Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены гетеродимерные антитела, направленные против PD-1 и CTLA-4. Также предложены нуклеиновые кислоты и векторы, кодирующие указанные антитела, включающая их клетка-хозяин и способ получения гетеродимерного антитела по изобретению, включающий культивирование указанной клетки-хозяина. Изобретение обеспечивает эффективное специфичное связывание с двумя антигенами, приводящее к блокировке иммунных контрольных точек, активации Т-клеток и противоопухолевой активности. 6 н. и 1 з.п. ф-лы, 264 ил., 1 табл., 7 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Эта заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/350145, поданной 14 июня 2016 года, предварительной заявке на патент США № 62/353511, поданной 22 июня 2016 года, и предварительной заявке на патент США № 62/420500, поданной 10 ноября 2016 года, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

Перечень последовательностей

Данная заявка содержит Перечень последовательностей, представленный в электронном виде в формате ASCII и включенный в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 9 июня 2017 года, имеет название 067461_5191WO_SL.txt и размер, составляющий 32 442,145 килобайт.

Уровень техники изобретения

Рецепторы контрольных точек, такие как CTLA-4, PD-1 (запрограммированной гибели клеток 1), TIM-3 (домен 3 Т-клеточного иммуноглобулина и муцина), LAG-3 (ген 3 активации лимфоцитов), TIGIT (Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM) и другие, ингибируют активацию, пролиферацию и/или эффекторную активность Т-клеток и других типов клеток. Руководствуясь гипотезой о том, что рецепторы контрольных точек подавляют эндогенный ответ Т-клеток на опухолевые клетки, доклинические и клинические исследования антител анти-CTLA4 и анти-PD1, включая ниволумаб, пембролизумаб, ипилимумаб и тремлимумаб, действительно продемонстрировали, что блокада контрольных точек приводит к впечатляющим противоопухолевым ответам, путем стимуляции воздействия эндогенных Т-клеток на опухолевые клетки, что приводит к долгосрочным ремиссиям раковых заболеваний у части пациентов с различными злокачественными новообразованиями. К сожалению, на эти методы лечения отвечает только определенная часть пациентов, причем частота ответа для каждого вида монотерапии, как правило, составляет от 10 до 30%, а иногда и выше, в зависимости от показаний и других факторов. Терапевтическая комбинация этих агентов, например, ипилимумаб плюс ниволумаб, приводит к еще большей частоте ответов, которая в некоторых случаях приближается к 60%. Доклинические исследования продемонстрировали дополнительную синергию между антителами анти-PD-1 и/или антителами анти-CTLA-4 с блокадой недавно идентифицированных рецепторов контрольных точек, включая LAG-3, TIM-3, BTLA и TIGIT. Несмотря на то, что потенциал множественной блокады контрольных точек очень перспективен, ожидается, что комбинированная терапия с применением таких агентов будет сопряжена с высокими финансовыми расходами. Более того, аутоиммунная токсичность комбинированных видов лечения, например ниволумаб плюс ипилимумаб, является значительно выше по сравнению с монотерапией, что приводит к тому, что многие пациенты прекращают терапию.

В ряде исследований (Ahmadzadeh et al., Blood 114: 1537 (2009), Matsuzaki et al., PNAS 107 (17): 7875-7880 (2010), Fourcade et al. Cancer Res. 72(4):887-896 (2012) и Gros et al, J. Clinical Invest. 124 (5): 2246 (2014)), в которых изучали инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL), продемонстрировано, что TIL обычно экспрессируют множество рецепторов контрольных точек. Более того, вполне вероятно, что TIL, которые экспрессируют множество рецепторов контрольных точек, на самом деле являются наиболее опухолереактивными. Напротив, нереактивные к опухоли Т-клетки на периферии с большей вероятностью экспрессируют одну контрольную точку. Блокада контрольных точек моноспецифическими полноразмерными антителами, вероятно, является недискриминационной в отношении дерепрессии опухолереактивных TIL, по сравнению с аутоантиген-реактивными, экспрессирующими одну молекулу контрольной точки, Т-клетками, которые, как предполагается, способствуют аутоиммунной токсичности.

Соответственно, данное изобретение относится к биспецифическим антителам, которые связываются с двумя различными белками ингибиторами контрольных точек.

Краткое описание сущности изобретения

В данном изобретении предлагаются биспецифические гетеродимерные антитела, которые связываются с двумя различными рецепторами контрольной точки поверхности клетки, такими как PD-1 человека, CTLA-4 человека, TIM-3 человека, LAG-3 человека и TIGIT человека. Таким образом, в некоторых аспектах подходящие биспецифические антитела связывают PD-1 и CTLA-4, PD-1 и TIM-3, PD-1 и LAG-3, PD-1 и TIGIT, PD-1 и BTLA, CTLA-4 и TIM-3, CTLA-4 и LAG-3, CTLA-4 и TIGIT, CTLA-4 и BTLA, TIM-3 и LAG-3, TIM-3 и TIGIT, TIM-3 и BTLA, LAG-3 и TIGIT, LAG-3 и BTLA, а также TIGIT и BTLA.

В одном аспекте данного изобретения предлагаются форматы открывалки бутылок, которые включают: а) первый мономер ("мономер scFv", иногда называемый "тяжелой цепью scFv"), который содержит scFv с вариабельным тяжелым и вариабельным легким доменом, связанным с помощью заряженного линкера scFv (с + H-последовательностью, как изображено на фиг. 7, что является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), Fc-домен, содержащий искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты и E233P/L234V/L235A/G236del/S267K и Fv, который связывается с рецептором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер" или "тяжелая цепь"), который содержит Fc-домен с искаженными вариантами L368D/K370S, pI вариантами N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционными вариантами E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K и вариабельный тяжелый домен, который, с вариабельным легким доменом, составляет Fv, который связывается со вторым рецептором контрольной точки, как описано в данном документе; и c) легкую цепь. В этом конкретном варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv мономеров включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv) PD-1 и CTLA-4, CTLA-4 и PD-1, PD-1 и TIM-3, TIM-3 и PD-1, PD-1 и LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 и TIGIT, TIGIT и PD-1, PD-1 и BTLA, BTLA и PD-I, CTLA-4 и TIM-3, TIM-3 и CTLA-4, CTLA-4 и LAG-3, LAG-3 и CTLA-4, CTLA-4 и TIGIT, TIGIT и CTLA-4, CTLA-4 и BTLA, BTLA и CTLA-4, TIM-3 и LAG- 3, LAG-3 и TIM-3, TIM-3 и TIGIT, TIGIT и TIM-3, TIM-3 и BTLA, BTLA и TIM-3, LAG-3 и TIGIT, TIGIT и LAG-3, LAG-3 и BTLA, BTLA и LAG-3, BTLA и TIGIT, а также TIGIT и BTLA.

Другие аспекты данного изобретения приведены в этом документе.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1А-I проиллюстрированы несколько форматов данного изобретения. Первый представляет собой формат открывалки бутылок, с первым и вторым анти-антигенсвязывающим доменом. Дополнительно проиллюстрированы форматы mAb-Fv, mAb-scFv, Central-scFv, Central-scFv, сentral-scFv с одним плечом, один scFv-mAb, scFv-mAb и формат с двойным scFv. Что касается всех проиллюстрированных scFv-доменов, они могут состоять от N-конца до C-конца либо из вариабельной тяжелой- (необязательный линкер)-вариабельной легкой цепи, либо наоборот. Кроме того, что касается scFv-mAb с одним плечом, scFv может быть присоединенным либо к N-концу мономера тяжелой цепи, либо к N-концу легкой цепи.

На фиг. 2 (фиг. 2А, 2В, 2С и 2D) приведены последовательности антигенов для ряда антигенов, применяемых в данном изобретении, включая антигены как человека, так и яванского макака во многих случаях, с целью содействия разработке антигенсвязывающих доменов, которые связываются с обоими антигенами для облегчения проведения клинических исследований.

На фиг. 3A-3F приведены пригодные пары наборов гетеродимеризационных вариантов (включая искаженные варианты и pI варианты). На фиг. 3Е приведены варианты, для которых не существует соответствующих вариантов "мономер 2"; это pI варианты, которые могут применяться отдельно на любом мономере или, например, могут быть включенными на Fab стороне открывалки бутылок, а подходящий заряженный линкер scFv может применяться на втором мономере, который использует scFv в качестве второго антигенсвязывающего домена. Пригодные заряженные линкеры приведены на фиг. 7.

На фиг. 4 приведен перечень константных областей изостерического варианта антитела и их соответствующие замены, pI (-) обозначает варианты c более низкой pI, в то время как pI _ (+) обозначает варианты с более высокой pI.

Эти области могут быть необязательно и независимо объединены с другими гетеродимеризационными вариантами по данному изобретению (а также с другими типами вариантов, как описано в данном документе).

На фиг. 5 приведены пригодные абляционные варианты, которые подвергают абляции связывание FcγR (иногда называемые "нокаутными" или "КО" вариантами). Как правило, абляционные варианты встречаются на обоих мономерах, хотя в некоторых случаях они могут находиться только на одном мономере.

На фиг. 6 приведены два особенно пригодных варианта осуществления данного изобретения, которые могут применяться как для формата, проиллюстрированного на фиг. 1А, так и на фиг. 1F. Что касается формата, проиллюстрированного на фиг. 1А, компоненты "не-Fv" этого варианта осуществления данного изобретения продемонстрированы на фиг. 37А, хотя могут применяться и другие форматы (а также формат, проиллюстрированный на фиг. 38).

На фиг. 7 приведено некоторое количество заряженных линкеров scFv, которые находят применение при повышении или понижении pI гетеродимерных антител, которые используют один или большее количество scFv в качестве компонента. (+H)-позитивный линкер находит в данном изобретении конкретное применение, в частности, с описанными в данном документе последовательностями анти-CD3 vl и vh. Один линкер scFv предшествующего уровня техники с одним зарядом упоминается как "Whitlow", из Whitlow et al, Protein Engineering 6 (8): 989-995 (1993). Следует отметить, что этот линкер применяли для снижения агрегации и повышения протеолитической стабильности в scFv.

На фиг. 8 приведен перечень сконструированных гетеродимер-искажающих Fc вариантов с получением гетеродимеров (определяемых методом ВЭЖХ-CIEX) и термической стабильностью (определяемой методом ДСК). Неопределенная термическая стабильность обозначается как "н.о."

На фиг. 9A-E приведено выбранное количество PD-1 ABD, причем дополнительные анти-PD-1 ABD перечислены в виде SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 1 1465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073-35394 и SEQ ID NO: 36127-36146. CDR подчеркнуты, линкер scFv дважды подчеркнут (в последовательностях, линкер scFv представляет собой положительно заряженный scFv (GKPGS)₄ линкер (SEQ ID NO: 37755), хотя, как будет понятно специалистам в данной области техники, этот линкер может быть заменен другими линкерами, включая незаряженные или отрицательно заряженные линкеры, некоторые из которых приведены на фиг. 7), а знаки косой черты указывают границу(ы) вариабельных доменов. Кроме того, соглашение о присвоении имён иллюстрирует ориентацию scFv от N- до С-конца. То есть, "FH.279_L1.194" означает, что ориентация представляет собой vh -линкер scFv - vl (от N- до C-конца, с необязательными доменными линкерами на одной или обеих сторонах, в зависимости от применяемого формата), хотя эти последовательности также могут применяться в противоположной ориентация (от N- до С-конца) vl -линкер - vh. Аналогичным образом, "LI.194 H 1.279" показывает, что ориентация представляет собой vl - линкер scFv - vh (от N- до C-конца, опять же с необязательными доменными линкерами), с противоположной ориентацией, также включенной в данное изобретение. Как отмечено в данном документе и применимо для каждой последовательности, содержащей CDR, точная идентификация местоположений CDR может несколько отличаться в зависимости от используемой нумерации, как показано в Таблице 1, и, таким образом, в данное изобретение включены не только CDR, которые подчеркнуты, но также CDR, входящие в домен vh и vl, с использованием других системы нумерации. Кроме того, как и для всех последовательностей на фигурах, эти последовательности vh и vl могут применяться либо в формате scFv, либо в формате Fab.

На фиг. 10А-PP приведено некоторое количество CTLA-4 ABD, при этом дополнительные анти-CTLA-4 ABD перечислены в виде SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416. CDR подчеркнуты, линкер scFv дважды подчеркнут (в последовательностях, линкер scFv представляет собой положительно заряженный scFv (GKPGS)4 линкер (SEQ ID NO: 37755), хотя, как будет понятно специалистам в данной области техники, этот линкер может быть заменен другими линкерами, включая незаряженные или отрицательно заряженные линкеры, некоторые из которых приведены на фиг. 7), а знаки косой черты указывают границу(ы) вариабельных доменов. Как указано выше, соглашение о присвоении имён иллюстрирует ориентацию scFv от N- до С-конца; в последовательностях, приведенных на этой фигуре, все они ориентированы как vh- линкер scFv - vl (от N- до C-конца), хотя эти последовательности могут также применяться в противоположной ориентации (от N- до C-конца) vl - линкер - vh; кроме того, некоторые из последовательностей в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416 находятся в противоположной ориентации. Как отмечено в данном документе и применимо для каждой последовательности, содержащей CDR, точная идентификация местоположений CDR может несколько отличаться в зависимости от используемой нумерации, как показано в таблице 1, и, таким образом, в данное изобретение включены не только CDR, которые подчеркнуты, но также CDR, входящие в домен vh и vl, с использованием других системы нумерации. Кроме того, как и для всех последовательностей на фигурах, эти последовательности vh и vl могут применяться либо в формате scFv, либо в формате Fab. В частности, многие из этих фигур включают идентификатор XENP как для формата scFv, так и для формата Fab; см., например, фиг. 10A, которая демонстрирует, что XENP19235 является молекулой, использующей формат Fab, а XENP 19769 является молекулой scFv.

На фиг. 11A-N приведено некоторое количество LAG-3 ABD, при этом дополнительные анти-LAG-3 ABD перечислены в виде SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417- 35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002. CDR подчеркнуты, линкер scFv дважды подчеркнут (в последовательностях, линкер scFv представляет собой положительно заряженный scFv (GKPGS)4 линкер, хотя, как будет понятно специалистам в данной области техники, этот линкер может быть заменен другими линкерами, включая незаряженные или отрицательно заряженные линкеры, некоторые из которых приведены на фиг. 7), а знаки косой черты указывают границу(ы) вариабельных доменов. Как указано выше, соглашение о присвоении имён иллюстрирует ориентацию scFv от N- до С-конца; в последовательностях, приведенных на этой фигуре, все они ориентированы как vh - линкер scFv - vl (от N- до C-конца), хотя эти последовательности могут также применяться в противоположной ориентации (от N- до C-конца) vl - линкер - vh; кроме того, некоторые из последовательностей в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002 находятся в противоположной ориентации. Как отмечено в данном документе и применимо для каждой последовательности, содержащей CDR, точная идентификация местоположений CDR может несколько отличаться в зависимости от используемой нумерации, как показано в Таблице 1, и, таким образом, в данное изобретение включены не только CDR, которые подчеркнуты, но также CDR, входящие в домен vh и vl, с использованием других системы нумерации. Кроме того, как и для всех последовательностей на фигурах, эти последовательности vh и vl могут применяться либо в формате scFv, либо в формате Fab.

На фиг. 12А-С приведено некоторое количество BTLA ABD, при этом дополнительные анти-BTLA ABD перечислены как SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738. CDR подчеркнуты, линкер scFv дважды подчеркнут (в последовательностях, линкер scFv представляет собой положительно заряженный scFv (GKPGS)4 линкер, хотя, как будет понятно специалистам в данной области техники, этот линкер может быть заменен другими линкерами, включая незаряженные или отрицательно заряженные линкеры, некоторые из которых приведены на фиг. 7), а знаки косой черты указывают границу(ы) вариабельных доменов. Как указано выше, соглашение о присвоении имён иллюстрирует ориентацию scFv от N- до С-конца; в последовательностях, приведенных на этой фигуре, все они ориентированы как vh- линкер scFv - vl (от N- до C-конца), хотя эти последовательности могут также применяться в противоположной ориентации (от N- до C-конца) vl - линкер - vh; кроме того, некоторые из последовательностей в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NOs: 36707-36738 находятся в противоположной ориентации. Как отмечено в данном документе и применимо для каждой последовательности, содержащей CDR, точная идентификация местоположений CDR может несколько отличаться в зависимости от используемой нумерации, как показано в таблице 1, и, таким образом, в данное изобретение включены не только CDR, которые подчеркнуты, но также CDR, входящие в домен vh и vl, с использованием других системы нумерации. Кроме того, что касается всех последовательностей на фигурах, эти последовательности vh и vl могут применяться либо в формате scFv, либо в формате Fab.

На фиг. 13А-I приведено некоторое количество TIM-3 ABD, при этом дополнительные анти-TIM-3 ABD перечислены как SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706. CDR подчеркнуты, линкер scFv дважды подчеркнут (в последовательностях, линкер scFv представляет собой положительно заряженный scFv (GKPGS)4 линкер, хотя, как будет понятно специалистам в данной области техники, этот линкер может быть заменен другими линкерами, включая незаряженные или отрицательно заряженные линкеры, некоторые из которых приведены на фиг. 7), а знаки косой черты указывают границу(ы) вариабельных доменов. Как указано выше, соглашение о присвоении имён иллюстрирует ориентацию scFv от N- до С-конца; в последовательностях, приведенных на этой фигуре, все они ориентированы как vh - линкер scFv - vl (от N- до C-конца), хотя эти последовательности могут также применяться в противоположной ориентации (от N- до C-конца) vl - линкер - vh; кроме того, некоторые из последовательностей в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706 находятся в противоположной ориентации. Как отмечено в данном документе и применимо для каждой последовательности, содержащей CDR, точная идентификация местоположений CDR может несколько отличаться в зависимости от используемой нумерации, как показано в таблице 1, и, таким образом, в данное изобретение включены не только CDR, которые подчеркнуты, но также CDR, входящие в домен vh и vl, с использованием других системы нумерации. Кроме того, как и для всех последовательностей на фигурах, эти последовательности vh и vl могут применяться либо в формате scFv, либо в формате Fab.

На фиг. 14А-I приведены аминокислотные последовательности специфических антител анти-CTLA-4 X анти-PD-1 в формате открывалки бутылок (Fab-scFv-Fc). Антитела называют с использованием сначала вариабельной Fab-области, а затем – scFv-области, разделенных дефисом, с последующим обозначением цепи (Fab-Fc тяжелая цепь, scFv-Fc тяжелая цепь или легкая цепь). CDR подчеркнуты, а знаки косой черты указывают границу(ы) вариабельных областей. ScFv-домены имеют разные ориентации (от N- до С-конца) либо vh - линкер - vl, либо vl - линкер - vh, как указано, хотя этот порядок может изменяться в обратную сторону. Кроме того, каждая последовательность, описанная в данном документе, может включать или исключать варианты M428L/N434S в одном или, предпочтительно, обоих Fc-доменах, что приводит к увеличению периода полувыведения в сыворотке.

На фиг. 15А-I приведены аминокислотные последовательности специфических биспецифических антител анти-LAG-3 X анти-PD-1 Fab-scFv-Fc. Антитела называют с использованием сначала вариабельной Fab-области, а затем – scFv-области, разделенных дефисом, с последующим обозначением цепи (Fab-Fc тяжелая цепь, scFv-Fc тяжелая цепь или легкая цепь). CDR подчеркнуты, а знаки косой черты указывают границу(ы) вариабельных областей. ScFv-домены имеют ориентацию (от N- до С-конца) vl -линкер - vh, хотя этот порядок может изменяться в обратную сторону. Кроме того, каждая последовательность, описанная в данном документе, может включать или исключать варианты M428L/N434S в одном или, предпочтительно, обоих Fc-доменах, что приводит к увеличению периода полувыведения в сыворотке.

На фиг. 16 приведены аминокислотные последовательности специфических биспецифических антител анти-BTLA X анти-PD-1 Fab-scFv-Fc. Антитела называют с использованием сначала вариабельной Fab-области, а затем – scFv-области, разделенных дефисом, с последующим обозначением цепи (Fab-Fc тяжелая цепь, scFv-Fc тяжелая цепь или легкая цепь). CDR подчеркнуты, а знаки косой черты указывают границу(ы) вариабельных областей. ScFv-домены имеют ориентацию (от N- до С-конца) vl -линкер - vh, хотя этот порядок может изменяться в обратную сторону. Кроме того, каждая последовательность, описанная в данном документе, может включать или исключать варианты M428L/N434S в одном или, предпочтительно, обоих Fc-доменах, что приводит к увеличению периода полувыведения в сыворотке.

На фиг. 17 приведены аминокислотные последовательности специфических биспецифических антител анти-LAG-3 X анти-CTLA-4 Fab-scFv-Fc. Антитела называют с использованием сначала вариабельной Fab-области, а затем – scFv-области, разделенных дефисом, с последующим обозначением цепи (Fab-Fc тяжелая цепь, scFv-Fc тяжелая цепь или легкая цепь). CDR подчеркнуты, а знаки косой черты указывают границу(ы) вариабельных областей. ScFv-домены имеют ориентацию (от N- до С-конца) vh - линкер - vl, хотя этот порядок может изменяться в обратную сторону. Кроме того, каждая последовательность, описанная в данном документе, может включать или исключать варианты M428L/N434S в одном или, предпочтительно, обоих Fc-доменах, что приводит к увеличению периода полувыведения в сыворотке.

На фиг. 18 продемонстрированы результаты одного скрининга гибридомы анти-LAG-3. 1 мкг LAG-3-hIg человека в 10 смешивали с 50 супернатантом гибридомы (разбавленным в 2 раза, 8 раз в среде RPMI с 10% FBS) в течение 20 минут при комнатной температуре. 40 клеток Дауди или Рамоса (которые эндогенно экспрессируют MHC-II) добавляли и инкубировали при 4°С в течение 30 минут. Затем клетки промывали и инкубировали с вторичным антителом против Fc-Alexa647 человека в течение 30 минут. Затем клетки промывали и анализировали на наличие Alexa647 методом проточной цитометрии (FACS).

На фиг. 19А и В проиллюстрированы результаты количественного определения высвобождения цитокинов (A: IL-2, B: IFNγ) после SEB-стимуляции МКПК человека и воздействия биспецифическим антителом анти-CTLA-4 X анти-PD-1.

На фиг. 20 A-C проиллюстрированы результаты получения явлений CD45+ и явлений CD8 + на День 14 после того, как МКПК человека были введены в организм мышей NSG в День 0 с последующим введением доз указанных исследуемых препаратов в День 1.

На фиг. 21А и В проиллюстрировано связывание Т-клеток химерными антителами, полученными из гибридом анти-TIM-3, в анализе SEB-стимулированных МКПК человека.

На фиг. 22 приведены некоторые данные относительно сконструированного антиген-связывающего домена анти-TIM-3 из трех экспериментов. Приведен код XENP для двухвалентных вариантов осуществления, производный клон, обозначения сконструированных доменов vh и vl, константа связывания KD, константа ассоциации и константа диссоциации относительно TIM-3 человека, измеренная с помощью анализа Octet.

На фиг. 23А-N приведены некоторые данные относительно сконструированного антиген-связывающего домена анти-PD-1. На фигуре приведен код XENP для двухвалентных и scFv вариантов осуществления, обозначения сконструированных доменов vh и vl, ориентация scFv (от N- до C-конца), константа связывания KD относительно PD-1 человека, измеренная с помощью анализа Octet, и Tm scFv.

На фиг. 24А-G продемонстрированы результаты скрининга некоторых анти-CTLA-4 Fab. Представлены: код XENP для Fab и scFv вариантов осуществления, обозначения сконструированных доменов vh и vl, константа связывания KD относительно CTLA-4 человека и яванского макака, измеренная с помощью Octet, а также Tm scFv и Fab. Кроме того, количество последовательностей 9-меров, которые точно соответствовали по меньшей мере одной зародышевой линии человека VH или VL, изображено в качестве показателя гуманизации для вариабельных областей как Fab, так и scFv.

На фиг. 25А и В проиллюстрирована реакция смешанных лимфоцитов, демонстрирующая повышение высвобождения IL-2 при воздействии только ниволумабом (моноклональное антитело анти-PD-1, доступное на рынке как Опдиво®), только ипилимумабом (моноклональное антитело анти-CTLA-4, доступное на рынке как Ервой®), прототипом биспецифического антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1 на основе плечей ниволумаба и ипилимумаба, а также "одноплечевым" комбинированным контрольным антителом.

На фиг. 26 проиллюстрирована реакция смешанных лимфоцитов, демонстрирующая повышение высвобождения IL-2 при воздействии биспецифическими антителами анти-CTLA-4 x анти-PD-1 с вариантами антитела с плечами анти-CTLA-4 Fab и вариантами антитела с плечами анти-PD-1 scFv, а также только ниволумабом, только ипилимумабом, и прототипом биспецифического антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1 на основе плечей ниволумаба и ипилимумаба в качестве контроля.

На фиг. 27 проиллюстрировано, что биспецифические антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1 усиливают приживление (измеренное с помощью подсчета количества CD45 человека) у мышей NSG с привитыми МКПК человека. Наблюдаемое повышение является больше, чем при воздействии только ниволумаба (XENP 16432) (пунктирная линия).

На фиг. 28 проиллюстрирована корреляция между весом тела и количеством клеток CD45 при болезни "трансплантат против хозяина", что свидетельствует о том, что уровни клеток CD45 являются предиктором этого заболевания.

На фиг.29 проиллюстрирована корреляция между количеством клеток CD45 и высвобождением IFNγ в исследовании, продемонстрированном на фиг. 27.

На фиг. 30 проиллюстрировано, что биспецифические антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1 усиливают приживление (измеренное с помощью подсчета количества CD45 человека) у мышей NSG с привитыми МКПК человека. Наблюдаемое повышение является больше, чем при воздействии только ниволумаба (XENP 16432) (пунктирная линия).

На фиг. 31 проиллюстрирована корреляция между количеством клеток CD45 и высвобождением IFNγ в исследовании, продемонстрированном на фиг. 30.

На фиг. 32 проиллюстрировано сравнение эффектов исследуемого препарата между исследованиями, показанными на фиг. 27 и 30, и демонстрирующими постоянное превосходство биспецифических антител контрольных точек анти-PD-1 x анти-CTLA-4 по сравнению с ниволумабом.

На фиг. 33А и В показаны результаты реакций смешанных лимфоцитов для оценки биспецифических антител анти-CTLA-4 x анти-PD-1, анти-LAG-3 x анти-PD-1 и анти-LAG-3 x анти-CTLA -4. Уровни анализируемых веществ были нормированы к таким, которые индуцировались только ниволумабом (значения, превышающие один, представляют собой повышение по сравнению с ниволумабом).

На фиг. 34 продемонстрированы реакции SEB для оценки биспецифических антител анти-LAG-3 x анти-CTLA-4. Биспецифическое антитело анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 само по себе повышает чувствительность IL-2 относительно контроля, хотя оно уступает ниволумабу, применяемому отдельно. Однако биспецифическое антитело анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 в комбинации с ниволумабом приводит к значительно более высокому ответу IL-2, чем в отдельности.

На фиг. 35 продемонстрировано, что биспецифические антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1, анти-LAG-3 x анти-PD-1, анти-BTLA x анти-PD-1 и анти-LAG-3 x анти-CTLA- 4 усиливают приживление (измеренное с помощью подсчета количества CD45 человека) у мышей NSG с привитыми МКПК человека. Наблюдаемое повышение является больше, чем при воздействии только ниволумаба (XENP 16432). Кроме того, биспецифическое антитело анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 комбинируют с ниволумабом, чтобы получить самые высокие уровни приживления.

На фиг. 36A и B продемонстрировано, что биспецифическое антитело анти-BTLA x-анти-PD-1 требует нарушения взаимодействия HVEM/BTLA, чтобы обладать эквивалентной дерепрессивной активностью как ниволумаб.

На фиг. 37А-Е продемонстрированы последовательности нескольких пригодных форматов открывалки бутылок на основе IgG1 человека без последовательностей Fv (например, scFv и vh и vl для Fab стороны). Каркас открывалки бутылок 1 основан на IgG1 человека (аллотип 356E/358M) и включает в себя искаженные варианты S364K/E357Q : L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне и абляционные варианты 233P/L234V/L235A/G236del/S267K на обеих цепях. Каркас открывалки бутылок 2 основан на IgG1 человека (аллотип 356E/358M) и включает в себя различные искаженные варианты, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне и абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K на обеих цепях. Каркас открывалки бутылок 3 основан на IgG1 человека (аллотип 356E/358M) и включает в себя различные искаженные варианты, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне и абляционные варианты 233P/L234V/L235A/G236del/S267K на обеих цепях. Каркас открывалки бутылок 4 основан на IgG1 человека (аллотип 356E/358M) и включает в себя различные искаженные варианты, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне и абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K на обеих цепях. Каркас открывалки бутылок 5 основан на IgG1 человека (аллотип 356D/358L) и включает в себя искаженные варианты S364K/E357Q : L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне и абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K на обеих цепях. Каркас открывалки бутылок 6 основан на IgG1 человека (аллотип 356E/358M) и включает в себя искаженные варианты S364K/E357Q : L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне и абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K на обеих цепях, а также вариант N297A на обеих цепях. Каркас открывалки бутылок 7 является идентичным 6, за исключением того, что мутация представляет собой N297S. Альтернативные форматы для каркасов открывалки бутылок 6 и 7 могут исключать абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K в обеих цепях. Каркас 8 основан на IgG4 человека и включает в себя искаженные варианты S364K/E357Q : L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне и абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K на обеих цепях, а также вариант S228P (нумерация EU, это вариант S241P по Кабату) на обеих цепях, который подвергает абляции обмен плеча Fab, как известно в данной области техники. Альтернативные форматы для каркаса открывалки бутылок 8 могут исключать абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K в обеих цепях.

Каркас 8 основан на IgG2 человека и включает в себя искаженные варианты S364K/E357Q : L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне. Каркас 10 основан на IgG2 человека и включает в себя искаженные варианты S364K/E357Q : L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне, а также вариант S267K на обеих цепях.

Как будет понятно специалистам в данной области техники и описано ниже, эти последовательности могут применяться с любыми парами vh и vl, описанными в данном документе, с одним мономером, включая scFv (необязательно включая заряженный линкер scFv), и другим мономером, включая последовательности Fab (например, vh, присоединенную к "тяжелой цепи Fab стороны" и vl, присоединенную к "константной легкой цепи"). То есть любые последовательности Fv, описанные в данном документе, для анти-CTLA-4, анти-PD-1, анти-LAG-3, анти-TIM-3, анти-TIGIT и анти-BTLA, будь то как scFv (опять же, необязательно с заряженными линкерами scFv) или как Fabs, могут быть включены в эти каркасы по фиг. 36 в любой комбинации. Константная легкая цепь, изображенная на фиг. 37А, может применяться для всех конструкций на фигуре, хотя константная легкая цепь каппа также может быть заменена.

Следует отметить, что эти каркасы открывалки бутылок находят применение в формате central-scFv на фиг. 1F, где дополнительный второй Fab (vh-CH1 и vl-константная легкая) с тем же антигенным связыванием, что и первый Fab, добавляется к N-концу scFv на стороне открывалки бутылок.

В каждый из этих каркасов включены последовательности, которые являются идентичными (как определено в данном документе) на 90, 95, 98 и 99%, и/или содержат от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислотных замен (по сравнению с "родительским элементом" по этой фигуре, который, как будет понятно специалистам в данной области техники, уже содержит ряд аминокислотных модификации по сравнению с родительским IgG1 человека (или IgG2 или IgG4, в зависимости от каркаса). То есть указанные каркасы могут содержать дополнительные модификации аминокислот (как правило, аминокислотные замены) в дополнение к искаженным вариантам, pI вариантам и абляционным вариантам, содержащимся в каркасах по этой фигуре.

На фиг. 38А-D продемонстрированы последовательности каркаса mAb-scFv, применяемые в данном изобретении, к которым добавлены последовательности Fv по данному изобретению. Каркас mAb-scFv 1 основан на IgG1 человека (3500E/358M аллотип) и включает: искаженные варианты S364K/E357Q : L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне и абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K на обеих цепях. Каркас 2 основан на IgG1 человека (аллотип 356D/358L) и включает: искаженные варианты S364K/E357Q : L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне и абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K на обеих цепях. Каркас 3 основан на IgG1 человека (аллотип 356E/358M) и включает: искаженные варианты S364K/E357Q : L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне и абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K на обеих цепях, а также вариант N297A на обеих цепях. Каркас 4 является идентичным каркасу 3, за исключением того, что мутация представляет собой N297S. Альтернативные форматы для каркасов mAb-scFv 3 и 4 могут исключать абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K в обеих цепях. Каркас 5 основан на IgG4 человека и включает в себя искаженные варианты S364K/E357Q : L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне и абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K для обеих цепей, а также вариант S228P (нумерация EU, это вариант S241P по Кабату) на обеих цепях, который подвергает абляции обмен плеча Fab, как известно из уровня техники. Каркас 6 основан на IgG2 человека и включает в себя искаженные варианты S364K/E357Q : L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне. Каркас 7 основан на IgG2 человека и включает в себя искаженные варианты S364K/E357Q : L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D на Fab стороне, а также вариант S267K на обеих цепях.

Как будет понятно специалистам в данной области техники и описано ниже, эти последовательности могут применяться с любыми парами vh и vl, описанными в данном документе, с одним мономером, включая как Fab, так и scFv (необязательно включая заряженный линкер scFv), и другим мономером, включая последовательности Fab (например, vh, присоединенную к "тяжелой цепи Fab стороны" и vl, присоединенную к "константной легкой цепи"). То есть любые последовательности Fv, описанные в данном документе, для анти-CTLA-4, анти-PD-1, анти-LAG-3, анти-TIM-3, анти-TIGIT и анти-BTLA, будь то как scFv (опять же, необязательно с заряженными линкерами scFv) или как Fabs, могут быть включены в эти каркасы по фиг. 38 в любой комбинации. Сторона мономера 1 представляет собой Fab-scFv pI отрицательную сторону и включает гетеродимеризационные варианты L368D/K370S, изостерические pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, (все относительно IgG1). Сторона мономера 2 представляет собой положительную сторону scFv pI и включает гетеродимеризационные варианты 364K/E357Q. Однако могут быть заменены другие пары искаженных вариантов, в частности [S364K/E357Q : L368D/K370S] ; [L368D/K370S : S364K] ; [L368E/K370S : S364K] ; [T41 1T/E360E/Q362E : D401K] ; [L368D/K370S : S364K/E357L], [K370S : S364K/E357Q], [T366S/L368A/Y407V : T366W] и [T366S/L368A/Y407V/Y394C : T366W/S354C].

Константная легкая цепь, изображенная на фиг. 38А, может применяться для всех конструкций на фигуре, хотя константная легкая цепь каппа также может быть заменена.

Следует отметить, что эти каркасы mAb-scFv находят применение в обоих форматах mAb-Fv по фиг. 1H (где один мономер содержит vl на C-конце, а другой содержит vh на C-конце), а также формат scFv-mAb по фиг. 1E (с scFv-доменом, добавленным к С-концу одного из мономеров).

В каждый из этих каркасов включены последовательности, которые являются идентичными (как определено в данном документе) на 90, 95, 98 и 99%, и/или содержат от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислотных замен (по сравнению с "родительским элементом" по этой фигуре, который, как будет понятно специалистам в данной области техники, уже содержит ряд аминокислотных модификации по сравнению с родительским IgG1 человека (или IgG2 или IgG4, в зависимости от каркаса). То есть указанные каркасы могут содержать дополнительные модификации аминокислот (как правило, аминокислотные замены) в дополнение к искаженным вариантам, pI вариантам и абляционным вариантам, содержащимся в каркасах по этой фигуре.

На фиг. 39А и В продемонстрирована матрица возможных комбинаций для биспецифических антител контрольных точек по данному изобретению. На фиг. 39A комбинации не связаны форматом, и может применяться любой формат, проиллюстрированный на фиг. 1. "A" в ячейке означает, что CDR от первого ABD (указанного на оси X) можно комбинировать с CDR второго ABD (указанного на оси Y). "B" в ячейке означает, что цепи vh и vl из первого ABD можно комбинировать с цепями vh и vl со второго ABD. "C" в ячейке означает, что CDR из первого ABD можно комбинировать с цепями vh и vl со второго ABD. "D" в ячейке означает, что цепи vh и vl из первого ABD можно комбинировать с CDR со второго ABD. "Е" в ячейке означает, что PD-1 ABD выбирают из группы 1 G6_H1.279_L1.194; 1 G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; и 2E9_H1L1. "F" в ячейке означает, что CTLA-4 ABD выбирают из группы [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; 0[CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121 ; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67; и [CTLA-4]_H3_L0.74. "G" в ячейке означает, что TIM-3 ABD выбирают из группы 1D10 _H0L0; 1D12 _H0L0; 3H3_H1_L2.1 ; 6C8 _H0L0; 6D9 H0 1D12 L0; 7A9 _H0L0; 7B11 _H0L0; 7B11 var_H0L0; и 7C2 _H0L0. "H" в ячейке означает, что LAG-3 ABD выбирают из группы идентификаторов 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1 ; 2A11_H1L2; 2A11 H2L2; 2A11 H3L1; 2A11 H3L2; 2A11 H4L1 ; 2A11 H4L2; 7G8 H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1 ; 7G8_H3.28_L1.11 ; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; и 7G8_H3L1. "I" в ячейке означает, что "J" в ячейке означает, что BTLA ABD выбирают из группы 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; и 9C6_H1.11_L1. Фиг. 39B является идентичной фиг. 39A, за исключением того, что фиг. 39B является специфической для формата открывалки бутылок. В B, когда первое ABD связывает PD-1, первое ABD представляет собой мономер scFv, а другие ABD (CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3 и BTLA) находятся в Fab мономере. В B, когда первое ABD связывает CTLA-4, оно находится в мономере scFv (кроме случаев комбинации с PD-1, когда он является Fab стороной), а другие ABD (CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3 и BTLA) находятся в Fab мономере.

На фиг. 40 продемонстрирована матрица возможных комбинаций форматов открывалки бутылок. "Q" в ячейке означает, что домен первого ABD (опять же, указанного на оси X) представляет собой scFv, а второй ABD (опять же, указанный на оси Y) представляет собой Fab сторону. "R" в ячейке означает, что первое ABD представляет собой Fab сторону, а второе ABD представляет собой scFv. "S" в ячейке означает, что первое ABD представляет собой анти-PD-1 и является scFv стороной. "Т" в ячейке означает, что первое ABD представляет собой анти-CTLA-4 и является scFv стороной. "U" в ячейке означает, что первое ABD представляет собой анти-TIM-3 и является scFv стороной. "V" в ячейке означает, что первое ABD представляет собой анти-LAG-3 и является scFv стороной. "W" в ячейке означает, что первое ABD представляет собой анти-TIGIT и является scFv стороной. "Х" в ячейке означает, что первое ABD представляет собой анти-BTLA и является scFv стороной. Кроме того, каждая комбинация, представленная на фиг. 39, может использовать комбинации CDR, scFvs и vh и vl по фиг. 38. Кроме того, конкретными вариантами осуществления каркасов открывалки бутылок по фиг. 39 являются последовательности по фиг. 36.

На фиг. 41A и B изображена схема, ассоциированная с пользой, которую может обеспечить биспецифическое антитело контрольной точки при комбинированных видах терапии с применением двух разных антител или препаратов.

На фиг. 42 изображена аналогичная схема, демонстрирующая, что, поскольку опухолевые TIL коэкспрессируют множество контрольных точек, двухвалентное связывание увеличивает авидность, усиливает противоопухолевую активность и предотвращает периферическую токсичность.

На фиг. 43 продемонстрировано, что биспецифические антитела контрольных точек по данному изобретению (например, анти-LAG-3 x анти-CTLA-4) могут быть объединены с другими моноспецифическими антителами контрольных точек (например, ниволумаб, пемобролизумаб).

На фиг. 44 продемонстрировано, что PD-1 и CTLA-4 коэкспрессируются во множестве типов опухолей, включая рак мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, легкого, меланому и рак яичников.

На фиг. 45A-C проиллюстрировано сравнение повышения высвобождения IL-2 B) двухвалентным анти-PD-1 и анти-CTLA-4 x-анти-PD-1 и C) и одноплечевым анти-PD-1 + одноплечевым анти-CTLA-4 и анти-CTLA-4 x анти-PD-1 в анализе SEB-стимулированных МКПК, а также C) контрольный эксперимент без стимуляции SEB.

На фиг. 46А и В проиллюстрирована блокировка PD-1 к лигандам PD-L1 и PD-L2 с помощью типового биспецифического антитела анти-CTLA-4 x-анти-PD-1 по сравнению с одноплечевым антителом анти-PD-1 и одноплечевым антителом анти-CTLA-4.

На фиг. 47 проиллюстрировано связывание Т-клеток в анализе SEB-стимулированных МКПК с помощью типового биспецифического антитела анти-CTLA-4 x-анти-PD-1.

На фиг. 48 проиллюстрировано, что биспецифические антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1 усиливают приживление (измеренное с помощью подсчета количества CD45 человека) у мышей NSG с привитыми МКПК человека. Наблюдаемое повышение является больше, чем при воздействии только ниволумаба (XENP 16432).

На фиг. 49 продемонстрировано, что биспецифические кандидаты анти-BTLA x анти-PD-1 связываются с Т-клетками с большей авидностью по сравнению с "одноплечевыми" контролями в анализе SEB-стимулированных МКПК.

На фиг. 50А и В продемонстрировано, что химерное биспецифическое антитело анти-BTLA х анти-PD-1 способствует секреции IL-2 из SEB-стимулированных МКПК. МКПК стимулировали с применением 10 нг/мл SEB в течение 3 дней с указанными исследуемыми препаратами. Супернатанты клеток собирали и анализировали с помощью MSD на предмет указанного анализируемого вещества. A: 20 мкг/мл исследуемого образца; B: 5 мкг/мл исследуемого образца.

На фиг. 51А и В продемонстрировано, что химерные биспецифические антитела анти-BTLA х анти-PD-1 х способствует секреции IFNγ из SEB-стимулированных МКПК. МКПК стимулировали с применением 10 нг/мл SEB в течение 3 дней с указанными исследуемыми препаратами. Супернатанты клеток собирали и анализировали с помощью MSD на предмет указанного анализируемого вещества. A: 20 мкг/мл исследуемого образца; B: 5 мкг/мл исследуемого образца.

На фиг. 52А и В продемонстрировано, что биспецифические антитела анти-BTLA х анти-PD-1 (химерные и с гуманизированными/оптимизированными плечами анти-BTLA Fab) способствуют секреции IL-2 и IFN-г из SEB-стимулированных МКПК. На обеих панелях представлены МКПК, стимулированные 10 нг/мл SEB в течение 3 дней, с указанными исследуемыми препаратами 20 мкг/мл. Супернатанты клеток собирали через 72 часа и анализировали на предмет указанного анализируемого вещества.

На фиг. 53 A-F продемонстрирована временная динамика (Дни 10, 14 и 22) повышения количества клеток CD45 и секреции IFNγ при применении типового биспецифического антитела анти- BTLA x анти-PD-1 в исследовании БТПХ.

На фиг. 54 приведены некоторые данные относительно сконструированного антигенсвязывающего домена 9C6 анти-BTLA. На фигуре приведен код XENP для двухвалентных вариантов осуществления, обозначения сконструированных доменов vh и vl, а также константа связывания KD относительно BTLA человека, измеренная с помощью анализа Octet.

На фиг. 55 A-E приведены некоторые данные относительно сконструированного антигенсвязывающего домена 2A11 анти-LAG-3. На фигуре приведен код XENP для вариантов осуществления Fab, обозначения сконструированных доменов vh и vl, константа связывания KD относительно LAG-3 человека, измеренная с помощью анализа Octet, а также Tm Fab.

На фиг. 56A-K приведены некоторые данные относительно сконструированного антигенсвязывающего домена 7G8 анти-LAG-3. На фигуре приведен код XENP для вариантов осуществления Fab, обозначения сконструированных доменов vh и vl, константа связывания KD относительно LAG-3 человека, измеренная с помощью анализа Octet, а также Tm Fab.

На фиг. 57A и B приведены значения Kd для биспецифических гетеродимерных антител в формате открывалки бутылок анти-LAG-3 X анти-CTLA-4 на основе либо оптимизированных плечей 2A11, либо 7G8 анти-LAG-3 Fab, измеренные с помощью анализа Octet.

На фиг. 58 продемонстрировано, что биспецифические антитела анти-LAG-3 (7G8) x анти-CTLA-4 и анти-LAG-3 (2A11) x анти-CTLA-4 связывают антигены с большей авидностью по сравнению с одноплечевыми контролями анти-LAG-3. МКПК стимулировали 100 нг/мл SEB в течение 3 дней. Затем клетки обрабатывали указанными исследуемыми препаратами в течение 30 мин при 4°С и дважды промывали. Затем клетки обрабатывали анти-CD3-FITC и антителом против Fc-APC человека. Клетки затем дважды промывали и анализировали с помощью проточной цитометрии.

На фиг. 59А и В продемонстрировано, что биспецифические антитела анти-LAG-3 x анти-СTLA-4 на основе 7G8 проявляют более избирательную функцию на МКПК, чем биспецифические антитела анти-LAG-3 x анти-СTLA-4 на основе 2A11, что подтверждается повышением высвобождения IL-2 и IFNγ. МКПК стимулировали 500 нг/мл SEB в течение 2 дней. Клетки затем дважды промывали в культуральной среде и стимулировали 500 нг/мл SEB в комбинации с указанными количествами исследуемых препаратов. Клетки анализировали на предмет указанного анализируемого вещества (либо IL-2, либо IFN-г) через 24 часа после обработки. Каждая точка представляет собой уникальный донор, протестированный в техническом синглете.

На фиг. 60А и В продемонстрированы реакции смешанных лимфоцитов (MLR) с биспецифическими антителами анти-LAG-3 X анти-CTLA-4. 40 уникальных реакций MLR проводили в присутствии 20 мкг/мл указанных исследуемых препаратов. Супернатанты клеток затем анализировали с помощью MSD через 6 дней после обработки на предмет A: IL-2 и B: IFNγ.

На фиг. 61А и В продемонстрировано повышение высвобождения IL-2 и IFNγ дополнительными кандидатами анти-LAG-3 X анти-CTLA-4 в анализах SEB. МКПК стимулировали 500 нг/мл SEB в течение 2 дней. Клетки затем дважды промывали в культуральной среде и стимулировали 500 нг/мл SEB в комбинации с указанными количествами исследуемых препаратов. Клетки анализировали на предмет указанного анализируемого вещества (либо IL-2, либо IFN-г) через 24 часа после обработки. Каждая точка представляет собой уникальный донор, протестированный в техническом синглете.

На фиг. 62A и B приведены значения Kd для биспецифических гетеродимерных антител в формате открывалки бутылок анти-LAG-3 X анти-PD-1 на основе либо оптимизированных плечей 2A11, либо 7G8 анти-LAG-3 Fab, измеренные с помощью анализа Octet.

На фиг. 63A и B проиллюстрирована способность гуманизированных/оптимизированных клонов 7G8 и 2A11 анти-LAG-3 блокировать связывание LAG-3 с клетками Дауди, эндогенно экспрессирующими MHC-II.

На фиг. 64А и В проиллюстрирована функция кандидата анти-LAG-3 x анти-PD-1 на SEB-стимулированных Т-клетках. МКПК стимулировали 500 нг/мл SEB в течение 2 дней. Клетки затем дважды промывали в культуральной среде и стимулировали 500 нг/мл SEB в комбинации с указанными количествами исследуемых препаратов. Клетки анализировали на предмет указанного анализируемого вещества через 24 часа после обработки. Каждая точка представляет собой уникальный донор, протестированный в техническом синглете.

На фиг. 65 представлены графики, демонстрирующие, что инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) коэкспрессируют множество рецепторов контрольных точек в различных опухолях. В частности, графики демонстрируют, что различные опухоли коэкспрессируют PD-1 и CTLA-4, PD-1 и BTLA, PD-1 и LAG-3; а также LAG-3 и CTLA-4. Приведенные результаты основаны на данных, полученных в сети TCGA Research: http://cancergenome.nih.gov/

На фиг. 66 продемонстрировано, что биспецифические антитела субъекта, представленные в данном изобретении, избирательно нацеливаются на Т-клетки с двойной контрольной точкой. Биспецифические антитела PD-1 x LAG-3 применяют для определения заполнения рецепторов PD-1 и LAG-3 в CD3+ T-клетках, стимулированных стафилококковым энтеротоксином B (SEB), по сравнению с отрицательным контролем.

На фиг. 67A-F представлены графики, демонстрирующие, что домены компонентов антител, представленных в данном изобретении, способны блокировать взаимодействие рецептора контрольной точки с лигандом. В частности, биспецифическое антитело, содержащее плечо 1G6 анти-PD-1 scFv, способно блокировать взаимодействия PD-1/ PD-L1 и PD-1/PD-L2; одноплечевое антитело 7G8 анти-LAG-3 способно блокировать взаимодействие LAG-3/MHC II; биспецифическое антитело, содержащее типовое плечо анти-PD-1 Fab, способно блокировать взаимодействия CTLA-4/CD80 и CTLA-4/CD86; и биспецифическое антитело, содержащее плечо 9C6 анти-BTLA Fab, способно блокировать взаимодействие BTLA HVEM.

На фиг. 68 приведено сравнение повышения высвобождения IL-2 с помощью типового биспецифического антитела анти- CTLA-4 x анти-PD-1 и ниволумаба.

На фиг. 69 приведено сравнение повышения высвобождения IL-2 с помощью типового биспецифического антитела анти-LAG-3 x анти-CTLA-4, этого же биспецифического антитела в комбинации с ниволумабом, и ниволумабом отдельно.

На фиг. 70 приведено сравнение повышения высвобождения IL-2 с помощью типового биспецифического антитела анти-LAG-3 x анти-PD-1 и ниволумаба.

На фиг. 71 приведено сравнение повышения высвобождения IL-2 с помощью типового биспецифического антитела анти-BTLA-4 x анти-PD-1 и ниволумаба.

На фиг. 72 приведено сравнение повышения БТПХ (что подтверждается количеством клеток CD45) с помощью типового биспецифического антитела анти-PD-1 x анти-CTLA-4, ниволумаба отдельно и ниволумаба в комбинации с ипилимумабом.

На фиг. 73 приведено сравнение повышения БТПХ (что подтверждается количеством клеток CD45) с помощью типового биспецифического антитела анти-BTLA x анти-PD-1 и ниволумаба.

На фиг. 74 приведено сравнение повышения БТПХ (что подтверждается количеством клеток CD45) с помощью типового биспецифического антитела анти-LAG-3 x анти-CTLA-4, этого же биспецифического антитела в комбинации с ниволумабом, и ниволумабом отдельно.

На фиг. 75 приведено сравнение повышения БТПХ (что подтверждается количеством клеток CD45) с помощью типового биспецифического антитела анти-LAG-3 x анти-PD-1 и ниволумаба.

На фиг. 76A-D проиллюстрированы два исследования, демонстрирующие, что биспецифические антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1 могут стимулировать противоопухолевую активность, опосредованную Т-клетками in vivo. Мышам прививали раковые клетки KGla-luc. Через двадцать один день, тем же мышам прививали huPMC и осуществляли еженедельные введения антител (биспецифические антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1, двухвалентные антитела анти-PD-1; или двухвалентное антитело анти-PD-1 + двухвалентное антитело анти-CTLA-4). Визуализацию раковых клеток IVIS осуществляли у мышей для оценки размера опухоли, что определялось изменением плотности опухоли.

Подробное описание изобретения

A. Включение материалов

1. Фигуры и обозначения

Все фигуры и сопровождающие их обозначения US USNN 62350145, 62/353,511 и 62/420,500 прямо и независимо включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме, особенно, что касается аминокислотных последовательностей, изображенных в документе.

2. Последовательности

Ссылка на перечень сопровождающих последовательностей приводится, как показано ниже: последовательности анти-PD-1, пригодные для применения в качестве ABD, включают SEQ ID NO: 6209-11464 (последовательности PD-1 scFv, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как Fab), SEQ ID NO: 11465-17134 (последовательности PD-1 Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv), SEQ ID NO: 33003-33072 (дополнительные последовательности PD-1 Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv), SEQ ID NO: 33073-35394 (дополнительные последовательности scFv PD-1, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как Fab) и SEQ ID NO: 36127-36146 (двухвалентные конструкции PD-1, которые могут быть отформатированы как scFv или Fab). Последовательности анти-CTLA-4, пригодные для применения в качестве ABD, включают SEQ ID NO: 21-2918 (последовательности CTLA-4 scFv, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как Fab), SEQ ID NO: 2919-6208 (последовательности CTLA-4 Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv), SEQ ID NO: 36739-36818 (дополнительные последовательности CTLA-4 Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv) и SEQ ID NO: 35395-35416 (одноплечевые конструкции CTLA -4, которые могут быть отформатированы как Fab или scFv). Последовательности анти-LAG-3, пригодные для применения в качестве ABD, включают SEQ ID NO: 17135-20764 (LAG-3 Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv), SEQ ID NO: 36819-36962 (дополнительные LAG-3 Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv), SEQ ID NO: 35417-35606 (дополнительные LAG-3 Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv), SEQ ID NO: 25194-32793 (дополнительные LAG-3 Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv) и SEQ ID NO: 32794-33002 (одноплечевые конструкции LAG-3, которые могут быть отформатированы как Fab или scFv). Последовательности анти-TIM-3, пригодные для применения в качестве ABD, включают SEQ ID NO: 20765-20884 (TIM-3 Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv), SEQ ID NO: 37587-37698 (дополнительные TIM-3 Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv) и SEQ ID NO: 36347-36706 (двухвалентные конструкции TIM-3, которые могут быть отформатированы как Fab или scFv). Последовательности анти-BTLA, пригодные для применения в качестве ABD, включают SEQ ID NO: 20885-21503 (BTLA Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv) и SEQ ID NO: 36707-36738 (дополнительные BTLA Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатирован как scFv). Последовательности анти-TIGIT, пригодные для применения в качестве ABD, включают SEQ ID NO: 21504-21523 (TIGIT Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv) и SEQ ID NO: 37435-37586 (дополнительные TIGIT Fab, хотя последовательности Fv в нем могут быть отформатированы как scFv).

Биспецифические антитела по данному изобретению включают конструкции LAG3 X CTLA4 последовательности SEQ ID NO: 35607-35866 и SEQ ID NO: 21524-22620. Конструкции PD-1 X CTLA4 включают конструкции, которые перечислены как SEQ ID NO: 36167-36346 и SEQ ID NO: 23316-23735. Конструкции PD-1 X TIM3 включают конструкции, которые перечислены как SEQ ID NO: 25174-25193. Конструкции PD-1 X LAG3 включают конструкции, которые перечислены как SEQ ID NO: 35867-36126 и SEQ ID NO: 23736-25133. Конструкции PD-1 X TIGIT включают конструкции, которые перечислены как SEQ ID NO: 25134-25173. Конструкции PD-1 X BTLA включают конструкции, которые перечислены как SEQ ID NO: 22724-23315 и SEQ ID NO: 36147-36166. Конструкции CTLA4 X BTLA включают конструкции, которые перечислены как SEQ ID NO: 22624-22723.

Наконец, названия для XENP23552, XENP22841, XENP22842, XENP22843, XENP22844, XENP22845, XENP22846, XENP22847, XENP22848, XENP22849, XENP22850, XENP22851, XENP22852, XENP22858, XENP22854, XENP22855 должны включать обозначение "M428L/N434S" в заголовке, что было непреднамеренно упущено.

B. Общий обзор

Терапевтические антитела, направленные против ингибиторов иммунной контрольной точки, такие как PD-1, демонстрируют большие перспективы в ограниченных условиях в клинике для лечения рака. Рак можно рассматривать как патологическое состояние, характеризующееся неспособностью организма пациента распознавать и устранять раковые клетки. Во многих случаях эти трансформированные (например, раковые) клетки противодействуют функции иммунологического надзора. Существуют естественные механизмы контроля, которые ограничивают активацию Т-клеток в организме с целью предотвращения неограниченной активности указанных Т-клеток, которая может использоваться раковыми клетками для уклонения или подавления иммунного ответа. Восстановление иммунных эффекторных клеток, особенно Т-клеток, для распознавания и устранения раковых клеток является целью иммунотерапии. Область иммуноонкологии, иногда называемая "иммунотерапией", быстро развивается, при этом в последнее время утверждено несколько препаратов антител, ингибирующих контрольные точки Т-клеток, такие как Ервой, Кейтруда и Опдиво. Как правило, эти антитела называются "ингибиторами контрольных точек", поскольку они блокируют обычно отрицательные регуляторы иммунитета Т-клеток. Общепонятным является тот факт, что для согласованного оптимального антигенспецифического иммунного ответа можно применять различные иммуномодулирующие сигналы, как костимуляторные, так и коингибирующие.

Как правило, эти моноклональные антитела связываются с белками ингибитора контрольных точек, такими как CTLA-4 и PD-1, которые при нормальных условиях предотвращают или подавляют активацию цитотоксических Т-клеток (CTL). Путем ингибирования белка контрольной точки, например, посредством применения антител, которые связывают эти белки, может быть достигнут усиленный ответ Т-клеток против опухолей. То есть эти белки контрольных точек при раке подавляют иммунный ответ; когда указанные белки блокируются, например, при применении антител к белку контрольной точки, иммунная система активируется, что вызывает иммунную стимуляцию, тем самым осуществляя лечение таких патологических состояний, как рак и инфекционное заболевание.

Однако, как обсуждалось выше, исследования продемонстрировали, что TIL обычно экспрессируют множество рецепторов контрольных точек; это может указывать на то, что одиночная блокада контрольных точек может быть недостаточной для содействия полному ответу Т-клеток. Более того, вероятно, что TIL, которые экспрессируют множество контрольных точек, на самом деле являются наиболее опухолереактивными, это может предполагать то, что способы лечения, которые воздействуют на более чем один антиген контрольной точки, могут быть очень полезными.

Соответственно, в данном изобретении предлагаются биспецифические антитела контрольной точки, которые связываются с клетками, экспрессирующими два антигена, и способы активации Т-клеток и/или NK-клеток для лечения таких заболеваний, как рак и инфекционные заболевания, и других патологических состояний, при которых наблюдается повышение иммунной активности при лечении.

Таким образом, данное изобретение в некоторых случаях направлено на решение проблемы токсичности и затрат на введение множества антител путем введения биспецифических антител, которые связываются с двумя разными молекулами ингибитора контрольной точки в одной клетке и преимущественно требуют введения только одного терапевтического вещества.

Биспецифические антитела, которые могут одновременно связывать две разные мишени, дают возможность улучшить избирательность нацеливания на TIL по сравнению с периферическими Т-клетками, а также снизить стоимость терапии. Двухвалентное взаимодействие антитела с двумя мишенями на поверхности клетки должно в некоторых случаях приводить к более высокой авидности связывания по сравнению с одновалентным взаимодействием с одной мишенью каждый раз. Из-за этого нормальные двухвалентные антитела, как правило, имеют высокую авидность связывания со своей мишенью на поверхности клетки. Что касается биспецифических антител, существует потенциал для создания более высокой селективности для клеток, которые одновременно экспрессируют две разные мишени, используя более высокую авидность, обеспечиваемую одновременным связыванием с обеими мишенями.

Соответственно, данное изобретение относится к новым конструкциям для получения гетеродимерных антител, которые позволяют связываться с более чем одним антигеном контрольной точки или лигандом, например, для обеспечения биспецифического связывания. Следовательно, ожидается, например, что биспецифическое антитело анти-PDL x анти-CTLA4 (PD1 x CTLA4) будет более селективным по отношению к TIL, положительным для двух элементов: PD1+ CTLA4+, по сравнению с Т-клетками, положительными для одного элемента: для PDL отдельно или CTLA4 отдельно. Следовательно, селективная блокада TIL, положительных для двух элементов, по сравнению с Т-клетками, положительными для одного элемента, улучшает терапевтический показатель комбинированной блокады контрольных точек. Аналогичным образом это соответствует другим возможным комбинациям, как описано в данном документе. Соответственно, пригодные биспецифические антитела по данному изобретению связывают PD-1 и CTLA-4, PD-1 и TIM-3, PD-1 и LAG-3, PD-1 и TIGIT, PD-1 и BTLA, CTLA-4 и TIM-3, CTLA-4 и LAG-3, CTLA-4 и TIGIT, CTLA-4 и BTLA, TIM-3 и LAG-3, TIM-3 и TIGIT, TIM-3 и BTLA, LAG-3 и TIGIT, LAG-3 и BTLA, а также TIGIT и BTLA. Следует обратить внимание, что, как правило, эти биспецифические антитела называются "анти-PD-1 X анти-CTLA-4" или, как правило, упрощенно или для удобства (и, следовательно, взаимозаменяемо) обозначаются как "PD-1 X CTLA-4" и т.д. для каждой пары.

Гетеродимерные биспецифические антитела контрольных точек по данному изобретению являются пригодными для лечения различных видов рака. Как будет понятно специалистам в данной области техники, в отличие от традиционных моноклональных антител, которые связываются с опухолевыми антигенами, или с более новыми классами биспецифических антител, которые связывают, например, CD3 и опухолевые антигены (например, такие как описаны в USSN 15/141350), антитела контрольных точек применяются для усиления иммунного ответа, но, как правило, являются неспецифичными для опухолей по своему механизму действия. То есть биспецифические антитела контрольных точек по данному изобретению ингибируют подавление иммунной системы, что, как правило, приводит к активации Т-клеток и в свою очередь обуславливает более сильный иммунный ответ на раковые клетки и, таким образом, осуществляется лечение. Таким образом, такие антитела могут найти применение для лечения широкого спектра типов опухолей. Например, FDA недавно одобрило препарат Кейтруда®, моноспецифическое антитело анти-PD-1 на основе генетической характеристики, а не типа опухоли.

Как обсуждается ниже, существует множество способов активации Т-клеток, которую можно проанализировать. Функциональные эффекты биспецифических антител контрольных точек на NK- и Т-клетки можно оценить in vitro (а в некоторых случаях in vivo, как описано более подробно ниже) путем измерения изменений следующих параметров: пролиферации, высвобождения цитокинов и маркеров клеточной поверхности. Что касается NK-клеток, увеличение пролиферации клеток, цитотоксичность (способность уничтожать клетки-мишени, что измеряется увеличением экспрессии CD107α, гранзима, и экспрессии перфорина, или путем непосредственного измерения уничтожения клеток-мишеней), продуцирование цитокинов (например, IFN-г и TNF), и экспрессия рецептора клеточной поверхности (например, CD25) указывают на иммунную модуляцию, например, усиленное уничтожение раковых клеток. Что касается Т-клеток, увеличение пролиферации, повышение экспрессии маркеров клеточной поверхности активации (например, CD25, CD69, CD137 и PD1), цитотоксичность (способность уничтожать клетки-мишени) и продукция цитокинов (например, IL-2, IL- 4, IL-6, IFN-г, TNF-a, IL-10, IL-17A) указывают на иммунную модуляцию, например, усиленное уничтожение раковых клеток. Соответственно, оценка лечения может проводиться с помощью анализов, которые оценивают один или большее количество из следующих процессов: (i) повышение иммунного ответа, (ii) повышение активации бв и/ или гд Т-клеток, (iii) повышение цитотоксической активности Т-клетки, (iv) повышение активности NK- и / или NKT-клеток, (v) облегчение супрессии бв и/или гд Т-клеток, (vi) повышение провоспалительной секреции цитокинов, (vii) повышение секреции IL-2; (viii) повышение продукции интерферона-г, (ix) усиление ответа Thl, (x) ослабление ответа Th2, (xi) уменьшение количества клеток и/или активности по меньшей мере одной из регуляторных Т-клеток и клеток (xii) увеличение иммунных инфильтратов опухоли.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается применение биспецифических антител контрольных точек для выполнения одного или большего количества следующих процессов у субъекта, нуждающегося в этом: (а) повышение активности провоспалительных цитокинов; (b) повышение пролиферации, размножения Т-клеток или инфильтрования опухоли Т-клетками; (c) повышение содержания интерферона-г, TNF-a и других цитокинов в Т-клетках; (d) повышение секреции IL-2; (e) стимулирование ответа антител; (f) ингибирование роста раковых клеток; (g) стимулирование антигенного специфического Т-клеточного иммунитета; (h) стимулирование активации CD4+ и/или CD8 + Т-клеток; (i) облегчение супрессии Т-клеток; (j) стимулирование активности NK-клеток; (k) стимулирование апоптоза или лизиса раковых клеток; и/ или (1) цитотоксическое или цитостатическое действие на раковые клетки.

Соответственно, в данном изобретении предлагаются биспецифические гетеродимерные антитела контрольных точек. Конструкции гетеродимерных антител основаны на характерном признаке "самосборки" двух Fc-доменов тяжелых цепей антител, например, двух "мономеров", которые собираются в "димер". Гетеродимерные антитела получают путем изменения аминокислотной последовательности каждого мономера, как более подробно описано ниже. Таким образом, данное изобретение, как правило, направлено на создание гетеродимерных антител, которые могут совместно взаимодействовать с антигенами контрольных точек несколькими способами, на основе вариантов аминокислот в константных областях, которые различны для каждой цепи, с целью содействия гетеродимерному образованию и/или обеспечения легкости очистки гетеродимеров по сравнению с гомодимерами.

Таким образом, в данном изобретении предлагаются биспецифические антитела контрольных точек. Существующей проблемой в технологиях создания антител является стремление создать "биспецифические" антитела, которые одновременно связываются с двумя (или более) различными антигенами, как правило, тем самым позволяя приблизить различные антигены и получить новые функции и новые методы лечения. В общем, эти антитела получают путем включения генов для каждой тяжелой и легкой цепи в клетки-хозяева (как правило, в данном изобретении, гены для двух мономеров тяжелой цепи и легкой цепи, как описано в данном документе). Как правило, это приводит к образованию желаемого гетеродимера (А-В), а также двух гомодимеров (А-А и В-В). Однако основным препятствием в создании биспецифических антител является трудности очистки гетеродимерных антител от гомодимерных антител и/или систематические ошибки образования гетеродимера по сравнению с образованием гомодимеров.

Для решения этой проблемы существует ряд механизмов, которые можно применять для создания гетеродимеров по данному изобретению. Кроме того, как будет понятно специалистам в данной области техники, эти механизмы можно объединить для обеспечения высокой гетеродимеризации. Таким образом, варианты аминокислот, которые приводят к продукции гетеродимерных антител, называются "гетеродимеризационными вариантами ". Как обсуждается ниже, гетеродимеризационные варианты могут включать стерические варианты (например, варианты "выступы и впадины" или "искаженные" варианты, описанные ниже, и варианты "пары зарядов", описанные ниже), а также "pI варианты", которые позволяют очищать гомодимеры от гетеродимеров.

Один механизм, обычно называемый в данной области техники как "выступы и впадины" ("KIH") или иногда называемый в данном документе как "искаженные" варианты, относится к технологии аминокислот, которая создает стерические и/или электростатические воздействия в пользу гетеродимерного образования и не в пользу гомодимерного образования, и также может быть в некоторых случаях использована, как описано в Ridgway et al., Protein Engineering 9 (7): 617 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol. 1997 270:26; патент США № 8216805, US 2012/0149876, все из которых включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме. На фигурах идентифицировано некоторое количество пар "мономер А - мономер В", которые включают аминокислотные замены "выступы и впадины". Кроме того, как описано в Merchant et al, Nature Biotech. 16: 677 (1998), эти мутации "выступы и впадины" могут быть объединены с дисульфидными связями с искаженными образованиями до гетеродимеризации. В данном изобретении применяют T366S/L368A/Y407V в паре с T366W, а также этот вариант с мостиковым дисульфидом, T366S/L368A/Y407V/Y349C в паре с T366W/S354C, особенно в комбинации с другими гетеродимеризационными вариантами, включая pI варианты, как описано ниже.

Дополнительный механизм, который находит применение при создании гетеродимерных антител, иногда упоминается как "электростатическое взаимодействие" или "пары зарядов", как описано в публикации Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285 (25): 19637 (2010), включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме. Иногда этот механизм упоминается как "пары зарядов". В этом варианте осуществления данного изобретения электростатика применяется для искажения образования в сторону гетеродимеризации. Как будет понятно специалистам в данной области техники, они могут также оказывать влияние на pI, и, следовательно, на очистку и, таким образом, в некоторых случаях также могут рассматриваться как pI варианты. Однако, поскольку они были созданы для принудительной гетеродимеризации и не применялись в качестве инструментов очистки, они классифицируются как "стерические варианты". К ним относятся, но не ограничиваясь этим, D221E/P228E/L368E в паре с D221R/P228R/K409R (например, это "соответствующие наборы мономеров") и C220E/P228E/368E в паре с C220R/E224R/P228R/K409R и другие, продемонстрированные на фигурах.

В данном изобретении в некоторых вариантах его осуществления, pI варианты применяют для изменения pI одного или обоих мономеров и, таким образом, способствуют изоэлектрическому разделению димерных белков A-A, A-B и B-B.

В данном изобретении существует несколько основных механизмов, которые могут упростить очистку гетеродимерных белков; один из них основан на применении pI вариантов, так что каждый мономер имеет различную pI, что способствует изоэлектрической очистке димерных белков A-A, A-B и B-B. В альтернативном варианте, некоторые форматы каркаса, такие как формат "тройного F", также способствуют разделению на основе размера. Как дополнительно описано ниже, также возможно "сместить" образование гетеродимеров по сравнению с гомодимерами. Таким образом, комбинация вариантов пространственной гетеродимеризации и pI вариантов или пары зарядов находит свое определенное применение в данном изобретении. Кроме того, как более подробно описано ниже, каркасы, которые используют scFv (s), такие как формат "тройного F", могут включать в себя заряженные линкеры scFv (положительные или отрицательные), которые дают дополнительное повышение pI для целей очистки. Как будет понятно специалистам в данной области техники, некоторые форматы "тройного F" являются пригодными только с заряженными линкерами scFv и без дополнительных корректировок pI, хотя в данном изобретении также предлагается применение искаженных вариантов с заряженными линкерами scFv (и комбинации вариантов Fc, FcRn и KO, обсуждаемые в данном документе).

В данном изобретении, в котором для обеспечения очистки гетеродимерных белков используется pI в качестве механизма разделения, варианты аминокислот могут быть введены в один или оба мономерных полипептида; то есть pI одного из мономеров (называемого в данном документе для простоты как "мономер A") может быть спроектирована отдельно от мономера B, или оба мономера A и B могут быть изменены, с повышением pI мономера A и снижением pI мономера B. Как более подробно изложено ниже, изменения pI одного или обоих мономеров можно осуществить путем удаления или добавления заряженного остатка (например, нейтральную аминокислоту заменяют на положительно или отрицательно заряженный аминокислотный остаток, например, глицин на глутаминовую кислоту), изменения заряженного остатка с положительного или отрицательного на противоположный заряд (например, аспарагиновую кислоту заменяют на лизин) или изменение заряженного остатка на нейтральный остаток (например, потеря заряда; замена лизина на серин). Ряд этих вариантов продемонстрирован на фигурах. Кроме того, пригодными вариантами pI для применения в создании гетеродимерных антител по данному изобретению являются такие варианты, которые являются изотипическими, например, импортирование вариантов pI из различных изотипов IgG с тем, чтобы pI изменялась без введения значительной иммуногенности; см. фиг. 29 из публикации США № 20140288275, включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме.

Соответственно, в этом варианте осуществления данного изобретения предлагается внесение достаточного изменения в pI по меньшей мере в одном из мономеров с той целью, чтобы гетеродимеры можно было отделить от гомодимеров. Как будет понятно специалистам в данной области техники, и, как обсуждается ниже, это можно сделать, используя константную область тяжелой цепи "дикого типа" и вариантная область, которая была сконструирована так, чтобы либо повышать, либо снижать ее pI (% масс. A- + B или % масс. A - -B), либо путем увеличения одной области и уменьшения другой области (A + -B- или A-B +).

Таким образом, как правило, компонент некоторых вариантов осуществления данного изобретения представляет собой варианты аминокислот в константных областях антител, которые направлены на изменение изоэлектрической точки (pI) по меньшей мере одного, если не обоих, мономеров димерного белка с образованием "гетеродимеров pI" (когда белок является антителом, они называются "pI антитела") путем включения аминокислотных замен ("pI вариантов" или "pI замен") в один или оба из мономеров. Как показано в данном документе, разделение гетеродимеров от двух гомодимеров может быть выполнено, если pI двух мономеров отличаются всего на 0,1 единицы рН, с 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 или больше от всего обнаруженного применения в данном изобретении.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, количество pI вариантов, которые должны быть включены в каждый или оба мономера для получения надлежащего разделения, будет частично зависеть от начального значения pI scFv и Fab, представляющих интерес. То есть, чтобы определить, какой мономер необходимо сконструировать или в каком "направлении" (например, более положительном или более отрицательном), вычисляются последовательности Fv двух антигенов-мишеней и принимается решение брать их оттуда. Как известно в данной области техники, различные Fv будут иметь разные начальные значения pI, которые используются в данном изобретении. В общем, как указано в данном документе, pI спроектированы так, чтобы получить общую разность pI каждого мономера по меньшей мере около 0,1 log, причем диапазон от 0,2 до 0,5 является предпочтительным, как указано в данном документе.

Кроме того, как будет понятно специалистам в данной области техники и изложено в данном документе, в некоторых случаях (в зависимости от формата) гетеродимеры могут быть отделены от гомодимеров на основе размера (например, молекулярного веса). Например, как продемонстрировано в некоторых вариантах осуществления по фиг. 1, в результате использования некоторых форматов получают гомодимеры и гетеродимеры различного размера (например, что касается открывалки бутылок, один гомодимер представляет собой формат "двойного scFv", один гомодимер представляет собой стандартное антитело, а гетеродимер имеет один Fab и один scFv.

Кроме того, как продемонстрировано на фиг. 1, необходимо учитывать, что возможно некоторые антигены связываются двухвалентно (например, два антигенсвязывающих участка связываются с одним антигеном). Следует иметь в виду, что для достижения желаемого результата и комбинаций может быть использована любая комбинация Fab и scFv.

В случае, когда для получения очищенных гетеродимеров от гомодимеров применяют pI варианты, используя для этого константную область (области) тяжелой цепи (цепей), предлагается более модульный подход к разработке и очистке мультиспецифических белков, включая антитела. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения, гетеродимеризационные варианты (включая гетеродимеризационные варианты искажения и очистки) не включаются в вариабельные области, в результате чего необходимо конструировать каждое отдельное антитело. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения возможность иммуногенности в результате применения pI вариантов, значительно снижается за счет импортирования вариантов pI из различных изотипов IgG, так что pI изменяется без введения значительной иммуногенности. Таким образом, дополнительной проблемой, которую необходимо решить, является определение константных доменов с низким значением pI и высоким содержанием последовательности человека, например, минимизация или предотвращение применения нечеловеческих остатков в любом конкретном положении.

Дополнительным преимуществом, которое может иметь место при использовании этого проектирования pI, является также удлинение периода полужизни в сыворотке и усиление связывания FcRn. То есть, как описано в USSN 13/194904 (включенном посредством ссылки в полном объеме), снижение pI константных доменов антитела (включая те, которые обнаружены в антителах и слияниях Fc) может привести к более длительному удержанию в сыворотке in vivo. Эти pI варианты для увеличения периода полужизни в сыворотке также облегчают изменения pI для очистки.

Кроме того, следует отметить, что pI варианты гетеродимеризационных вариантов дают дополнительное преимущество для анализа и контроля качества биспецифических антител, так как способность устранять, минимизировать и различать при наличии гомодимеров, является существенной. Аналогичным образом, важной является способность надежно проверять воспроизводимость продукции гетеродимерного белка.

Как будет понятно специалистам в данной области техники и более подробно описано ниже, гетеродимерные слитые белки по данному изобретению могут принимать самые разнообразные конфигурации, как это в общих чертах проиллюстрировано на фиг. 1. На некоторых фигурах проиллюстрированы "одноконечные" конфигурации, в которых на одном "плече" молекулы есть один тип специфичности, а на другом "плече" - другой тип специфичности. На других фигурах проиллюстрированы "двухконечные" конфигурации, в которых по меньшей мере один тип специфичности находится в "верхней части" молекулы, а одна или большее количество других специфичностей - в "нижней части" молекулы. Таким образом, данное изобретение направлено на новые композиции иммуноглобулина, которые взаимодействуют с первым и вторым антигеном. Первый и второй антигены по данному изобретению называются соответственно антиген-1 и антиген-2 (или "контрольная точка-1" и "контрольная точка-2").

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в данном изобретении, представляет собой формат каркаса "тройного F" или открывалки бутылок, как проиллюстрировано на фиг. 1А. В этом варианте осуществления данного изобретения одна тяжелая цепь антитела содержит одноцепочечный Fv ("scFv", как определено ниже), а другая тяжелая цепь представляет собой "обычный" формат FAb, содержащий вариабельную тяжелую цепь и легкую цепь. Эта структура иногда упоминается в данном документе как формат "тройного F" (scFv-FAb-Fc) или формат открывалки бутылок из-за некоторого визуального сходства с открывалкой бутылок (см. фиг. 1A). Две цепи объединены путем применения вариантов аминокислот в константных областях (например, Fc-домен и/или шарнирная область), что способствует образованию гетеродимерных антител, как описано более подробно ниже.

Существует несколько отличительных преимуществ данного формата "тройного F". Как известно в данной области техники, аналоги антител, основанные на двух конструкциях scFv, часто характеризуются проблемами, связанными со стабильностью и агрегацией, которые могут быть устранены в данном изобретении путем добавления "обычного" спаривания тяжелой и легкой цепи. Кроме того, в отличие от форматов, которые основаны на двух тяжелых цепях и двух легких цепях, не существует проблемы с неправильным спариванием тяжелых и легких цепей (например, тяжелая цепь 1 спаривается с легкой цепью 2 и т.д.).

Кроме того, как описано в данном документе, в биспецифические антитела по данному изобретению могут быть введены дополнительные варианты аминокислот с целью достижения дополнительных функциональных возможностей. Например, можно добавить аминокислотные изменения в пределах Fc-области (либо в один мономер, либо в оба) для содействия повышению ADCC или CDC (например, измененное связывание с рецепторами Fсγ), а также для усиления связывания с FcRn и/или удлинения периода полужизни полученных молекул в сыворотке. Как описано далее и как будет понятно специалистам в данной области техники, любой и все варианты, описанные в данном документе, могут быть необязательно и независимо объединены с другими вариантами.

Аналогичным образом, другой категорией функциональных вариантов являются "абляционные варианты Fсγ" или варианты "выбивания Fc (FcKO или KO)". В этих вариантах осуществления данного изобретения для некоторых терапевтических применений желательно уменьшить или удалить нормальное связывание Fc-домена с одним или большим количеством или со всеми рецепторами Fcγ (например, FcγRl, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa и т.д.) во избежание дополнительных механизмов действия. То есть, например, обычно является желательной абляция связывания FcγRIIIa для устранения или значительного снижения активности ADCC. Соответствующие абляционные варианты приведены на фиг. 5.

C. Номенклатура

Биспецифические антитела по данному изобретению приведены в нескольких разных форматах. Каждому полипептиду присваивается уникальный номер "XENP", хотя, как будет понятно специалисту в данной области техники, более длинная последовательность может содержать более короткую. Например, тяжелая цепь scFv стороны мономера формата открывалки бутылок для данной последовательности будет иметь первый номер XENP, тогда как scFv-домен будет иметь другой номер XENP. Некоторые молекулы имеют три полипептида, поэтому номер XENP с компонентами используется в качестве названия. Таким образом, молекула XENP20717, которая находится в формате открывалки бутылок, содержит три последовательности, как правило, называемые "XENP20717 HC-Fab", "XENP20717 HC-scFv" и "XENP20717 LC" или их эквиваленты, хотя специалист в данной области техники сможет легко идентифицировать их посредством выравнивания последовательностей. Эти номера XENP, а также идентификаторы, находятся в перечне последовательностей и используются на фигурах. Кроме того, одна молекула, содержащая три компонента, обуславливает множество идентификаторов последовательности. Например, перечисленный Fab мономер имеет полноразмерную последовательность, вариабельную последовательность тяжелой цепи и три CDR вариабельной последовательности тяжелой цепи; легкая цепь имеет полноразмерную последовательность, вариабельную последовательность легкой цепи и три CDR вариабельной последовательности легкой цепи; а scFv-Fc-домен имеет полноразмерную последовательность, последовательность scFv, вариабельную последовательность легкой цепи, 3 CDR легкой цепи, линкер scFv, вариабельную последовательность тяжелой цепи и 3 CDR тяжелой цепи; следует обратить внимание, что все молекулы в данном случае с scFv-доменом используют один заряженный линкер scFv (+ H), хотя могут использоваться и другие. Кроме того, номенклатура наименования определенных вариабельных доменов использует формат типа "Hx.xx Lyyy", причем числа являются уникальными идентификаторами для последовательностей определенной вариабельной цепи. Таким образом, вариабельный домен Fab стороны XENP22841 представляет собой "7G8_H3.30_L1.34", что указывает на то, что вариабельный домен тяжелой цепи H3.30 объединен с доменом легкой цепи L1.34. В случае, когда эти последовательности используются как scFv, обозначение "7G8_H3.30_L1.34" указывает на то, что вариабельный домен тяжелой цепи H3.30 объединен с доменом легкой цепи L1.34 и находится в ориентации vh-линкер-vl, от N- до С-конца. Эта молекула с идентичными последовательностями вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, но в обратном порядке, будет называться "7G8_ L1.34_H3.30". Аналогичным образом, различные конструкции могут "смешивать и сопоставлять" тяжелую и легкую цепи, что будет очевидно из перечня последовательностей и фигур.

D. Определения

Для более полного понимания данного изобретения, ниже будут изложены некоторые определения. Такие определения предназначены для охвата грамматических эквивалентов.

Под "абляцией" в данном документе подразумевается снижение или удаление активности. Так, например, "абляция связывания FcγR" означает, что аминокислотный вариант Fc-области характеризуется менее 50% исходного связывания по сравнению с Fc-областью, не содержащей конкретного варианта, с предпочтительной потерей активности более чем на 70-80-90-95-98% и, в большинстве случаев, с активностью ниже уровня обнаруживаемого связывания в анализе Biacore, SPR или BLI. Особое применение для абляции связывания FcγR находят те варианты, которые приведены на фиг. 5 и, как правило, добавляются к обоим мономерам.

В данном контексте под термином "ADCC" или "антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность" подразумевается реакция, опосредованная клетками, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcγRs, распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени. ADCC коррелирует со связыванием с FcγRIIIa; усиление связывания с FcγRIIIa приводит к повышению активности ADCC.

В данном контексте под термином "ADC" или "антителозависимый клеточноопосредованный фагоцитоз" подразумевается реакция, опосредованная клетками, в которой неспецифические фагоцитарные клетки, которые экспрессируют FcγR, распознают связанное антитело в клетке-мишени и впоследствии вызывают фагоцитоз клетки-мишени.

В данном контексте под термином "антигенсвязывающий домен" или "ABD" подразумевается набор из шести определяющих комплементарность областей (CDR), которые, когда они присутствуют как часть полипептидной последовательности, специфически связывают антиген-мишень, как описано в данном документе. Таким образом, "домен, связывающий антиген контрольной точки" связывает антиген-мишень контрольной точки, как описано в данном документе. Как известно в данной области техники, эти CDR обычно присутствуют в виде первого набора вариабельных CDR тяжелой цепи (vhCDR или VHCDR) и второго набора вариабельных CDR легкой цепи (vlCDR или VLCDR), каждый из которых содержит три CDR: vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3 для тяжелой цепи и vlCDR1l, vlCDR2 и vlCDR3 для легкой цепи. CDR присутствуют в вариабельном домене тяжелой цепи и вариабельном домене легкой цепи соответственно, и вместе образуют Fv-область. (См. Таблицу 1 и соответствующее обсуждение выше для схем нумерации CDR). Таким образом, в некоторых случаях шесть CDR антигенсвязывающего домена обеспечиваются вариабельным доменом тяжелой цепи и вариабельным доменом легкой цепи. В формате "Fab" набор из 6 CDR обеспечивается двумя различными полипептидными последовательностями: вариабельного домена тяжелой цепи (vh или VH, содержащего vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3) и вариабельного домена легкой цепи (vl или VL, содержащего vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3), причем С-конец домена vh присоединен к N-концу CH1-домена тяжелой цепи, а С-конец домена vl присоединен к N-концу константного домена легкой цепи (и, таким образом, образует легкую цепь). В формате scFv, домены vh и vl являются ковалентно соединенными, как правило, посредством использования линкера ("линкер scFv"), как описано в данном документе, в одну полипептидную последовательность, которая может представлять собой (начиная с N-конца) либо "vh-линкер-vl", либо "vl-линкер-vh", причем первая из них, как правило, является предпочтительной (включая необязательные линкеры домена на каждой стороне, в зависимости от используемого формата (например, из фиг. 1). В большинстве случаев, С-конец scFv-домена присоединен к N-концу шарнира во втором мономере.

В данном контексте под термином "модификация" подразумевается замена, вставка и/или делеция аминокислоты в полипептидной последовательности или изменение на фрагмент, химически связанный с белком. Например, модификация может представлять собой измененную углеводную или ПЭГ-структуру, присоединенную к белку. В данном контексте под термином "модификация аминокислоты" подразумевается замена, вставка и/или делеция аминокислоты в полипептидной последовательности. Для внесения ясности следует отметить, если не указано иное, модификация аминокислоты всегда соответствует аминокислоте, кодируемой ДНК, например, 20 аминокислот, которые имеют кодоны в ДНК и РНК.

В данном контексте под термином "замена аминокислоты" или "замена" подразумевается замещение аминокислоты в определенном положении в исходной полипептидной последовательности на другую аминокислоту. В частности, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения, проводят замену на аминокислоту, которая не встречается в природе в конкретном положении, либо не встречается в природе в организме, либо не встречается в любом организме. Например, замена E272Y относится к варианту полипептида, в этом случае варианту Fc, в котором глутаминовая кислота в положении 272 заменяется тирозином. Для внесения ясности следует отметить, что если белок, который был сконструирован для изменения кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты, не изменяет исходную аминокислоту (например, обмен CGG (кодирующей аргинин) на CGA (все еще кодирующей аргинин) для повышения уровней экспрессии организма-хозяина), то это не является "заменой аминокислоты"; то есть, несмотря на создание нового гена, кодирующего один и тот же белок, если белок имеет ту же самую аминокислоту в определенном месте, в котором он начинался, это не является заменой аминокислоты.

В данном контексте под термином "вставка аминокислоты" или "вставка" подразумевается добавление аминокислотной последовательности в определенном положении в исходной полипептидной последовательности. Например, -233E или 233E обозначает вставку глутаминовой кислоты после положения 233 и перед положением 234. Кроме того, -233ADE или A233ADE обозначает вставку AlaAspGlu после положения 233 и перед положением 234.

В данном контексте под термином "делеция аминокислоты" или "делеция" подразумевается удаление аминокислотной последовательности в определенном положении в исходной полипептидной последовательности. Например, E233- или E233 #, E233 () или E233del обозначает делецию глутаминовой кислоты в положении 233. Кроме того, EDA233- или EDA233 # обозначает делецию последовательности GluAspAla, которая начинается в положении 233.

В данном контексте под термином "вариантный белок" или "вариант белка" подразумевается белок, который отличается от исходного белка по меньшей мере одной модификацией аминокислоты. Вариант белка имеет по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с исходным белком, но не в таком количестве, что вариантный белок не будет выравниваться с исходным белком с помощью программы выравнивания, такой как описанная ниже. В большинстве случаев вариантные белки (такие как варианты Fc-доменов и т.д., описанные в данном документе, как правило, являются идентичными с исходным белком по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, при применении программ выравнивания, описанных ниже, такой как BLAST.

Как описано ниже, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения исходный полипептид, например, исходный полипептид Fc, представляет собой человеческую последовательность дикого типа, такую как константная область тяжелой цепи или Fc-область из IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4, хотя последовательности человека с вариантами могут также служить в качестве "исходных полипептидов", например, может быть включен гибрид IgGl/2, описанный в публикации US 2006/0134105. Последовательность варианта белка по данному изобретению предпочтительно будет иметь по меньшей мере около 80% идентичности с последовательностью исходного белка, наиболее предпочтительно по меньшей мере около 90% идентичности, и более предпочтительно по меньшей мере около 95-98-99% идентичности. Соответственно, в данном контексте под термином "вариант антитела" или "вариантное антитело" подразумевается антитело, которое отличается от исходного антитела по меньшей мере одной модификацией аминокислоты; термин "вариант IgG" или "вариантный IgG" в данном контексте означает антитело, которое отличается от исходного IgG (опять же, во многих случаях, из последовательности IgG человека) по меньшей мере одной модификацией аминокислоты, а термин "вариант иммуноглобулина" или «вариантный иммуноглобулин" в данном контексте означает последовательность иммуноглобулина, которая отличается от последовательности исходного иммуноглобулина по меньшей мере одной модификацией аминокислоты. В данном контексте под термином "вариант Fc" или "вариантный Fc" подразумевается белок, содержащий модификацию аминокислоты в Fc-домене по сравнению с Fc -доменом IgG1, IgG2 или IgG4 человека.

Fc варианты по данному изобретению определяются в соответствии с модификациями аминокислот, которые их составляют. Так, например, N434S или 434S является Fc вариантом с сериновой заменой в положении 434 относительно исходного полипептида Fc, при этом нумерация соответствует индексу EU. Аналогично, M428L/N434S определяет Fc вариант с заменами M428L и N434S относительно исходного полипептида Fc. Идентичность аминокислоты WT может быть неопределенной, и в этом случае вышеупомянутый вариант обозначается как 428L/434S. Следует отметить, что порядок, в котором предусмотрены замены, является произвольным, то есть, например, N434S/M428L является тем же вариантом Fc, что и M428L/N434S, и так далее. Для всех положений, обсуждаемых в данном изобретении, которые относятся к антителам, если не указано иначе, нумерация положения аминокислоты соответствует индексу EU. Индекс EU или EU-индекс, как в схеме нумерации по Кабату или EU, относится к нумерации антител EU.

Kabat et al. собрали многочисленные первичные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей и легких цепей. Основываясь на степени сохранения последовательностей, они классифицировали отдельные первичные последовательности в CDR и каркас, а также составили их перечень (см. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al., что включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме). См. также Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85, что включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме. Модификация может представлять собой добавление, делецию или замену.

В данном контексте под термином "белок" подразумевается по меньшей мере две ковалентно присоединенные аминокислоты, которые включают белки, полипептиды, олигопептиды и пептиды. Кроме того, полипептиды, которые составляют антитела по данному изобретению, могут включать синтетическую дериватизацию одной или большего количества боковых цепей или концов, гликозилирование, ПЭГилирование, циклическую перестановку, циклизацию, линкеры с другими молекулами, слияние с белками или доменами белков и добавление пептидных тегов или меток.

В данном контексте под термином "остаток" подразумевается положение в белке и его ассоциированная идентичность аминокислот. Например, аспарагин 297 (также называемый Asn297 или N297) представляет собой остаток в положении 297 в антителе IgG1 человека.

В данном контексте под термином "Fab" или "Fab-область " подразумевается полипептид, который содержит домены иммуноглобулина VH, CH1, VL и CL, как правило, на двух разных цепях полипептида (например, VH-CH1 на одной цепи и VL- CL - на другой). Fab может относиться к этой области изолированно или может относиться к этой области в контексте биспецифического антитела по данному изобретению. В контексте Fab, Fab содержит Fv-область в дополнение к доменам CH1 и CL.

В данном контексте под термином "Fv" или "фрагмент Fv" подразумевается полипептид, который содержит VL- и VH-домены ABD. Fv-области могут быть отформатированы как Fab (как обсуждалось выше, как правило, два разных полипептида, которые также включают в себя константные области, как описано выше) и scFv, при этом домены v1 и vh объединены (как правило, с линкером, как обсуждалось в данном документе) с образованием ScFv.

В данном контексте под термином "одноцепочечный Fv" или "scFv" подразумевается вариабельный домен тяжелой цепи, ковалентно связанный с вариабельным доменом легкой цепи, как правило, с помощью линкера scFv, как обсуждалось в данном документе, с образованием scFv или scFv-домена. scFv-домен может быть в любой ориентации от N-до C-конца (vh - линкер - vl или vl - линкер - vh). В последовательностях, приведенных в перечне последовательностей и на фигурах, порядок домена vh и vl указывается в названии, например H.X L.Y означает, что от N- до C-конца порядок следующий: vh - линкер - vl, а L.Y H.X означает, что от N- до C-конца порядок следующий: vl - линкер - vh.

В данном контексте под термином "модификация подкласса IgG" или "модификация изотипа" подразумевается аминокислотная модификация, которая превращает одну аминокислоту одного изотипа IgG в соответствующую аминокислоту в другом, выровненном изотипе IgG. Например, поскольку IgG1 содержит тирозин, а IgG2 содержит фенилаланин в положении 296 EU, замена F296Y в IgG2 считается модификацией подкласса IgG.

В данном контексте под термином "не встречающаяся в природе модификация" подразумевается аминокислотная модификация, которая не является изотипической. Например, поскольку ни один из IgG человека не содержит серин в положении 434, замена 434S в IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (или их гибридах) считается модификацией, не встречающейся в природе.

В данном контексте под термином "аминокислота" и "идентичность аминокислот" подразумевается одна из 20 встречающихся в природе аминокислот, кодируемых ДНК и РНК.

В данном контексте под термином "эффекторная функция" подразумевается биохимическое явление, которое возникает в результате взаимодействия Fc-области антитела с рецептором Fc или лигандом. Эффекторные функции включают, но не ограничиваются этим, ADCC, ADCP и CDC.

В данном контексте под термином "лиганд Fc IgG" подразумевается молекула, предпочтительно полипептид, от любого организма, которая связывается с Fc-областью антитела IgG с образованием комплекса Fc/лиганд Fc. Лиганды Fc включают, но не ограничиваются этим, FcγRI, vRII, FcγRIII, FcRn, Clq, C3, маннансвязывающий лектин, маннозный рецептор, стафилококковый белок A, стрептококковый белок G и вирусный FcγR. Лиганды Fc также включают гомологи рецепторов Fc (FcRH), которые представляют собой семейство рецепторов Fc и являются гомологичными с FcγR (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190: 123-136, что включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Лиганды Fc могут включать неисследованные молекулы, которые связывают Fc. Конкретными лигандами Fc IgG являются рецепторы FcRn и Fc гамма. В данном контексте под термином "лиганд Fc" подразумевается молекула, предпочтительно полипептид, от любого организма, которая связывается с Fc-областью антитела с образованием комплекса Fc/лиганд Fc.

В данном контексте под термином "рецептор Fc-гамма", "FcγR" или "Fc-гаммаR" подразумевается любой представитель семейства белков, который связывает Fc-область антитела IgG и кодируется геном FcγR. У людей это семейство включает, но не ограничивается этим, FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc; FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIa (включая аллотипы H131 и R131), FcγRIIb (включая FcγRIIb-l и FcγRIIb-2) и FcγRIIc; и FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIb-NAl и FcγRIIb-NA2) (Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82: 57-65, что включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме), а также любые неисследованные изоформы или аллотипы FcγRs или FcγR человека. FcγR может быть из любого организма, включая, но не ограничиваясь этим, людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян. FcγR мыши включает, но не ограничивается этим, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIII-2 (CD 16-2), а также любые неисследованные изоформы или аллотипы FcγRs или FcγR мыши.

В данном контексте под термином "FcRn" или "неонатальный рецептор Fc" подразумевается белок, который связывает Fc-область антитела IgG и кодируется по меньшей мере частично геном FcRn. FcRn может быть из любого организма, включая, но не ограничиваясь ими, людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян. Как известно в данной области техники, функциональный белок FcRn содержит два полипептида, часто называемых тяжелой цепью и легкой цепью. Легкая цепь представляет собой бета-2-микроглобулин, а тяжелая цепь кодируется геном FcRn. Если не указано иначе, FcRn или белок FcRn относится к комплексу тяжелой цепи FcRn с бета-2-микроглобулином. Различные FcRn варианты применяются для усиления связывания с рецептором FcRn, а в некоторых случаях - для удлинения периода полужизни в сыворотке. "Вариант FcRn" является таким вариантом, который усиливает связывание с рецептором FcRn, и пригодные FcRn варианты продемонстрированы ниже.

В данном контексте под термином "исходный полипептид" подразумевается начальный полипептид, который затем модифицируют для получения варианта. Исходный полипептид может представлять собой встречающийся в природе полипептид или вариант или модифицированную версию встречающегося в природе полипептида. Соответственно, в данном контексте под термином "исходный полипептид" подразумевается немодифицированный полипептид иммуноглобулина, который модифицирован для получения варианта, а под термином "исходное антитело" в данном контексте подразумевается немодифицированное антитело, которое модифицировано для получения варианта антитела. Следует отметить, что "исходное антитело" включает известные коммерческие, рекомбинантно продуцируемые антитела, как описано ниже. В этом контексте термин "исходный Fc-домен" будет относиться к рассмотренному варианту; таким образом, "вариантный Fc-домен IgG1 человека" сравнивается с исходным Fc-доменом IgG1 человека, "вариантный Fc-домен IgG4 человека" сравнивается с исходным Fc-доменом IgG4 человека и т.д.

В данном контексте под термином "Fc" или " Fc-область " или "Fc-домен" подразумевается полипептид, содержащий CH2-CH3-домены молекулы IgG, и, в некоторых случаях, включает шарнир. В нумерации EU, CH2-CH3-домен IgG1 человека содержит аминокислоты с 231 по 447, а шарнир включает от 216 до 230. Таким образом, определение "Fc-домен" включает как аминокислоты 231-447 (CH2-CH3), так и 216-447 (шарнир-CH2-CH3) или их фрагменты. "Фрагмент Fc" в данном контексте может содержать меньше аминокислот из одного или обоих из N- и С-концов, но все же сохраняет способность образовывать димер с другим Fc-доменом или фрагментом Fc, который может быть обнаружен с помощью стандартных способов, как правило, на основе размера (например, неденатурирующая хроматография, эксклюзионная хроматографии и т.д.). Fc-домены IgG человека являются особенно пригодными для данного изобретения и могут быть Fc-доменами из IgG1, IgG2 или IgG4 человека.

"Вариантный Fc-домен" содержит модификации аминокислот по сравнению с исходным Fc-доменом. Таким образом, "вариантный Fc-домен IgG1 человека" представляет собой домен, который содержит модификации аминокислот (как правило, аминокислотные замены, хотя в случае абляционных вариантов включаются делеции аминокислот) по сравнению с Fc-доменом IgG1 человека. В большинстве случаев вариантные Fc-домены имеют по меньшей мере около 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99 процентов идентичности с соответствующим исходным Fc-доменом IgG человека (подтвержденной с помощью алгоритмов определения идентичности, рассмотренных ниже, с одним вариантом осуществления, использующим алгоритм BLAST, как известный в данной области техники, с использованием параметров по умолчанию). В альтернативном случае, вариантные Fc-домены могут иметь от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 модификаций аминокислот по сравнению с исходным Fc-доменом. Дополнительно, как обсуждалось в данном документе, вариантные Fc-домены по данному изобретению продолжают сохранять способность образовывать димер с другим Fc-доменом, что измеряется с помощью известных способов, описанных в данном документе, таких как неденатурирующий гель-электрофорез.

В данном контексте под термином "константная область тяжелой цепи" подразумевается часть антитела CH1-шарнир- CH2-CH3 (или его фрагменты), исключая вариабельный домен тяжелой цепи; в EU-нумерации IgG1 человека это аминокислоты 118-447. В данном контексте под термином "фрагмент константной области тяжелой цепи" подразумевается константная область тяжелой цепи, которая содержит меньше аминокислот либо из одного, либо из обоих из N- и С-концов, но все еще продолжает сохранять способность образовывать димер с другой константной областью тяжелой цепи.

В данном контексте под термином "положение" подразумевается местоположение в последовательности белка.

Положения могут быть пронумерованы последовательно или в соответствии с установленным форматом, например, индекс EU для нумерации антител.

В данном контексте под термином "антиген-мишень" подразумевается молекула, которая специфически связана антигенсвязывающим доменом, содержащим вариабельные области данного антитела. Как обсуждается ниже, в данном случае антигены-мишени являются белками ингибитора контрольной точки.

Под термином "соответствие цепей" в контексте мономеров гетеродимерных антител по данному изобретению в данном документе подразумевается, что, подобно двум цепям ДНК, которые являются "соответствующими", гетеродимеризационные варианты включены в каждый мономер, чтобы сохранить способность к "соответствию" с образованием гетеродимеров. Например, если некоторые pI варианты внесены в конструкцию мономера A (например, повышая значение pI), то стерические варианты, которые являются «парами зарядов» и могут быть использованы, также не препятствуют pI вариантам, например, варианты заряда, которые повышают значение pI, помещают на одну и ту же "цепь" или "мономер" для сохранения обеих функциональных возможностей. Аналогичным образом, что касается "искаженных" вариантов, которые входят в пары набора, более подробно описанные ниже, квалифицированный специалист в данной области техники будет учитывать возможность применения pI при принятии решения, в какую цепь или мономер следует вводить один набор пары, в результате чего разделение pI также максимизируется с применением pI искажений.

В данном контексте под термином "клетка-мишень" подразумевается клетка, которая экспрессирует антиген-мишень.

Под термином "клетка-хозяин" в контексте продуцирования биспецифического антитела в соответствии с данным изобретением подразумевается клетка, которая содержит экзогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие компоненты биспецифического антитела, и способна экспрессировать биспецифическое антитело в пригодных условиях. Пригодные клетки-хозяева обсуждаются ниже.

В данном контексте под термином "вариабельная область" или "вариабельный домен" подразумевается область иммуноглобулина, которая содержит один или большее количество доменов Ig, которые по существу кодируются любым из генов VK, нл и/или VH, которые составляют генетические локусы каппа, лямбда и тяжелой цепи иммуноглобулина соответственно, и содержат CDR, которые придают антигенную специфичность. Таким образом, "вариабельный домен тяжелой цепи" в паре с "вариабельным доменом легкой цепи" образуют антигенсвязывающий домен ("ABD"). Кроме того, каждый вариабельный домен содержит три гипервариабельные области ("определяющие комплементарность области", "CDR") (vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3 для вариабельного домена тяжелой цепи и vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3 для вариабельного домена легкой цепи) и четыре каркасных области (FR), расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

В данном контексте под термином "дикий тип или WT" подразумевается последовательность аминокислот или последовательность нуклеотидов, которая обнаруживается в природе, включая аллельные вариации. Белок WT имеет последовательность аминокислот или последовательность нуклеотидов, которая не была намеренно модифицирована.

В данном изобретении предлагается ряд доменов антитела, которые характеризуются идентичностью последовательности с доменами антитела человека. Идентичность последовательности между двумя подобными последовательностями (например, вариабельные домены антител) можно измерить с помощью таких алгоритмов, как Smith, TF & Waterman, MS (1981) "Comparison Of Biosequences," Adv. Appl. Math. 2: 482 [алгоритм локальной гомологии]; Needleman, SB & Wunsch, CD. (1970) "A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins," J. Mol. Biol.48: 443 [алгоритм выравнивания гомологии], Pearson, WR & Lipman, DJ (1988) "Improved Tools For Biological Sequence Comparison," Proc. Natl. Acad. Sci. (США) 85: 2444 [поиск метода подобия]; или Altschul, SF et al, (1990) "Basic Local Alignment Search Tool," J. Mol. Biol. 215: 403-10, алгоритм "BLAST", см. https:/;ѕiast.ncbi.nim.nih.go /Biast.cgi. При применении любого из вышеупомянутых алгоритмов используются параметры по умолчанию (для длины окна, штрафа за пропуск в последовательности и т.д.). В одном варианте осуществления данного изобретения идентичность последовательности оценивают с помощью алгоритма BLAST, используя параметры по умолчанию.

Антитела по данному изобретению, как правило, являются выделенными или рекомбинантными.

Термин "выделенный" при применении для описания различных полипептидов, охарактеризованных в данном документе, означает полипептид, который был идентифицирован, отделен и/или выделен из клетки или культуры клеток, в которой он экспрессировался. Обычно выделенный полипептид получают по меньшей мере в результате одного этапа очистки. "Выделенное антитело" относится к антителу, которое по существу не содержит других антител, имеющих разные антигенные специфичности. Термин "рекомбинантное" означает, что антитела генерируются с помощью методов рекомбинантных нуклеиновых кислот в экзогенных клетках-хозяевах, и они также могут быть выделены.

Термины "специфическое связывание" или "специфически связывается с" или "специфичный для" конкретного антигена или эпитопа означает связывание, которое измеримо отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может быть измерено, например, путем определения связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая, как правило, представляет собой молекулу с подобной структурой, не имеющей связывающей активности. Например, специфическое связывание может быть определено с помощью конкурентного анализа с контрольной молекулой, которая является подобной с мишенью.

Специфическое связывание с конкретным антигеном или эпитопом можно выявить, например, с помощью антитела, имеющего значение KD для антигена или эпитопа по меньшей мере около 10^-4 M, по меньшей мере около 10^-5 M, по меньшей мере около 10^-6 M, по меньшей мере около 10^-7 M, по меньшей мере около 10^-8 M, по меньшей мере около 10^-9 M, в альтернативном варианте по меньшей мере около 10^-10 M, по меньшей мере около 10^-11 M, по меньшей мере около 10^-12 M или более, при этом KD относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия "антитело-антиген". Как правило, антитело, которое специфически связывает антиген, будет иметь значение KD, которое в 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5000-, 10000- или более раз больше для контрольной молекулы относительно антигена или эпитопа.

Кроме того, специфическое связывание конкретного антигена или эпитопа можно выявить, например, с помощью антитела, имеющего значение KA или Ka для антигена или эпитопа, по меньшей мере, в 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5000-, 10 000- или более раз больше для эпитопа относительно контроля, при этом KA или Ka относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия "антитело-антиген". Аффинность связывания, как правило, измеряют с помощью анализа Biacore, SPR или BLI.

E. Антитела

Данное изобретение относится к генерации биспецифических антител контрольных точек, которые связывают два разных антигена контрольных точек, как обсуждается в данном документе. Как обсуждается ниже, обычно применяется термин "антитело". Антитела, которые находят применение в данном изобретении, могут принимать ряд форматов, как описано в данном документе, включая традиционные антитела, а также производные, фрагменты и миметики антител, описанные в данном документе и изображенные на фигурах.

Структурные единицы традиционных антител, как правило, содержат тетрамер. Каждый тетрамер, как правило, состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну "легкую" цепь (как правило, с молекулярной массой около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (как правило, с молекулярной массой около 50-70 кДа). Легкие цепи человека классифицируются как легкие цепи каппа и лямбда. Данное изобретение относится к биспецифическим антителам, которые, как правило, основаны на классе IgG, который имеет несколько подклассов, включая, но не ограничиваясь ими, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В большинстве случаев IgG1, IgG2 и IgG4 применяются чаще, чем IgG3. Следует отметить, что IgG1 имеет разные аллотипы с полиморфизмами в 356 (D или E) и 358 (L или M). Представленные в данном документе последовательности используют аллотип 356E/358M, однако другой аллотип также включен в данный документ. То есть любая последовательность, включающая Fc-домен IgG1, описанный в данном документе, может содержать 356D/358L, заменяющий аллотип 356E/358M.

Кроме того, многие из антител, описанных в данном документе, имеют по меньшей мере один из цистеинов в положении 220, замещенный серином; как правило, это наблюдается на стороне "scFv мономера" для большинства последовательностей, приведенных в данном документе, хотя это также может наблюдаться на стороне "Fab мономера" или в обеих сторонах, для уменьшения образования дисульфида. Один или оба из этих замененных цистеинов (C220S) являются специально включенными в указанные последовательности, описанные в данном документе.

Таким образом, термин "изотип" в данном контексте означает любой из подклассов иммуноглобулинов, определяемых химическими и антигенными характеристиками их константных областей. Следует понимать, что терапевтические антитела могут также содержать гибриды изотипов и/или подклассов. Например, как продемонстрировано в публикации US 2009/0163699, включенной в данный документ посредством ссылки, в данном изобретении применяются гибриды IgG1/G2 человека.

Гипервариабельная область обычно охватывает аминокислотные остатки приблизительно от аминокислотных остатков 24-34 (LCDR1, "L" обозначает легкую цепь), 50-56 (LCDR2) и 89- 97 (LCDR3) в вариабельной области легкой цепи и приблизительно около 31-35 В (HCDR1; "№" обозначает тяжелую цепь), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в вариабельной области тяжелой цепи, Kabat et al, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) и/или эти остатки, образующие гипервариабельную петлю (например, остатки 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) и 96-101 (HCDR3) в вариабельной области тяжелой цепи, Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917. Специфические CDR по данному изобретению описаны ниже.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, точная нумерация и размещение CDR могут быть разными в разных системами нумерации. Однако следует понимать, что описание последовательности вариабельной области тяжелой цепи и/или последовательности вариабельной области легкой цепи включает в себя описание ассоциированных (свойственных) CDR. Соответственно, описание каждой вариабельной области тяжелой цепи представляет собой описание vhCDR (например, vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3), а описание каждой вариабельной области легкой цепи представляет собой описание vlCDR (например, vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3). Удобное сравнение нумерации CDR приведено ниже, см. Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(l):55-77 (2003):

Таблица 1

	Кабат + Чотиа	IMGT	Кабат	AbM	Чотиа	Контакт	Xencor
vhCDR1	26-35	27-38	31-35	26-35	26-32	30-35	27-35
vhCDR2	50-65	56-65	50-65	50-58	52-56	47-58	54-61
vhCDR3	95-102	105-117	95-102	95-102	95-102	93-101	103-116
vlCDR1	24-34	27-38	24-34	24-34	24-34	30-36	27-38
vlCDR2	50-56	56-65	50-56	50-56	50-56	46-55	56-62
vlCDR3	89-97	105-117	89-97	89-97	89-97	89-96	97-105

В данном описании, как правило, применяется система нумерации по Кабату, если это относится к остатку в вариабельной области (приблизительно, остатки 1-107 вариабельной области легкой цепи и остатки 1-113 вариабельной области тяжелой цепи), и система нумерации EU для Fc-областей (например, Kabat et al., выше (1991)).

Другим типом домена Ig тяжелой цепи является шарнирная область. В данном контексте под термином "шарнир" или "шарнирная область" или "шарнирная область антитела" подразумевается гибкий полипептид, содержащий аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела. Структурно CH1-домен IgG заканчивается в положении 215 по нумерации EU, а CH2-домен IgG начинается в положении остатка 231 по нумерации EU. Таким образом, что касается шарнира антитела IgG в данном изобретении, то он включает в себя положения 216 (E216 в IgG1) до 230 (p230 в IgG1), при этом нумерация соответствует индексу EU, как по Кабату. В некоторых случаях применяется "фрагмент шарнира", который содержит меньше аминокислот на одном или обоих из N- и С-концов шарнирного домена. Как отмечено в данном документе, pI варианты могут быть внесены и в шарнирную область.

Как правило, легкая цепь содержит два домена, вариабельный домен легкой цепи (содержащий CDR легкой цепи и образующий Fv-область вместе с вариабельными доменами тяжелой цепи), и константную область легкой цепи (часто называемую CL или CK).

Другая область, представляющая интерес для дополнительных замещений, описанная ниже, представляет собой Fc-область.

В данном изобретении предлагается большое количество различных наборов CDR. В этом случае "полный набор CDR" содержит три вариабельных CDR легкой цепи и три вариабельных CDR тяжелой цепи, например, vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3. Они могут быть частью большего вариабельного домена легкой цепи или вариабельного домена тяжелой цепи, соответственно. Кроме того, как более подробно описано в данном документе, вариабельный домен легкой цепи или вариабельный домен тяжелой цепи могут находится на отдельных полипептидных цепях, когда применяется тяжелая и легкая цепь (например, когда применяются Fab), или на одной полипептидной цепи в случае последовательностей scFv.

CDR способствуют образованию антигенсвязывающего или, более конкретно, эпитопсвязывающего участка антител. Термин "эпитоп" относится к детерминанте, которая взаимодействует с определенным антигенсвязывающим участком в вариабельной области молекулы антитела, известным как паратоп. Эпитопы состоят из группировок молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и обычно имеют специфические структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Один антиген может иметь более чем один эпитоп.

Эпитоп может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании (также называемые иммунодоминантным компонентом эпитопа), и другие аминокислотные остатки, которые непосредственно не вовлечены в связывание, такие как аминокислотные остатки, которые эффективно специфически блокируются антигенсвязывающим пептидом; другими словами, аминокислотный остаток находится в пределах области распознавания специфического антигенсвязывающего пептида.

Эпитопы могут быть конформационными или линейным. Конформационный эпитоп продуцируется пространственно совмещенными аминокислотами из различных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп продуцируется смежными аминокислотными остатками в полипептидной цепи. Конформационные и неконформационные эпитопы могут отличаться тем, что связывание с первым, но не последним, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей.

Как правило, эпитоп включает по меньшей мере 3, а в большинстве случаев по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Антитела, которые распознают один и тот же эпитоп, могут быть верифицированы простым иммунологическим анализом, демонстрирующим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью, например, "сортировка". Как указано ниже, данное изобретение не только включает в себя перечисленные антигенсвязывающие домены и описанные в данном документе антитела, но и те, которые конкурируют за связывание с эпитопами, связанными с перечисленными антигенсвязывающими доменами.

Таким образом, в данном изобретении предлагаются различные доменам антител. Как описано в данном документе и известно в данной области техники, гетеродимерные антитела по данному изобретению содержат различные домены в пределах тяжелой и легкой цепей, которые также могут перекрываться. Эти домены включают, но не ограничиваются ими, Fc-домен, CH1-домен, CH2-домен, CH3-домен, шарнирный домен, константный домен тяжелой цепи (CH1-шарнир-Fc-домен или CH1-шарнир-CH2-CH3), вариабельный домен тяжелой цепи, вариабельный домен легкой цепи, константный домен легкой цепи, Fab-домены и scFv-домены.

Таким образом, "Fc-домен" включает в себя -CH2-CH3-домен и, необязательно, шарнирный домен (-H-CH2-CH3). В вариантах осуществления данного изобретения, когда scFv-область присоединяют к Fc-домену, это является С-концом конструкции scFv, которую присоединяют ко всему или части шарнира Fc-домена; например, его обычно присоединяют к последовательности EPKS, которая является началом шарнира. Тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи и константный домен, который включает в себя CH1 -необязательный шарнир - Fc-домен, содержащий CH2-CH3. Легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. ScFv содержит вариабельный домен тяжелой цепи, линкер scFv и вариабельный домен легкой цепи. В большинстве конструкций и последовательностей, описанных в данном документе, С-конец вариабельной тяжелой цепи присоединен к N-концу линкера scFv, С-конец которого присоединен к N-концу вариабельной легкой цепи (N-vh-линкер-vl-C), хотя это можно переключить (N-vl-линкер-vh-C).

Некоторые варианты осуществления данного изобретения содержат по меньшей мере один scFv-домен, который, хотя и не встречается в природе, обычно включает в себя домен вариабельной тяжелой цепи и домен вариабельной легкой цепи, соединенные вместе с помощью линкера scFv. Как указано в данном документе, в то время как scFv-домен, как правило, размещается от N- до С-конца, ориентированного как vh - линкер scFv - vl, этот порядок может быть изменен в обратном направлении для любого из scFv-доменов (или сконструированных с применением последовательностей vh и vl из Fab) до vl - линкер scFv - vh, с необязательными линкерами на одном или обоих концах в зависимости от формата (см., в целом, фиг. 1).

Как продемонстрировано в данном документе, существует ряд пригодных линкеров (для применения в качестве либо линкеров домена, либо линкеров scFv), которые можно применять для ковалентного присоединения указанных доменов, включая традиционные пептидные связи, получаемые с помощью рекомбинантных методов. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения пептид линкера может преимущественно включать следующие аминокислотные остатки: Gly, Ser, Ala или Thr. Пептид линкера должен иметь длину, достаточную для связывания двух молекул таким образом, чтобы они принимали правильную конформацию относительно друг друга, и в результате сохраняли желаемую активность. В одном варианте осуществления данного изобретения линкер имеет длину от около 1 до 50 аминокислот, предпочтительно от около 1 до 30 аминокислот в длину. В одном варианте осуществления данного изобретения можно применять линкеры длиной от 1 до 20 аминокислот, причем в некоторых вариантах осуществления данного изобретения находят применение линкеры длиной от около 5 до около 10 аминокислот. Пригодные линкеры включают глицин-сериновые полимеры, включая, например, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 37756), (GGGGS)n (SEQ ID NO: 37757), и (GGGS)n (SEQ ID NO: 37758), где n представляет собой целое число, по меньшей мере число один (и, как правило, от 3 до 4), глицин-аланиновых полимеров, аланин-сериновых полимеров и других гибких линкеров. В альтернативном варианте, в качестве линкеров можно применять множество небелковых полимеров, включая, но не ограничиваясь ими, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля.

Другие последовательности линкеров могут включать любую последовательность любой длины домена CL/CH1, но не все остатки CL/CH1 домена; например, первые 5-12 аминокислотных остатков доменов CL/CH1. Линкеры могут быть получены из легкой цепи иммуноглобулина, например, CK или C. Линкеры могут быть получены из тяжелых цепей иммуноглобулина любого изотипа, включая, например, Cy, Cy2, Cy3, Cy4, Cal, Ca2, C5, Cs и Пм. Последовательности линкеров также могут быть получены из других белков, таких как Ig-подобные белки (например, TCR, FcR, KIR), а также могут быть последовательностями, полученными из шарнирной области, и другими природными последовательностями из других белков.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения линкер является "линкером для доменов", который применяется для связывания любых двух доменов вместе, как описано в данном документе. Например, на фиг. 1F может быть линкер для доменов, присоединяющий С-конец CH1-домена Fab к N-концу scFv, с другим необязательным линкером для доменов, присоединяющим C-конец scFv к CH2-домену (хотя во многих вариантах осуществления данного изобретения в качестве этого линкера для доменов применяется шарнир). Несмотря на то, что можно применять любой пригодный линкер, во многих вариантах осуществления данного изобретения в качестве линкера для доменов используют глицин-сериновый полимер, включая, например, (GS) n, (GSGGS) n (SEQ ID NO: 37756), (GGGGS) n (SEQ ID NO: 37757) и (GGGS) n (SEQ ID NO: 37758), где n представляет собой целое число, по меньшей мере число один (и, как правило, от 3 до 4-5), а также любую пептидную последовательность, которая обеспечивает рекомбинантное присоединение двух доменов с достаточной длиной и гибкостью, что позволит каждому домену сохранить свою биологическую функцию. В некоторых случаях и с уделением особого внимания "соответствию цепей", как описано ниже, можно применять заряженные линкеры для доменов, применяемые в некоторых вариантах осуществления линкеров scFv.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения линкер представляет собой линкер scFv, применяемый для ковалентного присоединения доменов vh и vl, как обсуждается в данном документе. Во многих случаях линкером scFv является заряженный линкер scFv, определенное количество которых приведено на фиг. 7. [00189] Соответственно, в данном изобретении дополнительно предлагаются заряженные линкеры scFv для облегчения разделения в pI между первым и вторым мономерами. То есть, в результате включения заряженного линкера scFv, как положительного, так и отрицательного (или того и другого, в случае каркасов, которые используют scFv на разных мономерах), мономер, содержащий указанный заряженный линкер, может изменять pI без внесения дальнейших изменений в Fc-домены. Эти заряженные линкеры могут быть заменены на любые стандартные линкеры, содержащие scFv. Опять же, как будет понятно специалистам в данной области техники, заряженные линкеры scFv применяются на правильной "цепи" или мономере в соответствии с желаемыми изменениями в pI. Например, как обсуждается в данном документе, для получения гетеродимерного антитела в формате "тройного F", вычисляют исходное значение pI Fv-области для каждого из желаемых антигенсвязывающих доменов, и один выбирают так, чтобы сделать scFv, и в зависимости от pI, выбирают либо положительный, либо отрицательные линкеры.

Заряженные линкеры для доменов также можно применять для увеличения pI-разделения мономеров по данному изобретению, и, следовательно, те линкеры, которые включены в фиг. 7, можно применять в любом варианте осуществления, в котором используется линкер.

В частности, форматы, проиллюстрированные на фиг. 1, представляют собой антитела, обычно называемые "гетеродимерными антителами", что означает, что белок имеет по меньшей мере две связанные последовательности Fc, самособирающиеся в гетеродимерный Fc-домен и по меньшей мере две Fv-области, будь то Fab или scFv.

F. Химерные и гуманизированные антитела

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитела по данному изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи от гена иммуноглобулина тяжелой цепи конкретной зародышевой линии и/или вариабельную область легкой цепи от гена иммуноглобулина легкой цепи конкретной зародышевой линии. Например, такие антитела могут содержать или состоять из антитела человека, содержащего вариабельные области тяжелой или легкой цепи, которые являются "продуктами" или "производными от" последовательности конкретной зародышевой линии. Антитело человека, которое является "продуктом" или "производным от" последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, можно идентифицировать как таковое, путем сравнения аминокислотной последовательности антитела человека с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека и выбора последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, являющейся наиболее близкой по последовательности (то есть с наибольшим % идентичности) с последовательностью антитела человека (с помощью способов, описанных в данном документе). Антитело человека, которое является "продуктом" или "производным от " последовательности иммуноглобулина конкретной зародышевой линии человека может содержать аминокислотные различия по сравнению с последовательностью зародышевой линии, например, из-за естественных соматических мутаций или преднамеренного введения сайт-направленной мутации. Однако гуманизированное антитело является, как правило, по меньшей мере на 90% идентичным по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном зародышевой линии человека, и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицируют антитело как производное от последовательностей человека по сравнению с аминокислотными последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии других видов (например, последовательностями зародышевой линии мыши). В некоторых случаях гуманизированное антитело может характеризоваться по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% или даже по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Как правило, гуманизированное антитело, производное от последовательности конкретной зародышевой линии человека, будет характеризоваться не более чем 10-20 аминокислотными отличиями от аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии человека (до введения любого из вариантов: искаженных, pI и абляционных, описанных в данном документе; то есть, до введения вариантов по данному изобретению, количество вариантов, как правило, является небольшим). В некоторых случаях гуманизированное антитело может характеризоваться не более чем 5 или даже не более чем 4, 3, 2 или 1 аминокислотными отличиями от аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии (опять же, до введения любого из вариантов: искаженных, pI и абляционных, описанных в данном документе, то есть, до введения вариантов по данному изобретению, количество вариантов, как правило, является небольшим).

В одном варианте осуществления данного изобретения исходное антитело сродство характеризуется созревшей аффинностью, как известно в данной области техники. Для гуманизации и созревания аффинности можно применять способы на основе структуры, например, как описано в USSN 11/004590. Способы на основе отбора можно применять для гуманизации и/или созревания аффинности вариабельных областей антитела, включая, но не ограничиваясь ими, способы, описанные в Wu et al, 1999, J. Mol. Biol. 294: 151 -162; Baca et al, 1997, J. Biol. Chem. 272(16): 10678-10684; Rosok et al, 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 2261 1-22618; Rader et al, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al, 2003, Protein Engineering 16(10):753-759, все из которых включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Другие способы гуманизации могут включать прививание только частей CDR, включая, но не ограничиваясь ими, способы, описанные в USSN 09/810510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169: 1 119-1 125; De Pascalis et al, 2002, J. Immunol. 169: 3076-3084, все из которых включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

IV. Гетеродимерные антитела

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются гетеродимерные антитела контрольной точки, которые используют две различные последовательности варианта Fc тяжелой цепи, которые будут самособираться с образованием гетеродимерных доменов Fc и гетеродимерных антител.

Данное изобретение относится к новым конструкциям для получения гетеродимерных антител, которые позволяют связываться с более чем одним антигеном контрольной точки или лигандом, например, для обеспечения биспецифического связывания. Конструкции гетеродимерных антител основаны на характерном признаке "самосборки" двух Fc-доменов тяжелых цепей антител, например, двух "мономеров", которые собираются в "димер". Гетеродимерные антитела получают путем изменения аминокислотной последовательности каждого мономера, как более подробно описано ниже. Таким образом, данное изобретение, как правило, направлено на создание гетеродимерных антител контрольных точек, которые могут совместно взаимодействовать с антигенами несколькими способами, на основе вариантов аминокислот в константных областях, которые различны для каждой цепи, с целью содействия гетеродимерному образованию и/или обеспечения легкости очистки гетеродимеров по сравнению с гомодимерами.

Таким образом, в данном изобретении предлагаются биспецифические антитела. Существующей проблемой в технологиях создания антител является стремление создать "биспецифические" антитела, которые одновременно связываются с двумя различными антигенами, как правило, тем самым позволяя приблизить различные антигены и получить новые функции и новые методы лечения. В большинстве случаев эти антитела получают путем включения генов для каждой тяжелой и легкой цепи в клетки-хозяева. Как правило, это приводит к образованию желаемого гетеродимера (А-В), а также двух гомодимеров (А-А и В-В (без включения гетеродимерных продуктов легкой цепи)).

Однако основным препятствием в создании биспецифических антител является трудность в очистке гетеродимерных антител от гомодимерных антител и/или систематические ошибки образования гетеродимера по сравнению с образованием гомодимеров.

Существует ряд механизмов, которые можно применять для создания гетеродимеров по данному изобретению. Кроме того, как будет понятно специалистам в данной области техники, эти механизмы можно объединить для обеспечения высокой гетеродимеризации. Таким образом, варианты аминокислот, которые приводят к продукции гетеродимеров, называются "гетеродимеризационными вариантами". Как обсуждается ниже, гетеродимеризационные варианты могут включать в себя стерические варианты (например, варианты "выступы и впадины" или "искаженные" варианты, описанные ниже, и варианты "пары зарядов", описанные ниже), а также "pI варианты", которые позволяют очищать гомодимеры от гетеродимеров. Как в общих чертах описано в публикации WO2014/145806, включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме, и конкретно ниже, относительно обсуждения "гетеродимеризационных вариантов", пригодными механизмами для гетеродимеризации являются "выступы и впадины" ("KIH", иногда называемые в данном документе "искаженными" вариантами (см. обсуждение в WO2014 / 145806), "электростатическое взаимодействие" или "пары зарядов", как описано в WO2014 / 145806, pI варианты, как описано в WO 02414/145806, и общие дополнительные Fc варианты, как описано в WO 02414/145806 и ниже.

В данном изобретении существует несколько основных механизмов, которые могут упростить очистку гетеродимерных антител; один из них основан на применении pI вариантов, так что каждый мономер имеет различное значение pI, что способствует изоэлектрической очистке димерных белков A-A, A-B и B-B. В альтернативном варианте, некоторые форматы каркаса, такие как формат "тройного F", также способствуют разделению на основе размера. Как дополнительно описано ниже, также возможно "сместить" образование гетеродимеров по сравнению с гомодимерами. Таким образом, комбинация вариантов пространственной гетеродимеризации и pI вариантов или пары зарядов находит свое определенное применение в данном изобретении.

В общем, варианты осуществления конкретного применения в данном изобретении основаны на наборах вариантов, которые включают в себя искаженные варианты, способствующие преобладанию гетеродимерных образований над гетеродимерными образованиями в сочетании с pI вариантами, которые увеличивают разность pI между двумя мономерами для облегчения очистки гетеродимеров от гомодимеров.

Кроме того, как более подробно описано ниже, в зависимости от формата гетеродимерного антитела, могут применяться pI варианты, которые могут содержаться либо в константных доменах и/или Fc-доменах мономера, либо в заряженных линкерах, либо линкерах домена, либо линкерах scFv. То есть, каркасы, которые используют scFv (s), такие как формат "тройного F", могут включать в себя заряженные линкеры scFv (положительные или отрицательные), которые дают дополнительное повышение pI для целей очистки. Как будет понятно специалистам в данной области техники, некоторые форматы "тройного F" являются пригодными только с заряженными линкерами scFv и без дополнительных корректировок pI, хотя в данном изобретении также предлагается применение pI вариантов, которые находятся на одном или обоих мономерах и/или также на заряженных линкерах домена. Кроме того, дополнительная аминокислотная инженерия для альтернативных функциональных возможностей также может придавать изменения pI, такие как Fc варианты, FcRn и KO.

В данном изобретении, в котором для обеспечения очистки гетеродимерных белков используется pI в качестве механизма разделения, варианты аминокислот могут быть введены в один или оба мономерных полипептида; то есть pI одного из мономеров (называемого в данном документе для простоты как "мономер A") может быть спроектирована отдельно от мономера B, или оба мономера A и B могут быть изменены, с повышением pI мономера A и снижением pI мономера B. Как обсуждалось, изменения pI одного или обоих мономеров можно осуществить путем удаления или добавления заряженного остатка (например, нейтральную аминокислоту заменяют на положительно или отрицательно заряженный аминокислотный остаток, например, глицин на глутаминовую кислоту), изменения заряженного остатка с положительного или отрицательного на противоположный заряд (например, аспарагиновую кислоту заменяют на лизин) или изменение заряженного остатка на нейтральный остаток (например, потеря заряда; замена лизина на серин). Ряд этих вариантов продемонстрирован на фигурах.

Соответственно, в этом варианте осуществления данного изобретения предлагается внесение достаточного изменения в pI по меньшей мере в одном из мономеров с той целью, чтобы гетеродимеры можно было отделить от гомодимеров. Как будет понятно специалистам в данной области техники, и, как обсуждается ниже, это можно сделать, применяя константную область тяжелой цепи дикого типа и область варианта, которая была спроектирована так, чтобы либо повышать, либо снижать ее pI (% масс. A- + B или % масс. A - -B), либо путем увеличения одной области и уменьшения другой области (A + -B- или A-B +).

Таким образом, как правило, компонент некоторых вариантов осуществления данного изобретения представляет собой варианты аминокислот в константных областях антител, которые направлены на изменение изоэлектрической точки (pI) по меньшей мере одного, если не обоих, мономеров димерного белка с образованием "pI антитела" путем включения аминокислотных замен ("pI вариантов " или "pI замен") в один или оба из мономеров. Как показано в данном документе, разделение гетеродимеров от двух гомодимеров может быть выполнено, если pI двух мономеров отличаются всего на 0,1 единицы рН, с 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 или больше от всего обнаруженного применения в данном изобретении.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, количество pI вариантов, которые должны быть включены в каждый или оба мономера для получения надлежащего разделения, будет частично зависеть от начального значения pI компонентов, например, в формате "тройного F", начального значения pI scFv и Fab, представляющих интерес. То есть, чтобы определить, какой мономер необходимо сконструировать или в каком "направлении" (например, более положительном или более отрицательном), вычисляются последовательности Fv двух антигенов-мишеней и принимается решение брать их оттуда. Как известно в данной области техники, различные Fv будут иметь разные начальные значения pI, которые используются в данном изобретении. В общем, как указано в данном документе, pI спроектированы так, чтобы получить общую разность pI каждого мономера по меньшей мере около 0,1 log, причем диапазон от 0,2 до 0,5 является предпочтительным, как указано в данном документе.

Кроме того, как будет понятно специалистам в данной области техники и описано в данном документе, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения гетеродимеры могут быть отделены от гомодимеров на основе размера. Как проиллюстрировано на фиг. 1, например, некоторые из форматов позволяют разделять гетеродимеры и гомодимеры на основе размера.

A. Гетеродимеризационные варианты

В данном изобретении предлагаются гетеродимерные белки, включая гетеродимерные антитела в различных форматах, которые используют гетеродимерные варианты с целью обеспечения гетеродимерного образования и/или очищения от гомодимеров.

Существует множество пригодных пар наборов гетеродимеризационных искаженных вариантов. Эти варианты входят в "пары" "наборов". То есть один набор пары включен в первый мономер, а другой набор пары включен во второй мономер. Следует отметить, что эти наборы не обязательно функционируют как варианты "выступы и впадины" со взаимно однозначным соответствием между остатком на одном мономере и остатком на другом; то есть эти пары наборов образуют поверхность раздела между двумя мономерами, которая стимулирует образование гетеродимера и препятствует образованию гомодимера, обеспечивая процентное количество гетеродимеров, которые спонтанно формируются в биологических условиях, более 90%, а не ожидаемые 50% (гомодимер 25% A/A: 50% гетеродимер A/B: 25% гомодимер B/B).

B. Стерические варианты

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения образование гетеродимеров может быть облегчено путем добавления стерических вариантов. То есть, в результате изменения аминокислот в каждой тяжелой цепи, различные тяжелые цепи более склонны связываться с образованием гетеродимерной структуры, чем с образованием гомодимеров, с теми же аминокислотными последовательностями Fc. Пригодные стерические варианты включены в фигуры.

Также необязательно может применяться один механизм, обычно называемый в данной области техники как "выступы и впадины", который относится к технологии аминокислот и создает стерические влияния в пользу гетеродимерного образования, а не в пользу гомодимерного образования; этот способ иногда называют "выступы и впадины", как описано в USSN 61/596,846, Ridgway et al., Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell et al, J. Mol. Biol. 1997 270:26; патент США № 8216805, все из которых включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме. На фигурах идентифицировано некоторое количество пар "мономер А - мономер В", которые основаны на принципе "выступы и впадины". Кроме того, как описано в Merchant et al, Nature Biotech. 16: 677 (1998), эти мутации "выступы и впадины" могут быть объединены с дисульфидными связями с искаженными образованиями до гетеродимеризации.

Дополнительный механизм, который находит применение при создании гетеродимеров, иногда упоминается как "электростатическое взаимодействие", как описано в публикации Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285 (25): 19637 (2010), включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме. Иногда этот механизм упоминается как "пары зарядов". В этом варианте осуществления данного изобретения электростатика применяется для искажения образования в сторону гетеродимеризации. Как будет понятно специалистам в данной области техники, они могут также оказывать влияние на pI, и, следовательно, на очистку и, таким образом, в некоторых случаях также могут рассматриваться как pI варианты. Однако, поскольку они были созданы для принудительной гетеродимеризации и не применялись в качестве инструментов очистки, они классифицируются как "стерические варианты". К ним относятся, но не ограничиваются ими, D221E/P228E/L368E в паре с D221R/P228R/K409R (например, это "соответствующие наборы мономеров") и C220E/P228E/368E в паре с C220R/E224R/P228R/K409R.

Дополнительные варианты мономера А и мономера В, которые могут быть объединены с другими вариантами, необязательно и независимо в любом количестве, такие как pI варианты, описанные в данном документе, или другие стерические варианты продемонстрированы на фиг. 37 публикации US 2012/0149876, фигура и легенда, а также SEQ ID NO из которой явным образом включены в данное описание посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения стерические варианты, описанные в данном документе, могут быть необязательно и независимо включены в любой pI вариант (или другие варианты, такие как Fc варианты, FcRn варианты и т.д.) в один или оба мономера и могут быть независимо и необязательно включены или исключены из белков по данному изобретению.

Перечень пригодных искаженных вариантов приведен на фиг. 3 и фиг. 8, демонстрирующих некоторые пары для конкретного применения во многих вариантах осуществления данного изобретения. Конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения находят пары наборов, включая, но не ограничиваясь ими, S364K/E357Q: L368D / K370S; L368D / K370S: S364K; L368E / K370S: S364K; T411T / E360E / Q362E: D401K; L368D / K370S: S364K / E357L, K370S: S364K / E357Q и T366S / L368A / Y407V: T366W (необязательно, включая дисульфидный мост, T366S / L368A / Y407V / Y349C: T366W / S354C). В терминах номенклатуры пара "S364K / E357Q: L368D / K370S" означает, что один из мономеров имеет набор двойного варианта S364K / E357Q, и другой имеет набор двойного варианта L368D / K370S; как и выше, "соответствие цепей" этих пар зависит от начального значения pI.

C. pI (изоэлектрическая точка) варианты для гетеродимеров

В целом, как будет понятно специалистам в данной области техники, существуют две общие категории pI вариантов: те, которые увеличивают pI белка (основные изменения) и те, которые уменьшают pI белка (кислотные изменения). Как описано в данном документе, могут быть выполнены все комбинации этих вариантов: один мономер может быть дикого типа, или вариант, который не характеризуется значительным отличием pI от дикого типа, а другой может быть более щелочным или более кислым. В альтернативном варианте, каждый мономер изменяется, от одного до более щелочного и от одного до более кислого.

Предпочтительные комбинации pI вариантов продемонстрированы на фиг. 4. Как указано в данном документе и продемонстрировано на фигурах, эти изменения показаны относительно IgG1, но таким образом могут быть изменены все изотипы, а также гибриды изотипов. В случае, когда константный домен тяжелой цепи получают из IgG2-4, также могут применяться R133E и R133Q.

В одном варианте осуществления данного изобретения, например, в фиг. 1А, Е, F, G, H и форматах I, предпочтительная комбинация pI вариантов имеет один мономер (отрицательная Fab сторона), содержащий варианты 208D / 295E / 384D / 418E / 421D (N208D / Q295E / N384D / Q418E / N421D по отношению к IgG1 человека), и второй мономер (положительная scFv сторона), содержащий положительно заряженный линкер scFv, включая (GKPGS)₄ (SEQ) ID NO: 37755). Однако, как будет понятно специалистам в данной области техники, первый мономер включает CH1-домен, включая положение 208. Соответственно, в конструкциях, которые не включают CH1-домен (например, для антител, которые не используют CH1-домен на одном из доменов, например, в формате двойного scFv или в "одноплечевом" формате, таком как изображенный на фиг. 1 B, C или D), предпочтительный вариант набор Fc-вариантов с отрицательным значением pI включает в себя варианты 295E / 384D / 418E / 421D (Q295E / N384D / Q418E / N421D по отношению к IgG1 человека).

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения один мономер имеет набор замен по фиг. 4, а другой мономер имеет заряженный линкер (либо в виде заряженного линкера scFv, поскольку этот мономер содержит scFv или заряженный линкер для доменов, как требует формат, который может быть выбран из тех, что проиллюстрированы на фиг. 7).

1. Изотипические варианты

Кроме того, многие варианты осуществления данного изобретения основаны на "импортировании" pI аминокислот в определенные положения из одного изотипа IgG в другой, в результате чего уменьшается или исключается возможность нежелательной иммуногенности, вводимой в варианты. Некоторые из них продемонстрированы на фиг. 21 в публикации US 2014/0370013, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. То есть, IgG1 является распространенным изотипом для терапевтических антител по целому ряду причин, включая сильную эффекторную функцию. Однако тяжелая константная область IgG1 имеет более высокое значение pI, чем у IgG2 (8,10 против 7,31). В результате введения остатков IgG2 в определенные положения в каркас IgG1, значение pI полученного мономера снижается (или повышается) и, кроме того, мономер характеризуется более длительным периодом полужизни в сыворотке. Например, IgG1 имеет глицин (pI 5,97) в положении 137, а IgG2 имеет глутаминовую кислоту (pI 3,22); импортирование глутаминовой кислоты будет влиять на pI полученного белка. Как описано ниже, как правило, требуется некоторое количество аминокислотных замен для существенного воздействия на pI варианта антитела. Однако следует отметить, как обсуждалось ниже, что даже изменения в молекулах IgG2 позволяют увеличить период полужизни в сыворотке.

В других вариантах осуществления данного изобретения неизотипические изменения аминокислот производят либо для снижения общего состояния заряда полученного белка (например, путем изменения аминокислоты с более высоким значением pI на аминокислоту с более низким значением pI), либо для обеспечения размещения в структуре для стабильности и т.д., как более подробно описано ниже.

Кроме того, в результате конструирования значений pI константных доменов как тяжелой, так и легкой цепи, можно наблюдать значительные изменения в каждом мономере гетеродимера. Как обсуждалось в данном документе, наличие различий значений pI двух мономеров по меньшей мере на 0,5, может обеспечить разделение посредством ионообменной хроматографии или изоэлектрической фокусировки или других способов, чувствительных к изоэлектрической точке.

D. Вычисление pI

Значение pI каждого мономера может зависеть от значения pI варианта константного домена тяжелой цепи и значения pI общего мономера, включая вариант константного домена тяжелой цепи и партнера по слиянию. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения изменение pI рассчитывается на основе варианта константного домена тяжелой цепи с помощью диаграммы на фиг. 19 в публикации США 2014/0370013. Как обсуждалось в данном документе, решение о том, какой мономер следует применять для конструирования, как правило, принимается с учетом присущего значения pI Fv-области и каркаса. В альтернативном варианте, можно сравнить pI каждого мономера.

E. pI варианты, которые также обеспечивают лучшее связывание FcRn in vivo

В случае, когда pI вариант уменьшает значение pI мономера, они могут иметь дополнительное преимущество для улучшения удерживания в сыворотке in vivo.

Несмотря на продолжающиеся исследования, считается, что Fc-области имеют более длительные периоды полужизни in vivo, поскольку связывание с FcRn при рН 6 в эндосоме секвестирует Fc (Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18 (12): 592-598, что включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Затем эндосомальный компартмент перерабатывает Fc на поверхности клетки. Как только компартмент открывается во внеклеточное пространство, более высокое значение pH -7,4 индуцирует высвобождение Fc обратно в кровь. Dall 'Acqua et al. продемонстрировали, что у мышей мутанты Fc с повышенным связыванием FcRn при рН 6 и рН 7,4 фактически имели пониженные концентрации в сыворотке и тот же период полужизни, что и Fc дикого типа (Dall 'Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169: 5171 -5180, что включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Считается, что повышенная аффинность Fc с FcRn при рН 7,4 не дает возможности высвобождаться Fc обратно в кровь. Следовательно, мутации Fc, которые увеличивают период полужизни Fc in vivo, в идеальном случае увеличивают связывание FcRn при более низком рН, продолжая обеспечивать при этом высвобождение Fc при более высоком рН. Аминокислота гистидин меняет свое состояние заряда в диапазоне рН от 6,0 до 7,4. Поэтому неудивительно обнаружить остатки His у важных положениях в комплексе Fc/FcRn.

Недавно было высказано предположение, что антитела с вариабельными областями, которые имеют более низкие изоэлектрические точки, могут также иметь более длительные периоды полужизни в сыворотке (Igawa et al, 2010 PEDS. 23 (5): 385-392, что включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Однако механизм этого еще недостаточно изучен. Более того, вариабельные области отличаются от антитела к антителу. Варианты константной области со сниженным значением pI и удлиненным периодом полужизни обеспечивают более модульный подход к улучшению фармакокинетических свойств антител, как описано в данном документе.

F. Дополнительные Fc варианты для дополнительной функциональности

В дополнение к pI вариантам аминокислот существует ряд полезных модификаций Fc аминокислот, которые могут быть осуществлены по целому ряду причин, включая, но не ограничиваясь этим, изменение связывания с одним или большим количеством рецепторов FcγR, измененное связывание с рецепторами FcRn и т.д.

Соответственно, белки по данному изобретению могут включать модификации аминокислот, включая гетеродимеризационные варианты, описанные в данном документе, которые включают в себя pI варианты и стерические варианты. Каждый набор вариантов может быть независимо и необязательно включен или исключен из любого конкретного гетеродимерного белка.

G. Варианты FcγR

Соответственно, существует ряд полезных замен Fc, которые могут быть осуществлены для изменения связывания с одним или большим количеством рецепторов FcγR. Могут быть полезными замены, которые приводят к повышению связывания, а также к снижению связывания. Например, известно, что повышенное связывание с FcγRIIIa приводит к увеличению ADCC (антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность; опосредованная клетками реакция, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcγRs, распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени). Аналогичным образом, в некоторых случаях также может быть полезным ослабление некоторых связей с FcγRIIb (ингибиторным рецептором). Аминокислотные замены, которые находят применение в данном изобретении, включают те, которые перечислены в USSN 11/124 620 (в частности, фиг. 41), 11/174,287, 11/396495, 11/538406, все из которых явным образом включены в данный документе посредством ссылки в полном объеме и конкретно для вариантов, описанных в нем. Конкретные варианты, которые находят применение, включают, но не ограничиваются ими, 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D / 332E, 267D, 267E, 328F, 267E / 328F, 236A / 332E, 239D / 332E / 330Y, 239D, 332E / 330L, 243A, 243L, 264A, 264V и 299T.

Кроме того, существуют дополнительные замены Fc, которые находят применение при повышении связывания с рецептором FcRn и увеличении периода полужизни в сыворотке, как конкретно описано в публикации USSN 12/341769, включенной в данный документе посредством ссылки в полном объеме, включая, но не ограничиваясь ими, 434S, 434A, 428L, 308F, 2591, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 4361 или V/434S, 436V/428L и 259I/308F/428L.

H. Абляционные варианты

Аналогичным образом, другой категорией функциональных вариантов являются "абляционные варианты FcγR " или варианты "выбивания Fc (FcKO или KO)". В этих вариантах осуществления данного изобретения для некоторых терапевтических применений желательно уменьшить или удалить нормальное связывание Fc-домена с одним или большим количеством или со всеми рецепторами Fcγ (например, FcγRl, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa и т.д.) во избежание дополнительных механизмов действия. То есть, например, во многих вариантах осуществления данного изобретения, в частности, при применении биспецифических антител контрольной точки, является желательной абляция связывания FcγRIIIa для устранения или значительного снижения активности ADCC, в результате чего один из Fc-доменов включает один или большее количество абляционных вариантов рецептора Fcγ. Эти абляционные варианты изображены на фиг. 5, и каждый из них может быть независимо и необязательно включен или исключен, с предпочтительными аспектами, использующими абляционные варианты, выбранные из группы, состоящей из G236R/L328R, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G и E233P/L234V/L235A/G236del. Следует отметить, что абляционные варианты, упоминаемые в данном документе, подвергают абляции связывание FcγR, а не, как правило, связывание FcRn.

Как известно в данной области техники, Fc-домен IgG1 человека характеризуется самым высоким связыванием с рецепторами Fсy, и, таким образом, указанные абляционные варианты могут применяться, когда константный домен (или Fc-домен) в каркасе гетеродимерного антитела представляет собой IgG1. Альтернативно или в дополнение к абляционным вариантам относительно IgG1, мутации в положении гликозилирования 297 (как правило, на A или S) могут в значительной степени подвергать абляции связывание, например, с FcγRIIIa. IgG2 и IgG4 человека естественным образом снижают связывание с рецепторами Fсy, и поэтому эти каркасы могут применяться с абляционными вариантами или без них.

I. Комбинация гетеродимерных вариантов и вариантов Fc

Как будет понятно специалистам в данной области техники, все рассмотренные гетеродимеризационные варианты (включая искаженные варианты и/или pI варианты) могут быть необязательно и независимо объединены любым способом, если они сохраняют свои "соответствие цепей" или "мономерное разделение". Кроме того, все эти варианты могут быть объединены в любой из гетеродимеризационных форматов.

В случае pI вариантов, в то время как варианты осуществления данного изобретения, которые нашли конкретное применение, продемонстрированы на фигурах, могут быть созданы другие комбинации, следуя основному правилу изменения отличий значения pI между двумя мономерами для облегчения очистки.

Кроме того, любой из вариантов: гетеродимеризационный, искаженный и pI, также независимо и необязательно может комбинироваться с Fc абляционными вариантами, Fc вариантами, FcRn вариантами, как это в общих чертах описано в данном документе.

V. Пригодные форматы по данному изобретению

Как будет понятно специалистам в данной области техники и более подробно описано ниже, биспецифические гетеродимерные антитела по данному изобретению могут принимать самые разнообразные конфигурации, как это в общих чертах проиллюстрировано на фиг. 1. На некоторых фигурах проиллюстрированы "одноконечные" конфигурации, в которых на одном "плече" молекулы есть один тип специфичности, а на другом "плече" - другой тип специфичности. На других фигурах проиллюстрированы "двухконечные" конфигурации, в которых по меньшей мере один тип специфичности находится в "верхней части" молекулы, а одна или большее количество других специфичностей - в "нижней части" молекулы. Таким образом, данное изобретение направлено на новые композиции иммуноглобулинов, которые взаимодействуют с различными первым и вторым антигенами.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, гетеродимерные форматы по данному изобретению могут иметь различные валентности, а также быть биспецифическими. То есть гетеродимерные антитела по данному изобретению могут быть двухвалентными и биспецифическими, при этом одна мишень контрольной точки связывается одним ABD, а другая мишень контрольной точки связывается вторым ABD. Гетеродимерные антитела также могут быть трехвалентными и биспецифическими, при этом первый антиген связывается двумя ABD, а второй антиген связывается вторым ABD.

A. Формат открывалки бутылок

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в данном изобретении, представляет собой формат каркаса "тройного F" или открывалки бутылок, как продемонстрировано на фиг. 1А. В этом варианте осуществления данного изобретения одна тяжелая цепь антитела содержит одноцепочечный Fv ("scFv", как определено ниже), а другая тяжелая цепь представляет собой "обычный" формат FAb, содержащий вариабельную тяжелую цепь и легкую цепь. Эта структура иногда упоминается в данном документе как формат "тройного F" (scFv-Fab-Fc) или формат открывалки бутылок из-за некоторого визуального сходства с открывалкой бутылок (см. фиг. 1A). Две цепи объединены путем применения вариантов аминокислот в константных областях (например, Fc-домене, CH1-домене и/или шарнирной области), что способствует образованию гетеродимерных антител, как описано более подробно ниже.

Существует несколько отличительных преимуществ данного формата "тройного F". Как известно в данной области техники, аналоги антител, основанные на двух конструкциях scFv, часто характеризуются проблемами, связанными со стабильностью и агрегацией, которые могут быть устранены в данном изобретении путем добавления "обычного" спаривания тяжелой и легкой цепи. Кроме того, в отличие от форматов, которые основаны на двух тяжелых цепях и двух легких цепях, не существует проблемы с неправильным спариванием тяжелых и легких цепей (например, тяжелая цепь 1 спаривается с легкой цепью 2 и т.д.).

Многие из вариантов осуществления данного изобретения, описанные в данном документе, в большинстве случаев относятся к формату открывалки бутылок, который содержит первый мономер, содержащий scFv, который содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, ковалентно соединенные с помощью линкера scFv (заряженного, во многих, но не во всех случаях), при этом scFv ковалентно присоединен к N-концу первого Fc-домена, как правило, с помощью линкера для доменов (который, как указано в данном документе, может быть либо незаряжен, либо заряжен, и может быть экзогенным или эндогенным (например, весь или часть нативного шарнирного домена). Второй мономер формата открывалки бутылок представляет собой тяжелую цепь, и композиция дополнительно содержит легкую цепь.

Кроме того, Fc-домены формата открывалки бутылок, как правило, содержат искаженные варианты (например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг. 3 и фиг. 8), при этом особенно пригодные искаженные варианты выбирают из группы, состоящей из S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C), необязательно -абляционные варианты (включая варианты, продемонстрированные на фиг. 5), необязательно - заряженные линкеры scFv (включая линкеры, продемонстрированные на фиг. 7), и тяжелую цепь, содержащую pI варианты (в том числе продемонстрированные на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат открывалки бутылок включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают в себя форматы открывалки бутылок, которые включают: а) первый мономер ("мономер scFv "), который содержит заряженный линкер scFv (с +H последовательностью по фиг. 7, предпочтительной в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K и Fv, который связывается с рецептором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер"), который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K и вариабельный домен тяжелой цепи, который с вариабельным доменом легкой цепи составляет Fv, который связывается со вторым рецептором контрольной точки, как описано в данном документе; и c) легкую цепь. В этом конкретном варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv мономеров включают (первыми приведены Fab, вторыми - scFv) PD-1 и CTLA-4, CTLA-4 и PD-1, PD-1 и TIM-3, TIM-3 и PD-1, PD-1 и LAG-3, LAG-3 X PDl, PD-1 и TIGIT, TIGIT и PD-1, PD-1 и BTLA, BTLA и PD-1, CTLA-4 и TIM-3, TIM-3 и CTLA-4, CTLA-4 и LAG-3, LAG-3 и CTLA-4, CTLA-4 и TIGIT, TIGIT и CTLA-4, CTLA-4 и BTLA, BTLA и CTLA-4, TIM-3 и LAG-3, LAG-3 и TIM-3, TIM-3 и TIGIT, TIGIT и TIM- 3, TIM-3 и BTLA, BTLA и TIM-3. LAG-3 и TIGIT, TIGIT и LAG-3, LAG-3 и BTLA, BTLA и LAG-3, BTLA и TIGIT, а также TIGIT и BTLA. В этом конкретном варианте осуществления данного изобретения находит свое конкретное применение формат открывалки бутылок с этими вариантами, имеющими scFv сторону, содержащую ABD 1G6_L1.194_H1.279, который связывается с PD-1. В этом конкретном варианте осуществления данного изобретения находит свое конкретное применение формат открывалки бутылок с этими вариантами, имеющими scFv сторону, содержащую [CTLA-4]H3.23 L0.129 ABD, который связывается с CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, находят свое конкретное применение CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, TIM-3 X PD-1 и LAG- 3 X CTLA-4, особенно в формате открывалки бутылок.

Последовательности ABD для этих комбинаций могут быть такими, как описано в перечне последовательностей, или как продемонстрировано на фиг. 9-13, и в любой комбинации, как продемонстрировано на фиг. 39 и фиг. 40.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат открывалки бутылок включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер ("мономер scFv"), который содержит заряженный линкер scFv (с +H-последовательностью по фиг. 7, что является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и Fv, который связывается с ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер"), который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P /L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и вариабельный домен тяжелой цепи, который с вариабельным доменом тяжелой цепи составляет Fv, который связывается со вторым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документ; и c) легкую цепь. В этом конкретном варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv мономеров включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv) PD-1 и CTLA-4, CTLA-4 и PD-1, PD-1 и TIM-3, TIM-3 и PD-1, PD -1 и LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 и TIGIT, TIGIT и PD-1, PD-1 и BTLA, BTLA и PD-1, CTLA-4 и TIM-3, TIM-3 и CTLA -4, CTLA-4 и LAG-3, LAG-3 и CTLA-4, CTLA-4 и TIGIT, TIGIT и CTLA-4, CTLA-4 и BTLA, BTLA и CTLA-4, TIM-3 и LAG-3, LAG-3 и TIM-3, TIM-3 и TIGIT, TIGIT и TIM-3, TIM-3 и BTLA, BTLA и TIM-3. LAG-3 и TIGIT, TIGIT и LAG-3, LAG-3 и BTLA, BTLA и LAG-3, BTLA и TIGIT, а также TIGIT и BTLA. В этом конкретном варианте осуществления данного изобретения находит свое конкретное применение формат открывалки бутылок с этими вариантами, имеющими scFv сторону, содержащую ABD 1G6_L1.194_H1.279, который связывается с PD-1. В этом конкретном варианте осуществления данного изобретения находит свое конкретное применение формат открывалки бутылок с этими вариантами, имеющими scFv сторону, содержащую [CTLA-4] H3.23 L0.129 ABD, который связывается с CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, находят свое конкретное применение CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, TIM-3 X PD-1 и LAG- 3 X CTLA-4, особенно в формате открывалки бутылок.

В частности, на фиг.37 продемонстрированы последовательности "каркаса" формата открывалки бутылок, которые не имеют последовательности Fv и могут применяться в данном изобретении. То есть последовательности Fv для части scFv и части Fab могут применяться из любой комбинации PD-1 и CTLA-4, PD-1 и TIM-3, PD-1 и LAG-3, PD-1 и TIGIT, PD-1 и BTLA, CTLA-4 и TIM-3, CTLA-4 и LAG-3, CTLA-4 и TIGIT, CTLA-4 и BTLA, TIM-3 и LAG-3, TIM-3 и TIGIT, TIM- 3 и BTLA, LAG-3 и TIGIT, LAG-3 и BTLA, а также TIGIT и BTLA. Последовательности могут быть любыми из описанных в данном документе в перечне последовательностей и/или проиллюстрированных на фиг. 9-13.

Для каркаса 1 открывалки бутылок, проиллюстрированного на фиг. 37, специфические комбинации Fv, применяемые в данном изобретении, включают PD-1 и CTLA-4, PD-1 и TIM-3, PD-1 и LAG-3, PD-1 и TIGIT, PD-1 и BTLA, CTLA-4 и TIM-3, CTLA-4 и LAG-3, CTLA-4 и TIGIT, CTLA-4 и BTLA, TIM-3 и LAG-3, TIM-3 и TIGIT, TIM-3 и BTLA, LAG-3 и TIGIT, LAG-3 и BTLA, а также TIGIT и BTLA. Последовательности могут быть любыми из описанных в данном документе в перечне последовательностей и/или проиллюстрированных на фиг. 9-13.

Для каркаса 1 открывалки бутылок, проиллюстрированного на фиг. 37, специфические комбинации Fv, применяемые в данном изобретении, включают CTLA-4 (Fab) X PD-1 (scFv), PD-1 (Fab) X CTLA-4 (scFv), LAG-3 (Fab) X PD-1 (scFv), BTLA (Fab) X PD-1 (scFv) и LAG-3 (Fab) X CTLA-4 (scFv).

Для каркаса 1 открывалки бутылок, проиллюстрированного на фиг. 37 (необязательно, включающего 428L/434S), специфические ABD, которые связывают PD-1 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 и 2E9_H1L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073- 35394 и SEQ ID NO: 36127-36146.

Для каркаса 1 открывалки бутылок, проиллюстрированного на фиг. 37 (необязательно, включающего варианты 428L/434S), специфические ABD, которые связывают CTLA-4 человека, включают, но не ограничиваются ими, [[CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 и [CTLA-4]_H3_L0.74, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416.

Для каркаса 1 открывалки бутылок, проиллюстрированного на фиг. 37 (необязательно, включающего варианты 428L/434S), специфические ABD, которые связывают LAG-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 2A11_H0L0; ; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; и 7G8_H3L1, а также те, которые приведены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002.

Для каркаса 1 открывалки бутылок, проиллюстрированного на фиг. 37 (необязательно, включающего варианты 428L/434S), специфические ABD, которые связывают BTLA человека, включают, но не ограничиваются ими, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; и 9C6_H1.11_L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738.

Для каркаса 1 открывалки бутылок, проиллюстрированного на фиг. 37 (необязательно, включающего варианты 428L/434S), специфические ABD, которые связывают TIM-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2,1; 6C8_H0L0; 6D9 H0 1D12 L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7B11 var_H0L0 и 7C2_H0L0, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706.

Конкретные варианты осуществления формата открывалки бутылок описаны ниже.

B. Формат mAb-Fv

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в данном изобретении, представляет собой формат mAb-Fv, продемонстрированный на фиг. 1H. В этом варианте осуществления данного изобретения указанный формат основан на использовании С-концевого присоединения "экстра" вариабельного домена тяжелой цепи к одному мономеру и С-концевому присоединения "экстра" вариабельного домена легкой цепи к другому мономеру, образуя третий антигенсвязывающий домен, при этом части Fab двух мономеров связывают одну целевую контрольную точку, а "экстра" scFv-домен связывает другую целевую контрольную точку.

В этом варианте осуществления данного изобретения первый мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный домен тяжелой цепи и первый константный домен тяжелой цепи, содержащий первый Fc-домен, с первым вариабельным доменом легкой цепи, ковалентно связанным с С-концом первого Fc-домена с помощью линкера для доменов (vh1 - CH1 - шарнир - CH2 - CH3 - [необязательный линкер] - vl2). Второй мономер содержит второй вариабельный домен тяжелой цепи и второй константный домен тяжелой цепи, содержащий второй Fc-домен, и третий вариабельный домен тяжелой цепи, ковалентно связанный с С-концом второго Fc-домена, с помощью линкера для доменов (vh1 - CH1 - шарнир - CH2 - CH3 - [необязательный линкер] - vh2. Два вариабельных домена, связанных С-концами, составляют scFv. Этот вариант осуществления данного изобретения дополнительно использует общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, который связывается с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab. Что касается многих вариантов осуществления данного изобретения, эти конструкции включают в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты, дополнительные Fc варианты и т.д. по желанию и согласно описанию в данном документе. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv) PD-1 и CTLA-4, CTLA-4 и PD-1, PD-1 и TIM-3, TIM-3 и PD-1, PD- 1 и LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 и TIGIT, TIGIT и PD-1, PD-1 и BTLA, BTLA и PD-1, CTLA-4 и TIM-3, TIM-3 и CTLA- 4, CTLA-4 и LAG-3, LAG-3 и CTLA-4, CTLA-4 и TIGIT, TIGIT и CTLA-4, CTLA-4 и BTLA, BTLA и CTLA-4, TIM-3 и LAG-3, LAG-3 и TIM-3, TIM-3 и TIGIT, TIGIT и TIM-3, TIM-3 и BTLA, BTLA и TIM-3. LAG-3 и TIGIT, TIGIT и LAG-3, LAG-3 и BTLA, BTLA и LAG-3, BTLA и TIGIT, а также TIGIT и BTLA.

Последовательности ABD для этих комбинаций могут быть такими, как описано в перечне последовательностей, или как продемонстрировано на фиг. 9-13, и в любой комбинации, как продемонстрировано на фиг. 39 и фиг. 40.

Кроме того, Fc-домены формата mAb-Fv содержат искаженные варианты (например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг. 3 и фиг. 8, с особенно пригодными искаженными вариантами, выбранными из группы, состоящей из S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C), необязательно - абляционные варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 5), необязательно - заряженные линкеры scFv (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 7) и тяжелую цепь, содержащую pI варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат mAb-Fv включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи, образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывается со вторым ингибитором контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления этого формата, свое конкретное применение находят: (порядок Fab-scFv) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат mAb-Fv включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты EE233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи, образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывается со вторым ингибитором контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления этого формата, свое конкретное применение находят: (порядок Fab-scFv) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

Для последовательностей mAb-Fv, которые сходны с каркасом 1 mAb-scFv (необязательно включающего M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают PD-1 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 и 2E9_H1L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073 -35394 и SEQ ID NO: 36127-36146.

Для последовательностей mAb-Fv, которые сходны с каркасом 1 mAb-scFv (необязательно включающего M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают CTLA-4 человека, включают, но не ограничиваются ими, [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4] _H0.27_L0; [CTLA-4] _H0.29_L0; [CTLA-4] _H0.38_L0; [CTLA-4] _H0.39_L0; [CTLA-4] _H0.40_L0; [CTLA-4] _H0.70_L0; [CTLA-4] _H0_L0.22; [CTLA-4] _H2_L0; [CTLA-4] _H3.21_L0.124; [CTLA-4] _H3.21_L0.129; [CTLA-4] _H3.21_L0.132; [CTLA-4] _H3.23_L0.124; [CTLA-4] _H3.23_L0.129; [CTLA-4] _H3.23_L0.132; [CTLA-4] _H3.25_L0.124; [CTLA-4] _H3.25_L0.129; [CTLA-4] _H3.25_L0.132; [CTLA-4] _H3.4_L0.118; [CTLA-4] _H3.4_L0.119; [CTLA-4] _H3.4_L0.12; [CTLA-4] _H3.4_L0.121; [CTLA-4] _H3.4_L0.122; [CTLA-4] _H3.4_L0.123; [CTLA-4] _H3.4_L0.124; [CTLA-4] _H3.4_L0.125; [CTLA-4] _H3.4_L0.126; [CTLA-4] _H3.4_L0.127; [CTLA-4] _H3.4_L0.128; [CTLA-4] _H3.4_L0.129; [CTLA-4] _H3.4_L0.130; [CTLA-4] _H3.4_L0.131; [CTLA-4] _H3.4_L0.132; [CTLA-4] _H3.5_L2.1; [CTLA-4] _H3.5_L2.2; [CTLA-4] _H3.5_L2.3; [CTLA-4] _H3_L0; [CTLA-4] _H3_L0.22; [CTLA-4] _H3_L0.44; [CTLA-4] _H3_L0.67 и [CTLA-4] _H3_L0.74, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416.

Для последовательностей mAb-Fv, которые сходны с каркасом 1 mAb-scFv (необязательно включающего M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают LAG-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1 ; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1 ; 2A11_H3L2; 2A11 _H4L1; 2A11 _H4L2; 7G8 _H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11 ; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; и 7G8_H3L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002.

Для последовательностей mAb-Fv, которые сходны с каркасом 1 mAb-scFv (необязательно включающего M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают BTLA человека, включают, но не ограничиваются ими, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; и 9C6_H1.11_L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738.

Для последовательностей mAb-Fv, которые сходны с каркасом 1 mAb-scFv (необязательно включающего M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают TIM-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1D10_H0L0; 1D12H0L0; 3H3H1L2,1; 6C8H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7B11 var_H0L0 и 7C2 _H0L0, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706.

C. mAb-scFv

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в данном изобретении, представляет собой формат mAb-scFv, продемонстрированный на фиг. 1I. В этом варианте осуществления данного изобретения указанный формат основан на использовании С-концевого присоединения scFv к одному из мономеров, в результате чего образуется третий антигенсвязывающий домен, при этом части Fab двух мономеров связывают одну целевую контрольную точку, а "экстра" scFv-домен связывает другую целевую контрольную точку.

В этом варианте осуществления данного изобретения первый мономер содержит первую тяжелую цепь (содержащую первый вариабельный домен тяжелой цепи и константный домен) с ковалентно прикрепленным к C-концу scFv, содержащим вариабельный домен легкой цепи scFv, линкер scFv и вариабельный домен тяжелой цепи scFv в любой ориентации (vh1 - CH1 - шарнир - CH2 - CH3- [необязательный линкер] - vh2- линкер scFv -vl2 или vh1 - CH1 - линкер - CH2 - CH3- [дополнительный линкер] - vl2 - линкер scFv - vh2). Этот вариант осуществления данного изобретения дополнительно использует общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, который связывается с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab, которые связывают один из антигенов-мишеней. Что касается многих вариантов осуществления данного изобретения, эти конструкции включают в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты, дополнительные Fc варианты и т.д. по желанию и согласно описанию в данном документе. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv) PD-1 и CTLA-4, CTLA-4 и PD-1, PD-1 и TIM-3, TIM-3 и PD-1, PD- 1 и LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 и TIGIT, TIGIT и PD-1, PD-1 и BTLA, BTLA и PD-1, CTLA-4 и TIM-3, TIM-3 и CTLA- 4, CTLA-4 и LAG-3, LAG-3 и CTLA-4, CTLA-4 и TIGIT, TIGIT и CTLA-4, CTLA-4 и BTLA, BTLA и CTLA-4, TIM-3 и LAG-3, LAG-3 и TIM-3, TIM-3 и TIGIT, TIGIT и TIM-3, TIM-3 и BTLA, BTLA и TIM-3. LAG-3 и TIGIT, TIGIT и LAG-3, LAG-3 и BTLA, BTLA и LAG-3, BTLA и TIGIT, а также TIGIT и BTLA.

Последовательности ABD для этих комбинаций могут быть такими, как описано в перечне последовательностей, или как продемонстрировано на фиг. 9-13, и в любой комбинации, как продемонстрировано на фиг. 39 и фиг. 40.

Кроме того, Fc-домены формата mAb-scFv, как правило, содержат искаженные варианты (например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг. 3 и фиг. 8, при этом особенно пригодные искаженные варианты выбирают из группы, состоящей из S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C), необязательно - абляционные варианты (включая те, которые продемонстрированные на фиг. 5), необязательно - заряженные линкеры scFv (включая те, которые продемонстрированные на фиг. 7) и тяжелую цепь, содержащую pI варианты (включая те, которые продемонстрированные на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат mAb-Fv включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи, образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывается со вторым ингибитором контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления этого формата, свое конкретное применение находят: (порядок Fab-scFv) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат mAb-scFv включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен легкой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывает второй ингибитор контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В форматах mAb-scFv, специфические комбинации Fv, применяемые в данном изобретении, включают CTLA-4 (Fab) X PD-1 (scFv), PD-1 (Fab) X CTLA-4 (scFv), LAG-3 (Fab) X PD-1 (scFv), BTLA (Fab) X PD-1 (scFv) и LAG-3 (Fab) X CTLA-4 (scFv).

В каркасе 1 mAb-scFv (необязательно включающем M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают PD-1 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 и 2E9_H1L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073 -35394 и SEQ ID NO: 36127-36146.

В каркасе 1 mAb-scFv (необязательно включающем M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают CTLA-4 человека, включают, но не ограничиваются ими, [CTLA-4] _H0.25_L0; [CTLA-4] _H0.26_L0; [CTLA-4] _H0.27_L0; [CTLA-4] _H0.29_L0; [CTLA-4] _H0.38_L0; [CTLA-4] _H0.39_L0; [CTLA-4] _H0.40_L0; [CTLA-4] _H0.70_L0; [CTLA-4] _H0_L0.22; [CTLA-4] _H2_L0; [CTLA-4] _H3.21_L0.124; [CTLA-4] _H3.21_L0.129; [CTLA-4] _H3.21_L0.132; [CTLA-4] _H3.23_L0.124; [CTLA-4] _H3.23_L0.129; [CTLA- 4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 и [CTLA-4] _H3_L0.74, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416.

В каркасе 1 mAb-scFv (необязательно включающем M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают LAG-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11 _H4L1; 2A11 _H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; и 7G8_H3L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002.

В каркасе 1 mAb-scFv (необязательно включающем M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают BTLA человека, включают, но не ограничиваются ими, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; и 9C6_H1.11_L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738.

В каркасе 1 mAb-scFv (необязательно включающем M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают TIM-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1D10_H0L0; 1D12H0L0; 3H3H1L2,1; 6C8H0L0; 6D9 H0 1D12 L0; 7A9H0L0; 7B11H0L0; 7B11 var_H0L0 и 7C2_H0L0, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706.

D. Сentral scFv

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в данном изобретении, представляет собой формат сentral-scFv, продемонстрированный на фиг. 1F. В этом варианте осуществления данного изобретения указанный формат основан на использовании вставленного scFv-домена, в результате чего образуется третий антигенсвязывающий домен, при этом части Fab двух мономеров связывают одну целевую контрольную точку, а "экстра" scFv-домен связывает другую целевую контрольную точку. ScFv-домен вставляется между Fc-доменом и областью CH1-Fv одного из мономеров, в результате чего образуется третий антигенсвязывающий домен.

В этом варианте осуществления данного изобретения один мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный домен тяжелой цепи, CH1-домен (и необязательный шарнир) и Fc-домен, с scFv, содержащим вариабельный домен легкой цепи scFv, линкер scFv и вариабельный домен тяжелой цепи scFv. ScFv ковалентно присоединен между C-концом CH1-домена константного домена тяжелой цепи и N-концом первого Fc-домена с помощью необязательных линкеров для доменов (vh1 - CH1 - [необязательный линкер] - vh2 - линкер scFv - vl2- необязательный линкер, включающий шарнир] - CH2 - CH3, или противоположную ориентацию для scFv, vh1 - CH1 - [необязательный линкер] - vl2 - линкер scFv - vh2 - [необязательный линкер, включающий шарнир] - CH2 - CH3). Другой мономер представляет собой стандартную Fab сторону. Этот вариант осуществления данного изобретения дополнительно использует общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, который связывается с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab, которые связывают ингибитор контрольной точки. Что касается многих вариантов осуществления данного изобретения, эти конструкции включают в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты, дополнительные Fc варианты и т.д. по желанию и согласно описанию в данном документе. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv): PD-1 и CTLA-4, CTLA-4 и PD-1, PD-1 и TIM-3, TIM-3 и PD-1, PD- 1 и LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 и TIGIT, TIGIT и PD-1, PD-1 и BTLA, BTLA и PD-1, CTLA-4 и TIM-3, TIM-3 и CTLA- 4, CTLA-4 и LAG-3, LAG-3 и CTLA-4, CTLA-4 и TIGIT, TIGIT и CTLA-4, CTLA-4 и BTLA, BTLA и CTLA-4, TIM-3 и LAG-3, LAG-3 и TIM-3, TIM-3 и TIGIT, TIGIT и TIM-3, TIM-3 и BTLA, BTLA и TIM-3. LAG-3 и TIGIT, TIGIT и LAG-3, LAG-3 и BTLA, BTLA и LAG-3, BTLA и TIGIT, а также TIGIT и BTLA.

Последовательности ABD для этих комбинаций могут быть такими, как описано в перечне последовательностей, или как продемонстрировано на фиг. 9-13, и в любой комбинации, как продемонстрировано на фиг. 39 и фиг. 40.

Кроме того, Fc-домены формата central-scFv, как правило, содержат искаженные варианты (например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг. 3 и фиг. 8, при этом особенно пригодные искаженные варианты выбирают из группы, состоящей из S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C), необязательно - абляционные варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 5), необязательно - заряженные линкеры scFv (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 7) и тяжелую цепь, содержащую pI варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат central scFv включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи, образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывается со вторым ингибитором контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv): CTLA-4 X PD-1, PD-1 X CTLA-4, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат central-scFv включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен легкой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывает второй ингибитор контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv): CTLA-4 X PD-1, PD-1 X CTLA-4, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

Для последовательностей сentral-scFv, которые являются подобными/используют каркас 1 формата открывалки бутылок по фиг. 37 (необязательно включающего M428L/N434S), специфические комбинации Fv, применяемые в данном изобретении, включают CTLA-4 (Fab) X PD-1 (scFv), PD-1 (Fab) X CTLA-4 (scFv), LAG-3 (Fab) X PD-1 (scFv), BTLA (Fab) X PD-1 (scFv) и LAG-3 (Fab) X CTLA-4 (scFv).

Для последовательностей сentral-scFv, которые являются подобными/используют каркас 1 формата открывалки бутылок по фиг. 37 (необязательно включающего M428L/N434S), специфические ABD, которые связывают PD-1 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 и 2E9_H1L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073 -35394 и SEQ ID NO: 36127-36146.

Для последовательностей сentral-scFv, которые являются подобными/используют каркас 1 формата открывалки бутылок по фиг. 37 (необязательно включающего M428L/N434S), специфические ABD, которые связывают CTLA-4 человека, включают, но не ограничиваются ими, [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 и [CTLA-4]_H3_L0.74, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416.

Для последовательностей сentral-scFv, которые являются подобными/используют каркас 1 формата открывалки бутылок по фиг. 37 (необязательно включающего M428L/N434S), специфические ABD, которые связывают LAG- 3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 2A11_H0L0; 2A11 _H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1 ; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11 _H4L1 ; 2A11 _H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1 ; 7G8_H3.18_L1.11 ; 7G8_H3.23_L1.11 ; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; и 7G8_H3L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002.

Для последовательностей сentral-scFv, которые являются подобными/используют каркас 1 формата открывалки бутылок по фиг. 37 (необязательно включающего M428L/N434S), специфические ABD, которые связывают BTLA человека, включают, но не ограничиваются ими, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1 ; и 9C6_H1.11_L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738.

Для последовательностей сentral-scFv, которые являются подобными/используют каркас 1 формата открывалки бутылок по фиг. 37 (необязательно включающего M428L/N434S), специфические ABD, которые связывают TIM-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9 H0 1D12 L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7B11 var_H0L0 и 7C2_H0L0, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706.

E. Формат Central-scFv

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в данном изобретении, представляет собой формат Central-scFv, продемонстрированный на фиг. 1G. В этом варианте осуществления данного изобретения указанный формат основан на использовании вставленного scFv-домена, в результате чего образуется третий антигенсвязывающий домен, при этом части Fab двух мономеров связывают одну целевую контрольную точку, а "экстра" scFv-домен связывает другую целевую контрольную точку. ScFv-домен вставляют между Fc-доменом и областью CH1-Fv мономеров, в результате чего образуется третий антигенсвязывающий домен, при этом каждый мономер содержит компонент scFv (например, один мономер содержит вариабельный домен тяжелой цепи, а другой мономер содержит вариабельный домен легкой цепи).

В этом варианте осуществления данного изобретения один мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный домен тяжелой цепи, CH1-домен и Fc-домен, а также дополнительный вариабельный домен легкой цепи. Домен легкой цепи ковалентно присоединяется между С-концом CH1-домена константного домена тяжелой цепи и N-концом первого Fc-домена с помощью линкеров для доменов (vh1 - CH1 - [необязательный линкер] - vl2 - шарнир - CH2 - CH3). Другой мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный домен тяжелой цепи, CH1-домен и Fc-домен, а также дополнительный вариабельный домен тяжелой цепи (vh1 - CH1 - [необязательный линкер] - vh2 - шарнир - CH2 - CH3). Домен легкой цепи ковалентно присоединяется между С-концом домена CH1 константного домена тяжелой цепи и N-концом первого Fc-домена с помощью линкеров для доменов. Этот вариант осуществления данного изобретения дополнительно использует общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, который связывается с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab, которые связывают TTA. Что касается многих вариантов осуществления данного изобретения, эти конструкции включают в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты, дополнительные Fc варианты и т.д. по желанию и согласно описанию в данном документе. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv): PD-1 и CTLA-4, CTLA-4 и PD-1, PD-1 и TIM-3, TIM-3 и PD-1, PD- 1 и LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 и TIGIT, TIGIT и PD-1, PD-1 и BTLA, BTLA и PD-1, CTLA-4 и TIM-3, TIM-3 и CTLA- 4, CTLA-4 и LAG-3, LAG-3 и CTLA-4, CTLA-4 и TIGIT, TIGIT и CTLA-4, CTLA-4 и BTLA, BTLA и CTLA-4, TIM-3 и LAG-3, LAG-3 и TIM-3, TIM-3 и TIGIT, TIGIT и TIM-3, TIM-3 и BTLA, BTLA и TIM-3. LAG-3 и TIGIT, TIGIT и LAG-3, LAG-3 и BTLA, BTLA и LAG-3, BTLA и TIGIT, а также TIGIT и BTLA.

Последовательности ABD для этих комбинаций могут быть такими, как описано в перечне последовательностей, или как продемонстрировано на фиг. 9-13, и в любой комбинации, как продемонстрировано на фиг. 39 и фиг. 40.

В форматах сentral-scFv, специфические комбинации Fv, применяемые в данном изобретении, включают CTLA-4 (Fab) X PD-1 (scFv), PD-1 (Fab) X CTLA-4 (scFv), LAG-3 (Fab) X PD-1 (scFv), BTLA (Fab) X PD-1 (scFv) и LAG-3 (Fab) X CTLA-4 (scFv).

В форматах сentral-scFv, специфические ABD, которые связывают PD-1 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 и 2E9_H1L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073-35394 и SEQ ID NO: 36127-36146.

В форматах сentral-scFv, специфические ABD, которые связывают CTLA-4 человека, включают, но не ограничиваются ими, [CTLA-4] _H0.25_L0; [CTLA-4] _H0.26_L0; [CTLA-4] _H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 и [CTLA-4] _H3_L0.74, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416.

В форматах сentral-scFv, специфические ABD, которые связывают LAG-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11 _H4L2; 7G8 _H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; и 7G8_H3L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002.

В форматах сentral-scFv, специфические ABD, которые связывают BTLA человека, включают, но не ограничиваются ими, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; и 9C6_H1.11_L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738.

В форматах сentral-scFv, специфические ABD, которые связывают TIM-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1D10_H0L0; 1D12H0L0; 3H3H1L2,1; 6C8H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7B11 var_H0L0 и 7C2_H0L0, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706.

F. Формат сentral-scFv с одним плечом

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в данном изобретении, представляет собой формат сentral-scFv с одним плечом, продемонстрированный на фиг. 1С. В этом варианте осуществления данного изобретения один мономер содержит только Fc-домен, тогда как другой мономер использует вставленный scFv-домен, в результате чего образуется второй антигенсвязывающий домен. В этом формате, часть Fab связывает одну целевую контрольную точку, а scFv связывает другую целевую контрольную точку в равной степени. ScFv-домен вставляется между Fc-доменом и областью CH1-Fv одного из мономеров.

В этом варианте осуществления данного изобретения один мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный домен тяжелой цепи, домен CH1 и Fc-домен, с scFv, содержащим вариабельный домен легкой цепи scFv, линкер scFv и вариабельный домен тяжелой цепи scFv. scFv ковалентно присоединяется между С-концом CH1-домена константного домена тяжелой цепи и N-концом первого Fc-домена с помощью линкеров для доменов. Второй мономер содержит Fc-домен. Этот вариант осуществления данного изобретения дополнительно использует легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, который связывается с тяжелой цепью с образованием Fab. Что касается многих вариантов осуществления данного изобретения, эти конструкции включают в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты, дополнительные Fc варианты и т.д. по желанию и согласно описанию в данном документе. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv): PD-1 и CTLA-4, CTLA-4 и PD-1, PD-1 и TIM-3, TIM-3 и PD-1, PD- 1 и LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 и TIGIT, TIGIT и PD-1, PD-1 и BTLA, BTLA и PD-1, CTLA-4 и TIM-3, TIM-3 и CTLA- 4, CTLA-4 и LAG-3, LAG-3 и CTLA-4, CTLA-4 и TIGIT, TIGIT и CTLA-4, CTLA-4 и BTLA, BTLA и CTLA-4, TIM-3 и LAG-3, LAG-3 и TIM-3, TIM-3 и TIGIT, TIGIT и TIM-3, TIM-3 и BTLA, BTLA и TIM-3. LAG-3 и TIGIT, TIGIT и LAG-3, LAG-3 и BTLA, BTLA и LAG-3, BTLA и TIGIT, а также TIGIT и BTLA.

Последовательности ABD для этих комбинаций могут быть такими, как описано в перечне последовательностей, или как продемонстрировано на фиг. 9-13, и в любой комбинации, как продемонстрировано на фиг. 39 и фиг. 40.

Кроме того, Fc-домены формата сentral-scFv с одним плечом, как правило, содержат искаженные варианты (например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг. 3 и фиг. 8, при этом особенно пригодные искаженные варианты выбирают из группы, состоящей из S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V Y349C : T366W/S354C), необязательно - абляционные варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 5), необязательно - заряженные линкеры scFv (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 7) и тяжелую цепь, содержащую pI варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат сentral-scFv с одним плечом включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи, образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывается со вторым ингибитором контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv): CTLA-4 X PD-1, PD-1 X CTLA-4, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат сentral-scFv с одним плечом включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи, образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, и второй вариабельный домен тяжелой цепи, b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи, образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и вторую вариабельную легкую цепь, которая вместе со второй вариабельной тяжелой цепью образует Fv (ABD), который связывает второй ингибитор контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv): CTLA-4 X PD-1, PD-1 X CTLA-4, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

В форматах сentral-scFv с одним плечом, специфические ABD, которые связывают PD-1 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 и 2E9_H1L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073 -35394 и SEQ ID NO: 36127-36146.

В форматах сentral-scFv с одним плечом, специфические ABD, которые связывают CTLA-4 человека, включают, но не ограничиваются ими, [CTLA-4] _H0.25_L0; [CTLA-4] _H0.26_L0; [CTLA-4] _H0.27_L0; [CTLA-4] _H0.29_L0; [CTLA-4] _H0.38_L0; [CTLA-4] _H0.39_L0; [CTLA-4] _H0.40_L0; [CTLA-4] _H0.70_L0; [CTLA-4] _H0_L0.22; [CTLA-4] _H2_L0; [CTLA-4] _H3.21_L0.124; [CTLA-4] _H3.21_L0.129; [CTLA-4] _H3.21_L0.132; [CTLA-4] _H3.23_L0.124; [CTLA-4] _H3.23_L0.129; [CTLA-4] _H3.23_L0.132; [CTLA-4] _H3.25_L0.124; [CTLA-4] _H3.25_L0.129; [CTLA-4] _H3.25_L0.132; [CTLA-4] _H3.4_L0.118; [CTLA-4] _H3.4_L0.119; [CTLA-4] _H3.4_L0.12; [CTLA-4] _H3.4_L0.121; [CTLA-4] _H3.4_L0.122; [CTLA-4] _H3.4_L0.123; [CTLA-4] _H3.4_L0.124; [CTLA-4] _H3.4_L0.125; [CTLA-4] _H3.4_L0.126; [CTLA-4] _H3.4_L0.127; [CTLA-4] _H3.4_L0.128; [CTLA-4] _H3.4_L0.129; [CTLA-4] _H3.4_L0.130; [CTLA-4] _H3.4_L0.131; [CTLA-4] _H3.4_L0.132; [CTLA-4] _H3.5_L2.1; [CTLA-4] _H3.5_L2.2; [CTLA-4] _H3.5_L2.3; [CTLA-4] _H3_L0; [CTLA-4] _H3_L0.22; [CTLA-4] _H3_L0.44; [CTLA-4] _H3_L0.67 и [CTLA-4] _H3_L0.74, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416.

В форматах сentral-scFv с одним плечом, специфические ABD, которые связывают LAG-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 2A11_H0L0; ; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11 _H4L2; 7G8 _H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; и 7G8_H3L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002.

В форматах сentral-scFv с одним плечом, специфические ABD, которые связывают CTLA-4 человека, включают, но не ограничиваются ими, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; и 9C6_H1.11_L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738.

В форматах сentral-scFv с одним плечом, специфические ABD, которые связывают TIM-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1D10 _H0L0; 1D12 _H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8 _H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7B11 var_H0L0 и 7C2 _H0L0, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706.

G. Формат scFv-mAb с одним плечом

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в данном изобретении, представляет собой формат scFv-mAb с одним плечом, продемонстрированный на фиг. 1D. В этом варианте осуществления данного изобретения один мономер содержит только Fc-домен, в то время как другой мономер использует scFv-домен, присоединенный к N-концу тяжелой цепи, как правило, посредством линкера: vh - линкер scFv - vl - [необязательный линкер для доменов] - CH1 - шарнир - CH2 - CH3 или (в противоположном направлении) vl - линкер scFv - vh - [необязательный линкер для доменов] - CH1 - шарнир - CH2 - CH3. В этом формате, часть Fab связывает одну целевую контрольную точку, а scFv связывает другую целевую контрольную точку в равной степени. Этот вариант осуществления данного изобретения дополнительно использует легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, который связывается с тяжелой цепью с образованием Fab. Что касается многих вариантов осуществления данного изобретения, эти конструкции включают в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты, дополнительные Fc варианты и т.д. по желанию и согласно описанию в данном документе. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv) PD-1 и CTLA-4, CTLA-4 и PD-1, PD-1 и TIM-3, TIM-3 и PD-1, PD- 1 и LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 и TIGIT, TIGIT и PD-1, PD-1 и BTLA, BTLA и PD-1, CTLA-4 и TIM-3, TIM-3 и CTLA- 4, CTLA-4 и LAG-3, LAG-3 и CTLA-4, CTLA-4 и TIGIT, TIGIT и CTLA-4, CTLA-4 и BTLA, BTLA и CTLA-4, TIM-3 и LAG-3, LAG-3 и TIM-3, TIM-3 и TIGIT, TIGIT и TIM-3, TIM-3 и BTLA, BTLA и TIM-3. LAG-3 и TIGIT, TIGIT и LAG-3, LAG-3 и BTLA, BTLA и LAG-3, BTLA и TIGIT, а также TIGIT и BTLA.

Последовательности ABD для этих комбинаций могут быть такими, как описано в перечне последовательностей, или как продемонстрировано на фиг. 9-13, и в любой комбинации, как продемонстрировано на фиг. 39 и фиг. 40.

Кроме того, Fc-домены содержат искаженные варианты (например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг. 3 и фиг. 8, при этом особенно пригодные искаженные варианты выбирают из группы, состоящей из S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C), необязательно - абляционные варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 5), необязательно - заряженные линкеры scFv (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 7) и тяжелую цепь, содержащую pI варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат scFv-mAb с одним плечом включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи, образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывается со вторым ингибитором контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv): CTLA-4 X PD-1, PD-1 X CTLA-4, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат scFv-mAb" с одним плечом включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи, образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывается со вторым ингибитором контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv): CTLA-4 X PD-1, PD-1 X CTLA-4, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

В форматах scFv-mAb с одним плечом, специфические ABD, которые связывают PD-1 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 и 2E9_H1L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073 -35394 и SEQ ID NO: 36127-36146.

В форматах scFv-mAb с одним плечом, специфические ABD, которые связывают CTLA-4 человека, включают, но не ограничиваются ими, [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 и [CTLA-4]_H3_L0.74, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416.

В форматах scFv-mAb с одним плечом, специфические ABD, которые связывают LAG-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 2A11_H0L0; ; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11 _H4L2; 7G8 _H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; и 7G8_H3L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002.

В форматах scFv-mAb с одним плечом, специфические ABD, которые связывают BTLA человека, включают, но не ограничиваются ими, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; и 9C6_H1.11_L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738.

В форматах scFv-mAb с одним плечом, специфические ABD, которые связывают TIM-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7B11 var_H0L0 и 7C2 _H0L0, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706.

H. Формат scFv-mAb

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в данном изобретении, представляет собой формат mAb-scFv, продемонстрированный на фиг. 1E. В этом варианте осуществления данного изобретения указанный формат основан на использовании N-концевого присоединения scFv к одному из мономеров, в результате чего образуется третий антигенсвязывающий домен, при этом части Fab двух мономеров связывают одну целевую контрольную точку, а "экстра" scFv-домен связывает другую целевую контрольную точку.

В этом варианте осуществления данного изобретения первый мономер содержит первую тяжелую цепь (содержащую первый вариабельный домен тяжелой цепи и константный домен) с ковалентно прикрепленным к N-концу scFv, содержащим вариабельный домен легкой цепи scFv, линкер scFv и вариабельный домен тяжелой цепи scFv в любой ориентации ((vh1-линкер scFv - vl1 - [необязательный линкер для доменом] - vh2 - CH1 - шарнир - CH2 - CH3) или (с scFv в противоположной ориентации) ((vl1 - линкер scFv - vh1- [необязательный линкер для доменов] - vh2 - CH1 - шарнир - CH2 - CH3)). Этот вариант осуществления данного изобретения дополнительно использует общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, который связывается с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab, которые связывают один из антигенов-мишеней. Что касается многих вариантов осуществления данного изобретения, эти конструкции включают в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты, дополнительные Fc варианты и т.д. по желанию и согласно описанию в данном документе. В этом варианте осуществления данного изобретения пригодные пары Fv включают в себя (первыми приведены Fab, вторыми - scFv): PD-1 и CTLA-4, CTLA-4 и PD-1, PD-1 и TIM-3, TIM-3 и PD-1, PD- 1 и LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 и TIGIT, TIGIT и PD-1, PD-1 и BTLA, BTLA и PD-1, CTLA-4 и TIM-3, TIM-3 и CTLA-4, CTLA-4 и LAG-3, LAG-3 и CTLA-4, CTLA-4 и TIGIT, TIGIT и CTLA-4, CTLA-4 и BTLA, BTLA и CTLA-4, TIM- 3 и LAG-3, LAG-3 и TIM-3, TIM-3 и TIGIT, TIGIT и TIM-3, TIM-3 и BTLA, BTLA и TIM-3. LAG-3 и TIGIT, TIGIT и LAG-3, LAG-3 и BTLA, BTLA и LAG-3, BTLA и TIGIT, а также TIGIT и BTLA.

Последовательности ABD для этих комбинаций могут быть такими, как описано в перечне последовательностей, или как продемонстрировано на фиг. 9-13, и в любой комбинации, как продемонстрировано на фиг. 39 и фиг. 40.

Кроме того, Fc-домены формата scFv-mAb содержат искаженные варианты

(например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг. 3 и фиг. 8, с особенно пригодными искаженными вариантами, выбранными из группы, состоящей из S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C), необязательно - абляционные варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 5), необязательно - заряженные линкеры scFv (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 7) и тяжелую цепь, содержащую pI варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат mAb-Fv включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи, образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывается со вторым ингибитором контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления этого формата, свое конкретное применение находят: (порядок Fab-scFv) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат mAb-scFv включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен легкой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывает второй ингибитор контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления этого формата, свое конкретное применение находят: (порядок Fab-scFv) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

Для каркаса 1 формата mAb-scFv (необязательно включающего M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают PD-1 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 и 2E9_H1L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073- 35394 и SEQ ID NO: 36127-36146.

Для каркаса 1 формата mAb-scFv (необязательно включающего M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают CTLA-4 человека, включают, но не ограничиваются ими, [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4] _H3_L0.67 и [CTLA-4] _H3_L0.74, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416.

Для каркаса 1 формата mAb-scFv (необязательно включающего M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают LAG-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 2A11_H0L0; ; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; и 7G8_H3L1, а также те, которые приведены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002.

Для каркаса 1 формата mAb-scFv (необязательно включающего M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают BTLA человека, включают, но не ограничиваются ими, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; и 9C6_H1.11_L1, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738.

Для каркаса 1 формата mAb-scFv (необязательно включающего M428L/N434S) по фиг. 38, специфические ABD, которые связывают TIM-3 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7B11 var_H0L0 и 7C2_H0L0, а также те, которые перечислены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706.

I. Форматы двойного scFv

В данном изобретении также предлагаются форматы двойного scFv, известные из уровня техники и продемонстрированные на фиг. 1B. В этом варианте осуществления данного изобретения гетеродимерное биспецифическое антитело состоит из двух мономеров scFv-Fc (либо в формате (vh - линкер scFv - vl - [необязательный линкер для доменов) - CH2 - CH3), либо в формате (vl - линкер scFv - vh - [необязательный линкер для доменов] - CH2 -CH3), или с одним мономером в одной ориентации, и другим мономером в другой ориентации.

В этом случае все ABD находятся в формате scFv, с любой комбинацией PD-1 и CTLA-4, PD-1 и TIM-3, PD-1 и LAG-3, PD-1 и TIGIT, PD -1 и BTLA, CTLA-4 и TIM-3, CTLA-4 и LAG-3, CTLA-4 и TIGIT, CTLA-4 и BTLA, TIM-3 и LAG-3, TIM-3 и TIGIT, TIM-3 и BTLA, LAG-3 и TIGIT, LAG-3 и BTLA, а также TIGIT и BTLA, являющейся пригодной. Последовательности ABD для этих комбинаций могут быть такими, как описано в перечне последовательностей, или как продемонстрировано на фиг. 9-13, и в любой комбинации, как продемонстрировано на фиг. 39 и фиг. 40.

Кроме того, Fc-домены формата двойного scFv содержат искаженные варианты (например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг. 3 и фиг. 8, с особенно пригодными искаженными вариантами, выбранными из группы, состоящей из S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C), необязательно - абляционные варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 5), необязательно - заряженные линкеры scFv (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 7) и тяжелую цепь, содержащую pI варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат двойного scFv включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи, образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывается со вторым ингибитором контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления этого формата, свое конкретное применение находят: (порядок Fab-scFv) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения формат двойного scFv включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер, который содержит искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи, образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, и второй вариабельный домен тяжелой цепи; b) второй мономер, который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с первым вариабельным доменом легкой цепи образует Fv, который связывается с первым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе, и второй вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе со вторым вариабельным доменом тяжелой цепи образует Fv (ABD), который связывается со вторым ингибитором контрольной точки; и c) легкую цепь, содержащую первый вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления этого формата, свое конкретное применение находят: (порядок Fab-scFv) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1 и LAG-3 X CTLA-4.

J. Негетеродимерные биспецифические антитела

Как будет понятно специалистам в данной области техники, последовательности Fv, описанные в данном документе, могут также применяться как в моноспецифических антителах (например, "традиционных моноклональных антителах"), так и в негетеродимерных биспецифических форматах.

Пригодные негетеродимерные биспецифические форматы известны в данной области техники и включают в себя ряд различных форматов, как это в общих чертах описано в работах SpIess et al, Molecular Immunology (67):95-106 (2015) и Kontermann, mAbs 4:2, 182-197 (2012), обе из которых явным образом включены посредством ссылок и, в частности, что касается фигур, легенд и цитат, в описание форматов по данному изобретению.

K. Моноспецифические, моноклональные антитела

Как будет понятно специалистам в данной области техники, новые последовательности Fv, описанные в данном документе, могут также применяться как в моноспецифических антителах (например, "традиционных моноклональных антителах"), так и в негетеродимерных биспецифических форматах. Соответственно, в данном изобретении предлагаются моноклональные (моноспецифические) антитела, содержащие 6 CDR и/или последовательности vh и vl из фигур, как правило, с константными областями IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, с IgG1, IgG2 и IgG4 (включая константные области IgG4, содержащие аминокислотную замену S228P), в частности, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения. То есть любая последовательность с обозначением в данном документе "H_L" может быть связана с константной областью антитела IgG1 человека.

VI. Антигенсвязывающие домены для антигенов-мишеней

Биспецифические антитела по данному изобретению имеют два разных антигенсвязывающих домена (ABD), которые связываются с двумя различными антигенами-мишенями контрольных точек ("пары-мишени") в двухвалентных биспецифических форматах или трехвалентных биспецифических форматах, как в общих чертах продемонстрировано на фиг. 1. К пригодным антигенам-мишеням контрольных точек относятся последовательности PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, TIGIT и BTLA человека (а иногда и яванского макака), которые продемонстрированы на фиг. 2.

Соответственно, пригодные биспецифические антитела связывают PD-1 и CTLA-4, PD-1 и TIM-3, PD-1 и LAG-3, PD-1 и TIGIT, PD-1 и BTLA, CTLA-4 и TIM-3, CTLA-4 и LAG-3, CTLA-4 и TIGIT, CTLA-4 и BTLA, TIM-3 и LAG-3, TIM-3 и TIGIT, TIM-3 и BTLA, LAG-3 и TIGIT, LAG-3 и BTLA, а также TIGIT и BTLA. Следует обратить внимание, что, как правило, эти биспецифические антитела называются "анти-PD-1 X анти-CTLA-4" или, как правило, упрощенно или для удобства (и, следовательно, взаимозаменяемо) как "PD-1 X CTLA-4" и т.д. для каждой пары. Следует обратить внимание, что, если не уточняется в данном документе, порядок перечня антигенов в названии не подтверждает структуру; то есть антитело в формате открывалки бутылок PD-1 X CTLA-4, может связывать scFv с PD-1 или CTLA-4, хотя в некоторых случаях порядок определяет структуру, как указано.

Как более подробно описано в данном документе, эти комбинации ABD могут быть в различных форматах, как описано ниже, как правило, в комбинациях, где один ABD находится в формате Fab, а другой - в формате scFv. Как обсуждалось в данном документе и продемонстрировано на фиг. 1, в некоторых форматах используется один Fab и один scFv (фиг. 1A, C и D), а в некоторых форматах используются два Fab и один scFv (фиг. 1E, F, G, H и I).

A. Антигенсвязующие домены

Как обсуждалось в данном документе, гетеродимерные антитела биспецифических контрольных точек по данному изобретению включают два антигенсвязывающих домена (ABD), каждый из которых связывается с разными белками контрольных точек. Как указано в данном документе, эти гетеродимерные антитела могут быть биспецифическими и двухвалентными (каждый антиген связывается одним ABD, например, в формате, проиллюстрированном на фиг. 1A), или биспецифическими и трехвалентными (один антиген связывается одним ABD, а другой антиген связывается двумя ABD, например, как проиллюстрировано на фиг. 1F).

Кроме того, в большинстве случаев, один из ABD содержит scFv, как описано в данном документе, в ориентации от N- до C-конца vh - линкер scFv - vl или vl - линкер scFv - vh. Один или оба других ABD, в соответствии с форматом, как правило, представляют собой Fab, содержащий домен vh на одной белковой цепи (как правило, в качестве компонента тяжелой цепи) и vl на другой белковой цепи (как правило, в качестве компонента легкой цепи).

В данном изобретении предлагается ряд ABD, которые связываются с рядом различных белков контрольных точек, как описано ниже. Как будет понятно специалистам в данной области техники, любой набор из 6 CDR или доменов vh и vl может быть в формате scFv или в формате Fab, который затем добавляется к константным доменам тяжелой и легкой цепи, при этом константные домены тяжелой цепи содержат варианты (в том числе в пределах CH1-домена, а также в пределах Fc-домена). Последовательности scFv, содержащиеся в перечне последовательностей, используют конкретный заряженный линкер, но, как указано в данном документе, можно использовать незаряженные или другие заряженные линкеры, включая те, которые проиллюстрированы на фиг. 7.

Кроме того, как обсуждалось выше, нумерация, используемая в перечне последовательностей для идентификации CDR, представляет собой нумерацию по Кабату, однако можно использовать различную нумерацию, которая будет изменять аминокислотные последовательности CDR, как показано в таблице 1.

Для всех вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, перечисленных в данном документе, могут быть осуществлены дополнительные варианты. Как описано в данном документе, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения, в наборе из 6 CDR можно осуществить от 0, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных модификаций (с аминокислотными заменами, которые находят конкретное применение), а также можно осуществлять изменения в каркасных областях вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи до тех пор, пока каркасы (за исключением CDR) будут сохранять по меньшей мере около 80, 85 или 90% идентичности с последовательностью зародышевой линии человека, выбранной из тех, которые приведены на фиг. 1 патента США № 7657380, фигура и легенда которого включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме. Таким образом, например, идентичные CDR, как описано в данном документе, можно объединять с различными каркасными последовательностями из последовательностей зародышевой линии человека до тех пор, пока каркасные области будут сохранять по меньшей мере 80, 85 или 90% идентичности с последовательностью зародышевой линии человека, выбранной из тех, которые приведены на фиг. 1 патента США № 7657380. В альтернативном варианте, CDR могут иметь аминокислотные модификации (например, из 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных модификаций в наборе CDR (то есть в CDR можно осуществлять модификации до тех пор, пока общее количество изменений в наборе 6 CDR будет составлять менее 6 аминокислотных модификаций, с изменением любой комбинации CDR, например, может быть одно изменение в vlCDR1, два - в vhCDR2, и ни одного - в vhCDR3 и т.д.)), а также можно осуществлять изменения каркасной области до тех пор, пока каркасные области будут сохранять по меньшей мере 80, 85 или 90% идентичности с последовательностью зародышевой линии человека, выбранной из тех, которые приведены на фиг. 1 патента США № 7657380.

B. Домены, связывающие антиген PD-1

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения один из ABD связывает PD-1. Пригодные наборы из 6 CDR и/или доменов vh и vl, а также последовательности scFv приведены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073-35394 и SEQ ID NO: 36127-36146. Последовательности ABD, представляющие особый интерес в некоторых вариантах осуществления данного изобретения, продемонстрированы на фиг. 9 и включают в себя последовательности в перечне последовательностей с идентификаторами 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; и 2E9_H1L1.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, пригодные анти-PD-1 ABD могут содержать набор из 6 CDR, как показано в этих последовательностях и фигурах, и являются либо подчеркнутыми, либо, в случае использования другой системы нумерации, как описано в данном документе и как продемонстрировано в Таблице 1, выступают в качестве CDR, которые идентифицируются с помощью других выравниваний в пределах последовательностей vh и vl SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073-35394 и SEQ ID NO: 36127-36146. Пригодные ABD могут также включать в себя все последовательности vh и vl, как показано в этих последовательностях и фигурах, используемых как scFv или как Fab. Многие варианты осуществления данного изобретения, которые содержат Fv к PD-1, представляют собой мономер scFv, который связывает PD-1. Как обсуждалось в данном документе, другую из целевой пары, когда PD-1 является одним из антигенов, выбирают из CTLA-4 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO : 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), TIM-3 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), LAG-3 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), BTLA (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)) и TIGIT (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 21504- 21523 и SEQ ID NO: 37435-37586 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)).

Особенно пригодные ABD, которые связывают PD-1 человека, включают, но не ограничиваются ими, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 и 2E9_H1L1.

В дополнение к родительским наборам CDR, приведенным в перечне последовательностей, которые образуют ABD к PD-1, в данном изобретении предлагаются варианты наборов CDR. В одном варианте осуществления данного изобретения, в набор из 6 CDR можно вносить 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных изменений по сравнению с родительскими CDR до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения.

В дополнение к родительским вариабельным доменам тяжелой цепи и вариабельным доменам легкой цепи, описанным в данном документе, которые образуют ABD к PD-1, в данном изобретении предлагаются варианты доменов vh и vl. В одном варианте осуществления данного изобретения в варианты доменов vh и vl можно вносить от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных изменений по сравнению с родительским доменом vh и vl до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения. В другом варианте осуществления данного изобретения, варианты vh и vl являются по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичными соответствующим родительским vh или vl, до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения.

Конкретные предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя 1G6_L1.194_H1.279 анти-PD-1 Fv, в формате scFv, который включен в любой из каркасов формата открывалки бутылок по фиг. 37.

Конкретные предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя 1G6_L1.194_H1.279 анти-PD-1 Fv, в формате scFv, который включен в любой из каркасов формата mAb-scFv по фиг. 38.

C. Домены, связывающие антиген CTLA-4

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения один из ABD связывает CTLA-4. Пригодные наборы из 6 CDR и/или домены vh и vl, а также последовательности scFv приведены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416. Последовательности ABD, представляющие особый интерес в некоторых вариантах осуществления данного изобретения, продемонстрированы на фиг. 10, а также включают в себя последовательности в перечне последовательностей с идентификаторами [CTLA-4] _H0.25_L0; [CTLA-4] _H0.26_L0; [CTLA-4] _H0.27_L0; [CTLA-4] _H0.29_L0; [CTLA-4] _H0.38_L0; [CTLA-4] _H0.39_L0; 0 [CTLA-4] _H0.40_L0; [CTLA-4] _H0.70_L0; [CTLA-4] _H0_L0.22; [CTLA-4] _H2_L0; [CTLA-4] _H3.21_L0.124; [CTLA-4] _H3.21_L0.129; [CTLA-4] _H3.21_L0.132; [CTLA-4] _H3.23_L0.124; [CTLA-4] _H3.23_L0.129; [CTLA-4] _H3.23_L0.132; [CTLA-4] _H3.25_L0.124; [CTLA-4] _H3.25_L0.129; [CTLA-4] _H3.25_L0.132; [CTLA-4] _H3.4_L0.118; [CTLA-4] _H3.4_L0.119; [CTLA-4] _H3.4_L0.12; [CTLA-4] _H3.4_L0.121; [CTLA-4] _H3.4_L0.122; [CTLA-4] _H3.4_L0.123; [CTLA-4] _H3.4_L0.124; [CTLA-4] _H3.4_L0.125; [CTLA-4] _H3.4_L0.126; [CTLA-4] _H3.4_L0.127; [CTLA-4] _H3.4_L0.128; [CTLA-4] _H3.4_L0.129; [CTLA-4] _H3.4_L0.130; [CTLA-4] _H3.4_L0.131; [CTLA-4] _H3.4_L0.132; [CTLA-4] _H3.5_L2.1; [CTLA-4] _H3.5_L2.2; [CTLA-4] _H3.5_L2.3; [CTLA-4] _H3_L0; [CTLA-4] _H3_L0.22; [CTLA-4] _H3_L0.44; [CTLA-4] _H3_L0.67; и [CTLA-4] _H3_L0.74.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, пригодные анти-CTLA-4 ABD могут содержать набор из 6 CDR, как показано в этих последовательностях и фигурах, и являются либо подчеркнутыми, либо в случае использования другой системы нумерации, как описано в данном документе и как продемонстрировано в таблице 1, выступают в качестве CDR, которые идентифицируются с помощью других выравниваний в пределах последовательностей vh и vl SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739- 36818 и SEQ ID NO: 35395-35416. Пригодные ABD могут также включать в себя все последовательности vh и vl, как показано в этих последовательностях и фигурах, используемых как scFv или как Fab. Многие варианты осуществления данного изобретения, которые содержат Fv к CTLA-4, представляют собой мономер scFv, который связывает CTLA-4. Как обсуждалось в данном документе, другую из целевой пары, когда CTLA-4 является одним из антигенов, выбирают из PD-1 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073-35394 и SEQ ID NO: 36127-36146 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), TIM-3 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), LAG-3 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), BTLA (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)) и TIGIT (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 21504- 21523 и SEQ ID NO: 37435-37586 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)).

В дополнение к родительским наборам CDR, приведенным в перечне последовательностей, которые образуют ABD к CTLA-4, в данном изобретении предлагаются варианты наборов CDR. В одном варианте осуществления данного изобретения, в набор из 6 CDR можно вносить 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных изменений по сравнению с родительскими CDR до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения.

В дополнение к родительским вариабельным доменам тяжелой цепи и вариабельным доменам легкой цепи, описанным в данном документе, которые образуют ABD к CTLA-4, в данном изобретении предлагаются варианты доменов vh и vl. В одном варианте осуществления данного изобретения, в варианты доменов vh и vl можно вносить от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных изменений по сравнению с родительским доменом vh и vl до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения. В другом варианте осуществления данного изобретения, варианты vh и vl являются по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичными соответствующим родительским vh или vl, до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения.

Конкретные предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя [CTLA-4] _H3_L0.22 анти-CTLA-4 Fv в формате Fab, который включен в любой из каркасов формата открывалки бутылок по фиг. 37.

Конкретные предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя [CTLA-4]_H3_L0.22 анти-CTLA- 4 Fv в формате scFv, который включен в любой из каркасов формата открывалки бутылок по фиг. 37.

Конкретные предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя [CTLA-4]_H3_L0.22 анти-CTLA- 4 Fv в формате scFv, который включен в любой из каркасов формата mAb-scFv по фиг. 38.

Конкретные предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя [CTLA-4]_H3_L0.22 анти-CTLA- 4 Fv в формате Fab, который включен в любой из каркасов формата mAb-scFv по фиг. 38.

D. Домены, связывающие антиген TIM-3

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения один из ABD связывает TIM-3. Пригодные наборы из 6 CDR и/или домены vh и vl, а также последовательности scFv приведены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706. Последовательности ABD, представляющие особый интерес в некоторых вариантах осуществления данного изобретения включают в себя последовательности в перечне последовательностей с идентификаторами 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0LO; 7B11var_H0L0; и 7C2_H0L0.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, пригодные анти-TIM-3 ABD могут содержать набор из 6 CDR, как показано в этих последовательностях и фигурах, и являются либо подчеркнутыми, либо в случае использования другой системы нумерации, как описано в данном документе и как продемонстрировано в таблице 1, выступают в качестве CDR, которые идентифицируются с помощью других выравниваний в пределах последовательностей vh и vl SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706. Пригодные ABD могут также включать в себя все последовательности vh и vl, как показано в этих последовательностях и фигурах, используемых как scFv или как Fab. Многие варианты осуществления данного изобретения, которые содержат Fv к TIM-3, представляют собой Fab мономер, который связывает TIM-3. Как обсуждалось в данном документе, другую из целевой пары, когда TIM-3 является одним из антигенов, выбирают из PD-1 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 6209-11464,SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073-35394 и SEQ ID NO: 36127-36146 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), CTLA-4 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), LAG-3 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), BTLA (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)) и TIGIT (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 21504- 21523 и SEQ ID NO: 37435-37586 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)).

В дополнение к родительским наборам CDR, приведенным в перечне последовательностей, которые образуют ABD к TIM-3, в данном изобретении предлагаются варианты наборов CDR. В одном варианте осуществления данного изобретения, в набор из 6 CDR можно вносить 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных изменений по сравнению с родительскими CDR до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения.

В дополнение к родительским вариабельным доменам тяжелой цепи и вариабельным доменам легкой цепи, описанным в данном документе, которые образуют ABD к TIM-3, в данном изобретении предлагаются варианты доменов vh и vl. В одном варианте осуществления данного изобретения в варианты доменов vh и vl можно вносить от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных изменений по сравнению с родительским доменом vh и vl до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения. В другом варианте осуществления данного изобретения, варианты vh и vl являются по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичными соответствующим родительским vh или vl, до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения.

Домены, связывающие антиген LAG- 3

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения один из ABD связывает LAG-3. Пригодные наборы из 6 CDR и/или доменов vh и vl, а также последовательности scFv приведены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002. Последовательности ABD, представляющие особый интерес в некоторых вариантах осуществления данного изобретения, продемонстрированы на фиг. 11 и включают в себя последовательности в перечне последовательностей с идентификаторами 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1 ; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1 ; 2A11_H3L2; 2A11 _H4L1; 2A11 _H4L2; 7G8 _H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11 ; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; и 7G8_H3L1.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, пригодные анти-LAG-3 ABD могут содержать набор из 6 CDR, как показано в этих последовательностях и фигурах, и являются либо подчеркнутыми, либо в случае использования другой системы нумерации, как описано в данном документе и как продемонстрировано в таблице 1, выступают в качестве CDR, которые идентифицируются с помощью других выравниваний в пределах последовательностей vh и vl SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417- 35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002. Пригодные ABD могут также включать в себя все последовательности vh и vl, как показано в этих последовательностях и фигурах, используемых как scFv или как Fab. Многие варианты осуществления данного изобретения, которые содержат Fv к LAG-3, представляют собой Fab мономер, который связывает LAG-3. Как обсуждалось в данном документе, другую из целевой пары, когда LAG-3 является одним из антигенов, выбирают из PD-1 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073-35394 и SEQ ID NO: 36127-36146 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), CTLA-4 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), TIM-3 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), BTLA (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)) и TIGIT (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 21504- 21523 и SEQ ID NO: 37435-37586 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)).

В дополнение к родительским наборам CDR, приведенным в перечне последовательностей, которые образуют ABD к LAG-3, в данном изобретении предлагаются варианты наборов CDR. В одном варианте осуществления данного изобретения, в набор из 6 CDR можно вносить 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных изменений по сравнению с родительскими CDR до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения.

В дополнение к родительским вариабельным доменам тяжелой цепи и вариабельным доменам легкой цепи, описанным в данном документе, которые образуют ABD к LAG-3, в данном изобретении предлагаются варианты доменов vh и vl. В одном варианте осуществления данного изобретения, в варианты доменов vh и vl можно вносить от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных изменений по сравнению с родительским доменом vh и vl до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения. В другом варианте осуществления данного изобретения, варианты vh и vl являются по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичными соответствующим родительским vh или vl, до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения.

Конкретные предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя 7G8_H3.30_L1.34 анти-LAG-3 Fv, в формате Fab, который включен в любой из каркасов формата открывалки бутылок по фиг. 37.

Конкретные предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя 7G8_H3.30_L1.34 анти-LAG-3 Fv, в формате scFv, который включен в любой из каркасов формата открывалки бутылок по фиг. 37.

E. Домены, связывающие антиген BTLA

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения один из ABD связывает BTLA. Пригодные наборы из 6 CDR и/или домены vh и vl, а также последовательности scFv приведены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738. Последовательности ABD, представляющие особый интерес в некоторых вариантах осуществления данного изобретения, продемонстрированы на фиг. 12 и также включают в себя последовательности в перечне последовательностей с идентификаторами 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; и 9C6_H1.11_L1.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, пригодные анти-BTLA ABD могут содержать набор из 6 CDR, как показано в этих последовательностях и фигурах, и являются либо подчеркнутыми, либо в случае использования другой системы нумерации, как описано в данном документе и как продемонстрировано в таблице 1, выступают в качестве CDR, которые идентифицируются с помощью других выравниваний в пределах последовательностей vh и vl SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738. Пригодные ABD могут также включать в себя все последовательности vh и vl, как показано в этих последовательностях и фигурах, используемых как scFv или как Fab. Многие варианты осуществления данного изобретения, которые содержат Fv к BTLA, представляют собой Fab мономер, который связывает BTLA. Как обсуждалось в данном документе, другую из целевой пары, когда LAG-3 является одним из антигенов, выбирают из PD-1 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073-35394 и SEQ ID NO: 36127-36146 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), CTLA-4 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), TIM-3 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), LAG-3 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)) и TIGIT (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 21504- 21523 и SEQ ID NO: 37435-37586 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)).

В дополнение к родительским наборам CDR, приведенным в перечне последовательностей, которые образуют ABD к BTLA, в данном изобретении предлагаются варианты наборов CDR. В одном варианте осуществления данного изобретения, в набор из 6 CDR можно вносить 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных изменений по сравнению с родительскими CDR до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения.

В дополнение к родительским вариабельным доменам тяжелой цепи и вариабельным доменам легкой цепи, описанным в данном документе, которые образуют ABD к BTLA, в данном изобретении предлагаются варианты доменов vh и vl. В одном варианте осуществления данного изобретения, в варианты доменов vh и vl можно вносить от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных изменений по сравнению с родительским доменом vh и vl до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения. В другом варианте осуществления данного изобретения, варианты vh и vl являются по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичными соответствующим родительским vh или vl, до тех пор, пока ABD будет сохранять способность связываться с антигеном-мишенью, что измеряется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения.

Конкретные предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя 9C6 H1.1 L1 анти-LAG-3 Fv в формате Fab, который включен в любой из каркасов формата открывалки бутылок по фиг. 37.

Конкретные предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя 7G8_H3.30_L1.34 анти-LAG-3 Fv, в формате scFv, который включен в любой из каркасов формата открывалки бутылок по фиг. 37.

F. Домены, связывающие антиген TIGIT

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения один из ABD связывает TIGIT. Пригодные наборы из 6 CDR и/или домены vh и vl, а также последовательности scFv приведены в SEQ ID NO: 21504-21523 и SEQ ID NO: 37435-37586.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, пригодные анти-TIGIT ABD могут содержать набор из 6 CDR, как показано в этих последовательностях и фигурах, и являются либо подчеркнутыми, либо в случае использования другой системы нумерации, как описано в данном документе и как продемонстрировано в таблице 1, выступают в качестве CDR, которые идентифицируются с помощью других выравниваний в пределах последовательностей vh и vl SEQ ID NO: 21504-21523 и SEQ ID NO: 37435-37586. Пригодные ABD могут также включать в себя все последовательности vh и vl, как показано в этих последовательностях и фигурах, используемых как scFv или как Fab. Многие варианты осуществления данного изобретения, которые содержат Fv к TIGIT, представляют собой Fab мономер, который связывает TIGIT. Как обсуждалось в данном документе, другую из целевой пары, когда LAG-3 является одним из антигенов, выбирают из PD-1 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 6209-11464, SEQ ID NO: 11465-17134, SEQ ID NO: 33003-33072, SEQ ID NO: 33073-35394 и SEQ ID NO: 36127-36146 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), CTLA-4 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 21-2918, SEQ ID NO: 2919-6208, SEQ ID NO: 36739-36818 и SEQ ID NO: 35395-35416 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), TIM-3 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 20765-20884, SEQ ID NO: 37587-37698 и SEQ ID NO: 36347-36706 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)), LAG-3 (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 17135-20764, SEQ ID NO: 36819-36962, SEQ ID NO: 35417-35606, SEQ ID NO: 25194-32793 и SEQ ID NO: 32794-33002 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)) и BTLA (пригодные последовательности приведены в SEQ ID NO: 20885-21503 и SEQ ID NO: 36707-36738 (которые могут быть последовательностями scFv, наборами последовательностей CDR или последовательностями vh и vl)).

G. Специфические биспецифические варианты осуществления данного изобретения

В данном изобретении предлагается ряд конкретных биспецифических антител, как описано ниже.

1. LAG-3 X CTLA-4

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются биспецифические гетеродимерные антитела, содержащие первый ABD, который связывает LAG-3 человека, и второй ABD, который связывает CTLA-4 человека, и может быть в любом формате, продемонстрированном на фиг. 1. Данное изобретение в большей своей части относится к формату открывалки бутылок, при этом Fab является стороной LAG-3, а сторона CLTA-4 является scFv стороной, но этот порядок может быть полностью изменен для всех вариантов осуществления данного изобретения.

В одном варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело LAG-3 X CTLA-4 находится в формате открывалки бутылок по фиг. 1A, при этом CTLA-4 ABD представляет собой scFv. В другом варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело LAG-3 X CTLA-4 находится в формате сentral-scFv по фиг. 1F, при этом LAG-3 ABD является компонентом Fab. В другом варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело LAG-3 X CTLA-4 находится в формате сentral-scFv по фиг. 1F, при этом CTLA-4 ABD представляет собой scFv.

Биспецифические антитела LAG-3 X CTLA-4 (либо в формате открывалки бутылок, либо в формате сentral-scFv), как правило, включают в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты, как описано в данном документе. То есть в любом формате, Fc-домены двух мономеров могут содержать искаженные варианты (например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг.3 и фиг.8), необязательно - абляционные варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 5), а мономер, содержащий Fab сторону (например, константный домен тяжелой цепи), содержит pI варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело LAG-3 X CTLA-4 содержит Fc-домены с искаженными вариантами, с особенно пригодными искаженными вариантами, выбранными из группы, состоящей из S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело LAG-3 X CTLA-4 включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер ("мономер scFv"), который содержит заряженный линкер scFv (с +H-последовательностью по фиг. 7, что является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты EE233P/L234V/L235A/G236del/S267K и Fv, который связывается с ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер"), который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K и вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с вариабельным доменом легкой цепи составляет Fv, который связывается со вторым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; и c) легкую цепь. В конкретном примере этого варианта осуществления данного изобретения используется LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 и CTLA-4 scFv [CTLA-4] _H3.23_L0.129, хотя любой из CTLA-4 или LAG-3 Fv в перечне последовательностей может быть спарен в любой комбинации и использован.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело LAG-3 X CTLA-4 включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают в себя форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер ("мономер scFv"), который содержит заряженный линкер scFv (с +H-последовательностью по фиг. 7, что является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и Fv, который связывается с ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер"), который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с вариабельным доменом легкой цепи составляет Fv, который связывается со вторым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; и c) легкую цепь. В конкретном примере этого варианта осуществления данного изобретения используется LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 и CTLA-4 scFv [CTLA-4] _H3.23_L0.129, хотя любой из CTLA-4 или LAG-3 Fv в перечне последовательностей может быть спарен в любой комбинации и использован.

Дополнительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя любой из каркасов по фиг. 37 с LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 и CTLA-4 scFv [CTLA-4] _H3.23_L0.129.

Дополнительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя любой из каркасов по фиг. 38 с LAG- 3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 и CTLA-4 scFv [CTLA-4]_H3.23_L0.129.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, для биспецифических антител LAG-3 X CLTA-4, Fv для Fab стороны LAG-3 выбирают из последовательностей в перечне последовательностей с идентификаторами 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A1_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; и 7G8_H3L1. Fv для scFv стороны CTLA-4 выбирают из последовательностей в перечне последовательностей с идентификаторами [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; 0[CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67; и [CTLA-4]_H3_L0.74.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело LAG-3 X CTLA-4 выбирают из тех конструкций, которые перечислены в SEQ ID NO: 35607-35866 и SEQ ID NO: 21524-22620.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело LAG-3 X CTLA-4 выбирают из XENP20206, XENP21582, XENP21584, XENP21588, XENP22123, XENP22124, XENP22125, XENP22604, XENP22672, XENP22847, XENP22847, XENP22841 и XENP22849.

2. BTLA X PD-1

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются биспецифические гетеродимерные антитела, содержащие первый ABD, который связывает BTLA человека, и второй ABD, который связывает PD-1 человека, при этом указанные антитела могут быть в любом формате, продемонстрированном на фиг. 1. Данное изобретение в большей своей части относится к формату открывалки бутылок, при этом Fab является стороной BTLA, а scFv является стороной PD-1, но этот порядок может быть полностью изменен для всех вариантов осуществления данного изобретения.

В одном варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело BTLA X PD-1 находится в формате открывалки бутылок по фиг. 1A, при этом PD-1 ABD представляет собой scFv. В другом варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело BTLA X PD-1 находится в формате central-scFv по фиг. 1F, при этом BTLA ABD является компонентом Fab. В другом варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело BTLA X PD-1 находится в формате central-scFv по фиг. 1F, при этом PD-1 ABD представляет собой scFv.

Биспецифические антитела BTLA X PD-1 (либо в формате открывалки бутылок, либо в формате central-scFv), как правило, обычно включают в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты, как описано в данном документе. То есть в любом формате, Fc-домены двух мономеров могут содержать искаженные варианты (например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг.3 и фиг.8), необязательно - абляционные варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 5), а мономер, содержащий Fab сторону (например, константный домен тяжелой цепи), содержит pI варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело BTLA X PD-1 содержит Fc-домены с искаженными вариантами, при этом особенно пригодные искаженные варианты выбирают из группы, состоящей из S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело BTLA X PD-1 включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают в себя форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер ("мономер scFv"), который содержит заряженный линкер scFv (с +H-последовательностью по фиг. 7, что является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K, и Fv, который связывается с ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер"), который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K и вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с вариабельным доменом легкой цепи составляет Fv, который связывается со вторым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; и c) легкую цепь. В конкретном примере этого варианта осуществления данного изобретения используется BTLA Fab 9C6_H1.1_L1 и PD-1 scFv 1G6_L1.194_H 1.279, хотя любой из BTLA или PD-1 Fv в перечне последовательностей может быть спарен в любой комбинации и использован.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело BTLA X PD-1 включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер ("мономер scFv"), который содержит заряженный линкер scFv (с +H-последовательностью по фиг. 7, что является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и Fv, который связывается с ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер"), который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K и вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с вариабельным доменом легкой цепи составляет Fv, который связывается со вторым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; и c) легкую цепь. В конкретном примере этого варианта осуществления данного изобретения используется BTLA Fab 9C6 H1.1 L1 и PD-1 scFv 1G6_L1.194_H 1.279, хотя любой из BTLA или PD-1 Fv в перечне последовательностей может быть спарен в любой комбинации и использован.

Дополнительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя любой из каркасов по фиг. 37 с BTLA Fab 9C6_H1.1_L1 и PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279.

Дополнительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя любой из каркасов по фиг. 37 с BTLA Fab 9C6_H1.1_L1 и PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, для биспецифических антител BTLA X PD-1, Fv для Fab стороны BTLA выбирают из последовательностей в перечне последовательностей с идентификаторами 9C6_H0L0, 9C6_H1.1_L1, 9C6_H1.11_L1. Fv для scFv стороны PD-1 выбирают из последовательностей в перечне последовательностей с идентификаторами 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1 G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; и 2E9_H1L1.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело BTLA X PD-1 выбирают из конструкций, включая те, которые перечислены как SEQ ID NO: 22724-23315 и SEQ ID NO: 36147-36166.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело BTLA X PD-1 выбирают из XENP20895, XENP21220, XENP21221 и XENP22858.

3. CTLA-4 X PD-1

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются биспецифические гетеродимерные антитела, содержащие первый ABD, который связывает CTLA-4 человека, и второй ABD, который связывает PD-1 человека, при этом указанные антитела могут быть в любом формате, продемонстрированном на фиг. 1. Данное изобретение в большей своей части относится к формату открывалки бутылок, при этом Fab является стороной CTLA-4, а scFv является стороной PD-1, но этот порядок может быть полностью изменен для всех вариантов осуществления данного изобретения.

В одном варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело CTLA-4 X PD-1 находится в формате открывалки бутылок по фиг. 1A, при этом PD-1 ABD представляет собой scFv. В другом варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело CTLA-4 X PD-1 находится в формате сentral-scFv по фиг. 1F, при этом CTLA-4 ABD является компонентом Fab. В другом варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело CTLA-4 X PD-1 находится в формате сentral-scFv по фиг. 1F, при этом PD-1 ABD представляет собой scFv.

Биспецифические антитела CTLA-4 X PD-1 (либо в формате открывалки бутылок, либо в формате сentral-scFv), как правило, включают в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты, как описано в данном документе. То есть в любом формате, Fc-домены двух мономеров могут содержать искаженные варианты (например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг.3 и фиг.8), необязательно - абляционные варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 5), а мономер, содержащий Fab сторону (например, константный домен тяжелой цепи), содержит pI варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело CTLA-4 X PD-1 содержит Fc-домены с искаженными вариантами, при этом особенно пригодные искаженные варианты выбирают из группы, состоящей из S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело CTLA-4 X PD-1 включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер ("мономер scFv"), который содержит заряженный линкер scFv (с +H-последовательностью по фиг. 7, что является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K и Fv, который связывается с ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер"), который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K и вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с вариабельным доменом легкой цепи составляет Fv, который связывается со вторым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; и c) легкую цепь. В конкретном примере этого варианта осуществления данного изобретения используется CTLA-4 Fab [CTLA-4]_H3_L0.22 и PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279, хотя любой из CTLA-4 или PD-1 Fv в перечне последовательностей может быть спарен в любой комбинации и использован.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело CTLA-4 X PD-1 включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер ("мономер scFv"), который содержит заряженный линкер scFv (с +H-последовательностью по фиг. 7, что является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и Fv, который связывается с ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер"), который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K и вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с вариабельным доменом легкой цепи составляет Fv, который связывается со вторым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; и c) легкую цепь. В конкретном примере этого варианта осуществления данного изобретения используется CTLA-4 Fab [CTLA-4]_H3_L0.22 и PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279, хотя любой из CTLA-4 или PD-1 Fv в перечне последовательностей может быть спарен в любой комбинации и использован.

Дополнительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя любой из каркасов по фиг. 37 CTLA-4 Fab [CTLA-4]_H3_L0.22 и PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279.

Дополнительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя любой из каркасов по фиг. 38 с CTLA-4 Fab [CTLA-4] _H3_L0.22 и PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, для биспецифических антител CTLA-4 X PD-1, Fv для Fab стороны CTLA-4 выбирают из последовательностей в перечне последовательностей с идентификаторами [CTLA-4] _H0.25_L0 ; [CTLA-4] _H0.26_L0; [CTLA-4] _H0.27_L0; [CTLA-4] _H0.29_L0; [CTLA-4] _H0.38_L0; [CTLA-4] _H0.39_L0; 0 [CTLA-4] _H0.40_L0; [CTLA-4] _H0.70_L0; [CTLA-4] _H0_L0.22; [CTLA-4] _H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121 ; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67; и [CTLA-4]_H3_L0.74. Fv для scFv стороны PD-1 выбирают из последовательностей в перечне последовательностей с идентификаторами 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; и 2E9_H1L1.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело CTLA-4 X PD-1 выбирают из тех, которые перечислены как SEQ ID NO: 36167-36346 и SEQ ID NO: 23316-23735.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело CTLA-4 X PD-1 выбирают из XENP19738, XENP19739, XENP19741, XENP20053, XENP20066, XENP20130, XENP20146, XENP20717 и XENP22836.

4. LAG-3 X PD-1

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются биспецифические гетеродимерные антитела, содержащие первый ABD, который связывает LAG-3 человека, и второй ABD, который связывает PD-1 человека, при этом указанные антитела могут быть в любом формате, продемонстрированном на фиг. 1. Данное изобретение в большей своей части относится к формату открывалки бутылок, при этом Fab является стороной LAG-3, а scFv является стороной PD-1, но этот порядок может быть полностью изменен для всех вариантов осуществления данного изобретения.

В одном варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело LAG-3 X PD-1 находится в формате открывалки бутылок по фиг. 1A, при этом PD-1 ABD представляет собой scFv. В другом варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело LAG-3 X PD-1 находится в формате сentral-scFv по фиг. 1F, при этом LAG-3 ABD являются компонентами Fab. В другом варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело LAG-3 X PD-1 находится в формате central-scFv по фиг. 1F, при этом PD-1 ABD представляет собой scFv.

Биспецифические антитела LAG-3 X PD-1 (либо в формате открывалки бутылок, либо в формате central-scFv), как правило, обычно включают в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты, как описано в данном документе. То есть в любом формате, Fc-домены двух мономеров могут содержать искаженные варианты (например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг.3 и фиг.8), необязательно - абляционные варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 5), а мономер, содержащий Fab сторону (например, константный домен тяжелой цепи), содержит pI варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело LAG-3 X PD-1 содержит Fc-домены с искаженными вариантами, при этом особенно пригодные искаженные варианты выбирают из группы, состоящей из S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело LAG-3 X PD-1 включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают в себя форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер ("мономер scFv"), который содержит заряженный линкер scFv (с +H-последовательностью по фиг. 7, что является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K, и Fv, который связывается с ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер"), который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K и вариабельный домен тяжелой цепи, который с вариабельным доменом легкой цепи составляет Fv, который связывается со вторым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; и c) легкую цепь. В конкретном примере этого варианта осуществления данного изобретения используется LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 и PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279, хотя любой из LAG-3 или PD-1 Fv в перечне последовательностей может быть спарен в любой комбинации и использован.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело LAG-3 X PD-1 включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер ("мономер scFv"), который содержит заряженный линкер scFv (с +H-последовательностью по фиг. 7, что является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и Fv, который связывается с ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер"), который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и вариабельный домен тяжелой цепи, который с вариабельным доменом легкой цепи составляет Fv, который связывается со вторым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; и c) легкую цепь. В конкретном примере этого варианта осуществления данного изобретения используется LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 и PD-1 scFv 1G6_L1.194_H 1.279, хотя любой из LAG-3 или PD-1 Fv в перечне последовательностей может быть спарен в любой комбинации и использован.

Дополнительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя любой из каркасов по фиг. 37 с LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 и PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279.

Дополнительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя любой из каркасов по фиг. 38 с LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 и PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, для биспецифических антител LAG-3 X PD-1, Fv для Fab стороны LAG-3 выбирают из последовательностей в перечне последовательностей с идентификаторами 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11 H1 L2.91; 2A11 H1 L2.93; 2A11 H1 L2.97; 2A11 H1L1 ; 2A11 H1L2; 2A11 H2L2; 2A11 H3L1; 2A11 H3L2; 2A11 H4L1 ; 2A11 H4L2; 7G8 H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1 ; 7G8_H3.28_L1.11 ; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; и 7G8_H3L1. Fv для scFv стороны PD-1 выбирают из последовательностей в перечне последовательностей с идентификаторами 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; и 2E9_H1L1.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело LAG-3 X PD-1 выбирают из конструкций, включая те, которые перечислены как SEQ ID NO: 35867-36126 и SEQ ID NO: 23736-25133.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело LAG-3 X PD-1 выбирают из XENP20206, XENP21582, XENP21584, XENP21588, XENP22123, XENP22124, XENP22125, XENP22604, XENP22672, XENP22847, XENP22847 и XENP22849

5. TIGIT X PD-1

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело TIGIT X PD-1 выбирают из тех конструкций, которые перечислены в SEQ ID NO: 25134-25173.

6. TIM-3 X PD-1

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются биспецифические гетеродимерные антитела, содержащие первый ABD, который связывает TIM-3 человека, и второй ABD, который связывает PD-1 человека, при этом указанные антитела могут быть в любом формате, продемонстрированном на фиг. 1. Данное изобретение в большей своей части относится к формату открывалки бутылок, при этом Fab является стороной TIM-3, а scFv является стороной PD-1, но этот порядок может быть полностью изменен для всех вариантов осуществления данного изобретения.

В одном варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело TIM-3 X PD-1 находится в формате открывалки бутылок по фиг. 1A, при этом PD-1 ABD представляет собой scFv. В другом варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело TIM-3 X PD-1 находится в формате central-scFv по фиг. 1F, при этом TIM-3 ABD являются компонентами Fab. В другом варианте осуществления данного изобретения биспецифическое антитело TIM-3 X PD-1 находится в формате central-scFv по фиг. 1F, при этом PD-1 ABD представляет собой scFv.

Биспецифические антитела TIM-3 X PD-1 (либо в формате открывалки бутылок, либо в формате central-scFv), как правило, обычно включают в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты, как описано в данном документе. То есть в любом формате, Fc-домены двух мономеров могут содержать искаженные варианты (например, набор аминокислотных замен, как продемонстрировано на фиг.3 и фиг.8), необязательно - абляционные варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 5), а мономер, содержащий Fab сторону (например, константный домен тяжелой цепи), содержит pI варианты (включая те, которые продемонстрированы на фиг. 4).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело TIM-3 X PD-1 содержит Fc-домены с искаженными вариантами, при этом особенно пригодные искаженные варианты выбирают из группы, состоящей из S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W и T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело TIM-3 X PD-1 включает в себя искаженные варианты, pI варианты и абляционные варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают в себя форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер ("мономер scFv"), который содержит заряженный линкер scFv (с +H-последовательностью по фиг. 7, что является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K, и Fv, который связывается с ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер"), который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K и вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с вариабельным доменом легкой цепи составляет Fv, который связывается со вторым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; и c) легкую цепь. В конкретном примере этого варианта осуществления данного изобретения используется PD-1 scFv 1 G6_L1.194_H 1.279, хотя любой из TIM-3 или PD-1 Fv в перечне последовательностей может быть спарен в любой комбинации и использован.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело TIM-3 X PD-1 включает в себя искаженные варианты, pI варианты, абляционные варианты и FcRn варианты. Соответственно, некоторые варианты осуществления данного изобретения включают форматы открывалки бутылок, которые содержат: а) первый мономер ("мономер scFv"), который содержит заряженный линкер scFv (с +H-последовательностью по фиг. 7, что является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления данного изобретения), искаженные варианты S364K/E357Q, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K, FcRn варианты M428L/N434S и Fv, который связывается с ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; b) второй мономер ("Fab мономер"), который содержит искаженные варианты L368D/K370S, pI варианты N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, абляционные варианты E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K и вариабельный домен тяжелой цепи, который вместе с вариабельным доменом легкой цепи составляет Fv, который связывается со вторым ингибитором контрольной точки, как описано в данном документе; и c) легкую цепь. В конкретном примере этого варианта осуществления данного изобретения используется PD-1 scFv 1G6_L1.194_H 1.279, хотя любой из TIM-3 или PD-1 Fv в перечне последовательностей может быть спарен в любой комбинации и использован.

Дополнительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя любой из каркасов по фиг. 37 с Fab стороной TIM-3 и scFv стороной PD-1 1G6_L1.194_H1.279.

Дополнительные варианты осуществления данного изобретения включают в себя любой из каркасов по фиг. 38 с Fab стороной TIM-3 и scFv стороной PD-1 1G6_L1.194_H1.279.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, для биспецифических антител "Fab сторона TIM-3 X PD-1", Fv для Fab стороны TIM-3 выбирают из последовательностей в перечне последовательностей с идентификаторами 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B1 1_H0L0; 7B11 var_H0L0; и 7C2_ H0L0. Fv для scFv стороны PD-1 выбирают из последовательностей в перечне последовательностей с идентификаторами 1G6 H1.279 L 1.194; 1 G6_H1.280_L1.224; 1 G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; и 2E9_H1L1.

Кроме того, антитела по данному изобретению включают те антитела, которые связываются либо с одним и тем же эпитопом, в качестве антигенсвязывающих доменов, описанных в данном документе, либо конкурируют за связывание с антигенсвязывающими доменами, описанными в данном документе. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения биспецифическое антитело контрольной точки может содержать один из ABD, описанных в данном документе, и второй ABD, который конкурирует за связывание с одним из ABD, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения оба ABD конкурируют за связывание с соответствующим ABD, описанным в данном документе. Конкурентное связывание, как правило, определяется с помощью по меньшей мере одного из анализов: Biacore, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и/или BLI (биослойная интерферометрия, например, анализ Octet), причем последний анализ находит свое конкретное применение во многих вариантах осуществления данного изобретения.

VII. Пригодные варианты осуществления данного изобретения

В одном варианте осуществления данного изобретения конкретная комбинация искаженных вариантов и pI вариантов, которая находит применение в данном изобретении, представляет собой T366S/L368A/Y407V : T366W (необязательно включающая дисульфидный мостик, T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C), при этом один мономер содержит Q295E/N384D/Q418E/N481D, а другой - положительно заряженный линкер scFv (когда формат включает в себя scFv-домен ). Как будет понятно специалистам в данной области техники, варианты "выступы во впадины" не изменяют pI и, следовательно, могут применяться на любом мономере.

VIII. Нуклеиновые кислоты по данному изобретению

В данном изобретении также предлагаются композиции нуклеиновых кислот, кодирующих биспецифические антитела по данному изобретению (или, в случае "моноспецифических" антител, нуклеиновые кислоты, кодирующие их).

Как будет понятно специалистам в данной области техники, указанные композиции нуклеиновых кислот будут зависеть от формата и каркаса гетеродимерного белка. Так, например, когда формат требует трех аминокислотных последовательностей, например, для всех форматов, проиллюстрированных на фиг. 1, за исключением формата двойного scFv, три последовательности нуклеиновых кислот могут быть включены в один или большее количество экспрессионных векторов для экспрессии. Аналогичным образом, для некоторых форматов (например, форматов двойного scFv, таких как проиллюстрированные на фиг. 1) необходимы только две нуклеиновые кислоты; опять же, они могут быть помещены в один или два экспрессионных вектора.

Как известно в данной области техники, нуклеиновые кислоты, кодирующие компоненты по данному изобретению, могут быть включены в экспрессионные векторы, как известно в данной области техники, и в зависимости от клеток-хозяев, могут применяться для получения гетеродимерных антител по данному изобретению. Обычно нуклеиновые кислоты функционально связаны с любым количеством регуляторных элементов (промоторы, репликаторы, селективные маркеры, участки связывания рибосом, индукторы и т.д.). Экспрессионные векторы могут быть внехромосомными или интегрирующими векторами.

Нуклеиновые кислоты и/или экспрессионные векторы по данному изобретению затем превращаются в любое количество различных типов клеток-хозяев, как хорошо известно в данной области техники, включая клетки млекопитающих, бактерий, дрожжей, насекомых и/или грибов, с клетками млекопитающих (например, клетками СНО), находят применение во многих вариантах осуществления данного изобретения.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие каждый мономер и необязательную нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, что применительно в зависимости от формата, содержатся в пределах одного экспрессионного вектора, как правило, с разными или одинаковыми промоторными контролями. В вариантах осуществления конкретного применения в данном изобретении каждая из этих двух или трех нуклеиновых кислот содержится в другом экспрессионном векторе. Как продемонстрировано в данном документе и в 62/025931, включенных в данное описание посредством ссылки, для регулирования образования гетеродимеров могут применяться различные векторные соотношения. То есть, как ни удивительно, в то время как белки содержат легкие цепи первого мономера : второго мономера (в случае многих из вариантов осуществления данного изобретения, которые имеют три полипептида, включающих гетеродимерное антитело) в соотношении 1:1:2, это не те соотношения, которые дают самые лучшие результаты.

Гетеродимерные антитела по данному изобретению получают путем культивирования клеток-хозяев, содержащих экспрессионный(е) вектор(ы), как хорошо известно в данной области техники. После получения осуществляют традиционные этапы очистки антител, включая этап ионообменной хроматографии. Как обсуждалось в данном документе, наличие различий значений pI двух мономеров по меньшей мере на 0,5, может обеспечить разделение посредством ионообменной хроматографии или изоэлектрической фокусировки или других способов, чувствительных к изоэлектрической точке. То есть включение pI замен, которые изменяют изоэлектрическую точку (pI) каждого мономера так, что каждый мономер имеет отдельное значение pI и гетеродимер также имеет отличительное значение pI, что облегчает изоэлектрическую очистку гетеродимера "тройного F" (например, анионные обменные колонки, катионные обменные колонки). Эти замены также способствуют определению и мониторингу любых контаминирующих двойных гомодимеров scFv-Fc и mAb после очистки (например, гели ИЭФ, кИЭФ и аналитические колонки ИОХ).

IX. Биологическая и биохимическая функциональность гетеродимерной контрольной точки

Антитела

Как правило, биспецифические антитела контрольной точки по данному изобретению вводят пациентам с раком, при этом эффективность оценивают с помощью ряда способов, как описано в данном документе. Таким образом, параллельно с проведением стандартных анализов эффективности, таких как раковая нагрузка, размер опухоли, оценка наличия или степени метастазирования и т.д., иммуно-онкологические методы лечения можно также оценить на основании анализа иммунного статуса. Это можно осуществить с помощью ряда способов, включая как анализы in vitro, так и in vivo. Например, может быть проведена оценка изменений иммунного статуса (например, наличие ICOS+ CD4+ Т-клеток после лечения ipI), а также "давно известные" измерения, такие как опухолевая нагрузка, размер, инвазивность, вовлеченность лимфатических узлов (ЛУ), метастазы и т.д. Таким образом, можно оценить любой или все из следующих процессов: ингибирующие эффекты контрольных точек на активацию или пролиферацию CD4+ Т-клеток, активацию или пролиферацию CD8+ T (CTL), цитотоксическую активность, опосредованную CD8+ Т-клетками, и/или истощение клеток, опосредуемое CTL, активность NK-клеток и NK-опосредованное истощение клеток, потенцирующие эффекты контрольных точек на дифференцировку и пролиферацию, а также иммуносупрессию, опосредованную супрессорными клетками миелоидного или Treg-происхождения (MDSC) или иммунную толерантность и/или эффекты контрольных точек на продуцирование провоспалительных цитокинов иммунными клетками, например, продуцирование IL-2, IFN-г или TNF-a Т или другими иммунными клетками.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения оценку лечения проводят путем анализа пролиферации иммунных клеток, используя, например, метод разбавления CFSE, внутриклеточное окрашивание иммунных эффекторных клеток Ki67 и метод включения 3H-тимидина.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения оценку лечения проводят путем анализа повышения экспрессии гена или повышения уровней белка маркеров, ассоциированных с активацией, включая один или большее количество из следующих элементов: CD25, CD69, CD137, ICOS, PD1, GITR, OX40, и дегрануляции клеток, измеряемой поверхностной экспрессией CD107α.

В большинстве случаев анализы экспрессии генов выполняются так, как известно в данной области техники.

В большинстве случаев измерения экспрессии белка также аналогичным образом выполняются так, как известно в данной области техники.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения оценку лечения проводят путем анализа цитотоксической активности, измеряемой с помощью определения жизнеспособности клеток-мишеней посредством оценки многочисленных параметров клеток, таких как активность ферментов (включая активность протеаз), проницаемость клеточной мембраны, клеточная адгезия, продукция АТФ, продуцирование коферментов и активность поглощения нуклеотидов. Конкретные примеры этих анализов включают, но не ограничиваются ими, окрашивание трипановым синим или pI, способ высвобождения 51 Cr или 35S, активность ЛДГ, анализ MTT и/или WST, анализ кальцеин-AM, анализ на основе люминесценции и другие.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения оценку лечения проводят путем анализа активности Т-клеток, измеряемой по продуцированию цитокинов, которое оценивают либо внутриклеточно в культуре супернатанта с использованием цитокинов, включая, но не ограничиваясь ими, IFNγ, TNFa, GM-CSF, IL2, IL6, IL4, IL5, IL10, IL13 с помощью хорошо известных методов.

Соответственно, оценка лечения может проводиться с помощью анализов, которые оценивают один или большее количество из следующих процессов: (i) повышение иммунного ответа, (ii) повышение активации бв и/ или гд Т-клеток, (iii) повышение цитотоксической активности Т-клетки, (iv) повышение активности NK- и/или NKT-клеток, (v) облегчение супрессии бв и/или гд Т-клеток, (vi) повышение провоспалительной секреции цитокинов, (vii) повышение секреции IL-2; (viii) повышение продукции интерферона-г, (ix) усиление ответа Thl, (x) ослабление ответа Th2, (xi) уменьшение количества или элиминация клеток и/или активности по меньшей мере одной из регуляторных Т-клеток (Tregs).

Анализы для измерения эффективности

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения активацию Т-клеток оценивают с помощью анализа реакции смешанных лимфоцитов (MLR), как известно в данной области техники. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение иммунного ответа, что измеряется, например, посредством фосфорилирования или дефосфорилирования различных факторов, или посредством измерения других посттрансляционных модификаций. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение активации αβ и/или γδ Т-клеток, что измеряется, например, посредством секреции или пролиферации цитокинов, или посредством изменений экспрессии маркеров активации, как, например, CD137, CD107α, PD1 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение активности цитотоксических Т-клеток, что измеряется, например, посредством прямого уничтожения клеток-мишеней, как, например, раковых клеток, или посредством секреции цитокинов или посредством пролиферации или посредством изменения экспрессии маркеров активации, как, например, CD 137, CD107α, PD1 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение активности NK и/или NKT-клеток, что измеряется, например, посредством прямого уничтожения клеток-мишеней, как, например, раковых клеток, или посредством секреции цитокинов или посредством изменения экспрессии маркеров активации, как, например, CD 107α и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение супрессии αβ и/или γδ Т-клеток, что измеряется, например, посредством секреции цитокинов или посредством пролиферации, или посредством изменений экспрессии маркеров активации, как, например, CD137, CD107α, PD1 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение секреции провоспалительных цитокинов, что измеряется, например, с помощью ИФА или Luminex, или с помощью метода на основе гранул Multiplex, или с помощью внутриклеточного окрашивания и анализа FACS, или с помощью Alispot и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение секреции IL-2, что измеряется, например, с помощью ИФА или Luminex, или с помощью метода на основе гранул Multiplex, или с помощью внутриклеточного окрашивания и анализа FACS, или с помощью Alispot и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение продуцирования интерферона-г, что измеряется, например, с помощью ИФА или Luminex, или с помощью метода на основе гранул Multiplex, или с помощью внутриклеточного окрашивания и анализа FACS, или с помощью Alispot и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение Th1-ответа, что измеряется, например, посредством секреции цитокинов, или посредством изменения экспрессии маркеров активации. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение Th2-ответа, что измеряется, например, посредством секреции цитокинов, или посредством изменений экспрессии маркеров активации. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение количества клеток и/или активности по меньшей мере одной из регуляторных Т-клеток (Tregs), что измеряется, например, с помощью проточной цитометрии или с помощью ИГХ. Снижение ответа указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие снижения являются такими же, как и повышения, описанные ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение количества клеток макрофагов M2, что измеряется, например, с помощью проточной цитометрии или с помощью ИГХ. Снижение ответа указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие снижения являются такими же, как и повышения, описанные ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение протуморогенной активности макрофагов M2, что измеряется, например, посредством секреции цитокинов, или посредством изменений экспрессии маркеров активации. Снижение ответа указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие снижения являются такими же, как и повышения, описанные ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение количества клеток нейтрофилов N2, что измеряется, например, с помощью проточной цитометрии или с помощью ИГХ. Снижение ответа указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие снижения являются такими же, как и повышения, описанные ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение протуморогенной активности нейтрофилов N2, что измеряется, например, посредством секреции цитокинов, или посредством изменений экспрессии маркеров активации. Снижение ответа указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие снижения являются такими же, как и повышения, описанные ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение T ингибирования активации Т-клеток, что измеряется, например, посредством секреции цитокинов, или пролиферации, или посредством изменений экспрессии маркеров активации, как, например, CD 137, CD107α, PD1 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение ингибирования активации CTL, что измеряется, например, посредством прямого уничтожения клеток-мишеней, как, например, раковых клеток, или посредством секреции цитокинов или посредством пролиферации или посредством изменений экспрессии маркеров активации, как, например, CD137, CD107α, PD1 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет увеличение или уменьшение истощения бв и/или гд Т-клеток, что измеряется, например, посредством изменений экспрессии маркеров активации. Снижение ответа указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие снижения являются такими же, как и повышения, описанные ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение ответа αβ и/или γδ Т-клеток, что измеряется, например, посредством секреции цитокинов, или посредством пролиферации или посредством изменений экспрессии маркеров активации, как, например, CD137, CD107α, PD1 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение стимуляции антиген-специфических ответов памяти, что измеряется, например, посредством секреции цитокинов, или посредством пролиферации или изменениями экспрессии маркеров активации, как, например, CD45RA, CCR7 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет увеличение или уменьшение апоптоза или лизиса раковых клеток, что измеряется, например, с помощью анализов цитотоксичности, таких как, например, MTT, высвобождение Cr, кальцеин-AM, или с помощью анализов на основе проточной цитометрии, таких как, например, разбавление CFSE или окрашивание пропидием йодидом и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение стимуляции цитотоксического или цитостатического воздействия на раковые клетки, что измеряется, например, с помощью анализов цитотоксичности, таких как, например, MTT, высвобождение Cr, кальцеин-AM, или с помощью анализов на основе проточной цитометрии, таких как, например, разбавление CFSE или окрашивание пропидием йодидом и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет увеличение или уменьшение уничтожения раковых клеток, что измеряется, например, с помощью анализов цитотоксичности, таких как, например, MTT, высвобождение Cr, кальцеин-AM, или с помощью анализов на основе проточной цитометрии, таких как, например, разбавление CFSE или окрашивание пропидием йодидом и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет повышение или снижение активности Th17, что измеряется, например, посредством секреции цитокинов или посредством пролиферации или посредством изменений экспрессии маркеров активации. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения анализ сигнального пути измеряет увеличение или уменьшение индукции комплементзависимой цитотоксичности и/или антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, что измеряется, например, с помощью анализов цитотоксичности, таких как, например, MTT, высвобождение Cr, кальцеин-AM, или с помощью анализов на основе проточной цитометрии, таких как, например, разбавление CFSE или окрашивание пропидием йодидом и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения активацию Т-клеток измеряют, например, посредством прямого уничтожения клеток-мишеней, как, например, раковых клеток, или посредством секреции цитокинов или посредством пролиферации или посредством изменений экспрессии маркеров активации, как, например, CD 137, CD107α, PD1 и т.д. Что касается Т-клеток, увеличение пролиферации, маркеры клеточной поверхности активации (например, CD25, CD69, CD137 и PD1), цитотоксичность (способность уничтожать клетки-мишени) и продукция цитокинов (например, IL-2, IL- 4, IL-6, IFN-г, TNF-a, IL-10, IL-17A) будут свидетельствовать о иммунной модуляции, которая будет соответствовать усиленному уничтожению раковых клеток.

В одном варианте осуществления данного изобретения активацию NK-клеток измеряют, например, посредством прямого уничтожения клеток-мишеней, как, например, раковых клеток, или посредством секреции цитокинов или посредством изменений экспрессии маркеров активации, как, например, CD107α и т.д. Что касается NK-клеток, увеличение пролиферации, цитотоксичность (способность уничтожать клетки-мишени и увеличение экспрессии CD107α, гранзима, и экспрессии перфорина), продуцирование цитокинов (например, IFN-г и TNF), и экспрессия рецептора клеточной поверхности (например, CD25) будут свидетельствовать о иммунной модуляции, которая будет соответствовать усиленному уничтожению раковых клеток.

В одном варианте осуществления данного изобретения активацию гд T-клеток измеряют, например, посредством секреции цитокинов или посредством пролиферации или посредством изменений экспрессии маркеров активации.

В одном варианте осуществления данного изобретения активацию Th1 -клеток измеряют, например, посредством секреции цитокинов или посредством изменений экспрессии маркеров активации.

Соответствующие повышения активности или ответа (или снижения, в зависимости от конкретного случая, как указано выше) составляют 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95% или 98-99% от сигнала либо эталонного образца, либо контрольных образцов, например, исследуемых образцов, которые не содержат антитела по данному изобретению. Аналогичным образом, по меньшей мере одно-, двух, трех-, четырех- или пятикратное повышение по сравнению с эталонными или контрольными образцами демонстрирует эффективность.

X. Способы лечения

После изготовления, композиции по данному изобретению находят применение для ряда онкологических показаний при лечении рака, как правило, путем ингибирования подавления активации Т-клеток (например, Т-клетки больше не подавляются) с помощью связывания биспецифических антител контрольных точек по данному изобретению.

Соответственно, гетеродимерные композиции по данному изобретению находят применение при лечении этих видов рака.

XI. Комбинированные виды терапии

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, когда биспецифическое антитело контрольной точки не включает антигенсвязывающий домен анти-PD-1, биспецифическое антитело можно вводить совместно с отдельным антителом анти-PD-1, таким как пембролизумаб (Кейтруда®) или ниволумаб (Опдиво®). Совместное введение может быть выполнено одновременно или последовательно, как будет понятно специалистам в данной области техники.

То есть, описанное в данном документе биспецифическое антитело контрольной точки CTLA-4 X LAG-3 или такое, как любое из тех, которые включают в себя последовательности анти-LAG-3 и последовательности анти-CTLA-4 из перечня последовательностей и, в частности, XENP22602, XENP 22675, XENP22841 или XENP 22843, можно вводить совместно с антителом анти-PD-1.

Аналогичным образом, описанное в данном документе биспецифическое антитело контрольной точки BTLA X CTLA-4 или такое, как любое из тех, которые включают в себя последовательности анти-BTLA и последовательности анти-CTLA-4 из перечня последовательностей, можно вводить совместно с антителом анти-PD -1.

Биспецифическое антитело контрольной точки CTLA-4 X TIM-3 или такое, как любое из тех, которые включают в себя последовательности анти-TIM-3 и последовательности анти-CTLA-4 из перечня последовательностей, можно вводить совместно с антителом анти-PD-1.

Биспецифическое антитело контрольной точки CTLA-4 и TIGIT или такое, как любое из тех, которые включают в себя последовательности анти-CTLA-4 и анти-TIGIT из перечня последовательностей, можно вводить совместно с антителом анти-PD -1.

Биспецифическое антитело контрольной точки TIM-3 и LAG-3 или такое, как любое из тех, которые включают в себя последовательности анти-TIM-3 и последовательности анти-LAG-3 из перечня последовательностей, можно вводить совместно с антителом анти-PD-1.

Биспецифическое антитело контрольной точки TIM-3 и TIGIT или такое, как любое из тех, которые включают в себя последовательности анти-TIM-3 и последовательности анти-TIGIT из перечня последовательностей, можно вводить совместно с антителом анти-PD-1.

Биспецифическое антитело контрольной точки TIM-3 и BTLA или такое, как любое из тех, которые включают в себя последовательности анти-TIM-3 и анти-BTLA из перечня последовательностей, можно вводить совместно с антителом анти-PD-1.

Биспецифическое антитело контрольной точки LAG-3 и TIGIT или такое, как любое из тех, которые включают в себя последовательности анти-LAG-3 и последовательности анти-TIGIT из перечня последовательностей, можно вводить совместно с антителом анти-PD-1.

Биспецифическое антитело контрольной точки LAG-3 и BTLA или такое, как любое из тех, которые включают в себя последовательности анти-LAG-3 и последовательности анти-BTLA из перечня последовательностей, можно вводить совместно с антителом анти-PD-1.

Биспецифическое антитело контрольной точки TIGIT и BTLA или такое, как любое из тех, которые включают в себя последовательности анти-TIGIT и последовательности анти-BTLA из перечня последовательностей, можно вводить совместно с антителом анти-PD-1.

XII. Композиции антител для введения in vivo

Составы антител, применяемых согласно данному изобретению, готовят для хранения путем смешивания антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (как это в общих чертах описано в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, буферы, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают в себя буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутил или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен, катехол, резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и m-крезол); низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN ™, PLURONICS ™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Способы введения

Антитела и химиотерапевтические агенты по данному изобретению вводят субъекту в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение в виде болюса или путем непрерывной инфузии в течение определенного периода времени.

Способы лечения

В способах по данному изобретению терапия применяется для обеспечения положительного терапевтического ответа в отношении заболевания или патологического состояния. Под "положительным терапевтическим ответом" подразумевается положительная динамика заболевания или патологического состояния и/или ослабление симптомов, связанных с заболеванием или патологическим состоянием. Например, положительный терапевтический ответ будет относиться к одному или большему количеству из следующих явлений положительной динамики заболевания: (1) уменьшение числа неопластических клеток; (2) повышение гибели опухолевых клеток; (3) ингибирование выживаемости неопластических клеток; (5) ингибирование (т.е. замедление до некоторой степени, предпочтительно прекращение) роста опухоли; (6) повышение выживаемости пациентов; и (7) некоторое ослабление одного или большего количества симптомов, связанных с заболеванием или патологическим состоянием.

Положительные терапевтические ответы при любом заболевании или патологическом состоянии могут определяться стандартизованными критериями ответа, специфичными для этого заболевания или патологического состояния. Ответ опухоли может оцениваться на предмет изменений морфологии опухоли (то есть, общая опухолевая нагрузка, размер опухоли и т.п.) с помощью скрининговых методов, таких как магнитно-резонансное томографическое сканирование (МРТ), рентгенографическая визуализация, компьютерное томографическое сканирование (КТ), сканирование костей, эндоскопия и отбор проб биопсии опухоли, включая аспирацию костного мозга (BMA) и подсчет опухолевых клеток в системе кровообращения.

В дополнение к этим положительным терапевтическим ответам, субъект, получающий терапию, может испытать положительный эффект, заключающийся в ослаблении симптомов, связанных с заболеванием.

Лечение согласно данному изобретению включает "терапевтически эффективное количество" применяемых лекарственных средств. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата.

Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как течение заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, а также способность лекарственных средств вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также является таковым, при котором терапевтически полезные эффекты антитела или части антитела превосходят любые токсичные или вредные воздействия.

"Терапевтически эффективное количество" для лечения опухолей также может быть измерено его способностью стабилизировать прогрессирование заболевания. Способность соединения ингибировать рак может быть оценена в системе модели животного, прогнозирующей эффективность при опухолях человека.

В альтернативном варианте, это свойство композиции может быть оценено путем изучения способности соединения ингибировать рост клеток или индуцировать апоптоз с помощью анализов in vitro, известных практикующему специалисту. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшать размер опухоли или иным образом ослаблять симптомы у субъекта. Специалист в данной области техники может определить такие количества на основе таких факторов, как площадь тела субъекта, степень тяжести симптомов субъекта, а также выбранная конкретная композиция или путь введения.

Схемы введения доз можно регулировать для получения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, с учетом терапевтической необходимости, может вводиться одна болюсная доза или могут вводиться несколько разделенных доз в течение определенного периода времени или дозу можно пропорционально уменьшить или увеличить. Парентеральные композиции могут быть составлены в виде единичных лекарственных форм для обеспечения простоты введения и однородности дозы. В данном описании единичная дозированная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, пригодным для применения в качестве унифицированных доз для пациентов, подлежащих лечению; при этом каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем.

Требования к единичным дозированным лекарственным формам согласно данному изобретению продиктованы и непосредственно зависят от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, и (b) ограничений, присущих области составления композиций такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.

Эффективные дозы и схемы введения биспецифических антител, применяемых в данном изобретении, зависят от заболевания или патологического состояния, подлежащего лечению, и могут быть определены специалистами в данной области техники.

Иллюстративный, неограничивающий диапазон терапевтически эффективного количества биспецифического антитела, применяемого в данном изобретении, составляет около 0,1-100 мг/кг.

Вся литература, цитируемая по тексту описания, включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

В то время как конкретные варианты осуществления данного изобретения были описаны выше для целей иллюстрации, специалистам в данной области техники будет понятно, что могут быть сделаны многочисленные изменения деталей без отступления от изобретения, как описано в прилагаемой формуле изобретения.

Примеры

Ниже приводятся примеры, иллюстрирующие данное изобретение. Эти примеры не предназначены для ограничения данного изобретения каким-либо конкретным применением или принципом работы. Для всех положений константной области, обсуждаемых в данном изобретении, нумерация соответствует индексу EU, как по Кабату (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, что включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме). Специалистам в области антител будет понятно, что это соглашение состоит из непоследовательной нумерации в определенных участках последовательности иммуноглобулина, что позволяет нормализовать эталон к консервативным положениям в семействах иммуноглобулинов. Соответственно, положения любого данного иммуноглобулина, определенные с помощью индекса EU, не обязательно будут соответствовать его последовательной последовательности.

Общие и специфические научные методы изложены в публикациях США 2015/0307629, 2014/0288275 и WO2014/145806, все из которых включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме и, в частности, для методов, изложенных в нем.

A. Пример 1: TIL из множества типов рака, коэкспрессирующих рецепторы иммунных контрольных точек

С целью исследования потенциальных ассоциаций между PD-1, CTLA-4, LAG-3 и BTLA, для анализа использовали данные секвенирования РНК из проекта The Cancer Genome Atlas (TCGA). Данные V2 RSEM загружались из FireBrowse (http://firebrowse.org/). Анализ выполняли с применением R с пользовательскими подпрограммами. Корреляция между экспрессией PD-1 и CTLA-4 проиллюстрирована на фиг. 66 вместе с вычисленными значениями R2 (фиг. 1, квадрат коэффициента корреляции Пирсона). На фиг. 66 дополнительно продемонстрирована корреляция между экспрессией PD-1 и LAG-3, экспрессией PD-1 и BTLA и экспрессией LAG-3 и CTLA-4.

На фиг. 44 продемонстрировано, что PD-1 и CTLA-4 коэкспрессировались в раковых опухолях, включая рак мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, меланому, рак яичников и легкого, а также продемонстрировано, что наборы PD-1 и CTLA-4, PD- 1 и LAG-3, PD-1 и BTLA, и LAG-3 и CTLA-4 коэкспрессировались в раковых опухолях, включая рак мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, головы и шеи, почек, аденокарциному легкого, плоскоклеточный рак легкого, рак яичников, поджелудочной железы, рак предстательной железы и меланому.

B. Пример 2. Биспецифические антитела иммунных контрольных точек превосходят моноспецифические антитела иммунных контрольных точек

Прототипные антител иммунных контрольных точек (например, ниволумаб и ипилимумаб) и биспецифические антитела иммунных контрольных точек на основе прототипных антител продуцировали, чтобы продемонстрировать эффект двойной блокады контрольных точек. Если не указано иное, биспецифики в данном документе называются с использованием сначала названия вариабельной Fab-области, а затем вариабельной scFv-области. Аминокислотные последовательности для прототипных антител перечислены в перечне последовательностей. ДНК, кодирующую тяжелую и легкую цепи, генерировали с помощью синтеза генов (Blue Heron Biotechnology, Bothell, Wash.), субклонировали с помощью стандартных методов молекулярной биологии в экспрессионный вектор pTT5, содержащий двухвалентные или биспецифические константные области и временно трансфицировали в клетки HEK293E. Антитела очищали с помощью хроматографии с белком А (и с помощью катионообменной хроматографии для биспецифических антител). Чистоту оценивали с помощью эксклюзионной хроматографии, аналитической катионообменной хроматографии и капиллярной изоэлектрической фокусировки.

1. Двойные положительные клетки избирательно захватываются биспецифическими антителами иммунных контрольных точек

Избирательное нацеливание опухолереактивных TIL, экспрессирующих множество рецепторов иммунных контрольных точек (как продемонстрировано в Примере 1), по сравнению с нереактивными к опухоли Т-клетками, экспрессирующими единичные рецепторы иммунных контрольных точек, может усиливать противоопухолевую активность, избегая при этом периферической токсичности (как проиллюстрировано на фиг. 42).

Анализ SEB-стимулированных МКПК применяли для исследования связывания биспецифических антител контрольных точек с Т-клетками. Анализ SEB-стимулированных МКПК представляет собой метод in vitro для оценки пролиферации Т-хелперных (TH) клеток и оценки генерации популяции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Когда МКПК стимулируют стафилококковым энтеротоксином B (SEB), количество популяций клеток TH увеличивается с последующим увеличением популяции CTL. МКПК стимулировали 100 нг/мл SEB в течение 3 дней, а затем обрабатывали прототипным биспецифическим антителом анти-LAG-3 x анти-PD-1 и антителом отрицательного контроля (Нумакс, двухвалентное) в течение 30 минут при 4°C. После обработки клетки инкубировали с APC-меченным одноплечевым антителом анти-LAG-3, FITC-меченным одноплечевым антителом анти-PD-1 и BV605-меченым антителом анти-CD3 в течение 30 минут при 4°C. Графики рассеяния CD3⁺ T-клеток изображены на фиг. 67. Приведенные данные показывают, что двойные положительные клетки, экспрессирующие как PD-1, так и LAG-3, избирательно захватываются биспецифическим антителом анти-LAG-3 x анти-PD-1, что свидетельствует о том, что биспецифические антитела иммунных контрольных точек избирательно нацеливаются на Т-клетки, экспрессирующие множество рецепторы контрольных точек.

2. Биспецифическое антитело анти-CTLA-4 x анти-PD-1 усиливает ответ IL-2 в реакции смешанных лимфоцитов

Прототипные антитела иммунных контрольных точек XENP 16432 (ниволумаб) и XENP 16433 (ипилимумаб), биспецифическое антитело иммунных контрольных точек XENP 16004 на основе ниволумаба и ипилимумаба, и одноплечевое (моноспецифическое, одновалентное) комбинированное контрольное антитело тестировали в реакции смешанных лимфоцитов (также известной как реакция смешанных лейкоцитов или MLR). MLR представляет собой еще один метод in vitro для оценки пролиферации Т-хелперных (TH) клеток и оценки генерации популяции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Когда аллогенные (с разными MHC-гаплотипами) лимфоциты культивируют вместе, количество популяций клеток TH увеличивается с последующим увеличением популяции CTL. С помощью оценки секреции интерлейкина-2 (IL-2) осуществляли мониторинг активации Т-клеток.

Различные наборы МКПК человека очищали с использованием градиентов плотности Ficoll-Paque ™ Plus после получения лейкоцитов от различных анонимных здоровых добровольцев с помощью лейкафереза (HemaCare, VanNuys, штат Калифорния). МКПК от двух доноров смешивали, а затем обрабатывали с применением 20 мкг/мл указанных исследуемых образцов. Супернатант собирали и измеряли концентрацию IL-2 с помощью IL-2 ИФА, при этом данные продемонстрированы на изображениях некоторых скринингов анти-CTLA-4 Fab. Представлены: код XENP для Fab и scFv вариантов осуществления, обозначения сконструированных доменов vh и vl, константа связывания KD относительно CTLA-4 человека и яванского макака, измеренная с помощью Octet, а также Tm scFv и Fab. Кроме того, количество последовательностей 9-меров, которые точно соответствовали по меньшей мере одной зародышевой линии человека VH или VL, изображено в качестве показателя гуманизации для вариабельных областей как Fab, так и scFv.

Фиг. 25А. Для каждого столбца, каждая точка данных представляет собой отдельную реакцию с другой комбинацией донор-донор.

Приведенные данные демонстрируют, что прототипное биспецифическое антитело анти-PD-1 x анти-CTLA-4 усиливало ответ IL-2 в большей степени, чем ниволумаб и ипилимумаб. Примечательно, что одноплечевая комбинация (каждое одновалентное плечо биспецифического антитела добавлено отдельно) уступает биспецифическому антителу анти-PD-1 x анти-CTLA-4, что свидетельствует о более авидном связывании биспецифического антитела с двойными положительными PD-1+ CTLA -4+ клетками, что согласуется с данными, изображенными на фиг. 67, для биспецифического антитела анти-LAG-3 x анти-PD-1.

3. Дополнительные биспецифические антитела иммунных контрольных точек усиливают ответ IL-2 при смешанной реакции лимфоцитов

Дополнительные прототипные антитела иммунных контрольных точек и биспецифические антитела иммунных контрольных точек, направленные на дополнительные рецепторы иммунных контрольных точек, были исследованы в анализе MLR, как описано выше. Были созданы два набора MLR, в которых образцы 20 доноров были нацелены на одного реципиента-донора, а образцы другого набора от 20 доноров были нацелены на другого реципиента-донора, в общей сложности было поставлено 40 реакций MLR. Реакции инкубировали с 20 мкг/мл указанных исследуемых образцов в течение 6 дней. Данные, изображающие кратность повышения IL-2 и IFNγ (в соответствии с анализом ИФА) после обработки указанными исследуемыми образцами, по сравнению с обработкой бивалентным антителом анти-PD-1 (XENP 16432), продемонстрированы на фиг. 32. Данные показывают, что дополнительные биспецифические антитела иммунных контрольных точек также превосходили ниволумаб относительно активации Т-клеток.

4. Тройная блокада иммунных контрольных точек - бивалентное антитело анти-PD-1 и биспецифическое антитело анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 проявляют синергизм в отношении усиления ответа IL-2 в анализе SEB-стимулированных МКПК.

Было высказано предположение, что блокада иммунных контрольных точек, осуществляемая бивалентным антителом анти-PD-1 и биспецифическим антителом анти-LAG-3 x анти-CTLA-4, как проиллюстрировано на фиг. 43, обеспечит дополнительное преимущество в усилении активации Т-клеток. Чтобы проверить эту гипотезу, прототипные антитела иммунных контрольных точек XENP 16432 (ниволумаб), прототипное биспецифическое антитело иммунных контрольных точек анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 XENP 16430 на основе 25F7 и ипилимумаб, а также комбинацию XENP 16432 и XENP16430 тестировали в анализе SEB-стимулированных МКПК.

МКПК человека от множества доноров стимулировали 10 нг/мл SEB в течение 72 ч с 20 мкг/мл указанных исследуемых образцов. После обработки супернатанты клеток анализировали на IL-2 с помощью ИФА. Данные на фиг. 33 демонстрируют кратность повышения IL-2 после применения двухвалентного антитела Нумакс. Каждая точка означает донора, представленного в техническом синглете.

Приведенные данные демонстрируют, что биспецифическое антитело контрольной точки анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 (XENP 16430), применяемое отдельно, усиливало ответ IL-2 по сравнению с контролем (двухвалентное антитело Нумакс), хотя это усиление было ниже, чем при применении отдельно ниволумаба.

(XENP 16432). Однако биспецифическое антитело анти-CTLA-4 x анти-LAG-3 в комбинации с ниволумабом приводит к значительно более высокому ответу IL-2, чем в отдельности.

5. Блокирование взаимодействия "рецептор контрольной точки - лиганд" необходимо для активации Т-клеток

Прототипные антитела анти-BTLA 4A7, E8D9 и 8D5 подвергали скринингу относительно их способности блокировать взаимодействие BTLA с его лигандом HVEM с помощью Octet, метода на основе биослойной интерферометрии (BLI). Экспериментальные этапы метода Octet обычно включали следующее: иммобилизация (захват лиганда или исследуемого образца на биосенсоре); ассоциация (погружение биосенсоров, покрытых лигандом или исследуемым образцом, в лунки, содержащие серийные разведения соответствующего исследуемого образца или лиганда); а также диссоциация (возвращение биосенсоров в буфер, содержащий буфер) для определения моновалентной аффинности исследуемых образов. Эталонная лунка, содержащая только буфер, также была включена в метод коррекции фона при обработке данных. 500 нМ каждого антитела анти-BTLA и 100 нМ BTLA-Fc инкубировали в течение периода времени более чем час. Биосенсоры анти-Пента-HIS (HIS IK) использовали для захвата HVEM-Fc-His и затем погружали в смесь антитело/BTLA для измерения остаточного связывания BTLA/HVEM. Как проиллюстрировано на фиг. 35B, 8D5 не блокирует взаимодействие BTLA/HVEM, в то время как 4A7 и E8D9 блокируют взаимодействие BTLA/HVEM.

Прототипные антитела анти-BTLA и биспецифические антитела анти-BTLA x анти-PD-1 с плечами анти-BTLA Fab на основе прототипных антител тестировали в анализе SEB-стимулированных МКПК. В частности, МКПК человечка стимулировали 20 нг/мл SEB в течение 72 часов с 20 мкг/мл указанными исследуемыми образцами. После обработки, супернатанты клеток анализировали на IL-2 с помощью ИФА. Данные на фиг. 35А демонстрируют кратность повышения IL-2 после применения двухвалентного антитела Нумакс (каждая точка представляет собой индивидуальный донор МКПК, протестированный в синглете). Произведенные данные демонстрируют, что биспецифическое антитело с неблокирующим плечом 8D5 анти-BTLA Fab, индуцировало IL-2 значительно меньше, чем ниволумаб, что указывает на то, что для усиления активации Т-клеток необходимо блокирование взаимодействия BTLA/HVEM.

6. Биспецифические антитела иммунных контрольных точек усиливают приживление и активность заболевания у мышей NSG, привитых МКПК человека.

Биспецифические антитела контрольных точек оценивали в модели болезни "трансплантат против хозяина" (БТПХ), проведенной у иммунодефицитных мышей NSG (NOD-SCID-гамма). При введении МКПК человека мышам NSG, указанные МКПК человека вызывали аутоиммунный ответ против клеток мыши. Введение МКПК человека мышам NSG с последующим применением ингибиторов иммунной контрольной точки дерепрессирует привитые Т-клетки и усиливает приживление.

10 миллионов МКПК человека прививали мышам NSG посредством IV-OSP в День

0 с последующим введением доз указанных исследуемых образцов (5 мг/кг или, как показано), в День 1. Количество явлений CD45 + измеряли в День 14 (фиг. 34). В то время как БТПХ можно оценить непосредственно, повышенные уровни клеток CD45+ коррелируют с уменьшением веса тела (проиллюстрирована реакция смешанных лимфоцитов, демонстрирующая повышение высвобождения IL-2 при воздействии только ниволумабом (моноклональное антитело анти-PD-1, доступное на рынке как Опдиво®), только ипилимумабом (моноклональное антитело анти-CTLA-4, доступное на рынке как Ервой®), прототипным биспецифическим антителом анти-CTLA-4 x анти-PD-1 на основе плечей ниволумаба и ипилимумаба, а также "одноплечевым" комбинированным контрольным антителом.

Фиг. 26B) и являются предикторами заболевания.

Приведенные данные демонстрируют, что биспецифические антитела контрольных точек по данному изобретению усиливают пролиферацию клеток CD45+ у мышей NSG, привитых МКПК человека, по сравнению с контролем (ФСБ + МКПК). Кроме того, усиление возрастает при применении антител по данному изобретению, и проявляется в большей степени, чем при применении ниволумаба отдельно (XENP 16432).

Кроме того, биспецифическое антитело анти-CTLA-4 x анти-LAG-3 (XENP 16430) в комбинации с ниволумабом вызывает самые высокие уровни приживления, соответствующие данным, приведенным в Примере 2D.

C. Пример 3: Гибридомы

1. Генерация гибридомы

С целью разработки плечей, нацеливающихся на PD-1, LAG-3 и BTLA, у биспецифических антителах иммунных контрольных точек по данному изобретению, моноклональные антитела сначала генерировали по гибридомной технологии посредством ImmunoPrecise, либо посредством их стандартного метода, либо метода быстрого праймера.

При применении стандартного метода антиген(ы) вводили 3 мышам BALB/c. За 7-10 дней до умерщвления для генерации гибридомы иммунизированные мыши получали дополнительную антигенную стимуляцию. Титр антител оценивали с помощью ИФА на антигене, и мышей с наилучшим ответом отбирали для слияния. Последнюю дополнительную антигенную стимуляцию проводили за 4 дня до слияния. Лимфоциты от мышей собирали, очищали, а затем соединяли с клетками миеломы SP2/0. Слитые клетки выращивали на селективной среде для одноэтапного клонирования HAT в течение 10-12 дней, после чего гибридомы были готовы к скринингу.

При применении метода быстрого праймера антиген(ы) вводили 3 мышам BALB/c. Через 19 дней лимфоциты от всех мышей собирали, очищали, а затем соединяли с клетками миеломы SP2/0. Слитые клетки выращивали на селективной среде для одноэтапного клонирования HAT в течение 10-12 дней, после чего гибридомы были готовы к скринингу.

Для генерации гибридом анти-PD-1, применяли стандартный метод и метод быстрого праймера, и использовали следующие антиген(ы): Fc мыши, слитый с PD-1 человека (huPD-l-mFc), Fc мыши, слитый с PD-1 яванского макака (cynoPD-l-mFc), His-меченый PD-1 человека (huPD-l-His), His-меченый PD-1 яванского макака (cynoPD-l-His) или их смеси.

Для генерации гибридом анти-BTLA, применяли стандартный метод и метод быстрого праймера, и использовали антиген Fc мыши, слитый с BTLA человека (huBTLA-mFc), Fc мыши, слитый с BTLA яванского макака (cynoBTLA-mFc), His-меченый BTLA человека (huBTLA-His), или смеси huBTLA-mFc и cynoBTLA-mFc.

Для генерации гибридом анти-LAG-3, применяли стандартный метод и метод быстрого праймера, и использовали антиген Fc мыши, слитый с LAG-3 человека (huLAG-3-mFc), Fc мыши, слитый с LAG-3 яванского макака (cynoLAG-3-mFc), His-меченый LAG-3 человека (huLAG-3-His), смесь huLAG-3-mFc и cynoLAG-3-mFc, или смесь huLAG-3-His и cynoLAG-3-His.

Для генерации гибридом анти-TIM-3, применяли стандартный метод и метод быстрого праймера, и использовали антиген(ы) Fc мыши, слитый с TIM-3 человека (huTIM-3-mFc), Fc мыши, слитый с TIM-3 яванского макака (cynoTIM-3-mFc), His-меченый TIM-3 человека (huTIM-3-His), His-меченый TIM-3 яванского макака (cynoTIM-3-His) или их смеси.

2. Скрининг клонов гибридомы анти-PD-1

Клоны гибридомы анти-PD-1, сгенерированные, как описано выше, подвергались двум циклам скрининга с помощью Octet. В первом цикле, биосенсоры против Fc мыши (AMC) применяли для захвата клонов с погружениями в 500 нМ двухвалентного PD-l-Fc-His человека и яванского макака. Во втором цикле, клоны, которые были идентифицированы в первом цикле как положительные для PD-1 как человека, так и для яванского макака, помещали на биосенсоры AMC и погружали в 500 нМ одновалентного PD-l-His человека и яванского макака.

Последовательности для типовых антител анти-PD-1 приведены в перечне последовательностей.

3. Скрининг клонов гибридомы анти-BTLA

Клоны гибридомы анти-BTLA, сгенерированные, как описано выше, подвергались двум циклам скрининга с помощью Octet. В первом цикле, биосенсоры AMC применяли для захвата клонов с погружениями во множество концентраций BTLA-His человека и яванского макака для определения значения KD. Во втором цикле применяли анализ блокирования для идентификации клонов, которые блокировали взаимодействие BTLA/HVEM. Биосенсоры анти-Пента-HIS (HIS IK) применяли для захвата HVEM-Fc-His и погружали в 25 нМ BTLA-Fc или 25 нМ BTLA-Fc + 1: 1 разведение образцов гибридомы для измерения остаточного связывания BTLA/HVEM. Последовательности для типовых антител анти-BTLA приведены в перечне последовательностей.

4. Скрининг клонов гибридомы анти-LAG-3

Клоны гибридомы анти-LAG-3, сгенерированные, как описано выше, подвергали нескольким циклам скрининга для идентификации клонов с высокой аффинностью, которые блокируют связывание LAG-3 с клетками Рамоса, эндогенно экспрессирующими MHC-II, и которые связывают эпитоп, отличающийся от того, который связывается антителом 25F7 mAb.

Аффинность определяли с помощью анализа Octet. Биосенсоры AMC применяли для захвата клонов с погружениями в одну концентрацию LAG-3-Fc человека и LAG-3-Fc яванского макака. Для идентификации клонов, которые блокируют взаимодействие LAG-3 / MHC-II, 1 мкг LAG-3-hIg человека в 10 смешивали с 50 супернатантом гибридомы (разбавленным в 2 раза, 8 раз в среде RPMI с 10% FBS) в течение 20 минут при комнатной температуре. 40 клеток Дауди или Рамоса (которые эндогенно экспрессируют MHC-II) добавляли и инкубировали при 4°С в течение 30 минут. Затем клетки промывали и инкубировали с вторичным антителом против Fc-Alexa647 человека в течение 30 минут. Затем клетки промывали и анализировали на наличие Alexa647 методом проточной цитометрии (FACS). Данные приведены на фиг. 62. Для идентификации клонов, которые связывают не тот эпитоп, который связывает 25F7 mAb, биосенсоры AMC применяли для захвата клонов с погружениями в 100 нМ LAG-3-hFc человека или 100 нМ LAG-3-hFc с 500 нМ 25F7 для измерения остаточного связывания. Последовательности для типовых антител анти-LAG-3 приведены в перечне последовательностей.

5. Скрининг клонов гибридомы анти-TIM-3

Клоны гибридомы анти-TIM-3, сгенерированные, как описано выше, подвергались двум циклам скрининга. Первый цикл был разделен на скрины для образцов IgG и клонов IgM. Для клонов IgG, биосенсоры AMC применяли для захвата клонов с погружениями во множество концентраций TIM-3-His человека и яванского макака. Для клонов IgM, mAb анти-IgM связывали с помощью AR2G на биосенсорах, которые погружали во множество концентраций TIM-3-His человека и яванского макака. Ни один из образцов IgM не обуславливал связывание сигналов выше, чем на исходном уровне. После первого цикла скрининга, клоны IgG, которые связывали TIM-3 как человека, так и яванского макака, повторно скринировали с двухвалентными вариантами двухвалентного TIM-3-Fc человека и яванского макака. Последовательности для типовых антител анти-TIM-3 приведены в перечне последовательностей.

Некоторые из клонов подвергали химеризации и оценивали на связывание Т-клеток в анализе SEB-стимулированных МКПК человека. МКПК человека стимулировали 100 нг/мл SEB в течение 3 дней. После стимуляции клетки обрабатывали указанными исследуемыми образцами в течение 30 минут при 4 градусах. Связывание на CD3-клетках определяли с помощью вторичного антитела против Fc человека, что проиллюстрировано на фиг. 21.

6. Домены компонентных антител, полученные из гибридомы, блокирующей взаимодействия "рецептор контрольной точки - лиганд"

Как описано в Примере 2Е, для активации Т-клеток необходимо блокирование взаимодействия "рецептор контрольной точки - лиганд". Блокирующую способность типовых антител, содержащих домены, полученные из гибридомы, исследовали с помощью либо анализов связывания клеток, либо анализа Octet, как проиллюстрировано на графиках, демонстрирующих, что домены компонентных антител, рассматриваемых и предлагаемых в данном изобретении, способны блокировать взаимодействия "рецептор контрольной точки - лиганд". В частности, биспецифическое антитело, содержащее плечо 1G6 анти-PD-1 scFv, способно блокировать взаимодействия PD-1/ PD-L1 и PD-1/PD-L2; одноплечевое антитело 7G8 анти-LAG-3 способно блокировать взаимодействие LAG-3/MHC II; биспецифическое антитело, содержащее типовое плечо анти-PD-1 Fab, способно блокировать взаимодействия CTLA-4/CD80 и CTLA-4/CD86; и биспецифическое антитело, содержащее плечо 9C6 анти-BTLA Fab, способно блокировать взаимодействие BTLA/HVEM.

Фиг. 68.

Инкубация HEK293T, экзогенно экспрессирующего PD-1, с XENP20717 предотвращала связывание PD-L1 и PD-L2 с PD-1 дозозависимым образом. Инкубация LAG-3 с XENP22606 предотвращала его связывание с клетками Дауди, эндогенно экспрессирующими MHC-II. Инкубация CTLA-4 с XENP20066 предотвращала остаточное связывание с CD80 и CD86. Инкубация BTLA с XENP20895 предотвращала остаточное связывание с HVEM.

D. Пример 4: Оптимизация аффинности и стабильности

1. Анти-PD-1 mAb 1 G6 и 2E9

Клоны гибридомы анти-PD-1 1G6 и 2E9, генерирование которых описано в Примере 3, сконструированы так, чтобы иметь оптимальную аффиность и стабильность в контексте scFv или Fab для применения в биспецифическом ингибиторе иммунной контрольной точки. Клоны сначала гуманизировали посредством оптимизации последовательного содержимого (см., например, патент США № 7,657,380, выдан 2 февраля 2010 г.). ДНК, кодирующую тяжелую и легкую цепи, генерировали с помощью синтеза генов (Blue Heron Biotechnology, Bothell, Wash.), и субклонировали с помощью стандартных методов молекулярной биологии в экспрессионный вектор pTT5. С-конец scFv включал полигистидиновую метку. Библиотеку вариантов Fv конструировали посредством стандартного мутагенеза (QuikChange, Stratagene, Cedar Creek, Tx.) в полноразмерных двухвалентных форматах Fab-His и/или scFv-His. Двухвалентные mAb очищали с помощью стандартной хроматографии с белком A, а Fab-His и scFv-His очищали с помощью хроматографии Ni-NTA. Последовательности для типовых двухвалентных антител 1G6 и 2E9, Fab и scFv согласно данному изобретению перечислены в перечне последовательностей (хотя полигистидиновые метки удалены для Fabs и scFv). После начального скрининга создавали комбинации вариантов, представляющие интерес, после чего их экспрессировали, очищали и повторно исследовали на аффинность и стабильность.

Скринирование на аффиность двухвалентных антител выполняли с помощью анализа Octet.

Биосенсоры против Fc человека (AHC) применяли для захвата исследуемых образцов и погружали во множество концентраций PD-1-His для определения значения KD. Стабильность scFv-His оценивали с помощью дифференциальной сканирующей флюориметрии (DSF). Эксперименты DSF выполняли с применением системы Bio-Rad CFX Connect Real-Time PCR Detection System. Белки смешивали с флуоресцентным красителем SYPRO Orange и разбавляли до 0,2 мг/мл в ФСБ. Конечная концентрация SYPRO Orange составляла 1 OX. После первичного 10-минутного инкубационного периода при 25°С белки нагревали от 25 до 95°С со скоростью нагрева 1°С/мин. Измерение флуоресценции проводили каждые 30 секунд. Температуры плавления (T_m) рассчитывали с помощью программного обеспечения прибора. Результаты аффинности и стабильности приведены на фиг. 23.

2. Анти-CTLA-4 mAb

Родительская вариабельная область антитела анти-CTLA-4 была разработана для применения в качестве компонента различных биспецифических антител. Были предприняты два подхода к попытке идентифицировать варианты с улучшенными свойствами: (1) осуществляли единичные, двойные и тройные замены аминокислот посредством мутагенеза QuikChange (Stratagene, Cedar Creek, Tx.) и (2) конструировали перепривитые последовательности с их каркасом, замененным на альтернативные зародышевые линии человека (IGHV3-7, IGHV3-13, IGHV3-21, IGHV3-64, IGKV3D-20, IGKV3-15), посредством синтеза ДНК и субклонирования.

Разрабатывали, экспрессировали и очищали варианты Fabs и scFv. Значения аффинности для CTLA-4 человека и яванского макака измеряли для Fabs с помощью анализа Octet. Биосенсоры AHC применяли для захвата Fc-слияний человека или CTLA-4 яванского макак и погружали во множество концентраций исследуемых образцов Fab для определения значения KD. Термическую стабильность измеряли как для Fabs, так и для scFv с помощью DSF. Кроме того, количество последовательностей 9-меров, которые точно соответствовали по меньшей мере одной зародышевой линии человека VH или VL, выражали в качестве показателя гуманизации (см., например, патент США № 7657380, опубликованный 2 февраля 2010 г.) для вариабельных областей как Fab, так и scFv. После начального скрининга создавали комбинации вариантов, представляющие интерес, после чего их экспрессировали, очищали и повторно исследовали на аффинность и стабильность. Результаты приведены на фиг. 24. Несколько вариантов обладали повышенной термической стабильностью по сравнению с родительской вариабельной областью, сохраняя при этом сходную аффинность к CTLA-4 как человека, так и яванского макака. Кроме того, для нескольких вариантов было характерно повышение гуманизации последовательности, что измерялось числом последовательностей 9-меров, выявленных в этих нескольких вариантах и соответствующих зародышевой линии человека. Предпочтительные варианты включают: H0.25_L0, H0.26_L0, H0.27_L0, H0.29_L0, H0.38_L0, H0.39_L0, H0.40_L0, H0.70_L0, H0_L0.22, H2_L0, H3_L0, H3_L0.22, H3_L0.67, H3_L0.74, H3_L0.44, H3.4_L0.118, H3.4_L0.119, H3.4_L0.120, H3.4_L0.121, H3.4_L0.122, H3.4_L0.123, H3.4_L0.124, H3.4_L0.125, H3.4_L0.126, H3.4_L0.127, H3.4_L0.128, H3.4_L0.129, H3.4_L0.130, H3.4_L0.131, H3.4_L0.132, H3.5_L2.1, H3.5_L2.2, H3.5_L2.3, H3.21_L0.124, H3.21_L0.129, H3.21_L0.132, H3.23_L0.124, H3.23_L0.129, H3.23_L0.132, H3.25_L0.124, H3.25_L0.129 и H3.25_L0.132.

3. Анти-BTLA mAb 9C6

Клон 9C6 гибридомы анти-BTLA, генерирование которого описано в Примере 3, был гуманизирован и сконструирован таким образом, чтобы иметь оптимальную аффиность и стабильность в формате двухвалентного антитела, как описано выше в Примере 4A. Последовательности для типовых двухвалентных антител анти-BTLA по данному изобретению приведены в перечне последовательностей.

Скринирование на аффиность вариантов двухвалентных антител выполняли с помощью анализа Octet. Биосенсоры AHC применяли для захвата исследуемых образцов и погружали в лунки во множество концентраций BTLA-His для определения значения KD (как продемонстрировано в A и B, химерное биспецифическое антитело анти-BTLA х анти-PD-1 способствует секреции IFNγ из SEB-стимулированных МКПК. МКПК стимулировали с применением 10 нг/мл SEB в течение 3 дней с указанными исследуемыми препаратами. Супернатанты клеток собирали и анализировали с помощью MSD на предмет указанного анализируемого вещества. A: 20 мкг/мл исследуемого образца; B: 5 мкг/мл исследуемого образца.

Фиг. 52.

4. Анти-LAG-3 mAb 7G8 и 2A11

Клоны 7G8 и 2A11 гибридомы анти-LAG-3, генерирование которых описано в Примере 3, были гуманизированы и сконструированы так, чтобы иметь оптимальную аффиность и стабильность в контексте Fab для применения в биспецифическом ингибиторе иммунной контрольной точки, как описано выше в Примере 4 A. Последовательности для типовых бивалентных антител анти-LAG-3 и Fab по данному изобретению приведены в перечне последовательностей.

Аффинность и стабильность для варианта анти-LAG-3 Fab определяли, как описано выше в Примере 4А. Биосенсоры AHC применяли для захвата слияний Fc мыши с LAG-3 человека и погружали в лунки со множеством концентраций исследуемых образцов для определения значения KD. Результаты приведены на фиг. 53 для вариантов 2A11 и на фиг. 54 для вариантов 7G8.

Типовые варианты 2A11 и 7G8 двухвалентных антител анти- LAG-3 дополнительно подвергали скринингу на их способность блокировать связывание LAG-3 с клетками Дауди, эндогенно экспрессирующими MHC-II. 1 мкг LAG-3-mFc смешивали с указанными концентрациями mAb в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем добавляли клетки Дауди и инкубировали в течение 30 минут при 4°С. Связывание LAG-3-mFc обнаруживали с помощью вторичного антитела против мышиного Fc. Данные приведены на фиг. 63.

5. Анти-TIM-3 mAb

Клоны гибридомы анти-TIM-3, генерирование которых описано в Примере 3, были гуманизированы и сконструированы таким образом, чтобы иметь оптимальную аффиность и стабильность в формате двухвалентного антитела, как описано выше в Примере 4A. Последовательности для типовых двухвалентных антител анти-TIM-3 по данному изобретению приведены в перечне последовательностей.

Скринирование на аффиность вариантов двухвалентных антител выполняли с помощью анализа Octet. Биосенсоры AHC применяли для захвата исследуемых образцов и погружали в лунки с множеством концентраций TIM-3-His для определения значения KD (продемонстрировано на фиг. 22).

Оптимизированные варианты были также оценивали на связывание Т-клеток в анализе SEB-стимулированных МКПК. МКПК человека стимулировали 100 нг/мл SEB в течение 72 часов. После стимуляции клетки обрабатывали указанными исследуемыми образцами.

Связывание 3H3_H1_L2.1 (XENP21189) на CD3⁺ клетках определяли с помощью вторичного антитела против Fc человека, что проиллюстрировано на фиг. 21. Связывание 7B11_HJ1_L1.1 на CD3-клетках определяли с помощью вторичного антитела анти--IgG-APC человека, что проиллюстрировано на фиг. 21.

6. Скринирование на аффинность варианта биспецифических антител анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 Fab-scFv

Биспецифические антитела, содержащие анти-LAG-3 Fab, полученные из оптимизированных двухвалентных антител анти-LAG-3, описанных в Примере 4D, и типовое анти-CTLA-4 scFv, описанное в Примере 4B, подвергали скринингу на аффинность с помощью анализа Octet, как описано выше. В частности, биосенсоры AMC или HIS IK применяли для захвата слияний Fc мыши с LAG-3 или His-Avi человека, меченого слиянием TEV-Fc с LAG-3 человека и погружали в лунку, содержащую исследуемые образцы, для определения значения KD. Результаты приведены на фиг. 55.

7. Скринирование на аффинность варианта биспецифических антител анти-LAG-3 x анти-PD-1 Fab-scFv.

Биспецифические антитела, содержащие анти-LAG-3 Fab, полученные из оптимизированных двухвалентных антител анти-LAG-3, описанных в Примере 4D, и типовое анти-PD-1 scFv, описанное в Примере 4А, подвергали скринингу на аффинность с помощью анализа Octet, как описано выше. В частности, биосенсоры AMC или HIS IK применяли для захвата слияний Fc мыши с LAG-3 или His-Avi человека, меченого слиянием TEV-Fc с LAG-3 человека и погружали в лунку, содержащую исследуемые образцы, для определения значения KD. Результаты приведены на фиг. 61.

E. Пример 5: Оценка in vitro биспецифических антител иммунных контрольных точек, имеющих плечи с оптимизированными аффинностью и стабильностью

1. Биспецифические антитела анти-PD-1 x анти-CTLA-4

а. Биспецифическое антитело анти-PD-1 x анти-CTLA-4 блокирует взаимодействие PD-1 с PD-L1 и PD-L2

Клетки HEK293T, экспрессирующие PD-1, инкубировали с XENP20717 (анти-PD-1 x анти-CTLA-4) и одноплечевыми контрольными антителами анти-PD-1 и анти-CTLA-4 (соответственно XENP20111 и XENP20059) в течение 30 минут при 4°С.

После инкубации добавляли PD-Ll-mFc или PD-L2-mFc и оставляли для дальнейшей инкубации в течение 30 минут при 4°C. PD-Ll-mFc и PD-L2-mFc обнаруживали с помощью вторичного антитела анти-IgG мыши.

На фиг. 45 продемонстрировано, что XENP20717 характеризовался способностью блокировать связывание PD-1 с лигандами PD-L1 и PD-L2 дозозависимым образом. XENP20111 также характеризовался способностью блокировать связывание PD-1 с лигандами PD-L1 и PD-L2, тогда как XENP20559 не блокировал связывание PD-1 с его лигандами.

b. Связывание Т-клеток биспецифическим антителом анти-CTLA-4 x анти-PD-1 на CD3⁺ клетках

МКПК человека стимулировали 500 нг/мл SEB в течение 3 дней, дважды промывали в культуральной среде и затем повторно стимулировали 500 нг/мл SEB в течение дополнительных 24 часов. Затем МКПК обрабатывали XENP20717 (анти-CTLA-4 x анти-PD-1) в течение 30 минут при 4°C. После обработки, МКПК промывали и инкубировали с вторичным антителом против Fc человека (специфический Fab фрагмент)- APC (Jackson Labs) на CD3⁺ клетках с анти-CD3-FITC (UCHT1) mAb. МКПК затем дважды промывали и анализировали с помощью проточной цитометрии. На фиг. 45 показано среднее значение MFI 7 уникальных доноров МКПК и продемонстрировано связывание XENP20717 на CD3+ Т-клетках и что связывание происходило дозозависимым образом.

с. Оценка влияния варианта биспецифических антител анти-CTLA-4 x анти-PD-1 на активацию Т-клеток

Биспецифические антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1 с вариантом антител с плечами анти-CTLA-4 Fab исследовали в анализе MLR. Смешанные МКПК обрабатывали 69,5 нМ двухвалентных антител (например, ниволумаб) или 139 нМ биспецифических антител (например, XENP16004) для эквимолярных концентраций связывания PD-1. Представленные данные демонстрируют результаты некоторых скринингов анти-CTLA-4 Fab. Представлены: код XENP для Fab и scFv вариантов осуществления, обозначения сконструированных доменов vh и vl, константа связывания KD относительно CTLA-4 человека и яванского макака, измеренная с помощью Octet, а также Tm scFv и Fab. Кроме того, количество последовательностей 9-меров, которые точно соответствовали по меньшей мере одной зародышевой линии человека VH или VL, изображено в качестве показателя гуманизации для вариабельных областей как Fab, так и scFv.

На фиг. 25В продемонстрировано, что ряд биспецифических антител вызывают индукцию IL-2 в большей степени, чем ниволумаб, применяемый отдельно.

В анализе SEB-стимулированных МКПК, МКПК обрабатывали 500 нг/мл SEB в течение 2 дней. Затем клетки промывали и обрабатывали 20 мкг/мл XENP16432 (ниволумаб) или XENP20717 и 500 нг/мл SEB. Супернатант анализировали на IL-2 в качестве индикатора активации Т-клеток. Данные, изображенные на фиг. 69, демонстрируют, что биспецифическое антитело анти-CTLA-4 x-анти-PD-1 вызывает высвобождение IL-2 в значительно большей степени, чем ниволумаб, применяемый отдельно.

В другом исследовании, XENP 16432, XENP20717 и одноплечевое комбинированное контрольное антитело оценивали в анализе SEB-стимулированных МКПК. МКПК стимулировали 500 нг/мл SEB в течение 2 дней. Клетки затем один раз промывали ФСБ, после чего добавляли культуральную среду с 20 мкг/мл указанных исследуемых образцов и 500 нг/мл SEB. Супернатанты собирали через 24 часа и анализировали на IL-2. В контрольном эксперименте без стимуляции SEB, МКПК обрабатывали указанными исследуемыми образцами в течение 3 дней до того, как супернатант анализировали на IL-2. Кратность изменений концентрации IL-2 представлена на фиг. 45A-C. Как продемонстрировано на фиг. 45B, XENP20717 повышал секрецию IL-2 в значительно большей степени, чем ниволумаб. Приведенные данные показывают, что XENP20717 активирует Т-клетки более эффективно, чем двухвалентное антитело анти-PD-1, а также комбинация одноплечевого антитела анти-PD-1 и одноплечевого антитела анти-CTLA-4, демонстрируя преимущество избирательной активации Т-клеток, экспрессирующих множество рецепторов иммунных контрольных точек. Примечательно, что в соответствии с данными, описанными в примере 2B, биспецифическое антитело XENP20717 повышало секрецию IL-2 в большей степени, чем комбинация одноплечевых антител, полученных из XENP20717.

Дополнительное биспецифическое антитело, нацеленное на CTLA-4 и PD-1, с плечом анти-CTLA-4 scFv и вариантом 2E9 плеча анти-PD-1 Fab, и контрольным исследуемым образцом оценивали в анализе SEB-стимулированных МКПК. МКПК человека стимулировали 100 нг/мл SEB в течение 2 дней. Клетки промывали и рестимулировали 100 нг/мл SEB в комбинации с 20 мкг/мл указанных исследуемых образцов. Супернатанты анализировали на IL-2 и IFNy через 24 часа после обработки (что изображено на фиг. 19A и B соответственно).

7. Оценка in vitro биспецифических антител контрольных точек анти-LAG-3 x анти-PD-1

а. Оценка влияния варианта биспецифических антител анти-LAG-3 x анти-PD-1 на активацию Т-клеток

В анализе SEB-стимулированных МКПК, МКПК обрабатывали 500 нг/мл SEB в течение 2 дней. Затем клетки промывали и обрабатывали 20 мкг/мл XENP16432 (ниволумаб) или XENP22604 и 500 нг/мл SEB. Супернатант анализировали на IL-2 в качестве индикатора активации Т-клеток (изображено на фиг. 69).

Дополнительные биспецифические антитела анти-LAG-3 x анти-PD-1 с оптимизированными плечами 2A11 анти-LAG-3 Fab (полученные из вариантов mAb, сгенерированных, как описано в Примере 4) также оценивали на предмет активации Т-клеток в анализе SEB-стимулированных МКПК. МКПК человека от множества доноров стимулировали 500 нг/мл SEB в течение 2 дней. Клетки затем дважды промывали в культуральной среде и стимулировали 500 нг/мл SEB в комбинации с 10 мкг/мл указанных исследуемых образцов. Через 24 часа после обработки супернатанты клеток анализировали на IL-2 и IFNγ. Данные на фиг. 64 демонстрируют кратность повышения IL-2 и IFNγ после применения двухвалентного антитела Нумакс. Каждая точка означает донора, представленного в техническом синглете.

Приведенные данные демонстрируют, что ряд биспецифических антител анти-LAG-3 x анти-PD-1 активирует Т-клетки более эффективно, чем либо ниволумаб, применяемый отдельно, либо двухвалентное антитело анти-LAG-3, применяемое отдельно.

3. Оценка in vitro биспецифических антител контрольных точек анти-BTLA x анти-PD-1

а. Связывание Т-клеток биспецифическими антителами анти-BTLA x анти-PD-1 на CD3⁺ клетках

Биспецифические антитела анти--BTLA x анти-PD-1 с оптимизированными плечами анти-BTLA Fab (полученные из вариантов mAb, сгенерированных, как описано в Примере 4) оценивали на предмет связывания на Т-клетках. МКПК человека стимулировали 100 нг/мл SEB в течение 3 дней, после чего МКПК обрабатывали указанными исследуемыми образцами в течение 30 минут при 4°С. Затем МКПК инкубировали с вторичным антителом против Fc человека в течение 30 минут при 4°С. На фиг. 47 продемонстрировано связывание указанных исследуемых образцов на CD3⁺ клетках.

Приведенные данные демонстрируют, что биспецифические антитела контрольных точек анти-PD-1 x анти-BTLA по данному изобретению (например, XENP20895, XENP21220 и XENP21221) связываются с Т-клетками с большей авидностью по сравнению с одноплечевыми контрольными антителами (например, XENP21446 и XENP16011). Это свидетельствует о том, что степень связывания с Т-клетками человека обычно выше у биспецифических антител, причем каждое плечо моновалентно связывает антиген, отличающийся от того, который связывается одновалентными, моноспецифическими антителами, такими как одноплечевые контрольные антитела.

b. Оценка влияния варианта биспецифических антител анти-BTLA x анти-PD-1 на активацию Т-клеток

Биспецифические антитела анти-BTLA x анти-PD-1 с прототипными антителами анти-BTLA (например, 4C7, 8D5 и E8D9) и плечами 9C6 Fab оценивали на предмет активации Т-клеток в анализе SEB-стимулированных МКПК. МКПК человека от множества доноров стимулировали 10 нг/мл SEB в течение 72 часов с 5 мкг/мл или 20 мкг/мл указанных исследуемых образцов. После обработки супернатанты клеток анализировали на IL-2 и IFNγ с помощью ИФА, что изображено на фиг. 1J и 1K соответственно. Приведенные данные демонстрируют, что биспецифические антитела, включающие плечо, полученное из гибридомы 9C, усиливали активацию Т-клеток не только в большей степени, чем бивалентное антитело анти-PD-1, применяемое отдельно, но и в большей степени, чем биспецифические антитела с прототипными плечами анти-BTLA Fab.

Типовые антитела анти-BTLA х анти-PD-1 XENP21220 и XENP16432 (ниволумаб) оценивали в анализе SEB-стимулированных МКПК. МКПК обрабатывали 500 нг/мл SEB в течение 2 дней. Затем клетки промывали и обрабатывали 20 мкг/мл XENP16432 или XENP21220 и 500 нг/мл SEB. Супернатант анализировали на IL-2 в качестве индикатора активации Т-клеток (изображено на фиг. 69).

Дополнительные биспецифические антитела анти-BTLA-x-анти-PD-1 с вариантами 9C6 плечей анти-BTLA Fab и одноплечевые варианты 9C6 антител (отдельно и в комбинации с одноплечевым антителом анти-PD-1) оценивали на предмет активации Т-клеток в анализе SEB-стимулированных МКПК, как описано выше. Данные на фиг. 1L демонстрируют кратность повышения секреции IL-2 и IFNγ после обработки ФСБ.

4. Оценка in vitro биспецифических антител контрольных точек анти-LAG-3 x анти-CTLA-4

а. Связывание Т-клеток биспецифическими антителами анти-BTLA x анти-PD-1 на CD3⁺ клетках

Биспецифические антитела анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 с вариантами антител с плечами анти-LAG-3 Fab и одноплечевыми вариантами антител анти-LAG-3 оценивали на предмет связывания на Т-клетках. МКПК человека стимулировали 100 нг/мл SEB в течение 3 дней, после чего МКПК обрабатывали указанными исследуемыми образцами в течение 30 минут при 4°С. После обработки МКПК инкубировали с анти-CD3-FITC и антителами против Fc-APC человека в течение 30 минут при 4°C. Затем МКПК дважды промывали и анализировали с помощью проточной цитометрии. На фиг. 56 продемонстрировано связывание указанных исследуемых образцов с CD3⁺ Т-клетками.

Приведенные данные демонстрируют, что ряд биспецифических антител контрольных точек анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 по данному изобретению (например, XENP22505 и XENP21896) связываются с Т-клетками с большей авидностью по сравнению с одноплечевыми контрольными антителами (например, XENP22516). Это свидетельствует о том, что степень связывания с Т-клетками человека может быть выше у биспецифических антител, причем каждое плечо моновалентно связывает антиген, отличающийся от того, который связывается одновалентными, моноспецифическими антителами, такими как одноплечевые контрольные антитела.

b. Активация Т-клеток посредством биспецифических антител анти-LAG-3 x анти-CTLA-4

Биспецифические антитела анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 оценивали на предмет активации Т-клеток в анализе MLR и в анализе SEB-стимулированных МКПК.

40 реакций MLR проводили в присутствии 20 мкг/мл указанных исследуемых препаратов., и супернатант клеток анализировали через 6 дней после обработки на предмет IL-2 и IFNγ. На фиг. 59 продемонстрирована кратность индукции IL-2 и IFNγ после применения двухвалентного антитела анти-RSV (XENP 15074).

В анализе SEB-стимулированных МКПК, МКПК обрабатывали 500 нг/мл SEB в течение 2 дней. Затем клетки промывали и обрабатывали 20 мкг/мл XENP16432 (ниволумаб), XENP22602 или комбинацией XENP 16432 и XENP22602 и 500 нг/мл SEB. Супернатант анализировали на IL-2 в качестве индикатора активации Т-клеток (изображено на фиг. 69).

В других анализе SEB-стимулированных МКПК оценивали дополнительное биспецифическое антитело анти-LAG-3 x анти-CTLA-4. МКПК человека от множества доноров стимулировали 500 нг/мл SEB в течение 2 дней. Клетки затем дважды промывали в культуральной среде и стимулировали 500 нг/мл SEB в комбинации с 20 мкг/мл указанных исследуемых образцов. Через 24 часа после обработки супернатанты клеток анализировали на IL-2 и IFNγ. Данные на фиг. 64, фиг. 58 и фиг. 60 демонстрируют кратность повышения IL-2 и IFNy после применения двухвалентного антитела Нумакс. Каждая точка означает донора, представленного в техническом синглете.

Эти данные согласуются с Примером 2D, демонстрирующим, что комбинация бивалентного антитела анти-D-1 и биспецифического антитела анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 проявляет синергический эффект при активации Т-клеток. Кроме того, эти данные демонстрируют, что биспецифические антитела анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 на основе 7G8, проявляют более избирательную функцию на МКПК, чем биспецифические антитела анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 на основе 2A11.

F. Пример 6: Оценка in vivo биспецифических антител иммунных контрольных точек

1. Биспецифические антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1 усиливают приживление и активность заболевания у мышей NSG, привитых МКПК человека.

В нескольких исследованиях БТПХ продемонстрировано, что типовые биспецифические антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1 по данному изобретению усиливают приживление и активность заболевания у мышей NSG, привитых МКПК человека.

В первом исследовании 10 миллионов МКПК человека прививали мышам NSG посредством IV-OSP в День 0. В день 1 мышам вводили XENP 16432 (2,89 мг/кг), XENP20053 (2 мг/кг) и комбинацию XENP16432 и XENP16433 (2,89 + 2,92 мг/кг). Количество клеток CD45 + измеряли в День 14 (проиллюстрировано на фиг. 70).

Оценивали дополнительные биспецифические антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1 с вариантом антител с плечами анти-CTLA-4 Fab и анти-PD-1 scFv. 10 миллионов МКПК человека прививали мышам NSG посредством IV-OSP в День 0, с последующим введением указанных исследуемых образцов (5 мг/кг или, как указано) в День 1. Количество клеток CD45 + измеряли в День 14 (фиг. 1QA, фиг. 1RA и фиг. 1S). Уровни IFNγ также измеряли как дополнительный показатель БТПХ и наносили в зависимости от уровней CD45 + клеток (проиллюстрирована реакция смешанных лимфоцитов, демонстрирующая повышение высвобождения IL-2 при воздействии биспецифическими антителами анти-CTLA-4 x анти-PD-1 с вариантами антитела с плечами анти-CTLA-4 Fab и вариантами антитела с плечами анти-PD-1 scFv, а также только ниволумабом, только ипилимумабом, и прототипом биспецифического антитела анти-CTLA-4 x анти-PD-1 на основе плечей ниволумаба и ипилимумаба в качестве контроля.

Фиг. 27 и фиг. 30.

Приведенные данные демонстрируют, что биспецифические антитела контрольных точек анти-PD-1 x анти-CTLA-4 по данному изобретению усиливают пролиферацию клеток CD45+ у мышей NSG, привитых МКПК человека, по сравнению с контролем (ФСБ + МКПК). Кроме того, усиление возрастает при применении антител по данному изобретению, и проявляется в большей степени, чем при применении ниволумаба отдельно (XENP 16432). На фиг. 31 приведено сравнение влияния исследуемого образца на пролиферацию CD45+ клеток между исследованием 160314 (представлено на фиг. 26) и исследованием 160331 (представлено на фиг. 29). Оба исследования последовательно демонстрируют превосходство биспецифических антител контрольных точек анти-PD-1 x анти-CTLA-4 по сравнению с ниволумабом, применяемым отдельно.

В другом исследовании оценивали биспецифическое антитело анти-CTLA-4 x анти-PD-1 с Xtend Fc. Мышам, привитым МКПК, вводили указанные исследуемые образцы в указанных концентрациях, и измеряли явления CD45 +, CD4 + и CD8 + в День 14 (проиллюстрировано на фиг. 20).

2. Биспецифические антитела анти-BTLA x анти-PD-1 усиливают приживление и активность заболевания у мышей NSG, привитых МКПК человека.

В первом исследовании 10 миллионов МКПК человека прививали мышам NSG посредством IV-OSP в День 0. В День 1 мышам вводили XENP 16432 (2,89 мг/кг) и XENP20895 (5 мг/кг). Количество клеток CD45 + измеряли в День 14 (проиллюстрировано на фиг. 70).

Биспецифическое антитело анти-BTLA x анти-PD-1 XENP20895 оценивали во втором исследовании БТПХ. 10 миллионов МКПК человека прививали мышам NSG посредством IV-OSP в День 0, с последующим введением указанных исследуемых образцов (в концентрациях, как указано) в День 1. Количество клеток CD45 + измеряли в День 10, 14 и 22 (проиллюстрировано на фиг. 51 соответственно).

3. Биспецифические антитела анти-LAG-3 x анти-PD-1 усиливают приживление и активность заболевания у мышей NSG, привитых МКПК человека.

В исследовании БТПХ, 10 миллионов МКПК человека прививали мышам NSG посредством IV-OSP в День 0. В День 1 мышам вводили XENP 16432 (2,89 мг/кг) и XENP20895 (5 мг/кг). Количество клеток CD45 + измеряли в День 14 (проиллюстрировано на фиг. 70).

Во втором исследовании, описанном в Примере 6A, также оценивали еще одно типовое антитело анти-LAG-3 x анти-PD-1 (XENP22847) (фиг. 20C).

4. Биспецифические антитела анти-LAG-3 x анти-CTLA-4 усиливают приживление и активность заболевания у мышей NSG, привитых МКПК человека.

В исследовании БТПХ, 10 миллионов МКПК человека прививали мышам NSG посредством IV-OSP в День 0. В День 1 мышам вводили XENP 16432 (2,89 мг/кг), XENP22675 (5 мг/кг) и комбинацию XENP 16432 и XENP22675 (5 + 5 мг/кг). Количество клеток CD45 + измеряли в День 14 (проиллюстрировано на фиг. 70).

Эти данные показывают, что XENP22675 усиливает приживление и активность заболевания в большей степени, чем введение ниволумаба отдельно. Примечательно, что XENP22675 в комбинации с ниволумабом действует синергетически для дополнительного усиления приживления.

G. Пример 7: Биспецифические антитела анти-PD-1 x анти-CTLA-4 демонстрируют противоопухолевую активность у мышей NSG, привитых клетками рака KG1 A-luc и МКПК человека

Мышам NOD SCID гамма (NSG) прививали клетки рака KGlA-luc в День 0. В День 21 этим мышам внутрибрюшинно прививали МКПК человека. После приживления МКПК, указанные исследуемые образцы вводили еженедельно путем внутрибрюшинной инъекции (контрольным мышам вводили ФСБ). Рост опухоли контролировали путем измерения общего потока на мышь с помощью системы визуализации in vivo (IVIS® Lumina III); данные представлены на фиг. 71 (дни после 1-й дозы).

XIII. Включение посредством ссылки

Наборы заявок из "анти-CTLA-4", набор заявок от A1 до A30, "анти-PD-1", набор заявок от B1 до B30, "анти-LAG-3", набор заявок от C1 до C28, "анти-TIM-3", набор заявок от D1 до D28, "анти-TIGIT", набор заявок от E1 до E28, набор заявок "анти-BTLA" от F1 до F28, "каркас плюс Fv", набор заявок от Y1-Y5 и "Специфические молекулы", набор заявок от X1 до X16, из USSN 62/420,500, явным образом включены посредством ссылки в полном объеме.

1. Гетеродимерное направленное против PD-1 и CTLA-4 антитело, содержащее:

а) первый мономер, содержащий:

i) первый вариантный Fc-домен; а также

ii) одноцепочечную Fv (scFv), направленную против PD-1, причем указанная scFv-область содержит первый вариабельный домен тяжелой цепи, первый вариабельный домен легкой цепи и заряженный линкер scFv, причем указанный заряженный линкер scFv ковалентно соединяет указанный первый вариабельный домен тяжелой цепи и указанный вариабельный домен легкой цепи; а также

b) второй мономер, содержащий мономер VH-CH1-шарнир-CH2-CH3, причем VH является вторым вариабельным доменом тяжелой цепи, а CH2-CH3 является вторым вариантным Fc-доменом; а также

c) легкую цепь, содержащую второй вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи;

причем указанный CH1-шарнир-CH2-CH3 указанного второго мономера содержит аминокислотные замены N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D,

причем указанные первый и второй вариантные Fc-домены, каждый, содержат аминокислотные замены E233P/L234V/L235A/G236del/S267K;

причем указанный первый вариантный Fc-домен содержит аминокислотные замены S364K/E357Q, а второй вариантный Fc-домен содержит аминокислотные замены L368D/K370S,

причем указанный первый вариабельный домен тяжелой цепи и указанный первый вариабельный домен легкой цепи представляют собой SEQ ID NO: 11376 и SEQ ID NO: 11377 соответственно,

причем указанная вторая вариабельная область тяжелой цепи и указанная вторая вариабельная область легкой цепи образуют область, связывающую человеческий CTLA-4,

причем указанная вторая вариабельная область тяжелой цепи и указанная вторая вариабельная область легкой цепи представляют собой SEQ ID NO: 38134 и SEQ ID NO: 38138 соответственно, и

при этом нумерация соответствует индексу EU, как у Кабата.

2. Гетеродимерное антитело по п. 1, отличающееся тем, что компонент CH1-шарнир-CH2-CH3 второй тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 37725, указанный первый вариантный Fc-домен имеет SEQ ID NO: 37726, и указанный константный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 37727.

3. Гетеродимерное антитело, направленное против PD-1 и против CTLA-4, содержащее:

а) первый мономер, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38518;

б) второй мономер, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38523 и

с) третий мономер, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38533.

4. Композиция нуклеиновых кислот, способная кодировать указанное антитело по пп. 1-3, содержащая:

а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный первый мономер указанного гетеромерного антитела по пп. 1-3;

b) вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный второй мономер указанного гетеромерного антитела по пп. 1-3; и

c) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную легкую цепь указанного гетеромерного антитела по пп. 1-3, соответственно.

5. Композиция экспрессионных векторов для экспрессии указанного антитела по пп. 1-3, содержащая:

а) первый экспрессионный вектор, содержащий указанную первую нуклеиновую кислоту указанной композиции нуклеиновых кислот по п. 4;

b) второй экспрессионный вектор, содержащий указанную вторую нуклеиновую кислоту указанной композиции нуклеиновых кислот по п. 4; и

c) третий экспрессионный вектор, содержащий указанную третью нуклеиновую кислоту указанной композиции нуклеиновых кислот по п. 4.

6. Клетка-хозяин для продуцирования указанного антитела по пп. 1-3, содержащая указанную композицию экспрессионных векторов по п. 5.

7. Способ получения гетеродимерного антитела по пп. 1-3, включающий культивирование указанной клетки-хозяина по п. 6 в условиях, в которых указанное антитело экспрессируется, и выделение указанного антитела.