Изобретение относится к иммунологии и вирусологии. Создано иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к патогенным для человека филовирусам, включающее основу, представляющую собой рекомбинантный аденовирус человека 26 серотипа или 5 серотипа, содержащий экспрессионную кассету SEQIDNO:1, или SEQIDNO:2, или SEQIDNO:3, или SEQIDNO:4, или SEQIDNO:5, или SEQIDNO:6, или SEQIDNO:7, или SEQIDNO:8. Кроме того, создано иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к патогенным для человека филовирусам, включающее основу, представляющую собой рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий нуклеиновую кислоту, соответствующую кДНК SEQIDNO:9, или SEQIDNO:10, или SEQIDNO:11, или SEQIDNO:12, или SEQIDNO:13, или SEQIDNO:14, или SEQIDNO:15, или SEQIDNO:16. Также был разработан способ использования иммунобиологического средства, заключающийся в его введении в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета против вируса Эбола и/или вируса Марбург. При этом возможно последовательное введение в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств с интервалом более чем в 1 неделю или одновременное введение в организм млекопитающих нескольких иммунобиологических средств. Разработанные варианты иммунобиологического средства могут вводиться интраназально и/или подкожно и/или внутримышечно. Изобретение может быть использовано в качестве специфического профилактического средства против заболеваний, вызванных вирусом Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), Marburg virus (MARV). 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 14 табл., 13 пр.

Область техники

Изобретение относится к иммунологии и вирусологии и может быть использовано для создания специфического профилактического средства против заболеваний, вызванных вирусом Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), Marburg virus (MARV).

Предшествующий уровень техники

Filoviridae – это семейство РНК-содержащих вирусов, которое по современной классификации включает 6 родов: Cuevavirus, Dianlovirus, Ebolavirus, Marburgvirus, Striavirus, Thamnovirus (https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/negative-sense-rna-viruses/mononegavirales/w/filoviridae). Из них патогенными для человека считаются 2 рода: Marburgvirus и Ebolavirus.

Род Marburgvirus включает два вида: Marburg virus (MARV) и Ravn virus (RAVV). Впервые Marburg virus был выделен в 1967 году, во время вспышки геморрагической лихорадки у работников завода по производству вакцины от полиомиелита, которые контактировали с тканями гриветов. Вспышки были зафиксированы в трех городах: г.Марбурге, г.Франкфурте и г.Белграде. В общей сложности заразился 31 человек, 7 из которых погибли. Впоследствии вспышки болезни и отдельные случаи заболевания регистрировались в Анголе, Демократической Республике Конго, Кении, Уганде и Южной Африке. Ravn virus был впервые описан в 1987 году и назван в честь датского пациента, от которого он был выделен. Оба вида Marburgvirus вызывают марбургскую геморрагическую лихорадку, которая является тяжелым заболеванием с высокой смертностью, которая в некоторых вспышках доходила до 90%. Начальные симптомы заболевания включают высокую температуру, головную боль, озноб, тошноту, рвоту, диарею, фарингит, макулопапулезную сыпь, боль в животе, конъюнктивит. В дальнейшем развивается одышка, отек, инъекция конъюнктивы, вирусная экзантема и нарастают неврологические симптомы: спутанность сознания, делирий, апатию, агрессию, энцефалит. Геморрагические симптомы появляются в конечной стадии заболевания и включают кровавый стул, экхимозы, подтекание крови из мест венепункции, слизистые и висцеральные кровотечения. Гибель больных может наступить от отека легких или мозга, гиповолемического шока, ДВС-синдрома, острой почечной недостаточности. С момента начала наблюдения было зафиксировано 466 случаев заболевания, погибло 373 человека. (https://www.cdc.gov/vhf/marburg/outbreaks/chronology.html)

Род Ebolavirus включает 6 видов: Ebola virus (EBOV), Reston virus (RESTV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), Taï Forest virus (TAFV), Bombali virus (BOMV). Три из них являются высокопатогенными для человека (Ebola virus, Bundibugyo virus, Sudan virus) и вызывают геморрагическую лихорадку Эбола. Это тяжелое заболевание, с острой манифестацией, без продромальных явлений. Первые симптомы включают лихорадку, головную боль, катаральные явления, миалгии. Позднее появляется неукротимая рвота, диарея, боли в животе, могут наблюдаться колющие боли в области грудной клетки, развивается обезвоживание организма, у 50% заболевших появляется геморрагическая сыпь, геморрагии в виде кожных кровоизлияний, наружных и внутренних кровотечений. С момента начала наблюдения было зафиксировано более 31 тысячи случаев заболевания, погибло более 12 тысяч человек. Самая крупная эпидемия была связанна с вирусом EBOV и произошла в 2014-2016 гг. Она затронула 5 стран Западной и Центральной Африки и унесла жизни более одиннадцати тысяч человек. SUDV стал причиной нескольких вспышек в Уганде и Южном Судане (412 погибших). BDBV, обнаруженный в 2007 году, был связан с двумя вспышками: в Демократической Республике Конго и в Уганде, и унес жизни 50 человек (https://www.cdc.gov/vhf/ebola/history/distribution-map.html).

Марбургская геморрагическая лихорадка и геморрагическая лихорадка Эбола – это зоонозные инфекции. В настоящее время считается, что естественным резервуаром филовирусов являются рукокрылые (Rousettus aegyptiacus, Mops condylurus, Chaerephon pumilus и др.), которые широко распространены в природе. Развитие сельского хозяйства приводит к тому, что человек все теснее контактирует с дикой природой, а, следовательно, в будущем можно ожидать новых эпидемий связанных с филовирусами.

В настоящее время нет разрешенных к применению профилактических препаратов против марбургской геморрагической лихорадки и ограниченное число вакцин против геморрагической лихорадки Эбола.

Известно решение согласно патенту WO 2011130627 А2, в котором для индукции иммунного ответа к филовирусам (вирус Эбола, вирус Марбург) предполагается использование аденовирусов шимпанзе, которые содержат гены различных белков данных вирусов, в том числе белок GP вируса Эбола.

Существует решение по патенту СА 2821289 А1, согласно которому для индукции иммунного ответа против филовирусов используют рекомбинантный аденовирусный вектор на основе аденовирусов 26 и 35 серотипа, которые экспрессируют антигены филовирусов.

Известно решение согласно патенту US 20100047282 А1, где в качестве вакцины против геморрагической лихорадки Эбола используют рекомбинантный аденовирус, содержащий ген гликопротеина вируса Эбола (GP).

Известно решение согласно патенту СА 2493142 С, в котором для стимуляции иммунного ответа к вирусу Эбола используют рекомбинантный вирус везикулярного стоматита (VSV), содержащий ген гликопротеина, выбранный из группы, состоящей из гликопротеина вируса лихорадки Ласса, гликопротеина вируса Марбург и гликопротеина вируса Эбола, вставленный в вирусный геном так, что данная последовательность заменила исходный ген гликопротеина VSV. Недостатком данного решения является то, что при повторной вакцинации антитела к векторной части могут снижать эффективность вакцинации.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке нового иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против филовирусов на основе различных типов рекомбинантных вирусов.

Раскрытие изобретения

Технической задачей заявленного изобретения является расширение арсенала иммунобиологических средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против филовирусов: рода Ebolavirus: Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), и/или филовирусов рода Marburgvirus: Marburg virus (MARV).

Технический результат заключается в создании иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вирусов Эбола и/или Марбург на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа, содержащего экспрессионную кассету SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6, или SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8.

Кроме того, технический результат заключается в создании иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вирусов Эбола и/или Марбург на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего экспрессионную кассету SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6, или SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8.

А также, технический результат заключается в создании иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вирусов Эбола и/или Марбург на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего нуклеиновую кислоту, соответствующую кДНК SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO:12, или SEQ ID NO:13, или SEQ ID NO:14, или SEQ ID NO:15, или SEQ ID NO:16.

Кроме того, был разработан способ использования иммунобиологического средства, заключающийся в его введении в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета против вируса Эбола и/или вируса Марбург.

Также был разработан способ использования, который предусматривает последовательное введение в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств с интервалом более чем в 1 неделю.

Другой вариант использования предусматривает одновременное введение в организм млекопитающих нескольких иммунобиологических средств.

При этом разработанные варианты иммунобиологического средства могут вводиться интраназально и/или подкожно и/или внутримышечно.

Также был разработан вариант способа использования, заключающийся во введении в организм млекопитающих композиции, содержащей любое количество иммунобиологических средств. При этом композиция может вводиться многократно с интервалом более 1 недели.

Реализация изобретения

Гликопротеин (GP) – единственный белок, расположенный на поверхности вириона филовирусов. Он необходим для прикрепления вирусной частицы к клетке и последующей интернализации. Было показано, что GP является мишенью для вируснейтрализующих антител, а титры антител к GP коррелируют с защитой от заболевания. Все это делает его одним из самых перспективных вакцинных антигенов.

Гликопротеин филовируса (GP) синтезируется в виде предшественника GP0, который расщепляется фурином на GP1 и GP2. GP1 содержит рецептор-связывающий домен, гликановый кэп и сильно гликозилированный муцинподобный домен. GP2 включает трансмембранный домен, гибридный пептид и гептадные повторы, необходимые для слияния вируса с клеточной мембраной. GP1 и GP2 соединяются дисульфидной связью и образуют гетеродимер. Затем гетеродимеры GP1/GP2 собираются в тример, образующий шипы на поверхности вириона.

При этом муцинподобный домен характеризуется высокой вариабельностью. Для того, чтобы в результате вакцинации получить антитела к более консервативным эпитопам, из гена гликопротеина филовирусов удалили последовательность, кодирующую муцинподобный домен (GPΔmuc).

На основе генов GP филовирусов (Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), Marburg virus (MARV)) и их модификаций было предложено несколько вариантов экспрессионных кассет для аденовирусных векторов:

1) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:1, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Ebola virus (EBOV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ». Изменение последовательности гена GP было выполнено в соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что в данном месте образуется петля, которая является сложной структурой для прохождения ферментом полимеразой,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

2) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:2, которая содержит:

- CMV промотор,

- модифицированный ген GPΔmuc Ebola virus (EBOV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

3) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:3, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Bundibugyo virus (BDBV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

4) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:4, которая содержит:

- CMV промотор,

- модифицированный ген GPΔmuc Bundibugyo virus (BDBV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

5) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:5, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Sudan virus (SUDV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

6) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:6, которая содержит:

- CMV промотор,

- модифицированный ген GPΔmuc Sudan virus (SUDV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

7) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:7, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Marburg virus (MARV),

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

8) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:8, которая содержит:

- CMV промотор,

- модифицированный ген GPΔmuc Marburg virus (MARV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

Кроме того, было предложено несколько вариантов дискретных транскрипционных единиц для рекомбинантного вируса везикулярного стоматита:

1) Транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:9), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

2) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:10), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

3) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:11), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

4) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:12), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

5) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:13), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

6) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:14), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

7) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:15), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- полноразмерный ген GP Marburg virus (MARV),

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

8) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:16), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

В качестве экспрессионных векторов были выбраны рекомбинантные аденовирусы человека 5-го и 26-го серотипов и вектор на основе вируса везикулярного стоматита, которые способны индуцировать устойчивый Т-клеточный и гуморальный ответ, а также показывают высокие профили безопасности.

Таким образом были разработаны варианты иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа к филовирусам, который обеспечивают индукцию иммунного ответа к эпидемиологически значимым видам филовирусов.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1.

Разработка дизайна экспрессионных кассет.

На первом этапе работы производили выбор последовательности гена GP для каждого филовируса (Ebola virus, Bundibugyo virus, Sudan virus, Marburg virus) отдельно. Для анализа использовали последовательности, опубликованные в открытых базах данных. На основании нуклеотидной последовательности получали аминокислотную последовательность. Далее подсчитывали вариабельность аминокислот в каждой позиции и определяли консенсусную (консервативную) аминокислотную последовательность, которую затем сравнивали с полными последовательностями GP данного филовируса. По результатам проведенного исследования было определено, что самая близкая к консенсусной аминокислотная последовательность для Ebola virus (EBOV) - ID AIG 95977, для Bundibugyo virus (BDBV) - ID AGL73460, для Sudan virus (SUDV) - ID AGB56678, для Marburg virus (MARV) - ID AFV31307. Далее из аминокислотной последовательности получили нуклеотидную последовательность GP-EBOV, GP-BDBV, GP-SUDV, GP-MARV. Затем были разработаны модификации гена GP с удаленной последовательностью, кодирующей муцинподобный домен: GPΔmuc-EBOV, GPΔmuc-BDBV, GPΔmuc-SUDV, GPΔmuc-MARV.

Таким образом был разработан дизайн экспрессионных кассет для аденовирусных рекомбинантных векторов:

1) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:1, которая содержит:

- CMV промотор,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

2) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:2, которая содержит:

- CMV промотор,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

3) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:3, которая содержит:

- CMV промотор,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

4) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:4, которая содержит:

- CMV промотор,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

5) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:5, которая содержит:

- CMV промотор,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

6) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:6, которая содержит:

- CMV промотор,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

7) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:7, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Marburg virus (MARV),

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

8) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:8, которая содержит:

- CMV промотор,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

1) Транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:9), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

2) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:10), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

3) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:11), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

4) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:12), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

5) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:13), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

6) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:14), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

7) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:15), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- полноразмерный ген GP Marburg virus (MARV),

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

8) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:16), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

Синтез генов осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).

Пример 2.

Способ получения иммунобиологического средства на основе аденовируса человека 26 серотипа.

На первом этапе с помощью методов генной инженерии были получены плазмиды pAd26-Ends-GP-EBOV, pAd26-Ends-GPΔmuc-EBOV, pAd26-Ends-GP-BDBV, pAd26-Ends-GPΔmuc-BDBV, pAd26-Ends-GP-SUDV, pAd26-Ends-GPΔmuc-SUDV, pAd26-Ends-GP-MARV, pAd26-Ends-GPΔmuc-MARV, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа. После этого, полученные конструкции линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd26-too, который содержит геном аденовируса человека 26-го серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа (на месте ORF6 аденовируса человека 26 серотипа) и с делецией E1 и Е3-областей. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd26-too-GP-EBOV, pAd26-too-GPΔmuc-EBOV, pAd26-too-GP-BDBV, pAd26-too-GPΔmuc- BDBV, pAd26-too-GP-SUDV, pAd26-too-GPΔmuc-SUDV, pAd26-too-GP-MARV, pAd26-too-GPΔmuc-MARV, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа (на месте ORF6 аденовируса человека 26 серотипа) и с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, соответственно.

Далее, полученные плазмиды гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате был получен материал, который затем был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.

Таким образом, иммунобиологическое средство по варианту 1 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 26 серотипа, содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO:1 (Ad26-GP-EBOV), или SEQ ID NO:2 (Ad26-GPΔmuc-EBOV), или SEQ ID NO:3 (Ad26-GP-BDBV), или SEQ ID NO:4 (Ad26-GPΔmuc-BDBV), или SEQ ID NO:5 (Ad26-GP-SUDV), или SEQ ID NO:6 (Ad26-GPΔmuc-SUDV), или SEQ ID NO:7 (Ad26-GP-MARV), или SEQ ID NO:8 (Ad26-GPΔmuc-MARV), находящийся в буферном растворе. При этом буферный раствор может иметь любой состав, обеспечивающий жизнеспособность и стабильность вирусных частиц и подходящий для введения в организм млекопитающих. Например, состав буферного раствора: трис (0,1831-0,3432масс. %), хлорид натрия (0,3313-0,6212 масс. %), сахароза (3,7821-7,0915 масс. %), магния хлорида гексагидрат (0,0154-0,0289 масс. %), ЭДТА (0,0029-0,0054 масс. %), полисорбат-80 (0,0378-0,0709 масс. %), этанол 95% (0,0004-0,0007 масс. %), вода остальное.

Пример 3.

Способ получения иммунобиологического средства на основе аденовируса человека 5 серотипа.

На первом этапе, с помощью методов генной инженерии были получены плазмиды pAd5-Ends-GP-EBOV, pAd5-Ends-GPΔmuc-EBOV, pAd5-Ends-GP-BDBV, pAd5-Ends-GPΔmuc-BDBV, pAd5-Ends-GP-SUDV, pAd5-Ends-GPΔmuc-SUDV, pAd5-Ends-GP-MARV, pAd5-Ends-GPΔmuc-MARV, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа.

Далее полученные конструкции лианеризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологи, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too, который содержит геном аденовируса человека 5-го серотипа с делецией E1 и Е3 областей генома. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd5-too-GP-EBOV, pAd5-too-GPΔmuc-EBOV, pAd5-too-GP-BDBV, pAd5-too-GPΔmuc-BDBV, pAd5-too-GP-SUDV, pAd5-too-GPΔmuc-SUDV, pAd5-too-GP-MARV, pAd5-too-GPΔmuc-MARV, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с делецей Е1 и Е3 областей и экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, соответственно.

На четвертом этапе, данные плазмиды гидролизовали специфической эндонуклеазой рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. Полученный материал был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.

Таким образом, иммунобиологическое средство по варианту 2 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO:1 (Ad5-GP-EBOV), или SEQ ID NO:2 (Ad5-GPΔmuc-EBOV), или SEQ ID NO:3 (Ad5-GP-BDBV), или SEQ ID NO:4 (Ad5-GPΔmuc-BDBV), или SEQ ID NO:5 (Ad5-GP-SUDV), или SEQ ID NO:6 (Ad5-GPΔmuc-SUDV), или SEQ ID NO:7 (Ad5-GP-MARV), или SEQ ID NO:8 (Ad5-GPΔmuc-MARV), находящийся в буферном растворе. При этом буферный раствор может иметь любой состав, обеспечивающий жизнеспособность и стабильность вирусных частиц и подходящий для введения в организм млекопитающих. Например, состав буферного раствора: трис (0,1831-0,3432масс. %), хлорид натрия (0,3313-0,6212 масс. %), сахароза (3,7821-7,0915 масс. %), магния хлорида гексагидрат (0,0154-0,0289 масс. %), ЭДТА (0,0029-0,0054 масс. %), полисорбат-80 (0,0378-0,0709 масс. %), этанол 95% (0,0004-0,0007 масс. %), вода остальное.

Пример 4.

Для получения рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита была использована плазмида pVSV-deltaG, представляющая собой кДНК, комплементарную геномной РНК вируса везикулярного стоматита с удаленным геном гликопротеина. Методами генной инженерии из данной плазмиды было получено 8 генетических конструкций: pVSV-deltaG-GP-EBOV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-EBOV, pVSV-deltaG-GP-SUDV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-SUDV, pVSV-deltaG-GP-BDBV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-BDBV, pVSV-deltaG-GP-MARV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-MARV, содержащие SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, соответственно.

Для получения препаратов рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита была проведена трансфекция клеток BHK21 плазмидами, несущими: ен ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7; гены - N (нуклеокапсид), Р (фосфопротеин), L (большая субъединица полимеразы) белков VSV; и векторной плазмидой, выбранной из pVSV-deltaG-GP-EBOV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-EBOV, pVSV-deltaG-GP-SUDV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-SUDV, pVSV-deltaG-GP-BDBV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-BDBV, pVSV-deltaG-GP-MARV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-MARV. Трансфекцию проводили с помощью реагента Lipofectamine-2000 (Life Technologies) согласно инструкции производителя. Таким образом, было получено 8 препаратов рекомбинантного вируса везикулярного стоматита.

Таким образом, иммунобиологическое средство по варианту 3 представляет собой рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий последовательность, соответствующую кДНК SEQ ID NO:9 (VSV-GP-EBOV), или SEQ ID NO:10 (VSV-GPΔmuc-EBOV), или SEQ ID NO:11 (VSV-GP-BDBV), или SEQ ID NO:12 (VSV-GPΔmuc-BDBV), или SEQ ID NO:13 (VSV-GP-SUDV), или SEQ ID NO:14 (VSV-GPΔmuc-SUDV), или SEQ ID NO:15 (VSV-GP-MARV), или SEQ ID NO:16 (VSV-GPΔmuc-MARV), находящийся в буферном растворе. При этом буферный раствор может иметь любой состав, обеспечивающий жизнеспособность и стабильность вирусных частиц и подходящий для введения в организм млекопитающих. Например, состав буферного раствора: трис(гидроксиметил)аминометан - 0,4-0,7 мг, ЭДТА динатриевая соль - 0,1-0,2 мг, сахароза – 30-70 мг, вода для инъекций до 0,5 мл.

Пример 5.

Проверка безопасности разработанных вариантов иммунобиологического средства.

Целью данного эксперимента являлась проверка токсичности разработанного средства при однократном введении (острая токсичность) на мышах при и внутримышечном введении.

В исследовании были использованы аутбредные мыши, обоих полов, массой 18-20 грамм, возрастом 6-8 недель.

Минимальной дозой для токсикологических экспериментов была выбрана доза для мыши 10⁸в.ч., как наиболее близкая к терапевтической. Для пересчета доз не использовался коэффициент межвидового пересчета, дозы получены путем прямого пересчета на массу тела, согласно рекомендация ВОЗ для вакцинных препаратов.

В результате, для введения мышам в данном эксперименте выбрали следующие дозы средства:

10⁹в.ч. – увеличенная эффективная доза (ЭД) для мышей в 20 раз;

10¹⁰в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 200 раз;

10¹¹в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 2000 раз;

Таким образом, были получены следующие экспериментальные группы животных:

1) Ad26-GP-EBOV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

2) Ad26-GP-EBOV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

3) Ad26-GP-EBOV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

4) Ad26-GPΔmuc-EBOV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

5) Ad26-GPΔmuc-EBOV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

6) Ad26-GPΔmuc-EBOV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

7) Ad26-GP-BDBV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

8) Ad26-GP-BDBV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

9) Ad26-GP-BDBV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

10) Ad26-GPΔmuc-BDBV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

11) Ad26-GPΔmuc-BDBV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

12) Ad26-GPΔmuc-BDBV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

13) Ad26-GP-SUDV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

14) Ad26-GP-SUDV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

15) Ad26-GP-SUDV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

16) Ad26-GPΔmuc-SUDV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

17) Ad26-GPΔmuc-SUDV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

18) Ad26-GPΔmuc-SUDV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

19) Ad26-GP-MARV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

20) Ad26-GP-MARV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

21) Ad26-GP-MARV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

22) Ad26-GPΔmuc-MARV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

23) Ad26-GPΔmuc-MARV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

24) Ad26-GPΔmuc-MARV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

25) Ad5-GP-EBOV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

26) Ad5-GP-EBOV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

27) Ad5-GP-EBOV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

28) Ad5-GPΔmuc-EBOV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

29) Ad5-GPΔmuc-EBOV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

30) Ad5-GPΔmuc-EBOV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

31) Ad5-GP-BDBV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

32) Ad5-GP-BDBV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

33) Ad5-GP-BDBV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

34) Ad5-GPΔmuc-BDBV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

35) Ad5-GPΔmuc-BDBV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

36) Ad5-GPΔmuc-BDBV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

37) Ad5-GP-SUDV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

38) Ad5-GP-SUDV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

39) Ad5-GP-SUDV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

40) Ad5-GPΔmuc-SUDV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

41) Ad5-GPΔmuc-SUDV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

42) Ad5-GPΔmuc-SUDV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

43) Ad5-GP-MARV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

44) Ad5-GP-MARV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

45) Ad5-GP-MARV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

46) Ad5-GPΔmuc-MARV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

47) Ad5-GPΔmuc-MARV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

48) Ad5-GPΔmuc-MARV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

49) VSV-GP-EBOV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

50) VSV -GP-EBOV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

51) VSV -GP-EBOV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

52) VSV -GPΔmuc-EBOV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

53) VSV -GPΔmuc-EBOV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

54) VSV -GPΔmuc-EBOV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

55) VSV -GP-BDBV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

56) VSV -GP-BDBV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

57) VSV -GP-BDBV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

58) VSV -GPΔmuc-BDBV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

59) VSV -GPΔmuc-BDBV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

60) VSV -GPΔmuc-BDBV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

61) VSV -GP-SUDV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

62) VSV -GP-SUDV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

63) VSV -GP-SUDV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

64) VSV -GPΔmuc-SUDV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

65) VSV -GPΔmuc-SUDV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

66) VSV -GPΔmuc-SUDV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

67) VSV -GP-MARV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

68) VSV -GP-MARV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

69) VSV -GP-MARV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

70) VSV -GPΔmuc-MARV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

71) VSV -GPΔmuc-MARV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

72) VSV -GPΔmuc-MARV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

73) плацебо (буферный раствор), 20 мышей.

Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.

Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных: активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей. Физиологические функции: дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. -На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.

На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.

Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.

При макроскопическом исследовании не обнаружено влияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Cтатистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.

Таким образом, в ходе проведенной работы определяли безопасность разработанных средств путем оценки острой токсичности. Исходя из полученных данных можно заключить, что все разработанные иммунобиологические средства безопасны.

Пример 6.

Проверка иммуногенности вариантов иммунобиологического средства, содержащих ген гликопротеина Ebola virus или его производные.

Целью данного эксперимента являлось определение эффективности иммунизации вариантами разработанного иммунобиологического средства по оценке гуморального иммунного ответа. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции гликопротеин-специфических антител класса IgG в сыворотке крови.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 7 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10¹⁰вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null, VSV-null), не содержащие гена GP Ebola virus или буферный раствор.

Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) Ad26-GP-EBOV;

2) Ad26-GPΔmuc-EBOV;

3) Ad26-null;

4) Ad5-GP-EBOV;

5) Ad5-GPΔmuc-EBOV;

6) Ad5-null;

7) VSV-GP-EBOV;

8) VSV-GPΔmuc-EBOV;

9) VSV-null;

10) Буферный раствор.

Оценка титра антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.

Для иммуноферментного анализа антиген (GP Ebola virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 ^oС в течение ночи.

На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄, 0,24 г KH₂PO₄, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.

Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.

Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС на протяжении часа.

Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.

Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Таблица 1. Титр антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 1

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP-EBOV	220,8
2	Ad26-GPΔmuc-EBOV	243,8
3	Ad26-null	0
4	Ad5-GP-EBOV	7801,7
5	Ad5-GPΔmuc-EBOV	8613,8
6	Ad5-null	0
7	VSV-GP-EBOV	7066,2
8	VSV-GPΔmuc-EBOV	8613,8
9	VSV-null	0
10	Буферный раствор	0

Как видно из представленных результатов все испытуемые варианты разработанного иммунобиологического средства обеспечивают развитие гуморального иммунного ответа к гликопротеину Ebola virus.

Пример 7.

Проверка иммуногенности вариантов иммунобиологического средства, содержащих ген гликопротеина Bundibugyo virus или его производные.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 7 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10¹⁰вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null, VSV-null), не содержащие гена GP Bundibugyo virus или буферный раствор.

Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) Ad26-GP-BDBV;

2) Ad26-GPΔmuc- BDBV;

3) Ad26-null;

4) Ad5-GP- BDBV;

5) Ad5-GPΔmuc- BDBV;

6) Ad5-null;

7) Буферный раствор.

Оценка титра антител к GP Bundibugyo virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.

Для иммуноферментного анализа антиген (GP Bundibugyo virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 ^oС в течение ночи.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2. Титр антител к GP Bundibugyo virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 2

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP-BDBV	220,8
2	Ad26-GPΔmuc- BDBV	441,6
3	Ad26-null	0
4	Ad5-GP- BDBV	2898,3
5	Ad5-GPΔmuc- BDBV	1076,7
6	Ad5-null	0
7	Буферный раствор	0

Пример 8.

Проверка иммуногенности вариантов иммунобиологического средства, содержащих ген гликопротеина Sudan virus или его производные.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 7 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10¹⁰вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null, VSV-null), не содержащие гена GP Sudan virus или буферный раствор.

Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) Ad26-GP-SUDV;

2) Ad26-GPΔmuc- SUDV;

3) Ad26-null;

4) Ad5-GP- SUDV;

5) Ad5-GPΔmuc- SUDV;

6) Ad5-null;

7) VSV-GP- SUDV;

8) VSV-GPΔmuc- SUDV;

9) VSV-null;

10) Буферный раствор.

Оценка титра антител к GP Sudan virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.

Для иммуноферментного анализа антиген (GP Sudan virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 ^oС в течение ночи.

Результаты эксперимента представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Титр антител к GP Sudan virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 3

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP- SUDV	220,8
2	Ad26-GPΔmuc- SUDV	181,1
3	Ad26-null	0
4	Ad5-GP- SUDV	34455,0
5	Ad5-GPΔmuc- SUDV	4306,9
6	Ad5-null	0
7	VSV-GP- SUDV	883,3
8	VSV-GPΔmuc- SUDV	800,0
9	VSV-null	0
10	Буферный раствор	0

Пример 9.

Проверка иммуногенности вариантов иммунобиологического средства, содержащих ген гликопротеина Marburg virus или его производные.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 7 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10¹⁰вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null, VSV-null), не содержащие гена GP Marburg virus или буферный раствор.

Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) Ad26-GP-MARV;

2) Ad26-GPΔmuc- MARV;

3) Ad26-null;

4) Ad5-GP- MARV;

5) Ad5-GPΔmuc- MARV;

6) Ad5-null;

7) VSV-GP- MARV;

8) VSV-GPΔmuc- MARV;

9) VSV-null;

10) Буферный раствор.

Оценка титра антител к GP Marburg virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.

Для иммуноферментного анализа антиген (GP Marburg virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 ^oС в течение ночи.

Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Таблица 4. Титр антител к GP Marburg virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 4

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP- MARV	243,8
2	Ad26-GPΔmuc- MARV	243,8
3	Ad26-null	0
4	Ad5-GP- MARV	975,2
5	Ad5-GPΔmuc- MARV	2377,6
6	Ad5-null	0
7	VSV-GP- MARV	656,3
8	VSV-GPΔmuc- MARV	883,3
9	VSV-null	0
10	Буферный раствор	0

Пример 10.

Проверка эффективности разработанных иммунобиологических средств, путем оценки их способности индуцировать вируснейтрализующие антитела к филовирусам в организме млекопитающих.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 5 животных, которым внутримышечно двукратно с интервалом 21 день вводили смесь из различных вариантов иммунобиологических средств.

Были сформированы следующие группы животных:

1) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

2) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

3) VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/

VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;

4) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

5) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

6) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;

7) VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

8) VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

9) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;

10) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV;

11) VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

12) VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

13) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc –SUDV, VSV- GPΔmuc -MARV;

14) Буферный раствор/ Буферный раствор.

Через 21 день после последней иммунизации у животных отбирали кровь и далее выделяли сыворотку крови.

Для проведения реакции вирус-нейтрализации использовали клеточную линию VeroE6 (клетки почки африканской зеленой мартышки). Клетки сеяли на 12-луночные планшеты в концентрации 5*10⁵клеток на лунку за 24 часа до проведения реакции. Клетки инкубировали в СО₂-инкубаторе при t = 37ºC и 100% влажности.

Доза псевдотипированного вируса везикулярного стоматита бралась в расчете 100 БОЕ/лунку. Титр препарата псевдотипированного вируса везикулярного стоматита был заранее измерен в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 1 мл суспензии. С помощью 10-ти кратных разведений был приготовлен раствор псевдотипированного вируса везикулярного стоматита с концентрацией 100 БОЕ/100 мкл. Вирус разводили в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА, 10 % сахарозу. Приготовленный раствор вируса был разаликвочен и хранился при -70°С. Исследуемые инактивированные сыворотки до добавления вирусных частиц разводили в фосфатно-солевом буфере. Первое разведение составляло 1:20, общий объем в каждом разведении – 100 мкл. Далее к каждому разведению вносили одинаковое число вирусных частиц псевдотипированного вируса везикулярного стоматита в объеме 100 мкл. Для образования комплекса АГ+АТ, смесь вирусных частиц и сыворотки инкубировали при t = 37ºC в течение 60 мин и затем вносили в объеме 200 мкл на лунку к клеткам VeroE6 в 12-луночный планшет. Каждое разведение ставилось в трехкратном повторе. В качестве контрольного вируса использовали разведения псевдотипированного вируса с концентрацией 100 БОЕ/100 мкл без добавления сыворотки. Клетки инкубировали при t = 37ºC в течение 2-3 часов. После инкубации среду с комплексом АГ+АТ удаляли из лунок, затем вносили 3 мл покрытия, содержащего 0,4 % агарозу разведенную в ростовой среде DMEM c 5% эмбриональной телячьей сыворотки, и оставляли на 48-96 часов в инкубаторе с 5% CO₂ при t = 37ºC и 100% влажности.

Результаты учитывали через 48-96 часов. Проводили подсчет вирусных бляшек в каждом разведении. За титр вирус-нейтрализующих антител принимали максимальное разведение сыворотки, дающее снижения вирусных бляшек более чем на 50% по сравнению с контрольным вирусом.

Результаты эксперимента представлены в таблицах 5,6,7,8.

Таблица 5. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-EBOV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 5

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	139,3
2	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV	367,6
3	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV	367,6
4	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	422,2
5	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	367,6
6	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	367,6
7	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV	422,2
8	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	640,0
9	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	640,0
10	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV;	320,0
11	VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	367,6
12	VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	485,0
13	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc -SUDV; VSV- GPΔmuc -MARV;	557,2
14	Буферный раствор/ Буферный раствор	0

Таблица 6. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-BDBV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 6

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	139,3
2	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV	367,6
3	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV	367,6
4	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	422,2
5	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	367,6
6	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	367,6
7	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV	422,2
8	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	640,0
9	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	640,0
10	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV;	320,0
11	VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	422,2
12	VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	557,2
13	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc -SUDV; VSV- GPΔmuc -MARV;	557,2
14	Буферный раствор/ Буферный раствор	0

Таблица 7. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-SUDV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 7

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	160,0
2	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV	320,0
3	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV	367,6
4	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	367,6
5	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	320,0
6	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	320,0
7	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV	422,2
8	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	557,2
9	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	640,0
10	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV;	278,6
11	VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	320,0
12	VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	557,2
13	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc -SUDV; VSV- GPΔmuc -MARV;	557,2
14	Буферный раствор/ Буферный раствор	0

Таблица 8. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-MARV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 8

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	139,3
2	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV	422,2
3	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV	367,6
4	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	557,2
5	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	367,6
6	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	422,2
7	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV-GP-SUDV; VSV-GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV	422,2
8	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	735,2
9	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	640,0
10	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV;	485,0
11	VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	422,2
12	VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	640,0
13	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc -SUDV; VSV- GPΔmuc -MARV;	640,0
14	Буферный раствор/ Буферный раствор	0

Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что иммунизация млекопитающих разработанными иммунобиологическими средствами приводит к образованию вируснейтрализующих антител к филовирусам.

Пример 11.

Способ использования иммунобиологических средств, путем введения в организм млекопитающих композиции, состоящей из разработанных средств, для индукции иммунного ответа к филовирусам.

Были сформированы следующие группы животных:

1) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

2) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

3) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/

VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;

4) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

5) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

6) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;

7) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

8) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

9) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;

10) Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;

11) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;

12) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;

13) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /

Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;

14) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /

Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;

15) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;

16) Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/

Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;

17) Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/

Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;

18) Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/

VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;

19) VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /

Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;

20) VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /

Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;

21) Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/

VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;

22) Буферный раствор/ Буферный раствор.

Через 21 день после последней иммунизации у животных отбирали кровь и далее выделяли сыворотку крови.

Результаты эксперимента представлены в таблицах 9, 10,11,12.

Таблица 9. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-EBOV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 9

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	121,3
2	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV	320,0
3	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV	367,6
4	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	367,6
5	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	320,0
6	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	320,0
7	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV	367,6
8	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	640,0
9	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	557,2
10	Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;	278,6
11	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;	278,6
12	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;	320,0
13	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;	320,0
14	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;	557,2
15	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;	557,2
16	Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;	367,6
17	Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;	278,6
18	Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;	320,0
19	VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;	320,0
20	VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;	557,2
21	Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;	485,0
22	Буферный раствор/ Буферный раствор	0

Таблица 10. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-BDBV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 10

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	52,8
2	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV	121,3
3	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV	139,3
4	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	139,3
5	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	105,6
6	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	160,0
7	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV	121,3
8	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	160,0
9	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	139,3
10	Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;	121,3
11	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;	91,9
12	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;	121,3
13	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;	91,9
14	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;	139,3
15	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;	121,3
16	Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;	105,6
17	Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;	91,9
18	Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;	139,3
19	VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;	91,9
20	VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;	121,3
21	Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;	121,3
22	Буферный раствор/ Буферный раствор	0

Таблица 11. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-SUDV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 11

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	139,3
2	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV	367,6
3	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV	320,0
4	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	367,6
5	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	367,6
6	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	367,6
7	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV	422,2
8	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	485,0
9	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	557,2
10	Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;	320,0
11	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;	320,0
12	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;	367,6
13	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;	422,2
14	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;	422,2
15	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;	422,2
16	Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;	320,0
17	Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;	367,6
18	Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;	320,0
19	VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;	367,6
20	VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;	422,2
21	Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;	485,0
22	Буферный раствор/ Буферный раствор	0

Таблица 12. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-MARV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 12

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	160,0
2	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV	367,6
3	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV	422,2
4	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	557,2
5	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;	367,6
6	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	422,2
7	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV	422,2
8	VSV-GP-EBOV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;	735,2
9	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;	557,2
10	Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;	485,0
11	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;	278,6
12	Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;	367,6
13	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;	367,6
14	VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;	640,0
15	Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;	485,0
16	Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;	557,2
17	Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;	320,0
18	Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;	367,6
19	VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;	367,6
20	VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;	640,0
21	Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;	367,6
22	Буферный раствор/ Буферный раствор	0

Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что иммунизация млекопитающих композицией из трех разработанных иммунобиологических средств, содержащих ген гликопротеина Ebola virus, Sudan virus, Marburg virus приводит к образованию вируснейтрализующих антител против 4 видов филовирусов: Ebola virus, Bundibugyo virus, Sudan virus, Marburg virus.

Специалисту среднего уровня очевидно, что антитела, образующиеся после введения разработанных иммунобиологических средств, могут также связываться с гликопротеином близкородственных видов филовирусов.

Пример 12.

Оценка иммуногенности разработанных иммунобиологических средств в зависимости от пути их введения в организм млекопитающих.

Целью данного эксперимента являлась оценка эффективности иммунизации млекопитающих вариантами разработанного иммунобиологического средства путем их интраназального, внутримышечного или подкожного введения. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции антител класса IgG специфичных к GP Ebola virus в сыворотке крови.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 5 животных, которым внутримышечно, подкожно или интраназально вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10¹⁰вирусных частиц/мышь.

Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) Ad26-GP-EBOV интраназально;

2) Ad26-GP-EBOV внутримышечно;

3) Ad26-GP-EBOV подкожно;

4) Ad5-GP-EBOV интраназально;

5) Ad5-GP-EBOV внутримышечно;

6) Ad5-GP-EBOV подкожно;

7) VSV-GP-EBOV интраназально;

8) VSV-GP-EBOV внутримышечно;

9) VSV-GP-EBOV подкожно;

10) Буферный раствор.

Результаты эксперимента представлены в таблице 13.

Таблица 13. Титр антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 13

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP-EBOV интраназально;	67,3
2	Ad26-GP-EBOV внутримышечно;	220,8
3	Ad26-GP-EBOV подкожно;	181,1
4	Ad5-GP-EBOV интраназально;	5250,1
5	Ad5-GP-EBOV внутримышечно;	8613,8
6	Ad5-GP-EBOV подкожно;	7066,2
7	VSV-GP-EBOV интраназально;	3533,1
8	VSV-GP-EBOV внутримышечно;	7801,7
9	VSV-GP-EBOV подкожно;	6400,0
10	Буферный раствор.	0

Как видно из представленных результатов, все пути введения разработанных иммунобиологических средств в организм млекопитающих приводят к развитию гуморального иммунного ответа. При этом наиболее высокие титры антител наблюдаются при внутримышечном и подкожном введении.

Пример 13.

Оценка иммуногенности разработанных иммунобиологических средств при последовательной и одновременной иммунизации.

Целью данного эксперимента являлась оценка эффективности иммунизации млекопитающих вариантами разработанного иммунобиологического средства при различных схемах введения средств. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции антител класса IgG специфичных к GP Ebola virus в сыворотке крови.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 5 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10¹⁰вирусных частиц/мышь.

Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) Ad26-GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV одновременно,

2) Ad26-GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,

3) Ad5-GP-EBOV, Ad26-GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,

4) Ad26-GP-EBOV, VSV-GP-EBOV одновременно,

5) Ad26-GP-EBOV, VSV -GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,

6) VSV -GP-EBOV, Ad26-GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,

7) VSV -GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV одновременно,

8) VSV -GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,

9) Ad5-GP-EBOV, VSV -GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,

10) Буферный раствор.

Результаты эксперимента представлены в таблице 14.

Таблица 14.

Титр антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 14

№	Название группы животных	Титр антител
1	Ad26-GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV одновременно,	8613,8
2	Ad26-GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,	46373,1
3	Ad5-GP-EBOV, Ad26-GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,	34455,0
4	Ad26-GP-EBOV, VSV-GP-EBOV одновременно,	10500,3
5	Ad26-GP-EBOV, VSV -GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,	42001,2
6	VSV -GP-EBOV, Ad26-GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,	38041,5
7	VSV -GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV одновременно,	11593,3
8	VSV -GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,	51200,0
9	Ad5-GP-EBOV, VSV -GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,	42001,2
10	Буферный раствор.	0

Как видно из представленных результатов, как одновременное, так и последовательное введение иммунобиологических средств в организм млекопитающих приводят к развитию гуморального иммунного ответа. При этом наиболее высокие титры антител наблюдаются при последовательном введении иммунобиологических средств.

Приведенные примеры подтверждают выполнение технической задачи, а именно: «расширение арсенала иммунобиологических средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против филовирусов: рода Ebolavirus: Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), и/или филовирусов рода Marburgvirus: Marburg virus (MARV).

Промышленная применимость

Все приведенные примеры подтверждают промышленную применимость изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный

исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного

академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

<120> Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к патогенным

для человека филовирусам, способ использования иммунобиологического средства

<160> 16

<170> BISSAP1.3.6

<210> 1

<211> 2914

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,

последовательность GP Ebola virus и сигнал полиаденилирования

<400> 1

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540

ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctgaattcac 600

catgggtgtt acaggaatat tgcagttacc tcgtgatcga ttcaagagga catcattctt 660

tctttgggta attatccttt tccaaagaac attttccatc ccgcttggag ttatccacaa 720

tagtacatta caggttagtg atgtcgacaa actagtttgt cgtgacaaac tgtcatccac 780

aaatcaattg agatcagttg gactgaatct cgaggggaat ggagtggcaa ctgacgtgcc 840

atctgtgact aaaagatggg gcttcaggtc cggtgtccca ccaaaggtgg tcaattatga 900

agctggtgaa tgggctgaaa actgctacaa tcttgaaatc aaaaaacctg acgggagtga 960

gtgtctacca gcagcgccag acgggattcg gggcttcccc cggtgccggt atgtgcacaa 1020

agtatcagga acgggaccat gtgccggaga ctttgccttc cacaaagagg gtgctttctt 1080

cctgtatgat cgacttgctt ccacagttat ctaccgagga acgactttcg ctgaaggtgt 1140

cgttgcattt ctgatactgc cccaagctaa gaaggacttc ttcagctcac accccttgag 1200

agagccggtc aatgcaacgg aggacccgtc gagtggctat tattctacca caattagata 1260

tcaggctacc ggttttggaa ctaatgagac agagtacttg ttcgaggttg acaatttgac 1320

ctacgtccaa cttgaatcaa gattcacacc acagtttctg ctccagctga atgagacaat 1380

atatgcaagt gggaagagga gcaacaccac gggaaaacta atttggaagg tcaaccccga 1440

aattgataca acaatcgggg agtgggcctt ctgggaaact aaaaaaaacc tcactagaaa 1500

aattcgcagt gaagagttgt ctttcacagc tgtatcaaac ggacccaaaa acatcagtgg 1560

tcagagtccg gcgcgaactt cttccgaccc agagaccaac acaacaaatg aagaccacaa 1620

aatcatggct tcagaaaatt cctctgcaat ggttcaagtg cacagtcaag gaaggaaagc 1680

tgcagtgtcg catctgacaa cccttgccac aatctccacg agtcctcaac ctcccacaac 1740

caaaacaggt ccggacaaca gcacccataa tacacccgtg tataaacttg acatctctga 1800

ggcaactcaa gttggacaac atcaccgtag agcagacaac gacagcacag cctccgacac 1860

tccccccgcc acgaccgcag ccggaccctt aaaagcagag aacaccaaca cgagtaagag 1920

cgctgactcc ctggacctcg ccaccacgac aagcccccaa aactacagcg agactgctgg 1980

caacaacaac actcatcacc aagataccgg agaagagagt gccagcagcg ggaagctagg 2040

cttaattacc aatactattg ctggagtagc aggactgatc acaggcggga gaaggactcg 2100

aagagaagta attgtcaatg ctcaacccaa atgcaacccc aatttacatt actggactac 2160

tcaggatgaa ggtgctgcaa tcggattggc ctggatacca tatttcgggc cagcagccga 2220

aggaatttac acagaggggc taatgcacaa ccaagatggt ttaatctgtg ggttgaggca 2280

gctggccaac gaaacgactc aagctctcca actgttcctg agagccacaa ctgagctgcg 2340

aaccttttca atcctcaacc gtaaggcaat tgacttcctg ctgcagcgat ggggtggcac 2400

atgccacatt ttgggaccgg actgctgtat cgaaccacat gattggacca agaacataac 2460

agacaaaatt gatcagatta ttcatgattt tgttgataaa acccttccgg accaggggga 2520

caatgacaat tggtggacag gatggagaca atggataccg gcaggtattg gagttacagg 2580

tgttataatt gcagttatcg ctttattctg tatatgcaaa tttgtctttt gataaggaat 2640

tcaagcttct agataagata tccgatccac cggatctaga taactgatca taatcagcca 2700

taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct 2760

gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta 2820

caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag 2880

ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttaa 2914

<210> 2

<211> 2320

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,

последовательность GPEbolavirus, модифицированная путем удаления области,

кодирующей муцинподобный домен, и сигнал полиаденилирования

<400> 2