Перфузионная камера, система и способ для исследования активности головного мозга in vivo

Группа изобретений относится к медицине, а именно к перфузионной камере, системе и способу исследования активности головного мозга in vivo. Перфузионная камера для исследования активности головного мозга in vivo представляет собой монолитную конструкцию. Конструкция выполнена из пластика, обладающего диэлектрическими свойствами, с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель. Конструкция состоит из несущего корпуса. Корпус содержит канал для входа перфузионного раствора, канал для ввода опорного электрода, канал для ввода датчика температуры входного перфузионного раствора, предварительную камеру, входной спиралевидный желоб между предварительной и основной камерами, основную камеру, выходной спиралевидный желоб между основной камерой и отверстием для выхода перфузионного раствора, отверстие для выхода перфузионного раствора, монтажные пазы, место для крепления черепа животного. Входные каналы камеры выполнены в виде сквозных протоков. Сквозные протоки выходят в предварительную камеру. Предварительная камера соединяется с основной камерой с помощью входного спиралевидного желоба. Выход из предварительной камеры расположен выше дна основной камеры и выполнен с возможностью гравитационной подачи жидкости. Основная камера имеет форму усеченного параболоида вращения и соединена выходным спиральным желобом с отверстием для выхода перфузионного раствора в нижней части перфузионной камеры с возможностью размещения второго датчика температуры контроля температуры выходного раствора. По периметру перфузионной камеры расположены три монтажных паза для крепления к стереотаксическому аппарату. Место крепления черепа животного расположено снизу основной камеры и выполнено в виде усеченного конуса, адаптированного к размеру и кривизне черепа исследуемого животного. Система исследования активности головного мозга in vivo состоит из перфузионной камеры и прижима мозговой поверхности. Прижим мозговой поверхности выполнен из пластика с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель. Прижим представляет собой пластиковый диск с гладкой поверхностью и перфорированный набором периодических круглых отверстий. Прижим оснащен техническим бортом по периметру диска с возможностью усиления конструкции. Усиленный пластиковый диск соединен с крепежным элементом с помощью двух ручек. Крепежный элемент вставлен в держатель прижима. При этом прижим мозговой поверхности выполнен с возможностью замены в случае его поломки с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель. Держатель прижима установлен в микроманипуляторе с возможностью регулировки положения и степени давления на ткани мозга. Прижим мозговой поверхности размещен непосредственно на поверхности мозга в основной камере перфузионной камеры после крепления к животному и удаления участка черепа и твердой мозговой оболочки. В другом варианте система состоит из перфузионной камеры, прижима мозговой поверхности, системы крепления к стереотаксическому аппарату и проточной перфузионной системы. Система крепления к стереотаксическому аппарату представляет собой опорные колонны, на которые опирается перфузионная камера в местах монтажных пазов. Сквозь монтажные пазы перфузионной камеры и опорные колонны проходят болты. Болты закреплены в стереотаксическом аппарате. Перфузионная камера крепится к животному в предусмотренном месте крепления к черепу животного. Проточная перфузионная система представляет собой последовательно расположенные элементы перфузионной системы. При этом каждый следующий элемент находится ниже предыдущего для обеспечения гравитационной подачи жидкости, включая буферный резервуар, соединительную трубку, капельницу-регулятор, соединительную трубку, нагревательный линейный проточный элемент, перфузионную камеру, гибкое соединение, регулятор уровня перфузионного раствора, канал вакуумного отсоса, подсоединенный к системе вакуумного отсоса. Гибкое соединение выполнено из двух штуцеров, соединенных гибкой трубкой. Буферный резервуар соединен через соединительную трубку с капельницей-регулятором с возможностью регулирования скорости потока перфузионного раствора и гальванической развязки перфузионного раствора в перфузионной камере и буферном резервуаре. Капельница-регулятор в свою очередь соединена посредством трубки с нагревательным линейным проточным элементом с возможностью установления требуемой температуры перфузионного раствора. Выход нагревательного линейного проточного элемента соединен посредством трубки с каналом для входа перфузионного раствора перфузионной камеры посредством трубки. Отвестрие для выхода перфузионного раствора перфузионной камеры присоединено посредством гибкого соединения и связано с регулятором уровня перфузионного раствора с возможностью его возвратно-поступательного вертикального перемещения и возможностью осуществления таким образом регулирования уровня перфузионного раствора в основной камере за счет эффекта сообщающихся сосудов, с возможностью удаления излишков перфузионного раствора в регуляторе уровня перфузионного раствора через канал вакуумного отсоса, подсоединенного к системе вакуумного отсоса. При исполнении способа проводят предварительную подготовительную операцию по удалению скальпа и покровных тканей над согреваемым животным под анестезией. Череп животного крепят к перфузионной камере в предусмотренном месте крепления с помощью сначала цианакрилатного клея, затем стоматологического цемента. Выполняют крепление перфузионной камеры в стереотаксическом аппарате с использованием монтажных пазов. В пазы вставляют болты, проходящие сквозь опорные колонны, на которые в свою очередь опирается заявленная перфузионная камера. Перфузионную камеру подключают к проточной перфузионной системе. Для этого выход нагревательного линейного проточного элемента соединяют с каналом для входа перфузионного раствора перфузионной камеры посредством трубки. Отверстие для выхода перфузионного раствора перфузионной камеры присоединяют посредством гибкого соединения к регулятору уровня перфузионного раствора. Регулятор совершает возвратно-поступательное вертикальное перемещение и осуществляет таким образом регулирование уровня перфузионного раствора в основной камере за счет эффекта сообщающихся сосудов. Излишки перфузионного раствора в регуляторе уровня перфузионного раствора удаляют через канал вакуумного отсоса, подсоединенного к системе вакуумного отсоса. Размещают датчики температуры через канал для ввода входного перфузионного раствора в предварительной камере и отверстия для выхода перфузионного раствора для контроля фактической температуры входного и выходного раствора. Удаляют участок черепа и твердой мозговой оболочки. Размещают прижим поверхности мозга непосредственно на поверхности мозга в основной камере перфузионной камеры. Проводят электрофизиологические исследования активности мозга с использованием опорного электрода в виде серебряной хлорированной проволоки. При этом проволока помещена в канал для ввода опорного электрода и регистрирующих электродов, расположенных в мозге через отверстия перфорированного усиленного пластикового диска. Проводят оптические исследования активности мозга с помощью регистрации системами видеонаблюдения отраженного от тканей мозга электромагнитного излучения видимого и инфракрасного диапазонов в областях отверстий перфорированного усиленного пластикового диска. Обеспечивается устройство и способ исследования активности головного мозга in vivo для проведения электрофизиологических и оптических исследований активности мозга, таких как изучение действия лекарственных препаратов и биологически активных веществ на активность головного мозга in vivo. 4 н.п. ф-лы, 7 ил.

 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности - к объектам медицинской техники, а именно - к устройствам для исследования активности головного мозга in vivo и способам их работы. Заявленное техническое решение может быть также использовано для изучения действия лекарственных препаратов и биологически активных веществ на активность головного мозга in vivo, потому что основные этапы формирования центральной нервной системы млекопитающих, включая ранние ритмы активности, которые, например, у крыс и человека схожи, при этом критический период развития соматосенсорной системы крыс также сопоставим по своей функциональной значимости и уровню развития коры с плодом человека во время последнего триместра гестации.

Далее в тексте заявителем приведены термины, которые необходимы для облегчения однозначного понимания сущности заявленных материалов и исключения противоречий и/или спорных трактовок при выполнении экспертизы по существу.

In vivo – обозначает проведение исследований на (или внутри) живой ткани при живом организме [https://ru.wikipedia.org/wiki/In_vivo].

Нейромедиатор – биологически активное химическое вещество, посредством которого осуществляется передача электрохимического импульса от нервной клетки через синаптическое пространство между нейронами, а также, например, от нейронов к мышечной ткани или железистым клеткам [https://ru.wikipedia.org/wiki/Нейромедиатор].

Гестация – период времени вынашивания ребенка (беременность), обусловленный численностью полных недель [https://vlanamed.com/gestatsiya/].

Диэлектрик – вещество (материал), относительно плохо проводящее электрический ток [https://ru.wikipedia.org/wiki/Диэлектрик].

Перфузия – искусственное пропускание раствора через биологические ткани [https://ru.wikipedia.org/wiki/Перфузия].

Перфузионная система – система устройств для обеспечения, направления и регуляции перфузии.

Артефакты перфузии – кратковременное нарушение стационарности и ламинарности потока перфузионного раствора в перфузионной системе вследствие эндогенных процессов, например кавитации [https://ru.wikipedia.org/wiki/Кавитация], температурных флуктуаций плотности перфузионного раствора и т.д.

Адгезия — сцепление поверхностей разнородных твёрдых и/или жидких тел [https://ru.wikipedia.org/wiki/Адгезия].

Стереотаксический аппарат – устройство, прикрепляемое к голове во время операции и предназначенное для точного позиционирования целевого объекта в пространстве для введения электродов, канюль или инструмента в заданную точку мозга по заранее рассчитанным пространственным координатам [https://dic.academic.ru/dic.nsf/medic2/2948].

Вибриссы – осязательные механочувствительные длинные жесткие волосы многих млекопитающих, выступающие над поверхностью шерстного покрова [https://ru.wikipedia.org/wiki/Вибриссы].

Нейровизуализамция — общее название нескольких методов, позволяющих визуализировать структуру, функции и биохимические характеристики мозга. Включает компьютерную томографию, магнитно-резонансную томографию и т. п. Это сравнительно новая дисциплина, являющаяся разделом медицины, а конкретнее неврологии, нейрохирургии и психиатрии [https://ru.wikipedia.org/wiki Нейровизуализация].

Первая неделя после рождения является критическим периодом для формирования кортикальных карт в соматосенсорной коре головного мозга крыс [Rakic P. / Prenatal genesis of connections subserving ocular dom- inance in the rhesus monkey // Nature (1976). 261:467–471. DOI: 10.1038/261467a0; Katz LC, Shatz CJ. / Synaptic activity and the construction of cor- tical circuits // Science (1996) 274:1133–1138 DOI: 10.1126/science.274.5290.1133; Lopez-Bendito G, Lujan R, Shigemoto R, Ganter P, Paulsen O, Molnar Z. / Blockade of GABA(B) receptors alters the tangential migration of cortical neurons // Cereb Cortex (2003) 13:932–942 DOI: 10.1093/cercor/13.9.932; O’Leary DD, Sahara S. / Genetic regulation of arealization of the neocortex // Curr Opinion Neurobiol. (2008) 18:90–100 DOI: 10.1016/j.conb.2008.05.011; Rakic P, Ayoub AE, Breunig JJ, Dominguez MH. / Decision by div- ision: making cortical maps // Trends Neurosci. (2009) 32:291–301 DOI: 10.1016/j.tins.2009.01.007; Erzurumlu RS, Gaspar P./ Development and critical period plasti- city of the barrel cortex // Eur J Neurosci. (2012) 35:1540–1553].

Во время первой недели после рождения в бочонковой коре у крыс наблюдаются уникальные для этого периода развития ритмы осцилляторной электрической активности, такие как ранняя гамма осцилляция, а также веретенообразная осцилляция [Khazipov R, Sirota A, Leinekugel X, Holmes GL, Ben Ari Y, Buzsaki G / Early motor activity drives spindle bursts in the developing somatosensory cortex // Nature (2004) 432:758–761. DOI: 10.1038/nature03132; Yang JW, Hanganu-Opatz IL, Sun JJ, Luhmann HJ. / Three patterns of oscillatory activity differentially synchronize developing neocor- tical networks in vivo // J Neurosci. (2009) 29:9011–9025 DOI:10.1523/jneurosci.5646-08.2009; Minlebaev M, Colonnese M, Tsintsadze T, Sirota A, Khazipov R. /. Early gamma oscillations synchronize developing thalamus and cortex // Science (2011) 334:226–229 DOI: 10.1126/science.1210574; Minlebaev M, Ben-Ari Y, Khazipov R. / Network mechanisms of spindle-burst oscillations in the neonatal rat barrel cortex in vivo // J Neurophysiol.(2007) 97:692–700].

Оба описанных выше ранних ритма могут быть вызваны как стимуляцией сенсорной периферии, так и наблюдаться при регистрации спонтанной активности.

Кроме того, эти ранние ритмы активности активно вовлечены в формирование соматосенсорных кортикальных карт и бесследно исчезают после окончания критического периода развития соматосенсорной системы [Feldman, D. E. /. Map Plasticity in Somatosensory Cortex // Science (2005), 310(5749), 810–815. DOI:10.1126/science.1115807; Fox K. / Barrel Cortex // Cambridge University Press (2008) DOI: 10.1017/CBO9780511541636; Feldman, D. E. / Synaptic Mechanisms for Plasticity in Neocortex // Annual Review of Neuroscience (2009), 32(1), 33–55. DOI: 10.1146/annurev.neuro.051508.135516].

Однако, несмотря на жизненную важность ранних ритмов в формировании высокоорганизованной структуры центральной нервной системы, механизмы ранних ритмов остаются до сих пор неизученными.

Вопрос понимания этих механизмов актуален еще и потому, что основные этапы формирования центральной нервной системы млекопитающих, включая ранние ритмы активности, схожи. Критический период развития соматосенсорной системы крыс сопоставим по своей функциональной значимости и уровню развития коры с плодом человека во время последнего триместра гестации.

В кортикальной активности недоношенного ребенка в это время можно наблюдать также ритмы, подобные ранней гамма осцилляции и веретенообразной осцилляции у крыс [Milh, M., Kaminska, A., Huon, C., Lapillonne, A., Ben-Ari, Y., & Khazipov, R. /. Rapid Cortical Oscillations and Early Motor Activity in Premature Human Neonate // Cerebral Cortex ((2006)) 17(7), 1582–1594. DOI:10.1093/cercor/bhl069; Vecchierini, M.-F., André, M., & d’ Allest, A. M. /. Normal EEG of premature infants born between 24 and 30 weeks gestational age: Terminology, definitions and maturation aspects // Neurophysiologie Clinique/Clinical Neurophysiology (2007), 37(5), 311–323. DOI:10.1016/j.neucli.2007.10.008; Koolen, N., Dereymaeker, A., Räsänen, O., Jansen, K., Vervisch, J., Matic, V., Vanhatalo, S. / Early development of synchrony in cortical activations in the human // Neuroscience (2016). 322, 298–307. DOI:10.1016/j.neuroscience.2016.02.017; Kaminska, A., Delattre, V., Laschet, J., Dubois, J., Labidurie, M., Duval, A., … Chiron, C. / Cortical Auditory-Evoked Responses in Preterm Neonates: Revisited by Spectral and Temporal Analyses // Cerebral Cortex (2017), 1–16. DOI:10.1093/cercor/bhx206].

Поскольку эти ритмы являются отличительным признаком электрической активности коры в этот пренатальный период, то знание о механизмах их генерации позволит диагностировать и, возможно, предотвращать наличие когнитивных и неврологических расстройств у человека.

Исследование механизмов нейрональной активности заключается в изучении лежащих в основе формирования электрической активности тех или иных мембранных ионных каналов нейронов.

Для этого необходимо иметь возможность принудительно активировать или отключать хемочувствительные мембранные ионные каналы за счет соответствующих нейромедиаторов.

Этого можно достичь разными способами, однако каждый из них связан с определенными техническими проблемами. Действительно, классическое применение нейромедиаторов путем расположения их непосредственно на ткани мозга имеет серьезные недостатки, так как процесс вымывания нейромедиаторов в этом случае невозможен. Это влечет за собой нерациональный расход животного материала, когда для проверки одного возможного механизма необходимо утилизировать целое животное. В то же время внутримозговые инъекции нейромедиаторов могут влиять на активность мозга путем возрастающего внутреннего давления на ткани мозга из-за образования инъекционного включения [Greig, N. H. / Optimizing drug delivery to brain tumors // Cancer Treatment Reviews (1987), 14(1), 1–28. doi:10.1016/0305-7372(87)90048-x]. Использование светоосвобождаемых нейромедиаторов требуют генетически модифицированных животных и дополнительные источники света [https://en.wikipedia.org/wiki/Photostimulation].

Таким образом, в современных нейробиологических исследованиях мозга in vivo использование перфузионной техники намывки веществ на поверхность мозга с помощью перфузионных камер обладает рядом преимуществ по сравнению с общепринятыми методами исследования мозга в целом.

Далее заявителем приведены факторы, детализирующие описанные в целом выше преимущества заявленного технического решения.

Заявленное техническое решение, базируемое на перфузионной камере:

- во-первых, позволяет исследовать нейрональную активность in vivo при долговременных контролируемых фармакологических условиях.

-во-вторых, обеспечивает неограниченный доступ к обширной области головного мозга для электрофизиологических исследований [Khazipov R, Holmes GL. / Synchronization of kainate-induced epileptic activity via GABAergic inhibition in the superfused rat hippocampus in vivo // J Neurosci. (2003) 23: 5337-53411, DOI:10.1523/jneurosci.23-12-05337.2003].

- в-третьих, обеспечивает возможность регулировать температуру мозга для исключения проблемы неконтролируемой потери тепла мозгом.

- в-четвертых, обеспечивает возможность оптического исследования мозговой активности с использованием оптического диапазона видимого света и ближнего инфракрасного излучения.

Таким образом, к перфузионным камерам предъявляется ряд серьезных требований, в особенности при оптическом и электрофизиологическом исследовании активности в мозге.

Как известно, в современных исследованиях электрическую активность мозга принято регистрировать с помощью специальных дифференциальных усилителей, например, усилителя Neuralynx с частотой дискретизации до 40 кГц и входным диапазоном от -121 до 121 мВ, где регистрирующий электрод находится в исследуемой зоне мозга, а опорный электрод - вне ее.

Регистрация электрофизиологической активности нейронов мозга в перфузионной камере имеет ограничения на использование металлических частей в конструкции камеры. Металлы обладают высокой электрической проводимостью и являются хорошими приемниками электромагнитных волн, что приводит к наличию шумовых радиосигналов в непосредственной близости от зоны электрофизиологической регистрации.

Такие части должны быть заземлены или изолированы от перфузионного раствора. Таким образом, при изготовлении перфузионной камеры предпочтительно использовать диэлектрические материалы, например, пластик.

При этом следует учитывать, что фармакологическое применение требует прямого доступа перфузионного раствора к неповрежденному мозгу без твердой мозговой оболочки, что приводит к пульсациям мозга и/или грыже мозга, вызванных внутренним кровяным и мозговым давлением соответственно. [Khazipov R, Holmes GL. / Synchronization of kainate-induced epileptic activity via GABAergic inhibition in the superfused rat hippocampus in vivo // J Neurosci. (2003) 23: 5337-53411, DOI:10.1523/jneurosci.23-12-05337.2003].

Вследствие вышеизложенного, для решения вопроса о нейтрализации влияния такого негативного последствия, как пульсации и/или грыжа мозга, в заявленной конструкции перфузионной камеры предусмотрена нейтрализующая дополнительная конструкция в виде перфорированной пластины, закрепленной на регулируемом держателе, который смонтирован (установлен) на экспериментальном столе.

Причем, по мнению заявителя, следует акцентировать внимание на наличие в заявленном техническом решении технологической возможности регулировать температуру покрывающего мозг раствора до требуемого значения, что также исключает проблему неконтролируемой потери тепла мозгом.

Основываясь на вышеизложенном, представляется возможность сделать логический вывод о том, что заявленное техническое решение, а именно - конструктивные особенности заявленной перфузионной камеры, системы с ее использованием и способа её работы являются оптимально подходящим техническим решением для исследования головного мозга и предоставляют возможность максимально эффективно использовать все доступные на дату представления заявочных материалов методы исследования, наряду с возможностью контроля температуры мозга для регуляции до требуемого значения температуры и исключения проблемы неконтролируемой потери тепла мозгом, что обеспечивает достижение максимально возможного положительного эффекта исследований мозга в целом.

Перфузионная камера также потенциально может использоваться при исследованиях головного мозга с использованием технологии нейровизуализации.

Осуществление исследования мозговой активности с использованием оптического диапазона видимого света и ближнего инфракрасного излучения предполагает наличие широкого открытого участка поверхности мозга и перфузионного раствора, обладающего малым поглощением светового излучения в данном диапазоне (500-900 нм).

Кроме того, оптическая среда раствора должна быть максимально однородной, а значит не содержать инородных включений, турбулентных завихрений и т.д.

Следовательно, при использовании методов нейровизуализации, необходимы условия для создания стационарного потока перфузионного раствора, стабильной глубины покрытия головного мозга перфузионным раствором, а также нивелирование артефактов перфузии.

Так как любое смещение перфузионной камеры может привести к повреждению мозга и/или регистрирующих электродов, то в экспериментах in vivo также требуется прочное крепление перфузионной камеры к черепу.

При этом возможность повторного использования перфузионной камеры снижается, так как наиболее широко используемые материалы крепежа с высокой адгезией, как, например, зубной цемент, не позволяют отсоединить перфузионную камеру от черепа.

Таким образом, необходимо либо использовать скрепляющие материалы, поддающиеся легкой отмывке, либо использовать дешевые материалы и скоростные технологии для изготовления перфузионных камер с целью их одноразового использования.

Первый вариант требует дополнительных испытаний скрепляющего вещества на прочность и токсичность.

Во втором же случае при проектировании перфузионной камеры необходимо учитывать как требуемые технические характеристики, так и простоту и скорость ее производства.

Изготовление деталей сложной формы с внутренними полостями может быть реализовано такими методами как литье [https://ru.wikipedia.org/wiki/Литьё], фрезерование [https://ru.wikipedia.org/wiki/Фрезерование] и токарная обработка [https://ru.wikipedia.org/wiki/Токарная_обработка], лазерная стереолитография [https://ru.wikipedia.org/wiki/Лазерная_стереолитография] и аддитивная технология 3D-печати [https://ru.wikipedia.org/wiki/Аддитивные_технологии].

Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки, однако любой может быть использован в качестве рабочего метода для изготовления монолитных конструкций.

Более того, современное автоматизированное оборудование в каждом из методов имеет возможность использования трехмерных цифровых моделей изделия в качестве основы для проведения соответствующей обработки.

Также в данном случае одним из важных критериев при выборе метода изготовления необходимо учитывать возможность простоты модификации изделия, поскольку решение научных задач часто требует дополнительных технических решений.

Поэтому технология изготовления должна учитывать баланс между массовостью производства и устареванием актуальности конкретных исследований.

В настоящее время аддитивная технология 3D-печати становится все более популярным методом изготовления сложных деталей в особенности для научных исследований [C. Zhang, N.C. Anzalone, R.P. Faria, J.M. Pearce / Open-source 3D-printable optics equipment // PLoS ONE, 8 (2013), Article e59840, DOI:10.1371/journal.pone.0059840; M.S. Sulkin, E. Widder, C. Shao, K.M. Holzem, C. Gloschat, S.R. Gutbrod, et al. / Three-dimensional printing physiology laboratory technology // Am. J. Physiol.-Heart Circulatory Physiol., 305 (2013), pp. H1569-H1573, DOI:10.1152/ajpheart.00599.2013; T. Baden, A.M. Chagas, G. Gage, T. Marzullo, L.L. Prieto-Godino, T. Euler / Open Labware: 3-D printing your own lab equipment // PLoS Biol., 13 (2015), Article e1002086, DOI:10.1371/journal.pbio.1002086; J. Bravo-Martinez / Open source 3D-printed 1000мL micropump // HardwareX, 3 (2018), pp. 110-116, DOI:10.1016/j.ohx.2017.08.002; B.J. Winters, D. Shepler / 3D printable optomechanical cage system with enclosure // HardwareX, 3 (2018), pp. 62-81, DOI:10.1016/j.ohx.2017.12.001; B.C. Gross, J.L. Erkal, S.Y. Lockwood, C. Chen, D.M. Spence / Evaluation of 3D printing and its potential impact on biotechnology and the chemical sciences // Anal Chem, 86 (2014), pp. 3240-3253, DOI:10.1021/ac403397r]. Эта технология позволяет исследователям создавать функциональные устройства для решения конкретных научных и прикладных задач в кратчайшие сроки и по минимальным затратам и себестоимости.

Разнообразие видов пластика, используемых в 3D-печати, позволяет воспроизводить материалы с разными свойствами (эластичность, прозрачность, прочность, гибкость и т. д.). В совокупности преимущества 3D-печати образуют привлекательный и недорогой метод проектирования установок. 3D-печать методом послойного наплавления — аддитивная технология, широко используемая при создании опытных образцов и в промышленном производстве. Эта технология имеет минимальные процедуры постобработки и возможность создавать объекты размером до десятых долей миллиметра, что позволяет быстро и легко создавать в том числе и миниатюрные устройства.

В таблице на Фиг. 1 приведены параметры наиболее широко используемых в 3D-печати методом послойного наплавления видов пластиков (https://www.simplify3d.com/support/materials-guide/properties-table/), а именно:

• ABS – акрилонитрил бутадиен стирол,

• PLA – полилактид,

• HIPS – высокопрочный полистирол,

• PETG – полиэтилентерефталатгликоль,

• Nylon – полиамид.

Характеристики всех представленных пластиков удовлетворяют условиям использования заявленной перфузионной камеры, так как все они обладают свойствами диэлектриков и не вступают в реакцию с перфузионными физиологическими растворами.

При этом эксплуатация заявленной перфузионной камеры проводится заявителем при температуре 30-40 °С, малых динамических нагрузках и в течение небольшого промежутка времени, так как исследования биологических объектов in vivo, согласно этическим требованиям, проводятся в течение суток, при физиологических условиях и с анестезией животного.

Поэтому заявитель не ограничивает объем патентных притязаний по материалу заявленной перфузионной камеры только полилактидом PLA, приведенным в разделе осуществления заявленного технического решения настоящего описания, а расширяет объем патентных притязаний до любых пластиков, обладающих диэлектрическими свойствами, например, наиболее широко используемых в 3D-печати пластиков, представленных на Фиг.1.

Основываясь на вышеизложенном, можно сделать вывод, что аддитивные технологии являются наиболее приемлемыми для изготовления заявленной перфузионной камеры и системы, однако они не ограничивают объем патентных притязаний заявителя, и при этом выбор метода (технологии) изготовления перфузионной камеры и системы с ее использованием остается в компетенции исследователя/производителя и зависит от многих факторов, таких как массовость производства, возможность и/или целесообразность повторного использования, себестоимости конечного продукта и спроса на конкурентном рынке.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлена изобретение по патенту RU № 2175348 «Камера для электрофизиологических исследований рецептирующих эпителиев». Сущностью предложенного устройства является Камера для электрофизиологических исследований рецептирующего эпителия, содержащая корпус с основанием и полостью для физиологического раствора, расположенный в ней выступ с манжетой для фиксации исследуемого эпителия, электроды и крышку корпуса со световым окном, отличающаяся тем, что один из электродов представляет собой жидкостный стеклянный микроэлектрод, установленный в держателе на крышке с возможностью угловых поворотов и перемещения вдоль его оси для ввода этого электрода в клетки эпителия, при этом выступ выполнен с возможностью его вертикального перемещения для регулирования зазора между ним и корпусом и снабжен каналом, в котором размещается световод.

Изобретение обеспечивает возможность использования различных методов отведения потенциала от любых рецептирующих эпителиев, закрепление эпителия в камере без повреждений и простую и надежную подачу светового импульса.

Недостатком известного технического решения, в отношении конструкции по сравнению с заявленным техническим решением, является отсутствие возможности исследования головного мозга in vivo, а именно - отсутствие возможности крепления непосредственно на череп животного, т.к. предназначено для изучения рецептирующих эпителиев в биологии, биофизике, медицине, а также для изучения действия лекарственных препаратов и биологически активных веществ на эпителии и отдельные клетки. При этом известное устройство не совпадает с заявленной перфузионной камерой по конструкционным признакам, внесенным в формулу заявленного изобретения.

Недостатками известного технического решения в отношении способа работы и применения по назначению является то, что оно не может быть использовано по назначению в силу не совпадающей области применения по назначению.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлена полезная модель по патенту RU № 81199 «Перфузионная камера для переживающего препарата». Сущностью предложенного устройства является Перфузионная камера для переживающего препарата, содержащая трубку для подачи физраствора, проходящую сквозь стенку водяной бани, ее заполнение и ее крышку с отверстием над рабочей камерой, а также отводящую трубку для отработанного физраствора, отличающаяся тем, что трубка для подачи физраствора выполнена из полиэтилена и снабжена на выходе стеклянным микрокапилляром, размещенным над отверстием в крышке водяной бани, отводящая трубка связывает отверстие в дне рабочей зоны сквозь заполнение и стенку водяной бани с резервуаром для отработанного физраствора.

Преимущества предложенного устройства перфузионной камеры в том, что исключены механические перемещения микроскопического переживающего препарата в перфузионной камере, исключены гидроудары препарата от перистальтического насоса.

Недостатком известного технического решения, в отношении конструкции по сравнению с заявленным техническим решением, является отсутствие возможности исследования головного мозга in vivo, а именно - отсутствие возможности крепления непосредственно на череп животного. При этом известное устройство не совпадает с заявленной перфузионной камерой по конструкционным признакам, внесенным в формулу заявленного изобретения.

Недостатками известного технического решения в отношении способа работы и применения по назначению является то, что оно также не может быть использовано по назначению в силу не совпадающей области применения по назначению.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлено изобретение «Устройство для микроэлектродного исследования биологических объектов» по патенту SU № 1017722. Сущностью прототипа является устройство для микроэлектродного исследования биологических объектов, содержащее корпус с соединенными между собой предварительной камерой, камерой отсоса, рабочей перфузионной камерой, выполненной в виде полого цилиндра, верхнее основание которого выполнено заподлицо с корпусом, а центр симметрии лежит на равном расстоянии от центра симметрии предварительной камеры и камеры отсоса, дополнительно снабжено приспособлением для поддержания стабильной температуры, выполненным в виде полого цилиндра с каналом для ввода термодатчика в рабочую камеру, установленного внутри рабочей перфузионной камеры. При этом внешняя стенка цилиндра выполнена в виде спиралевидной прямоугольной канавки, снабженной каналами для подвода и отвода теплоносителя, а камера отсоса выполнена в виде полого эллиптического цилиндра и снабжена каналами для ввода индифферентных электродов.

Недостатком известного технического решения, в отношении конструкции по сравнению с заявленным техническим решением, является отсутствие возможности исследования головного мозга in vivo, а именно - отсутствие возможности крепления непосредственно на череп животного. При этом известное устройство не совпадает с заявленной перфузионной камерой по конструкционным признакам, внесенным в формулу заявленного изобретения.

Недостатками известного технического решения в отношении способа работы и применения по назначению является то, что оно также не может быть использовано по назначению в силу не совпадающей области применения по назначению.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен аналог, совпадающий с заявленным техническим решением по назначению «Синхронизация индуцированной каинатом эпилептической активности посредством ГАМКергического ингибирования в перфузируемом гиппокампе крыс in vivo» [Khazipov R, Holmes GL. / Synchronization of kainate-induced epileptic activity via GABAergic inhibition in the superfused rat hippocampus in vivo // J Neurosci. (2003) 23: 5337-53411, DOI:10.1523/jneurosci.23-12-05337.2003]. Сущностью является цилиндрический срез длиной 2 мм от пластикового шприца объемом 1 мл, к которому снизу с помощью  цианакрилатного клея приклеена сетка из лайкры.

Использование известного устройства заключалось в том, что его размещали в полости, образовавшейся после удаления части коры в мозге, таким образом, чтобы сетка слабо прижимала гиппокамп для предотвращения пульсаций мозга. Предварительно череп анестезированного животного очищался от скальпа и в черепной кости проделывалось круглое отверстие над предполагаемой областью исследования. Часть коры головного мозга над областью исследования удалялась вакуумным отсасыванием до обнажения поверхности гиппокампа и образования полости. Крепление устройства к животному осуществлялось за счет зубного цемента, размещаемого между внешней стенкой прототипа и окружающей верхний край прототипа черепной костью. Во время фиксации прототипа степень прижатия поверхности гиппокампа контролировалась только визуальным путем. При этом крыса фиксировалась в стереотаксическом аппарате путем закрепления черепа к технической балке аппарата в носовой части черепа, а также в затылочной части черепа к коническим стержням с помощью зубного цемента. Подача и забор перфузионного раствора осуществлялись за счет двух металлических полых игл, где у каждой один из концов был размещен в рабочем объеме перфузионной камеры, а другой включен в систему перфузии.

Недостатками известного устройства, по сравнению с заявленным техническим решением, являются:

– отсутствие конструкционных признаков для контроля температуры перфузионного раствора;

– использование статической системы прижима открытой поверхности мозга в перфузионной камере, что приводит к отсутствию регуляции степени давления на ткани мозга, ограничивает применение только на плоских участках черепа животного, а также делает невозможным локальную смену зоны исследования;

– отсутствие конструкционных признаков для нивелирования артефактов перфузии;

– способ крепления перфузионной камеры к черепу животного не позволяет последующий контроль относительного положения перфузионной камеры;

– отсутствие широкого угла обзора исследуемой зоны, что ограничивает возможности проведения оптических исследований;

– наличие нескольких составных частей.

При этом известное устройство не совпадает с заявленной перфузионной камерой по конструкционным признакам, однако совпадает с ним по назначению.

В силу того, что анализ исследованного уровня техники не позволил выявить аналоги, являющиеся наиболее близкими по совокупности совпадающих признаков по отношению к перфузионной камере, независимые пункты формулы изобретения составлены без ограничительной части.

Целью заявленного изобретения является разработка перфузионной камеры для исследования активности головного мозга in vivo, системы с ее использованием и способа работы системы. Заявленное изобретение позволяет использовать принципы перфузионной камеры для исследования активности головного мозга in vivo.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка монолитной конструкции перфузионной камеры, системы с ее использованием и способа работы системы, обеспечивающие:

– возможность контроля температуры входного и выходного перфузионного раствора за счет специально предусмотренного канала для ввода датчика температуры входного перфузионного раствора 4 и осуществимости размещения датчика температуры в специально расположенном отверстии для выхода перфузионного раствора 9;

– использование регулируемой системы прижима перфузионной камеры к открытой поверхности мозга за счет внешних конструкций с возможностью проведения электрофизиологических и оптических исследований мозга, а также отсутствие необходимости предварительного соединения с прижимными устройствами тканей мозга, что позволяет регулировать степень давления на ткани мозга, использовать участки черепа животного с любой кривизной, а также дает возможность локальной смены зоны исследования;

– наличие конструкционных признаков для нивелирования артефактов перфузии, а именно - предварительной камеры 5, входного спиралевидного желоба 6 и выходного спиралевидного желоба 8;

– наличие регулируемой системы относительного положения перфузионной камеры в пространстве за счет использования специально предусмотренных монтажных пазов 10 для крепления к стереотаксическому аппарату;

– наличие возможности у перфузионной камеры обеспечения широкого угла обзора исследуемой зоны, что в свою очередь обеспечивает возможность проведения также и оптических исследований;

– отсутствие составных частей у перфузионной камеры, что упрощает эксплуатацию.

Сущностью заявленной группы изобретений является перфузионная камера для исследования активности головного мозга in vivo, представляющая собой монолитную конструкцию, выполненную из пластика обладающего диэлектрическими свойствами, с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, состоящую из несущего корпуса, содержащего канал для входа перфузионного раствора, канал для ввода опорного электрода, канал для ввода датчика температуры входного перфузионного раствора, предварительную камеру, входной спиралевидный желоб между предварительной и основной камерами, основную камеру, выходной спиралевидный желоб между основной камерой и отверстием для выхода перфузионного раствора, отверстие для выхода перфузионного раствора, монтажные пазы, место для крепления черепа животного; при этом входные каналы перфузионной камеры выполнены в виде сквозных протоков, выходящих в предварительную камеру, предварительная камера соединяется с основной камерой с помощью входного спиралевидного желоба; выход из предварительной камеры расположен выше дна основной камеры с возможностью гравитационной подачи жидкости, основная камера имеет форму усеченного параболоида вращения, при этом основная камера соединена выходным спиральным желобом с отверстием для выхода перфузионного раствора в нижней части перфузионной камеры с возможностью размещения второго датчика температуры контроля температуры выходного раствора; а по периметру перфузионной камеры расположены три монтажных паза для крепления к стереотаксическому аппарату; место крепления черепа животного расположено снизу основной камеры и выполнено в виде усеченного конуса, адаптированного к размеру и кривизне черепа исследуемого животного. Система исследования активности головного мозга in vivo с использованием перфузионной камеры, состоящая из перфузионной камеры и прижима мозговой поверхности, при этом перфузионная камера выполнена в виде монолитной конструкции из пластика, обладающего диэлектрическими свойствами, с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, состоящую из несущего корпуса, содержащего канал для входа перфузионного раствора, канал для ввода опорного электрода, канал для ввода датчика температуры входного перфузионного раствора, предварительную камеру, входной спиралевидный желоб между предварительной и основной камерами, основную камеру, выходной спиралевидный желоб между основной камерой и отверстием для выхода перфузионного раствора, отверстие для выхода перфузионного раствора, монтажные пазы, место для крепления черепа животного; при этом входные каналы перфузионной камеры выполнены в виде сквозных протоков, выходящих в предварительную камеру, предварительная камера соединяется с основной камерой с помощью входного спиралевидного желоба; выход из предварительной камеры расположен выше дна основной камеры с возможностью гравитационной подачи жидкости, основная камера имеет форму усеченного параболоида вращения, при этом основная камера соединена выходным спиральным желобом с отверстием для выхода перфузионного раствора в нижней части перфузионной камеры с возможностью размещения второго датчика

температуры контроля температуры выходного раствора; а по периметру перфузионной камеры расположены три монтажных паза для крепления к стереотаксическому аппарату; место крепления черепа животного расположено снизу основной камеры и выполнено в виде усеченного конуса, адаптированного к размеру и кривизне черепа исследуемого животного; при этом прижим мозговой поверхности выполнен из пластика с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель и представляет собой пластиковый диск с гладкой поверхностью и перфорированный набором периодических круглых отверстий, оснащенный техническим бортом по периметру диска с возможностью усиления конструкции, при этом усиленный пластиковый диск соединен с крепежным элементом с помощью двух ручек, а крепежный элемент вставлен в держатель прижима, при этом прижим мозговой поверхности выполнен с возможностью замены в случае его поломки с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, при этом держатель прижима установлен в микроманипуляторе с возможностью регулировки как положения, так и степени давления на ткани мозга; прижим мозговой поверхности размещен непосредственно на поверхности мозга в основной камере перфузионной камеры после крепления к животному и удаления участка черепа и твердой мозговой оболочки. Система исследования активности головного мозга in vivo с использованием перфузионной камеры, состоящая из перфузионной камеры, прижима мозговой поверхности, системы крепления к стереотаксическому аппарату и проточной перфузионной системы, при этом перфузионная камера представляет собой монолитную конструкцию, выполненную из пластика, обладающего диэлектрическими свойствами, с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, состоящую из несущего корпуса, содержащего канал для входа перфузионного раствора, канал для ввода опорного электрода, канал для ввода датчика температуры входного перфузионного раствора, предварительную камеру, входной спиралевидный желоб между предварительной и основной камерами, основную камеру, выходной спиралевидный желоб между основной камерой и отверстием для выхода перфузионного раствора, отверстие для выхода перфузионного раствора, монтажные пазы, место для крепления черепа животного; при этом входные каналы перфузионной камеры выполнены в виде сквозных протоков, выходящих в предварительную камеру, предварительная камера соединяется с основной камерой с помощью входного спиралевидного желоба; выход из предварительной камеры расположен выше дна основной камеры с возможностью гравитационной подачи жидкости, основная камера имеет форму усеченного параболоида вращения, при этом основная камера соединена выходным спиральным желобом с отверстием для выхода перфузионного раствора в нижней части перфузионной камеры с возможностью размещения второго датчика температуры контроля температуры выходного раствора; а по периметру перфузионной камеры расположены три монтажных паза для крепления к стереотаксическому аппарату; место крепления черепа животного расположено снизу основной камеры и выполнено в виде усеченного конуса, адаптированного к размеру и кривизне черепа

исследуемого животного; при этом прижим мозговой поверхности выполнен из пластика с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель и представляет собой пластиковый диск с гладкой поверхностью и перфорированный набором периодических круглых отверстий, оснащенный техническим бортом по периметру диска с возможностью усиления конструкции, при этом усиленный пластиковый диск соединен с крепежным элементом с помощью двух ручек, а крепежный элемент вставлен в держатель прижима, при этом прижим мозговой поверхности выполнен с возможностью замены в случае его поломки с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, при этом держатель прижима установлен в микроманипуляторе с возможностью регулировки как положения, так и степени давления на ткани мозга; прижим мозговой поверхности размещен непосредственно на поверхности мозга в основной камере перфузионной камеры после крепления к животному и удаления участка черепа и твердой мозговой оболочки; при этом система крепления к стереотаксическому аппарату представляет собой опорные колонны, на которые опирается перфузионная камера в местах монтажных пазов, при этом сквозь монтажные пазы перфузионной камеры и опорные колонны проходят болты, закрепляемые в стереотаксическом аппарате, а заявленная перфузионная камера крепится к животному в предусмотренном месте крепления к черепу животного; при этом проточная перфузионная система представляет собой последовательно расположенные элементы перфузионной системы, где каждый следующий элемент находится ниже предыдущего для обеспечения гравитационной подачи жидкости, включая буферный резервуар, соединительную трубку, капельницу-регулятор, соединительную трубку, нагревательный линейный проточный элемент, перфузионную камеру, гибкое соединение, выполненное из двух штуцеров, соединенных гибкой трубкой, регулятор уровня перфузионного раствора, канал вакуумного отсоса, подсоединенный к системе вакуумного отсоса; при этом буферный резервуар соединен через соединительную трубку с капельницей-регулятором с возможностью регулирования скорости потока перфузионного раствора, а также с возможностью гальванической развязки перфузионного раствора в перфузионной камере и буферном резервуаре, при этом капельница-регулятор в свою очередь соединена посредством трубки с нагревательным линейным проточным элементом с возможностью установления требуемой температуры перфузионного раствора, при этом выход нагревательного линейного проточного элемента соединен посредством трубки с каналом для входа перфузионного раствора перфузионной камеры посредством трубки, при этом отверстие для выхода перфузионного раствора перфузионной камеры присоединено посредством гибкого соединения, выполненного из двух штуцеров, соединенных гибкой трубкой, и связано с регулятором уровня перфузионного раствора с возможностью его возвратно-поступательного вертикального перемещения и возможностью осуществления таким образом регулирования уровня перфузионного раствора в основной камере за счет эффекта сообщающихся сосудов, с возможностью удаления излишков перфузионного

раствора в регуляторе уровня перфузионного раствора через канал вакуумного отсоса, подсоединенного к системе вакуумного отсоса. Способ исследования активности головного мозга in vivo с помощью системы по п. 3, заключающийся в том, что проводят предварительную подготовительную операцию по удалению скальпа и покровных тканей над согреваемым животным под анестезией, далее череп животного крепят к перфузионной камере в предусмотренном месте крепления с помощью сначала цианакрилатного клея, затем стоматологического цемента, далее выполняют крепление перфузионной камеры в стереотаксическом аппарате с использованием монтажных пазов, в которые далее вставляют болты, проходящие сквозь опорные колонны, на которые в свою очередь опирается заявленная перфузионная камера; далее перфузионную камеру подключают к проточной перфузионной системе, для чего выход нагревательного линейного проточного элемента соединяют с каналом для входа перфузионного раствора перфузионной камеры посредством трубки, далее отверстие для выхода перфузионного раствора перфузионной камеры присоединяют посредством гибкого соединения, выполненного из двух штуцеров, соединенных гибкой трубкой, к  регулятору уровня перфузионного раствора, который совершает возвратно-поступательное вертикальное перемещение и осуществляет таким образом регулирование уровня перфузионного раствора в основной камере за счет эффекта сообщающихся сосудов, при этом излишки перфузионного раствора в регуляторе уровня перфузионного раствора удаляют через канал вакуумного отсоса, подсоединенного к системе вакуумного отсоса; далее размещают датчики температуры через канал для ввода входного перфузионного раствора в предварительной камере и отверстия для выхода перфузионного раствора для контроля фактической температуры входного и выходного раствора; далее удаляют участок черепа и твердой мозговой оболочки, после чего размещают прижим поверхности мозга непосредственно на поверхности мозга в основной камере перфузионной камеры; далее проводят электрофизиологические исследования активности мозга с использованием опорного электрода в виде серебряной хлорированной проволоки, помещенной в канал для ввода опорного электрода и регистрирующих электродов, расположенных в мозге через отверстия перфорированного усиленного пластикового диска; далее проводят оптические исследования активности мозга с помощью регистрации системами видеонаблюдения отраженного от тканей мозга электромагнитного излучения видимого и инфракрасного диапазонов в областях отверстий перфорированного усиленного пластикового диска.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг.1 - Фиг.7.

На Фиг.1 приведена Таблица 1, в которой представлены параметры видов пластиков, наиболее широко используемых в 3D-печати методом послойного наплавления и имеющих диэлектрические свойства.

На Фиг.2 представлена 3D-модель заявленной перфузионной камеры,

2А – вид сверху,

2Б – вид снизу, где:

1 – несущий корпус,

2 – канал для входа перфузионного раствора,

3 – канал для ввода опорного электрода,

4 – канал для ввода датчика температуры входного перфузионного раствора,

5 – предварительная камера,

6 – входной спиралевидный желоб,

7 – основная камера,

8 – выходной спиралевидный желоб,

9 – отверстие для выхода перфузионного раствора,

10 – монтажные пазы,

11 – место крепления черепа животного.

2В – 3D-модель прижима поверхности мозга и 3D-модель держателя прижима, где:

25 – прижим поверхности мозга,

26 – держатель прижима.

На Фиг.3 представлена схема возможного крепления заявленной перфузионной камеры к черепу животного и монтажа на стереотаксический аппарат,

3А – вид слева,

3Б – вид справа, где

12 – схематическое изображение животного,

13 – схематическое изображение подвижной части стереотаксического аппарата,

14 – монтажные болты, например, M4,

15 – опорные колонны для создания опоры заявленной перфузионной камеры.

На Фиг.4 представлена схема возможного подключения проточной перфузионной системы с использованием заявленной перфузионной камеры, где:

2 – канал для входа перфузионного раствора,

5 – предварительная камера,

6 – входной спиралевидный желоб,

7 – основная камера,

8 – выходной спиралевидный желоб,

9 – отверстие для выхода перфузионного раствора,

11 – место крепления черепа животного,

12 – схематическое изображение животного,

16 – буферный резервуар,

17 – капельница-регулятор,

18 – нагревательный линейный проточный элемент,

19 – гибкое соединение, состоящее из двух штуцеров соединенных гибкой трубкой, например, силиконовой,

20 – регулятор уровня перфузионного раствора,

21 – канал вакуумного отсоса.

На Фиг.5 представлены:

5А – схема использования заявленной перфузионной камеры для многоканальной регистрации электрических сигналов головного мозга крысы при разных температурах мозга и во время стимуляции вибриссы;

5Б - схема использования заявленной перфузионной камеры для многоканальной регистрации электрических сигналов головного мозга крысы при разных температурах мозга и во время стимуляции вибриссы, где:

22 – датчик температуры,

23 – опорный электрод,

24 – регистрирующий многоканальный электрод,

25 – прижим поверхности мозга,

26 – держатель прижима.

5В – графики, иллюстрирующие результаты использования заявленной перфузионной камеры для многоканальной регистрации электрических сигналов соматосенсорной коры головного мозга крысы при разных температурах мозга и во время стимуляции вибриссы, где черные сплошные кривые являются вызванным локальным полевым потенциалом (ЛПП), а красные вертикальные линии - мультиклеточной активностью (МКА) в представительстве вибриссы в соматосенсорной коре головного мозга крысы.

На Фиг.6 представлено возможное использование заявленной перфузионной камеры для одновременной регистрации вызванного внутреннего оптического сигнала (ВОС) и электрических сигналов соматосенсорной коры головного мозга крысы во время стимуляции вибрисс.

6А – схема регистрации внутреннего оптического сигнала, где:

7 – основная камера,

12 – схематическое изображение животного,

25 – прижим поверхности мозга,

27 – ПЗС камера

28 – оптическая система, например, микроскоп,

29 – инфракрасный светодиод,

30 – зеленый/красный светодиод.

Пунктирная черная линия отображает примерный оптический ход отраженных световых лучей сквозь оптическую систему 28 до ПЗС камеры 27, примерный конус освещения обозначен бордовыми и зелеными/красными линиями для инфракрасного диода 29 и зеленого/красного светодиода 30, соответственно.

6Б – иллюстрация визуализации ВОС, где 24 – регистрирующий многоканальный электрод, 25 – прижим поверхности мозга, оранжевым обозначена область вокруг регистрирующего многоканального электрода 24, не прикрытая прижимом поверхности мозга 25, черным обозначена произвольная область, прикрытая прижимом поверхности мозга 25.

6В – графики, иллюстрирующие зависимость изменения концентрации гемоглобина во время серии стимулов, где оранжевым обозначено изменение в области вокруг регистрирующего многоканального электрода 24, не прикрытой прижимом поверхности мозга 25, черным обозначено изменение в произвольной области, прикрытой прижимом поверхности мозга 25.

6Г – графики, иллюстрирующие зависимость изменения концентрации псевдохромофора, соответствующего рассеянию света, где оранжевым обозначено изменение в области вокруг регистрирующего многоканального электрода 24, не прикрытой прижимом поверхности мозга 25, черным обозначено изменение в произвольной области, прикрытой прижимом поверхности мозга 25.

6Д – графики, иллюстрирующие регистрацию вызванных электрических сигналов соматосенсорной коры головного мозга крысы с помощью регистрирующего многоканального электрода 24  и при стимуляции вибрисс, где черная сплошная кривая является вызванным локальным полевым потенциалом (ЛПП), а красные вертикальные линии - мультиклеточной активностью (МКА) в представительстве вибриссы в соматосенсорной коре головного мозга крысы. На всех иллюстрациях период стимуляции вибрисс обозначен серой полупрозрачной областью.

На Фиг.7 приведена Таблица 2, в которой приведено назначение элементов заявленной перфузионной камеры и системы с ее использованием и признаки способа её работы (для упрощения формирования признаков формулы заявленного технического решения и выбора из них существенных признаков).

Поставленные цели и заявленный технический результат достигаются тем, что с помощью аддитивных технологий производства создается монолитная конструкция заявленной перфузионной камеры, выполненная из пластика с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, обладающего диэлектрическими свойствами (Фиг.2), далее создается система с использованием заявленной перфузионной камеры.

Заявленная перфузионная камера является монолитным изделием, выполненным с помощью аддитивной технологии 3D печати, и представляет собой следующую конструкцию (Фиг.2).

Несущий корпус 1 перфузионной камеры содержит три входных канала 2, 3, 4, две открытых камеры: предварительную камеру 5 и основную камеру 7, соединенных входным спиральным желобом 6, а также отверстие для выхода перфузионного раствора 9, соединенное с основной камерой 7 выходным спиральным желобом 8. Три входных канала 2, 3, 4 используются для ввода перфузионного раствора, размещения опорного электрода (Фиг.4, поз.22) и датчика температуры (Фиг.4, поз.23) перфузионного раствора, соответственно. Входные каналы  2, 3, 4 выполнены в виде сквозных протоков, выходящих в предварительную камеру 5.

Заявитель поясняет, что наличие предварительной камеры 5 необходимо для защиты основной камеры 7 от пузырей воздуха и гидроудара, которые возможны при артефактах в проточной перфузионной системе.

Предварительная камера 5 соединяется с основной камерой 7 с помощью входного спиралевидного желоба 6, форма и наклон которого используется как против прямого гидроудара, так и для обеспечения гравитационной подачи жидкости. При этом выход из предварительной камеры 5 расположен выше дна основной камеры 7, для обеспечения гравитационной подачи жидкости.

Спиральная форма входного спиралевидного желоба 6 обусловлена:

во-первых, разницей высот выхода предварительной камеры 5 и входа основной камеры 7;

во-вторых, избеганием прямой траектории подачи перфузионного раствора;

в-третьих, обеспечением ламинарности и стационарности потока перфузионного раствора.

Основная камера 7 имеет форму усеченного параболоида вращения для обеспечения большего угла обзора для возможности оптических исследований, а также для обеспечения свободного пространства для размещения исследовательского оборудования.

Основная камера 7 также соединена выходным спиральным желобом 8 с отверстием для выхода перфузионного раствора 9, расположенным в нижней части заявленной перфузионной камеры.

Спиральная форма выходного спиралевидного желоба 8 обусловлена:

- во-первых, разницей высот выхода основной камеры 7 и отверстия для выхода перфузионного раствора 9;

- во-вторых, избеганием прямой траектории подачи перфузионного раствора;

- в-третьих, обеспечением ламинарности и стационарности потока перфузионного раствора.

В отверстии для выхода перфузионного раствора 9 в случае необходимости может быть размещен второй датчик температуры (на Фиг. не указан) для контроля температуры выходного перфузионного раствора.

Снизу основной камеры 7 предусмотрено место крепления черепа животного 11, выполненное в виде усеченного конуса и адаптированного, например, к размеру и кривизне черепа крысы.

По периметру перфузионной камеры расположены три монтажных паза 10 для крепления к стереотаксическому аппарату.

Размер перфузионной камеры для приведенного в Примерах 3-5 эксперимента (с крысами) составляет максимально 30 х 49 х 3 мм.

При этом заявитель поясняет, что размер перфузионной камеры заявителем в формуле изобретения не указан, так как приведенный в настоящем описании образец перфузионной камеры спроектирован для работы именно с крысами, но может быть масштабирован к размеру любого исследуемого животного, например, кролика, хорька, кошки и др.

Заявленная перфузионная камера имеет техническую возможность крепления к черепу животного посредством, например, зубного цемента и с соблюдением предусмотренных этических норм. При этом сама перфузионная камера является несущей конструкцией и может, в свою очередь, крепиться как к стереотаксическому аппарату, являясь, таким образом, одновременно опорой для животного, так и по выбору пользователя к иным необходимым элементам позиционирования при наличии необходимости.

Все элементы для обеспечения стационарной перфузии выполнены непосредственно в несущем корпусе для создания условий для стационарной и стабильной перфузии. Этого можно достичь благодаря технологиям либо литья, либо фрезерования и токарной обработки, либо лазерной стереолитографии, либо аддитивной технологии 3D-печати или любой другой технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель. В качестве примера показана заявленная перфузионная камера, изготовленная с помощью аддитивной технологии 3D печати, что обеспечивает быструю воспроизводимость и простоту изготовления и также исключает временные и материальные затраты на подготовку производства.

Далее заявителем приводится описание прижима для мозга.

Чтобы избежать грыжи мозга наружу после удаления достаточно большого фрагмента черепа и твердой мозговой оболочки, используется прижим для мозга (Фиг.2В), изготовленный с использованием аддитивных технологий 3D-печати.

Прижим представляет собой тонкий (~0.2 мм) пластиковый диск с гладкой поверхностью и перфорированный набором периодических круглых отверстий ~1 мм.

Для удобства использования прижим для мозга разделен на две части – прижим поверхности мозга 25 и держатель прижима 26 (Фиг.2В). Это позволяет легко и быстро удалять сломанный прижим и существенно сокращать время повторной печати.

Прочность конструкции увеличена за счет добавления технического борта по периметру диска.

Прижим мозговой поверхности в виде усиленного пластикового диска соединен с крепежным элементом с помощью двух ручек, при этом крепежный элемент вставлен в держатель прижима, с обеспечением возможности легко и быстро заменять прижим мозговой поверхности в случае его поломки с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель.

Держатель прижима вставляют в манипулятор, например, трехпозиционный микроманипулятор Narishige M-152, для точной регулировки положения и степени давления на ткани мозга. Прижим мозговой поверхности размещен непосредственно на поверхности мозга в основной камере перфузионной камеры после крепления к животному и удаления участка черепа и твердой мозговой оболочки, при этом прижим мозговой поверхности изготовлен из пластика с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель.

В данном эксперименте прижим для мозга помещали непосредственно над поверхностью мозга сразу после удаления части кости черепа (~4 мм²) и части твердой мозговой оболочки.

При этом заявитель указывает, что заявленная перфузионная камера может быть использована без прижима мозговой поверхности, например, в случае проведения оптических исследований.

Таким образом, заявленное техническое решение сохраняет все преимущества исследований на объектах in vivo, но при этом отсутствует необходимость предварительного соединения с прижимными устройствами тканей мозга, что потенциально позволяет регулировать степень давления на ткани мозга, использовать участки черепа животного с любой кривизной, а также дает возможность локальной смены зоны исследования за счет внешних конструкций.

При этом в конструкции заявленной перфузионной камеры присутствуют признаки, способствующие нивелированию артефактов перфузии, а именно – наличие предварительной камеры 5, спиралевидного входного желоба 6 и спиралевидного выходного желоба 8.

Далее заявителем приводится описание системы крепления к стереотаксическому аппарату.

Система крепления к стереотаксическому аппарату представляет собой опорные колонны 15, на которые опирается заявленная перфузионная камера, в местах монтажных пазов 10, при этом сквозь монтажные пазы 10 и опорные колонны проходят болты 14, например, болты M4, закрепляемые в подвижной части стереотаксического аппарата 13, а заявленная перфузионная камера крепится к животному в предусмотренном месте крепления к черепу животного 11. Система крепления к стереотаксическому аппарату способствует возможности регуляции относительного положения перфузионной камеры в пространстве.

Также конструкция заявленной перфузионной камеры обеспечивает возможность контроля температуры входного и выходного перфузионного раствора за счет специально предусмотренного канала 4 для ввода датчика температуры и осуществимости размещения датчика температуры в специально расположенном отверстии 9 для вывода перфузионного раствора.

Трехмерная модель заявленной перфузионной камеры была разработана в свободной проектной среде Tinkercad (Autodesk), которая также применима и ко всем описанным выше известным как таковым технологиям.

В представленных примерах в качестве метода изготовления была использована аддитивная технология 3D печати, а в качестве материала для перфузионной камеры – пластики для 3D-печати методом послойного наплавления (см. Таблицу на Фиг.1), например, полилактид (PLA), являющиеся диэлектриками и не вступающие в реакцию с перфузионными физиологическими растворами. Эксплуатация заявленной перфузионной камеры происходит при температуре 30-40 °С, малых динамических нагрузках и в течение небольшого промежутка времени. Поэтому все характеристики представленных в Таблице на Фиг.1 примеров материалов удовлетворяют предполагаемым условиям эксплуатации. При этом заявитель не ограничивает объем патентных притязаний по материалу заявленной перфузионной камеры только полилактидом PLA, приведенным в разделе осуществления заявленного технического решения настоящего описания, а расширяет объем патентных притязаний до любого пластика, обладающего диэлектрическими свойствами, например, наиболее широко используемых в 3D-печати пластиков, представленных на Фиг.1.

Для соединения перфузионной камеры с перфузионной системой используют трубки, например, силиконовые.

Далее заявителем приводится описание проточной перфузионной системы.

Проточная перфузионная система представляет собой последовательно расположенные элементы перфузионной системы, где каждый следующий элемент находится ниже предыдущего для обеспечения гравитационной подачи жидкости, включая буферный резервуар 16, соединительную трубку, капельницу-регулятор 17, соединительную трубку, нагревательный линейный проточный элемент 18, заявленную перфузионную камеру, гибкое соединение 19, выполненное из двух штуцеров, соединенных гибкой трубкой, регулятор уровня перфузионного раствора 20, канал вакуумного отсоса 21, подсоединенный к системе вакуумного отсоса; при этом буферный резервуар 16 соединен через соединительную трубку с капельницей-регулятором 17 с возможностью регулирования скорости потока перфузионного раствора, а также с возможностью гальванической развязки перфузионного раствора в заявленной перфузионной камере и буферном резервуаре 16, при этом капельница-регулятор 17 в свою очередь соединена посредством соединительной трубки с нагревательным линейным проточным элементом 18 с возможностью установления требуемой температуры перфузионного раствора, при этом выход нагревательного линейного проточного элемента 18 соединен посредством трубки с каналом для входа перфузионного раствора 2 заявленной перфузионной камеры посредством трубки, при этом отверстие для выхода перфузионного раствора 9 заявленной перфузионной камеры присоединено посредством гибкого соединения, выполненного из двух штуцеров, соединенных гибкой трубкой, например, силиконовой, и связано с  регулятором уровня перфузионного раствора 20 с возможностью его возвратно-поступательного вертикального перемещения и возможностью осуществления таким образом регулирования уровня перфузионного раствора в основной камере за счет эффекта сообщающихся сосудов, с возможностью удаления излишков перфузионного раствора в регуляторе уровня перфузионного раствора 20 через канал вакуумного отсоса 21, подсоединенного к системе вакуумного отсоса.

Ниже приведены примеры конкретного осуществления использования заявленного технического решения.

Пример 1. Крепление заявленной перфузионной камеры к животному и монтаж на стереотаксический аппарат (Фиг. 3).

Для выполнения экспериментов использовали самцов и самок крыс линии Wistar с постнатальных дней [P] 4-7 (3 крысы).

Операция проводили под изофлурановой анестезией, например, 5% при индукции и 1,5% во время операции.

Сначала проводят предварительную подготовительную операцию по удалению скальпа и покровных тканей над согреваемым животным под анестезией.

После удаления скальпа череп очищают и покрывают цианакрилатным клеем, за исключением окна размером ~ 50 мм² над корой для размещения электродов.

Животных согревали для восстановления после наркоза.

Во время записи голову крепят к перфузионной камере в предусмотренном месте крепления цианакрилатным клеем (для предварительной фиксации) и, затем, стоматологическим цементом (для надежной фиксации).

Животных окружают ватой и подогревают с помощью термоковрика, например, при температуре 35–37°C.

Во время эксперименты крысы находились под наркозом посредством внутрибрюшинной инъекции уретана концентрацией, например, 1.5 г/кг.

Заявленную перфузионную камеру крепят к животному 12 в предусмотренном месте крепления к черепу животного 11 (Фиг.2), а также к стереотаксическому аппарату 13, например, таким образом, как показано на Фиг.3: в монтажные пазы 10 вставляют болты 14, например, болты М4, которые проходят сквозь опорные колонны 15, на которые опирается заявленная перфузионная камера, и крепят в стереотаксическом аппарате 13 посредством, например, гаек М4.

Пример 2. Подключение проточной перфузионной системы (Фиг. 4).

После соединения заявленной перфузионной камеры с черепом животного и ее фиксации на стереотаксическом аппарате, например, как это было показано в Примере 1, осуществляют подключение заявленной перфузионной камеры к проточной перфузионной системе, например, таким образом, как показано на Фиг.4.

В качестве перфузионного раствора используют, например, искусственную спинномозговую жидкость следующего состава: 126 мМ NaCl, 3.5 мМ KCl, 1.2 мМ NaH₂PO₄, 2 мМ CaCl₂, 13 мМ MgCl₂).

Проточная перфузионная система организована следующим образом.

Каждый следующий элемент перфузионной системы располагается ниже предыдущего для обеспечения гравитационной подачи жидкости.

Перфузионный раствор поступает из буферного резервуара 16 в капельницу-регулятор 17 через соединительную трубку, например, силиконовую.

Капельница-регулятор 17 используется для гальванической развязки перфузионного раствора в заявленной перфузионной камере и буферного резервуара 16, а также для регуляции скорости потока перфузионного раствора.

Далее капельницу-регулятор 17 подсоединяют с помощью трубки, например, силиконовой, к нагревательному линейному проточному элементу 18 для достижения необходимой температуры перфузионного раствора.

Выход нагревательного линейного проточного элемента 18 соединяется с каналом для входа перфузионного раствора 2 с помощью трубки, например, силиконовой.

После прохода через систему каналов и камер заявленной перфузионной камеры перфузионный раствор покидает ее через отверстие для выхода перфузионного раствора 9. Отверстие для выхода перфузионного раствора 9 посредством гибкого соединения 19, состоящего из двух штуцеров, соединенных гибкой трубкой, например, силиконовой, связано с регулятором уровня перфузионного раствора 20, имеющего возможность перемещения вверх-вниз и осуществления таким образом регуляции уровня перфузионного раствора в основной камере 7 за счет эффекта сообщающихся сосудов.

Излишки перфузионного раствора в регуляторе уровня перфузионного раствора 20 удаляются через канал вакуумного отсоса 21, подсоединенного к системе вакуумного отсоса.

Пример 3. Использование заявленной перфузионной камеры для  многоканальной регистрации электрических сигналов головного мозга крысы при разных температурных условиях во время стимуляции вибриссы (Фиг. 5).

Заявителем проверена возможность использования заявленной перфузионной камеры для электрофизиологического исследования активности мозга при различных температурах.

Для этого заявленную перфузионную камеру крепят к животному и стереотаксическому аппарату по Примеру 1 .

Затем заявленную перфузионную камеру подсоединяют к проточной перфузионной системе по Примеру 2.

В Примере 3 используется проточная перфузионная система, приведенная на Фиг.3. Изменение температуры мозга производится за счет изменения температуры перфузионной жидкости. Датчики температуры размещают через канал для ввода датчика температуры входного перфузионного раствора 4 в предварительной камере 5 и отверстии для выхода перфузионного раствора 9, далее контролируют фактическую температуру входного и выходного раствора.

В случае если нет необходимости контроля фактической температуры входного и выходного раствора, датчики температуры не размещают.

С целью избежания грыжи мозга наружу после удаления достаточно большого фрагмента черепа и твердой мозговой оболочки, заявитель перед проведением эксперимента использует прижим для мозга 25 (Фиг.5А), изготовленный с использованием аддитивных технологий 3D-печати, который (прижим для мозга) размещают после удаления участка черепа и твердой мозговой оболочки непосредственно на поверхности мозга в основной камере 7 заявленной перфузионной камеры.

Прижим представляет собой тонкий (~0.2 мм) перфорированный пластиковый диск с гладкой поверхностью и набором периодических круглых отверстий (перфорации) диаметром ~1 мм. Прочность конструкции прижима увеличена заявителем за счет добавления борта по периметру диска.

Усиленный перфорированный пластиковый диск с крепежным элементом соединяют две ручки. Для удобства использования мозговой прижим разделен заявителем на две части – собственно прижим поверхности мозга 25 и держатель прижима 26. Это позволяет легко и быстро заменять прижим в случае его поломки, при существенном сокращении времени посредством применения повторной печати.

Держатель прижима вставляют в микроманипулятор для точной регулировки положения и степени давления на ткани мозга. В данном эксперименте прижим для мозга помещали непосредственно над поверхностью мозга сразу после предварительного удаления части кости черепа (~4 мм²).

Заявленная система в виде комбинации заявленной перфузионной камеры и прижимного устройства для мозга, изготовленных с помощью 3D-печати, обеспечивает успешное исследование влияния температуры мозга на нейрональную активность в представительстве одной вибриссы в коре головного мозга крысы под перфузией.

Далее перед экспериментом вибриссы на морде животного обрезали до длины 3 мм. Вибриссы стимулировали методом пьезодефлекции.

К концу пьезодефлектора (Noliac) приклеивали кусок губки и вставляли в губку вибриссы для стимуляции всех вибрисс.

Чтобы вызвать отклонение пьезодефлекторов, применяли прямоугольные импульсы амплитудой 80–90 В и длительностью 10 мс.

Чтобы избежать подавления вызванного ответа, стимуляцию вибрисс проводили каждые 50 с.

Проточный нагреватель раствора (Warner instruments) использовали для регулирования температуры раствора.

Датчики температуры 23 (Фиг.5А) (терморезисторы, Warner instruments) размещали через канал для ввода датчика температуры входного перфузионного раствора 4 в предварительной камере 5 и отверстии для выхода перфузионного раствора 9 для контроля фактической температуры входного и выходного раствора.

Данные с датчиков температуры 23 обрабатывали с помощью усилителя электрических сигналов Digidata 1440A (Axon Instruments).

Полученные результаты были использованы для оценки температуры раствора в основной камере 7.

В конце эксперимента также измеряли температуру тела и мозга с помощью датчиков температуры, располагая их ректально и непосредственно в мозге, соответственно.

Во всех протоколах использовался дополнительный ректальный датчик температуры для контроля температуры тела животного.

Опорный электрод 22 (Фиг.5А) в виде серебряной хлорированной проволоки помещали в специальный  канал для ввода опорного электрода 3.

Внеклеточные записи вызванной кортикальной активности были выполнены с использованием, например, кремниевого одностержневого 16-канального электрода (Neuronexus Technologies, США с расстоянием между электродами 100 мкм). Регистрирующий многоканальный электрод 24 (Фиг.5А) располагали вертикально и перпендикулярно поверхности мозга на глубине 1500 мкм от поверхности. Регистрирующий многоканальный электрод 24 был размещен в соматосенсорной коре крысы для одновременной регистрации  вызванной внеклеточной электрической активности - локального полевого потенциала (ЛПП) и мультиклеточной активности (МКА).

Анализ электрофизиологических данных проводили на основе записей 15 кортикальных ответов.

Необработанные данные были предварительно подготовлены с использованием специально разработанных функций в MATLAB (MathWorks).

Исходные данные были исследованы для обнаружения МКА с последующим понижением частоты дискретизации исходных данных до 1000 Гц для дальнейшего спектрального анализа ЛПП. Анализ проводился в окнах 500 мс после стимула для определения вызванной активности [Suchkov, D., Sintsov, M., Sharipzyanova, L., Khazipov, R., & Minlebaev, M. /. Attenuation of the Early Gamma Oscillations During the Sensory-Evoked Response in the Neonatal Rat Barrel Cortex // BioNanoScience (2016), 6(4), 575–577. doi:10.1007/s12668-016-0289-7]. MUA был обнаружен при полосовом сигнале (> 200 и <4000 Гц), когда все отрицательные события, превышающие 3,5 SD, считались пиками (достоверность> 99,9%) [Mitrukhina, O., Suchkov, D., Khazipov, R., & Minlebaev, M. / Imprecise Whisker Map in the Neonatal Rat Barrel Cortex // Cerebral Cortex (2014), 25(10), 3458–3467. doi:10.1093/cercor/bhu169].

На Фиг.5Б приведены графики зависимости характера вызванной сенсорной активности мозга от температуры мозга, иллюстрирующие влияние температуры мозга на нейрональную активность в представительстве одной вибриссы в коре головного мозга крысы под перфузией.

Приведенные данные демонстрируют выраженную зависимость сенсорной активности от температуры мозга – длительность вызванного ЛПП поддержанного МКА увеличивается по мере понижения температуры мозга. Кроме того, при понижении температуры в вызванном ответе прослеживается постепенное доминирование медленноволновых осцилляций. При этом возвращение температуры мозга к начальным значениям восстанавливает контрольные параметры вызванной электрической активности, что говорит о наличии именно температурной зависимости.

Пример 4. Использование заявленной системы для одновременной регистрации вызванного внутреннего оптического сигнала и электрических сигналов соматосенсорной коры головного мозга крысы во время стимуляции вибрисс (Фиг. 6).

Заявителем проверена возможность использования заявленной системы для электрофизиологического исследования активности мозга при различных температурах.

Комбинация перфузионной камеры и прижимного устройства для мозга как, например, по Примеру 3, позволяет успешно использовать методы нейровизуализации для предварительного определения положения соматосенсорной коры [Minlebaev, M., Colonnese, M., Tsintsadze, T., Sirota, A., and Khazipov, R. / Early gamma oscillations synchronize developing thalamus and cortex // Science (2011) 334, 226–229. DOI: 10.1126/science.1210574].

Среди множества подходов, используемых в нейровизуализации, регистрация и анализ внутреннего оптического сигнала (ВОС) позволяет охарактеризовать свойства активной нейрональной ткани.

Заявителем использованы параметры восстановленных с помощью ВОС компонентов рассеяния света и кровенаполнения нейрональной ткани, чтобы найти и охарактеризовать активные области коры (Фиг.5Б).

Для этого создают заявленную систему.

Для этого заявленную перфузионную камеру крепят к животному и стереотаксическому аппарату по Примеру 1.

Затем заявленную перфузионную камеру подсоединяют к проточной перфузионной системе по Примеру 2. В Примере 4 используется проточная перфузионная система, указанная на Фиг.2.

Изменение температуры мозга производят за счет изменения температуры перфузионной жидкости.

Подготовка вибрисс животного и проведение электрофизиологической регистрации с использованием прижима мозга проводили по Примеру 3. Регистрирующий многоканальный электрод 24 (Фиг.5А, 5Б) был размещен в соматосенсорной коре крысы для одновременной регистрации  вызванной внеклеточной электрической активности - локального полевого потенциала (ЛПП) и мультиклеточной активности (МКА).

Внутренний оптический сигнал (ВОС) был зарегистрирован с использованием системы видеозаписи как показано на Фиг.6А. ПЗС камера 27 была расположена перпендикулярно черепу над предполагаемым расположением соматосенсорной коры. Для обнаружения ВОС ПЗС камера 27 (сокр. от «прибор с зарядовой связью» [https://ru.wikipedia.org/wiki/ПЗС-матрица]) была сфокусирована через оптическую систему 28, например, микроскопа на 400–1200 мкм (в зависимости от возраста животного) ниже поверхности черепа на ожидаемую глубину таламореципиентного четвертого слоя соматосенсорной коры.

Для оценки компонентов рассеяния нервной ткани и кровотока использовалась подсветка поверхности мозга инфракрасным диодом 29 (LED Engin, LZ1-00R400, 850 нм) и зеленым/красным 30 (OSRAM, LRT GFTM-ST7-1 + VV9-29-0-A-R33-ZB, 572/610 нм) диодами. Отраженный свет собирался ПЗС камерой 27 (QICAM Fast 1394, разрешение 130x174, 1 пиксель = 35 мкм). Оптическая стабилизация изображения была рассчитана на основе среднего значения двадцати повторных видеосъемок. Каждая видеосъемка имела длительность 100 сек, включающую: 5 сек периода до стимуляции, 10 сек серии отклонений вибрисс с частотой 2 Гц и длительностью 10 мсек каждое, 85 сек периода после стимуляции. Во время предварительной обработки записанное видео подвергалось изменению частоты дискретизации до 10 Гц с последующим обнаружением ВОС, когда усредненные видеокадры во время стимуляции сравнивались с усредненными видеокадрами до стимуляции. Координаты представляющих интерес кортикальных представительств вибрисс определяли с помощью визуализации ВОС, описанной выше.

Результаты одновременно зарегистрированной электрической активности мозга и внутреннего оптического сигнала представлены на Фиг.6Б, 6Д. Также на Фиг.6В, 6Г продемонстрированы восстановленные с помощью ранее разработанного метода [Sintsov M, Suchkov D, Khazipov R, Minlebaev M. / Developmental changes in sensory-evoked optical intrinsic signals in the rat barrel cortex // Front Cell Neurosci. (2017) 11:392. DOI: 10.3389/fncel.2017.00392] изменения светового рассеяния и кровенаполнения нейрональной ткани во время сенсорной активации участка соматосенсорной коры, находящегося под перфузией в заявленной перфузионной камере.

Основываясь на полученных результатах эксперимента, приведенных на Фиг.6Б, представляется возможность сделать следующие выводы:

- в области расположения внеклеточного электрода наблюдается наличие ВОС, что отмечено потемнением на визуализации ВОС на Фиг.6Б.

- на одном из каналов регистрирующего многоканального электрода 24, находящемся на глубине таламорецепиентного слоя соматосенсорной коры, наблюдается вызванная электрическая активность в виде высокоамплитудных колебаний ЛПП, поддержанных МКА.

- заявленная перфузионная камера может быть использована как для проведения совместных электрофизиологических и оптических исследований мозга, так и для проведения отдельных электрофизиологических или оптических исследований мозга.

Это говорит о том, что нейрональная ткань мозга действительно активировалась в рассматриваемой области, способствуя появлению вызванного ВОС и демонстрируя наличие вызванной электрической активности. В свою очередь, активность нейрональной ткани имеет двухкомпонентную природу [Hillman, E. M. C. // Optical brain imaging in vivo: techniques and applications from animal to man // J. Biomed. Opt. (2008). 12:051402. DOI: 10.1117/1.2789693], проявляющуюся в рассеянии света (тканевая компонента) и изменении кровенаполнения (гемодинамическая компонента). Благодаря разработанному ранее методу [Sintsov M, Suchkov D, Khazipov R, Minlebaev M. / Developmental changes in sensory-evoked optical intrinsic signals in the rat barrel cortex // Front Cell Neurosci. (2017) 11:392. DOI: 10.3389/fncel.2017.00392] и используя ВОС от разных длин волн освещения, заявителю удалось восстановить относительные изменения этих компонент, отраженных на Фиг.6В (гемодинамическая) и на Фиг.6Д (тканевая). Изменения этих компонент показали наличие изменения физиологического состояния изучаемой области, что может быть далее детально изучено.

Таким образом, заявленная перфузионная камера, заявленная система с ее использованием и заявленный способ ее работы позволили контролировать температуру перфузионного раствора одновременно с проведением электрофизиологических и оптических исследований активности соматосенсорной коры крысы in vivo. С помощью заявленной перфузионной камеры, заявленной системы с ее использованием и заявленного способа ее работы заявителем впервые показано, что температура оказывает существенное влияние на параметры вызванной кортикальной активности, например, у крыс. Таким образом, заявленное техническое решение обеспечивает условия как для раздельной, так и одновременной электрофизиологической и оптической регистрации активности головного мозга in vivo с возможностью постоянного контроля температуры поверхности головного мозга.

Из изложенного выше можно сделать вывод, что заявителем достигнуты поставленные цели и заявленный технический результат,  а именно – разработана перфузионная камера для исследования активности головного мозга in vivo, система с ее использованием и способ работы системы. Заявленное изобретение позволяет использовать принципы перфузионной камеры для исследования активности головного мозга in vivo.

При этом разработана монолитная конструкция перфузионной камеры, состоящая из несущего корпуса с технологическими каналами, желобами и камерами для обеспечения стационарной регулируемой перфузии, а также предусмотренной возможностью крепления к черепу животного и стереотаксическому аппарату, система с ее использованием и способ работы системы, обеспечивающие:

– возможность контроля температуры входного и выходного перфузионного раствора за счет специально предусмотренного канала для ввода датчика температуры входного перфузионного раствора 4 и осуществимости размещения датчика температуры в специально расположенном отверстии для выхода перфузионного раствора 9;

– использование регулируемой системы прижима перфузионной камеры к открытой поверхности мозга за счет внешних конструкций с возможностью проведения электрофизиологических и оптических исследований мозга, а также отсутствие необходимости предварительного соединения с прижимными устройствами тканей мозга, что позволяет регулировать степень давления на ткани мозга, использовать участки черепа животного с любой кривизной, а также дает возможность локальной смены зоны исследования;

– наличие конструкционных признаков для нивелирования артефактов перфузии, а именно - предварительной камеры 5, входного спиралевидного желоба 6 и выходного спиралевидного желоба 8;

– наличие регулируемой системы относительного положения перфузионной камеры в пространстве за счет использования специально предусмотренных монтажных пазов 10 для крепления к стереотаксическому аппарату;

– наличие возможности у перфузионной камеры обеспечения широкого угла обзора исследуемой зоны, что в свою очередь обеспечивает возможность проведения также и оптических исследований;

– отсутствие составных частей наряду с применением прижима поверхности мозга с держателем, что упростило эксплуатацию.

При этом в приведенных примерах продемонстрировано, что заявленные перфузионная камера, система с ее использованием и способ работы системы:

- позволяет исследовать нейрональную активность in vivo при долговременных контролируемых фармакологических условиях.

- обеспечивает неограниченный доступ к обширной области головного мозга для электрофизиологических исследований.

- обеспечивает возможность регулировать температуру мозга для исключения проблемы неконтролируемой потери тепла мозгом.

- обеспечивает возможность оптического исследования мозговой активности с использованием оптического диапазона видимого света и ближнего инфракрасного излучения.

При этом заявленное техническое решение было показано на примере изготовления по аддитивной технологии с помощью 3D-печати из пластика, обладающего диэлектрическими свойствами.

Заявленное техническое решение позволяет производить как электрофизиологические исследования активности мозга in vivo, так и оптические исследования, и успешно использовано для исследования активности головного мозга in vivo.

Заявленное техническое решение при необходимости может быть использовано для крепления головы животного к стереотаксическому аппарату для проведения других исследований in vivo, что не порочит заявленных целей и достигаемого технического результата.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники заявителем не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью существенных признаков.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками заявленного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на заявленный технический результат.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемой к изобретениям, так как может быть изготовлена на стандартном оборудовании с использованием известных материалов и деталей.

1. Перфузионная камера для исследования активности головного мозга in vivo, представляющая собой монолитную конструкцию, выполненную из пластика, обладающего диэлектрическими свойствами, с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, состоящую из несущего корпуса, содержащего канал для входа перфузионного раствора, канал для ввода опорного электрода, канал для ввода датчика температуры входного перфузионного раствора, предварительную камеру, входной спиралевидный желоб между предварительной и основной камерами, основную камеру, выходной спиралевидный желоб между основной камерой и отверстием для выхода перфузионного раствора, отверстие для выхода перфузионного раствора, монтажные пазы, место для крепления черепа животного; при этом входные каналы перфузионной камеры выполнены в виде сквозных протоков, выходящих в предварительную камеру, предварительная камера соединяется с основной камерой с помощью входного спиралевидного желоба; выход из предварительной камеры расположен выше дна основной камеры с возможностью гравитационной подачи жидкости, основная камера имеет форму усеченного параболоида вращения, при этом основная камера соединена выходным спиральным желобом с отверстием для выхода перфузионного раствора в нижней части перфузионной камеры с возможностью размещения второго датчика температуры контроля температуры выходного раствора; а по периметру перфузионной камеры расположены три монтажных паза для крепления к стереотаксическому аппарату; место крепления черепа животного расположено снизу основной камеры и выполнено в виде усеченного конуса, адаптированного к размеру и кривизне черепа исследуемого животного.

2. Система исследования активности головного мозга in vivo с использованием перфузионной камеры, состоящая из перфузионной камеры и прижима мозговой поверхности,

при этом перфузионная камера выполнена в виде монолитной конструкции из пластика, обладающего диэлектрическими свойствами, с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, состоящую из несущего корпуса, содержащего канал для входа перфузионного раствора, канал для ввода опорного электрода, канал для ввода датчика температуры входного перфузионного раствора, предварительную камеру, входной спиралевидный желоб между предварительной и основной камерами, основную камеру, выходной спиралевидный желоб между основной камерой и отверстием для выхода перфузионного раствора, отверстие для выхода перфузионного раствора, монтажные пазы, место для крепления черепа животного; при этом входные каналы перфузионной камеры выполнены в виде сквозных протоков, выходящих в предварительную камеру, предварительная камера соединяется с основной камерой с помощью входного спиралевидного желоба; выход из предварительной камеры расположен выше дна основной камеры с возможностью гравитационной подачи жидкости, основная камера имеет форму усеченного параболоида вращения, при этом основная камера соединена выходным спиральным желобом с отверстием для выхода перфузионного раствора в нижней части перфузионной камеры с возможностью размещения второго датчика температуры контроля температуры выходного раствора; а по периметру перфузионной камеры расположены три монтажных паза для крепления к стереотаксическому аппарату; место крепления черепа животного расположено снизу основной камеры и выполнено в виде усеченного конуса, адаптированного к размеру и кривизне черепа исследуемого животного;

при этом прижим мозговой поверхности выполнен из пластика с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, и представляет собой пластиковый диск с гладкой поверхностью и перфорированный набором периодических круглых отверстий, оснащенный техническим бортом по периметру диска с возможностью усиления конструкции, при этом усиленный пластиковый диск соединен с крепежным элементом с помощью двух ручек, а крепежный элемент вставлен в держатель прижима, при этом прижим мозговой поверхности выполнен с возможностью замены в случае его поломки с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, при этом держатель прижима установлен в микроманипуляторе с возможностью регулировки как положения, так и степени давления на ткани мозга; прижим мозговой поверхности размещен непосредственно на поверхности мозга в основной камере перфузионной камеры после крепления к животному и удаления участка черепа и твердой мозговой оболочки.

3. Система исследования активности головного мозга in vivo с использованием перфузионной камеры, состоящая из перфузионной камеры, прижима мозговой поверхности, системы крепления к стереотаксическому аппарату и проточной перфузионной системы,

при этом перфузионная камера представляет собой монолитную конструкцию, выполненную из пластика, обладающего диэлектрическими свойствами, с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, состоящую из несущего корпуса, содержащего канал для входа перфузионного раствора, канал для ввода опорного электрода, канал для ввода датчика температуры входного перфузионного раствора, предварительную камеру, входной спиралевидный желоб между предварительной и основной камерами, основную камеру, выходной спиралевидный желоб между основной камерой и отверстием для выхода перфузионного раствора, отверстие для выхода перфузионного раствора, монтажные пазы, место для крепления черепа животного; при этом входные каналы перфузионной камеры выполнены в виде сквозных протоков, выходящих в предварительную камеру, предварительная камера соединяется с основной камерой с помощью входного спиралевидного желоба; выход из предварительной камеры расположен выше дна основной камеры с возможностью гравитационной подачи жидкости, основная камера имеет форму усеченного параболоида вращения, при этом основная камера соединена выходным спиральным желобом с отверстием для выхода перфузионного раствора в нижней части перфузионной камеры с возможностью размещения второго датчика температуры контроля температуры выходного раствора; а по периметру перфузионной камеры расположены три монтажных паза для крепления к стереотаксическому аппарату; место крепления черепа животного расположено снизу основной камеры и выполнено в виде усеченного конуса, адаптированного к размеру и кривизне черепа исследуемого животного;

при этом прижим мозговой поверхности выполнен из пластика с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, и представляет собой пластиковый диск с гладкой поверхностью и перфорированный набором периодических круглых отверстий, оснащенный техническим бортом по периметру диска с возможностью усиления конструкции, при этом усиленный пластиковый диск соединен с крепежным элементом с помощью двух ручек, а крепежный элемент вставлен в держатель прижима, при этом прижим мозговой поверхности выполнен с возможностью замены в случае его поломки с применением технологии, использующей в основе трехмерную цифровую модель, при этом держатель прижима установлен в микроманипуляторе с возможностью регулировки как положения, так и степени давления на ткани мозга; прижим мозговой поверхности размещен непосредственно на поверхности мозга в основной камере перфузионной камеры после крепления к животному и удаления участка черепа и твердой мозговой оболочки;

при этом система крепления к стереотаксическому аппарату представляет собой опорные колонны, на которые опирается перфузионная камера в местах монтажных пазов, при этом сквозь монтажные пазы перфузионной камеры и опорные колонны проходят болты, закрепляемые в стереотаксическом аппарате, а заявленная перфузионная камера крепится к животному в предусмотренном месте крепления к черепу животного;

при этом проточная перфузионная система представляет собой последовательно расположенные элементы перфузионной системы, где каждый следующий элемент находится ниже предыдущего для обеспечения гравитационной подачи жидкости, включая буферный резервуар, соединительную трубку, капельницу-регулятор, соединительную трубку, нагревательный линейный проточный элемент, перфузионную камеру, гибкое соединение, выполненное из двух штуцеров, соединенных гибкой трубкой, регулятор уровня перфузионного раствора, канал вакуумного отсоса, подсоединенный к системе вакуумного отсоса; при этом буферный резервуар соединен через соединительную трубку с капельницей-регулятором с возможностью регулирования скорости потока перфузионного раствора, а также с возможностью гальванической развязки перфузионного раствора в перфузионной камере и буферном резервуаре, при этом капельница-регулятор в свою очередь соединена посредством трубки с нагревательным линейным проточным элементом с возможностью установления требуемой температуры перфузионного раствора, при этом выход нагревательного линейного проточного элемента соединен посредством трубки с каналом для входа перфузионного раствора перфузионной камеры посредством трубки, при этом отверстие для выхода перфузионного раствора перфузионной камеры присоединено посредством гибкого соединения, выполненного из двух штуцеров, соединенных гибкой трубкой, и связано с регулятором уровня перфузионного раствора с возможностью его возвратно-поступательного вертикального перемещения и возможностью осуществления таким образом регулирования уровня перфузионного раствора в основной камере за счет эффекта сообщающихся сосудов, с возможностью удаления излишков перфузионного раствора в регуляторе уровня перфузионного раствора через канал вакуумного отсоса, подсоединенного к системе вакуумного отсоса.

4. Способ исследования активности головного мозга in vivo с помощью системы по п. 3, заключающийся в том, что

проводят предварительную подготовительную операцию по удалению скальпа и покровных тканей над согреваемым животным под анестезией, далее череп животного крепят к перфузионной камере в предусмотренном месте крепления с помощью сначала цианакрилатного клея, затем стоматологического цемента, далее выполняют крепление перфузионной камеры в стереотаксическом аппарате с использованием монтажных пазов, в которые далее вставляют болты, проходящие сквозь опорные колонны, на которые в свою очередь опирается заявленная перфузионная камера;

далее перфузионную камеру подключают к проточной перфузионной системе, для чего выход нагревательного линейного проточного элемента соединяют с каналом для входа перфузионного раствора перфузионной камеры посредством трубки, далее отверстие для выхода перфузионного раствора перфузионной камеры присоединяют посредством гибкого соединения, выполненного из двух штуцеров, соединенных гибкой трубкой, к регулятору уровня перфузионного раствора, который совершает возвратно-поступательное вертикальное перемещение и осуществляет таким образом регулирование уровня перфузионного раствора в основной камере за счет эффекта сообщающихся сосудов, при этом излишки перфузионного раствора в регуляторе уровня перфузионного раствора удаляют через канал вакуумного отсоса, подсоединенного к системе вакуумного отсоса;

далее размещают датчики температуры через канал для ввода входного перфузионного раствора в предварительной камере и отверстия для выхода перфузионного раствора для контроля фактической температуры входного и выходного раствора;

далее удаляют участок черепа и твердой мозговой оболочки, после чего размещают прижим поверхности мозга непосредственно на поверхности мозга в основной камере перфузионной камеры;

далее проводят электрофизиологические исследования активности мозга с использованием опорного электрода в виде серебряной хлорированной проволоки, помещенной в канал для ввода опорного электрода и регистрирующих электродов, расположенных в мозге через отверстия перфорированного усиленного пластикового диска;

далее проводят оптические исследования активности мозга с помощью регистрации системами видеонаблюдения отраженного от тканей мозга электромагнитного излучения видимого и инфракрасного диапазонов в областях отверстий перфорированного усиленного пластикового диска.