Водная композиция, полученная из морской воды и морских водорослей
Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к применению водной композиции для стимулирования врожденного иммунитета у субъекта с целью предотвращения заболеваний, спровоцированных инвазией патогенного агента через кожу, глаз и слизистую оболочку. Применяемая водная композиция включает фильтрованную морскую воду и фукан из Ascophyllum nodosum, имеющий молекулярную массу от 2 до 21 кДа, в определенном соотношении. Изобретение обеспечивает применение композиции, обладающей иммуностимулирующим эффектом, для увеличения секреции бета-дефензина-2, увеличения аутофагической способности клеток, увеличения секреции ИЛ-10. 9 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 2 пр.
Данное изобретение относится к композиции на основе морской воды, предназначенной, в частности, для стимуляции иммунной системы с целью предотвращения вредного воздействия внешней среды.
Физическую защиту организма обеспечивает кожа, слизистые оболочки, реснички и ворсинки клеток мерцательного эпителия, а также слизь и секретируемые жидкости клеток, которые выстилают большинство слизистых оболочек. Эти средства защиты позволяют механически блокировать проникновение экзогенного агента в организм и/или способствуют его эвакуации, в частности, за счет смещения под действием ресничек.
Химическая и клеточная защита организма использует несколько действующих факторов в несколько этапов. На первом этапе в начале инфекции воспалительный ответ запускается неспецифическим образом, чтобы активировать фагоциты и макрофаги, которые расщепляют патогенный агент после секреции цитокинов и других медиаторов воспаления. На втором этапе, если первой линии защиты недостаточно для удаления патогенного агента, лейкоциты при содействии макрофагов инициируют иммунный ответ, чтобы специфически распознать патогенный агент и расщеплять его. В определенных случаях организму не удается бороться с инвазией, и развивается патология. На уровне оториноларингологической сферы в случае нарушения работы иммунной системы могут развиваться ринит, синусит и ларингит.
Первые рекомендации по поддержанию иммунной системы в случае вредного воздействия окружающей среды - вести здоровый образ жизни: не курить, регулярно заниматься спортом, ограничивать потребление алкоголя, высыпаться, часто мыть руки и т.д. Диета также играет роль в поддержании иммунитета; по этой причине в продаже имеются пищевые добавки, предназначенные для «укрепления иммунной системы». В основном это пищевые добавки на основе витаминов (А, В, С, D и Е) и/или микроэлементов (селен, цинк). Однако ни одно достаточно исчерпывающее исследование не показало эффективность таких пищевых добавок. Другие пищевые добавки на пробиотической основе позволяют улучшить работу пищеварительной системы, и таким образом, усвоение питательных веществ, необходимых для синтеза витаминов (особенно В и К), а также для восстановления комменсальной флоры.
С точки зрения профилактики, чтобы блокировать развитие определенных серьезных инфекций, с которыми организм не может бороться, медицина предлагает вакцинацию. Противоинфекционная вакцинация заключается во введении антигена, полученного из инфекционного агента или подобного ему, для того, чтобы стимулировать развитие иммунного ответа организма. Вакцины могут быть ослабленными или инактивированными вирусами (для предотвращения вирусной патологии), бактериями или субъединичными антигенами. Иммунная реакция, индуцируемая таким образом, позволяет запомнить антиген, чтобы позволить приобретенному иммунитету во время фактической контаминации быстрее активироваться.
Кроме того, известны решения, которые используют сульфатированные полисахариды, и в частности, фуканы для лечения патологий, использующие защитные механизмы иммунной системы. Такие фуканы описаны в заявке WO2010/133359. Заявка WO2010/133359 описывает использование фуканов, необходимых для адекватного функционирования иммунной системы, с положительным влиянием на здоровье кишечной флоры плода во время беременности.
Существует реальная потребность в улучшении результатов, полученных благодаря фуканам, например, путем активации их эффекта за счет синергизма действия с другими элементами. Чтобы восполнить недостатки предшествующего уровня техники, цель этого изобретения состоит в том, чтобы предложить композицию, которая обеспечивает возможность вмешательства до проникновения и/или пролиферации патогенных агентов путем стимуляции врожденного иммунитета.
Объект данного изобретения относится к водной композиции для стимуляции иммунной системы путем стимулирования врожденного иммунитета с целью предотвращения по меньшей мере одного из заболеваний, вызываемых проникновением одного или нескольких патогенных агентов в кожу, глаза или слизистую оболочку, полученной из 20-60 масс.% отфильтрованной морской воды по отношению к общей массе композиции, и включающей сульфатированный полисахарид, содержащийся в водорослях.
В рамках изобретения выражение «содержащийся в морских водорослях» означает, что композиция содержит водоросли полностью или частично, или что композиция включает экстракт морских водорослей, который содержит указанный сульфатированный полисахарид, или что используемый сульфатированный полисахарид представляет собой синтетическую молекулу, которая идентична натуральной молекуле, содержащейся в морских водорослях.
В рамках изобретения выражение «полученная из морской воды» означает, что композиция включает морскую воду или что она содержит трансформированную морскую воду.
Иммуностимуляция предназначена для усиления естественной иммунизации. Макрофаги, первая линия защиты в иммунном ответе, играют двойную роль: они запускают воспалительный процесс, который затем следует ингибировать, чтобы можно было вернуться в физиологическое состояние. Эти явно противоречивые эффекты отражают сложность иммунной реакции. Поэтому вполне возможно, что активный ингредиент является иммуностимулирующим и противовоспалительным, все зависит от используемых механизмов. Более того, такие эффекты были выявлены в рамках исследования куркумы (Curcuma longa): Chandrasekaran et al., Pharmacognosy Res. 2013, April; 5(2): 71-79. Это также можно было наблюдать в рамках исследования экстракта чеснока: Ishiwada et al. J. Nutr. 2006; 136 (3 Suppl): 816S-820S; Keiss et al., J. Nutr. 2003; 133 (7): 2171–2175. Аналогичное было показано в рамках исследования кверцетина: Liao et al. J. Agric. Food. Chem. 2014 Apr 2; 62(13):2872-80.
Авторы изобретения неожиданно показали, что композиция по изобретению обладает иммуностимулирующим эффектом за счет увеличения секреции антимикробного пептида, квалифицируемого как β-дефензин-2, за счет увеличения аутофагической способности клеток и за счет увеличения секреции ИЛ-10. Композиция также обладает противовоспалительными свойствами, ингибируя секрецию ФНОα и ИЛ-1β, стимулированную ЛПС E.coli. Кроме того, интересно отметить, что при отсутствии бактериального воспалительного стресса (индуцируемого ЛПС) композиция согласно изобретению стимулирует иммунный ответ путем незначительного увеличения секреции ФНОα и ИЛ-1β (см. черные столбцы на диаграммах 4 и 5).
В таблице 1 приведены составляющие элементы морской воды, а также их теоретическая доля, выраженная в частях на миллион:
Таблица 1
| Элемент | Содержание, ч./млн | Элемент | Содержание, ч./млн |
| Хлор, Cl | 19500 | Цирконий, Zr | 0,00003 |
| Натрий, Na | 10770 | Висмут, Bi | 0,00002 |
| Магний, Mg | 1290 | Ниобий, Nb | 0,00001 |
| Сера, S | 905 | Таллий, Tl | 0,00001 |
| Кальций, Ca | 412 | Торий, Th | 0,00001 |
| Калий, K | 380 | Гафний, Hf | 7 x 10-6 |
| Бром, Br | 67 | Гелий, He | 6,8 x 10-6 |
| Углерод, C | 28 | Бериллий, Be | 5,6 x 10-6 |
| Азот, N | 11,5 | Германий, Ge | 5 x 10-6 |
| Стронций, Sr | 8 | Золото, Au | 4 x 10-6 |
| Кислород, O | 6 | Рений, Re | 4 x 10-6 |
| Бор, B | 4,4 | Кобальт, Co | 3 x 10-6 |
| Кремний, Si | 2 | Лантан, La | 3 x 10-6 |
| Фтор, F | 1,3 | Неодим, Nd | 3 x 10-6 |
| Аргон, Ar | 0,43 | Свинец, Pb | 2 x 10-6 |
| Литий, Li | 0,18 | Серебро, Ag | 2 x 10-6 |
| Рубидий, Rb | 0,12 | Тантал, Ta | 2 x 10-6 |
| Фосфор, P | 0,06 | Галлий, Ga | 2 x 10-6 |
| Йод, I | 0,06 | Иттрий, Y | 1,3 x 10-6 |
| Барий, Ba | 0,02 | Ртуть, Hg | 1 x 10-6 |
| Молибден, Mo | 0,01 | Церий, Ce | 1 x 10-6 |
| Мышьяк, As | 0,0037 | Диспрозий, Dy | 9 x 10-7 |
| Уран, U | 0,0032 | Эрбий, Er | 8 x 10-7 |
| Ванадий, V | 0,0025 | Иттербий, Yb | 8 x 10-7 |
| Титан, Ti | 0,001 | Гадолиний, Gd | 7 x 10-7 |
| Цинк, Zn | 0,0005 | Празеодим, Pr | 6 x 10-7 |
| Никель, Ni | 0,00048 | Скандий, Sc | 6 x 10-7 |
| Алюминий, Al | 0,0004 | Олово, Sn | 6 x 10-7 |
| Цезий, Cs | 0,0004 | Гольмий, Ho | 2 x 10-7 |
| Хром, Cr | 0,0003 | Лютеций, Lu | 2 x 10-7 |
| Сурьма, Sb | 0,00024 | Тулий, Tm | 2 x 10-7 |
| Криптон, Kr | 0,0002 | Индий, In | 1 x 10-7 |
| Селен, Se | 0,0002 | Тербий, Tb | 1 x 10-7 |
| Неон, Ne | 0,00012 | Палладий, Pd | 5 x 10-8 |
| Марганец, Mn | 0,0001 | Самарий, Sm | 5 x 10-8 |
| Кадмий, Cd | 0,0001 | Теллур, Te | 1 x 10-8 |
| Медь, Cu | 0,0001 | Европий, Eu | 1 x 10-8 |
| Вольфрам, W | 0,0001 | Радий, Ra | 7 x 10-11 |
| Железо, Fe | 0,000055 | Протактиний, Pa | 5 x 10-11 |
| Ксенон, Xe | 0,00005 | Радон, Rn | 6 x 10-16 |
Концентрации, указанные в таблице 1, выражены в виде средних значений, которые могут меняться в зависимости от географического положения моря и даже места отбора морской воды.
Морская вода в основе композиции в соответствии с изобретением представляет собой носитель с различными химическими элементами, присутствующими в более или менее существенной концентрации. Физико-химические свойства морской воды зависят от баланса между анионами и катионами. Эти элементы ведут себя как набор биомолекул, которые взаимодействуют друг с другом. В рамках изобретения синергизм действия осуществляется не только между этими различными ионами, но также с сульфатированными полисахаридами, присутствующими в композиции.
Авторы изобретения совершенно неожиданно обнаружили, что такая композиция, объединяющая комбинацию ингредиентов, поступающих из морских продуктов, где эти ингредиенты происходят как из веществ, растворенных в морской воде, так и из морских водорослей, растущих в морской воде, позволила предотвратить развитие заболеваний, связанных с включением и распространением патогенных агентов в организме. Целевые патогены представляют собой главным образом вирусы или бактерии, или аллергенные агенты. Композиция согласно изобретению предназначена для профилактического лечения, способствуя повышению защиты организма от вредного воздействия таких патогенных агентов путем стимуляции врожденного иммунитета.
Эта композиция в соответствии с изобретением стимулирует врожденный иммунитет, то есть она позволяет активировать защитные механизмы против патогенных агентов, таких как упомянутые выше, без обязательного предварительного контакта организма субъекта с указанными агентами.
Было продемонстрировано, что композиция по изобретению особенно выгодна благодаря тому, что биологический ответ индуцируется непосредственно с первого применения. Эффект in vitro наблюдается на живых клетках спустя всего один час после контакта.
Кроме того, измеренный эффект запоминается клетками и сохраняется даже после устранения раствора. Следовательно, биологическое действие является профилактическим.
Кроме того, биологическое действие наблюдается для разных типов клеток, что приводит к эффекту, возможному в разных участках организма при местном применении непосредственно на клетках. Подготовка организма к защите осуществляется с помощью различных дополнительных механизмов, обеспечивающих противодействие различным типам патогенных агентов (бактерий, вирусов, аллергенов, грибковых микроорганизмов).
Композиция согласно изобретению содержит от 20 до 60%, а предпочтительно от 35 до 55%, даже от 40 до 50% отфильтрованной морской воды, в массовых процентах по отношению к общей массе полученной готовой композиции. Отфильтрованная морская вода представляет собой морскую воду, которую обрабатывают путем пропускания по меньшей мере через один очищающий фильтр; диаметр пор упомянутого фильтра преимущественно составляет менее 1 мкм.
Морская вода предпочтительно является бретонской морской водой, выбранной предпочтительно в городе Пенмарш в департаменте Финистер, в заливе Сен-Бриё в департаменте Кот-д'Армор или в заливе Сен-Мало в департаменте Иль-и-Вилен.
Используемая морская вода выбрана по её предпочтительному местоположению, которое обуславливает и/или обеспечивает:
- отсутствие в непосредственной близости производств, со здоровой окружающей средой;
- участок отбора, который не закрыт: постоянное обновление воды;
- поток в зоне, благоприятной для обновления воды; и
- воду с качеством, которое признано удовлетворительным специализированными органами, такими как IFREMER (Французский научно-исследовательский институт эксплуатации моря) и DDASS (Департамент по вопросам здравоохранения и социального обеспечения).
Композиция согласно изобретению предпочтительно содержит по меньшей мере одну воду, выбранную из очищенной воды, дистиллированной воды и деминерализованной воды, в количестве от 40 до 80%, предпочтительно от 45 до 65%, еще более предпочтительно от 50 до 60%. Чистота разбавляющей воды, используемой для регуляции концентраций, тщательно контролируется, чтобы предотвратить добавление нежелательных элементов, которые могут загрязнять или изменять физико-химические свойства среды.
Предпочтительно сульфатированный полисахарид представляет собой фукан. Определение фуканов в терминах изобретения дано в заявке WO1999032099.
Сульфатированный полисахарид предпочтительно экстрагируют из бурых морских водорослей. Бурые водоросли предпочтительно выбирают из одного из видов: Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus и Undaria pinnatifida.
Предпочтительно бурые водоросли представляют собой Ascophyllum nodosum. Сульфатированные полисахариды, выделенные из Ascophyllum nodosum, продемонстрировали сильную синергию действия в сочетании с элементами, содержащимися в морской воде, для стимуляции антимикробного пептида β-дефензина-2, участвующего в врожденном иммунитете, который можно рассматривать как первую линию защиты организма против микробных атак.
Сульфатированный полисахарид предпочтительно содержится в количестве от 0,01 до 0,5%, предпочтительно от 0,05 до 0,4%, более предпочтительно от 0,09 до 0,25%.
Сульфатированный полисахарид предпочтительно имеет массу от 2 до 21 кДа (килодальтон), предпочтительно от 4 до 17,5 кДа, более предпочтительно от 5 до 15 кДа. Испытания показали, что среди полисахаридов, и в частности, фуканов, с фуканами массой 4, 8 и 20 кДа можно получить очень хорошую антимикробную активность. Наилучшие результаты были получены с фуканами 8 кДа.
Предпочтительно, концентрация элементов в готовой композиции, присутствующих в ионной форме, составляет:
| Cl (г/л) | 5-15 |
| Na (г/л) | 2,5-7 |
| Mg (г/л) | 0,45-0,70 |
| Ca (г/л) | 0,10-0,30 |
| K (г/л) | 0,10 – 0,30 |
Предпочтительно, концентрация элементов из веществ в готовой композиции в соответствии с изобретением составляет:
| Cl (г/л) | 7,9-10,1 |
| Na (г/л) | 4,3-5,3 |
| Mg (г/л) | 0,51-0,63 |
| Ca (г/л) | 0,16-0,22 |
| K (г/л) | 0,15 - 0,23 |
Общие сахара (г/л) 0,25-0,55
Предпочтительно содержание следующих веществ в композиции по изобретению составляет:
Общие сульфаты (г/кг) 1,0 - 1,8
Концентрации в композиции, используемой для биологического действия, являются низкими для сильного клеточного ответа, что свидетельствует о высоком коэффициенте эффективности этого натурального морского комплекса.
Композиция оказывается полностью безвредной для пациентов в описанных концентрациях, что делает ее пригодной для использования как в общей популяции, так и в педиатрической популяции.
Композиция также показала отличную переносимость слизистых оболочек, даже самых чувствительных, таких как мерцательный эпителий слизистой оболочки носа. Действительно, изучение цитотоксичности композиции по изобретению позволило оценить ее высокую переносимость для рассматриваемых применений. Были проведены различные оценочные тесты на цитотоксичность для нескольких типов клеток, а также исследование толерантности у людей с целью лучшего определения переносимости организмом композиции согласно изобретению. Исследования по данным наблюдений у здоровых субъектов показывают эту толерантность по сохранению нормального функционирования ресничных клеток слизистой оболочки носа.
Предпочтительно рН композиции составляет от 6,5 до 8,5. Предпочтительно pH составляет от 6,9 до 8,1.
Предпочтительно, осмоляльность, измеренная при 25°С, составляет от 400 до 550 мОсмоль/кг. Предпочтительно осмоляльность составляет от 450 до 500 мОсмоль/кг.
Осмоляльность измеряют в соответствии с методом, описанным в Европейской фармакопее 9.0 (девятое издание) - пункт 2.2.35. Электропроводность измеряют в соответствии с методом, описанным в Европейской Фармакопее 9.0 - пункт 2.2.38.
Стимуляция иммунитета композицией по изобретению предпочтительно заключается в стимуляции врожденного иммунитета.
Слизистая оболочка или оболочки, на которые направлено профилактическое лечение согласно изобретению, выбрана или выбраны из слизистой оболочки носа, слизистой оболочки полости рта и слизистой оболочки влагалища. Предпочтительно композиция по изобретению обеспечивает профилактику воспалительных состояний слизистых оболочек.
Композиция в соответствии с изобретением может применяться в любой области, которая использует клеточную физиологию, в таких органах, как глаз или органы сферы ЛОР, в частности, на слизистых оболочках носа, с целью предотвращения поражений, таких как ринит, заложенность носа, сухость носа, синусит или бронхит. Композицию по изобретению также можно наносить на кожу и на слизистые оболочки влагалища, в частности, в препаратах для интимной гигиены.
Данное изобретение также относится к способу приготовления композиции, такой как описана выше в рамках изобретения, включающему этапы:
а) подачи насосом морской воды;
b) при необходимости, предварительной обработки морской воды с использованием первого натурального или искусственного фильтра;
c) фильтрации при необходимости предварительно обработанной морской воды через второй фильтр, средний диаметр пор которого составляет 5 мкм или менее;
d) проведения другой фильтрации через третий фильтр, у которого средний диаметр пор меньше диаметра пор второго фильтра, и составляет 0,45 мкм или менее;
е) разбавления отфильтрованного раствора очищенной водой.
На этапе (а) морскую воду, отобранную с помощью насоса, при необходимости фильтруют (этап (b)) с помощью либо натурального фильтра, такого как, например, песок, либо искусственного фильтра, такого как, например, сетка, приспособленная для удаления частиц крупного размера. Затем воду предпочтительно хранят в бассейне или резервуаре для предварительной обработки. Затем эту морскую воду перенаправляют в трубы с помощью насоса с целью ее фильтрации.
Предварительно обработанную морскую воду фильтруют на этапах (с) и (d) через два фильтра, средний размер пор которых составляет соответственно от 5 мкм до 1 мкм (для (с)) и менее 0,45 мкм (для (d)). Для этого этапа фильтрации воду предпочтительно вводят в блок фильтрации, который объединяет трубы, которые предпочтительно включают фильтры в форме цилиндрических картриджей. Пример блока фильтрации описан ниже в экспериментальной части.
Это изобретение будет лучше понятно при ознакомлении с последующей экспериментальной частью, примеры и чертежи которой приведены исключительно в информационных целях, и которые никоим образом не могут рассматриваться как ограничивающие. Чтобы проиллюстрировать результаты экспериментальной части, на диаграмме 1 показано схематическое поперечное сечение фильтрующего устройства, которое позволяет фильтровать морскую воду перед ее разбавлением, чтобы получить композицию согласно изобретению.
Экспериментальная часть
Приготовление композиции по изобретению, содержащей 45% морской воды (диаграмма 1):
45 кг морской воды, отобранной в Бретани с помощью насоса, фильтровали с помощью воронки. Забранную таким образом морскую воду хранили в бассейне для предварительной обработки. Эту морскую воду затем перекачивали с помощью насоса.
Предварительно обработанную морскую воду закачивали в трубы блока фильтрации 1, показанного на схеме 1. Блок фильтрации 1 содержит ввод 2 морской воды. Этот ввод для воды 2 соединен с расходомером 3, который соединен с нижней частью корпуса 4 предварительного фильтра 5 (1 мкм). Выводное отверстие предварительного фильтра 5 (так же в нижней части корпуса 4) соединено с нижней частью корпуса 6 фильтра 7 (0,22 мкм), выход которого соединен с трубой, которая используется для сбора воды, поступающей из фильтра для хранения в контейнере 8.
Затем отфильтрованный раствор дополняют очищенной водой и добавляют экстракт морских водорослей.
I. Проверка иммунологической эффективности композиции путем изучения различных маркеров иммунного ответа.
Сравнивали различные экстракты морских водорослей, богатые фуканами разной молекулярной массы.
• Оценка секреции антимикробного пептида β-дефензина-2
Были протестированы три экстракта Ascophyllum nodosum: один, богатый фуканами 4000 Да (Fuc 4000, черный столбец на диаграммах 1 и 2), другой, богатый фуканами 8000 Да (Fuc 8000, серый столбец на диаграммах 1 и 2) и последний, богатый фуканами 20 000 Да (Fuc 20000, белый столбец на диаграммах 1 и 2). Также были протестированы экстракт Fucus vesiculosus (Fuc Fucus) и экстракт Undaria pinnatifida (Fuc Undaria), молекулярная масса которых составляет от 5000 до 30000 Да. Эти образцы растворяли либо в культуральной среде RPMI, содержащей 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,5% пенициллина/стрептомицина и 1% глутамина, либо в морской воде при 45% (Sal 15) в трех концентрациях (1 мкг/мл, 100 мкг/мл и 1 мг/мл). Образцы инкубировали с макрофагами в течение 1 часа, затем надосадочную жидкость извлекали для анализа антимикробного пептида β-дефензина-2.
Продукцию β-дефензина-2 измеряли на макрофагах, используя метод ИФА (иммуноферментный анализ). Этот метод позволяет проводить анализ белков в образце; в данном случае метод ИФА позволяет количественно определить пептид β-дефензин-2, высвобождаемый в надосадочной жидкости макрофагами. Специфический антиген β-дефензина-2 прикрепляют к подложке, 96-луночному микропланшету. Надосадочную жидкость от клеток вносят в него, и β-дефензин-2 может связываться со своим антигеном. Первичное антитело позволяет распознавать β-дефензин-2, затем вторичное антитело, конъюгированное с ферментом, связывается с первичным антителом. Колориметрическая ферментативная реакция позволяет выявить комплекс антител. Устройство, используемое для количественной оценки оптической плотности, представляет собой цитометр, адаптированный для микропланшетов (Safire, TECAN).
Секрецию β-дефензина-2 оценивали путем измерения коэффициента секреции, который указан на оси ординат на диаграммах 1 и 2.
Экстракт Ascophyllum nodosum, богатый фуканами с молекулярной массой 8000 Да (Fuc 8000), является наиболее эффективным для стимуляции секреции антимикробного пептида β-дефензина-2.
Эти тесты однозначно демонстрируют синергизм действия между фуканами и отфильтрованной морской водой при стимуляции врожденного иммунитета (при 1 мкг/мл: х0,97 в культуральной среде, по сравнению с х1,18 в морской воде; при 100 мкг/мл: х1,26 против х1,98 и 1 мг/мл: х1,28 против х 1,36).
• Оценка воспалительного ответа с ФНО-α
Выделение провоспалительных цитокинов (ФНО-α) измеряли на макрофагах методом ИФА, поясненным выше.
Экстракт Ascophyllum nodosum, богатый фуканами со средней молекулярной массой 10000 Да (Ascophysious), и экстракт Laminaria digitata, богатый фуканами со средней молекулярной массой 520 000 Да (Fuc3 F), были протестированы на их способность снижать секрецию провоспалительных цитокинов (ФНО-α), индуцированную бактериальным агентом (белые столбцы на диаграммах 3 и 4, по сравнению с теми же образцами без ЛПС: черные столбцы), ЛПС Escherichia coli в течение 24 часов при 37°C. Их солюбилизировали либо в культуральной среде RPMI, содержащей 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,5% пенициллина/стрептомицина и 1% глутамина, либо в морской воде при 45% в концентрациях, указанных на диаграммах 3 и 4, и инкубировали с макрофагами.
Секрецию провоспалительных цитокинов измеряли анализом ФНО-α, который показан на диаграммах 3 и 4, со шкалой ординат, представленной в относительных единицах:
- Как можно видеть при интерпретации результатов на диаграмме 2,5%, экстракт Laminaria digitata (Fuc3 F) не стимулирует выработку провоспалительного цитокина ФНО-α. Он не способен блокировать выработку цитокинов, индуцированную ЛПС Escherichia coli. Следовательно, он не обладает противовоспалительным действием в отношении ФНО-α.
- С другой стороны, если такой же анализ проводили после инкубации макрофагов с композицией, содержащей 0,1% экстракта Ascophyllum nodosum (Ascophysious), богатого фуканами со средней молекулярной массой 10 кДа, растворенного в 45% отфильтрованной морской воды (композицией Stimmuno_A), в этом случае секреция ФНО-α, индуцированная ЛПС, блокировалась (диаграмма 4). Таким образом, экстракт Ascophyllum nodosum, богатый фуканами со средней молекулярной массой 10000 Да (Ascophysious) в сочетании с 45% отфильтрованной морской воды, обладает сильным противовоспалительным эффектом.
• Оценка воспалительного ответа с ИЛ-1β
Здесь также использовали методику ИФА.
Таким образом, для подтверждения контроля воспалительной реакции, измеренной с помощью ФНО-α, с помощью композиции, был проведен анализ другого провоспалительного цитокина, ИЛ-1β.
Как можно видеть при интерпретации результатов, показанных на диаграмме 5, которая показывает анализ ИЛ-1β (относительные единицы на оси ординат), Ascophyllum nodosum (Ascophyscient), растворенный в 45% отфильтрованной морской воды (состав Stimmuno_A), не стимулировал выработку провоспалительного цитокина ИЛ-1β. Следовательно, композиция Stimmuno_A согласно изобретению с 0,1% Ascophyllum nodosum и 45% отфильтрованной морской воды способна блокировать продукцию цитокинов, индуцированную ЛПС Escherichia coli, что показывает контроль секреции ИЛ-1β в ответ на бактериальный стресс.
Вывод: Ascophyllum nodosum эффективен для снижения выработки провоспалительных цитокинов. Экстракт Ascophyllum nodosum, богатый фуканами с молекулярной массой 10000 Да, контролирует воспалительную реакцию, в отличие от экстракта Laminaria digitata, богатого фуканами 520 000 Да.
Были также протестированы другие экстракты морских водорослей, и в частности, Fucus vesiculosus и Undaria pinnatifida в отфильтрованной морской воде, что позволило сделать вывод о том, что наилучшие результаты были получены с Ascophyllum nodosum.
• Оценка аутофагии и выявление синергизма действия
Другие тесты (часть А и В) также были проведены, чтобы выявить эффективность композиции в отношении маркеров защиты клеток, которые были изучены после инкубации клеток человека с композициями, содержащими 0,1 - 0,2% экстракта Ascophyllum nodosum (Ascophysious), богатого фуканами со средней молекулярной массой 10 кДа, растворенного в 45% отфильтрованной морской воды и дополненными до 100% очищенной водой (дост.кол.): аутофагия и секреция антимикробного пептида β-дефензина-2.
Часть А
Композицию Stimmuno_A (0,1% (масс./об.) экстракта Ascophyllum nodosum (Ascophysious), богатого фуканами со средней молекулярной массой 10 кДа, растворенного в 45% отфильтрованной морской воды и дополненного до 100% очищенной водой (дост.кол.), приводили в контакт с клетками иммунной системы (человеческими макрофагами) на 1 час; композицию удаляли, после чего измеряли индукцию аутофагии сразу или через 24 часа. Аутофагия - это катаболический процесс, который позволяет поддерживать клеточный гомеостаз. Он активируется в случае клеточного стресса для переваривания патогенных элементов. Параллельно надосадочную жидкость извлекали для анализа антимикробного пептида β-дефензина-2, который выделяют макрофаги для уничтожения микроорганизмов.
Полученные результаты представлены на диаграмме 6, которая показывает измерение аутофагии на макрофагах с помощью цитометрии (тест с монодансилкадаверином, MDC). Во время своего образования аутофагосома, которая состоит из секвестрационной камеры с двойной мембраной, образованной из фагосомы, включает в свою мембрану цитоплазматические компоненты, из которых MDC является флуоресцентным. После инкубации с образцами надосадочную жидкость отбирали для последующего анализа пептида β-дефензина-2, и клетки инкубировали с раствором MDC при 0,05 мМ (исходный раствор для приготовления в ДМСО при 50 мМ) в буфере ФБР в течение 30 минут при 37°С. После инкубации датчик удаляли и клетки промывали ФБР. Микропланшет затем считывали цитофлуориметром Safire-TECAN на длинах волн MDC (λ возбуждения = 380 нм, λ испускания = 525 нм).
Сплошные серые столбцы слева количественно определяют немедленный эффект, измеренный после 1 часа инкубации, а заштрихованные столбцы справа количественно определяют замедленный эффект после 1 + 24 часа инкубации. Образец 1 соответствует отрицательному контролю, образец 2 (в середине диаграммы) соответствует тесту, проведенному на композиции Stimmuno_A, а образец 3 - тесту, проведенному на положительном контроле. Положительным контролем, используемым здесь для индукции аутофагии, является бактериальный агент ЛПС из Escherichia coli в концентрации 0,5 мкг/мл.
Шкала ординат соответствует измеренным значениям коэффициента модуляции по отношению к отрицательному контролю.
Три звездочки «***» на диаграмме 6, которые указаны на столбцах. соответствующих образцам 2 и 3, указывают статистическую значимость р<0,001 (вероятность того, что различие является случайным) по сравнению с отрицательным контролем (ANOVA, тест Даннета, программное обеспечение GraphPad Prism 6).
Вывод: после инкубации (1 час) с композицией Stimmuno_A, аутофагия в макрофагах значительно возрастает как сразу после удаления композиции, так и через 24 часа. Композиция Stimmuno_A позволяет стимулировать аутофагию, катаболический процесс, который позволяет поддерживать клеточный гомеостаз путем переваривания клеток, как подготовку к агрессии со стороны патогенных элементов.
Часть В
Сравнительные испытания проводили между:
- композицией согласно изобретению, композицией Stimmuno_B (0,2% (масс./об.)) экстракта Ascophyllum nodosum (Ascophysious), богатого фуканами со средней молекулярной массой 10 кДа, растворенного в 45% отфильтрованной морской воды и дополненного до 100% очищенной водой (дост.кол.));
- композицией AN: включающей только 0,2% (масс./об.) экстракта Ascophyllum nodosum (Ascophysious), растворенного в буфере ФБР (физиологический раствор с фосфатным буфером, обычно используемый в культуре клеток); и
- композицией EDM, включающей отфильтрованную морскую воду, содержащую 15 г/л в NaCl.
Результаты показаны на диаграмме 7, где собраны измерения секреции антимикробного пептида β-дефензина-2 макрофагами (метод ИФА); шкала на оси ординат соответствует измеренным значениям коэффициента модуляции секреции по отношению только к буферу ФБР: образец 1 соответствует только ФБР, образец 2 (в середине диаграммы) соответствует тесту, проведенному на композиции Stimmuno_B, образец 3 соответствует тесту, проведенному на композиции AN, а образец 4 соответствует тесту, проведенному на композиции EDM.
После инкубации (1 час) с композицией Stimmuno_B секреция макрофагами антимикробного пептида β-дефензина-2 увеличивалась через 24 часа. С другой стороны, композиция AN, а также композиция EDM не оказывали какого-либо влияния на секрецию антимикробного пептида β-дефензина-2. Композиция Stimmuno_B позволяет стимулировать секрецию антимикробного пептида β-дефензина-2, как средство защиты против агрессии со стороны патогенных элементов.
Вывод: следовательно, существует синергия действия между компонентами отфильтрованной морской воды и сульфатированными полисахаридами.
• Оценка активности на разных моделях с разными стрессовыми агентами: маркер врожденного иммунитета
Композицию Stimmuno_C по изобретению также тестировали на разных клеточных моделях с различными стрессовыми агентами в соответствии с одним и тем же протоколом: продукт приводили в контакт с клетками в течение короткого периода времени (1 час), затем композиции удаляли и клетки подвергали стрессу добавлением патогенного токсического агента. Таким образом, во время стресса клетки больше не контактировали с композицией, однако воспалительная реакция значительно ингибировалась: это означает, что клетки метаболизируют и запоминают сигналы, запускаемые композицией Stimmuno_C, чтобы таким образом иметь возможность контролировать воспалительный ответ.
Композиция Stimmuno_C:
- Раствор 253 кг, приготовленный из 116,4 кг отфильтрованной морской воды, 269,5 г экстракта Ascophyllum nodosum, богатого фуканом (Ascophyscient), 136 г очищенной воды.
- Характеристики полученного раствора:
pH: 7,2
Осмоляльность: 471 мОсмоль/кг
Хлорид, выраженный в NaCl: 14,6 г/л
Общие сахара: 0,395 г/л (или общее количество сахаров, измеренное по методу Dubois et al. (1956)).
Иммунные клетки (макрофаги) инкубировали в течение 1 часа, с одной стороны, с композицией Stimmuno_C, а с другой стороны, с культуральной средой (MC 0% = отрицательный контроль), затем растворы удаляли и клетки инкубировали с ЛПС Escherichia coli для индукции бактериального воспалительного стресса.
С помощью теста ИФА в надосадочной жидкости клеток анализировали два цитокина: провоспалительный цитокин ИЛ-1β (черные столбцы на диаграмме 8) и противовоспалительный цитокин ИЛ-10 (белые столбцы на диаграмме 8).
Результаты показаны на диаграмме 8, где собраны анализы цитокинов после 1 часа инкубации, а затем через 24 часа в ЛПС Escherichia coli на макрофагах. Шкала на оси ординат соответствует факторам усиления секреции. Черная пунктирная линия представляет базовый уровень секреции без ЛПС, который равен 1.
Когда клетки инкубировали с культуральной средой - отрицательным контролем (слева на диаграмме), ЛПС стимулировал секрецию ИЛ-1β в 2,7 раза, а секрецию ИЛ-10 в 4,2 раза по отношению к базовому уровню секреции без ЛПС. Таким образом, клетки реагируют на ЛПС, секретируя сигнал атаки (ИЛ-1β) и защитный сигнал (ИЛ-10). Когда клетки инкубировали с композицией Stimmuno_C (справа на диаграмме 8), ЛПС стимулировал секрецию ИЛ-1β в 1,3 раза, а секрецию IL-10 в 5,8 раза. Следовательно, композиция Stimmuno_C уменьшает сигнал атаки, в то же время стимулируя защитный сигнал, индуцированный ЛПС.
Вывод:
Воспалительная реакция значительно ингибировалась: это означает, что клетки метаболизируют и запоминают (эффект памяти) сигналы, запускаемые композицией Stimmuno_C, чтобы таким образом иметь возможность контролировать воспалительный ответ. Эти экспериментальные результаты демонстрируют стимуляцию врожденного иммунитета (эффект памяти) композицией согласно изобретению.
• Оценка активности на эпителиальных клетках легких человека, инфицированных вирусом.
Эпителиальные клетки легких брали у человека и инкубировали в присутствии композиции Stimmuno_A. Показано, что композиция по изобретению резко снижала экспрессию генов, участвующих в воспалительном ответе, а также секрецию провоспалительных цитокинов, индуцируемых PolyIC (полиинозиновой-полицитидиловой кислотой), агентом вирусного стресса.
Эпителиальные клетки бронхов, взятые у человека, инкубировали в течение 1 часа с 0,9% NaCl (используется здесь в качестве отрицательного контроля) или композицией Stimmuno_A, затем растворы удаляли и клетки инкубировали с PolyIC для индукции вирусного воспалительного стресса.
Экспрессию гена провоспалительного цитокина CCL20 анализировали с помощью RTqPCR (количественной ПЦР в режиме реального времени). Экспрессия CCL20 повышена у пациентов с хроническим риносинуситом.
Результаты показаны на диаграмме 9, которая количественно определяет экспрессию гена белка CCL20 эпителиальными клетками бронхов. Шкала на оси ординат показывает значения, измеренные для относительной экспрессии (2 дельта Ct x 1000).
PolyIC стимулировал сверхэкспрессию гена CCL20 (оранжевый столбец), но когда клетки инкубировали с композицией Stimmuno_A, PolyIC значительно меньше стимулировал секрецию этого гена (снижение в 25 раз). Следовательно, композиция Stimmuno_A уменьшает сигнал атаки, индуцированный PolyIC.
Вывод:
Результаты показывают, что на клетках легочного эпителия, взятых у человека, композиция Stimmuno_A резко снижает экспрессию генов, участвующих в воспалительном ответе, а также секрецию провоспалительных цитокинов, индуцируемых PolyIC, агентом вирусного стресса.
В качестве общего вывода, композиция по изобретению подготавливает клетки организма к защите в случае бактериальной или вирусной атаки. Композиция блокирует и контролирует воспалительный ответ, который могут индуцировать различные вредные факторы внешней среды. Эта защита применяется к различным точкам проникновения в организм: к слизистой оболочке носа, слизистой оболочки полости рта, горла, глаз, к коже, к слизистой оболочке влагалища и т.д.
II. Тесты на безвредность по отношению к клеткам организма
Хорошая переносимость композиции, содержащей 0,1% экстракта Ascophyllum nodosum (Ascophysious), богатого фуканами со средней молекулярной массой 10 кДа, растворенного в 45% отфильтрованной морской воды (композиция Stimmuno_A), для назального эпителия была подтверждена исследованием морфологии ресничных клеток эпителия носа. Вибрирующие реснички этих клеток позволяют удалить слизь. Поддержание морфологии ресничек имеет важное значение для нормальной работы эпителия носа.
Протокол: человеческие клетки эпителия носа инкубировали либо с изотоническим хлоридом натрия в концентрации 0,9%, либо с композицией в течение 1 часа. Цитоскелет клеток окрашивали флуоресцентным маркером (зеленый), а ядра - другим флуоресцентным маркером (синий).
На Фигуре 1 видно, что реснички были гораздо более заметными и длинными, когда реснитчатые эпителиальные клетки инкубировали с композицией согласно изобретению (показано на фото справа), по сравнению с изотоническим раствором хлорида натрия (показан на фото слева).
Таким образом, можно сделать вывод, что композиция, содержащая экстракт Ascophyllum nodosum и 45% отфильтрованной морской воды, прекрасно переносится носовым эпителием человека.
1. Применение водной композиции, которая включает:
- от 20 до 60% по массе от общей массы композиции фильтрованной морской воды,
- от 0,01 до 0,5 масс./об. % по отношению к общему объему композиции фукана из Ascophyllum nodosum, имеющего молекулярную массу от 2 до 21 кДа,
для стимулирования врожденного иммунитета у субъекта с целью предотвращения по меньшей мере одного из заболеваний, спровоцированных инвазией по меньшей мере одного патогенного агента, по меньшей мере через одну из различных точек проникновения в организм, выбранных из кожи, глаз и слизистой оболочки.
2. Применение по п. 1, в котором водная композиция включает от 40 до 50 % по массе отфильтрованной морской воды по отношению к общей массе композиции.
3. Применение по любому из пп. 1, 2, в котором водная композиция дополнительно включает по меньшей мере одну воду, выбранную из очищенной воды, дистиллированной воды и деминерализованной воды, в количестве до 100 %.
4. Применение по любому из пп. 1-3, в котором водная композиция включает от 0,09 до 0,25 масс./об. % по отношению к общему объему композиции фукана из Ascophyllum nodosum.
5. Применение по любому из пп. 1-4, в котором водная композиция включает:
| Cl, г/л | 5-15 |
| Na, г/л | 2,5-7 |
| Mg, г/л | 0,45-0,70 |
| Ca, г/л | 0,10-0,30 |
| K, г/л | 0,10-0,30 |
6. Применение по любому из пп. 1-5, в котором водная композиция включает:
| Cl, г/л | 7,9-10,1 |
| Na, г/л | 4,3-5,3 |
| Mg, г/л | 0,51-0,63 |
| Ca, г/л | 0,16-0,22 |
| K, г/л | 0,15-0,23 |
| Общие сахара, г/л | 0,25-0,55 |
7. Применение по любому из пп. 1-6, в котором рН водной композиции составляет от 6,5 до 8,5.
8. Применение по любому из пп. 1-7, в котором осмолярность при 25°С водной композиции составляет от 400 до 550 мОсмоль/кг.
9. Применение по любому из пп. 1-8, в котором указанная слизистая оболочка выбрана из слизистой оболочки носа, слизистой оболочки полости рта и слизистой оболочки влагалища.
10. Применение по любому из пп. 1-9 для профилактики воспалительных состояний слизистых оболочек.
