Применение натриевой соли диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты, моногидрата в качестве средства лечения и профилактики поздних осложнений сахарного диабета
Изобретение относится к применению натриевой соли диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты, моногидрата формулы I в качестве средства лечения и профилактики отдаленных последствий сахарного диабета. Натриевая соль диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты, моногидрат является эффективным средством лечения и профилактики формирования таких диабетических осложнений, как нефропатия, кардиомиопатия, нейропатия, энцефалопатия, эндотелиальная дисфункция и гемореологические нарушения, и может найти широкое применение в медицине в области терапии поздних осложнений сахарного диабета. 13 ил.
Изобретение относится к фармакологии, а именно к применению биологически активного соединения - натриевой соли диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты, моногидрата - для лечения и профилактики поздних осложнений сахарного диабета (СД), а именно нефропатии, кардиомиопатии, ангиопатии, нейро- и энцефалопатии, эндотелиопатии, катаракты, повышения внутриглазного давления и гемореологических нарушений при СД.
Изобретение может быть использовано для создания биологически активных добавок и фармацевтических композиций, препятствующих развитию поздних осложнений СД.
Распространенность СД достигла масштабов неинфекционной эпидемии, мировой показатель которой составил 415 млн человек (2015, International Diabetes Federation) [1, 2]. Прогнозируется дальнейший рост заболеваемости.
Поздние осложнения СД (ПОСД) составили 37% причин смерти в популяции больных СД 1 и 2 типов в РФ (2015). В мире сердечно-сосудистый исход составляет более 2/3 причин смерти при СД, нейропатия является самым частым ПОСД (1/2-1/3 всех случаев СД), микроангиопатии и атеросклероз при СД - причины ампутаций (1/6 всех случаев СД), а нефропатия - значимый фактор, ограничивающий продолжительность жизни [3]. Экономические затраты на лечение СД и ПОСД составляют порядка 12% бюджетного финансирования здравоохранения РФ, в значительной степени являются непрямыми (потеря трудоспособности вследствие ПОСД) [4].
Патогенез ПОСД является сложным и комплексным, носящим признаки цикличного самоподдержания. Согласно Diabetic control and complications trial и UK Prospective diabetes study, в основе стартового механизма лежит многократное повреждающее действие острой внутриклеточной гипергликемии. Дальнейшие изменения связаны с индукцией дефицита восстановительных коферментов (I), необходимостью утилизации метаболитов глюкозы и продуктов ее (и ее дериватов) химического реагирования с неуглеводными компонентами и накоплением изменений в макромолекулах стромы (II), приобретением нормальными метаболическими путями признаков патологических, замыкающих на себе цикл патологической адаптации (III).
(I) Истощение восстановительных коферментов: внутриклеточная гипергликемия устраняется посредством преобразования глюкозы в сорбитол альдозоредуктазой с участием NADPH, тогда как восстановление глутатиона глутатионредуктазой замедляется [5]. Это провоцирует начальный этап окислительного стресса и возможно только при гипергликемии, поскольку альдозоредуктаза имеет низкое сродство к глюкозе. Окислительный стресс по механизму положительной обратной регуляции вызывает оверэкспрессию глюкозных транспортеров (ГЛЮТ) [6, 7, 8] в наиболее подверженных повреждающему действию гипергликемии клетках (эндотелиоциты, мезангиальные клетки и др.), формируя первый порочный круг.На данном этапе на уровне организма ожидается формирование диабет-ассоциированной артериальной гипертензии вследствие нарушения антиоксидантной защиты [9], фактором развития которой (не единственным) является снижение функции eNOS на фоне окислительного стресса [5]. Гипертензия является предиктором нефропатии (58% случаев СД2 - гипертензия первична [10]) в том случае, если на этапе диагностирования СД гипертензия имеет генез, не связанный напрямую с почечной патологией. Гипертензия является фактором риска кардиальной смерти при СД, особенно на фоне атеросклероза. Глюкозотоксичность, помимо альдозного пути (полиоловый путь), определена гексозаминным путем: на этапе образования глюкозо-6-фосфата в условиях внутриклеточной гипергликемии реализуется метаболизация до глюкозамино-6-фосфата (при участии GFAT) [11] и дальнейшая. метаболизация до UDP-GlcNAc.
(II) Утилизация дериватов глюкозы и продуктов ее реагирования в клетке необходима ввиду их токсического действия на внутриклеточные структуры (эндоплазматический стресс апоптоз), и реактивности (физико-химическое взаимодействие с белками, ДНК, липидами). Клиренс осуществляется посредством выведения за пределы клетки, где они физико-химически взаимодействуют с белками внеклеточной среды [5]. Последнее изменяет физические свойства белков (растворимость, эластичность и др.), и дополнено вкладом глюкозных, аминокислотных и липидных окислительных и неокислительных дериватов, образующихся внеклеточно. На данном этапе могут формироваться начальные проявления микрососудистой патологии по типу амилоидоза [12]. Развитие амилоидоза усиливается на фоне наличия артериальной гипертензии и атеросклероза, берущих начало от (I) [13]. Накапливающиеся вне клетки дериваты возвратно влияют на рецепторные системы клетки замыкаясь на новых и уже задействованных мишенях (eNOS, окислительный стресс и др.), что дает начало второму порочному кругу. Развивающаяся патология микроциркуляторного русла дополнена, нарушением функции коллагеназ (металлопротеиназы различных изоформ, МРР), что, на фоне окислительного стресса, влечет склерозирование, перераспределение типов коллагена (повышение содержания высокожесткого коллагена типа 1), экспансию. мезангия (проявление нефроповреждающего действия), ремоделирование миокарда (сопутствует кардиопатии), утяжеляя выраженность стромального компонента патологии.
(III) Как действие продуктов окислительной деградации белков / глюкозы / липидов и продуктов их взаимодействия, так и непосредственно внутриклеточная гипергликемия индуцируют активацию протеинкиназ (С, α, β, δ), имеющих широкое воздействие на организм: активация Nf-kB (фактор развития воспаления и апоптоза), NADPH-оксидаз (разрушающих NADPH - кофермент восстановительных ферментов → усиление событий пункта I), факторов ангиогенеза VEGF, трансформирующего фактора роста β, эндотелина-1 и снижение продукции / функции эндотелиальной NO-синтазы [5]. В результате, начатый в (II) этап порочного цикла замыкается на усилении окислительного стресса, утяжелении формирующейся эндотелиопатии, прогрессии микроангиопатии. Окислительный стресс вызывает нейропатию [14], а микроангиопатия усиливает ее проявление. Кроме этого, окислительный стресс усиливается на фоне присутствия металлов переходной валентности, имеющих значение при формировании ПОСД [14].
Конечным звеном патогенеза и финалом порочных кругов является нарушенное функционирование митохондриальной цепи переноса электронов, связанная с этим гиперпродукция активных форм кислорода (вместо передачи электрона в реакции комплекс II → комплекс III наблюдается реакция коэнзим Qe+O2=>коэнзим Q+O2e-).
При формировании приоритета на активность соединения в отношении препятствия развитию ПОСД ввиду широты патогенеза данных осложнений (Ι-ΙΠ), целесообразно исходить из приоритета на конечную активность, установленную на моделях целостных биологических систем (in vivo) гистологическими, поведенческими, иммуноферментными и иными аналитическими методиками, непосредственно связанными с оценкой степени развития осложнения. Это оправдано тем, что блокирование отдельных этапов патогенеза ПОСД (например, этапа (I)) не имеет однозначно установленного превентивного или терапевтического значения при ПОСД [5], смоделированные in vitro процессы ограниченно репрезентативны модели оценки анти-ПОСД активности, а углубленный молекулярно-биологический анализ труднореализуем, поскольку требует затраты значительного временного ресурса и существенного расширения материально-технической базы. При этом целесообразна регистрация «конечных точек» формирования ПОСД, таких, как митохондриальная патология, нейродегенерация, склерозирование сосудов и др., как репрезентативных и труднооспоримых маркеров ПОСД. Таким образом, представляемое решение нацелено на создание приоритета на вид активности нового соединения, установленной в рамках модельной патологии по конечному результату - наличию доказанного лечебного действия при ПОСД.
Проведенный заявителем анализ российских и зарубежных патентных баз данных, научной литературы и интернет-ресурсов показал, что существуют аналоги заявленного решения по назначению, способные препятствовать формированию диабетических патий, которые, однако, обладают значительными недостатками, а именно - недостаточно высокой эффективностью и/или существенными побочными эффектами, включая и дополнительную, сопутствующую основному действию фармакологическую активность, высокой токсичность и т.д. К числу таких представителей относятся сартановые блокаторы ΑΤII1 рецепторов (лозартан, кандесартан и др.), антиоксиданты (липоевая кислота), а также некоторые синтетические сахароснижающие препараты (метформин, пиоглитазон и др.). Данные средства используются в настоящее время в клинической практике, и при реализации эффекта препятствования диабетическим патиям реализуют различные механизмы действия.
Один из анти-ПОСД аспектов активности сартанов, предположительно, связан с усилением по механизму обратной связи продукции ангиотензина II, действующего на незаблокированные ATII2 рецепторы. Увеличение продукции металлопротеиназы (МРР) типа 1 (фермент, разрушающий коллагены) замедляет экспансию мезангия, разрыхляет склерозированные атеросклеротические бляшки [15]. Это же определяет повышение на 19% риска острого инфаркта миокарда из-за нарастающей нестабильности. атеросклеротических бляшек и эмболии (клиническое исследование VALUE). С другой стороны, источником внутриклеточного радикалообразования служит минералокортикоидная активность (активация минералокортикоидных рецепторов эндотелия), активация ΑΤII1, то есть совокупно - активность РААС.При усилении РААС наблюдается процесс повышенной активности NADPH-оксидазы - одного из звеньев пострецепторного метаболического пути ΑΤΙΙ1 и минералокортикоидного рецептора (дальнейшие метаболические звенья - р38МАРК, ERK1/2, Nf-kB влекут ускорение митргенеза в эндотелии и развитие эндотелиальной пролиферации) [16]. Таким образом, блокирование оксидативного звена дополняет активность сартанов в связи с возможностью блокирования ΑΤΙΙ1-сигнального пути. Однако активность сартанов неизменно дополнена антигипертензивным действием, логично ограничивающим их применяемость у части пациентов с гипотензией.
Для липоевой кислоты основное анти-ПОСД действие заключается в наличии антиоксидантности, которая, однако, признана слабой по результату 6 клинических испытаний (когортные и двойные слепые плацебо-контролируемые) [17, 18, 19, 20, 21, 22]. В отличие от сартанов липоевая кислота не имеет значимого гипотензивного действия, однако спектр анти-ПОСД активности более узкий - преимущественно для лечения полинейропатии, ассоциированной с СД [23, 24, 25].
Все перечисленные средства не рассматривались как препараты, способные тормозить развитие диабетических патий на этапе создания лекарственного препарата. Данное действие было определено как дополнительный, сопутствующий эффект. Меньшее количество средств, без исключения экспериментальных, разработаны первично с целью предотвращения диабетических патий. К таким относится аминогуанидин. Гидразиноподобная молекула - аминогуанидин - при экспериментальном СД препятствует развитию диабетической нефропатии, ретинопатии, нейропатии и др. патий [26, 27, 28]. Однако в отношении нейропатии действие аминогуанидина имело относительную выраженность [29]. Активность нельзя было охарактеризовать как высокую, что, предположительно, могло быть связано с недостаточной антиоксидантностью [30]. Аминогуанидин способен проявлять прооксидантное действие в условиях присутствия незначительных концентраций переходных металлов, что ограничивает его использование, поскольку в патогенезе ПОСД имеет место роль таковых [31, 32]. Аминогуанидин имеет множественную сопутствующую (нежелательную) активность, проявляющуюся в ингибировании eNOS, снижении активности катионного транспортера ОСТ2 (значимого при экскреции уремических токсинов, креатинина, метформина, цисплатина, самого аминогуанидина) [33]. Ингибирование eNOS имеет место в патогенезе ПОСД (см. выше), как фактор прогрессии. Это также ограничивает терапевтическую значимость препарата. В клинических исследованиях (рандомизированные плацебо-контролируемые исследования) у пациентов с СД препарат замедлял прогрессию снижения фильтрационной функции почек и уменьшал протеинурию. Однако у некоторых пациентов, получавших высокую дозу аминогуанидина (300 мг/кг, 3 года) отмечено развитие гломерулонефрита. Клинические испытания аминогуанидина были остановлены из-за проблем с безопасностью и недостаточной эффективностью. Имелись серьезные побочные эффекты в группе пациентов, получавших высокие дозы: преходящий гриппоподобный синдром, нарушение функции печени, желудочно-кишечные расстройства, редко васкулит и анемия [34].
В заключение описательной части - аминогуанидин - наиболее исследованный препарат, замедляющий прогрессию ПОСД, создаваемый целенаправленно для указанных показаний. Препарат проявил ограничивающие его клиническую значимость побочные эффекты, тем не менее, не утратил своей экспериментальной значимости. Его действие высокостандартизовано и многократно подтверждено, по этой причине препарат репрезентативен как референт при исследовании новых соединений, препятствующих ПОСД. Эффект клинически доступных препаратов хорошо изучен и стандартизован, однако существенно более высокая широта использования аминогуанидина в качестве референта, а также то, что ПОСД является основным показанием для препарата, отсутствие прочих клинических эффектов, на пример антигипертензивного (нежелательные эффекты аминогуанидина не рассматриваются, поскольку отсутствует их клиническая полезность), делает его препаратом выбора.
На основании вышесказанного проблема создания высокоактивных анти-ПОСД средств, имеющих высокую активность при разных формах ПОСД, разрешенных к клиническому применению для профилактики и лечения ПОСД остается нерешенной не только в РФ, но и за рубежом.
Сущность изобретения
Техническим результатом является применение натриевой соли диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты моногидрата (АВ-19) формулы I в качестве средства лечения и профилактики формирования таких диабетических осложнений, как нефропатия, кардиомиопатия, ангиопатия, нейропатия, энцефалопатия, эндотелиальная дисфункция, катаракта, повышение внутриглазного давления и гемореологические нарушения, и может найти широкое применение в медицине в области терапии поздних осложнений сахарного диабета
Синтез соединения представлен в патенте RU 2612300 С1 (Русинов В.Л., Чарушин В.Н., Сапожникова И.М., Близник A.M., Чупахин О.Н., Спасов А.А., Кузнецова В.Α., Соловьева О.А., Мацевич А.И).
Сущность изобретения поясняется следующими материалами:
На Фиг. 1 представлена таблица, в которой приведена динамика уровня глюкозы в крови экспериментальных животных. Примечание: * - данные достоверны по отношению к интактному контролю (р<0,05); # - данные достоверны по отношению к показателям животных со стрептозотоциновым диабетом (р<0,05).
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
На Фиг.2 представлена таблица, в которой приведены данные уровня белка (мг/сут) в моче интактных крыс и животных со стрептозотоциновой интоксикацией. Примечание: * - данные достоверны по отношению к интактному контролю (р<0,05); # -данные достоверны по отношению к показателям животных со стрептозотоциновым диабетом (р<0,05).
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет' На Фиг. 3 представлена таблица, в которой приведены данные клиренса креатинина (мл/мин/кг) интактных крыс и животных со стрептозотоциновой интоксикацией. Примечание: * - данные достоверны по отношению к интактному.контролю (р<0,05); # - данные достоверны по отношению к показателям животных со стрептозотоциновым диабетом (р<0,05).
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
На Фиг. 4 представлена таблица, в которой приведены данные об офтальмопротективной активности соединения АВ-19 и аминогуанидина на животных со стрептозотоциновой интоксикацией. Примечание: * - данные достоверны по отношению к интактному контролю (р<0,05); # - данные достоверны по отношению к показателям животных со стрептозотоциновым диабетом (р<0,05).
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
На Фиг. 5 представлен рисунок, на котором приведены данные о левожелудочковом давлении миокарда интактных крыс и животных со стрептозотоциновой интоксикацией при проведении кардиодинамической нагрузки с адреналином. Примечание: АГ - аминогуанидин; ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
На Фиг. 6 представлен рисунок, на котором приведены данные о сократительной активности миокарда интактных крыс и животных со стрептозотоциновой интоксикацией при проведении кардиодинамической нагрузки с адреналином. Примечание: АГ -аминогуанидин; ЧСС - частота сердечных сокращений; ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
На Фиг. 7 представлена таблица, в которой приведены данные гистологического изучения ткани почек интактных крыс и животных со стрептозотоциновой интоксикацией. Примечание: * - данные достоверны по отношению к интактному.контролю (р<0,05); # - данные достоверны по отношению к показателям животных со стрептозотоциновым диабетом (р<0,05).
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
На Фиг. 8 представлена таблица, в которой приведены данные о влиянии вещества АВ-19 и аминогуанидина на развитие нейропатии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом (стрептозотоцин 45 мг/кг). Примечание: * - данные достоверны по отношению к интактному контролю (р<0,05); # - данные достоверны по отношению к показателям живртных со стрептозотоциновым диабетом (р<0,05).
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
На Фиг. 9 представлена таблица, в которой приведены данные о пространственной памяти интактных крыс и животных со стрептозотоциновой интоксикацией в тесте «лабиринт Барнса». Примечание: * - данные достоверны по отношению к интактному контролю (р<0,05); # - данные достоверны по отношению к показателям животных со стрептозотоциновым диабетом (р<0,05).
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
На Фиг.10 представлена таблица, в которой приведены данные о процентном содержании гиперхромных нейронов в церебральной коре (сенсомоторная область париетальной коры) головного мозга интактных крыс и животных со стрептозотоциновой интоксикацией. Примечание: * - данные достоверны по отношению к интактному контролю (р<0,05); # - данные достоверны по отношению к показателям животных со стрептозотоциновым диабетом (р<0,05).
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
На Фиг. 11 представлена таблица, в которой приведены данные о процентном содержании митохондрий с деструктивными изменениями в эндотелиоцитах сосудов микроциркуляторного русла церебральной коры (сенсомоторная область париетальной коры) головного мозга интактных крыс и животных со стрептозотоциновой интоксикацией. Примечание: * - данные достоверны по отношению к интактному контролю (р<0,05); # - данные достоверны по отношению к показателям животных со стрептозотоциновым диабетом (р<0,05).
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
На Фиг. 12 представлен рисунок, на котором приведены данные о коэффициентах эндотелиальной дисфункции интактных крыс и животных со стрептозотоциновой интоксикацией. Примечание: АГ - аминогуанидин; ЭСД - экспериментальный сахарный диабет; * - данные достоверны по отношению к интактному контролю (р<0,05); # - данные достоверны по отношению к показателям животных со стрептозотоциновым диабетом (р<0,05).
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
На Фиг. 13 представлена таблица, в которой приведены данные о влиянии вещества АВ-19 и аминогуанидина на индекс элонгации эритроцитов, обработанных глиоксалем (1 mM). IC50 - концентрация вещества, вызывающая увеличение индекса элонгации эритроцитов, обработанных глиоксалем, на 50%; * - данные достоверны по отношению к интактному контролю (р<0,05); # - данные достоверны по отношению к показателю индекса элонгации эритроцитов, обработанных глиоксалем (р<0,05).
ЭСД - экспериментальный сахарный диабет.
Пример 1. Моделирование экспериментального сахарного диабета
Эксперименты проводили на 50-ти половозрелых крысах-самцах Sprague-Dawley массой 200-230 г, которых содержали в условиях вивария ВолгГМУ с естественным световым режимом на полнорационной сбалансированной по содержанию питательных веществ диете для лабораторных животных, согласно ГОСТ Р50258-92. Экспериментальный сахарный диабет (ЭСД) моделировали путем однократного внутривенного введения стрептозотоцина («Sigma», США), растворенного в 0,1 Μ цитратном буфере с рН 4,5 в дозе 45 мг/кг [35]. Количественное определение глюкозы в крови проводили через сутки после введения цитотоксина и далее еженедельно, в утреннее время, натощак, в течение всего срока эксперимента длительностью 12 недель, с использованием глюкометра «Глюкокард» (Россия). В эксперимент брали животных с.уровнем глюкозы натощак более 17 ммоль/л. Всем животным с уровнем глюкозы >19,4 ммоль/л для снижения риска гибели от кетоацидоза вводили двухфазный инсулин «ХУМУЛИН МЗ». Введение инсулина осуществляли подкожно в область холки животного в период времени 15.00-17.00 в дозе 1-4 ЕД. Через неделю после введения стрептозотоцина животных распределяли по группам. Контрольным группам: интактных животных и крысам с экспериментальным СД (ЭСД) вводили воду дистиллированную (1 мл/100 г); опытным группам - изучаемое вещество АВ-19 (20 мг/кг) и вещество сравнения аминогуанидин (50 мг/кг). Введение воды дистиллированной и растворов изучаемых веществ осуществляли через желудочный зонд ежедневно 1 раз в сутки в одно и то же время (12:00-14:00).
В результате было показано, что после введения стрептозотоцина наблюдали достоверное увеличение уровня глюкозы в крови у крыс с ЭСД по отношению к показателям интактных животных. Развитие диабета сопровождалось полидипсией, полиурией, животные были вялы и апатичны. Уровень глюкозы в крови у крыс всех экспериментальных групп с сахарным диабетом оставался достоверно высоким на протяжении всего эксперимента (Фигура 1), превышая значения интактной группы животных в среднем в 4,5 раза - 1-й месяц, в 3,5 раза - 2-й месяц, в 3,8 раза - 3-й месяц (p<0,05).
Пример 2. Оценка нефропатии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом
Для определения функции почек каждые 4 недели крыс помещали на 24 часа в метаболические камеры для сбора мочи с целью исследования суточной экскреции альбумина и креатинина. Определение концентрации белка в моче проводили с помощью набора реагентов «Vital Diagnostics)), (Россия) для определения содержания общего белка в моче и ликворе (метод с бромфеноловым синим). Определение концентрации креатинина в сыворотке крови и моче проводили с помощью коммерческого набора реагентов, Ольвекс-Диагностикум (Россия) для определения креатинина в биологических жидкостях методом Яффе с депротеинизацией. Используя значения концентрации. креатинина в сыворотке крови и моче, объема мочи и массы тела животного, рассчитывали клиренс креатинина по следующей формуле:
Для проведения гистологического исследования материал, полученный из почек, фиксировали в течение 24 часов в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (рН 7,4), обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой гистологической методике. На роторном микротоме изготавливали срезы толщиной 3-5 мкм, которые окрашивали по Массону.
Для проведения иммуногистохимического исследования (ИГХ) использовали моноклональные антитела к фибронектину (GeneTex, F14) и карбоксиметиллизину (Abeam, CMS-10). Оба маркера являются показательными при выявлении диабетической нефропатии [36, 37]. Процедуры депарафинизации, демаскировки антигенов, визуализации, окрашивания гематоксилином проводили в соответствии с протоколами фирм производителей антител с последующим анализом иммунофенотипа.
Гистологические препараты фотографировали цифровой камерой Axiocam 105 color (Карл Цейс, Германия, 5 мегапикселей) на базе микроскопа Axiocam plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х10; х40 и окуляра х10. При морфологическом исследовании оценивали наличие изменений в почечных тельцах (капсула, капилляры, мезангий), изменений соединительной ткани, наличие воспалительной инфильтрации. С помощью морфометрического метода исследования (с использованием программы «ΖΕΝ Pro 2012», (Карл Цейс, Германия) определяли площадь почечного тельца (мкм2), площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце (мкм) и относительную площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце.
В результате показано, что у животных с ЭСД на протяжении всего эксперимента регистрировали достоверное повышение уровня белка в моче (Фигура 2) по сравнению со значениями интактной группы крыс (в 2,6 раза - 1-й месяц, в 3,1 раза - 2-й месяц, в 3,9 раза - 3-й месяц). Однако, оба вещества, и АВ-19 и аминогуанидин, вводимые перорально экспериментальным животным, приводили к постепенному снижению выделения белка с мочой и статистически значимо снижали данный показатель через 3 месяца на 44,6% и 40% соответственно.
Нарушение экскреторной функции почек у животных с ЭСД подтверждается увеличением клиренса креатинина по сравнению с таковым у интактных животных (в 2,4 раза - 1-й месяц, в 13,2 раза - 2-й месяц, в 5,6 раза - 3-й месяц), что может происходить в результате гиперфильтрации креатинина и свидетельствовать о развитии ранней стадии диабетической нефропатии. Изучаемое соединение АВ-19 приводило к постепенной нормализации данного показателя и через 3 месяца уменьшало клиренс креатинина на 87,7% (р<0,05) по сравнению с группой животных с ЭСД до показателей сопоставимых с интактньгми животными. Вещество сравнения аминогуанидин, в свою очередь, не приводило к столь выраженному терапевтическому эффекту и снижало клиренс креатинина крыс с ЭСД на 52,6%.
Полученные данные были подтверждены гистологическими методами исследования ткани почек крыс всех изучаемых групп. При проведении морфометрического исследования микропрепаратов почек животных с ЭСД, окрашенных по Массону, было выявлено, что площадь клубочка уменьшалась на 25% (в отсутствии статистической значимости), а площадь соединительной ткани клубочков увеличивалась в 7 раз по сравнению с интактными животными (р<0,05) (Фигура 5), что, вероятно, характеризует явление экспансии мезангия. При этом наблюдали увеличение относительной площади соединительной ткани в 9,7 раза (р<0,05). Полученные результаты были подтверждены при использовании антител против фибронектина. Так, показатели площадей фибронектин-позитивного материала у животных с ЭСД увеличивались в 2,2 раза по сравнению с интактными крысами (р<0,05).
При проведении морфометрического исследования срезов почек животных, получавших вещество АВ-19, окрашенных по Массону, было выявлено достоверное увеличение площади клубочка на 27,7% и снижение площади соединительной ткани на 33,3% по сравнению с показателями крыс с сахарным диабетом, причем относительная площадь соединительной ткани уменьшалась в 2 раза (р<0,05). При проведении морфометрического иммуногистохимического исследования срезов почек данной группы животных, было показано уменьшение площадей фибронектин-позитивного материала на 38,6% и в 2,6 раза соответственно по сравнению с животными с ЭСД (р<0,05). При этом по активности изучаемое вещество АВ-19 было сопоставимо либо превышало вещество сравнения аминогуанидин (Фигура 5).
Пример 3. Исследование прозрачности хрусталика глаза и внутриглазного давления у крыс с экспериментальным сахарным диабетом
Исследование вели на фоне активности тропикамида. Введение тропикамида проводили местно (по 1 капле в глаз) за 5 минут до проведения исследования. Проводили видеорегистрацию хрусталика глаза с использованием щелевой лампы HSL с сохранением видео изображения. Проводилась визуальная оценка, к какой из групп по классификации.катаракты крыс со стрептозотоцин индуцированным диабетом относилось данное животное., Согласно данной классификации катаракта подразделяется на 4 стадии [38]:
0-нормальные линзы;
1 - минимальная непрозрачность в центре объектива;
2 - неоднородное появление непрозрачности как в центре, так и по периферии линзы;
3 - однородная опалесценция по всей линзе;
4 - нормальная катаракта с ядерной непрозрачностью.
В интактной группе животных линзы были прозрачные до конца эксперимента. В группе со стрептозотоцин-индуцированным диабетом развивалась 2 стадия изменения прозрачности хрусталика глаза. У животных получающих АВ-19 наблюдалась дозозависимая отсроченная прогрессия катаракты по сравнению с группой диабетических животных. В группе животных, получающих аминогуанидин, изменения прозрачности хрусталика были такие же, что и в группах животных, получающих АВ-19.
Внутриглазное давление (ВГД) измеряли с помощью ручного контактного аппланационного тонометра Icare. Принцип измерения заключается в мгновенном ударе маленького легкого наконечника по центру роговицы, что делает возможным измерение ВГД аккуратно, точно и без введения обезболивающих препаратов, которые заметно влияли на результаты измерений. Измерение занимало 0,1 секунды, что меньше времени корнеального рефлекса (0,2 с) и безболезненно, поэтому, анестезия роговицы не требовалась. Измерение производилось на расстояние 4 мм. После 6 автоматических измерений на табло выводилось среднее значение внутриглазного давления.
Было выявлено, что у животных со стрептозотоциновым диабетом на 32% повышается внутриглазное давление. В группах животных получающих АВ-19, данный. показатель снижался до нормы. У животных, получающих аминогуанидин, внутриглазное давление снижалось на 28%.
Пример 4. Оценка кардиомиопатии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом
На 120-й день эксперимента у животных проводили регистрацию основных показателей кардио- и гемодинамики [39]. Животных предварительно наркотизировали (хлоралгидрат 400 мг/кг, внутрибрюшинно), в условиях искусственной вентиляции легких проводилась торакотомия и перикардотомия. Для измерения внутрижелудочкового давления и частоты сердечных сокращений (ЧСС) через верхушку сердца в полость левого желудочка вводили иглу-катетер, соединенную с датчиком (Элема, Швеция). Данные показатели записывались и обрабатывались с помощью универсальной компьютерной многоканальной системы обработки сигналов в реальном масштабе времени BEAT (РКНПК. РАМН, Москва, 2000).
После периода стабилизации регистрируемых показателей (10 мин) путем введения адреналина внутривенно в разведении 10-6 г/л из расчета 0,1 мл/100 г массы тела проводили дозированную стимуляцию адренорецепторов сердца. Используемые функциональные пробы позволяли выявить ино- и хронотропные резервы сердца.
В результате показано, что при проведении кардиодинамической нагрузки с адреналином у здоровых животных наблюдали повышение сократительной активности миокарда (Рисунок 1). Прирост ЛЖД составил 50,6% и 54,4% к 15 и 30 секундам соответственно, что согласуется с данными прироста частоты сердечных сокращений (ЧСС) на тех же секундах фиксации показателя на 33,3% и 41,1%.
В условиях гипергликемии снижается чувствительность β-адренорецепторов к катехоламинам, поэтому у животных с 3-х месячным ЭСД наблюдали менее выраженный, ответ на нагрузку адреналином. Максимальное повышение ЛЖД и ЧСС происходило на 15 секунде и составило 42,8% и 8,6% соответственно, т.е. прирост ЛЖД и ЧСС у животных с ЭСД был ниже, чем у интактных (Рисунок 1), что может свидетельствовать о снижении функциональных резервов сердца у крыс со стрептозотоциновой интоксикацией.
Вещество АВ-19 приводило к восстановлению изученных показателей до величин сопоставимых с данными интактной группы животных (Рисунок 1). В группе животных, которым вводили вещество сравнения аминогуанидин, восстановление ЛЖД происходило лишь к 30 секунде после введения адреналина, а ЧСС не достигала показателей интактной группы крыс.
Пример 5. Оценка нейропатии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом
Для оценки развития диабетической нейропатии у экспериментальных животных использовали тест «горячая пластина» [40, 41]. Для этого животное помещали на медную пластину, являющуюся дном пластикового цилиндра диаметром 15 см, с заранее установленной температурой (55°С). При этом фиксировали латентное время (в сек.) появления ноцицептивной реакции (облизывания задних лап).
В результате было зафиксировано увеличение латентного времени появления ноцицептивной реакции (облизывания задних лап) в группе животных с экспериментальным сахарным диабетом (Фигура 6) на 69,7% (р<0,05) по сравнению с контрольной группой интактных крыс. Вещества АВ-19 и аминогуанидин приводили к уменьшению данного показателя на 19,6% (р<0,05) и 9,8% соответственно.
Пример 6. Оценка энцефалопатии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом
Для изучения когнитивных функций у экспериментальных животных была использована установка «лабиринт Барнс» (Открытая наука, Россия) [42], которая представляет собой арену, выполненную из матового светло-серого пластика (поливинилхлорида) на устойчивой подставке. По периметру арены расположены отверстия на одинаковом расстоянии друг от друга и от центра. Под одним из отверстий располагается убежище (норка), в то время как остальные закрыты ложными убежищами (ложнонорка). Ложные убежища меньше по размеру и имеют форму, отличную от прямоугольной. Зрительно убежища неразличимы. На начальном этапе (0 день) проводили обучение животных, которых помещали в центр арены и давали возможность поиска убежища в течение 5 минут. После нахождения норки животному давали адаптироваться в ней в течение 2-4 минут. В случае если животное не находило норку в течение 5 минут, животному оказывали помощь в поиске убежища. На следующий день (1 день) после обучения животных поочередно помещали в установку и отводили на поиск норки максимально 5 минут (300 с). На заключительном этапе (7 день) для оценки памяти. через неделю после обучения животных проводили контрольное тестирование, по описанной выше схеме. В период нахождения животного в установке "лабиринт Барнса" фиксировали следующие показатели: время нахождения норки (убежища, в секундах), количество совершенных ошибок (заглядывания в ложнонорки), эмоциональность (количество болюсов). Для оценки пространственной памяти рассчитывали индекс когнитивного дефицита, который является отношением значения времени в сек. нахождения убежища в 7 день к аналогичному показателю в сек. в 1 день эксперимента.
В результате при изучении пространственной памяти у экспериментальных животных было показано, что в группе интактного контроля индекс когнитивного дефицита составил 1,43 (Фигура 7). У крыс с экспериментальным сахарным диабетом наблюдали увеличение данного показателя в 4 раза (р<0,05), что свидетельствует об ухудшении мнестических функций головного мозга. В группах животных, получавших вещества АВ-19 и аминогуанидин наблюдали сохранение пространственной памяти, что подтверждается достоверным (по сравнению с группой ЭСД) уменьшением коэффициента когнитивного дефицита до уровня значений группы интактных крыс.
Полученные данные могут быть результатом структурно-функциональных нарушений в нейронах коры головного мозга, выявленных в ходе проведения электронной микроскопии срезов микропрепаратов головного мозга экспериментальных животных всех групп. Было показано, что у животных с ЭСД происходило достоверное по сравнению с интактной группой (Фигура 8) уменьшение числа неизмененных нейронов в сенсомоторной области париетальной коры головного мозга на 23,7% и увеличение количества нейронов с выраженной гиперхромией ядра и цитоплазмы в 3,2 раза (р<0,05). У животных, которым вводили изучаемые вещества, наблюдали сохранение количества неизмененных нейронов, кроме того в группе животных, получавших вещество АВ-19 количество нейронов с гиперхромией ядра было сопоставимо с показателем группы интактного контроля.
Кроме того, при электронной микроскопии препаратов головного мозга было обнаружено двукратное по сравнению с интактными животными снижение количества неизмененных митохондрий и увеличение на 74% набухших митохондрий с частичной деструкцией крист в эндотелиоцитах сосудов микроциркуляторного русла церебральной коры животных с экспериментальным сахарным диабетом (Фигура 9). У животных, получавших вещество АВ-19, наблюдали сохранение данных параметров на уровне интактного контроля, а назначение животным аминогуанидина приводило лишь к ' снижению количества набухших митохондрий.
Пример 7. Оценка эндотелиальной дисфункции у крыс с экспериментальным сахарным диабетом и индекса элонгации эритроцитов в проточной микрокамере
Для оценки эндотелиальной дисфункции проводили функциональные пробы с внутривенным введением ацетилхолина (40 мкг/кг) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) [43]. Среднее артериальное давление (АДср) измеряли непрерывно с помощью электроманометра на механотронных датчиках с малым объемом смещения (0,05 мл на 250 мм рт. ст:) с помощью компьютерного гемодинамического анализатора на базе программы BEAT (Москва, Россия). Регистрировали показатели снижения артериального давления в ответ на введение веществ и время его восстановления до исходных величин. Коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) рассчитывали как отношение площади над кривой среднего артериального давления после введения нитропруссида натрия к площади над кривой среднего артериального давления после введения ацетилхолина.
Нарушение деформируемости эритроцитов изучали на суспензии красных клеток крови, которую инкубировали с изучаемыми веществами в разных концентрациях при 37°С в течение 10 мин, после этого добавляли 1 мМ глиоксаля [44]. В качестве контрольных образцов использовали суспензии интактных эритроцитов и эритроцитов обработанных глиоксалем.
Деформируемость эритроцитов крови оценивали по индексу элонгации при фиксированном напряжении сдвига в проточной микрокамере. Ее заполняли суспензией эритроцитов (0,5%) в изотоническом растворе NaCl, содержащем 0,1% альбумина, и помещали на предметный столик микроскопа. В микрокамеру подавали давление, которое создает в ней определенную величину напряжения сдвига (длина микрокамеры - 3,5 см, ширина - 0,95 см, а высота - 120 мкм). Величина напряжения сдвига (τ) в камере рассчитывается по формуле: τ=6ηQ/Wh2
где, η - вязкость суспензии (примерно - 1,0 мПа*с), Q - объемная скорость в микрокамере, W - ширина проточного канала микрокамеры, h - высота канала, равная. толщине прокладки (стандартная полиэтиленовая пленка от 100 до 120 мкм).
Изображение растянутых потоком жидкости, прикрепленных одной точкой к поверхности микроканала эритроцитов транслировалось в удобном для обработки формате с помощью цифрового окуляра (DCM500). После «захвата» и записи изображения, проводили анализ в графическом редакторе Photoshop определяли длину и ширину 100 деформированных клеток и рассчитывали индекс элонгации как показатель деформации:
ИУЭ=(L-W)/(L+W)
где L - длина деформированной клетки, W - ее ширина.
В результате при изучении функции эндотелия у экспериментальных животных было показано увеличение в 3,4 раза (р<0,05) коэффициента эндотелиальной дисфункции у животных с сахарным диабетом (рис.2), что свидетельствует о снижении эндотелийзависимой вазодилатации, по сравнению с интактными животными. Изучаемые вещества АВ-19 и аминогуанидин приводили к достоверной нормализации данного показателя (рис. 2).
Поскольку развитие эндотелиальной дисфункции тесно взаимосвязано с гемореологическими нарушениями, было изучено влияние веществ АВ-19 и аминогуанидина на деформируемость эритроцитов, которые были обработаны одним из продуктов деградации углеводов - глиоксалем. В результате было показано, что деформируемость эритроцитов проинкубированных с глиоксалем ухудшалась, и индекс их элонгации снижался в 2 раза (Фигура10) по сравнению с интактными клетками (р<0,05). При одновременной инкубации эритроцитов с глиоксалем и веществами АВ-19 и аминогуанидином наблюдали улучшение деформационных свойств эритроцитов, что подтвердилось увеличением индекса их элонгации (Фигура 10). Эффект носил характер концентрационно-зависимого. По показателю зависимости активности от концентрации соединение АВ-19 на 33,3% активнее вещества сравнения аминогуанидина.
Таким образом, заявленное решение позволяет применение натриевой соли диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты, моногидрата (АВ-19) в качестве средства профилактики и лечения осложнений сахарного диабета, которое потенциально позволит существенно повысить качество и продолжительности жизни пациентов.
Список литературы
1) Распространенность сахарного диабета 2 типа у взрослого населения России (исследование NATION) / Дедов И.И., Шестакова М.В., Галстян Г.Р. // Сахарный диабет.2016;19(2):104-112.
2) Complications of diabetes / Papatheodoru K., Papanas Ν., Banach Μ., Papazoglou D., Edmonds M. // J Diabetes Research. 2016: 6989453.
3) Epidemiology of diabetes and diabetes-related complications / Deshpande Α., Harris-Hayes M., Schootman Μ // Phys Ther. 2008. 88(11): 1254-1264.
4) Сахарный диабет как экономическая проблема в Российской Федерации / Дедов И.И., Омельяновский В.В., Шестакова М.В., Авксентьева М.В., Игнатьева В.И. // Сахарный диабет.2016;19(1): 30-43.
5) The Pathobiology of Diabetic Complications. A Unifying Mechanism / Brownlee M. // Diabetes 2005 Jun; 54(6): 1615-1625.
6) The roles of hyperglycaemia and oxidative stress in the rise and collapse of the natural protective mechanism against vascular endothelial cell dysfunction in diabetes / Cohen G, Riahi Y, Alpert E, Gruzman A, Sasson S. // Arch Physiol Biochem. 2007; 113(4-5):259-67.
7) Overexpression of glucose transporters in rat mesangial cells cultured in a normal glucose milieu mimics the diabetic phenotype / Heilig CW, Concepcion LA, Riser BL, Freytag SO, Zhu M, Cortes Ρ//J Clin Invest. 1995.96:1802-1814.
8) Differential regulation of glucose transport and transporters by glucose in vascular endothelial and smooth muscle cells / Kaiser N, Sasson S, Feener EP, Boukobza-Vardi N, Higashi S, Moller DE, Davidheiser S, Przybylski RJ, King GL // Diabetes. 1993. 42:80-89.
9) Superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and NADPH oxidase in lead-induced hypertension / Vaziri ND Lin CY, Farmand F, Sindhu RK // Kidney Int. 2003. 63(l):186-94.
10) Hypertension in diabetic nephropathy: epidemiology, mechanisms, and management / Buren P.V., Toto R // Adv Chronic Kidney Dis. 2001. 18(1): 28-41.
11) Hexosamines, insulin resistance and the complications of diabetes: current status / Buse M.G. // Am J Physiol Endocrinol Metab. 2006. 290(1): E1-E8.
12) Renal AA amyloidosis in patients with type 2 diabetes mellitus / Diez R., Madero M., Gamba G., Soriano J., Soto V. //Nephron Extra. 2014. 4(2). 119-126.
13) Wang Y., Feng X., Shen В., Ma J., Zhao W. Is vascular amyloidosis intertwined with arterial aging, hyperthension. Front Genet. 2017. 8: 126.
14) Vincent AM, Russell JW, Low P, Feldman EL. Oxidative stress in the pathogenesis of diabetic neuropathy. Endocr Rev. 2004 Aug. 25(4):612-28.
15) Kim M.P., Zhou M., Wahl L.M. / Angiotensin II increases human monocyte matrixmetalloproteinase-1 through the AT2receptor andprostaglandin E2: implications for atheroscleroticplaque rupture // Journal of Leukocyte Biology. 2005. 78:195-201.
16) Renin-angiotensin-aldosterone system and oxidative stress in cardiovascular insulin resistance / Cooper S.A., Whaley-Connell Α., Habibi J., Wei Y., Lastra G., Manrique C, Stas S., Sowers J.R. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007. 293(4):H2009-23.
17) Assessment of the antioxidant effectiveness of alpha-lipoic acid in healthy men exposed to muscle-damaging exercise / Zembron-Lacny A, Slowinska-Lisowska M, Szygula Z, Witkowski K, Stefaniak T, Dziubek W. // J Physiol Pharmacol. 2009. 60(2):139-43.
18) Alpha-lipoic acid improves endothelial dysfunction in patients with subclinical hypothyroidism / G D X, J Η Ρ, Η L S, L S Z. // Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2010; 118(9):625-9.
19) Effects of alpha-lipoic acid supplementation on inflammation, oxidative stress, and serum lipid profile levels in patients with end-stage renal disease on hemodialysis / Khabbazi T, Mahdavi R, Safa J, Pour-Abdollahi P. // J Ren Nutr. 2012. 22(2):244-50.
20) Effect of α-lipoic acid and exercise training on cardiovascular disease risk in obesity with impaired glucose tolerance / McNeilly AM, Davison GW, Murphy MH, Nadeem N, Trinick T, Duly E, Novials A, McEneny J // Lipids Health Dis. 2011;10:217.
21) Complementary therapy in diabetic patients with chronic complications: a pilot study / Palacka P, Kucharska J, Murin J, Dostalova K, Okkelova A, Cizova M, Waczulikova I, Moricova S, Gvozdjakova A. // Bratisl Lek Listy. 2010.111(4):205-11.
22) Restoration of blood total glutathione status and lymphocyte function following alpha-lipoic acid supplementation in patients with HIV infection / Jariwalla RJ, Lalezari J, Cenko D, Mansour SE, Kumar A, Gangapurkar B, Nakamura D. // J Altern Complement Med. 2008. 14(2): 139-46.
23) Эффективность препаратов альфа-липоевой кислоты в лечении диабетической полинейропатии / Кольцова Е.А., Ковражкина Е.А., Стаховская Л.В. // Трудный пациент.2017. №10-11, Т. 15:25-29.
24) The role of alpha-lipoic acid in diabetic polyneuropathy treatment /
// Bosn J Basic Med Sci. 2008.8(4):341-5.
25) Diabetic neuropathy / Bansal V, Kalita J, Misra UK // Postgrad Med J. 2006. Vol.82. P. 95-100.
26) Aminqguanidine prevents the decreased myocardial compliance produced by streptozotocin-induced diabetes mellitus in rats / Norton GR, Candy G, Woodiwiss AJ. // Circulation. 1996 May 15;93(10):1905-12.
27) Aminoguanidine reduces regional albumin clearance but not urinary albumin excretion in streptozotocin-diabetic rats / Huijberts MS, Wolffenbuttel BH, Crijns FR, Nieuwenhuijzen Kruseman AC, Bemelmans MH, Struijker Boudier HA // Diabetologia. 1994 Jan; 37(l):10-4.
28) Shazly AH, Mahmoud AM, Darwish NS / Potential prophylactic role of aminoguanidine in diabetic retinopathy and nephropathy in experimental animals // Acta Pharm. 2009; 59(l):67-73.
29) Effect of aminoguanidine treatment on diabetes-induced changes in the myenteric plexus of rat ileum / Shotton HR, Adams A, Lincoln J. // Auton Neurosci. 2007; 132(1-2): 16-26.
30) Pyridoxal-aminoguanidine adduct is more effective than aminoguanidine in preventing neuropathy and cataract in diabetic rats / Chen AS, Taguchi T, Sugiura M, Wakasugi Y, Kamei A, Wang MW, Miwa I // Horm Metab Res. 2004;36(3): 183-7.
31) Aminoguanidine has both pro-oxidant and antioxidant activity toward LDL / Philis-Tsimikas A, Parthasarathy S, Picard S, Palinski W, Witztum JL // Arterioscler Thromb Vase Biol. 1995;15(3):367-76.
32) DNA damage by free radical production by aminoguanidine / Suji G, Sivakami S. // Ann N Y Acad Sci. 2006; 1067:191-9.
33) Transport of guanidine compounds by human organic cation transporters, hOCTl and hOCT2 / Kimura N, Masuda S, Katsura T, Inui K. // Biochem Pharmacol. 2009; 77(8): 1429-36.
34) Design and baseline characteristics for the aminoguanidine Clinical Trial in Overt Type 2 Diabetic Nephropathy (ACTION II) / Freedman B.I., Wuerth JP, Cartwright K, Bain RP, Dippe S, Hershon K, Mooradian AD, Spinowitz BS. // Control. Clin. Trials. 1999. 20(5): 493-510.
35) Renoprotective effect of lansoprazole in streptozotocin-induced diabetic nephropathy in wistar rats / R. Kaur, R. Kaur Sodhi, N. Aggarwal, J. Kaur, U.K. Jain // Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 2016; 389(l):73-85.
36) SGK1-mediated fibronectin formation in diabetic nephropathy / Feng Y, Wang Q, Wang Y, Yard B, Lang F. // Cell Physiol Biochem. 2005; 16(4-6):237-44.
37) N(carboxymethyl)lysine as a biomarker for microvascular complications in type 2 diabetic patients / Wautier MP, Massin P, Guillausseau PJ, Huijberts M, Levy B, Boulanger E, Laloi-Michelin M, Wautier JL. // Diabetes Metab. 2003 Feb; 29(l):44-52.
38) Reduction of oxidative-nitrosative stress underlies anticataract effect of topically applied tocotrienol in streptozotocin-induced diabetic rats / Nurul Alimah Abdul Nasir // PLoS ONE. 2017; 12(3):e0174542.
39) Методические рекомендации по доклиническому изучению кардиотонической активности лекарственных средств / Тюренков И.Н., Перфилова В.Н. // в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть I. - М.: Гриф и К. - 2012. - С. 375-384.
40) Assessment of the hot-plate antinociceptive test in mice. A new method for the statistical. treatment of graded data / Kitchen I, Crowder Μ // J Pharmacol Meth. 1985; 13:1-7.
41) The increasing temperature hot-plate test: an improved test of nociception in mice and rats / A, Rosland JH, Berge OG, Hole К // J Pharmacol Meth. 1991; 25:241-250.
42) Memory deficits associated with senescence: A neurophysiological and behavioral study in the rat. / Barnes, C.A. // J. Сотр. Physiol. Psychol. 1979. 93: 74-104.
43) Патент С 22301015 RU A 61 B5/02. Способ оценки эндотелиальной дисфункции / Покровский М.В., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И. // №2005113243/14; Заявл. 04.05.2005/17 Изобретения (Заявки и патенты). - 2007. - №17.
44) Effect of carbonyl compounds on red blood cells deformability / Iwata H, Ukeda H, Maruyama T, Fujino T, Sawamura Μ // Biochem Biophys Res Commun. 2004; 321(3):700-6.
Применение натриевой соли диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты моногидрата формулы I в качестве средства лечения и профилактики формирования поздних осложнений сахарного диабета
