Набор высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зондов для детекции и дифференциации нетуберкулезных микобактерий

Изобретение относится к биотехнологии в области ветеринарной микробиологии, а именно к средствам молекулярной диагностики. Разработаны олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченные зонды для детекции и дифференциациимаркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий Mycobacteriumavium, Mycobacteriumaviumsubsp. paratuberculosis, Mycobacteriumkansasii, Mycobacteriumscrofulaceum, Mycobacteriumsmegmatis, Mycobacteriumfortuitum, Mycobacteriumintracellulare в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при одинаковом термическом профиле. Изобретение расширяет арсенал средств для диагностики микобактерий.

 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к детекции и дифференциации маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий Mycobacterium avium, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium intracellulare в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

В настоящее время в мире неуклонно растет количество заболеваний, которые связывают с потенциально патогенными микроорганизмами рода Mycobacterium, но отличающимися по своим характеристикам от микобактерий туберкулеза. Такие бактерии принято называть атипичными или нетуберкулезными микобактериями (НТМБ), а вызываемые ими заболевания микобактериозами. НТМБ представлены более чем 20 видами широко распространенных в окружающей среде кислотоустойчивых микроорганизмов, не входящих в состав M. tuberculosis complex [1,2].

Заболевания, вызванные НТМБ, имеют схожую с туберкулезом локализацию патологического процесса, а также клиническую, и, на определенных этапах патогенеза, морфологическую картины [3,4]. Микобактериозам подвержены и люди, и животные, последние играют основную роль в распространении их.

На данный момент о микобактериозе у животных можно говорить при получении неспецифических реакций на туберкулинизацию. Дальнейшая дифференциальная диагностика заключается в бактериологическом исследовании патологического материала, полученного при контрольно-диагностическом убое, для установления наличия или отсутствия микобактерий туберкулезного комплекса. Как правило, результат этих исследований отрицательный. Однако, наличие и вид возбудителя НТМБ, вызвавшего проявление неспецифических реакций, остаются невыясненными.

Существуют методы бактериологического исследования для дифференциации нетуберкулезных микобактерий. Все они занимают длительное время проведения и не всегда дают точные результаты.

Наибольшую точность в определении вида возбудителя и его количества в исследуемом образце дает исследование методом полимеразной цепной реакции. К сожалению, на сегодняшний день не существует определенного набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для выявления и дифференциации нетуберкулезных микобактерий методом ПЦР в реальном времени.

Изобретение касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных зондов для индикации нетуберкулезных микобактерий

1. Mycobacterium kansasii:

f-5`-TCGCGTCGGTGGAGGCAG-3`;

r-5`-CGCACAGGGCCGCTGATTT-3`;

зонд 5`-CGTAGACCCGTCCGCCGTTGAGG-3`;

2. Mycobacterium scrofulaceum:

f-5`-GCTTTTGCGGTGTGGGATGG-3`;

r-5`-GCTACCCGTCGTCGCCTTGA-3`;

зонд 5`-TCACCCCACCAACTAGCTGATAGGCCG-3`;

3. Mycobacterium smegmatis:

f-5`-TCGGGCGCACAACGTTCC-3`;

r-5`-GCAGGGTCGCGGTGCGT-3`;

зонд 5`-CGACGCCCTGCTCGACGAGTGG-3`;

4. Mycobacterium fortuitum:

f-5`-GACCAGGACCAGGAAGATGAGGC-3`;

r-5`-TGGCCTGGCTGGTGACCCT-3`;

зонд 5`-GTCAGGGACTCGACGCCGTGAGA-3`;

5. Mycobacterium paratuberculosis:

f-5`-TTACGGAGGTGGTTGTGGCACA-3`;

r-5`-AATCAACTCCAGCAGCGCGG-3`;

зонд 5`-CGCAGCGATTGCTCTCGCAGC-3`;

6. Mycobacterium avium:

f-5`-CCCATCCCACACCGCAAAAG-3`;

r-5`-AGCAATCTGCCCTGCACTTCG-3`;

зонд 5`-ACATGCGTCTTGAGGTCCTATCCGGTATTAGA-3`;

7. Mycobacterium intracellulare:

f-5`-GCCCATCCCACACCGCAA-3`;

r-5`-GGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTA-3`;

зонд 5`-TCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAGGTCCTAT-3`.

В качестве источника флуоресценции на 5' конце зондов применяют краситель ROX, а для тушения флуоресценции на 3' конце - BHQ-2. Флуоресценцию у всех зондов измеряют по каналу ROX.

При тестировании пробы на наличие маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий учитывают:

- пересечение, кривой флуоресценции, пороговой линии с праймерами на геном НТМБ свидетельствует о наличии в образце маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий (один или несколько из перечисленных выше видов);

- отсутствие пересечения, кривой флуоресценции, пороговой линии для всех систем праймеров свидетельствует об отсутствии маркерных участков ДНК НТМБ в исследуемом материале.

Изобретение может быть использовано в лабораторной диагностике для индикации маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий в пробах патологического материала.

Технический результат от предлагаемого изобретения заключается в разработке современной, высокоспецифичной тест-системы, предназначенной для индикации маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Сущность изобретения заключается в высокоспецифичной идентификации и дифференциации маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий от микобактерий, входящих в группу MTB complex в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при одном термическом профиле в индивидуальных пробирках, что исключает возможную конкуренцию между праймерами во время амплификации.

Для разработки праймеров из базы данных GenBank были получены полногеномные последовательности M. avium, M. paratuberculosis, M. kansasii, M. fortuitum, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. smegmatis. Последовательности выравнивали с помощью программы VectorNTI91, затем визуально оценивали консервативные участки и проверяли их на специфичность с помощью BLAST-анализа. Специфичность каждого участка составляет более 99%. Далее в программе VectorNTI91, в соответствии с единым термическим профилем, был получен ряд праймеров. В результате проведения контрольного BLAST-анализа была получена оптимальная комбинация праймеров и зондов, которые показывают высокую специфичность и возможность амплификации при одном термическом профиле.

ПЦР-РВ проводится в одну стадию с использованием ПЦР смесей, включающих на одну реакцию: фермент Taq-ДНК-полимеразу (0,25-0,5 мкл); буфер, содержащий хлорид магния, 10х для ПЦР-РВ (1,5 мкл); дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, 50х (0,3 мкл); олигонуклеотидные праймеры (0,5 мкл каждого праймера, в концентрации 10 пмоль); зонд (0,5 мкл, в концентрации 10 пмоль); выделенную ДНК (10 мкл); ТЕ-буфер или деионизированную воду, до получения объема одной пробы, равного 15 мкл, в программируемом амплификаторе. Перед началом постановки реакции необходимо разморозить все необходимые компоненты реакции и встряхнуть на шейкере.

Устанавливают пробирки в амплификатор для постановки ПЦР-РВ, отмечают в программе расположение и характеристику проб, выбирают рабочий краситель (ROX), устанавливают в программе температурно-временной профиль реакции.

После первоначальной денатурации при 95°С в течение 3 мин, проводят ПЦР в режиме реального времени в следующих условиях: 95°С - 15 с, 60°С - 30 с - 5 повторов; 95° -15 с, 60° - 30 с - детекция - 40 повторов.

Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов реакции, выведенной в результате машинного анализа.

Образец считается положительным, если значение Ct не более 35. Однако в случае, если значение Ct для проб находится в пределах от 30 до 37, необходимо повторить реакцию с этапа выделения ДНК, с целью подтвердить или опровергнуть наличие ДНК искомой бактерии в исследуемой пробе.

Образец считается отрицательным на наличие маркерной ДНК, если для него значение Ct отсутствует или более 37.

Таким образом, изобретение может быть использовано в ветеринарной практике для индикации генетического материала нетуберкулезных микобактерий в патологических образцах, для постановки и уточнения диагноза, для решения научно-исследовательских задач по мониторингу распространения нетуберкулезных микобактерий среди восприимчивых животных. Использование специфических праймеров и зондов позволяет выявить и дифференцировать от патогенных микобактерий генетический материал НТМБ в исследуемых образцах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (РВ).

Для оценки специфичности набора использовались следующие образцы штаммов нетуберкулезных микобактерий: ДНК Mycobacterium smegmatis (шт. 9-77), Mycobacterium scrofulaceum (шт.526), Mycobacterium kansasii (шт. ВИЭВ), Mycobacterium paratuberculosis (шт. Центрально-Любинский), Mycobacterium avium (шт. Vet. 1387), Mycobacterium intracellulare (шт. TMC 1473), Mycobacterium fortuitum (шт.409).

Процедуру выделения ДНК из исследуемого материала проводили с использованием промышленного набора реагентов.

ПЦР в режиме реального времени проводили в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):

- фермент Taq-ДНК-полимераза (0,5 мкл), буфер, содержащий хлорид магния, (1,5 мкл), дезоксинуклеотидтрифосфаты (0,3 мкл), олигонуклеотидные праймеры (0,5 мкл каждого праймера 10 пмоль), зонд (0,5 мкл 10 пмоль), выделенную (ДНК 10 мкл) и ТЕ-буфер или деионизированную воду до получения объема одной пробы, равного 15 мкл в программируемом амплификаторе.

ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в ПЦР-РВ приборе по программе, описанной выше.

Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линии, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Набор высокоспецифичных олигонкулеотидных праймеров и зондов для детекции и дифференциации нетуберкулезных микобактерий»:

1. Макарова МВ, Гунтупова ЛД. Нетуберкулезные микобактерии. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020;20(2):97-102. doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-2-97-102

2. Marras TK, Mendelson D, Marchand-Austin A, May K, Jamieson FB. Pulmonary nontuberculous mycobacte-rial disease, Ontario, Canada, 1998-2010. Emerg Infect Dis. 2013;19(11):1889-91. doi.org/10.3201/eid1911.130737

3. Griffith D.E., Aksamit T., Brown-Elliott B.A., et al. An official ATS/ IDSA statement: Diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am J Respir Crit Care Med. 2007;175(4):367-416.

4. Найманов А. Х. Проблема неспецифических реакций на туберкулин и совершенствование симультанной пробы для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота / А. Х. Найманов, Г. И. Устинова, Н. Г. Толстен-ко, Е. П. Вангели, О. Д. Кучерук // Ветеринария. № 6. М., 2015. С. 20-25.

Набор, включающий олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченные зонды для амплификации и детекции маркерных участков ДНК нетуберкулезных микобактерий:

1. Mycobacterium kansasii:

f-5`-TCGCGTCGGTGGAGGCAG-3`;

r-5`-CGCACAGGGCCGCTGATTT-3`;

зонд 5`-CGTAGACCCGTCCGCCGTTGAGG-3`;

2. Mycobacterium scrofulaceum:

f-5`-GCTTTTGCGGTGTGGGATGG-3`;

r-5`-GCTACCCGTCGTCGCCTTGA-3`;

зонд 5`-TCACCCCACCAACTAGCTGATAGGCCG-3`;

3. Mycobacterium smegmatis:

f-5`-TCGGGCGCACAACGTTCC-3`;

r-5`-GCAGGGTCGCGGTGCGT-3`;

зонд 5`-CGACGCCCTGCTCGACGAGTGG-3`;

4. Mycobacterium fortuitum:

f-5`-GACCAGGACCAGGAAGATGAGGC-3`;

r-5`-TGGCCTGGCTGGTGACCCT-3`;

зонд 5`-GTCAGGGACTCGACGCCGTGAGA-3`;

5. Mycobacterium paratuberculosis:

f-5`-TTACGGAGGTGGTTGTGGCACA-3`;

r-5`-AATCAACTCCAGCAGCGCGG-3`;

зонд 5`-CGCAGCGATTGCTCTCGCAGC-3`;

6. Mycobacterium avium:

f-5`-CCCATCCCACACCGCAAAAG-3`;

r-5`-AGCAATCTGCCCTGCACTTCG-3`;

зонд 5`-ACATGCGTCTTGAGGTCCTATCCGGTATTAGA-3`;

7. Mycobacterium intracellulare:

f-5`-GCCCATCCCACACCGCAA-3`;

r-5`-GGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTA-3`;

зонд 5`-TCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAGGTCCTAT-3`