 4020

cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg 4080

gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg 4140

cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgtt gccttcgccc 4200

cgtgccccgc tccgcgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc 4260

ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagcg cttggtttaa 4320

tgacggctcg tttcttttct gtggctgcgt gaaagcctta aagggctccg ggagggccct 4380

ttgtgcgggg gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc 4440

gtgcggcccg cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc gcggcgcggg gctttgtgcg 4500

ctccgcgtgt gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc gggggggctg 4560

cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg 4620

cgcggcggtc gggctgtaac ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc 4680

cggcttcggg tgcggggctc cgtgcggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg 4740

ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg 4800

gggaggggcg cggcggcccc ggagcgccgg cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca 4860

ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc gcagggactt cctttgtccc aaatctggcg 4920

gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcgggcg aagcggtgcg 4980

gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc 5040

ttctccatct ccagcctcgg ggctgccgca gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg 5100

cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt 5160

tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttgttg tgctgtctca 5220

tcattttggc aaagaattcc ctgcaggaaa ttgagcccgc agcctcccgc ttcgctctct 5280

gctcctcctg ttcgacagtc agccgcatct tcttttgcgt cgccagccga gccacatcgc 5340

tcagacaccg 5350

<210> 3

<211> 5641

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 3

ctagcatgaa tgccaaggtc gttgtggtgc ttgtacttgt gctgactgct ctgtgtctga 60

gcgacggaaa accagtctcc ctcagctaca ggtgcccatg ccgattcttc gaatctcatg 120

tggcccgggc caatgtgaag cacttgaaaa tcctgaatac acccaactgc gcgttgcaga 180

tcgtggcccg cctgaaaaat aataataggc aggtatgtat cgatccaaag cttaagtgga 240

tccaggagta tctggaaaag gctctcaata aaagagccaa gagggcaccg gtgaaacaga 300

ctttgaattt tgaccttctg aagttggcag gagacgttga gtccaaccct gggcccatga 360

attttctgct ctcttgggtg cactggtcac tggcactgct gctgtatctg caccatgcaa 420

aatggtccca agcagctccc atggcagagg gaggtggaca gaatcatcat gaggttgtca 480

aatttatgga tgtctaccag cggagctact gccacccaat tgagacgttg gtagacattt 540

ttcaggaata tccagacgag attgagtaca ttttcaagcc tagctgtgtg cccttgatgc 600

gatgcggtgg ctgttgcaat gatgagggac tcgagtgtgt ccccaccgag gaaagcaata 660

taaccatgca aatcatgcga atcaaacccc accagggcca gcatatcggc gagatgtctt 720

tcttgcaaca taacaaatgc gagtgtcggc caaagaagga cagggctcgc caggaaaatc 780

cctgtggtcc ttgttcagag cgcaggaagc atcttttcgt ccaggatccg cagacttgta 840

aatgttcatg caagaatacc gattctaggt gtaaggcgag gcaactcgag cttaacgaga 900

gaacctgtag gtgtgacaaa cctagaagat aaatcgatta cgctcctcta ctctttgaga 960

catcactggc ctataataaa tgggttaatt tatgtaacaa aattgccttg gcttgttaac 1020

tttattagac attctgatgt ttgcattgtg taaatactgt tgtattggaa aagcgtgcca 1080

agatggatta ttgtaattca gtgtcttttt tagtagcgtc acgtgccaaa cactgttagt 1140

cacagagggc atgagacagc ctgtgctgga acagctcagt tcatagggct atggagatgg 1200

ggagaaaggg gcgcttctgt cagagacaag ctgtggtctg ggaaggcctt agcactaaaa 1260

gcaccacaat gagaagcaac cgccagaagc agggcccgca ggcctttgtt ccagctgcaa 1320

agagaaagga aaaagtgggg aataagagtt ggggctgcgg agggggtggg gagcattgtg 1380

caggttccgt acttgaacag aaagcaggga ccaacacaag gaaggctcga gctggcggaa 1440

taggttccaa tctgtcgcgg ccgcattacc ctgttatccc taatctcgtt taactatgac 1500

tctcttaagg tagccaaatt ccggaactat aaattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 1560

agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcata aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 1620

gtttgcgtat tgggcgcgct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 1680

ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 1740

gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 1800

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 1860

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 1920

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 1980

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 2040

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 2100

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 2160

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 2220

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 2280

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 2340

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 2400

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 2460

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 2520

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacatgc 2580

gcatctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gcctcagaag 2640

aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc gataccgtaa 2700

agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc acgggtagcc 2760

aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat gaatccagaa 2820

aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt cacgacgaga 2880

tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg cgcgagcccc 2940

tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg agtacgtgct 3000

cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc aagcgtatgc 3060

agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag gtgagatgac 3120

aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc ttcagtgaca 3180

acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag ccgcgctgcc 3240

tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag aaccgggcgc 3300

ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg ttgtgcccag 3360

tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa tccatcttgt 3420

tcaatcatgc gaaacgatcc tcattcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca 3480

tatttgaatg tatttaggct gagcatctat gtcgggtgcg gagaaagagg taatgaaatg 3540

gcaggcgcct ttttcgttag atatgtagta agtatcttaa tatacagctt tatctgtttt 3600

ttaagatact tactactttt cttagtggaa actattagtg gctgttaatt aagctagtac 3660

tacccaagat ttgacagaat gcatcgtttg cattcgaata actataacgg tcctaaggta 3720

gcgacgtacg aaccgttggg cgcgcctggg gatagcgatc gctgctggcg cggtccgcta 3780

tgaggtctct gatagaccac agacgcgtcg acattgatta ttgactagtt attaatagta 3840

atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac 3900

ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac 3960

gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt 4020

acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 4080

tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga 4140

ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg gtcgaggtga 4200

gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 4260

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gcgcgcgcca 4320

ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc 4380

aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc 4440

tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcgt tgccttcgcc ccgtgccccg 4500

ctccgcgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg 4560

agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctc 4620

gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt aaagggctcc gggagggccc tttgtgcggg 4680

ggggagcggc tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggccc 4740

gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcgtg 4800

tgcgcgaggg gagcgcggcc gggggcggtg ccccgcggtg cgggggggct gcgaggggaa 4860

caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcggcggt 4920

cgggctgtaa cccccccctg cacccccctc cccgagttgc tgagcacggc ccggcttcgg 4980

gtgcggggct ccgtgcgggg cgtggcgcgg ggctcgccgt gccgggcggg gggtggcggc 5040

aggtgggggt gccgggcggg gcggggccgc ctcgggccgg ggagggctcg ggggaggggc 5100

gcggcggccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 5160

atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctggc ggagccgaaa 5220

tctgggaggc gccgccgcac cccctctagc gggcgcgggc gaagcggtgc ggcgccggca 5280

ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccatc 5340

tccagcctcg gggctgccgc agggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg 5400

gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt 5460

cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttgtt gtgctgtctc atcattttgg 5520

caaagaattc cctgcaggaa attgagcccg cagcctcccg cttcgctctc tgctcctcct 5580

gttcgacagt cagccgcatc ttcttttgcg tcgccagccg agccacatcg ctcagacacc 5640

g 5641

<210> 4

<211> 5641

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 4