Способы детекции аполипопротеинов

Группа изобретений относится к медицине, а именно к способам детекции и количественного определения аполипопротеинов и их изоформ в образце. Раскрыт способ детекции in vitro аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ, способ определения in vitro относительного количества изоформы E4, аполипопротеина apoE относительно общего содержания указанного аполипопротеина в образце, способ определения вероятности того, что у пациента развивается нейродегенеративное заболевание, который включает определение в образце от указанного пациента уровней изоформы E4 apoE, а также применение in vitro набора, содержащего полистироловую поверхность, блокированную альбумином, антитело со специфичностью к аполипопротеину apoE4 и включающего детекции и/или количественное определение аполипопротеина apoE. Группа изобретений позволяет оценивать вероятности развития нейродегенеративных заболеваний на основании уровней аполипопротеинов. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 2 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам детекции и количественного определения аполипопротеинов и их изоформ в образце, а также к предсказательным способам оценки вероятности развития нейродегенеративных или сердечнососудистых заболеваний на основании уровней аполипопротеинов, как определяют способами детекции по изобретению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Аполипопротеин E (apoE) представляет собой гликопротеин 34 кДа, участвующий в липидном метаболизме. Ген APOE человека, кодирующий этот белок, является полиморфным и расположен на хромосоме 19. Существует три общих кодоминантных аллеля (ε2, ε3 и ε4), которые кодируют три изоформы белка apoE: E2, E3 и E4. Эти изоформы различают аминокислотными остатками 112 и 158. Изоформа E2 имеет остатки цистеина в обоих сайтах, E4 имеет остатки аргинина в обоих сайтах, тогда как E3, наиболее распространенная форма, имеет цистеин в положении 112 и аргинин в положении 158. Эти различия оказывают сильные эффекты на биологические функции apoE. Липид-связывающая активность этих изоформ различна: E2 и E3 связываются предпочтительно с липопротеинами высокой плотности (HDL), тогда как E4 предпочитает липопротеины очень низкой плотности (VLDL). Эти биохимические различия могут отвечать за связь изоформ с различными патологическими процессами. Изоформа E4 связана с более высокими уровнями холестерина и повышенным риском коронарной болезни сердца и болезни Альцгеймера. В отличие от этого, изоформа E2 демонстрирует протективный эффект против болезни Альцгеймера, но связан с семейной гиперлипопротеинемией III типа. Таким образом, интерес к генотипам APOE или изоформам apoE высок при эпидемиологических исследованиях, стратификации пациентов и идентификации тех, кто обладает повышенным риском, для клинических исследований и предотвращения.

Некоторые способы широко используют для генотипирования трех основных гаплотипов APOE. Более часто используемые способы представляют собой: PCR-RFLP (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов полимеразной цепной реакцией), капиллярный электрофорез, ПЦР+секвенирование или масс-спектрометрия, ARMS-PCR (ПЦР в системе с мутациями, рефракторными к амплификации) и SSP-PCR (простая ПЦР с праймерами, специфичными к последовательности), обнаружение ПЦР в реальном времени с помощью флуоресцентных кривых плавления, FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции), аллель-специфическая RT-ПЦР и зонды TaqMan®. Однако все эти способы, основанные на генах APOE, требуют информированного согласия на экстрагирование ДНК и анализ генетической информации и не могут быть легко реализованы в повседневном клиническом анализе.

Преимущественно для исследовательских целей несколько альтернативных биохимических (не генетических) способов используют для чувствительного определения характеристик изоформ apoE. Наиболее широко используемыми являются изоэлектрическое фокусирование (IEF) и сэндвич ELISA, которые основаны на определении характеристик apoE из биологических жидкостей, таких как плазма или CSF. Для аналитического IEF apoE, за изоэлектрофокусированием белков в иммобилизованных градиентах pH следует иммунообнаружение разделенных изоформ с использованием антитела против apoE. Конкретный паттерн полос apoE допускает обнаружение различных изоформ apoE, присутствующих в образце. Этот способ преимущество, поскольку может обнаруживать редкие варианты apoE, отличные от изоформ apoE E2, E3 и E4; однако он технически сложен и требует времени.

В способах ELISA (твердофазный иммуносорбентный анализ) используют антитела для того, чтобы захватывать белок-мишень. Для проверки на присутствие изоформы apoE E4 можно использовать сэндвич ELISA, который основан на использовании двух антител (захватывающего и репортерного антител), среди которых одно из них должно обладать специфичностью к изоформе E4. Существует несколько коммерчески доступных наборов ELISA для детекции apoE E4 (например ApoE4/pan-ApoE ELISA Kit, MBL № 7635); однако, вероятно из-за свойственных технических ограничений этот способ не реализован в повседневных клинических условиях.

В данной области описаны способы предсказания развития заболевания на основании уровней аполипопротеинов. US5945289A относится к способам оценки предрасположенности пациента к развитию злокачественной опухоли предстательной железы на основании генотипирования аллелей ApoE с помощью ПЦР.

Однако в уровне техники все еще сохраняется необходимость в разработке надежных и точных способов детекции аполипопротеинов и определения изоформы аполипопротеина, которые делают возможным быстрое и надежное определение аполипопротеинов в образце. Указанные способы представляют интерес для предсказания развития определенного заболевания, связанного с аполипопротеином или его конкретными изоформами, присутствием или отсутствием.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения разработали способ детекции, количественного определения и анализа аполипопротеинов и их изоформ. Этот способ основан на конкретных свойствах связывания аполипопротеинов с поверхностью, в частности полистироловой поверхностью, что позволяет избегать необходимости использовать захватывающее антитело или предшествующие процедуры выделения для детекции или количественного определения. Авторы показали, что полистироловые поверхности (включая планшеты для ELISA, бусы Luminex или турбидиметрические бусы) специфически захватывают аполипопротеины, в частности, apoE. Конкретную изоформу аполипопротеина, такую как apoE E4, когда она связана с поверхностью, можно обнаруживать с помощью антитела против apoE4, так что достигают детекции и количественного определения изоформы apoE4 в образце. Это количественное определение может коррелировать с присутствием генотипа APOE ε4, или при гетерозиготности (ε2/ε4, ε3/ε4) или при гомозиготности (ε4/ε4). Учитывая, что эти свойства связывания являются общими для других аполипопротеинов, этот способ также можно применять к другим аполипопротеинам, в том числе apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII и apoJ (кластерин).

Таким образом, в первом аспекте, настоящее изобретение относится к способу детекции и/или количественного определения in vitro для аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин) или его изоформы в образце, который включает:

(i) приведение в контакт образца с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания аполипопротеина или его изоформы с поверхностью, где поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанному аполипопротеину или его изоформе, связанными с ней,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин или его изоформу, сформированной на стадии (i), с антителом со специфичностью к указанному аполипопротеину или к указанной его изоформе при подходящих условиях для формирования комплекса между антителом и аполипопротеином или его изоформой, и

(iii) детекцию комплексов, сформированных на стадии (ii)

где полистироловую поверхность или поликарбонатную поверхность не обрабатывают перед приведением в контакт с образцом или блокируют альбумином перед приведением в контакт с образцом.

В дополнительном аспекте изобретение относится к способу определения in vitro относительного количества изоформы заданного аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин) относительно общего содержания указанного аполипопротеина в образце, который включает:

(i) приведение в контакт образца с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания аполипопротеина с поверхностью, где поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанному аполипопротеину, связанному с ней,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин, сформированной на стадии (i), с первым антителом со специфичностью к указанной изоформе аполипопротеина и со вторым антителом, которое способно к связыванию со всеми изоформами указанного аполипопротеина, присутствующими в образце, где указанное приведение в контакт осуществляют в условиях, подходящих для формирования первого комплекса, содержащего первое антитело и изоформу аполипопротеина, и для формирования второго комплекса, содержащего второе антитело и все изоформы указанного аполипопротеина,

(iii) детекцию первого и второго комплексов, сформированных на стадии (ii) и

(iv) определение относительных количеств изоформы относительно общего содержания аполипопротеинов на основании уровней первого и второго комплекса, полученных на стадии (iii)

где полистироловую поверхность или поликарбонатную поверхность не обрабатывают перед приведением в контакт с образцом или блокируют альбумином перед приведением в контакт с образцом.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения аллельной дозы гаплотипов, связанных с экспрессией изоформы аполипопротеина для аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин) у пациента, который включает

(i) приведение в контакт белок-содержащего образца от указанного пациента, полученного из ткани, в которой экспрессирована изоформа аполипопротеина, с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания изоформы аполипопротеина с поверхностью, где поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанной изоформе аполипопротеина, связанной с ней,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин, сформированной на стадии (i), с по меньшей мере одним антителом со специфичностью к изоформе аполипопротеина при подходящих условиях для формирования комплекса между антителом и изоформой аполипопротеина,

(iii) определение аллельной дозы изоформы аполипопротеина с помощью корреляции количества комплекса, сформированного на стадии (ii), с числом аллелей, кодирующих указанный генетический вариант,

где полистироловую поверхность или поликарбонатную поверхность не обрабатывают перед приведением в контакт с образцом или блокируют альбумином перед приведением в контакт с образцом.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения вероятности того, что у пациента разовьется нейродегенеративное заболевание, который включает определение в образце от указанного пациента уровней изоформы E4 apoE посредством способа в соответствии с любым из способов по изобретению, в котором, если уровни apoE E4 выше эталонного значения, то это указывает на то, что пациент имеет высокую вероятность развития нейродегенеративного заболевания.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения вероятности того, что у пациента развивается нейродегенеративное заболевание, который включает определение у указанного пациента аллельной дозы гаплотипа, кодирующей изоформу apoE4, посредством способа в соответствии с любым из способов по изобретению, где присутствие одного или двух аллелей apoE4 в геноме пациента указывает на то, что пациент имеет высокую вероятность развития нейродегенеративного заболевания, и где отсутствие аллелей apoE4 в геноме пациента указывает на то, что пациент имеет низкую вероятность развития нейродегенеративного заболевания.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения вероятности того, что у пациента развивается сердечнососудистое заболевание, который включает определение в образце от указанного пациента уровней изоформы аполипопротеина посредством способа в соответствии с любым из способов по изобретению, в котором, если уровни указанной изоформы аполипопротеина выше эталонного значения, то это указывает на то, что пациент имеет высокую вероятность развития сердечнососудистого заболевания.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу определения вероятности того, что у пациента развивается сердечнососудистое заболевание, который включает определение у указанного пациента аллельной дозы гаплотипа, кодирующего изоформу аполипопротеина, посредством способа в соответствии с любым из способов по изобретению, где присутствие одного или двух аллелей указанной изоформы аполипопротеина в геноме пациента указывает на то, что указанный пациент имеет более высокую вероятность развития сердечнососудистого заболевания, и где отсутствие аллелей указанной изоформы аполипопротеина в геноме пациента указывает на то, что указанный пациент имеет более низкую вероятность развития сердечнососудистого заболевания.

В другом аспекте, изобретение относится к набору, содержащему полистироловую или поликарбонатную поверхность и антитело со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе, где набор не содержит второе антитело со специфичностью к указанному аполипопротеину или его изоформе.

В другом аспекте изобретение относится к применению набора, как описано выше, для детекции и/или количественного определения аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин) или его изоформы, где полистироловую или поликарбонатную поверхность блокируют альбумином.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1 представлен анализ присутствия изоформы E4 apoE в 157 образцах плазмы, не содержащих изоформу apoE4, и 73 образцах, содержащих apoE4.

На фиг. 2 представлены показания поглощения ELISA для 73 образцов, содержащих apoE E4 (с фиг. 1), распределенных в соответствии с их генотипом.

На фиг. 3 представлены средние показания поглощения 230 анализированных образцов, который распределены в соответствии с генотипом APOE. Планки ошибки представляют стандартную ошибку среднего.

На фиг. 4 представлено соотношение поглощений apoE E4/общего apoE (4E4/для всех apoE) при различных разведениях плазмы у не носителей APOE e4 (E3/E3) и гетерозиготных (E3/E4) и гомозиготных (E4/E4) носителей APOE e4.

На фиг. 5 представлено связывание аполипопротеинов из образцов плазмы (1:200) с полистироловой поверхностью в формате планшета для ELISA.

На фиг. 6 представлен эффект различных буферов, содержащих соль (NaCl 0-2,4 M) или детергент (полисорбат 20 -Tween 20- или Triton X-100, 0-0,5%), оказываемый на связывание ApoE с планшетом для ELISA. Темные и светлые серые столбцы представляют образцы, анализируемые в лунках, которые блокировали блокирующими растворами на основе BSA или Superblock, соответственно.

На фиг. 7 представлен эффект pH (2-10), оказываемый на связывание ApoE с планшетом для ELISA. Светлые и темные серые столбцы представляют образцы, анализируемые в лунках, блокируемых с использованием блокирующих растворов на основе BSA или Superblock, соответственно.

На фиг. 8 представлен эффект строгих условий, оказываемый на связывание ApoE с планшетом для ELISA.

На фиг. 9 представлен предварительный анализ образцов apoE e3/e3 и apoE e4/e4 посредством LEIT в различные моменты времени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что аполипопротеины из биологических жидкостей, в частности, аполипопротеин apoE, и более конкретно, изоформа 4 apoE (apoE E4), обладают стабильной способностью к высоко аффинному связыванию с полистироловыми поверхностями. На основании этого свойства, авторы изобретения разработали способы детекции и количественного определения аполипопротеинов, для которых не требуется изоэлектрофокусирование или захватывающие антитела. Изобретение описывает простой, надежный и экономически эффективный способ, который можно легко реализовать в исследовательских лабораториях, а также в условиях клинического анализа. Поскольку аполипопротеины связаны с сердечнососудистым и нейрососудистым риском и с нейродегенерацией, способы, предоставленные в настоящем описании, предоставляют полезную информацию для стратификации и идентификации пациента среди тех, кто имеет повышенный риск болезни Альцгеймера (AD) и сердечнососудистых нарушений. Этот способ также можно использовать для определения характеристик других аполипопротеинов в качестве белковых биологических маркеров, а именно apoCI, apoCII, apoCIII, apoAI и кластерина, и он релевантен для анализа легко доступных биологических жидкостей, таких как кровь или моча.

Определения

Термин «аллель», как его используют в настоящем описании, относится к одной из двух или больше форм гена, локуса или генетического полиморфизма. Иногда, различные аллели могут вести к различным признака; однако, в других случаях различные аллели будут иметь один и тот же результат при экспрессии гена. Большинство многоклеточных организмов имеют два набора хромосом, то есть, они являются диплоидными. Эти хромосомы обозначают как гомологичные хромосомы. Диплоидные организмы имеют одну копию каждого гена (и один аллель) на каждой хромосоме. Если оба аллеля одинаковы, они являются гомозиготами. Если аллели различны, они являются гетерозиготами.

Термин «аллельная доза», как его используют в настоящем описании, относится к числу копий конкретного аллельного варианта, в диапазоне от 0 до 2 в диплоидном организме.

Термин «болезнь Альцгеймера» или «AD», как его используют в настоящем описании, относится к умственному нарушению, связанному с конкретным дегенеративным заболеванием головного мозга, которое отличается сенильными бляшками, нейритными клубками и прогрессирующей утратой нейронов, которое манифестирует в клинике в виде прогрессирующего дефицита памяти, спутанности, поведенческих проблем, неспособности ухаживать за собой, постепенного физического истощения и, в конечном итоге, смерти. Как его используют в настоящем описании, этот термин предназначен для того, чтобы включать все стадии заболевания.

Термины «антитело», «иммуноглобулин» и схожие термины относятся к полипептиду, по существу кодируемому геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулинов или их фрагментами, который специфически связывает и распознает анализируемое вещество (антиген). Известные гены иммуноглобулинов включают гены константных областей κ, λ, α, γ, δ, ε и μ, а также большое число генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируют как κ или λ. Тяжелые цепи классифицируют как γ, μ, α, δ или ε, которые в свою очередь определяют классы иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. образцовая структурная единица иммуноглобулина (антитела) состоит из двух пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну «легкую» (приблизительно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область приблизительно от 100 до 110 или больше аминокислот, в первую очередь отвечающую за распознавание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (VL) и вариабельная тяжелая цепь (VH) относятся к этим легким и тяжелым цепям, соответственно. C-концы каждой тяжелой цепи связаны вместе дисульфидными связями и образуют константную область антитела. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, антитела можно относить к различным «классам». Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них дополнительно можно делить на «подклассы» (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Полноразмерные «легкие цепи» иммуноглобулинов (приблизительно 25 кДа или приблизительно 214 аминокислот) содержат вариабельную область из приблизительно 1-10 аминокислот на NH₂-конце и константную область κ или λ на COOH-конце. Полноразмерные «тяжелые цепи» иммуноглобулинов (приблизительно 50 кДа или приблизительно 446 аминокислот) аналогичным образом содержат вариабельную область (приблизительно из 116 аминокислот) и одно из указанных выше константных областей тяжелой цепи или классов, например, γ (приблизительно 330 аминокислот). Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов различных классов хорошо известны.

Термин «аполипопротеин», как его используют в настоящем описании, относится к белку, который связывает липиды для того, чтобы формировать липопротеин. Этот белок может выполнять функцию кофактора фермента, лиганда рецептора и носителя для переноса липидов, который регулирует метаболизм белков и их захват в тканях. Этот термин охватывает множество следующих классов аполипопротеинов: apoA (включая изоформы apoA-I, apoA-II, Apo A-IV и apoA-V), apoB (включая изоформы apoB48 и apoB100), ap°C (включая изоформы apoC-I, apoC-II, apoC-III и apoC-IV), apoD, apoE (включая изоформы apoE2, apoE3 и apoE4), apoH и apoJ (кластерин), а также apoF, apoG, apoL, apoM, apoN и apoO. В конкретном варианте осуществления аполипопротеин представляет собой apoE.

Термин «аполипопротеин A-I» или «ApoA-I» или «ApoAI», как его используют в настоящем описании, относится к белку который представляет собой основной белковый компонент липопротеинов высокой плотности (HDL) в плазме. ApoAI является кофактором лецитинхолестеринацилтрансферазы (LCAT), которая отвечает за образование большинства сложных холестериловых эфиров плазмы. У человека apoAI кодирует ген APOAI. apoA-I может иметь любое происхождение, например, от человека, коровы, мыши, лошади, собаки и т. д. В конкретном варианте осуществления apoA-I представляет собой белок человека с номером доступа UniProt P026547 (дата публикации 16 мая 2014 года).

Термин «аполипопротеин A-IV» или «Apo A-IV» или «ApoAIV», как его используют в настоящем описании, относится к белку, получаемому после протеолиза первичного продукта трансляции пропротеина из 306 остатков. Apo A-IV может иметь любое происхождение, например, от человека, коровы, мыши, лошади, собаки и т. д. В конкретном варианте осуществления Apo A-IV представляет собой белок человека с номером доступа UniProt P06727 (дата публикации 16 мая 2014 года). Изоформы Apo A-IV человека включают Apo A-IV-1a (T347S) и Apo A-IV-2 (Q360H).

Термин «аполипопротеин C-I» или «Apo C-I» или «ApoCI», как его используют в настоящем описании, относится к белку, обычно встречающемуся в плазме и отвечающему за активацию этерифицированного холестерина лецитина, который выполняет важную роль в обмене этерифицированного холестерина между липопротеинами и удалении холестерина из тканей. У человека apoC-I кодирует ген APOC1. Apo C-I может иметь любое происхождение, например, от человека, коровы, мыши, лошади, собаки и т. д. В конкретном варианте осуществления apoC-I представляет собой белок человека с номером доступа UniProt P02654 (дата публикации 16 мая 2014 года).

Изоформы ApoC-I включают кислую (apoC-IA) и основную (apoC-IB), исходя из их вычисленных изоэлектрических точек.

Термин «аполипопротеин C-II» или «Apo C-II» или «ApoCII», как его используют в настоящем описании, относится к белку, обычно встречающемуся в плазме, где он является компонентом липопротеинов очень низкой плотности (VLDL) и хиломикронов. У человека apoC-II кодирует ген APOC2. apoC-II может иметь любое происхождение, например, от человека, коровы, мыши, лошади, собаки и т. д. В конкретном варианте осуществления apoC-II представляет собой белок человека с номером доступа UniProt P02655 (дата публикации 16 мая 2014 года).

Термин «аполипопротеин C-III» или «Apo C-III» или «ApoCIII», как его используют в настоящем описании, относится к белку, встречающемуся в качестве компонента липопротеинов очень низкой плотности (VLDL). ApoCIII представляет собой относительно небольшой белок, содержащий 79 аминокислот, который может быть гликозилирован по треонину-74. Он ингибирует липазу липопротеинов и печеночную липазу. У человека apo C-III кодирует ген APOC3. Apo C-III может иметь любое происхождение, например, от человека, коровы, мыши, лошади, собаки и т. д. В конкретном варианте осуществления apo C-III представляет собой белок человека с номером доступа UniProt P02656 (дата публикации 16 мая 2014 года). ApoC-III присутствует в трех изоформах, которые называют apoC-III0, apoC-III1 и apoC-III2 в зависимости от числа молекул сиаловой кислоты (от 0 до 2), которыми оканчиваются олигосахаридные части белка. Показано, что каждая изоформа вносит вклад, соответственно, в приблизительно 10, 55 и 35% от общих уровней apoC-III в циркуляции.

Термин «аполипопротеин-E» или «Apo-E» или «ApoE», как его используют в настоящем описании, относится к белку, встречающемуся в хиломикронах и липопротеинах средней плотности (IDL), который необходим для нормального катаболизма липопротеиновых компонентов, богатых триглицеридами. У человека, аполипопротеин E кодирует ген ApoE, который представляет собой полиморфный ген с тремя основными аллелями, ε2, ε3 и ε4, который кодирует изоформы ApoE2 (cys112, cys158), ApoE3 (cys112, arg158) и ApoE4 (argll2, arg158). Аполипопротеин E может иметь любое происхождение, например, от человека, коровы, мыши, лошади, собаки и т. д. В конкретном варианте осуществления Apo E представляет собой белок человека с номером доступа UniProt P02649 (16 мая 2014 года).

Термин «изоформа аполипопротеина E 2-го типа» или «apoE2», как его используют в настоящем описании, относится к изоформе E2 белка аполипопротеина E, которую определяют по присутствию остатка цистеина в положениях 112 и 158 аминокислотной последовательности.

Термин «изоформа аполипопротеина E 3-го типа» или «apoE3», как его используют в настоящем описании, относится к изоформе E3 белка аполипопротеина E, которую определяют по присутствию остатка цистеина в положении 112 и остатка аргинина в положении 158 аминокислотной последовательности.

Термин «изоформа аполипопротеина E 4-го типа» или «apo E cod variable» или «apoE4», как его используют в настоящем описании, относится к изоформе E4 белка аполипопротеина E, которую определяют по присутствию остатка аргинина в положениях 112 и 158 аминокислотной последовательности.

Термин «аполипопротеин-J» или «Apo-J» или «ApoJ» или «кластерин» или «ингибитор лизиса комплемента» или «CLI» или «сульфатированный гликопротеин 2» или «SGP2» или «SP-40,40» или «репрессируемый тестостероном транскрипт 2 предстательной железы» или «TRPM2», как его используют в настоящем описании, относится к a секреторному, гетеродимерному гликопротеину, который влияет на иммунную регуляцию, клеточную адгезию, трансформацию, транспорт липидов, ремоделирование тканей, рециркуляцию мембран и межклеточные взаимодействия. Кластерин синтезируется в виде полипептида из 449 аминокислот, который проходит посттрансляционное расщепление по внутренней связи между Arg 227 и Ser 228. Аполипопротеин J может иметь любое происхождение, например, от человека, коровы, мыши, лошади, собаки и т. д. В конкретном варианте осуществления ApoJ представляет собой белок человека с номером доступа UniProt P10909 (16 мая 2014 года).

Термин «сердечнососудистое заболевание» или «сердечнососудистое нарушение», как его используют в настоящем описании, относится к заболеваниям, поражающим сердце или кровеносные сосуды или и то и другое или связанным с кардиопульмональной системе и системе кровообращения, включая в качестве неограничивающих примеров ишемию, стенокардию, отечные состояния, артеросклероз, коронарное заболевание сердца, окисление LDL, адгезию моноцитов к клеткам эндотелия, образование пенистых клеток, развитие жировых прожилок, прилипание и агрегирование тромбоцитов, пролиферацию гладкомышечных клеток, реперфузионное повреждение, высокое кровяное давление, тромботическое заболевание, аритмию (предсердную или желудочковую или ту и другую); нарушения сердечного ритма; ишемию миокарда; инфаркт миокарда; сердечную или сосудистую аневризму; васкулит, инсульт; периферическую обструктивную артериопатию конечности, органа или ткани; реперфузионное повреждение после ишемии головного мозга, сердца или другого органа или ткани, эндотоксический, хирургический или травматический шок; гипертензию, заболевание клапанов сердца, сердечную недостаточность, ненормальное кровяное давление; шок; вазоконстрикцию (включая ту, которая связана с мигренями); отклонение от нормы в сосудах, воспаление и недостаточность, ограниченную одним органом или тканью.

Термин «детергент», как его используют в настоящем описании, также известный как «поверхностно-активное средство», относится к амфипатическим поверхностно-активным средствам, которые при добавлении в жидкость снижают поверхностное натяжение жидкости в сравнении с той же жидкостью в отсутствие детергента. Детергенты также способны предотвращать агрегирование белков и предотвращать неспецифическое взаимодействие или связывание контаминантов с белком, представляющим интерес. Детергенты в соответствии с настоящим изобретением включают, без ограничения, неионные (нейтральные), анионные, катионные или цвиттер-ионные детергенты.

Примеры неионных или нейтральных детергентов включают, без ограничения, детергенты серии Tween (полисорбат), такие как Tween® 20 (полисорбат 20), Tween® 21 (полисорбат 21), Tween® 40 (полисорбат 40), Tween® 60 (полисорбат 60), Tween® 61 (полисорбат 61), Tween® 65 (полисорбат 65), Tween® 80 (полисорбат 80), Tween® 81 (полисорбат 81), Tween® 85 (полисорбат 85), детергенты серии Span®, такие как Span® 20; детергенты серии Tergitol, такие как Tergitol типа 15-S-12; детергенты серии Brij®, такие как Brij® 35, Brij® 56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij® 97, Brij® 58P; детергенты серии Tween, такие как Tween® 20, Tween® 21, Tween® 40, Tween® 60, Tween® 61, Tween® 65, Tween® 80, Tween® 81, Tween® 85; детергенты серии Triton®, такие как Triton® X-100, Triton® X-114, Triton® CF-21, Triton® CF-32, Triton® DF-12, Triton® DF-16, Triton® GR-5M, Triton® X-102, Triton® X-15, Triton® X-151, Triton® X-207, Triton® X-165, Triton® X-305, Triton® X-405, Triton® X-45, Triton® X-705-70, или неионный консервативный вариант для по меньшей мере одного из указанных детергентов.

Примеры анионных детергентов включают, без ограничения, холевую кислоту и ее производные, таурохолевую кислоту, Triton X-200, Triton W-30, Triton-30, Triton-770, диоктилсульфосукцинат, N-оксид N₅N-диметилдодециламина, 1-алкилсульфонаты натрия, соли N-лауроилсаркозина или жирных кислот.

Примеры катионных детергентов включают, без ограничения, моно- и диметиловые жирные амины, соли алкилтриметиламмония, соли диалкилдиметиламмония, алкиламинацетаты, триалкилацетаты аммония, соли алкилдиметилбензиламмония, соли диалкиметилбензиламмония, галогенид алкилпиридиния и соли алкилпиридиния (алкил-замещенные), соли алкилтиометилпиридиния, соли алкиламидометилпиридиния, соли алкилхинолиния, соли алкилизохинолиния, соли N,N-алкилметилпироллидония, соли 1,1-диалкилпиперидиния, соли 4,4-диалкилтиаморфолиния, соли 4,4-диалкилтиаморфолиний-1-оксида, метилсульфат метил бис(алкилэтил)-2-алкилимидазолиния (и другие соли), метилсульфат метил бис(алкиламидоэтил)-2-гидроксиэтиламмония (и другие соли), соли алкиламидопропил-диметилбензиламмония, соли карбоксиалкилалкилдиметиламмония, алкиламиноксиды, алкилдиметиламиноксиды, соли поли(винилметилпиридиния), соли поли(винилпиридина), полиэтиленимины, бикарбонаты триалкилфосфония (и другие соли), соли триалкилметилфосфония, соли алкилэтилметилсульфония и соли алкилдиметилсульфоксония.

Примеры цвиттер-ионных детергентов включают, без ограничения, 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат (CHAPS); 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-2-гидрокси-1-роропансульфонат (CHAPSO); N-(алкил C₁₀-C₁₆)-N,N-диметилглицинбетаин (EMPIGEN BB); каприлилсульфобетаин (SB3-10); 3-[N,N-диметил(3-миристоиламинопропил)аммонио]пропансульфонат (амидосульфобетаин-14; ASB-14); N-тетрадецил-N,N-диметил-3-аммонио-1-пропоансульфонат(3-14 Detergent; ZWITTERGENT); N-додецил-N,N'-диметил-3-аммонио-1-пропансульфонат; N-октадецил-N,N-диметил-3-аммонио-1- пропансульфонат; N-децил-N,N-диметил-3-аммоний-1-пропансульфонат; Mirataine CB; Mirataine BB; Mirataine CBR; Mirataine ACS; Miracare 2MHT и Miracare 2MCA.

Выражение «определение вероятности» или «предсказание вероятности» или схожее, как его используют в настоящем описании, синонимично выражению «оценка вероятности» и обозначает, что настоящее изобретение позволяет предсказывать или оценивать вероятность развития заболевания у пациента, в частности, нейродегенеративного заболевания или сердечнососудистого заболевания. Предсказание вероятности в целом подразумевает, что вероятность повышена или понижена. Как поймут специалисты в данной области, предсказание, хотя и предпочтительно, но не обязано быть правильным для 100% пациентов, подлежащих оценке. Однако термин требует, чтобы статистически значимую часть пациентов можно было идентифицировать как имеющих повышенную вероятность наличия заболевания, в частности, нейродегенеративного заболевания или сердечнососудистого заболевания. Является ли пациент статистически значимым, может определять без дополнительных усилий специалист в данной области с использованием различных хорошо известных инструментов статистической оценки, например, определения доверительных областей, определения p-значений, критерия Стьюдента, критерия Манна-Уитни и т. д. Подробности можно найти в Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Предпочтительные доверительные области составляют по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% по меньшей мере 95%. p-значения предпочтительно составляют 0,05, 0,025, 0,001, 0,0001 или меньше.

Термин «гаплотип», как его используют в настоящем описании, относится к конкретной группе генов, которые потомство наследует от одного родителя. В частности, гаплотип охватывает совокупность конкретных аллелей на хромосоме, которые вероятно наследуются вместе. Гаплотип может содержать два или больше аллелей.

Термин «иммунотурбидометрия», как его используют в настоящем описании, относится к способу детекции анализируемого вещества в образце на основании реакции анализируемого вещества с антителом, которая ведет к формированию иммунного комплекса антитело-антиген между анализируемым веществом и антителом, который преципитирует, увеличивая мутность образца. Как результат, когда свет пропускают через реакционный раствор, часть света рассеивается образцом, часть света поглощается образцом и остальной проходит через образец. Количество поглощенного света прямо пропорционально концентрации анализируемого вещества или, другими словами, сигнал проходящего света прямо пропорционален концентрации анализируемого вещества. В соответствии с настоящим изобретением, анализируемое вещество, подлежащее обнаружению посредством иммунотурбидометрии, представляет собой аполипопротеин или его изоформу, в частности, аполипопротеин, выбранный из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин) и их изоформ, более конкретно apoE и/или изоформ apoE - apoE2, apoE3 и apoE4, более предпочтительно apoE4. В конкретном варианте осуществления изобретения анализ иммунотурбидометрии представляет собой LEIT (технология иммунотурбидометрии с латексным усилением).

Термин «нейродегенеративное заболевание», как его используют в настоящем описании, связан с заболеваниями, которые являются результатом дегенерации или истощения нервной ткани, в частности нейронов, что ведет с течением времени к нарушению функции или нетрудоспособности; термин дегенерация включает утрату жизнеспособности клеток, утрату функции клеток и/или снижение числа клеток (нейронов или других). Иллюстративные неограничивающие примеры нейродегенеративных заболеваний включают болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Гентингтона, болезнь Паркинсона, амиотрофический боковой склероз (ALS), рассеянный склероз и т. д. В конкретном варианте осуществления указанное нейродегенеративное заболевание представляет собой AD.

Термин «окислитель», как его используют в настоящем описании, относится к химической частице, которая удаляет электрон с другой частицы в ОВР (окислительно-восстановительной реакции).

Термин «поликарбонат», как его используют в настоящем описании, относится к группе термопластических полимеров, содержащих карбонатные группы (-O- (C=O)- O-) в своей химической структуре.

Термин «полистирол», как его используют в настоящем описании, относится к синтетическому, ароматическому, термопластическому полимеру, выполненному из мономера стирола. Полистирол может быть твердым или вспененным.

Термин «протеаза», как его используют в настоящем описании, также известный как «пептидаза», относится к ферменту, катализирующему гидролиз пептидных связей в белках. Иллюстративные неограничивающие примеры протеаз включают сериновые пептидазы, треониновые пептидазы, цистеиновые пептидазы, аспартилпептидазы, металлопептидазы и глутамилпептидазы. В конкретном варианте осуществления протеаза представляет собой пепсин, трипсин или химотрипсин. Как его используют в настоящем описании, термин «пепсин» относится к протеазе, катализирующей гидролиз пептидных связей между гидрофобными аминокислотами и предпочтительно ароматическими аминокислотами, такими как фенилаланин, триптофан и тирозин.

Термин «восстанавливающее средство», как его используют в настоящем описании, относится к соединению, которое отдает электрон другой химической частице (окислителю) в ОВР (окислительно-восстановительной химической реакции). Потеря электронов восстанавливающим средством ведет к его окислению.

Термин «эталонное значение», как его используют в настоящем описании, относится к предварительно определяемым критериям, используемым в качестве эталона для оценки значений или данных, получаемых от образцов, собранных у пациента. Эталонное значение или эталонный уровень может представлять собой абсолютное значение; относительное значение; значение, которое имеет верхний или нижний предел; диапазон значений; усредненное значение; медианное значение; среднее значение; или значение по сравнению с конкретным значением контрольного или базового уровня. Эталонное значение может быть основано на значении индивидуального образца, например, таком как значение, получаемое из образца от тестируемого пациента, но в более ранний момент времени. Эталонное значение может быть основано на большом числе образцов, например, от популяции пациентов из группы с совпадающими календарными возрастами, или на основании совокупности образцов, включающей или не включающей образец, подлежащей тестированию.

Термин «соль», как его используют в настоящем описании, относится к любой форме соединения в ионной форме, или заряженной и сопряженной с противоионом (катионом или анионом), или в растворе. Определение включает, в частности, фармацевтически приемлемые соли.

Термин «образец», как его используют в настоящем описании, относится к биологическому материалу, выделенному у пациента и, следовательно, включает биологические образцы. Указанный образец может содержать любой биологический материал, подходящий для детекции желаемого маркера, и может содержать клетки и/или не клеточный материал от пациента. В целом, образец можно выделять из любой подходящей биологической ткани или текучего вещества. Конкретные предпочтительные образцы в соответствии с изобретением включают, без ограничения, кровь, плазму, сыворотку, слюну, мочу и цереброспинальную жидкость (CSF). В одном из вариантов осуществления изобретения образец представляет собой образец плазмы.

Термин «пациент» или «индивидуум» или «животное» или «пациент» включает любого пациента, в частности, пациента-млекопитающее, для которого терапия желательна. Пациенты-млекопитающие включают человека, домашних животных, сельскохозяйственных животных и животных из зоопарков или питомцев, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы и так далее. В конкретном варианте осуществления пациентом является человек.

Способ детекции аполипопротеинов и количественного определения по изобретению

В первом аспекте, изобретение относится к способу детекции и/или количественного определения in vitro аполипопротеина или его изоформы в образце (первый способ по изобретению), который включает:

(i) приведение в контакт образца с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания аполипопротеина или его изоформы с поверхностью, где поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанному аполипопротеину или его изоформе, связанным с ней,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин или его изоформу, сформированной на стадии (i), с антителом со специфичностью к указанному аполипопротеину или к указанной его изоформе при подходящих условиях для формирования комплекса между антителом и аполипопротеином или его изоформой, и

(iii) обнаружение комплексов, сформированных на стадии (ii).

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции и/или количественного определения in vitro аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин) или его изоформы, в образце который включает:

(i) приведение в контакт образца с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания аполипопротеина или его изоформы с поверхностью, где поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанному аполипопротеину или его изоформе, связанным с ней,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин или его изоформу, сформированной на стадии (i), с антителом со специфичностью к указанному аполипопротеину или к указанной его изоформе при подходящих условиях для формирования комплекса между антителом и аполипопротеином или его изоформой, и

(iii) обнаружение комплексов, сформированных на стадии (ii),

где полистироловую поверхность или поликарбонатную поверхность не обрабатывают перед приведением в контакт с образцом или блокируют альбумином перед приведением в контакт с образцом.

Аполипопротеины, подлежащие обнаружению и/или количественному определению в соответствии с первым способом по изобретению, включают apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин). Изоформы аполипопротеинов, подлежащие обнаружению и/или количественному определению, включают изоформы apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин). В конкретном варианте осуществления аполипопротеин, подлежащий обнаружению и/или количественному определению в соответствии с первым способом по изобретению, представляет собой apoE. В конкретном варианте осуществления изоформы аполипопротеинов, подлежащие обнаружению и/или количественному определению в соответствии с первым способом по изобретению, представляют собой изоформы apoE, выбранные из группы, состоящей из apoE2, apoE3 и apoE4. В более конкретном варианте осуществления, аполипопротеин представляет собой apoE и более конкретно изоформа аполипопротеина представляет собой apoE4.

Таким образом, на первой стадии первого способа по изобретению образец приводят в контакт с полистироловой поверхностью или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания аполипопротеина или его изоформы в образце с указанной полистироловой поверхностью или указанной поликарбонатной поверхностью, где указанная поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанному аполипопротеину или его изоформе, связанным с ней.

Приведение в контакт между образцом и полистироловой поверхностью или поликарбонатной поверхностью можно осуществлять путем непосредственного контакта при подходящих условиях для связывания аполипопротеина или его изоформы в образце с полистироловой поверхностью или поликарбонатной поверхностью. Как поймет специалист, указанные условия будут представлять собой подходящие условия для взаимодействий между аполипопротеином или его изоформой и полистироловой или поликарбонатной поверхностью, предпочтительно подходящие условия для электростатических и/или гидрофобных взаимодействий между аполипопротеином или его изоформой и полистироловой поверхностью или поликарбонатной поверхностью. В конкретном предпочтительном варианте осуществления поверхность представляет собой полистироловую поверхность. Подходящие условия для связывания может определять специалист, и они включают подходящую температурю, время инкубации, pH, концентрацию образца и т. д. В конкретном варианте осуществления температурные диапазоны от 4 до 40°C, в частности от 10 до 35°C, более конкретно от 15 до 30°C, предпочтительно от 20 до 25°C (комнатная температура). В конкретном варианте осуществления pH во время указанной стадии приведения в контакт находится в диапазоне от pH 2 до pH 10, предпочтительно от pH 4 до pH 10. В конкретном варианте осуществления образец инкубируют в контакте с поверхностью, предпочтительно полистироловой поверхностью, в течение по меньшей мере 1 минуты, предпочтительно в течение по меньшей мере 5 минут, более предпочтительно в течение по меньшей мере 30 минут, даже более предпочтительно в течение по меньшей мере 60 минут. Аполипопротеин-содержащие образцы в соответствии с изобретением можно приводить в контакт с поверхностью, предпочтительно полистироловой поверхностью, без предварительного разведения или разведения, где разведение составляет по меньшей мере 1:2, предпочтительно по меньшей мере 1:5, более предпочтительно по меньшей мере 1:10, даже более предпочтительно по меньшей мере 1:100, даже более предпочтительно по меньшей мере 1:200. Как поймет специалист, различные буферы подходят для разведения образца. В конкретном образце разведение образца осуществляют в фосфатно-солевом буфере (PBS) или в карбонатном/бикарбонатном буфере, более предпочтительно в PBS.

В конкретном варианте осуществления связывание аполипопротеина или его изоформы и полистироловой или поликарбонатной поверхности не опосредовано каким-либо пептидом, каким-либо полипептидом, каким-либо липидом или каким-либо сшивающим средством. В частности, указанный пептид, не опосредующий связывание, представляет собой пептид, способный связывать аполипопротеин или его изоформу, и включает, без ограничения, амилоидные пептиды. Амилоидные пептиды включают, без ограничения, амилоидный белок-предшественник (APP), β-амилоидные пептиды [пептиды из 36-43 аминокислот, которые принципиально вовлечены в болезнь Альцгеймера в качестве основного компонента амилоидных бляшек, которые находят в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера, в том числе Aβ (1-5), Aβ (1-6), Aβ (1-12), Aβ (1-40), Aβ (1-42), Aβ (12-28), Aβ (13-28), Aβ (25-35), Aβ (35-42), Aβ (33-42) и Aβ (33-40), где выражение Aβ (Χ-Υ) относится к пептиду, получаемому из β-амилоидного пептида, состоящему из аминокислот от положения X до положения Y), Aβ40 и Aβ42]. Липиды, не опосредующие связывание, включают, без ограничения, фосфолипиды и жирные кислоты.

В конкретном варианте осуществления образец содержит аполипопротеин или его изоформу, подлежащие обнаружению и/или количественному определению в биологическом образце. Биологические образцы в соответствии с изобретением включают, без ограничения, биологические жидкости, такие как кровь, плазма, сыворотка, моча, слюна, моча и цереброспинальная жидкость (CSF). Способы выделения образцов хорошо известны специалистам в данной области. В конкретном варианте осуществления образец представляет собой образец плазмы. Подходящие разведения образца плазмы в соответствии с первым способом по изобретению находятся в диапазоне от 1:10 до 1:100000, предпочтительно от 1:100 до 1:1000, более предпочтительно разведение образца плазмы составляет 1:200.

Полистироловая или поликарбонатная поверхность, предпочтительно полистироловая поверхность, в соответствии с изобретением не содержит какое-либо антитело со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе, связанным с ней и для которых осуществляют обнаружение и/или количественное определение. Полистироловые поверхности в соответствии с изобретением включают любую полистироловую поверхность, которую можно приводить в контакт с образцом, в частности биологическим образцом, и включают, без ограничения, планшеты, пробирки, бусы и чипы, все они коммерчески доступны и, в целом, любую полистироловую поверхность, подходящую для анализа на основе микрофлюидики. В конкретном варианте осуществления полистироловую поверхность содержит планшет для ELISA, турбидиметрические бусы, бусы Luminex или, в целом, любая полистироловая поверхность, подходящая для анализа на основе микрофлюидики. Поликарбонатные поверхности в соответствии с изобретением включают любую полистироловую поверхность, которую можно приводить в контакт с образцом, в частности биологическим образцом, и включают, без ограничения, планшеты, пробирки, бусы и чипы, все они коммерчески доступны. В любом случае, указанная полистироловая поверхность или поликарбонатная поверхность не содержит антитела, которые обладают специфичностью к аполипопротеину или его изоформе, подлежащим связыванию с указанной поверхностью.

Полистироловые планшеты в соответствии с изобретением включают полистироловые планшеты для ELISA, коммерчески доступные в Nunc, Fisher Scientific, VWR, Greiner и Corning, в качестве примера.

Полистироловые бусы в соответствии с изобретением включают, без ограничения, бусы, коммерчески доступные в Sigma Aldrich. В конкретном варианте осуществления полистироловые бусы имеют средний размер частицы в диапазоне от 50 нм до 1 мкм, предпочтительно от 100 нм до 500 нм, более предпочтительно от 150 нм до 400 нм, даже более предпочтительно от 200 до 300 нм. В конкретном варианте осуществления полистироловые бусы представляют собой модифицированные аминами полистироловые бусы. В конкретном альтернативном варианте осуществления полистироловые бусы представляют собой модифицированные карбоксилатами полистироловые бусы. Полистироловые бусы в соответствии с изобретением включают, без ограничения, бусы Luminex® и турбидиметрические бусы. Бусы Luminex представляют собой микросферы, коммерчески доступные в Luminex.

В конкретном варианте осуществления полистироловую поверхность или поликарбонатную поверхность не обрабатывают перед приведением в контакт с образцом. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления полистироловую поверхность или поликарбонатную поверхность блокируют перед приведением в контакт с образцом, то есть, полистироловую поверхность или поликарбонатную поверхность блокируют перед стадией связывания (i) первого способа по изобретению. В конкретном варианте осуществления полистироловую поверхность или поликарбонатную поверхность блокируют перед стадией связывания белком, отличным от аполипопротеина, и/или детергентом. Подходящие белки для блокирования поверхности, предпочтительно полистироловой поверхности, перед стадией связывания, включают, без ограничения, альбумин, такой как бычий сывороточный альбумин (BSA), казеин и желатин, а также коммерчески доступные блокирующие растворы, такие как Superblock (Pierce). Особенно предпочтительными белками для блокирования являются BSA, казеин и желатин, более предпочтительно BSA, даже более предпочтительно BSA в диапазоне от 1% до 3%, более предпочтительно BSA 1%. В конкретном варианте осуществления полистироловую поверхность или поликарбонатную поверхность блокируют альбумином перед приведением в контакт с образцом, более предпочтительно альбумин представляет собой BSA. В конкретном варианте осуществления поверхность блокируют с помощью BSA 1%. В качестве дополнения или альтернативы для белка, отличного от аполипопротеина, поверхность, предпочтительно полистироловую поверхность, блокируют перед стадией связывания детергентом. Подходящие детергенты для блокирования полистироловой поверхности перед стадией связывания включают, без ограничения, поливинилпиролидон-40 (PVP-40), полисорбат 20 (Tween 20), Nonidet-P40 и Triton X-100. В конкретном варианте осуществления детергент представляет собой полисорбат 20. В конкретном варианте осуществления поверхность блокируют полисорбатом 20.

В одном из вариантов осуществления изобретения полистироловую или поликарбонатную, предпочтительно полистироловую, поверхность обрабатывают промывающим раствором после приведения в контакт с образцом, то есть, поверхность обрабатывают промывающим раствором после стадии связывания (i) первого способа по изобретению. Предпочтительно, обработку поверхности промывающим раствором осуществляют после стадии связывания (i) и перед стадией (ii) первого способа по изобретению. В конкретном варианте осуществления промывающий раствор содержит одну или несколько солей. Предпочтительно, соль, которую содержит промывающий раствор, представляет собой NaCl, которую содержит буфер Tris (TBS) или фосфатный буфер (PBS). Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор содержит по меньшей мере один детергент. Предпочтительно, детергент выбирают из группы, состоящей из полисорбата 20 (Tween 20) и Triton X-100. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор содержит кислоту. Предпочтительно, кислоту выбирают из группы, состоящей из HCl и муравьиной кислоты. Более предпочтительно, кислоту выбирают из HCl 2 M и муравьиной кислоты 70%. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор содержит основание. Предпочтительно, основание представляет собой NaOH, более предпочтительно NaOH 2 M. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор содержит восстанавливающее средство. Предпочтительно, восстанавливающее средство представляет собой 2-меркаптоэтанол. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор не содержит ферментативный детергент (такой как протеаза), окисляющий реактив (такой как гипохлорит натрия) или их сочетание.

На второй стадии первого способа по изобретению, полистироловую или поликарбонатную, предпочтительно полистироловую, поверхность, с которой связывают аполипопротеин или его изоформу, в результате первой стадии способа, приводят в контакт с антителом со специфичностью к указанному аполипопротеину или его изоформе, связанным с полистироловой или поликарбонатной поверхностью. Эту стадию осуществляют при подходящих условиях для формирования комплекса между антителом и аполипопротеином или его изоформой, связанными с полистироловой или поликарбонатной поверхностью.

Антитела со специфичностью к аполипопротеинам известны специалисту и коммерчески доступны. Образцовые, неограничивающие антитела, которые можно использовать в контексте изобретения включают следующее:

- для детекции и/или количественного определения apoAI: поликлональное антитело кролика к apoAI из Santa Cruz Biotechnology (FL-267, номер по каталогу sc-30089), моноклональное антитело мыши против apoAI из Santa Cruz Biotechnology (069-01, номер по каталогу sc-58230), моноклональное антитело мыши против apoAI из Santa Cruz Biotechnology (B10, номер по каталогу sc-376818), поликлональное антитело кролика против apoAI из Abcam (номер по каталогу ab64308) и поликлональное антитело козы против apoAI из Abcam (номер по каталогу ab7613).

- для детекции и/или количественного определения apoAII: моноклональное антитело мыши против apoAII из LifeSpan Biosciences (номер по каталогу LS-B4281) и поликлональное антитело кролика против apoAII из OriGene (номер по каталогу TA328111).

- для детекции и/или количественного определения apoAIV: поликлональное средство козы против apoAIV человека из Abcam (номер по каталогу ab59036), и поликлональное средство кролика против apoAIV человека из Sigma-Aldrich (номер по каталогу HPA001352).

- для детекции и/или количественного определения apoCI: поликлональное антитело кролика против apoCI из Abcam (номер по каталогу ab20793) и поликлональное антитело козы против apoCI из Abcam (номер по каталогу ab104446).

- для детекции и/или количественного определения apoCII: поликлональное антитело кролика против apoCII из Abcam (номер по каталогу ab76452), поликлональное антитело кролика против apoCII из Sigma-Aldrich (номер по каталогу SAB1300917 и моноклональное антитело мыши против apoCII из Novus-Biologicals (3E4, номер по каталогу H00000344-M01).

- для детекции и/или количественного определения apoCIII: поликлональное антитело козы против apoCIII из Abcam (номер по каталогу ab7619) и поликлональное антитело кролика против apoCIII из Sigma-Aldrich (номер по каталогу A0734).

- для детекции и/или количественного определения apoE: поликлональное антитело кролика для общего apoE (SantaCruz Biotechnology, Inc., № sc-98573), и IgG кролика против apoE человека из TaKaRa Clontech (номера по каталогу 18171A и 18171B), и поликлональное антитело кролика против apoE человека из Abcam (номер по каталогу ab72398).

- для детекции и/или количественного определения изоформы apoE2: моноклональное средство мыши против apoE2 человека из Biolegend (клон 3C2, номер по каталогу 815001; клон 8G3, номер по каталогу 812701).

- для детекции и/или количественного определения изоформы apoE3: поликлональное средство кролика против apoE3 человека из Preprotech (номер по каталогу 350-02).

- для детекции и/или количественного определения изоформы apoE4: моноклональное средство мыши против apoE4 человека из Merck Millipore (клон 4E4, номер по каталогу MABN43), моноклональное средство мыши против apoE4 человека из Biolegend (клон 5B5, номер по каталогу 811601), моноклональное антитело мыши со специфичностью к E4 apoE, клон 4E4 (Novus Biologicals, № NBP1-49529), моноклональное антитело мыши со специфичностью к E4 apoE, клон 5B5 (IBL № 10025), моноклональное антитело мыши со специфичностью к E4 apoE, клон 1F9 (MBL, № M067-3) и моноклональное антитело мыши против apoE4, клон 4E4 из Thermo Scientific (номер по каталогу № MA5-16146).

- для детекции и/или количественного определения apoJ: моноклональное антитело мыши против apoJ из Abcam (CLI-9, номер по каталогу ab16077) и поликлональное антитело козы против apoJ из Sigma-Aldrich (номер по каталогу SAB2500251).

Контакт между поверхностью, с которой связывают аполипопротеин или его изоформу, как результат стадии (i) с антителом со специфичностью к указанному аполипопротеину или его изоформе осуществляют при подходящих условиях для формирования комплекса между антителом и аполипопротеином или его изоформой. Подходящие условия для формирования указанного комплекса может определять специалист, и они включают подходящую температуру, время инкубации и pH. В конкретном варианте осуществления температурные диапазоны от 4 до 40°C, в частности от 10 до 35°C, более конкретно от 15 до 30°C, предпочтительно от 20 до 25°C (комнатная температура). В предпочтительном варианте осуществления температура на стадиях (i) и (ii) первого способа по изобретению по существу является одинаковой. В конкретном варианте осуществления pH находится в диапазоне от pH 2 до pH 10, предпочтительно от pH 4 до pH 10. В предпочтительном варианте осуществления pH на стадиях (i) и (ii) первого способа по изобретению является по существу одинаковым. В конкретном варианте осуществления антитело инкубируют с аполипопротеином или его изоформой, связанными с поверхностью, в течение по меньшей мере 1 минуты, предпочтительно в течение по меньшей мере 5 минут, более предпочтительно в течение по меньшей мере 30 минут, даже более предпочтительно в течение по меньшей мере 60 минут.

На третьей стадии первого способа по изобретению обнаруживают комплексы между аполипопротеином или его изоформой, связанными с полистироловой или поликарбонатной поверхностью, и специфическим антителом для указанного аполипопротеина или его изоформы, как результат второй стадии способа.

Поскольку аполипопротеин или его изоформа не являются поддающейся обнаружению молекулой сами по себе, осуществляют стадию детекции, в конкретном варианте осуществления посредством поддающейся обнаружению молекулы или комплекса. Комплекс аполипопротеин-антитело или изоформа аполипопротеина-антитело можно обнаруживать различными способами, известными специалисту. В конкретном варианте осуществления изобретения, обнаружение комплекса аполипопротеин-антитело или комплекса изоформа аполипопротеина-антитело осуществляют с помощью поддающегося обнаружению реактива, который специфически связывается с комплексом аполипопротеин-антитело или комплексом изоформа аполипопротеина-антитело, где поддающийся обнаружению реактив облегчает обнаружение комплекса, генерируя сигнал, который можно измерять. Способы мечения биологических молекул, таких как полипептиды и антитела, хорошо известны в данной области.

Любые из широкого спектра поддающихся обнаружению реактивов можно использовать при практической реализации настоящего изобретения. Подходящие поддающиеся обнаружению реактивы включают, но не ограничиваясь этим: различные лиганды, радионуклиды, флуоресцентные красители, хемилюминесцентные средства, микрочастицы (например, такие как квантовые точки, нанокристаллы, фосфоры и т. п.), ферменты (такие как, например, те, которые используют в ELISA, т. е., пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), колориметрические метки, магнитные метки и биотин, дигоксигенин или другие гаптены и белки, для которых доступны антисыворотки или моноклональные антитела.

Поддающиеся обнаружению реактивы для оптической визуализации включают, например, флуоресцеин, производное флуоресцеина, индоцианин зеленый, орегон зеленый, производное орегона зеленого, родамин зеленый, производное родамина зеленого, эозин, эритрозин, техасский красный, производное техасского красного, малахитовый зеленый, сложных сульфосукцинимидиловый эфир нанозолота, каскад синий, производное кумарина, нафталин, производное пиридилоксазола, краситель каскад желтый, краситель дапоксил и различные другие флуоресцентные соединения, такие как Cy3, Cy2, Cy5, семейство флуоресцентных меток Alexa Fluor® (Molecular Probes, Inc.), карбоксифлуоресцеин (FAM) и флуоресцеинизотиоцианат (FITC).

В конкретном варианте осуществления поддающийся обнаружению реактив представляет собой белок. Термин «белок», в контексте по настоящему изобретению, относится к макромолекулам, состоящим из одной или нескольких цепочек аминокислот. Белки отвечают за перенос разнообразных групп клеточных функций на основании их способности специфически связывать другие молекулы. Белки могут связываться с другими белками, а также с небольшим молекулами субстрата. Неограничивающие примеры белков, подходящие в качестве поддающихся обнаружению реактивов, включают, без ограничения, ферменты, флуоресцентные белки, люминесцентные белки и антигены.

В предпочтительном варианте осуществления белок представляет собой фермент. Термин «фермент», в контексте настоящего изобретения, относится к белку, работающему в качестве высоко избирательного катализатора, увеличивающего как скорость, так и специфичность метаболической реакции, для которой он обладает специфичностью. Неограничивающие примеры ферментов, подходящих для изобретения, включают, без ограничения, пероксидазу хрена (HRP) и щелочную фосфатазу. Как поймет специалист в данной области, ферменты, пригодные для использования в настоящем изобретении, являются опосредованно поддающимися обнаружению в результате их способности катализировать модификацию субстрата в соединении, поддающемся обнаружению, посредством колориметрии, хемилюминесценции или флуорометрии. Примеры подходящих субстратов включают, без ограничения, п-нитрофенилфосфат (PNPP), 2,2'-азинобис[3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту] (ABTS), о- фенилендиамин (OPD) и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB).

Биолюминесцентные белки или фотобелки являются конкретным случаем окислительных ферментов, способных осуществлять химическую реакцию их специфических простетических групп, что ведет к испусканию света без необходимости предшествующего возбуждения. Неограничивающие примеры биолюминесцентных белков включают люциферазу светляка, люциферазу Renilla и экворин.

В другом варианте осуществления белок представляет собой флуоресцентный белок. Термин «флуоресцентный белок», в контексте настоящего изобретения, относится к белку со способностью испускать свет, когда его возбуждают на длине волны, подходящей для возбуждения. Неограничивающие примеры флуоресцентных белков, которые можно использовать в комплексе по изобретению, включают, без ограничения, GFP, GFPuv, BFP, CFP, YFP, EBFP2, mCerulean, mCerulean3, mVenus, mTurquoise, T-Sapphire, цитрин, amFP486, zFP506, zFP538, drFP, DsRed, mCherry, dTomate, mTFP1, TagRFP-T, mKO2, mRuby, mKate, mAmetrine, REACh, R-фикоэритрин (R-PE) и аллофикоцианин (APC).

В другом варианте осуществления белок представляет собой люминесцентный белок. Термин «люминесцентный белок» в контексте настоящего изобретения относится к белку способному испускать свет, когда его возбуждают на длине волны, подходящей для возбуждения.

В другом варианте осуществления белок представляет собой антиген. Термин «антиген», в контексте настоящего изобретения, относится к молекуле, которая индуцирует иммунный ответ в организме. Следовательно, антиген можно использовать для создания антитела, которое распознает его и специфически связывается с ним. Неограничивающие примеры антигенов включают, inter alia, опухолевые антигены, такие как эмбриональный опухолевый антиген (CEA), HER2, специфический антиген предстательной железы (PSA) и тканевой активатор плазминогена и их рекомбинантные варианты, такие как Activase®, а также бактериальные антигены, аллергены и т. д. Как поймет специалист в данной области, антигены, пригодные для использования в настоящем изобретении, являются опосредованно поддающимися обнаружению в результате их способности быть специфически распознанными антителом.

В другом варианте осуществления поддающийся обнаружению реактив представляет собой гаптен. Термин «гаптен», в контексте настоящего изобретения, относится к группе химических соединений, имеющих небольшой молекулярный размер (<10000 Да), которые являются антигенными, но неспособными индуцировать самостоятельно специфическую иммунную реакцию. Химическое сопряжение гаптена с большим иммуногенным белком, называемым носителем, создает конъюгат гаптен-иммуногенный носитель, который способен индуцировать специфическую иммунную реакцию. Неограничивающие примеры витаминов включают биотин (витамин B7), дигоксигенин, динитрофенол (DNP) и нитройодфенол (NIP). В конкретном варианте осуществления витамином является биотин. Термин «биотин», в контексте настоящего изобретения, относится к растворимому в воде и спирте термостабильному витамину, также обозначаемому как витамин H и витамин B7, который отличается специфическим связыванием с авидином с наивысшей аффинностью, описанной на сегодняшний день K_d=10^-15 M. Как поймет специалист в данной области, биотин является опосредованно поддающимся обнаружению в результате его способности быть специфически распознанным авидином или его вариантами, такими как стрептавидин и нейтравидин.

Обнаружение поддающегося обнаружению реактива можно осуществлять посредством флуорометрии или колориметрии с использованием аппаратов, подходящих для реактивов определенных типов и образца определенного типа, которые известны специалисту в данной области.

В качестве примера, комплекс аполипопротеин-антитело, в котором аполипопротеин комплекса прикрепляют к поверхности, предпочтительно полистироловой поверхности, инкубируют со вторым антителом (репортерным антителом), которое обладает специфичностью к антителу против аполипопротеина, которое предварительно образовало комплекс с аполипопротеином. Следовательно, в конкретном варианте осуществления первого способа по изобретению, обнаружение комплексов аполипопротеин-антитело, сформированных на стадии (ii) способа, обнаруживают посредством репортерного антитела, которое обладает специфичностью к антителу против аполипопротеина. В конкретном варианте осуществления антитело против аполипопротеина и репортерное антитело представляют собой одно и то же антитело. В предпочтительном варианте осуществления второе антитело (репортерное антитело) конъюгируют с ферментом, в условиях, схожих с условиями инкубации поверхности с аполипопротеином и/или инкубации антитела со специфичностью к аполипопротеину с аполипопротеином, связанным с поверхностью. Комплексы антитело-аполипопротеин, связанные с поверхностью, обнаруживают при добавлении субстрата, который превращают с помощью фермента в поддающийся обнаружению продукт, например, посредством флуорометрии под флуоресцентным микроскопом или посредством колориметрии в спектрофотометре. В альтернативном варианте осуществления, обнаружение можно осуществлять аналогичным образом посредством использования зонда со специфичностью к аполипопротеину, который мечен подходящим образом поддающимся обнаружению реактивом.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, комплекс аполипопротеин-антитело или комплекс изоформа аполипопротеина-антитело, можно обнаруживать посредством поддающейся обнаружению молекулы или комплекса, как описано выше. В альтернативном варианте осуществления изобретения, комплекс аполипопротеин-антитело или изоформа аполипопротеина-антитело обнаруживают посредством турбидиметрии, в частности, посредством иммунотурбидиметрического анализа. Формирование комплекса аполипопротеин-антитело или комплекса изоформа аполипопротеина-антитело, когда указанный аполипопротеин или изоформа аполипопротеина присутствует в образце, подлежащем анализу, ведет к увеличению мутности по сравнению с мутностью в образце, не содержащем аполипопротеин или изоформу аполипопротеина, где вариацию указанной мутности можно измерять (например, посредством спектрофотометра). В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммунотурбидиметрический анализ представляет собой LEIT (технология иммунотурбидометрии с латексным усилением).

В конкретном варианте осуществления обнаружение комплекса осуществляют посредством ELISA. В альтернативном варианте осуществления обнаружение комплекса осуществляют посредством иммунотурбидиметрического анализа.

Способ определения относительных количеств изоформы аполипопротеина

Авторы настоящего изобретения разработали способ определения того, присутствует ли конкретная изоформа аполипопротеина или нет у пациента, на основании двойного анализа ELISA для образца плазмы от пациента, где в одном анализе определяют уровни конкретной изоформы аполипопротеина и в другом анализе определяют уровни общего аполипопротеина. Затем вычисляют соотношение изоформа аполипопротеина/общий аполипопротеин. См. пример 1, «Различение гетерозиготных/гомозиготных носителей APOE ε4 в образцах плазмы», и фиг. 4. Содержание изоформы аполипопротеина для apoE также определяли посредством иммунотурбидиметрического анализа. См. пример 2, «Обнаружение ApoE4 посредством турбидиметрического анализа».

Таким образом, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу определения in vitro относительного количества изоформы заданного аполипопротеина относительно общего содержания указанного аполипопротеина в образце (второй способ по изобретению), который включает:

(i) приведение в контакт образца с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания аполипопротеина с поверхностью, где поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанному аполипопротеину, связанному с ней,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин, сформированной на стадии (i), с первым антителом со специфичностью к указанной изоформе аполипопротеина и со вторым антителом, которое способно к связыванию со всеми изоформами указанного аполипопротеина, присутствующими в образце, где указанное приведение в контакт осуществляют в условиях, подходящих для формирования первого комплекса, содержащего первое антитело и изоформу аполипопротеина, и для формирования второго комплекса, содержащего второе антитело и все изоформы указанного аполипопротеина,

(iii) обнаружение первого и второго комплексов, сформированных на стадии (ii) и

(iv) определение относительных количеств изоформы относительно общего содержания аполипопротеинов на основании уровней первого и второго комплекса, получаемых на стадии (iii).

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу определения in vitro относительного количества изоформы заданного аполипопротеина, выбранной из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин), относительно общего содержания указанного аполипопротеина в образце, который включает:

(i) приведение в контакт образца с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания аполипопротеина с поверхностью, где поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанному аполипопротеину, связанному с ней,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин, сформированной на стадии (i), с первым антителом со специфичностью к указанной изоформе аполипопротеина и со вторым антителом, которое способно к связыванию со всеми изоформами указанного аполипопротеина, присутствующими в образце, где указанное приведение в контакт осуществляют в условиях, подходящих для формирования первого комплекса, содержащего первое антитело и изоформу аполипопротеина, и для формирования второго комплекса, содержащего второе антитело и все изоформы указанного аполипопротеина,

(iii) обнаружение первого и второго комплексов, сформированных на стадии (ii) и

(iv) определение относительных количеств изоформы относительно общего содержания аполипопротеинов на основании уровней первого и второго комплекса, полученных на стадии (iii)

где полистироловую поверхность или поликарбонатную поверхность не обрабатывают перед приведением в контакт с образцом или блокируют альбумином перед приведением в контакт с образцом.

Изоформы аполипопротеинов, подлежащие определению в соответствии со вторым способом по изобретению, включают изоформы apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин). В конкретном варианте осуществления изоформы аполипопротеинов, подлежащие определению, представляют собой изоформы apoE, выбранные из группы, состоящей из apoE2, apoE3 и apoE4, предпочтительно apoE4. В более конкретном варианте осуществления, аполипопротеин представляет собой apoE и изоформа аполипопротеина представляет собой apoE4.

На первой стадии второго способа по изобретению образец приводят в контакт с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания аполипопротеина или его изоформы в образце с поверхностью, где указанная поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанному аполипопротеину или его изоформе, связанным с ней.

Подходящие условия для связывания аполипопротеина или его изоформы в образце с полистироловой или поликарбонатной, предпочтительно полистироловой, поверхностью описаны предварительно в контексте первого способа по изобретению и включены в настоящее описание.

В конкретном варианте осуществления образец, содержащий аполипопротеин или его изоформу, подлежащие определению, представляет собой биологический образец. Подходящие биологические образцы указаны в контексте первого способа по изобретению и включены в настоящее описание. Предпочтительные образцы включают биологические жидкости, такие как кровь, плазма, сыворотка, моча, слюна, моча и цереброспинальная жидкость (CSF). В конкретном варианте осуществления образец представляет собой образец плазмы. Подходящие разведения образца плазмы находятся в диапазоне от 1:10 до 1:100000, предпочтительно от 1:100 до 1:1000, более предпочтительно разведение образца плазмы составляет 1:200.

Полистироловая или поликарбонатная поверхность в соответствии с изобретением не содержит какое-либо антитело со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе, связанным с ней, для которых осуществляют обнаружение. Полистироловые или поликарбонатные поверхности в соответствии с изобретением указаны выше и включены в настоящее описание. В конкретном варианте осуществления полистироловую поверхность содержит планшет для ELISA, бусы Luminex или турбидиметрические бусы. В любом случае, указанная полистироловая или поликарбонатная поверхность не содержит антитела, которые обладают специфичностью к аполипопротеину или его изоформе, подлежащим связыванию с указанной поверхностью.

В конкретном варианте осуществления полистироловую или поликарбонатную поверхность в соответствии со вторым способом по изобретению формируют с помощью единственного объекта с тем, чтобы указанный единственный объект предоставлял поверхность, необходимую для связывания аполипопротеина, например, одного планшета, такого как один планшет для ELISA или одна лунка в планшете для ELISA. Понятно, что этот вариант осуществления можно использовать в тех, случаях, когда первое и второе антитела обнаруживают с использованием различных поддающихся обнаружению маркеров с тем, чтобы можно было точно определять сигнал, являющийся результатом каждого антитела без взаимного влияния со стороны сигнала, предоставляемого вторым антителом. В альтернативном варианте осуществления полистироловую или поликарбонатную поверхность в соответствии со вторым способом по изобретению формируют с помощью множества объектов, то есть, с помощью по меньшей мере двух единиц объекта, предоставляющего поверхность, доступную для связывания аполипопротеина с указанной поверхностью, например, множества бусин, таких как бусы Luminex или турбидиметрические бусы. В конкретном варианте осуществления второго способа по изобретению, полистироловую или поликарбонатную поверхность, подлежащую приведению в контакт с образцом при подходящих условиях для связывания аполипопротеина в указанном образце с поверхностью, формируют с помощью множества объектов. Предпочтительно, указанную поверхность формируют посредством бус Luminex или посредством турбидиметрических бус. Этот вариант осуществления можно использовать, когда комплексы, формируемые на стадии (i), дополнительно не обрабатывают поддающимися обнаружению реактивами, которые делают возможным различение обоих антител по сигналу, предоставляемому каждым поддающимся обнаружению реактивом. Например, в случае турбидиметрического детекции, формирование комплекса между аполипопротеином и антителом обнаруживают по увеличению мутности образца. В этом случае, невозможно определять, обусловлена ли увеличенная мутность формированием комплексов изоформы аполипопротеина и первого антитела или комплексов общего аполипопротеина и второго антитела. В этом случае, приведение в контакт следует выполнять с использованием поверхности, которую формируют с помощью множества объектов (например в форме микрочастиц) с тем, чтобы объекты, приводимые в контакт с антителом каждого типа, можно было обнаруживать отдельно, помещая их в различные контейнеры.

В конкретном варианте осуществления полистироловую или поликарбонатную поверхность не обрабатывают перед приведением в контакт с образцом. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления, полистироловую или поликарбонатную поверхность блокируют перед приведением в контакт с образцом, то есть, поверхность блокируют перед стадией связывания (i) второго способа по изобретению. В конкретном варианте осуществления полистироловую или поликарбонатную поверхность блокируют перед стадией связывания с помощью белка, отличного от аполипопротеина, и/или с помощью детергента. Подходящие белки и детергенты для блокирования поверхности в соответствии с изобретением описаны выше и включены в настоящее описание посредством ссылки. Особенно предпочтительными белками для блокирования являются BSA, казеин и желатин, более предпочтительно, BSA, даже более предпочтительно, BSA в диапазоне от 1% до 3%, более предпочтительно BSA 1%. Подходящие детергенты для блокирования поверхности перед стадией связывания включают, без ограничения, поливинилпиролидон-40 (PVP-40), полисорбат 20 (Tween 20), Nonidet-P40 и Triton X-100.

В конкретном варианте осуществления полистироловую или поликарбонатную поверхность обрабатывают промывающим раствором после приведения в контакт с образцом, то есть, полистироловую или поликарбонатную поверхность обрабатывают промывающим раствором после стадии связывания (i) второго способа по изобретению. Предпочтительно, обработку полистироловой или поликарбонатной поверхности промывающим раствором осуществляют после стадии связывания (i) и перед стадией (ii) второго способа по изобретению. Подходящие промывающие растворы описаны ранее и включены в настоящее описание. В конкретном варианте осуществления промывающий раствор содержит одну или несколько солей. Предпочтительно, соль, которую содержит промывающий раствор, представляет собой NaCl. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор содержит по меньшей мере один детергент. Предпочтительно, детергент выбирают из группы, состоящей из полисорбата 20 (Tween 20) и Triton X-100. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор содержит кислоту. Предпочтительно, кислоту выбирают из группы, состоящей из HCl и муравьиной кислоты. Более предпочтительно, кислоту выбирают из HCl 2 M и муравьиной кислоты 70%. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор содержит основание. Предпочтительно, основание представляет собой NaOH, более предпочтительно NaOH 2 M. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор содержит восстанавливающее средство. Предпочтительно, восстанавливающее средство представляет собой 2-меркаптоэтанол. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор не содержит ферментативный детергент (такой как протеаза), окисляющий реактив (такой как гипохлорит натрия) или их сочетание.

На второй стадии второго способа по изобретению, поверхность, с которой связывают аполипопротеин, формируемую на стадии (i), приводят в контакт с первым антителом со специфичностью к указанной изоформе аполипопротеина и со вторым антителом, которое способно к связыванию со всеми изоформами указанного аполипопротеина, присутствующими в образце, где указанное приведение в контакт осуществляют в условиях, подходящих для формирования первого комплекса, содержащего первое антитело и изоформу аполипопротеина, и подходящих для формирования второго комплекса, содержащего второе антитело и все изоформы указанного аполипопротеина.

Антитела со специфичностью к аполипопротеинам и антителам со специфичностью к конкретным изоформам аполипопротеинов перечислены выше в контексте первого способа по изобретению и включены в настоящее описание.

В соответствии со вторым способом по изобретению, поверхность, с которой связывают аполипопротеин, формируемую на стадии (i), приводят в контакт с первым антителом и со вторым антителом, где первое антитело обладает специфичностью к изоформе аполипопротеина, подлежащей определению, и где второе антитело способно к связыванию со всеми изоформами указанного аполипопротеина. В конкретном варианте осуществления поверхность, с которой связывают аполипопротеин и которую приводят в контакт с первым антителом, представляет собой ту же поверхность, с которой аполипопротеин связывают и которую приводят в контакт со вторым антителом, то есть, контакт осуществляют в одном контейнере, например, одной лунке в планшете, таком как планшет для ELISA. Следовательно, контакт между поверхностью, с которой связывают аполипопротеин, и первым антителом осуществляют в том же контейнере, что тот, в котором осуществляют контакт со вторым антителом. В альтернативном варианте осуществления первую поверхность, с которой связывают аполипопротеин, приводят в контакт с первым антителом и вторую поверхность, с которой связывают аполипопротеин, приводят в контакт со вторым антителом, где указанная первая и вторая поверхности представляют собой различные поверхности, в качестве примера, различные лунки в планшете (таком как планшет для ELISA), различные бусины (такие как бусины Luminex турбидиметрических бус) или различные частицы. Следовательно, контакт между поверхностью, с которой связывают аполипопротеин, и первым антителом осуществляют в другом контейнере, нежели контейнер, в котором осуществляют контакт между поверхностью, с которой связывают аполипопротеин, и вторым антителом, то есть, используют отдельные контейнеры. В более конкретном варианте осуществления, когда используют отдельные контейнеры, каждый из указанных контейнеров содержит множество объектов, например, два отдельных набора бус (такие как бусы Luminex турбидиметрических бус) или два отдельных набора частиц.

В предпочтительном варианте осуществления второго способа по изобретению, поверхность, используемую на стадии (i), формируют с помощью множества объектов, и приведение в контакт с первым антителом и со вторым антителом на стадии (ii) осуществляют в отдельных контейнерах, каждый содержит часть множества объектов, формирующих поверхность.

Приведение в контакт между поверхностью, с которой связывают изоформу аполипопротеина в результате стадии (i), с первым антителом со специфичностью к указанной изоформе аполипопротеина и со вторым антителом, которое способно к связыванию со всеми его изоформами указанного аполипопротеина, осуществляют при подходящих условиях для формирования первого комплекса, содержащего первое антитело и изоформу аполипопротеина, и для формирования второго комплекса, содержащего второе антитело и все изоформы указанного аполипопротеина. Подходящие условия для формирования указанных комплексов может определять специалист, и они включают подходящую температуру, время инкубации и pH. В конкретном варианте осуществления температурные диапазоны от 4 до 40°C, в частности, от 10 до 35°C, более конкретно от 15 до 30°C, предпочтительно от 20 до 25°C (комнатная температура). В предпочтительном варианте осуществления температура на стадиях (i) и (ii) второго способа по изобретению является по существу одной и той же. В конкретном варианте осуществления pH находится в диапазоне от pH 2 до pH 10, предпочтительно от pH 4 до pH 10. В предпочтительном варианте осуществления pH на стадиях (i) и (ii) второго способа по изобретению является по существу одним и тем же. В конкретном варианте осуществления первое антитело инкубируют с изоформой аполипопротеина, подлежащей определению, которая связана с поверхностью, в течение по меньшей мере 1 минуты, предпочтительно в течение по меньшей мере 5 минут, более предпочтительно в течение по меньшей мере 30 минут, даже более предпочтительно в течение по меньшей мере 60 минут. В конкретном варианте осуществления второе антитело инкубируют с изоформами аполипопротеина, подлежащими определению, которые связаны с поверхностью, в течение по меньшей мере 1 минуты, предпочтительно в течение по меньшей мере 5 минут, более предпочтительно в течение по меньшей мере 30 минут, даже более предпочтительно в течение по меньшей мере 60 минут.

На третьей стадии второго способа по изобретению обнаруживают первый и второй комплексы, формируемые на второй стадии способа.

Как описано ранее, поверхность, с которой связывают аполипопротеин и которую приводят в контакт с первым антителом, может представлять собой ту же или отличную от поверхности, с которой связывают аполипопротеин и которую приводят в контакт со вторым антителом. В конкретном варианте осуществления, когда указанные поверхности представляют собой различные поверхности и приведение в контакт осуществляют в отдельных контейнерах, обнаружение на стадии iii) второго способа по изобретению осуществляют отдельно в каждом контейнере.

В предпочтительном варианте осуществления второго способа по изобретению, поверхность, используемую на стадии (i), формируют с помощью множества объектов, приведение в контакт с первым антителом и со вторым антителом на стадии (ii) осуществляют в отдельных контейнерах, каждый содержит часть множества объектов, формирующих поверхность, и обнаружение на стадии (iii) осуществляют отдельно в каждом контейнере. Этот вариант осуществления особенно предпочтителен, когда полистироловые или поликарбонатные поверхности содержат бусы, предпочтительно бусы Luminex или турбидиметрические бусы, и обнаружение осуществляют посредством иммунотурбидометрии. Таким образом, в соответствии с этим вариантом осуществления изобретения, первый и второй комплексы, формируемые на второй стадии способа, обнаруживают посредством турбидиметрии, в частности посредством иммунотурбидиметрического анализа. Формирование комплекса аполипопротеин(все его изоформы)-антитело или комплекса изоформа аполипопротеина-антитело, когда указанный аполипопротеин или изоформа аполипопротеина присутствует в образце, подлежащем анализу, ведет к увеличению мутности по сравнению с мутностью в образце, не содержащем аполипопротеин или изоформу аполипопротеина, где указанную вариацию мутности можно измерять (например, посредством спектрофотометра). В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммунотурбидиметрический анализ представляет собой LEIT.

В конкретном альтернативном варианте осуществления, первый и второй комплексы, формируемые на второй стадии способа, обнаруживают посредством поддающегося обнаружению реактива. Подходящие поддающиеся обнаружению реактивы в контексте изобретения описаны ранее в контексте первого способа по изобретению и включены в настоящее описание. В предпочтительном варианте осуществления первый и второй комплексы, формируемые на второй стадии способа, обнаруживают посредством репортерного антитела, которое обладает специфичностью к антителу против аполипопротеина и/или антителу против изоформы аполипопротеина. В предпочтительном варианте осуществления второе антитело (репортерное антитело) конъюгируют с ферментом, в условиях, схожих с условиями инкубации поверхности с изоформой аполипопротеина и/или инкубации антитела со специфичностью к изоформе аполипопротеина с изоформой аполипопротеина, связанной с поверхностью. Этот вариант осуществления особенно предпочтителен, когда полистироловые или поликарбонатные поверхности содержит планшет, предпочтительно планшет для ELISA, и когда обнаружение осуществляют посредством анализа ELISA.

На четвертой стадии второго способа по изобретению определяют относительные количества изоформы относительно общего содержания аполипопротеинов на основании уровней первого и второго комплекса, получаемых на стадии (iii).

В конкретном варианте осуществления вычисляют соотношение между сигналами, получаемыми при обнаружении первого и второго комплексов, которые обнаруживают на стадии (iii) второго способа по изобретению. Как результат, определяют относительное количество изоформы конкретного аполипопротеина относительно общего содержания указанного аполипопротеина. Как признает специалист, соотношение может находиться в диапазоне между 0 (когда конкретная изоформа аполипопротеина отсутствует в образце, подлежащем анализу) и 1 (когда конкретная изоформа аполипопротеина представляет собой единственную изоформу указанного аполипопротеина, присутствующую в образце, подлежащем анализу).

Способ определения аллельной дозы по изобретению

Авторы настоящего изобретения разработали способ определения того, является ли пациент гомозиготным или гетерозиготным носителем для конкретной изоформы аполипопротеина на основании двойного анализа образца пациента, где в одном анализе определяют уровни конкретной изоформы аполипопротеина и в другом анализе определяют уровни общего аполипопротеина. Затем вычисляют соотношение изоформа аполипопротеина/общий аполипопротеин, и из этого соотношения можно выводить аллельную дозу. См. пример 1. Содержание изоформы аполипопротеина также определяют посредством иммунотурбидиметрического анализа. См. пример 2.

Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к способу определения аллельной дозы гаплотипов, связанных с экспрессией изоформы аполипопротеина у пациента (третий способ по изобретению), который включает:

(i) приведение в контакт белок-содержащего образца от указанного пациента, полученного из ткани, в которой экспрессирована изоформа аполипопротеина, с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания изоформы аполипопротеина с поверхностью, где поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанной изоформе аполипопротеина, связанной с ней,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин, формируемой на стадии (i), с по меньшей мере одним антителом со специфичностью к изоформе аполипопротеина при подходящих условиях для формирования комплекса между антителом и изоформой аполипопротеина,

(iii) определение аллельной дозы изоформы аполипопротеина с помощью корреляции количества комплекса, формируемого на стадии (ii), с числом аллелей, кодирующих указанный генетический вариант.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу определения аллельной дозы гаплотипов, связанных с экспрессией изоформы аполипопротеина для аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин) у пациента, который включает,

(i) приведение в контакт белок-содержащего образца от указанного пациента, полученного из ткани, в которой экспрессирована изоформа аполипопротеина, с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания изоформы аполипопротеина с поверхностью, где поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанной изоформе аполипопротеина, связанной с ней,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин, формируемой на стадии (i), с по меньшей мере одним антителом со специфичностью к изоформе аполипопротеина при подходящих условиях для формирования комплекса между антителом и изоформой аполипопротеина,

(iii) определение аллельной дозы изоформы аполипопротеина с помощью корреляции количества комплекса, формируемого на стадии (ii), с числом аллелей, кодирующих указанный генетический вариант,

где полистироловую поверхность или поликарбонатную поверхность не обрабатывают перед приведением в контакт с образцом или блокируют альбумином перед приведением в контакт с образцом.

Изоформы аполипопротеинов, подлежащие определению в соответствии с третьим способом по изобретению, включают изоформы apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин). В конкретном варианте осуществления изоформы аполипопротеинов, подлежащие определению в соответствии с третьим способом по изобретению, представляют собой изоформы аполипопротеинов apoE, выбранные из группы, состоящей из apoE2, apoE3 и apoE4. В более конкретном варианте осуществления, изоформа аполипопротеина, подлежащая определению в соответствии с третьим способом по изобретению, представляет собой apoE4.

На первой стадии третьего способа по изобретению, белок-содержащий образец от пациента, полученный из ткани, в которой экспрессирована изоформа аполипопротеина, приводят в контакт с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания аполипопротеина или его изоформы в образце с поверхностью, где указанная поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанному аполипопротеину или его изоформе, связанным с ней.

Подходящие условия для связывания аполипопротеина или его изоформы в образце с полистироловой или поликарбонатной, предпочтительно полистироловой, поверхностью описаны ранее в контексте первого способа по изобретению и включены в настоящее описание.

Образец представляет собой белок-содержащий образец, полученный из ткани, в которой экспрессирована изоформа аполипопротеина. Подходящие образцы включают биологические жидкости, такие как кровь, плазма, сыворотка, моча, слюна, моча и цереброспинальная жидкость (CSF), как описано ранее. В конкретном варианте осуществления образец представляет собой образец плазмы. Подходящие разведения образца плазмы находятся в диапазоне от 1:10 до 1:100000, предпочтительно от 1:100 до 1:1000, более предпочтительно разведение образца плазмы составляет 1:200.

Полистироловая или поликарбонатная поверхность в соответствии с изобретением не содержит какое-либо антитело со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе, которые связаны с ней и обнаружение которых осуществляют. Полистироловые или поликарбонатные поверхности в соответствии с изобретением указаны выше и включены в настоящее описание. В конкретном варианте осуществления полистироловую поверхность содержит планшет для ELISA, бусы Luminex или турбидиметрические бусы. В любом случае, указанная полистироловая или поликарбонатная поверхность не содержит антитела, которые обладают специфичностью к аполипопротеину или его изоформе, подлежащим связыванию с указанной поверхностью.

В конкретном варианте осуществления полистироловую или поликарбонатную поверхность в соответствии с третьим способом по изобретению формируют с помощью единственного объекта с тем, чтобы указанный единственный объект предоставлял поверхность, необходимую для связывания аполипопротеина, например, единственный планшет, такой как единственный планшет для ELISA. В альтернативном варианте осуществления полистироловую или поликарбонатную поверхность в соответствии с третьим способом по изобретению формируют с помощью множества объектов, то есть, с помощью по меньшей мере двух единиц объекта, предоставляющего поверхность, доступную для связывания аполипопротеина с указанной поверхностью, например, множества бусин, таких как бусы Luminex или турбидиметрические бусы. В конкретном варианте осуществления третьего способа по изобретению, полистироловую или поликарбонатную поверхность, подлежащую приведению в контакт с образцом при подходящих условиях для связывания аполипопротеина в указанном образце с поверхностью, формируют с помощью множества объектов. Предпочтительно, указанную поверхность формируют с помощью бус Luminex или с помощью турбидиметрических бус.

В конкретном варианте осуществления полистироловую или поликарбонатную поверхность не обрабатывают перед приведением в контакт с образцом. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления, полистироловую или поликарбонатную поверхность блокируют перед приведением в контакт с образцом, то есть, поверхность блокируют перед стадией связывания (i) третьего способа по изобретению. В конкретном варианте осуществления полистироловую или поликарбонатную поверхность блокируют перед стадией связывания с помощью белка, отличного от аполипопротеина, и/или с помощью детергента. Подходящие белки и детергенты для блокирования поверхности в соответствии с изобретением описаны выше и включены в настоящее описание. Особенно предпочтительными белками для блокирования являются BSA, казеин и желатин, более предпочтительно, BSA, даже более предпочтительно, BSA в диапазоне от 1% до 3%, более предпочтительно BSA 1%. Подходящие детергенты для блокирования поверхности перед стадией связывания включают, без ограничения, поливинилпиролидон-40 (PVP-40), полисорбат 20 (Tween 20), Nonidet-P40 и Triton X-100.

В конкретном варианте осуществления полистироловую или поликарбонатную поверхность обрабатывают промывающим раствором после приведения в контакт с образцом, то есть, полистироловую или поликарбонатную поверхность обрабатывают промывающим раствором после стадии связывания (i) третьего способа по изобретению. Предпочтительно, обработку полистироловой или поликарбонатной поверхности промывающим раствором осуществляют после стадии связывания (i) и перед стадией (ii) третьего способа по изобретению. Подходящие промывающие растворы описаны ранее и включены в настоящее описание. В конкретном варианте осуществления промывающий раствор содержит одну или несколько солей. Предпочтительно, соль, которую содержит промывающий раствор, представляет собой NaCl. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор содержит по меньшей мере один детергент. Предпочтительно, детергент выбирают из группы, состоящей из полисорбата 20 (Tween 20) и Triton X-100. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор содержит кислоту. Предпочтительно, кислоту выбирают из группы, состоящей из HCl и муравьиной кислоты. Более предпочтительно, кислоту выбирают из HCl 2 M и муравьиной кислоты 70%. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор содержит основание. Предпочтительно, основание представляет собой NaOH, более предпочтительно NaOH 2 M. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор содержит восстанавливающее средство. Предпочтительно, восстанавливающее средство представляет собой 2-меркаптоэтанол. Дополнительно или альтернативно, промывающий раствор не содержит ферментативный детергент (такой как протеаза), окисляющий реактив (такой как гипохлорит натрия) или их сочетание.

На второй стадии третьего способа по изобретению, поверхность, с которой связывают аполипопротеин, формируемую на стадии (i), приводят в контакт с по меньшей мере одним антителом со специфичностью к изоформе аполипопротеина при подходящих условиях для формирования комплекса между антителом и изоформой аполипопротеина.

В конкретном предпочтительном варианте осуществления, вторая стадия третьего способа по изобретению дополнительно включает приведение в контакт поверхности со вторым антителом, которое способно к связыванию со всеми изоформами указанного аполипопротеина, присутствующими в образце, где указанное приведение в контакт осуществляют в условиях, подходящих для формирования первого комплекса, содержащего первое антитело и изоформу аполипопротеина, и для формирования второго комплекса, содержащего второе антитело и все изоформы указанного аполипопротеина.

Антитела со специфичностью к аполипопротеинам и антитела со специфичностью к конкретным изоформам аполипопротеинов перечислены выше в контексте первого способа по изобретению и включены в настоящее описание.

Условия, подходящие для формирования первого комплекса, содержащего первое антитело и изоформу аполипопротеина, и для формирования второго комплекса, содержащего второе антитело и все изоформы указанного аполипопротеина, может определять специалист, и они включают подходящую температуру, время инкубации и pH, как описано ранее. В конкретном варианте осуществления температурные диапазоны от 4 до 40°C, в частности от 10 до 35°C, более конкретно от 15 до 30°C, предпочтительно от 20 до 25°C (комнатная температура). В предпочтительном варианте осуществления температура на стадиях (i) и (ii) третьего способа по изобретению является по существу одной и той же. В конкретном варианте осуществления pH находится в диапазоне от pH 2 до pH 10, предпочтительно от pH 4 до pH 10. В предпочтительном варианте осуществления pH на стадиях (i) и (ii) третьего способа по изобретению является по существу одним и тем же. В конкретном варианте осуществления первое антитело инкубируют с изоформой аполипопротеина, подлежащей определению, которая связана с поверхностью, в течение по меньшей мере 1 минуты, предпочтительно в течение по меньшей мере 5 минут, более предпочтительно в течение по меньшей мере 30 минут, даже более предпочтительно в течение по меньшей мере 60 минут. В конкретном варианте осуществления второе антитело инкубируют с изоформами аполипопротеина, подлежащими определению, которые связаны с поверхностью, в течение по меньшей мере 1 минуты, предпочтительно в течение по меньшей мере 5 минут, более предпочтительно в течение по меньшей мере 30 минут, даже более предпочтительно в течение по меньшей мере 60 минут.

В конкретном варианте осуществления поверхность, с которой связывают аполипопротеин и которую приводят в контакт с первым антителом, представляет собой ту же поверхность, с которой связывают аполипопротеин и которую приводят в контакт со вторым антителом, то есть, контакт осуществляют в одном контейнере, например, одной лунке в планшете, таком как планшет для ELISA. Следовательно, контакт между поверхностью, с которой связывают аполипопротеин, и первым антителом осуществляют в том же контейнере, что и тот, в котором осуществляют контакт со вторым антителом. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления, первую поверхность, с которой связывают аполипопротеин, приводят в контакт с первым антителом и вторую поверхность, с которой связывают аполипопротеин, приводят в контакт со вторым антителом, где указанные первая и вторая поверхности представляют собой различные поверхности, в качестве примера, различные лунки в планшете (таком как планшет для ELISA), различные бусы (такие как бусы Luminex турбидиметрических бус) или различные частицы. Следовательно, контакт между поверхностью, с которой связывают аполипопротеин, и первым антителом осуществляют в контейнере, отличном от контейнера, в котором осуществляют контакт между поверхностью, с которой связывают аполипопротеин, и вторым антителом, то есть, используют отдельные контейнеры. В более конкретном варианте осуществления, когда используют отдельные контейнеры, каждый из указанных контейнеров содержит множество объектов, например, два отдельных набора бус (таких как бусы Luminex турбидиметрических бус) или два отдельных набора частиц.

В предпочтительном варианте осуществления второго способа по изобретению, поверхность, используемую на стадии (i), формируют с помощью множества объектов, и приведение в контакт с первым антителом и со вторым антителом на стадии (ii) осуществляют в отдельных контейнерах, каждый содержит часть множества объектов, образующих поверхность.

На третьей стадии третьего способа по изобретению, определяют аллельную дозу изоформы аполипопротеина с помощью корреляции количества комплекса, формируемого на стадии (ii), с числом аллелей, кодирующих указанный генетический вариант.

В конкретном варианте осуществления определение относительных количеств изоформы относительно общего содержания аполипопротеинов осуществляют на основании уровней первого и второго комплекса, получаемых на стадии (ii), и где аллельную дозу гаплотипов, связанных с экспрессией изоформы аполипопротеина, определяют по относительным количествам, определяемым в (iii).

В конкретном варианте осуществления вычисляют соотношение между сигналами, получаемыми при обнаружении первого и второго комплексов, обнаруживаемых на стадии (ii). Как результат, определяют относительное количество изоформы конкретного аполипопротеина относительно общего содержания указанного аполипопротеина. Как признает специалист, соотношение может находиться в диапазоне между 0 (когда конкретная изоформа аполипопротеина отсутствует в образце, подлежащем анализу) и 1 (когда конкретная изоформа аполипопротеина представляет собой единственную изоформу указанного аполипопротеина, присутствующую в образце, подлежащем анализу). Таким образом, соотношение, равное нулю, относится к отсутствию изоформы аполипопротеина в анализируемом образце. Соотношение, равное 1, где 1 представляет собой произвольное значение в произвольных единицах, относится к гомозиготному пациенту по изоформе аполипопротеина. Соотношение, равное 0,5, где 0,5 представляет собой произвольное значение в произвольных единицах, относится к гетерозиготному пациенту по изоформе аполипопротеина. Способы детекции комплексов описаны ранее и включены в настоящее описание.

В предпочтительном варианте осуществления второго способа по изобретению, поверхность, используемую на стадии (i), формируют с помощью множества объектов, приведение в контакт с первым антителом и со вторым антителом на стадии (ii) осуществляют в отдельных контейнерах, каждый содержит часть множества объектов, формирующих поверхность, и обнаружение на стадии (iii) осуществляют отдельно в каждом контейнере. Этот вариант осуществления особенно предпочтителен, когда полистироловые или поликарбонатные поверхности содержат бусы, предпочтительно бусы Luminex или турбидиметрические бусы, и обнаружение осуществляют посредством иммунотурбидометрии. Таким образом, первый и второй комплексы, формируемые на второй стадии способа, обнаруживают посредством турбидиметрии, в частности, посредством иммунотурбидиметрического анализа. Формирование комплекса аполипопротеин(все его изоформы)-антитело или комплекса изоформа аполипопротеина-антитело, когда указанный аполипопротеин или изоформа аполипопротеина присутствует в образце, подлежащем анализу, ведет к увеличению мутности по сравнению с мутностью в образце, не содержащем аполипопротеин или изоформу аполипопротеина, где указанную вариацию мутности можно измерять (например, посредством спектрофотометра). В предпочтительном варианте осуществления изобретения, иммунотурбидиметрический анализ представляет собой LEIT.

В конкретном альтернативном варианте осуществления, первый и второй комплексы, формируемые на второй стадии способа, обнаруживают посредством поддающегося обнаружению реактива. Подходящие поддающиеся обнаружению реактивы в контексте изобретения описаны ранее и включены в настоящее описание. В предпочтительном варианте осуществления первый и второй комплексы, формируемые на второй стадии способа, обнаруживают посредством репортерного антитела, которое обладает специфичностью к антителу против аполипопротеина и/или антителу против изоформы аполипопротеина. В предпочтительном варианте осуществления второе антитело (репортерное антитело) конъюгируют с ферментом, в условиях, которые схожи с условиями инкубации поверхности с изоформой аполипопротеина и/или инкубации антитела со специфичностью к изоформе аполипопротеина с изоформой аполипопротеина, связанной с поверхностью. Этот вариант осуществления особенно предпочтителен, когда полистироловые или поликарбонатные поверхности содержит планшет, предпочтительно планшет для ELISA, и когда обнаружение осуществляют посредством анализа ELISA.

Как результат, соотношение, равное нулю, идентифицирует отсутствие изоформы аполипопротеина в анализируемом образце, то есть, доза конкретного аллеля, кодирующего генетический вариант, равна нулю. Соотношение, равное 1, относится к гомозиготному пациенту по изоформе аполипопротеина, то есть, доза конкретного аллеля, кодирующего генетический вариант, равна 2. Соотношение, равное 0,5, относится к гетерозиготному пациенту по изоформе аполипопротеина, то есть, присутствует одна доза конкретного аллеля, кодирующего генетический вариант.

В конкретном предпочтительном варианте осуществления третьего способа по изобретению, поверхность, используемую на стадии (i), формируют с помощью множества объектов, стадия (ii) дополнительно включает приведение в контакт поверхности со вторым антителом, которое способно к связыванию со всеми изоформами указанного аполипопротеина, присутствующими в образце, где указанное приведение в контакт осуществляют в условиях, подходящих для формирования первого комплекса, содержащего первое антитело и изоформу аполипопротеина, и для формирования второго комплекса, содержащего второе антитело и все изоформы указанного аполипопротеина, где приведение в контакт с первым и со вторым антителом осуществляют в отдельных контейнерах, каждый содержит часть множества объектов, формирующих поверхность, где определение относительных количеств изоформы относительно общего содержания аполипопротеинов осуществляют на основании уровней первого и второго комплекса, получаемых на стадии (ii), и аллельную дозу гаплотипов, связанных с экспрессией изоформы аполипопротеина, определяют по относительным количествам, определяемым на стадии (iii).

Способы предсказания развития нейродегенеративного заболевания

Известно, что присутствие гена ApoE ε4 на хромосоме 19 у пациента увеличивает риск развития болезни Альцгеймера (AD) у указанного пациента. Соответственно, установлено, что присутствие одного аллеля apoE4 у пациента связано с четырехкратным увеличением вероятности развития AD по сравнению с пациентом, который не несет аллели apoE4, и присутствие двух аллелей apoE4 у пациента связано с 15-20-кратным увеличением вероятности развития AD по сравнению с пациентом, который не несет аллели apoE4. Следовательно, способы по изобретению для определения изоформ аполипопротеинов, в том числе apoE4, можно применять к предсказанию развития AD у пациента.

Таким образом, в дополнительном аспекте, изобретение относится к способу определения вероятности того, что пациент развивает нейродегенеративное заболевание, который включает определение в образце от указанного пациента уровней изоформы apoE4 любым из способов по изобретению, которые описаны ранее (первый, второй и третий способы), в котором, если уровни apoE4 выше эталонного значения, то это указывает на то, что пациент имеет высокую вероятность развития нейродегенеративного заболевания.

Эталонное значение в соответствии со способом по изобретению для определения вероятности развития нейродегенеративного заболевания представляет собой уровень apoE4, как определяют в образце от пациента, который не несет аллели apoE4.

Эталонное значение или эталонный уровень в соответствии со способами по изобретению может представлять собой абсолютное значение; относительное значение; значение, которое имеет верхний и/или нижний предел; диапазон значений; усредненное значение; медианное значение, среднее значение или значение по сравнению с конкретным значением контрольного или базового уровня. Эталонное значение может быть основано на значении индивидуального образца, например, таком как значение, получаемое из образца от тестируемого пациента, но в более ранний момент времени. Эталонное значение может быть основано на большом числе образцов, например, от популяции пациентов из группы с совпадающими календарными возрастами, или на основании совокупности образцов, включающей или не включающей образец, подлежащей тестированию. При определении эталонного значения маркера принимают во внимание различные соображения. Среди таких соображений имеют место возраст, масса, пол, общее физическое состояние пациента и т. п. Например, в качестве эталонной группы берут равные количества в группе по меньшей мере 2, по меньшей мере 10, по меньшей мере от 100 до предпочтительно больше чем 1000 пациентов, предпочтительно классифицированных в соответствии с вышеуказанными соображениями, например, в соответствии с различными возрастными категориями,.

Высокая вероятность развития нейродегенеративного заболевания возникает в ситуации, в которой пациент демонстрирует по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 100% вероятности развить или страдать указанным заболеванием с течением времени. В конкретном варианте осуществления высокая вероятность составляет по меньшей мере 100%. В других вариантах осуществления высокая вероятность составляет по меньшей мере 200%, по меньшей мере 300%, по меньшей мере 400%, по меньшей мере 500%, по меньшей мере 700%, по меньшей мере 800%, по меньшей мере 900% и по меньшей мере 1000%. Однако также предусмотрены другие пороги или диапазоны, как сочтет подходящим специалист в данной области, чтобы охарактеризовать изобретение, и они также входят в объем настоящего изобретения. В соответствии со способом предсказания по изобретению, высокая вероятность развития нейродегенеративного заболевания у пациента связана с присутствием одного или двух аллелей apoE4 в геноме указанного пациента, где определение указанных аллелей apoE4 осуществляют с помощью любого из первого, второго или третьего способов по изобретению, как описано ранее.

Низкая вероятность развития нейродегенеративного заболевания возникает в ситуации, в которой пациент демонстрирует по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 100% вероятности не развивать или страдать указанным заболеванием с течением времени. В конкретном варианте осуществления низкая вероятность составляет по меньшей мере 100%. В других вариантах осуществления низкая вероятность составляет по меньшей мере 200%, по меньшей мере 300%, по меньшей мере 400%, по меньшей мере 500%, по меньшей мере 700%, по меньшей мере 800%, по меньшей мере 900% и по меньшей мере 1000%. Однако также предусмотрены другие пороги или диапазоны, как сочтет подходящим специалист в данной области, чтобы охарактеризовать изобретение, и они также входят в объем настоящего изобретения. В соответствии со способом предсказания по изобретению, низкая вероятность развития нейродегенеративного заболевания у пациента связана с отсутствием аллелей apoE4 в геноме указанного пациента, где определение указанных аллелей apoE4 осуществляют с помощью любого из первого, второго или третьего способов по изобретению, как описано ранее.

В конкретном варианте осуществления нейродегенеративное заболевание выбирают из группы, состоящей из болезни Альцгеймера (AD), церебральной амилоидной ангиопатии (CAA), ассоциированной с синдромом Дауна деменции, сосудистой деменции, болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви и болезни Крейцфельда-Якоба. В более конкретном варианте осуществления, нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера (AD).

В дополнительном аспекте, изобретение относится к способу определения вероятности того, что пациент развивает нейродегенеративное заболевание, который включает определение у указанного пациента аллельной дозы гаплотипа, кодирующего изоформу apoE4, с помощью третьего способа по изобретению, где присутствие одного или двух аллелей apoE4 в геноме пациента указывает на то, что пациент имеет высокую вероятность развития нейродегенеративного заболевания, и где отсутствие аллелей apoE4 в геноме пациента указывает на то, что пациент имеет низкую вероятность развития нейродегенеративного заболевания.

В конкретном варианте осуществления нейродегенеративное заболевание выбирают из группы, состоящей из болезни Альцгеймера (AD), церебральной амилоидной ангиопатии (CAA), ассоциированной с синдромом Дауна деменции, сосудистой деменции, болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви и болезни Крейцфельда-Якоба. В предпочтительном варианте осуществления нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера (AD).

Способы предсказания развития сердечнососудистого заболевания

Недостаточность аполипопротеинов ассоциирована с развитием сердечнососудистых заболеваний. Следовательно, способы по изобретению для определения аполипопротеинов и изоформ аполипопротеинов также можно применять к предсказанию риска развития сердечнососудистого заболевания.

Таким образом, в другом аспекте данное изобретение относится к способу определения вероятности того, что пациент развивает сердечнососудистое заболевание, который включает определение в образце от указанного пациента уровней изоформы аполипопротеина с помощью любого из описанных ранее способов по изобретению (первого, второго и третьего способов), в котором, если уровни изоформы аполипопротеина выше эталонного значения, то это указывает на то, что пациент имеет высокую вероятность развития сердечнососудистого заболевания.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения вероятности того, что пациент развивает сердечнососудистое заболевание, который включает определение у указанного пациента аллельной дозы гаплотипа, кодирующего изоформу аполипопротеина, с помощью третьего способа по изобретению, где присутствие одного или двух аллелей указанной изоформы аполипопротеина в геноме пациента указывает на то, что указанный пациент имеет более высокую вероятность развития сердечнососудистого заболевания, и где отсутствие аллелей указанной изоформы аполипопротеина в геноме пациента указывает на то, что указанный пациент имеет более низкую вероятность развития сердечнососудистого заболевания.

В одном из вариантов осуществления способов предсказания сердечнососудистое заболевание по изобретению, изоформа аполипопротеина, подлежащая определению, представляет собой изоформу apoE, в частности, выбранную из группы, состоящей из изоформ apoE - apoE E2, apoE E3 и apoE E4, и сердечнососудистое заболевание выбирают из группы, состоящей из гиперлипопротеинемии III типа (также известной как дисбеталипопротеинемия или семейная гиперлипопротеинемия III типа, редкое генетическое нарушение, которое отличается неправильным метаболизмом липидов, в частности, холестерина и триглицеридов, что ведет к анормальному накоплению липидов в организме или гиперлипидемии), дисбеталипопротеинемии вследствие дефекта в аполипопротеине e-d, семейной гипербеталипопротеинемии (увеличенное накопление липопротеинов низкой плотности или беталипопротеинов в крови) и пребеталипопротеинемии (избыток липопротеинов очень низкой плотности или пребеталипопротеинов в крови), семейной гиперхолестеринемии с гиперлипемией, гиперлипемии с семейным гиперхолестеринемическим ксантоматозом (отложение скоплений, богатых холестерином, в организме), широкой беталипопротеинемии (состояния, которое отличается развитием областей избыточного жира в различных частях организма, так что жир откладывается в анормальных местах по всему организму, включая ладони, пальцы, колени, локти и подмышки), блуждающей беталипопротеинемии и болезни коронарных артерий (потеря эластичности и сужение артерий, несущих кровь к сердечной мышце, что ведет к атеросклерозу и даже стенокардии или сердечным приступам).

В другом варианте осуществления способов предсказания сердечнососудистого заболевания по изобретению, подлежащий определению аполипопротеин представляет собой apoAI и сердечнососудистое заболевание представляет собой гипоальфалипопротеинемию (дефицит HDL, наследуемый по аутосомно-доминантному типу).

В другом варианте осуществления способов предсказания сердечнососудистого заболевания по изобретению, подлежащий определению аполипопротеин представляет собой apoCII и сердечнососудистое заболевание представляет собой гиперлипопротеинемию типа Ib (редкое наследственное состояние, являющееся результатом низких уровней apoCII, которое отличается высокими уровнями хиломикронов).

В другом варианте осуществления способов предсказания сердечнососудистого заболевания по изобретению, подлежащий определению аполипопротеин представляет собой apoCIII и сердечнососудистое заболевание представляет собой дефицит apoCIII, связанный с гипертриглицеридемией (увеличенные уровни триглицеридов в крови).

Наборы по изобретению и их использование

В дополнительном аспекте, изобретение относится к набору, содержащему полистироловую или поликарбонатную поверхность и антитело со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе, где набор не содержит второе антитело со специфичностью к указанному аполипопротеину или его изоформе.

Таким образом, первый элемент набора по изобретению представляет собой полистироловую или поликарбонатную поверхность. Полистироловые и поликарбонатные поверхности в соответствии с изобретением описаны ранее в контексте первого способа по изобретению и включены в настоящее описание. Предпочтительно, поверхность представляет собой полистироловую поверхность. В конкретном варианте осуществления полистироловую или поликарбонатную поверхность содержит планшет для ELISA, бусы Luminex, турбидиметрические бусы или белковый чип. Конкретные предпочтительные поверхности представляют собой полистироловые поверхности, в том числе, без ограничения, планшеты, такие как планшеты для ELISA, бусы, такие как бусы Luminex и турбидиметрические бусы, и частицы.

Второй элемент набора по изобретению представляет собой антитело со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе. Аполипопротеины в соответствии с набором по изобретению включают apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин). Изоформы аполипопротеинов в соответствии с набором по изобретению включают изоформы apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин). Антитела со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе описаны ранее и включены в настоящее описание. В конкретном варианте осуществления аполипопротеин представляет собой apoE и антитело представляет собой антитело против apoE. В конкретном варианте осуществления изоформы аполипопротеинов представляют собой изоформы apoE, выбранные из группы, состоящей из apoE2, apoE3 и apoE4, и антитела выбирают из группы, состоящей из антител против apoE2, против apoE3 и против apoE4.

В конкретном варианте осуществления антитело со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе из набора по изобретению связывают с полистироловой или поликарбонатной поверхностью, предпочтительно полистироловой поверхностью.

Набор по изобретению не содержит второе антитело со специфичностью к конкретному аполипопротеину или конкретной его изоформе, к которым антитело, содержащееся в наборе, обладает специфичностью. Однако в конкретном варианте осуществления, когда антитело, которое содержится в наборе, представляет собой антитело со специфичностью к конкретной изоформе аполипопротеина, набор дополнительно может содержать второе антитело, которое способно к связыванию со всеми изоформами указанного конкретного аполипопротеина.

В конкретном варианте осуществления набор по изобретению дополнительно содержит репортерное антитело, где указанное репортерное антитело обладает специфичностью к антителу со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе, содержащемуся в указанном наборе. В конкретном альтернативном варианте осуществления антитело со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе набора по изобретению содержит поддающийся обнаружению реактив. Подходящий поддающийся обнаружению реактив в контексте настоящего изобретения описан ранее в контексте первого способа по изобретению и включен в настоящее описание.

В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к использованию набора, как описано выше, для детекции и/или количественного определения аполипопротеина или его изоформы в образце, для определения относительного количества изоформы заданного аполипопротеина относительно общего содержания указанного аполипопротеина в образце, для определения аллельной дозы гаплотипов, связанных с экспрессией изоформы аполипопротеина у пациента, для определения вероятности того, что пациент развивает нейродегенеративное заболевание, или для определения вероятности того, что пациент развивает сердечнососудистое заболевание. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к использованию набора, как описано выше, для детекции и/или количественного определения аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин) или его изоформы. В более конкретном варианте осуществления, изобретение относится к использованию набора, как описано выше, для детекции и/или количественного определения аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин) или его изоформы, где полистироловую или поликарбонатную поверхность блокируют альбумином, даже более предпочтительно где альбумин представляет собой BSA. Конкретные подробности этих определений описаны вместе с настоящим описанием и включены в настоящее описание.

Соответственно, настоящее изобретение относится к следующим аспектам:

1. Способ детекции и/или количественного определения in vitro аполипопротеина или его изоформы в образце, который включает:

(i) приведение в контакт образца с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания аполипопротеина или его изоформы с поверхностью, где поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанному аполипопротеину или его изоформе, связанным с ней,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин или его изоформу, сформированной на стадии (i), с антителом со специфичностью к указанному аполипопротеину или к указанной его изоформе при подходящих условиях для формирования комплекса между антителом и аполипопротеином или его изоформой, и

(iii) детекцию комплексов, сформированных на стадии (ii).

2. Способ в соответствии с аспектом 1, в котором аполипопротеин выбирают из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин).

3. Способ определения in vitro относительного количества изоформы заданного аполипопротеина относительно общего содержания указанного аполипопротеина в образце, который включает:

(i) приведение в контакт образца с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания аполипопротеина с поверхностью, где поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанному аполипопротеину, связанному с ней,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин, сформированной на стадии (i), с первым антителом со специфичностью к указанной изоформе аполипопротеина и со вторым антителом, которое способно к связыванию со всеми изоформами указанного аполипопротеина, присутствующими в образце, где указанное приведение в контакт осуществляют в условиях, подходящих для формирования первого комплекса, содержащего первое антитело и изоформу аполипопротеина, и для формирования второго комплекса, содержащего второе антитело и все изоформы указанного аполипопротеина,

(iii) детекцию первого и второго комплексов, формируемых на стадии (ii), и

(iv) определение относительных количеств изоформы относительно общего содержания аполипопротеинов на основании уровней первого и второго комплекса, получаемых на стадии (iii).

4. Способ по аспекту 3, в котором поверхность, используемую на стадии (i), формируют с помощью множества объектов, где приведение в контакт на стадии (ii) с первым антителом и со вторым антителом осуществляют в отдельных контейнерах, каждый контейнер содержит часть множества объектов, формирующих поверхность, и где обнаружение на стадии (iii) осуществляют отдельно в каждом контейнере.

5. Способ в соответствии с аспектами 3 или 4, в котором изоформа аполипопротеина представляет собой изоформу аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин).

6. Способ в соответствии с аспектом 5, в котором аполипопротеин представляет собой apoE и изоформу apoE выбирают из группы, состоящей из apoE2, apoE3 и apoE4.

7. Способ определения аллельной дозы гаплотипов, связанных с экспрессией изоформы аполипопротеина у пациента, который включает,

(i) приведение в контакт белок-содержащего образца от указанного пациента, полученного из ткани, в которой экспрессирована изоформа аполипопротеина, с полистироловой или поликарбонатной поверхностью при подходящих условиях для связывания изоформы аполипопротеина с поверхностью, где поверхность не содержит антитела со специфичностью к указанной изоформе аполипопротеина, связанной с ней,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин, сформированной на стадии (i), с по меньшей мере одним антителом со специфичностью к изоформе аполипопротеина при подходящих условиях для формирования комплекса между антителом и изоформой аполипопротеина,

(iii) определение аллельной дозы изоформы аполипопротеина с помощью корреляции количества комплекса, формируемого на стадии (ii), с числом аллелей, кодирующих указанный генетический вариант.

8. Способ по аспекту 7, в котором поверхность, используемую на стадии (i), формируют с помощью множества объектов, где стадия (ii) дополнительно включает приведение в контакт поверхности со вторым антителом, которое способно к связыванию со всеми изоформами указанного аполипопротеина, присутствующими в образце, где указанное приведение в контакт осуществляют в условиях, подходящих для формирования первого комплекса, содержащего первое антитело и изоформу аполипопротеина, и для формирования второго комплекса, содержащего второе антитело и все изоформы указанного аполипопротеина, где приведение в контакт с первым и со вторым антителом осуществляют в отдельных контейнерах, каждый содержит часть множества объектов, формирующих поверхность, где определение относительных количеств изоформы относительно общего содержания аполипопротеинов осуществляют на основании уровней первого и второго комплекса, получаемых на стадии (ii), и где аллельную дозу гаплотипов, связанных с экспрессией изоформы аполипопротеина, определяют по относительным количествам, определяемым на стадии (iii).

9. Способ в соответствии с аспектами 7 или 8, в котором генетический вариант, кодирующий изоформу аполипопротеина, представляет собой ген, кодирующий изоформу аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин).

10. Способ в соответствии с аспектом 9, в котором ген, кодирующий изоформу аполипопротеина, представляет собой ген, кодирующий apoE4.

11. Способ в соответствии с любым из предшествующих аспектов, в котором образец выбирают из группы, состоящей из крови, плазмы, сыворотки, слюны, мочи и цереброспинальной жидкости (CSF).

12. Способ в соответствии с предшествующим аспектом, в котором образец представляет собой плазму, предпочтительно в разведении в диапазоне от 1:10 до 1:100000, предпочтительно от 1:100 до 1:1000, более предпочтительно 1:200.

13. Способ в соответствии с любым из предшествующих аспектов, в котором полистироловую или поликарбонатную поверхность блокируют перед стадией связывания (i).

14. Способ в соответствии с предшествующим аспектом, в котором поверхность блокируют с помощью белка, отличного от аполипопротеина, и/или с помощью детергента.

15. Способ в соответствии с предшествующим аспектом, в котором поверхность блокируют белком, выбранным из группы, состоящей из BSA, казеина и желатина, и в котором детергент выбирают из группы, состоящей из поливинилпиролидона-40 (PVP-40), полисорбата 20, Nonidet-P40 и Triton X-100.

16. Способ в соответствии с предшествующим аспектом, в котором поверхность блокируют с помощью BSA, предпочтительно BSA 1%.

17. Способ в соответствии с любым из предшествующих аспектов, в котором полистироловую поверхность обрабатывают промывающим раствором после стадии связывания (i).

18. Способ в соответствии с предшествующим аспектом, в котором промывающий раствор содержит одну или несколько солей.

19. Способ в соответствии с предшествующим аспектом, в котором соль представляет собой NaCl.

20. Способ в соответствии с любым из аспектов с 17 до 19, в котором промывающий раствор содержит по меньшей мере один детергент.

21. Способ в соответствии с предшествующим аспектом, в котором по меньшей мере один детергент выбирают из группы, состоящей из полисорбата 20 и Triton X-100.

22. Способ в соответствии с аспектом с 17 до 21, в котором промывающий раствор содержит кислоту.

23. Способ в соответствии с предшествующим аспектом, в котором кислота представляет собой HCl 2 M или муравьиную кислоту 70%.

24. Способ в соответствии с любым из аспектов с 17 до 21, в котором промывающий раствор содержит основание.

25. Способ в соответствии с предшествующим аспектом, в котором основание представляет собой 2 M NaOH.

26. Способ в соответствии с любым из аспектов с 17 до 25, в котором промывающий раствор содержит восстанавливающее средство.

27. Способ в соответствии с предшествующим аспектом, в котором восстанавливающее средство представляет собой 2-меркаптотэтанол.

28. Способ в соответствии с любым из аспектов с 17 до 27, в котором промывающий раствор не содержит протеазу, окисляющий реактив или их сочетание.

29. Способ в соответствии с любым из предшествующих аспектов, в котором полистироловую или поликарбонатную поверхность содержит планшет для ELISA, бусы Luminex или турбидиметрические бусы.

30. Способ в соответствии с любым из предшествующих аспектов, в котором детекцию комплекса на стадии (iii) осуществляют посредством ELISA или посредством иммунотурбидиметрического анализа.

31. Способ в соответствии с предшествующим аспектом, в котором иммунотурбидиметрический анализ представляет собой LEIT (технологию иммунотурбидометрии с латексным усилением).

32. Способ в соответствии с любым из аспектов 1-30, в котором детекцию комплексов, формируемых на стадии (iii), осуществляют посредством репортерного антитела со специфичностью к антителу против аполипопротеина.

33. Способ определения вероятности того, что у пациента развивается нейродегенеративное заболевание, который включает определение в образце от указанного пациента уровней изоформы apoE4 посредством способа в соответствии с любым из аспектов с 1 до 32, в котором, если уровни apoE4 выше эталонного значения, то это указывает на то, что пациент имеет высокую вероятность развития нейродегенеративного заболевания.

34. Способ определения вероятности того, что у пациента развивается нейродегенеративное заболевание, который включает определение у указанного пациента аллельной дозы гаплотипа, кодирующей изоформу E4 apoE, посредством способа в соответствии с любым из аспектов с 7 до 32, где присутствие одного или двух аллелей apoE E4 в геноме пациента указывает на то, что пациент имеет высокую вероятность развития нейродегенеративного заболевания, и где отсутствие аллелей apoE4 в геноме пациента указывает на то, что пациент имеет низкую вероятность развития нейродегенеративного заболевания.

35. Способ в соответствии с любым из аспектов 33 или 34 в котором нейродегенеративное заболевание выбирают из группы, состоящей из болезни Альцгеймера (AD), церебральной амилоидной ангиопатии (CAA), ассоциированной с синдромом Дауна деменции, сосудистой деменции, болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви и болезни Крейцфельда-Якоба.

36. Способ в соответствии с предшествующим аспектом, в котором нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера (AD).

37. Способ определения вероятности того, что у пациента развивается сердечнососудистое заболевание, который включает определение в образце от указанного пациента уровней изоформы аполипопротеина посредством способа в соответствии с любым из аспектов с 1 до 30, в котором, если уровни указанной изоформы аполипопротеина выше эталонного значения, то это указывает на то, что пациент имеет высокую вероятность развития сердечнососудистого заболевания.

38. Способ определения вероятности того, что у пациента развивается сердечнососудистое заболевание, который включает определение у указанного пациента аллельной дозы гаплотипа, кодирующего изоформу аполипопротеина, посредством способа в соответствии с любым из аспектов с 7 до 30, где присутствие одного или двух аллелей указанной изоформы аполипопротеина в геноме пациента указывает на то, что указанный пациент имеет более высокую вероятность развития сердечнососудистого заболевания, и где отсутствие аллелей указанной изоформы аполипопротеина в геноме пациента указывает на то, что указанный пациент имеет более низкую вероятность развития сердечнососудистого заболевания.

39. Способ в соответствии с аспектами 37 или 38, в котором изоформа аполипопротеина представляет собой изоформу apoE и сердечнососудистое заболевание выбирают из группы, состоящей из гиперлипопротеинемии III типа, дисбеталипопротеинемии вследствие дефекта в аполипопротеине e-d, семейной гипербета- и пребеталипопротеинемии, семейной гиперхолестеринемии с гиперлипемией, гиперлипемии с семейным гиперхолестеринемическим ксантоматозом, широкой беталипопротеинемии, блуждающей беталипопротеинемии и болезни коронарных артерий.

40. Способ в соответствии с аспектами 37 или 38, в котором изоформа аполипопротеина представляет собой apoAI и сердечнососудистое заболевание представляет собой гипоальфалипопротеинемию.

41. Способ в соответствии с аспектами 37 или 38, в котором изоформа аполипопротеина представляет собой apoCII и сердечнососудистое заболевание представляет собой гиперлипопротеинемию типа Ib.

42. Способ в соответствии с аспектами 37 или 38, в котором изоформа аполипопротеина представляет собой apoCIII и сердечнососудистое заболевание представляет собой дефицит apoCIII, связанный с гипертриглицеридемией.

43. Набор, содержащий полистироловую или поликарбонатную поверхность и антитело со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе, где набор не содержит второе антитело со специфичностью к указанному аполипопротеину или его изоформе.

44. Набор в соответствии с аспектом 43, где, если антитело, присутствующее в наборе, обладает специфичностью к изоформе аполипопротеина, набор дополнительно содержит второе антитело, которое способно к связыванию со всеми изоформами указанного аполипопротеина.

45. Набор в соответствии с аспектами 43 или 44, где аполипопротеин выбирают из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин), и где изоформа аполипопротеина представляет собой изоформу аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ (кластерин).

46. Набор в соответствии с аспектом 45, где аполипопротеин представляет собой apoE и изоформу apoE выбирают из группы, состоящей из apoE2, apoE3 и apoE4.

47. Набор в соответствии с любым из аспектов с 43 до 46, в котором полистироловую или поликарбонатную поверхность содержит планшет для ELISA, бусы Luminex или турбидиметрические бусы.

48. Набор в соответствии с любым из аспектов с 43 до 47, который дополнительно содержит репортерное антитело, где указанное репортерное антитело обладает специфичностью к антителу со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе из набора.

49. Набор в соответствии с любым из аспектов с 43 до 47, в котором антитело со специфичностью к аполипопротеину или его изоформе содержит поддающийся обнаружению реактив.

50. Применение набора в соответствии с любым из аспектов с 43 до 49 для детекции и/или количественного определения аполипопротеина или его изоформы в образце, для определения относительного количества изоформы заданного аполипопротеина относительно общего содержания указанного аполипопротеина в образце, для определения аллельной дозы гаплотипов, связанных с экспрессией изоформы аполипопротеина у пациента, для определения вероятности того, что у пациента развивается нейродегенеративное заболевание, или для определения вероятности того, что у пациента развивается сердечнососудистое заболевание.

Изобретение описано подробно далее с помощью следующих примеров, которые следует толковать лишь в качестве иллюстрации и не ограничения объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Обнаружение ApoE4 посредством ELISA

Материалы и оборудование

- планшеты для ELISA, сильно связывающие (Nunc MaxiSorp® плоскодонный 96-луночный планшет. Альтернативные типы и марки планшетов для ELISA можно использовать со схожими результатами.

- Superblock в TBS (Thermo-Fisher, № PI-37535). Использовали альтернативные блокирующие реактивы, в том числе желатин, BSA, казеин, Tween-20, среди прочего, со схожими результатами.

- Моноклональное антитело мыши со специфичностью к apoE E4, клон 4E4 (Novus Biologicals, № NBP1-49529).

Использовали альтернативные антитела со специфичностью к apoE E4 (моноклональное антитело мыши со специфичностью к apoE E4, клон 5B5 (IBL № 10025); моноклональное антитело мыши со специфичностью к apoE E4, клон 1F9 (MBL, № M067-3)).

- Поликлональное антитело кролика для общего apoE (SantaCruz Biotechnology, Inc., № sc- 98573)

- Полисорбат-20 (Tween-20) из Sigma-Aldrich

- Поликлональное антитело против IgG мыши, конъюгированное с пероксидазой.

- TMB Peroxidase EIA Substrate (Biorad)

- ELISA Wash Station (TECAN)

- Спектрофотометр ELISA (TECAN)

Способ детекции

- Блокировать планшеты для ELISA посредством добавления 200 мкл Superblock (SB) в Tris-буферном физиологическом растворе (TBS) в течение 16 ч при комнатной температуре (RT)

- Промыть 2 раза в 300 мкл TBS 0,1% Tween 20 на ELISA Wash Station.

- Инкубировать 100 мкл разведенной плазмы 1:200 в TBS+20% SB в течение 1 часа при RT.

- Промыть 4 раза в 300 мкл TBS 0,1% Tween 20 на ELISA Wash Station.

- Инкубировать с 50 мкл репортерного антитела:4E4 антитела, разведенного 1:2000 в TBS+20% SB в течение 45 мин при RT.

- Промыть 4 раза в 300 мкл TBS 0,1% Tween 20 на ELISA Wash Station.

- Инкубировать с 50 мкл средства против IgG мыши-пероксидазы (1:10000) в TBS+20% SB в течение 30 мин.

- Промыть 4 раза в 300 мкл TBS 0,1% Tween 20 на ELISA Wash Station.

- Проявить посредством добавления 100 мкл de TMB в течение 10 минут в условиях темноты.

- Остановить посредством добавления 100 мкл H₂SO₄ 2,15 Н.

- Считать планшет в спектрофотометре на 450 нм с эталоном на 750 нм.

Анализировали различные разведения образцов плазмы в диапазоне от 1:20 до >1:80000. Наилучшие дифференциальные результаты получают в диапазоне между 1:100 и 1:1000. Для анализов, представленных здесь, используемое разведение плазмы составляет 1:200, если не указано иное.

Альтернативно, использовали другие моноклональные антитела со специфичностью к apoE E4, такие как 5B5 и 1F9, но наилучшие результаты получали с использованием клона 4E4.

Время инкубации можно укорачивать без важных вариаций в результатах.

Различные биологические жидкости можно анализировать посредством протокола, описанного здесь, но оптимальное разведение образца следует определять в соответствии с начальной концентрацией apoE.

Результаты

Различение отсутствия/присутствия apoE E4 в образцах плазмы

Присутствие/отсутствие ApoE4 обнаруживали с использованием протокола, описанного выше, используя полистироловые планшеты и моноклональное антитело со специфичностью к изоформе E4. Анализировали 230 образцов плазмы от индивидуумов, которых предварительно генотипировали посредством ПЦР в реальном времени (e2/e3, n=16; e2/e4, n=4; e3/e3, n=141; e3/e4, n=59; e4/e4, n=10). Валидация анализа (73 носителя ApoE4, 157 носителей не ApoE4) выявляла 100% конкордантность с генотипированием ApoE посредством ПЦР в реальном времени (см. фиг. 1 и таблицу 1).

Таблица 1. Распределение генотипов и показания ELISA для 230 образцов плазмы, анализируемых на изотип apoE4

Генотип ApoE	n	Среднее	Станд. откл.	Минимум	Максимум
2/3	16	0,0010	0,0025	-0,001	0,008
3/3	141	0,0020	0,0045	-0,004	0,036
2/4	4	3,087	0,2189	2,713	3,097
3/4	59	3,093	0,3787	1,322	3,471
4/4	10	3,226	0,2124	2,788	3,557

В соответствии с результатами, представленным в таблице 1 и на фиг. 2, образцы плазмы от гомозиготы APOE e4/4 склонны иметь более высокие показания поглощения, чем гетерозиготы APOE e3/e4 и e2/e4, что говорит о возможности отличать e4 гомозигот от гетерозигот (см. фиг. 3), несмотря на то, что имеет место определенное перекрытие между группами.

Различение гетерозиготных/гомозиготных носителей APOE ε4 в образцах плазмы

Альтернативно, дополнительное различение между гетерозиготными и гомозиготными образцами можно выполнять посредством выполнения двойного анализа ELISA для каждого образца, одного со специфичностью к apoE E4 и другого для того, чтобы определять уровни общего apoE (репортерное антитело: антитело для всех apoE, например, поликлональное для всех apo, SantaCruz Biotech., H-223, № sc-98573). Как показано на фиг. 4, соотношение apoE E4/общий apoE является хорошим представителем аллельной дозы APOE ε4. Различающая способность является хорошей для трех исследованных разведений (фиг. 4).

Связывание различных аполипопротеинов с полистироловой поверхностью

Для того чтобы исследовать связывание других аполипопротеинов с полистироловой поверхностью, осуществляли протокол ELISA, как описано выше, в котором использовали различные репортерные антитела со специфичностью к определенным аполипопротеинам. Анализ результатов показывал, что apoCI, apoAI, apoCIII, общий apoE и кластерин способны связываться с планшетом сходно с apoE E4 (см. фиг. 5).

Стабильное связывание apoE с полистироловой поверхностью

Для того чтобы дополнительно охарактеризовать свойства связывания apoE-полистирол, анализировали способность различных буферов, содержащих соль (NaCl 0-2,4 M) или детергент (полисорбат 20 или Triton X-100 0-0,5%), удалять apoE, связанный с полистироловым планшетом. С этой целью, после связывания apoE, присутствующего в плазме (разведение 1:200), лунки инкубировали в течение 1 часа при RT с различными буферами, представляющими интерес, промывали и продолжали анализ, как ранее описано выше. Как показано на фиг. 6, присутствие возрастающей концентрации NaCl или детергентов усиливает обнаружение apoE по сравнению с контролем без соли или детергента. Эти результаты подсказывают, что связывание опосредовано комбинацией электростатических и гидрофобных сил (фиг. 6).

Стабильность связывания apoE-полистирол также анализировали в качестве функции pH в диапазоне от pH 2 до 10 в лунках, блокированных с использованием блокирующего раствора, основанного на BSA, или Superblock (фиг. 7). pH в исследованном диапазоне совершенно не влиял на связывание apoE с блокированными BSA полистироловыми лунками. Что интересно, связывание apoE с блокированными Superblock полистироловыми лунками не стабильно при pH ниже 5 (фиг. 7), что подсказывает, что присутствие BSA может помогать поддерживать более стабильное микроокружение в силу его собственной буферной емкости. Следовательно, дополнительный анализ стабильности осуществляли в лунках, блокированных раствором BSA.

Также анализировали более строгие условия (см. фиг. 8) посредством обработки при 56°C в течение 1 часа с использованием:

- сильных кислот (2 M HCl или 70% муравьиная кислота),

- сильных оснований (2 M NaOH),

- комбинации анионного детергента и восстанавливающего средства (2% SDS и 0,7% 2-меркаптоэтанол, «очищающий буфер»),

- гипохлорита натрия (20000 ч./млн), и

- ферментативного детергента (очищающее средство Coulter Clenz®, Beckman Coulter)

Что интересно, реактивами, которые способны полностью удалять apoE, связанный с планшетом, являются только те, которые разрушают белок или посредством расщепления (ферментативный детергент) или посредством окисления (гипохлорит натрия) (фиг. 8).

Эти результаты показывают, что взаимодействие связывания apoE-полистирол является высоко стабильным, устойчивым к сильным детергентам, промываниям кислотами и основаниями. Эти свойства могут допускать проведение иммунологических анализов, анализа белковых микрочипов, турбидиметрического анализа и т. д. при очень строгих и конкретных условиях, которые устраняют необходимость процедур дополнительной очистки, фракционирования или концентрирования.

Схожие результаты наблюдали для связывания других аполипопротеинов с полистиролом; и, следовательно, схожие заключения переносят на другие процедуры для других аполипопротеинов.

Пример 2. Обнаружение ApoE4 посредством турбидиметрического анализа

Материалы и оборудование

- Образцы плазмы: 11 APOE e3/e3 и 6 APOE e4/e4 образцов.

- микросферы LEIT White, покрытые -NH2, с использованием Superblock, Prot. 20141222143CM, № 143CM1

- Спектрофотометр, номер UV-3100PC (VWR), код: PDX-1004

- Finnpipette F1 2-20 мкл, номер 4641060 (Thermoscientific, VWR), код: PDX-1009

- Finnpipette F1 20-200 мкл, номер 4641080 (Thermoscientific, VWR), код: PDX-1010

- MILI-Q ReferenceA+, номер Z00QSVC01

- Комбинированный холодильник Liebherr, номер CN4056, код: PDM-1000

- Vortex Mixer, номер VX200 (Labnet, Era biotech), код: PDX-1013

- Нагретая циркулирующая баня Optima, номер TC120-ST12 (Grant, VWR), код: PDX- 1028

Турбидиметрические анализы на основании технологии иммунотурбидометрии с латексным усилением (LEIT) основаны на использовании полистироловых бус. Следовательно, авторы изобретения использовали эту технологию для анализа apoE E4 и других аполипопротеинов, применяя их высоко стабильное высоко аффинное взаимодействие с полистиролом, как показано для планшетов для ELISA.

LEIT менее чувствительна, чем ELISA, но предлагает интересные и значительные преимущества для относительно высоко концентрированных анализируемых веществ, таких как аполипопротеины. LEIT позволяет проводить тесты за 5-20 минут в полностью автоматизированном обыкновенном клиническом химическом анализаторе произвольного доступа. Более высокая стоимость сырья, используемого в LEIT по сравнению с ELISA, полностью компенсируется экономией времени, простотой и эксплуатационной пригодностью технологии в клинических лабораториях. Значит, LEIT считают эффективным способом определения apoE.

Предварительный анализ APOE e3/e3 и 6 APOE e4/e4 образцов плазмы с использованием технологии LEIT и моноклонального 4E4 показывал, что процедура позволяет отличать носителей APOE e4 от не носителей (фиг. 9).

Способ детекции (тест 1)

Получение рабочих растворов:

- 0,5 мл раствора моноклонального антитела против apoE 4 0,176 мг/мл в PBS 10 мМ pH 7,3.

- растворить 88 мкл моноклонального антитела в 412 мкл.

Протокол:

1. Перенести 14,6 мкл белых микросфер LEIT -NH2 в пробирку Eppendorf и добавить 131,4 мкл PBS с Tween 20 0,01%. Гомогенизировать микропипеткой и инкубировать при 37°C в течение 2 мин.

2. Добавить 3,85 мкл раствора образца apoE в ту же пробирку Eppendorf, гомогенизировать микропипеткой и снова инкубировать в течение 2 мин при 37°C.

3. Добавить 50 мкл раствора моноклонального антитела, гомогенизировать микропипеткой и перенести весь объем в кварцевую кювету.

4. Считывать поглощение в течение минимального времени 5 минут и максимального времени 10 минут.

Способ детекции (тест 2)

Получение рабочих растворов:

- 0,5 мл раствора моноклонального антитела против apoE 4 0,044 мг/мл в PBS 10 мМ pH 7,3.

- Растворить 22 мкл моноклонального антитела в 478 мкл.

Протокол:

1. Перенести 14,6 мкл белых микросфер LEIT -NH2 в пробирку Eppendorf и добавить 131,4 мкл PBS с Tween 20 0,01% (№ 144CM1). Гомогенизировать микропипеткой и инкубировать при 37°C в течение 2 мин.

2. Добавить 3,85 мкл раствора образца apoE в ту же пробирку Eppendorf, гомогенизировать микропипеткой и снова инкубировать в течение 2 мин при 37°C.

3. Добавить 50 мкл раствора моноклонального антитела, гомогенизировать микропипеткой и перенести весь объем в кварцевую кювету.

4. Считывать поглощение в течение минимального времени 5 минут и максимального времени 10 минут.

Результаты

Тест 1

Результаты тестов 1 и 2 для анализа apoE посредством LEIT в различные моменты времени представлены в таблицах 2 и 3, соответственно.

Таблица 2. Анализ 3 e4/e4, 3 e3/e4 и 3 e3/e3 образцов посредством LEIT в различные моменты времени с помощью теста 1

Поглощение (произв. ед., λ=540 нм)
генотип ID код	4/4	3/4
01-007	05-009	02-001	01-003	01-006	01-016
t (мин)	MAb	Без MAb	MAb	MAb	MAb	MAb	MAb
0	0,935	0,921	0,954	0,960	0,907	0,916	0,887
1	0,941	0,917	0,956	0,963	0,905	0,916	0,886
2	0,952	0,916	0,963	0,970	0,904	0,918	0,888
3	0,963	0,915	0,972	0,980	0,905	0,921	0,892
4	0,971	0,915	0,983	0,990	0,905	0,924	0,897
5	0,978	0,915	0,992	0,999	0,905	0,927	0,902
ΔmAb0-5	0,043	-0,006	0,038	0,039	-0,002	0,011	0,015

Поглощение (произв. ед., λ=540 нм)
Генотип ID код	3/3	Контроли
01-010	01-008	01-013	Без apoE	Сыворотка козы	4/4 01-007
t (мин)	MAb	Без MAb	MAb	MAb	MAb	MAb	αM 0,176 мг/мл
0	0,970	0,903	0,924	0,932	0,888	0,884	0,882
1	0,967	0,900	0,920	0,929	0,887	0,881	0,878
2	0,966	0,899	0,918	0,928	0,888	0,880	0,877
3	0,966	-	0,918	0,928	0,888	0,880	0,876
4	0,967	0,898	0,920	0,928	0,891	0,880	0,875
5	0,969	0,898	0,921	0,928	0,895	0,881	0,875
ΔmAb0-5	-0,001	-0,005	-0,003	-0,004	0,007	-0,003	-0,007

Таблица 3. Анализ 6 e4/e4 и 11 e3/e3 образцов посредством LEIT в различные моменты времени с помощью теста 2

Поглощение (произв. ед., λ=540 нм)
Генотип/ ID код	3/3 01-121	3/3 01-122	3/3 01-123	3/3 01-124	3/3 01-116	3/3 01-117	3/3 01-118
t (мин)	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл
0	1,026	0,978	0,944	0,898	0,990	0,992	0,967
1	1,020	0,976	0,927	0,893	0,988	0,986	0,964
2	1,018	0,976	0,926	0,890	0,986	0,984	0,962
3	1,018	0,976	0,925	0,889	0,986	0,983	0,962
4	1,018	0,978	0,925	0,889	0,986	0,984	0,962
5	1,018	0,980	0,926	0,889	0,987	0,984	0,963
ΔmAb0-5	-0,008	0,002	-0,018	-0,009	-0,003	-0,008	-0,004

Генотип/ ID код	3/3 01-120	3/3 01-013	3/3 01-008	3/3 01-010
t (мин)	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл
0	0,993	0,973	1,046	1,086
1	0,976	0,969	1,040	1,074
2	0,975	0,968	1,038	1,070
3	0,973	0,968	1,039	1,069
4	0,973	0,969	1,042	1,071
5	0,974	0,971	1,046	1,073
ΔmAb0-5	-0,019	-0,002	0,000	-0,013

Поглощение (произв. ед., λ=540 нм)
Генотип/ ID код	4/4 07-004	4/4 07-005	4/4 07-015	4/4 02-001	4/4 01-007	4/4 05-009
t (мин)	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл	0,044 мг/мл
0	1,003	0,941	0,936	1,000	1,001	1,034
1	1,002	0,940	0,932	1,012	1,004	1,035
2	1,003	0,941	0,932	1,029	1,016	1,040
3	1,005	0,943	0,935	1,046	1,032	1,052
4	1,010	0,948	0,939	1,060	1,048	1,067
5	1,017	0,955	0,943	1,073	1,064	1,083
ΔmAb0-5	0,014	0,014	0,007	0,073	0,063	0,049

Из данных, полученных в тесте 1, авторы изобретения сделали заключение о том, что анализ LEIT позволяет проводить различия между различными apoE образцами плазмы, за исключением одного 3/4 образца плазмы (см. таблицу 2). Соответственно, разработаны оптимальные экспериментальные условия для латексного турбидиметрического анализа ApoE4 (см. таблицу 3):

- 2,75 мкг средства против apoE4/тест

- 3,85 мкл образца плазмы

- Общий объем анализа 200 мкл.

1. Способ детекции in vitro аполипопротеина, выбранного из группы, состоящей из apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE и apoJ в образце, который включает:

(i) приведение в контакт образца с полистироловой поверхностью для прямого электростатического и/или гидрофобного взаимодействия между аполипопротеином и полистироловой поверхностью,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин, сформированной на стадии (i), с антителом со специфичностью к указанному аполипопротеину для формирования комплекса между антителом и аполипопротеином, и

(iii) детекцию комплексов, сформированных на стадии (ii),

где полистироловую поверхность перед приведением в контакт с образцом блокируют соединением, выбранным из списка, состоящего из: альбумина, казеина, желатина или детергента.

2. Способ определения in vitro относительного количества изоформы Е4 аполипопротеина apoE относительно общего содержания указанного аполипопротеина в образце, который включает:

(i) приведение в контакт образца с полистироловой поверхностью для прямого электростатического и/или гидрофобного взаимодействия между аполипопротеином и полистироловой поверхностью,

(ii) приведение в контакт поверхности, с которой связывают аполипопротеин, сформированной на стадии (i), с первым антителом со специфичностью к указанной изоформе аполипопротеина и со вторым антителом, которое способно к связыванию со всеми изоформами указанного аполипопротеина, присутствующими в образце, где указанное приведение в контакт осуществляют для формирования первого комплекса, содержащего первое антитело и изоформу аполипопротеина, и для формирования второго комплекса, содержащего второе антитело и все изоформы указанного аполипопротеина,

(iii) детекцию первого и второго комплексов, сформированных на стадии (ii), и

(iv) определение относительных количеств изоформы относительно общего содержания аполипопротеинов на основании уровней первого и второго комплекса, получаемых на стадии (iii),

где полистироловую поверхность перед приведением в контакт с образцом блокируют соединением, выбранным из списка, состоящего из: альбумина, казеина, желатина или детергента.

3. Способ по п. 1, в котором аполипопротеин представляет собой apoE4.

4. Способ по п. 1 или 2, в котором альбумин представляет собой бычий сывороточный альбумин (BSA).

5. Способ по п. 1 или 2, в котором детергент представляет собой неионный детергент, выбранный из списка: поливинилпирролидон-40 (PVP-40), полисорбат 20 (Tween 20), Nonidet-P40 или Triton X-100.

6. Способ по п. 2, в котором поверхность, используемую на стадии (i), формируют с помощью множества объектов, где приведение в контакт на стадии (ii) с первым антителом и со вторым антителом осуществляют в отдельных контейнерах, каждый контейнер содержит часть множества объектов, формирующих поверхность, и где обнаружение на стадии (iii) осуществляют отдельно в каждом контейнере.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором полистироловую поверхность обрабатывают промывающим раствором после стадии связывания (i).

8. Способ определения вероятности того, что у пациента развивается нейродегенеративное заболевание, который включает определение в образце от указанного пациента уровней изоформы E4 apoE посредством способа по любому из пп. 2-7, в котором, если уровни apoE E4 выше эталонного значения, то это указывает на то, что пациент имеет высокую вероятность развития нейродегенеративного заболевания; причем эталонное значение представляет собой уровень apoE4, определяемый в образце от пациента, который не несет аллели apoE4.

9. Способ по п. 8, в котором нейродегенеративное заболевание выбирают из группы, состоящей из болезни Альцгеймера (AD), церебральной амилоидной ангиопатии (CAA), ассоциированной с синдромом Дауна деменции, сосудистой деменции, болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви и болезни Крейцфельда-Якоба.

10. Применение in vitro набора, содержащего i) полистироловую поверхность, блокированную альбумином, и ii) антитело со специфичностью к аполипопротеину apoE4, детекции и/или количественного определения аполипопротеина apoE согласно способу по любому из пп. 1-7.

11. Применение набора по п. 10, в котором набор дополнительно содержит второе антитело, которое способно к связыванию со всеми изоформами указанного аполипопротеина.

12. Применение набора по п. 10 или 11, где альбумин представляет собой бычий сывороточный альбумин (BSA).