Способ получения и анализа сухих образцов крови человека

Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быть использовано для получения сухих образцов крови человека и последующего проведения лабораторного анализа для скринингового полуколичественного определения 11 аминокислот и/или токсичных микроэлементов, таких как свинец, кадмий, мышьяк, таллий, ртуть. Для этого получают сухие образцы крови человека путем прокола кожных покровов, прикладывания к ней карточки-фильтра с нанесенными на нее четырьмя кругами, пропитывая круг таким образом, чтобы пятно крови было с обеих сторон карточки-фильтра, оставляют карточку-фильтр на ровной поверхности лицевой стороной вверх на 4 ч при комнатной температуре, не допуская попадания солнечных лучей. Карточку-фильтр упаковывают в zip-пакет и транспортируют в лабораторию, где проводят жидкостную хроматографию с тандемным масс-спектрометрическим детектированием с использованием дериватизирующих агентов. При этом для определения 11 аминокислот на этапе пробоподготовки в качестве дериватизирующего агента используют бутанол в объеме 60 мкл. Для определения токсических веществ на этапе пробоподготовки в качестве экстракционного реагента используют стандарт золота в концентрации 1000 ррт в 2% азотной кислоте и реагент Triton-X100 в качестве вспомогательного реагента. Способ обеспечивает наиболее точную детекцию определенных веществ, а именно 11 аминокислот и некоторых токсичных элементов, за счет использования конкретных дериватизирующих и экстракционных реагентов для каждого из детектируемых веществ, при этом процедура значительно ускоряется и удешевляется вследствие предлагаемой техники получения образцов крови в виде «сухих пятен», которые пациент может самостоятельно получить и направить в лабораторию, не выходя из дома. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быть использовано для получения сухих образцов крови человека и последующего проведения лаб ^аторного анализа для скринингового полуколичественного определения биологически активных веществ и/или токсичных микроэлементов.

Современные лабораторные анализы позволяют оценивать достаточно широкий спектр маркеров в различных биологических жидкостях, но наиболее распространенными являются кровь и моча.

Как правило, для сдачи анализов крови пациент сталкивается с необходимостью посещения лаборатории или вызова специалиста на дом, что, соответственно, связано с разнообразными неудобствами, особенно, в нынешнее время, когда условия диктует пандемия.

Метод «сухих пятен» в настоящее время активно развивается как альтернатива существующим формам сдачи анализов. Преимуществом метода является возможность для пациента самостоятельно собирать биологический материал в домашних условиях. При этом в рамках исследований сухих пятен можно провести, в том числе, и скрининговую оценку состояния организма.

Из уровня техники известны способы определения различных маркеров и гормонов методом «сухих пятен» крови (RU 2541164 С2, RU 2480772 С1,) при которых получают «сухие пятна» крови, которые затем подвергают детекции на наличие требуемых для анализа веществ. Однако все эти способы были применены только при проведении скрининга новорожденных и для этого необходимо было посещать саму лабораторию.

Известен способ получения и определения методом «сухая капля» микробных маркеров http://medbazisxom/d/700709/d/instruktsiva_po_sposobu_sukhaya_kaplya.pdf). При этом нет сведений о возможности получения и анализа данным способом крови для определения витамина Д3, Омега-3-индекса, 11 аминокислот, токсических веществ.

Однако при оценке нами известного уровня техники, не было выявлено документов, в которых речь шла об определении данным методом таких веществ, как: витамин ДЗ, Омега-3-индекс, 11 аминокислот (аргинин, валин, лейцин, метионин, фенилаланин, аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота, тирозин, орнитин, цитруллин), токсичных веществ: свинец, кадмий, мышьяк, таллий, ртуть.

По нашему мнению, именно скрининг указанных маркеров на данный момент является одним из важнейших направлений в лабораторной диагностике.

Так, на данный момент считается, что в патогенезе множества патологий не последнюю роль играет дефицит витамина D.

Витамин D - это группа биологически активных веществ, которые синтезируются в организме человека в коже под действием ультрафиолета солнечных лучей, поступают с пищей и регулируют множество функций в организме: фосфорно-кальциевый обмен, ремоделирование костной ткани, нейромышечную пластичность, обмен липопротеидов, активность иммунной системы, чувствительность тканей к инсулину и др.

Считается, что определенная степень дефицита витамина D наблюдается примерно у 15% жителей планеты. Значительные отклонения от нормы содержания витамина D в организме могут быть связаны с нарушениями в обменных процессах, а также с недостаточным поступлением витамина с пищей. Кроме того, дефицит может возникать по причине редкого пребывания на солнце.

Помимо синтеза в организме под действием солнечных лучей, витамин D можно получить из пищи. Больше всего витамина D содержат продукты животного происхождения - печень тресковых рыб, жирная рыба семейства лососевых. В значительно меньших количествах - в жирных молочных продуктах (сыры, сливочное масло). Кроме того, существует множество лекарственных препаратов и БАД, назначение которых может частично или полностью восполнить дефицит витамина D.

Наиболее показательным для определения уровня обеспеченности организма витамином D является определение 25-гидрокси-холекальциферола (25-ОН D3) в крови.

Избыток витамина D обладает токсическим эффектом (чаще наблюдается у детей). В таком случае нарушается обмен кальция и фосфора, страдают почки, возникает задержка роста, разлаживается функционирование иммунной системы, появляются тошнота, рвота, запоры, снижаются аппетит и масса тела.

Жирные кислоты (ЖК) - органические соединения, относящиеся к группе карбоновых кислот, молекулы которых содержат разное количество атомов углерода (~ от 10 до 20). По характеру связей между соседними атомами углерода ЖК делят на насыщенные (имеют только одинарные связи), мононенасыщенные (с одной двойною связью) и полиненасыщенные (с несколькими двойными связями).

ЖК входят в состав триглицеридов (ТГ) жировой ткани, фосфолипидов (ФЛ) клеточных мембран и эфиров холестерола липопротеинов высокой плотности. Уровень свободных ЖК в крови и встроенных в структуру ФЛ биомембран позволяет оценить обмен ЖК в организме.

Соотношение насыщенных и ненасыщенных ЖК определяет физико-химические свойства биомембран. Дефицит ненасыщенных ЖК приводит к уменьшению вязкости, гибкости, проницаемости и электропроводимости биомембран. Следствием этого может стать снижение активности клеточных белков-рецепторов, белков-транспортеров, мембраносвязанных ферментов, внутри- и межклеточного обмена веществ.

Особая роль в составе клеточных мембран отводится омега-3 незаменимым полиненасыщенным ЖК. К клинически значимым полиненасыщенным омега-3 ЖК относятся докозагексаеновая кислота (ДГК), докозапентаеновая (ДПК) и эйкозапентаеновая кислота (ЭПК).

Омега-3 ЖК обладают кардиопротективными, гиполипидемическими, антиаритмическими, противовоспалительными и антиканцерогенными свойствами, способствуют снижению риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений (инфарктов и инсультов).

Для оценки уровня достаточности омега-3 ЖК в организме определяют их содержание в биомембранах клеток крови (преимущественно в эритроцитах).

Омега-3 индекс - маркер сбалансированности соотношения между омега-3 ЖК (ДГК, ДПК, ЭПК) и другими насыщенными и мононенасыщенными ЖК в биомембранах клеток крови. Омега-3 индекс -выраженное в процентах отношение суммарного содержания омега-3 ЖК к общему количеству ЖК в мембранах клеток крови. Величина омега-3 индекса соответствует уровню риска развития патологии.

Обеспеченность организма аминокислотами и их правильный метаболизм - важный показатель здоровья. Отклонения в уровнях кислот могут свидетельствовать о серьезных нарушениях, врожденных или приобретенных. И те, и другие поддаются коррекции и лечению при своевременном выявлении.

Скрининговое определение 11 аминокислот в сухих пятнах капиллярной крови позволяет оценить общее состояние организма - его обеспеченность важнейшими аминокислотами и уровень метаболизма в цикле образования мочевины. Результаты такого анализа могут выявить имеющиеся нарушения и помогут более точно определить стратегию дальнейших действий: провести расширенный анализ на аминокислоты, витамины или микроэлементы, скорректировать рацион питания и, возможно, на ранней стадии выявить заболевание.

11 аминокислот включают незаменимые аминокислоты: аргинин, валин, лейцин, метионин, фенилаланин, аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота, тирозин и 2 заменимых: орнитин, цитруллин.

Особенно актуальным, при проведении судебно-химических и химико-токсикологических исследований, является скрининг токсичных элементов: свинец, кадмий, мышьяк, таллий, ртуть.

Токсичные элементы оказывают негативное влияние на организм. В группе риска отравления токсичными элементами находятся сотрудники промышленных предприятий и люди, проживающие в непосредственной близости от заводов и комбинатов. Кроме того, употребление в пищу продуктов, выращенных на загрязненных почвах или с использованием некачественных удобрений, и загрязненной воды также может нанести серьезный вред организму. Кадмий, мышьяк, таллий, свинец имеют тенденцию к накоплению и постепенному разрушению тканей организма. Часто контакт с ними повышает риск развития онкологических заболеваний. В первые месяцы и даже годы выраженная симптоматика отсутствует и ограничивается неспецифическими симптомами.

Проведение анализа в сухих пятнах цельной крови предъявляет дополнительные требования к точности, чувствительности и специфичности используемых методик. При этом способ детектирования должен быть адаптирован для проведения массовых обследований.

Технический результат заявленного изобретения заключается в обеспечении наиболее точной детекции определенных веществ, а именно, витамина D, Омега-3-индекса, 11 аминокислот и некоторых токсичных элементов, за счет использования конкретных дериватизирующих и экстракционных реагентов для каждого из детектируемых веществ, при этом процедура значительно ускоряется и удешевляется вследствие предлагаемой техники получения образцов крови в виде «сухих пятен», которые пациент может самостоятельно получить и направить в лабораторию, не выходя из дома, что не лишено актуальности на сегодняшний день.

Заявленный технический результат обеспечивается за счет использования способа получения сухих образцов крови человека и последующее проведение лабораторного анализа для скринингового полуколичественного определения показателей биологически активных веществ и/или токсичных микроэлементов, отличающийся тем, что для получения сухих образцов крови человека осуществляют прокол кожных покровов, получают первую каплю крови, которую удаляют салфеткой, затем получают вторую каплю крови, прикладывают к ней карточку-фильтр с нанесенными на нее четырьмя кругами, областью, очерченной первым кругом, прижимают фильтр-бланк к пальцу, пропитывая круг таким образом, чтобы пятно крови было с обеих сторон карточки-фильтра, аналогично пропитывают кровью оставшиеся 3 круга, оставляют карточку-фильтр на ровной поверхности лицевой стороной вверх на 4 часа при комнатной температуре, не допуская попадания солнечных лучей, карточку-фильтр упаковывают в zip-пакет и транспортируют в лабораторию, где проводят жидкостную хроматографию с тандемным масс-спектрометрическим детектированием с использованием дериватизирующих или экстракционных реагентов на этапе пробоподготовки.

При этом биологически активные вещества выбраны из группы: витамин Д3, Омега-3-индекс, 11 аминокислот.

11 аминокислот включают: аргинин, валин, лейцин, метионин, фенилаланин, аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота, тирозин, орнитин, цитруллин.

Определяемые токсичные элементы выбраны из группы: свинец, кадмий, мышьяк, таллий, ртуть.

Омега-3-индекс определяют по формуле: (эйкозапентаеновая кислота+докозапентановая кислота+докозагексаеновая кислота)/ сумма жирных кислот.

Омега-3-индекс эритроцитарных мембран определяют по формуле: (омега-3-индекс×0,95)+0,35.

При проведении хроматографии для определения витамина Д3 на этапе пробоподготовки в качестве дериватизирующего агента используют 4-Phenyl-l,2,4-triazoline-3,5-dione (PTAD) в объеме 100 мкл.

При проведении хроматографии для определения омега-3-индекса на этапе пробоподготовки в качестве дериватизирующего агента используют ацетилхлорид в объеме 100 мкл.

При проведении хроматографии для определения 11 аминокислот на этапе пробоподготовки в качестве дериватизирующего агента используют бутанол в объеме 60 мкл.

При проведении хроматографии для определения токсических веществ на этапе пробоподготовки в качестве экстракционного реагента используют стандарт золота в концентрации 1000 ррm в 2% азотной кислоте и реагент Triton-X100 в качестве вспомогательного реагента.

Авторам не известны технические решения, имеющие такую же совокупность признаков, как совокупность признаков заявляемого изобретения. Следовательно, заявляемое техническое решение отвечает критерию новизны.

Способ осуществляют следующим образом.

Взятие капиллярной крови самим пациентом:

1. Тщательно вымыть руки теплой водой и протереть бумажным полотенцем.

2. Для стимуляции кровотока встряхнуть руку и растереть безымянный 4-ый палец.

3. Будущее место прокола протирают спиртовой салфеткой.

4. Прокол в пальце делают одноразовым стерильным скарификатором на глубину 2,0 мм.

Потянув, отсоедините желтый фиксатор от скарификатора. Прижмите скарификатор к пальцу и надавите на белую кнопку, чтобы сделать прокол. Если не удалось сделать прокол, не используйте скарификатор повторно! Воспользуйтесь запасным скарификатором.

5. Первую каплю крови удалите сухой салфеткой.

6. Мягким надавливанием на подушечку пальца способствуйте накоплению второй капли крови.

7. Приложить карточку-фильтр к капле областью, очерченной кругом. Прижмите карточку-фильтр к пальцу. Пропитайте круг целиком и насквозь. Пятно крови должно быть одинаковым с обеих сторон карточки-фильтра. Не прикладывайте карточку-фильтр обратной стороной!

Повторите процедуру еще 4 раза.

8. После взятия крови протрите зону прокола спиртовой салфеткой и наклейте бактерицидный пластырь.

Высушивают карточку-фильтр с образцами крови, для чего оставляют карточку-фильтр на ровной поверхности лицевой стороной вверх на 4 часа при комнатной температуре, не допуская попадания солнечных лучей! Нельзя пользоваться бытовой техникой или отопительными системами для сокращения времени высушивания образцов.

Хранение и транспортировка: бумажный клапан карточки поместить над поверхностью с образцами крови. Упакуйте карточку-фильтр во вложенный zip-пакет и храните при комнатной температуре в сухом прохладном месте. Не допускать контакта с системами отопления, попадания прямых солнечных лучей до момента передачи курьеру. Собранные образцы хранить не более 21 дня.

Мы провели сравнение между определением всех биологически активных веществ и токсичных веществ стандартными способами и предлагаемым нами способом.

Ниже приводим конкретные примеры осуществления изобретения, где подробно раскрыта методика определения каждого из биологически активных и токсических веществ.

Пример 1.

Определение витамина D в сухих образцах крови человека.

Сам метод определения концентрации витамина Д - метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС). Анализ проводится на оборудовании, имеющем регистрационное удостоверение как средство медицинского назначения - жидкостной хроматограф Shimadzu с масс-детектором LC-MS 8060 (регистрационное удостоверение №РЗН 2013/417 от 19.09.2016).

1. Нанести на два пятна на каждом фильтр бланке по 20 мкл внутреннего стандарта 25-OH-D3-d6 (125 нг/мл в метаноле) и высушить в течение 10 минут. Вырезать из каждого из двух пятен по одному кругу обычным канцелярским дыроколом и поместить в эппендорф объемом 2 мл. Налить в пробирки по 600 мкл 50% метанола (чистота LC/MC, Fisher Scientific, США). Перемешать на шейкере при 2200 об/мин в течение 20 минут. Добавить 1 мл гексана (Баум-Люкс, Россия). Перемешать на шейкере при 2200 об/мин в течение 10 минут. Центрифугировать 5 минут при 13000 об/мин. Перенести по 800 мкл верхнего органического слоя в микропланшет. Упарить досуха в токе азота при 40°С. Добавить 100 мкл раствора PTAD (0,75 мг/мл в ацетонитриле, Fisher Scientific, США). Перемешать на шейкере 10 минут при 1100 об/мин. Центрифугировать 5 минут при 2000 об/мин и 8°С, после чего инкубировать в холодильнике 8-12 часов. Добавить по 100 мкл воды деионизированной MilliQ, перемешать на шейкере 5 минут при 1100 об/мин. Центрифугировать 5 минут при 2000 об/мин и 8°С. Перенести по 180 мкл образцов в виалы со вставками, готовые образцы хранить в холодильнике до анализа. Перед анализом убедиться, что фаза А - 0,1% муравьиная кислота в воде, фаза В - 0,1% муравьиная кислота в метаноле.

Регистрацию сигнала осуществляют путем сканирования характеристичных ионов вещества, которые образуются при ионизации образца в ионном источнике, далее происходит их фрагментация и детекция «родительских» и «дочерних» фрагментов ионов в масс-детекторе.

Пример 2.

Определение Омега-3-индекса в сухих образцах крови человека.

Сам метод определения омега-3-индекса - метод газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием (ГХ/ПИД). Анализ проводится на оборудовании, имеющем регистрационное удостоверение как средство медицинского назначения - Газовый хроматограф Agilent GC-7890B (регистрационное удостоверение ФСЗ 2080/03277 от 22.12.2008 г.).

В стеклянную виалу внести предварительно вырезанные и разделенные на полоски 2 диска фильтровальной бумаги тест-бланка с нанесенной на них и высушенной капиллярной кровью. Добавить во все образцы 250-300 мкл воды деионизованной MilliQ. Закрутить виалы крышками. Перемешать на вортексе 5-10 сек. при 3000 об/мин. Оставить на инкубацию при комнатной температуре 30 минут. Добавить во все образцы 800 мкл метанола (Fisher Scientific, США). С помощью шприца добавить в образцы 100 мкл ацетилхлорида (Sigma Aldrich, Германия). Поместить в термостат суховоздушный на 90 мин при 80°С. Охладить до комнатной температуры. Добавить 500 мкл гексана (Баум-Люкс, Россия). Перемешать на мультипланшетном шейкере 10 мин при ~2 200 об./мин. Центрифугировать образцы в роторном испарителе 1 мин на программе CENTR. Отобрать 100 мкл органического слоя (верхнего) в стеклянную вставку. Регистрацию сигнала осуществляют путем сканирования характеристичных ионов вещества, которые образуются при ионизации образца в пламенно-ионизационном детекторе.

Пример 3.

Определение 11 аминокислот в сухих образцах крови человека.

Определяют концентрации аргинина, валина, лейцина, метионина, фенилаланина, аспарагиновой кислоты, глицина, глутаминовой кислоты, тирозина, орнитина, цитруллина.

Сам метод определения концентрации 11 аминокислот - метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС). Анализ проводится на оборудовании, имеющем регистрационное удостоверение как средство медицинского назначения - жидкостной хроматограф Shimadzu с масс-детектором LC-MS 8040 (регистрационное удостоверение №РЗН 2013/417 от 19.09.2016).

Выдавить диск 5 мм сухого пятна, разрезать на 2 части, половину диска поместить в ячейку плашки. Добавить 200 мкл растворенного внутреннего стандарта. Закрыть плашку защитным матом и перемешать на шейкере при 600 об/мин в течение 20 минут при комнатной температуре. Удалить защитную пленку с плашки. Удалить половинки дисков из ячеек, упарить супернатант досуха в токе воздуха под лабораторным феном. Примечание. Плашка должна быть сухой. Остаточная влага влияет на последующий этап дериватизации! Добавить 60 мкл дериватизирующего реагента (бутанол, Баум-Люкс, Россия). Закрыть плашку защитным матом и инкубировать при 60°С и 600 об/мин в течение 15 минут на термостатируемом шейкере. Удалить защитный мат. Упаривать при 60°С и 600 об/мин в течение 15 минут используя лабораторный фен. Примечание. В процессе упаривания испаряется дериватизирующий реагент. Работать только в вытяжном шкафу! Добавить 100 мкл восстанавливающего буфера (ацетонитрил, Fisher Scientific, США). Перемешать при 600 об/мин 1 минуту. Перенести весь элюат в стеклянные виалы со вставками. Вколоть 10 мкл в хроматографическую систему.

Регистрацию сигнала осуществляют путем сканирования характеристичных ионов вещества, которые образуются при ионизации образца в ионном источнике, далее происходит их фрагментация и детекция «родительских» и «дочерних» фрагментов ионов в масс-детекторе.

Пример 4.

Определение токсичных веществ в сухих образцах крови человека.

Таким образом определяют концентрации таких токсичных веществ, как: свинец, кадмий, мышьяк, таллий, ртуть.

Сам метод - метод масс-спектрометрии с индукционно-связанной плазмой (ИСП-МС). Анализ проводится на оборудовании Agilent 7800.

Участок бумаги, на который нанесены 4 пятна крови, разрезается на 6 равных частей, которые затем переносятся в пластиковую пробирку объемом 15 мл. В пробирку добавляется 10 мл «разбавителя» (Состав: 0,5% Triton X-100, 1% HNO¬3, 1% Propanol-2, 200 ppb Au solution (Inorganic Ventures, США). Пробирка помещается в орбитальную мешалку со скоростью вращения 60 об/мин на 1 час. Кусочки бумаги в растворе необходимо переместить в коническую часть пробирки (постукиванием пробирки с раствором по столу), после чего поместить ее в центрифугу на 15 мин при 3000 об/мин. Из пробирки отбирается супернатант объемом 7 мл и переносится во вторую пробирку объемом 15 мл, после чего в нее добавляется 35 мкл раствора смеси внутренних стандартов с концентрацией 2 ppm (Li, Sc, Y, In, Tb, Bi) (Inorganic Ventures, США). Содержимое пробирки перемешивается на вортексе в течение 5 сек, после чего повторно центрифугируется 15 мин при 3000 об/мин. Регистрацию сигнала осуществляют путем сканирования характеристичных ионов вещества, которые образуются при ионизации образца в пламенно-ионизационном детекторе.

Образовавшиеся положительно заряженные ионы проходят через систему ионной оптики в анализатор, где происходит фильтрация ионов по отношению массы к заряду (m/z) и детектирование интенсивности ионного потока. В результате спектрометр выдает интенсивность сигнала на заданном m/z.

1. Способ скринингового полуколичественного определения веществ из сухих образцов крови человека, при этом сухие образцы крови человека получают путем прокола кожных покровов с получением первой капли крови, которую удаляют салфеткой, затем получают вторую каплю крови, прикладывают к ней карточку-фильтр с нанесенными на нее четырьмя кругами, областью, очерченной первым кругом, прижимают фильтр-бланк к пальцу, пропитывая круг таким образом, чтобы пятно крови было с обеих сторон карточки-фильтра, аналогично пропитывают кровью оставшиеся 3 круга, оставляют карточку-фильтр на ровной поверхности лицевой стороной вверх на 4 ч при комнатной температуре, не допуская попадания солнечных лучей, карточку-фильтр упаковывают в zip-пакет и транспортируют в лабораторию, где проводят жидкостную хроматографию с тандемным масс-спектрометрическим детектированием, отличающийся тем, что в качестве вещества определяют 11 аминокислот, причем на этапе пробоподготовки для жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием используют дериватизирующий реагент - бутанол в объеме 60 мкл.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что 11 аминокислот включают: аргинин, валин, лейцин, метионин, фенилаланин, аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота, тирозин, орнитин, цитруллин.

3. Способ скринингового полуколичественного определения веществ из сухих образцов крови человека, при этом сухие образцы крови человека получают путем прокола кожных покровов с получением первой капли крови, которую удаляют салфеткой, затем получают вторую каплю крови, прикладывают к ней карточку-фильтр с нанесенными на нее четырьмя кругами, областью, очерченной первым кругом, прижимают фильтр-бланк к пальцу, пропитывая круг таким образом, чтобы пятно крови было с обеих сторон карточки-фильтра, аналогично пропитывают кровью оставшиеся 3 круга, оставляют карточку-фильтр на ровной поверхности лицевой стороной вверх на 4 ч при комнатной температуре, не допуская попадания солнечных лучей, карточку-фильтр упаковывают в zip-пакет и транспортируют в лабораторию, где проводят жидкостную хроматографию с тандемным масс-спектрометрическим детектированием, отличающийся тем, что в качестве вещества определяют токсичные элементы - свинец, кадмий, мышьяк, таллий, ртуть, причем на этапе пробоподготовки для жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием используют экстракционный реагент - 200 ppb Au solution в 2% азотной кислоте и реагент Triton-X100 в качестве вспомогательного реагента.